Автореферат и диссертация по медицине (14.00.37) на тему:Повреждения ДНК клеток крови при тяжелой сочетанной травме

На правах рукописи

МУРАВЬЕВА Мария Юрьевна

ПОВРЕЖДЕННИЯ ДНК КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТЯЖЕЛОЙ СОЧЕТАННОЙ ТРАВМЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.00.37-Анестезиология и реаниматология

Москва-2009

003467343

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте общей реаниматологии Российской академии медицинских наук на базе 18 отделения общей реанимации Городской клинической больницы имени С.П. Боткина Департамента здравоохранения города Москвы

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки России МОРОЗ Виктор Васильевич

Доктор медицинских наук, профессор РЕШЕТНЯК Василий Иванович

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

СВИРИДОВ Сергей Викторович

Доктор медицинских наук ОСТАПЧЕНКО Дмитрий Анатольевич

Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «Ц » ,м/1л! 2009 г. в (У часов на заседании Диссертационного совета Д 001.051.01 при ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН по адресу: 107031 г. Москва ул. Петровка д. 25, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН; с авторефератом в Интернете на сайте: «www.niiorramn.ru».

Автореферат разослан « В » сии\1ил 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН Доктор медицинских наук, профессор

Решетняк В.И.

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной реаниматологии является исследование механизмов развития критических, терминальных и постреанимационных состояний на органном, клеточном и молекулярном уровнях (В.А. Неговский, 1999; В.В. Мороз, 2003). В структуре летальности механические повреждения различной этиологии занимают в настоящее время третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Тяжелая сочетанная травма (ТСТ) является ведущей причиной гибели лиц молодого - 18-45 лет - работоспособного возраста, что обуславливает социальную значимость этой проблемы (Г.Н. Цыбуляк, 1995; Е.К. Гуманенко, 1997).

Тяжелая сочетанная травма сопровождается развитием декомпенсации систем жизнеобеспечения организма, возникающего в результате комплексного влияния факторов повреждения: кровопотери, гипоксии, токсемии, боли, нарушения специфической функции жизненно важных органов. Доминирующими из этих факторов являются кровопотеря и гипоксия (Д.А. Остап-ченко, 2005). При несвоевременном оказании интенсивной помощи тяжесть состояния больного усугубляется развитием шока, который характеризуется общими гемодинамическими, гемореологическими и метаболическими расстройствами. Известно, что ТСТ приводит к нарушению практически всех видов обмена веществ (Е.В. Гембицкий, 1994). Вместе с тем, состояние обмена холестерина и его транспортной системы - липопротеидов, в разные периоды течения ТСТ до сих пор остается малоизученным. Имеются лишь единичные данные о возможности формирования дислипидемии у таких больных (JI.B. Молчанова и JI.H. Щербакова, 2008; А.А. Бессекеев, 2006). Одной из важных причин нарушения метаболизма возможно считаются структурно-функциональные изменения клеток, происходящие в условиях нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами (В.А. Неговский, 1986).

Свободнорадикальные процессы, ведущие к структурно-функциональным нарушениям в органах и тканях, могут быть запускающими механизмами патологических процессов при критических состояниях. Нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами в результате полученной травмы происходят за счет избыточной генерации активных форм кислорода (АФК) из-за блокады электронно-транспортной цепи митохондрий в посттравматическом периоде (С. Goo-dyear-Bruch et al., 2002; M. Keel et al., 2005). АФК исходно являются продуктами нормального клеточного метаболизма. При патологических состояниях их генерация значительно увеличивается и не компенсируется антиокси-дантной системой защиты, в результате чего АФК вызывают выраженные цитотоксические эффекты. Поскольку период жизни АФК слишком мал, то оценить уровень их продукции в клинических условиях практически невозможно. Поэтому определение увеличения продукции АФК осуществляют косвенным путем - по содержанию ряда метаболитов, образующихся в результате окислительной модификации липидов, белков и нуклеиновых кислот (Г.А. Рябов и соавт., 2002). Повреждения ДНК включают однонитевые

и/или двунитевые разрывы цепей ДНК, модификацию азотистых оснований и др. Ранее было показано, что из четырех оснований, входящих в структуру ДНК, гуанин является наиболее окисляемым (M. Dizdaroglu et al., 1992). Продуктом его окисления, в результате воздействия АФК, является 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, который можно определить в различных биологических тканях и жидкостях (А.К. Жанатаев и соавт., 2002). Количественное определение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина предложено использовать в качестве одного из маркеров свободнорадикальных процессов, происходящих в организме в норме и при развитии патологического процесса. Определение ДНК-повреждений в качестве биологического индикатора свободнорадикальных процессов может иметь существенное значение для раскрытия механизмов развития патологического процесса и при мониторинге терапии, а также для оценки прогноза заболевания. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липи-дов, АФК инициируют цепную реакцию их пероксидации, что сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток.

На сегодняшний день нет четких представлений о ДНК-повреждениях при критических состояниях и, в частности, при тяжелой сочетанной травме (В.Л. Кожура и соавт., 1999; R.S. Hotchkiss et al., 1999; J. Guan et al., 2002; J. Pachl et al., 2005). Повреждающему действию АФК на клеточные структуры в организме противостоит сложная многокомпонентная антиоксидантная система. С помощью этой системы обеспечивается поддержание про/антиокислительного баланса. Природные антиоксиданты являются представителями разных классов химических соединений, в связи с чем разнообразны и механизмы их антиоксидантного действия. Снижение уровня антиоксидантной защиты у пациентов в критических состояниях описано многими авторами (H.F. Goode et al., 1995; Е. Borrelli et al., 1996). При этом вопрос о необходимости ее усиления с помощью экзогенных антиоксидан-тов остается нерешенным (R. Lovât et al., 2003).

Цель работы.

Выявить новые механизмы развития постгравматических изменений путем исследования повреждения ДНК, апоптоза, некроза и ряда биохимических показателей у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой.

Задачи исследования:

1. Оценить динамику ДНК-повреждений, апоптоза и некроза клеток крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

2. Исследовать динамику содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина клеток крови и общего антиокислительного статуса у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

3. Выявить динамику биохимических показателей и липопротеинов крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

4. Определить уровень общего холестерина, холестерина липопротеинов и ряда биохимических показателей крови у лиц, перенесших тяжелую со-четанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.

5. Исследовать изменения эластических свойств стенки артериальных сосудов у пострадавших, перенесших тяжелую сочетанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.

Научная новизна.

Впервые у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой доказано, что в патогенезе посттравматических процессов имеет значение выявленное увеличение количества ДНК-повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели - некрозом и апоптозом.

Показано в динамике изменение содержания суммарного показателя свободно-радикальных процессов - 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина - у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы, свидетельствующее о дисбалансе про-/антиокислительной системы в организме и о необходимости проведения исследований по изучению коррекции антиокислительного статуса.

Оценено состояние гемодинимических и биохимических показателей в отдаленном периоде у выживших больных. Впервые у пострадавших, перенесших травму с нарушением гемодинамики, в отдаленном посттравматическом периоде обнаружено уменьшение эластических свойств артериальной стенки путем оценки изменений ее податливости и скорости распространения пульсовой волны, что требует ежегодного диспансерного наблюдения за этими больными.

Практическая значимость.

Увеличение количества ДНК-повреждений клеток крови у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой, усиление клеточной гибели дает представление о механизмах развития посттравматических патологических процессов.

Динамика общего антиокислительного статуса в первые две недели у больных с тяжелой сочетанной травмой свидетельствует о необходимости проведения дополнительной более эффективной антиоксидантной терапии.

Увеличение жесткости сосудов, сохранение в течение нескольких лет дислипидемии и повышенной активности щелочной фосфатазы у пострадавших в отдаленном периоде после тяжелой сочетанной травмы, позволяет предположить, что они нуждаются в диспансерном наблюдении.

Апробация работы. Результаты исследования по материалам диссертации доложены на:

19th Annual Congress European Society of Intensive Care Medicine (ESICM-2006), 24-27 сентября 2006 г, Барселона, Испания;

всероссийской научно-практической конференции «Экстренная медицинская помощь при чрезвычайных ситуациях техногенного характера в

крупном промышленном центре», 2007 г, Новокузнецк;

14th World Congress of Anesthesiology (WCA-2008), 2-7 марта 2008 г, Кейптаун, ЮАР;

28th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine (ISICEM-2008), 18-21 марта 2008 г, Брюссель, Бельгия;

IX сессии MHO АР, 28 марта 2008 г, Голицыно;

Всероссийском конгрессе анестезиологов-реаниматологов с международным участием, посвященном 100-летию академика РАМН В.А. Негов-ского, 18-20 марта 2009 г, Москва.

Внедрение результатов исследования в практику. Новые данные о патогенезе общепатологических реакций организма у больных с тяжелой со-четанной травмой в первые дни после травмы используются в учебном процессе в Государственном Учреждении Научно-исследовательском Институте общей реаниматологии РАМН и учитывается при ведении пострадавших в отделении общей реанимации городской клинической больницы имени С.П. Боткина.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При тяжелой сочетанной травме наблюдается увеличение процессов ДНК повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели.

2. Выявлены различия в динамике изменений показателей обмена холестерина, свободно-радикальных процессов и ряда биохимических показателей (общего белка, активности гамма-глютамилтрансферазы, аспартатами-нотрансферазы и коэффициента де Ритиса) в ранние сроки после травмы в группах выживших и умерших больных, часть из которых имеет прогностическое значение.

3. В отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы отмечается нормализация обмена холестерина и биохимических показателей.

4. Результаты исследования эластических свойств артериальной стенки свидетельствуют об увеличении жесткости сосудов в отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы с нарушением гемодинамики, как отдаленные неблагоприятные последствия тяжелой сочетанной травмы.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и материала исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает № источника, из которых 5 отечественных и ИГ иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика обследованных и методов исследования

В исследование были включены 77 человек, перенесших тяжелую соче-танную травму, кровопотерю (20-48 мл/кг) с нарушением гемодинамики (табл. 1).

Таблица 1

Характер травмы Число больных, п (%)

я i о U скелетная+торакальная 31 (40,26)

скелетная+абдоминальная 21 (27,27)

скелетная+торакальная+абдоминальная 17 (22,08)

Тяжелая изолированная 8 (10,39)

Всего 77 (100)

Средний возраст больных составил 36,8±9,2 лет (от 17 до 60 лет). Все больные нормостенического типа телосложения со средней массой тела 75,7±7,1 кг (от 50 до 95 кг). Из исследования были исключены больные с тяжелой черепно-мозговой травмой, больные старше 60 лет, а также больные с декомпенсированной соматической патологией. Всех больных в зависимости от исхода заболевания ретроспективно разделили на 2 основные группы: 1 - умершие, 2 - выжившие (табл. 2).

Таблица 2

Клиническая характеристика больных по группам, (М±т)

Значения показателей в группах больных

Показатели 1 2А 2Б Общее число обследованных Сравнения

Число больных, 9 32 36 77 10

г» (мужчин/женщин) (7/2) (23/9) (22/14) (52/25) (4/6)

Средний возраст, 34,4+7,4 34,9+5,3 38,5+5,8 35,9±6,2 26,9+2,6

годы

Объем 40,3±7,2 25,3+5,6 42,1+6,2 35,9±6,4 нет

кровопотери, мл/кг

АД ср. при 58,4±4,0 75,4±11,5 56,8±7,3 63,5±7,6 115,8+4,6

поступлении, мм рт. ст.

Тяжесть состояния оценивали в баллах с помощью интегральной шкалы APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation, Knaus et al, 1985). Средняя величина тяжести состояния больных по шкале APACHE II при поступлении составила 17,1±5,4 баллов (от 11 до 26 баллов). Больные поступили в реаниматологическое отделение ГКБ им. С.П. Боткина через 2,6±1,8 часа с момента травмы. У 61 (79,2%) больных в течение 1-4 часов с момента поступления в стационар после стабилизации гемодинамики на достаточном уровне, согласно показаниям, выполнено оперативное вмешательство.

В 1-ю группу включено 9 больных (7 мужчин и 2 женщины) в возрасте 34,4±7,4 года с объемом кровопотери 40,3±7,2 мл/кг, тяжесть состояния по

шкале APACHE II на момент поступления составила 21,28±1,89 балла (от 20 до 25 баллов). В группе выживших в зависимости от тяжести состояния выделили 2 подгруппы: 2А - тяжелые больные (APACHE II < 19 баллов, от 11 до 19) и 2Б - крайне-тяжелые больные (APACHE II > 20 баллов, от 20 до 26 баллов) (табл. 3). Пострадавшие 1-й и 2Б групп были сопоставимы по тяжести состояния, уровню кровопотери и характеру проведенных оперативных вмешательств.

Полиорганная недостаточность была диагностирована у 21 человека (27,3%). Недостаточность двух систем органов зафиксирована у тринадцати (61,9%), трех - у шести (28,6%), четырех - у двух пострадавших (9,5%).

В группу сравнения включены 10 практически здоровых добровольцев (4 мужчин и 6 женщин) в возрасте 26,9±2,6 лет.

Для ретроспективного анализа были отобраны 46 историй болезни пострадавших находившихся на лечении в больнице им. С.П. Боткина в 20002004 гг. Для оценки состояния больных в отдаленном периоде после получения травмы всем больным письменно было предложено пройти амбулаторное клинико-лаборатоное обследование. Выяснилось, что пятеро из пострадавших умерли в течение от 2 месяцев до 3,5 лет после выписки из больницы. Согласились участвовать в исследовании 13 человек, перенесших тяжелую сочетанную травму. Обследование включало оценку состояния основных систем организма, показателей центральной гемодинамики, биохимический анализ крови и липидный профиль.

Всем больным с ТСТ после оценки тяжести пострадавшего и состояния его витальных функций проводили традиционный комплекс интенсивной терапии согласно основным принципам лечения острой кровопотери и травматического шока (В.В. Мороз, 2003).

Методы исследований

Лабораторно-инструментальные исследования осуществляли при поступлении пострадавших в реанимационное отделение, на 3-й, 5-е, 7-е и 15-е сутки, а также в отдаленном периоде после перенесенной ТСТ через 1-5 лет (через 1 год - 5 человек, через 3 года - 6, через 5 лет - 2). Забор 20 мл венозной крови для определения показателей свободно-радикальных процессов и обмена холестерина проводили из катетеризированной центральной вены во время нахождения больных в реанимационном отделении или из локтевой вены при обследовании пострадавших в профильных отделениях и в отдаленном периоде после ТСТ.

Для исследования свободно-радикальных процессов 2 мл цельной крови смешивали с равным объемом среды RPMI 1640, содержащей 10% диметил-сульфоксида, замораживали и хранили до проведения анализа при минус 20°С. Для определения значений холестерина, биохимических показателей и антиокислительного статуса 18 мл крови помещали в пробирку с 0,1 мл гепарина с последующим перемешиванием и центрифугированием в течение 15 минут при скорости 2000g для получения плазмы, которую разливали по

1,5 мл в пробирки эппендорф, замораживали и хранили до проведения анализа при минус 20°С.

Исследование апоптоза, некроза, ДНК-повреждений, показателей свободно-радикальных процессов. Уровень ДНК повреждений в клетках крови, а также процент апоптотических и некротических клеток крови больных с тяжелой сочетанной травмой оценивали методом гельэлектрофореза изолированных клеток (метод "ДНК-комет", Ostling О. и Johanson K.J., 1984).

Метод основан на регистрации различной скорости передвижения в постоянном электрическом поле целой и фрагментированной ДНК лизирован-ных клеток, заключенных в агарозный гель. При электрофорезе образца, ДНК мигрирует к аноду, формируется след, напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от нарушения степени суперспирализации молекулы ДНК. У здоровых людей структура ДНК "хвоста кометы" обусловлена естественными, имеющими место в норме процессами репликации и транскрипции ДНК, связанными с делением клетки и происходящим в ней синтезом белка.

Рис. 1. ДНК апоптотических клеток больного Д. с ТСТ (указаны стрелками).

В качестве показателя нарушения структуры и поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте "ДНК-комет" (%ДНК) от общего количества ДНК в комете.

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в упорядоченной эндонуклеазной фрагментации ДНК. Постадийный распад ДНК при апоптозе завершается образованием ее фрагментов с различным содержанием в своем составе пар оснований, что формирует картину "лестницы" при электрофорезе. При проведении метода "ДНК-комет", разрезанные нуклеазами межнуклеосомные фрагменты ДНК апоптотических клеток, носят правильный упорядоченный ха-

рактер и выявляются в виде диффузного "хвоста". Часть ДНК не подвергшаяся воздействию эндонуклеаз составляет "головку кометы". Апоптотиче-ские клетки идентифицировали как специфичные "ДНК-кометы" с диффузным "хвостом" и практически отсутствующей "головой" (рис. 1).

В отличие от апоптоза, некроз характеризуется, прежде всего, нарушениями степени суперспирализации молекулы ДНК, без воздействия на нее эндонуклеаз. При некрозе клеток, ДНК так же деградирует, но уже как результат гибели клетки. При этом разрывы в молекуле ДНК носят случайный характер. В результате некротические клетки идентифицируются как широкие "рыхло-диффузные ДНК-кометы" неправильной формы (рис. 2).

Рис. 2. ДНК некротических клеток больного Т. с ТСТ (указаны стрелками).

Определение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина. Продуктом окисления гуанина, в результате воздействия АФК, является 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин. Количественное определение 8-шдрокси-2-дезоксигуанозина предложено использовать в качестве одного из маркеров свободнорадикальных повреждений нуклеиновых кислот. Окисленный гуанин подвергается гидролизу ферментом 8-oxoG ДНК-гликозилазой. Данный фермент используется в методе FLARE Assay (Fragment Length Analysis using Repair Enzymes) с использованием коммерческого набора реактивов «Human 8oxoGuanine DNA Glycosylase (OGG1) FLARE Assay» (R&D Systems Inc., USA,) при определении содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в ДНК клеток крови. Данный метод является модифицированным методом "ДНК комет" и основан на анализе длины фрагментов ДНК после применения фермента, гидролизирующего окисленный гуанин.

Исследование общего антиокислительного статуса. Определение общего антиокислительного статуса производили с использованием коммерческих наборов реактивов (Randox, Великобритания) на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas Mira Plus (Roche, Швейцария). Принцип

метода основан на ингнбированни антноксидантами плазмы крови образования радикального катиона 2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолина сульфата] (ABTSr+).

Исследование липидного профиля и биохимических показателей.

Определение триглицеридов, общего холестерина, холестерина липопротеи-дов высокой плотности (ХС ЛПВП) производили на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas Miras Plus (Roche, Швейцария) с использованием коммерческих наборов реактивов (Biotin, Германия). Холестерин липо-протеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) и липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) определяли расчетным методом по формуле Фрид-вальда:

ХС ЛПОНП = ТГ/2,2 (ммоль/л) ХС ЛПНП = общий ХС - ХС ЛПВП - ТГ/2 (ммоль/л)

Определение биохимических показателей плазмы крови производили на биохимическом анализаторе Cobas Mira Plus с использованием фирменных наборов реактивов (Biotin, Германия). Для выявления причин высокого уровня активности ферментов AJIT и ACT рассчитывали коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ, de Ritis coefficient).

Исследование показателей центральной гемодинамики. Для регистрации центральной гемодинамики использовали анализатор показателей кровообращения осциллометрический (АПКО 8 РИЦ, ООО «Глобус», Россия). В основе метода лежит использование данных объемной компрессионной осциллометрии артериального давления и пульсовой волны.

Статистический анализ. Весь материал обработан статистически с использованием общепринятых математико-статистических методов расчета основных характеристик выборочных распределений (среднее арифметическое (М), стандартное отклонение (SD)) с использованием среды Windows ХР и пакета компьютерных программ «Statistica 7.0». Среднегрупповые показатели сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни. Статистическую оценку результатов проводили у пострадавших путем сравнения показателей на различные сутки наблюдения непараметрическим методом с использованием критерия Вилкоксона. Для характеристики зависимостей между отдельными параметрами определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Статистически значимыми считали показатели при вероятности ошибки ¿><0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Средний показатель % ДНК в «хвосте комет» клеток крови у здоровых доноров составил 6,1±2,2%. У всех обследованных больных с ТСТ аналогичный показатель на 1-е сутки составил 10,5±1,9%, что статистически значимо выше по сравнению с контролем. На 3-й, 5-е и 7-е сутки наблюдается увеличение данного показателя. На 5-е сутки значение поврежденности ДНК у всех обследованных (14,0±1,3%) оказалось статистически значимо выше по сравнению с первыми сутками (рис. 3). На 15-е сутки средний показатель

поврежденности ДНК у всех обследованных снизился до уровня 10,3±0,9%, но оставался статистически значимо выше величины контроля.

В 1-й группе показатель поврежденности ДНК при поступлении составил 8,9±6,3%. На 3-й сутки наблюдали резкий рост данного показателя в этой группе на 41% (15,0±8,7%). Также достаточно высокие значения показателя поврежденности ДНК наблюдаются в 1-й группе на 7-е и 15-е сутки (14,2±12,1 и 14,5%, соответственно).

В группе 2Б, сопоставимой по тяжести состояния с больными 1-й группы, показатель поврежденности ДНК при поступлении был 10,8±6,0%. В дальнейшем также наблюдался рост данного показателя до 12,4+5,4% на 3-й сутки и до максимального значения на 5-е сутки (14,7+4,5%), которое статистически значимо отличается от исходных данных. Затем наблюдалось постепенное уменьшение значений данного показателя на 7-е и 15-е сутки -(12,5+5,8 и 9,4+1,2%, соответственно).

Рис 3. % поврежденной ДНК в "хвосте кометы" у всех обследованных с ТСТ («=22) и в контрольной группе. * - р<0,01 по сравнению с контрольной группой; ** -р<0,001 по сравнению с контрольной группой; #-р<0,05 по сравнению с исходными данными.

У здоровых доноров в крови некротические клетки не обнаружены, а показатель апоптотических клеток составил 0,7±0,2%. У всех обследованных больных ТСТ показатель некротических клеток на 1-е сутки составил 4,9±5,9% (рис. 46). На 3-й сутки наблюдается увеличение данного показателя более чем на 65% от исходных данных (8,2±4,5%), с достижением максимального значения на 5-е сутки (9,2±7,1%). После 5-х суток начинается постепенное уменьшение количества некротических клеток в крови пострадавших и уже в конце первой недели у всех пострадавших данный показатель составил 7,5±5,4%. А на 15-е сутки показатель некротических клеток у

ЗОп

| 25" □□

О

О 3 5 7 15 контроль сутки

всех пострадавших с ТСТ был 4,9±3,6% и сравним с данными при поступлении (рис. 46).

? 40-1

35-

0) £ 30-

о к 25-

X х 20-

о

I) у 15-

1 10-

с 0 5-

5 0-

15 контроль

е25 б

? 20-

Ф 5 0

° 1501 Ьо- ЧГ :Р д ^ 0

т г * Л /ч '.У II В" "к <г

* п ЛЛ

и 0 3 5 7 '1 15

сутки

Рис 4. % апоптотических (а) и некротических (б) клеток у всех обследованных с ТСТ (п=22) и в контрольной группе. *-р<0,01 по сравнению с контрольной группой; ** — р<0,001 по сравнению с контрольной группой; #-р<0,05 по сравнению с исходными данными.

При поступлении в 1-й группе наблюдается наибольшее количество некротических «ДНК-комет» (12,7±14,7%), данный показатель статистически значимо отличается от показателя в группе выживших (3,9±3,9%) (табл. 3). В последующие сутки наблюдается несущественное снижение уровня некротических «ДНК-комет» в 1-й группе. В группе выживших наблюдается постепенный рост данного показателя и на 3-й сутки его значения (7,3±4,5%) статистически значимо отличаются от исходных данных (табл. 3). Наибольший уровень некротических «ДНК-комет» в группе 2Б был отмечен на 5-е сутки (9,2±7,9%). Затем количество некротических «ДНК-комет» постепенно снижается на 7-е и 15-е сутки (7,5±6,1 и 4,5+3,8%, соответственно) (табл. 3).

Таблица 3

Процент некротических клеток у больных с ТСТ, {М£$В)

Показатель Группа Значения показателя, сутки

1 3 5 7 15

1 12,7+14,7 10,6+4,0 9,6+3,8 7,7±4,2 6,9

% ДНК некротических (п=2) («=5) (п=2) (и=3) (и=1)

клеток 2 3,9+3,9Л 7,3+4,5* 9,2±7,9 7,5+6,1 4,5+3,8

(и=16) ("=12) (*=8) (п=3) (я=5)

Примечание. * - статистически значимое отличие от исходных данных, Л - статистически значимое отличие от данных 1 группы.

У всех обследованных больных ТСТ показатель апоптотических «ДНК-комет» на всех этапах обследования статистически значимо отличался от показателя контрольной группы (рис. 4а). При поступлении показатель «ДНК-комет» апоптотических клеток для всех обследованных после ТСТ составил 4,7±9,2%. На 3-й сутки наблюдается максимальное значение данного показателя за весь период наблюдения (6,9±7,7%), что статистически значимо выше данных при поступлении. С 5-х суток начинается постепенное поэтапное уменьшение количества апоптотических клеток в крови пострадавших и в конце второй недели у всех пострадавших данный показатель составил 2,3±1,1%, что в 2 раза меньше данных при поступлении и в 3 раза выше контрольных значений (рис. 4а).

Количество «ДНК-комет» апоптотических клеток при поступлении в 1-й группе составило 3,1+0,4%, затем наблюдается рост данного показателя более чем в 2 раза на 3-й сутки (7,1±6,3%), с сохранением последующих высоких значений на 5-е сутки (7,7±8,5%). Затем наблюдается снижение показателя апоптотических «ДНК-комет» до 5,7±4,4% на 7-е сутки.

В группе 2Б при поступлении уровень «ДНК-комет» апоптотических клеток составил 4,9±9,8%, что в 7 раз превышает показатель контрольной группы. Далее на 3-й сутки продолжается рост данного показателя на 27% (6,7±8,4%). После 3-х суток начинается падение уровня апоптотических «ДНК-комет», достигнув к концу 2-й недели значения 2,4+1,1%. Начиная с 1-х суток, у пострадавших группы 2Б значительно возрастает содержание некротических и апоптотических «ДНК-комет», достигая максимального значения на 3-й и 5-е сутки и постепенно снижаясь к 15-м суткам наблюдения.

При этом стоит отметить, что на 15-е сутки, для всех обследованных, среднее содержание некротических (4,9±1,5%) и апоптотических клеток (2,3±0,5%) оставалось статистически значимо выше по сравнению с показателями для здоровых доноров (рис. 4).

У 8-и пострадавших (2 умерших и 6 выживших) преимущественно на 3-й и/или 5-е сутки наблюдали диффузно распределенную высокофрагмен-тированную ДНК, что может быть связанно с массивной клеточной гибелью (рис. 5).

Таким образом, установлено, что при тяжелой сочетанной травме наблюдается увеличение повреждений ДНК, а также усиление процессов гибели клеток в крови. Совокупный анализ данных указывает на то, что наиболее значимые изменения показателей ДНК-повреждений, некроза и апоптоза клеток в крови при ТСТ определяются на З-и-5-е сутки.

Рис. 5. «ДНК-кометы»: высокофрагментированная ДНК больного Д. с ТСТ.

Статистический анализ данных выявил корреляции между показателем ДНК-повреждений и содержанием некротических клеток на 1-е и 3-й сутки и процентом апоптотических клеток на 7-е сутки, что свидетельствует о взаимосвязи между ДНК-повреждениями и процессами некроза и апоптоза (табл.

4).

Таблица 4

Корреляция между показателем ДНК-повреждений и содержанием некротических и апоптотических клеток

Показатели %ДНК повреждений % апоптотических клеток

% некротических клеток г8=0,50 (1 сутки), г8=0,69 (3 сутки) -

%ДНК повреждений - г8=0,65 (7 сутки)

Свободно-радикальные процессы у больных с тяжелой сочетанной травмой. Содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в контрольной группе составило - 1,6+0,4 отн. ед. В 1-й группе значение этого показателя при поступлении больного в стационар было 1,7+0,4, а во 2-й - 1,6+0,4 отн. ед, что не выходило за пределы нормы. В 1-й группе отмечается увеличение суммарного показателя свободно-радикальных процессов с выходом за пределы нормальных значений (>2 отн.ед) на 5-е и 7-е сутки (2,3±0,2 и 2,5±0,1 отн.ед, соответственно). Тенденция к увеличению показателя на 7-й (1,8±0,4 отн. ед) день наблюдения отмечается и у выживших больных.

У здоровых доноров показатель общего антиокислительного статуса составил 1,33+0,25 отн. ед. Общий антиокислительный статус при поступле-

нии у выживших и умерших больных был ниже нормальных значений и составил 0,82+0,23 и 0,93+0,17 отн. ед, соответственно (рис. 6). Таким образом, антиокислительная система организма больных уже на начальном этапе заболевания не в состоянии адекватно противостоять модифицирующему действию АФК на биоструктуры, что проявляется уже в первые часы после травмы окислительным повреждением ДНК. Общий антиокислительный статус имел тенденцию к снижению в процессе наблюдения в обеих группах: до 0,61+0,11 отн. ед в 1-й и 0,58+0,18 отн. ед во 2Б группах пострадавших на 15-е сутки наблюдения (рис. 6), что свидетельствует о необходимости проведения дополнительной более эффективной антиоксидантной терапии.

1

отн.ед

0,8

0,6

0,4

3 5 7 15 сутки —Ф— умершие выжившие

Рис. 6. Динамика общего антиокислительного статуса у больных с ТСТ. * - р<0,05 по сравнению с исходными данными.

Липидный профиль в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы. У всех больных показатели концентрации ТГ и ХС ЛПОНП на этапах исследования находились в пределах нормальных значений.

Значение общего холестерина у больных 1-й группы при поступлении в реанимационное отделение 2,68±1,02 ммоль/л (табл. 5). Дефицит общего ХС у больных 1 группы в первые сутки от момента травмы в среднем составил 31%. В первые две недели после травмы отмечается некоторое увеличение концентрации общего холестерина, но все же показатель остается ниже нормы.

У больных 2-й группы в течение первой недели после травмы показатель концентрации общего холестерина во всей группе был ниже нормальных значений и имел тенденцию к постепенному увеличению. При этом в группе больных средней степени тяжести эта тенденция была более выражена, чем в подгруппе 2Б и к концу первой недели наблюдения достигала нормальных значений. В группе тяжелых выживших больных уровень общего

холестерина достигал нормального значения только к концу второй недели после травмы.

У больных 2А подгруппы уровень общего ХС нарастает к 15-м суткам до 4,42±0,85 ммоль/л. Показатели общего ХС больных данной подгруппы статистически значимо отличались от аналогичных показателей 1-й группы на 1-е, 3-й, 7-е и 15-е сутки (табл. 5).

У больных 2Б подгруппы исходная концентрация общего ХС была 3,21 ±1,43 ммоль/л и статистически значимо отличалась от исходного уровня на 15-е сутки (4,44±0,85 ммоль/л). Показатели общего ХС больных данной подгруппы статистически значимо отличались от аналогичных показателей 1-й группы на 1-е и 15-е сутки (табл. 5).

Нормализация уровня холестерина в крови выживших больных свидетельствует о нормальном функционировании гепатоцитов, в которых синтезируется большая часть холестерина плазмы, особенно в период недостаточного его поступления в организм из вне. О нормальной синтетической функции печени больных с ТСТ свидетельствует так же восстановление к 15-м суткам уровня белка в плазме крови выживших больных.

Среднестатистическое значение ХС ЛПНП в 1-й группе при поступлении в реанимационное отделение было 1,46+0,42 ммоль/л (табл. 5). К 3-м и 5-м суткам отмечается увеличение содержания ХС ЛПНП до нормальных значений (1,95±1,20 и 1,92±0,68 ммоль/л, соответственно), что можно объяснить попыткой травмированного организма увеличить доставку холестерина от печени с помощью ХС ЛПНП к поврежденным тканям и клеткам для их репарации. Выявленное снижение уровня ХС ЛПНП к 7-му дню наблюдения до 1,66±0,66 ммоль/л, возможно обусловлено истощением компенсаторных возможностей организма, связанных с тяжестью травмы. Увеличение общего холестерина с 2,70±0,63 ммоль/л на 7-е сутки до 3,76±1,81 ммоль/л на 15-е сутки при одновременном повышении ХС ЛПНП к 15-м суткам до 3,08±1,45 ммоль/л остается неясным. Отмеченное к 15-м суткам наблюдения увеличение общего холестерина и ХС ЛПНП в группе умерших больных, скорее всего, свидетельствует о том, что в этот период, несмотря на стремление организма увеличить доставку холестерина к клеткам и тканям, последние по каким-то причинам не способны встраивать его в клеточные мембраны. Одной из возможных причин может быть нарастание процессов апоптоза и некроза в терминальной стадии заболевания у пострадавших. ТСТ сопровождается повреждением органов, тканей и клеток, для восстановления целостности которых необходимы энергия и структурные компоненты (фосфолипиды, ХС, белки). Доставку холестерина к клеткам, тканям и органам осуществляют в организме ЛПНП. Содержание ХС ЛПНП в группе умерших к концу первой недели после травмы было ниже нормальных значений, в то время как у выживших больных значения этого показателя были в пределах нормы на всех этапах исследования.

Таблица 5

Содержание холестерина и триглицеридов в плазме крови больных с ТСТ, (М±8Э)

Показатель Нормальные значения Группы Значение показателей на этапах исследованиях, сутки

1 3 5 7 15 Перед смертью

Общий холестерин, ммоль/л 3,9-5,2 1 2,68±1,02 (и=7) 3,03±1,43 (я=9) 2,98±0,*78 (я=7) 2,70±0,63 («=6) 3,76±1,81 (я=2) 2,58±1,37 (и=9)

2 3,35±1,52 (я=67) 3,33±1,04(я=67) 3,45+1,33 (и=57) 3,80±1,43 (я=53) 4,43+1,49 («=46) -

2А 3,51±1,62л (и—32) 3,68±0,96*"л(я=31) 3,61±1;54(я=21) 4,02±1,08л(я=18) 4,42±0,85л («=13) -

2Б 3,21 ±1,43* (я=3 5) 3,02±1,02*(я=36) 3,35±1,19(«=36) 3,69+1,59 (я=35) 4,44±1,68**"л(«=33) -

Холестерин лпвп, ммоль/л 0,78-2,2 1 0,54±0,54 (я=7) 0,46±0,52 (я=9) 0,29+0,23 (я=7) 0,29±0,39 (я=6) 0,14±0,10 (я=2) 0,15±0,12(я=9)

2 0,51±0,32 (я=67) 0,50±0,29 (л=67) 0,45±0,28 (я=57) 0,45±0,28 (я=53) 0,58±0,44 (и=46) -

2А 0,53+0,36 (я=32) 0,56+0,31 (и=31) 039+0,25** («=21) 0,43+0,27 (я=18) 0,47+0,22 (я=13) -

2Б 0,50±0,29 (и=35) 0,45±0,26 (я=36) 0,49±0,29 (я=36) 0,46±0,29 («=35) 0,62±0,49 (и=33) -

Холестерин ЛПНП, ммоль/л 1,68-4,53 1 1,46+0,42 (и=7) 1,95±1,20(я=9) 1,92±0,68 (я=7) 1,66±0,66 (я=6) 3,08±1,45 (я=2) 1,65±1,37(я=9)

2 2,36±1,24(я=67) 2,26±0.89 («=67) 2,39±1,19(«=57) 2,74±1,30 (я=53) 3,17+1,14 (я=46) -

2А 2,48±1,33 («=32) 2,56±0,94*"л(«=31) 2,55±1,49(я=21) 2,30±0,97А(«=18) 3,17±0,75л(«=13) -

2Б 2,26±1,16(«=35) 2,03+0,79* (я=36) 2,30±0,99 (я=36) 3,00±1,44 (н=35) 3,17±1,27**"л(я=33) -

Холестерин лпонп, ммоль/л 0,20-0,83 1 0,68±0,33 (я=7) 0,62+0,18 (я=9) 0,76±0,27 (я=7) 0,75+0,27 (и=6) 0,57±0,26 (я=2) 0,78±0,21 (я=9)

2 0,45±0.28 («=67) 0,54±0,25 («=67) 0,60+0,32 (я=57) 0,61 ±0,28 (я=53) 0,69+0,35 (я=46) -

2А 0,45±0,28 (и=32) 0,53±0,23 («=31) 0,66+0,34 (я=21) 0,63±0,23 («=18) 0,77+0,41 («=13) -

2Б 0,44±0,28 (я=35) 0,55±0,26 (п=36) 0,56±0,30 (я=36) 0,61±0,30** («=35) 0,66±0,32** («=33) -

тгл, ммоль/л 0,45-1,82 1 1,49±0,72 (я=7) 1,36±0,39 (п=9) 1,66±0,60 (я=7) 1,65+0,60 (я=6) 1,26±0,56 («=2) 1,73±0,46 (я=9)

2 0,98±0,61 («=67) 1,19±0,55 (я=67) 1,31 ±0,69 (я=57) 1,35±0,61 (и=53) 1,52±0,77 («=46) -

2А 0,99+0,63л (н=32) 1,16±0,51 (и=31) 1,45±0,75 (я=21) 1,38±0,50 (я=18) 1,70±0,92 (и=13) -

2Б 0,97±0,61л («-35) 1,20±0,58 (я=36) 1,23±0,66 («=36) 1,34±0,67** (я=35) 1,45+0,71** («=33) -

Примечание. * - статистически значимое отличие между данными подгрупп А и Б группы 2, ** - статистически значимое отличие от исходных данных, л — статистически значимое отличие от данных 1 группы.

Во 2А подгруппе ХС ЛПНП был статистически значимо выше показателей 1-й группы на 3-й, 7-е и 15-е сутки (табл. 5). На 15-е сутки холестерин ЛПНП во 2А и 2Б подгруппах составил 3,17±0,75 и 3,17±1,27 ммоль/л соответственно, статистически значимо отличаясь от показателей 1-й группы у больных перед смертью (1,65+1,37 ммоль/л) и исходных показателей 2Б подгруппы (2,26+1,16 ммоль/л).

Полученные данные позволяют предположить, что значение ХС ЛПНП ниже 2,0 ммоль/л в течение первой недели после травмы, сопровождаемое низким (менее 3,2 ммоль/л) уровнем общего ХС, является прогностически неблагоприятным биохимическим признаком, свидетельствующем о недостаточном количестве ХС для репаративных процессов в клетках и тканях.

Изменения со стороны ХС ЛПВП в 1-й группе характеризовались низким его содержанием в плазме на всем протяжении наблюдения за пострадавшими. Отмечена динамика снижения показателя на каждом последующем этапе наблюдения за больными этой группы. Особенно заметное снижение показателя отмечалось у больных перед смертью (0,15±0,12 ммоль/л). Среднестатистический показатель ХС ЛПВП во 2-й группе при поступлении был почти на треть меньше значения нижней границы нормы. Динамика показателя ХС ЛПВП в первые две недели наблюдения за больными этой группы свидетельствует о его стабильности. Снижение транспорта ХС ЛПВП в посттравматическом периоде обусловлено скорее всего повышением репаративных процессов и необходимостью восстановления целостности клеточных мембран.

Биохимические показатели в первые две недели после тяжелой со-четанной травмы. У всех обследованных на всех этапах исследования наблюдалась гипопротеинемия. При поступлении активность ГГТ в 1-й группе была более чем в 2 раза выше нормальных значений. Во 2-й группе активность данного фермента была в пределах нормальных значений и статистически достоверно отличалась от показателя в 1-й группе. Динамика содержания общего белка и активности ГГТ фермента на этапах обследования имела тенденцию к увеличению у выживших больных и к снижению в группе умерших.

Концентрация мочевины, креатинина, общего билирубина в течение всего времени наблюдения за выжившими больными находилась в пределах физиологической нормы. В группе умерших данные показатели были также в пределах нормы с некоторым снижением содержания креатинина па 15-е сутки.

Среди ряда метаболических нарушений, выявленных в остром посттравматическом периоде, в 1-й группе обнаружено повышение активности ACT на 1-е (72,33±26,05 ед/л), 3-й (74,55±58,99 ед/л) и 5-е (52,43±29,98 ед/л) сутки. У умерших больных значительное повышение активности ACT наблюдалось на всех этапах исследования. При поступлении активность ACT во 2А подгруппе составила 109,74±149,47 ед/л, а во 2Б - 108,05±96,58 ед/л. В

последствии во 2А подгруппе наблюдалось постепенное статистически значимое снижение активности данного фермента по отношению к исходным показателям на 5-е (51,27+28,74 ед/л), 7-е (44,95+21,25 ед/л) и 15 (43,38±20,29 ед/л) сутки. Активность АСТ во 2Б подгруппе после первоначального роста на 3-й сутки, в дальнейшем так же характеризовалась постепенным статистически значимым снижением 5-е (71,83±55,54 ед/л), 7-е (56,14±45,33 ед/л) и 15-е (49,64+43,34 ед/л) сутки. Значительное повышение активности АСТ в 1-е сутки после травмы в группе выживших больных по-видимому, обусловлено гипоксическим и травматическим повреждением тканей и связанным с ним нарушением целостности цитоплазматических мембран. Значимое повышение активности фермента обусловлено так же активацией реакций переаминирования аминокислот, подвергшихся катаболизму в результате травмы. Активация аспартатаминотрапсферазы в первые дни после травмы приводит к чрезмерному образованию L-глутамата, который является единственной аминокислотой, которая может с существенной скоростью подвергаться окислительному дезаминированию, направляя азот для синтеза мочевины.

Таким образом, при чрезмерном катаболизме аминокислот (из травматически разрушенных клеток и тканей) под воздействием фермента АСТ образуется L-глутамат. Последний подвергается окислительному дезаминированию с последующим вовлечением аминного азота в синтез мочевины. Падение активности АСТ в группе выживших больных к концу второй недели наблюдения свидетельствует, прежде всего, об уменьшении процессов катаболизма аминокислот, связанного с травмой, а так же о восстановлении целостности цитоплазматических мембран.

Показатели активности AJIT находятся в пределах нормальных значений в обеих группах, что может свидетельствовать о сохранности целостности клеточных мембран гепатоцитов, так как самых больших значений активность AJIT достигает в печени, и, соответственно, при повреждении печени в первую очередь и наиболее значительно по сравнению с АСТ изменяется активность АЛТ.

С учетом динамики активности сывороточных АСТ и АЛТ для выявления причин ферментемии был рассчитан коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ, de Ritis coefficient), в норме равный 1,33. Высокие значения коэффициента де Ритиса при поступлении (1-я группа - 5,63±5,50, 2-я группа - 6,76±9,00), с одновременным повышением уровня активности АСТ, по-видимому, свидетельствуют преимущественно о внепеченочном цитолизе, связанном с травмой, кровопотерей и гипоксией. В группе выживших больных отмечается снижение коэффициента де Ритиса в процессе наблюдения (табл. 6). В группе умерших больных отмечаются стабильно высокие значения коэффициента на всех этапах исследования. Стабильно высокие значения коэффициента де Ритиса в 1-й группе больных могут быть связанны как с тяжестью травмы, так и с нарастанием процессов апоптоза на фоне некротического повреждения тканей. Значения коэффициента на 7-е и 15-е сутки во 2-й группе

(2,59+1,94 и 2,67+2,67, соответственно) уменьшались и статистически значимо отличались от повышенных исходных значений, что может косвенным образом свидетельствовать об уменьшении некротических и апоптотических процессов в травмированном организме.

Таблица 6

Коэффициент де Ритиса у больных с ТСТ, (М±БВ)

Группа Значения показателей на этапах исследования, сутки

1 3 5 7 15 Перед смертью

1 5,63±5,50 5,38±4,77 4,01+4,59 5,32+5,83' 9,75+0,35* 5,21±5,01

2 6,76+9,00 5,60±7,92 4,07±4,63 2,59+1,94*'" 2,67±2,67''" -

Примечание. * - статистически значимое отличие между 1-й и 2-й группами; ** - ста-

тистически значимое отличие от исходных данных.

Исходная активность ЩФ у всех обследованных была в пределах нормальных значений, но прогрессивно увеличивалась в динамике, с выходом за пределы нормальных значений. Рост активности ЩФ в течение первых двух недель после травмы, по-видимому, связан с повышенной потребностью организма в фосфоре, необходимого как для регенерации посттравматических повреждений костной ткани, так и для биосинтеза фосфолипидов, которые активно используются для репаративных процессов клеточных мембран поврежденных тканей и органов в эти сроки.

Лшшдный профиль, биохимические показатели крови и показатели центральной гемодинамики в отдаленном периоде тяжелой сочетанной травмы. Обследование 13 пострадавших через 1-5 лет после полученной травмы установило, что значения общего ХС, ТГ, ХС ЛПНП, активность АЛТ, ACT и коэффициент де Ритиса соответствовали нормальному уровню. Среднестатистическое значение ХС ЛПВП было на нижней границе нормы (0,75+0,44 ммоль/л). Уровень активности ЩФ оставался повышенным и составил в среднем 144,8+44,9 ед/л.

В группе обследованных, перенесших ТСТ, в отдаленном периоде сердечный индекс, сердечный выброс, ударный индекс, ударный объем крови, диаметр артерий, скорость кровотока, общее и удельное периферическое сопротивление было в пределах нормы (табл. 7). В то время как значение податливости артериальной стенки в группе перенесших ТСТ составило 0,05+0,01 мл/мм рт. ст., что на 65% ниже показателей контрольной группы. Наряду с этим, у пострадавших отмечалось увеличение скорости распространения пульсовой волны до 902+380 см/сек, что на 30% выше контрольных значений.

Таблица 7

Показатели центральной гемодинамики у больных перенесших ТСТ, (М±т)

Показатель Группа

основная(и=13) сравнения (л=10)

Сердечный индекс, л/(мин*кв.м) 3,17±0,43 2,75±0,36

Сердечный выброс, л/мин 5,8±0,9 5,3±0,6

Ударный индекс, мл/кв.м 45,0±8,1 40,0±5,6

Ударный объем, мл 83,2±13,8 72,7±9,6

Диаметр артерий, см 0,47±0,05 0,45±0,08

Скорость кровотока линейная, см/сек 37,8±8,2 55,7±14,0

Общее периферическое сопротивление, усл.ед. 1360±242 1256Ы42

Удельное периферическое сопротивление, дин*см-5* с 31,6±5,7 25,7±0,9

Податливость артериальной стенки, мм/мм рт. ст 0,05±0,01* 0,14±0,06

Скорость распространения пульсовой волны, см/сек 902±380 636±85

Примечание. * - статистически значимое отличие между группами.

Выявленные отклонения показателей податливости артериальной стенки и скорости распространения пульсовой волны свидетельствуют об изменениях эластических свойств артериальной стенки, вероятно, обусловленной перенесенной ТСТ. Возможно, эти изменения являются последствиями повреждающего действия избыточных количеств активных форм кислорода в раннем постгравматическом периоде на морфологические элементы сосудистой стенки.

Таким образом, проведенные исследования позволили нам выявить новые механизмы развития посттравматических изменений при изучении повреждений в ДНК клеток крови, вариантов клеточной гибели и ряда биохимических показателей у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой. В патогенезе ТСТ имеет место увеличение количества ДНК-повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели - некрозом и апоптозом, а так же дисбаланс про-/антиокислительной системы. Общее состояние здоровья выживших больных в отдаленном посттравматическом периоде расценивалось как удовлетворительное. В отдаленном периоде после ТСТ наблюдается нормализация биохимических показателей и обнаружено уменьшение эластических свойств артериальной стенки.

выводы

1. В первые две недели после тяжелой сочетанной травмы наблюдается увеличение процессов ДНК-повреждений более чем в 2 раза, апоптоза более чем в 7 раз и появляются ДНК-повреждения, связанные с некрозом клеток. Максимальные значения, связанные с повреждением ДНК, некрозом и апоп-тозом клеток в крови при тяжелой сочетанной травме определяются на 3-5-е сутки.

2. Выявлена корреляция между показателем % ДНК-повреждений и содержанием некротических клеток (г8=0,50) в 1-е сутки после травмы и процентом апоптотических клеток (г8=0,69) на 7-е сутки. Установленная корреляция указывает на то, что ДНК-повреждения в 1-3 сутки обусловлены процессами некроза, к концу недели после травмы - процессами апоптоза, к концу второй недели изменения показателя ДНК-повреждений, вероятнее всего, обусловлены активными репаративными процессами в клетках и тканях, связанными с восстановлением после травмы.

3. В группе выживших больных уровень 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина - суммарного показателя свободно-радикальных повреждений нуклеиновых кислот - колеблется на всех этапах наблюдения в пределах нормальных значений (1,4-1,8 отн. ед). В группе умерших больных на 5-е и 7-е сутки наблюдения отмечается увеличение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина до 2,3+0,2 и 2,5±0,8 отн. ед, что превышает нормальные значения.

4. Общий антиокислительный статус у больных с тяжелой сочетанной травмой при поступлении в реаниматологическое отделение снижен на 33% по сравнению с контрольной группой. В первые две недели после травмы наблюдается дальнейшее снижение данного показателя еще на 22-24% как в группе выживших, так и в группе умерших больных, что свидетельствует о необходимости проведения исследований по изучению коррекции антиокислительного статуса.

5. Значение холестерина липопротеинов низкой плотности ниже 2,0 ммоль/л в течение первой недели после травмы, сопровождаемое низким (менее 3,2 ммоль/л) уровнем общего холестерина в группе умерших больных свидетельствует о недостаточном количестве холестерина в организме этих больных для репаративных процессов в клетках и тканях после травмы.

6. Динамика активности аспартатаминотрансферазы и коэффициента де Ритиса в группе умерших больных свидетельствует об усиленном катаболизме аминокислот, следствием чего является снижение пластических репаративных процессов в организме пострадавшего.

7. В отдаленном периоде (1-5 лет) у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы отмечается нормализация биохимических показателей.

8. Результаты исследования эластических свойств артериальной стенки свидетельствуют об увеличении жесткости сосудов в отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы с нарушением гемодинамики.

Практические рекомендации

1. Усиление ДНК-повреждений, связанных с действием активных форм кислорода и снижение общего антиокислительного статуса в первые часы после травмы с отрицательной динамикой в последствии, требует разработки и подбора антиоксидантных препаратов, способных восстанавливать баланс про-/антиокислительной системы организма.

2. Значение холестерина липопротеинов низкой плотности ниже 2,0 ммоль/л в течение первой недели после травмы, сопровождаемое низким (менее 3,2 ммоль/л) уровнем общего холестерина требует проведения мероприятий, направленных на восстановление липидного профиля, необходимого для обеспечения адекватных репаративных процессов в организме.

3. Пострадавшие после тяжелой сочетанной травмы нуждаются в диспансерном наблюдении в связи с выявленным у них уменьшением эластических свойств артериальной стенки в отдаленном (1-5 лет) после травмы периоде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мороз В.В., Молчанова JI.B., Муравьева М.Ю., Марченков Ю.В., Ре-шетняк В.И. Дислипидемия в отдаленном периоде после тяжёлой механической травмы // Вестн. интенс. терапии. Приложение к №5 Стандарты и индивидуальные подходы в анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии. - 2006. - С. 64-65.

2. Мороз В.В., Муравьева М.Ю., Марченков Ю.В., Решетняк В.И. Эластические свойства артериальной стенки в отдаленном периоде тяжёлой механической травмы // Вестн. интенс. терапии. Приложение к №5 Стандарты и индивидуальные подходы в анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии. - 2006. - С. 65-66.

3. Muravieva M.U., Moroz V.V., Molchanova L.V., Marchenkov U.V. Re-shetnyak V.l. Cholesterol and Elastic Properties of Arterial Wall in Patients with Severe Multiple Trauma. Abstracts of 19th Annual Congress European Society of Intensive Care Medicine (ESICM-2006). Barcelona, Spain; A-1107, 24-27 September 2006:S285.

4. Мороз B.B., Молчанова JI.B., Муравьева М.Ю., Марченков Ю.В., Решетняк В.И. Нарушения липидного обмена после тяжелой механической травмы // Общая реаниматология. - 2006. - N 5-6. - С. 40-43.

5. Жанатаев А.К., Муравьева М.Ю., Мороз В.В., Дурнев А.Д., Решетняк В.И. ДНК-повреждения и клеточная гибель при тяжелой сочетанной травме. Сб. трудов всероссийской научно-практической конференции «Экстренная медицинская помощь при чрезвычайных ситуациях техногенного характера в крупном промышленном центре». - Новокузнецк. - 2007. С. 131-135.

6. Муравьева М.Ю., Жанатаев А.К., Мороз В.В., Дурнев А.Д., Решетняк В.И. Антиокислительный статус и липидный обмен у больных с тяжелой механической травмой. Сб. трудов всероссийской научно-практической конференции «Экстренная медицинская помощь при чрезвычайных ситуа-

циях техногенного характера в крупном промышленном центре». - Новокузнецк. - 2007. - С. 135-140.

7. Мороз В.В., Жанатаев А.К., Муравьева М.Ю., Марченков Ю.В., Ре-шетняк В.И., Дурнев А.Д. Обмен холестерина, ДНК-повреждения, апоптоз и некроз клеток в крови при тяжелой сочетанной травме Общая реаниматология. - 2008. - N 1. - С. 7-11.

8. Zhanataev А.К., Moroz V.V., Durnev A.D, Muravieva M.Yu., Reshetnyak V.I. DNA damage and cell death in blood cells in patients with severe multiple trauma. Abstracts of 14th World Congress of Anesthesiology (WCA-2008) / Cape Town, South Africa, 02-07 march 2008 (electronics).

9. Muravieva M.Yu., Zhanataev A.K., Moroz V.V., Durnev A.D, Reshetnyak V.I. Total antioxidant status and lipid metabolism in patients with severe multiple trauma. Abstracts of 28th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine (ISICEM-2008), Brussels, Belgium, 18-21 march 2008. Critical Care 2008, 12 (Suppl 2): P199 (doi: 10.1186/cc6420).

Ю. Мороз B.B., Жанатаев A.K., Муравьева М.Ю., Дурнев А.Д., Решетняк В.И. ДНК-повреждения, апоптоз и некроз при тяжёлой сочетанной травме. Материалы IX сессии МНОАР, Голицыно, 28 марта 2008. - С. 27-28.

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

AJIT - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза АФК - активные формы кислорода ГГТ - гамма-глютамилтрансфераза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЛП - липопротеиды

ЛГГВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПОН - полиорганная недостаточность

ТГ - триглицериды

ТСТ - тяжёлая сочетанная травма

ХС - холестерин

ЩФ - щелочная фосфатаза

В.А. Неговский

Актуальность темы.

Одной из важнейших проблем современной реаниматологии является исследование механизмов развития критических, терминальных и постреанимационных состояний на органном, клеточном и молекулярном уровнях [46, 53]. В структуре летальности механические повреждения различной этиологии занимают в настоящее время третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Тяжелая сочетанная травма (ТСТ) является ведущей причиной гибели лиц молодого — 18-45 лет — работоспособного возраста, что обуславливает социальную значимость этой проблемы [16, 77, 78].

Тяжелая сочетанная травма сопровождается развитием декомпенсации систем жизнеобеспечения организма, возникающего в результате комплексного влияния факторов повреждения: кровопотери, гипоксии, токсемии, боли, нарушения специфической функции жизненно важных органов. Доминирующими из этих факторов являются кровопотеря и гипоксия [57]. При несвоевременном оказании интенсивной помощи тяжесть состояния больного усугубляется развитием шока, который характеризуется общими гемодинамическими, гемореологическими и метаболическими расстройствами. Известно, что ТСТ приводит к нарушению практически всех видов обмена веществ [10]. Вместе с тем, состояние обмена холестерина и его транспортной системы - липопротеидов, в разные периоды течения ТСТ до сих пор остается малоизученным. Имеются лишь единичные данные о возможности формирования дислипидемии у таких больных [б, 32, 35, 47]. Одной из важных причин нарушения метаболизма возможно считаются структурно-функциональные изменения клеток, происходящие в условиях нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами.

Свободнорадикальные процессы, ведущие к структурно-функциональным нарушениям в органах и тканях, могут быть запускающими механизмами патологических процессов при критических состояниях [52]. Нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами в результате полученной травмы происходят за счет избыточной генерации активных форм кислорода (АФК) в условиях гипоксии вследствие блокады электронно-транспортной цепи митохондрий [122, 138]. АФК исходно являются продуктами нормального клеточного метаболизма. При патологических состояниях их генерация значительно увеличивается и не компенсируется антиоксидантной системой защиты, в результате чего АФК вызывают выраженные цитотоксические эффекты. Поскольку период жизни АФК слишком мал, то оценить уровень их продукции в клинических условиях практически невозможно. Поэтому определение увеличения продукции АФК осуществляют косвенным путем - по содержанию ряда метаболитов, образующихся в результате окислительной модификации липидов, белков и нуклеиновых кислот [61, 65]. Повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), вызываемые АФК, включают однонитевые и/или двунитевые разрывы цепей ДНК, модификацию азотистых оснований и др. Ранее было показано, что из четырех оснований, входящих в структуру ДНК, гуанин является наиболее окисляемым [108]. Продуктом его окисления, в результате воздействия АФК, является 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, который можно определить в различных биологических тканях и жидкостях [22]. Количественное определение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина предложено использовать в качестве одного из маркеров свободнорадикальных процессов, происходящих в организме в норме и при развитии патологического процесса. Определение ДНК-повреждений в качестве биологического индикатора свободнорадикальных процессов может иметь существенное значение для раскрытия механизмов развития патологического процесса и при мониторинге терапии, а так же для оценки прогноза заболевания.

На сегодняшний день нет четких представлений о ДНК-повреждениях при критических состояниях и, в частности, при тяжелой сочетанной травме [28, 127, 135, 160]. Повреждающему действию АФК на клеточные структуры в организме противостоит сложная многокомпонентная антиокислительная система. С помощью этой системы обеспечивается поддержание про/антиокислительного баланса. Природными антиокидантами, участвующими в метаболических процессах в норме, являются низкомолекулярные соединения - убихинон, витамин С, токоферол (витамин Е) и др. Известны также многочисленные синтетические антиоксиданты. Эти вещества являются представителями разных классов химических соединений, в связи с чем разнообразны и механизмы их антиоксидантного действия. Снижение уровня антиоксидантной защиты у пациентов в критических состояниях описано многими авторами [88, 121, 166]. При этом вопрос о необходимости ее усиления с помощью экзогенных антиоксидантов остается нерешенным [145, 155].

Цель работы

Выявить новые механизмы развития посттравматических изменений путем исследования повреждения ДНК, апоптоза, некроза и ряда биохимических показателей у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой.

Задачи исследования:

1. Оценить динамику ДНК-повреждений, апоптоза и некроза клеток крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

2. Исследовать динамику содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина клеток крови и общего антиокислительного статуса у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

3. Выявить динамику биохимических показателей и липопротеинов крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.

4. Определить уровень общего холестерина, холестерина липопротеинов и ряда биохимических показателей крови у лиц, перенесших тяжелую сочетанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.

5. Исследовать изменения эластических свойств стенки артериальных сосудов у пострадавших, перенесших тяжелую сочетанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.

Научная новизна

Впервые у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой доказано, что в патогенезе посттравматических процессов имеет значение выявленное увеличение количества ДНК-повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели - некрозом и апоптозом.

Показано в динамике изменение содержания суммарного показателя свободно-радикальных процессов - 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина - у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы, свидетельствующее о дисбалансе про-/антиокислительной системы в организме и о необходимости проведения исследований по изучению коррекции антиокислительного статуса.

Оценено состояние гемодинимических и биохимических показателей в отдаленном периоде у выживших больных. Впервые у пострадавших, перенесших травму с нарушением гемодинамики, в отдаленном посттравматическом периоде обнаружено уменьшение эластических свойств артериальной стенки путем оценки изменений ее податливости и скорости распространения пульсовой волны, что требует ежегодного диспансерного наблюдения за этими больными.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При тяжелой сочетанной травме наблюдается увеличение процессов ДНК повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели.

2. Выявлены различия в динамике изменений показателей обмена холестерина, свободно-радикальных процессов и ряда биохимических показателей (общего белка, активности гамма-глютамилтрансферазы, аспартатаминотрансферазы и коэффициента де Ритиса) в ранние сроки после травмы в группах выживших и умерших больных, часть из которых имеет прогностическое значение.

3. В отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы отмечается нормализация обмена холестерина и биохимических показателей.

4. Результаты исследования эластических свойств артериальной стенки свидетельствуют об увеличении жесткости сосудов в отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы с нарушением гемодинамики, как отдаленные неблагоприятные последствия тяжелой сочетанной травмы.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и материала исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 194 источника, из которых 79 отечественных и 115 иностранных.

8. Результаты исследования эластических свойств артериальной стенки свидетельствуют об увеличении жесткости сосудов в отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы с нарушением гемодинамики.

Практические рекомендации

1. Усиление ДНК-повреждений, связанных с действием активных форм кислорода и снижение общего антиокислительного статуса в первые часы после травмы с отрицательной динамикой в последствии, требует разработки и подбора антиоксидантных препаратов, способных восстанавливать баланс про-/антиокислительной системы организма.

2. Значение холестерина ЛПНП ниже 2,0 ммоль/л в течение первой недели после травмы, сопровождаемое низким (менее 3,2 ммоль/л) уровнем общего холестерина требует проведения мероприятий, направленных на восстановление липидного профиля, необходимого для обеспечения адекватных репаративных процессов в организме.

3. Пострадавшие после тяжелой сочетанной травмы нуждаются в диспансерном наблюдении в связи с выявленным у них уменьшением эластических свойств артериальной стенки в отдаленном после травмы периоде.