Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Патогенетическое и диагностическое значение нарушений кроветворения и иммунитета в развитии осложнений сочетанной травмы

На правах рукописи

МАЛЫШЕВ Михаил Евгеньевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ИММУНИТЕТА В РАЗВИТИИ ОСЛОЖНЕНИЙ СОЧЕТАННОЙ ТРАВМЫ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2014

2 4 АПР 2014

005547655

005547655

Работа выполнена в ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе»

Научные Багненко Сергей Федорович

консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Пивоварова Людмила Павловна доктор медицинских наук

Официальные Серебряная Наталья Борисовна оппоненты: доктор медицинских наук профессор

ГБОУ ВПО «Северо-Западный Государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» МЗ РФ, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики

Розанова Ольга Егоровна доктор биологических наук

ГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» ФМБА, ведущий научный сотрудник лаборатории иммуногематологии

Москалев Александр Витальевич

доктор медицинских наук профессор

ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.

Кирова» МО РФ, профессор кафедры микробиологии

Ведущая ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи

организация: имени Н.В. Склифосовского» Департамента здравоохранения города Москвы

Защита состоится «19» июня 2014 года в часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 197374, Санкт-Петербург, ул. Оптиков, д. 54. и на сайте http://www.arcerm.spb.ru

Автореферат разослан « « е t-iL_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сочетанная травма, сопровождающаяся развитием шока, является основной причиной смерти среди лиц работоспособного возраста (20-40 лет) (Багненко с соавт., 2010). Летальность при тяжелой сочетанной травме составляет от 10 до 40% (Гуманенко Е.К. с соавт.,2002; Апарцин К.А. с соавт., 2004; Савельев B.C., 2008; Martin G.S. et al., 2003). Основными причинами летальных исходов в постшоковом периоде являются тяжелые гнойные осложнения, в том числе сепсис, и тяжелый сепсис. Инфекционные осложнения тяжелых травм развиваются в среднем у 50-70 % пострадавших, а их частота определяется тяжестью повреждений и шока, степенью расстройств иммунитета (Селезнев С.А. с соавт., 2003; Рожков A.C. с соавт., 2005; Багненко С.Ф. с соавт., 2010; Martin G.S. et al., 2003).

При травматическом шоке средней и тяжелой степени у пострадавших можно наблюдать как признаки синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), так и признаки, характерные для сепсиса и тяжелого сепсиса в соответствии с классификацией, предложенной Bone R.S. (1992) и принятым протоколом по сепсису Калужской согласительной конференции (2004). ССВО рассматривается как ключевое звено развития сепсиса, шока различной этиологии и других критических состояний (в том числе и после травмы). Наиболее тяжелая сочетанная травма и шок, тяжелый сепсис ассоциированы с генерализацией воспаления и развитием полиорганной недостаточности (Faist Е., Angele М.К.,1999). В данном случае, очевидно, можно говорить о развитии системного воспаления, ассоциированного со стадийной активацией клеток (нейтрофилов, моноцитов, тканевых макрофагов, тучных клеток, лимфоцитов, тромбоцитов, эндотелиоцитов), секретирующих активные формы кислорода, цитокины, протеолитические ферменты, продукты активации арахидоновой кислоты и другие клеточные медиаторы (Гусев Е.Ю., Черешнев В.А., Юрченко Л.Н., 2007).

В первые часы и сутки после критического воздействия (механическая, ожоговая травма) изменения в иммунной системе носят срочный компенсаторный характер. В последующем, в зависимости от тяжести повреждения и исходной иммунной реактивности, происходит или компенсация изменений или дальнейшее развитие патологических процессов. Развитие иммуносупрессии обусловлено такими системными процессами как гипоксия, гипоперфузия, реперфузия, метаболические нарушения, оксидантный стресс, а при наиболее тяжелой травме и множественная недостаточность органов и тканей, что показано во многих исследованиях (Селезнев С.А., Багненко С.Ф., Шапот Ю.Б., 2004; Калинина Н.М. с соавт., 2005; Гуманенко Е.К., 2006; Vincent J.L., 2002; Brocher A.C., Toft P., 2009). Иммунорегуляторные центры головного мозга, костный мозг, вилочковая железа, селезенка, лимфатические узлы при геморрагическом шоке также находятся в режиме ограниченного кровоснабжения (Багненко С.Ф., Лапшин В.Н., Шах Б.Н., 2004; Raff G. et al., 1993), что существенно влияет на метаболизм клеточных элементов органов иммуногенеза и их функциональную активность.

Известно, что резервом восстановления клеточных популяций различных тканей и их функций является костный мозг. Реакция иммунной системы на повреждающие факторы травмы на первом этапе характеризуется активацией миграции клеток различных популяций из костного мозга в кровь и в очаг воспаления. Активация нейтрофильных гранулоцитов (НГ) крови как основных клеток неспецифической резистентности обеспечивает первую линию защиты от

эндогенной и экзогенной инфекции и развитие острой фазы воспаления (Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007). Таким образом, нарушения формирования воспаления и различных этапов фагоцитоза при сочетанной травме часто рассматривают как одну из наиболее важных причин развития инфекционных осложнений (Ayala А., Chung С., Grutkoski P.S., 2003). Нарушения функций нейтрофилов как основной популяции, обеспечивающей немедленную антибактериальную защиту, может быть обусловлено также и нарушением различных этапов гранулоцитопоэза в костном мозге при тяжелой травме.

Таким образом, изучение влияния факторов патогенеза сочетанной травмы, сопряженной с развитием шока средней или тяжелой степени, на количественный и качественный состав клеток иммунной системы как в крови, так и в костном мозге, и поиск нарушений в гемопоэзе необходимы для разработки новых способов ранней диагностики гнойных осложнений при травматической болезни.

Степень разработанности темы. Инфекционные осложнения при сочетанной травме и определяемая ими летальность в разные сроки постшокового периода, их прогнозирование и своевременная диагностика продолжают оставаться актуальной научной и клинической проблемой. Новые возможности в решении проблемы связаны с развитием клинической иммунологии и основаны на комплексном динамическом анализе общего состояния и результатов исследования иммунного статуса пострадавших в разные сроки после травмы. Особенности лечения больных с шокогенной сочетанной травмой определяют основное требование к методам прогнозирования осложнений - доступность и быстрота выполнения.

Попытки прогноза тяжести течения травматической болезни состояли в исследовании концентрации в крови различных цитокинов: IL-lß, IL-6, TNFa. Результаты прогноза в отдельных случаях были мало убедительными (Urbaschek R., 2001). В то же время другими исследователями были получены результаты, подтверждающие возможность прогнозирования развития острой респираторной недостаточности при травме и сепсисе на основании концентрации TNFa в сыворотке крови (Eichacker P,Q. et al., 2001), прогрессивного повышения концентраций IL-6, IL-8 и СЗа-компонента комплемента в крови (Pape Н.С. et al., 2003).

Однако, прогностическое значение иммунологических показателей у пострадавших с сочетанной травмой в ранние сроки после инцидента (1-3 сутки) для развития инфекционных осложнений и выживаемости больных чаще всего ставится под сомнение. Так, Kress H.A. с соавт. (2001) продемонстрировали, что показатели IL-lß и TNFa коррелируют с исходом тяжелой сочетанной травмы и риском развития сепсиса только в поздние сроки после травмы, а информативными являются тяжесть состояния по шкале ISS, уровень лактата в крови, парциальное напряжение кислорода и количество лейкоцитов крови в первые 2 дня после травмы.

Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена необходимостью поиска ранних маркёров развития гнойных осложнений при сочетанной травме на основе различных иммунологических критериев (концентрация медиаторов воспаления, изменение количественного состава и функциональных характеристик клеток крови и костного мозга), что будет способствовать своевременной диагностике сепсиса и тяжелого сепсиса у данной категории больных и началу адекватной терапии.

Цель исследования

Установить роль нарушений в системе кроветворения и иммунитета в развитии недостаточности противоинфекционной резистентности при сочетанной травме, сопровождающейся шоком, и обосновать алгоритмы ранней диагностики развития гнойных осложнений.

Задачи исследования:

1. Исследовать основные показатели содержания цитокинов, гормонов и медиаторов воспаления у пострадавших с сочетанной травмой в зависимости от тяжести травмы и шока и уровня развития воспаления.

2. Изучить состояние гемопоэза у пострадавших с сочетанной травмой на основе морфофункциональных характеристик ранних и коммитированных предшественников эритро-, миело- и лимфопоэза в костном мозге пострадавших.

3. Изучить состояние иммунитета и неспецифической резистентности на основе исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов крови при сочетанной травме

4. Оценить прогностическую значимость показателей костномозгового кроветворения и иммунитета для ранней диагностики сепсиса и тяжелого сепсиса у пациентов с сочетанной травмой.

Научная новизна

Доказана патогенетическая и диагностическая значимость изменений в системе гемопоэза для развития гнойных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой

Впервые установлено, что развитие системного воспаления у пострадавших с сочетанной травмой и шоком способствует нарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера и появлению в крови пострадавших маркера повреждений головного мозга - белка БЮОр, концентрация которого прямо коррелировала с концентрацией медиаторов острого воспаления (1Ь-6, 1Ь-10) в первые 12 часов от момента травмы.

Впервые показано, что у пострадавших с сочетанной травмой до 5 суток после травмы в костном мозге сохраняется нормальное или повышенное количество ранних предшественников гемопоэза при одновременном нарушении созревания клеток эритроидного и миелоидного ростков кроветворения (нормоцитов и миелоцитов), прямо ассоциированном с уровнем смешанной гипоксии.

Показано, что развитие анемии у пострадавших с сочетанной травмой связано со снижением количества полихроматофильных и оксифильных нормоцитов в костном мозге и одновременным усилением стресс-эритропоэза с повышенной генерацией ретикулоцитов из полихроматофильных нормоцитов и последующей миграцией их в кровоток.

Впервые установлен комплексный характер функциональной недостаточности нейтрофильных гранулоцитов пострадавших с сочетанной травмой при развитии гнойных осложнений, обусловленной истощением пула зрелых клеток гранулоцитарного ряда в костном мозге, мобилизацией в кровоток функционально незрелых клеток (дефензин - отрицательных гранулоцитов) и развитием оксидантного стресса.

Разработан и научно обоснован алгоритм проведения лабораторного обследования пациентов с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком, для раннего прогнозирования развития сепсиса и тяжелого сепсиса.

Теоретическая и практическая значимость работы

На основании проведенного исследования охарактеризован патогенез развития осложнений сочетанной травмы, заключающийся в одновременном нарушении костномозгового кроветворения и иммунитета в остром периоде травматической болезни.

Установлено, что ключевую роль в развитии гнойных осложнений при сочетанной травме играет недостаточность нейтрофильных гранулоцитов, связанная с повышением в крови количества незрелых клеток и снижением количества дефензин-положительных гранулоцитов как в костном мозге, так и в крови пострадавших.

Проведена клиническая оценка целого ряда лабораторных тестов на основе оценки содержания цитокинов и других медиаторов воспаления, функциональной активности клеток крови и костного мозга для ранней диагностики и прогнозирования развития сепсиса и тяжелого сепсиса при сочетанной травме, сопровождающейся шоком.

Показано, что исследование в крови пострадавших с сочетанной травмой таких цитокинов как 1Ь-10 и 1Ыга и количества в крови дефензин-положительных нейтрофильных гранулоцитов в первые 24 часа после травмы позволяет с большой вероятностью предсказать развитие тяжелого посттравматического сепсиса на 4-10 сутки.

Продемострировано, что увеличение содержания в крови НЬЛ-БЯ мононуклеаров выше 1,25-10% на 5 сутки после травмы является высокочувствительным диагностическим тестом развития бактериемии у пострадавших.

Использование показателей с высокой прогностической значимостью уже в 1 сутки после травмы позволяет выявить риск развития тяжелых гнойных осложнений у пациентов с сочетанной травмой и может быть рекомендовано для внедрения в практику работы отделений сочетанной травмы отечественных центров скорой помощи.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характерными признаками нарушения иммунитета и кроветворения при сочетанной травме, сопровождаемой развитием шока, является снижение содержания дифференцированных клеток-предшественников эритро- и гранулоцитопоэза в костном мозге пострадавших при повышенном количестве ранних клеток-предшественников, что обусловлено уменьшением концентрации в крови гемопоэтических цитокинов (1Ир, 1Ь-2, 1Ь-3, ОМ-СЗБ) и увеличением концентрации цитокинов, негативно влиящих на гемопоэз (1Ь-10, ГПМу).

2. Системное воспаление, маркёрами которого являются высокие концентрации в крови 1Ь-6 и 1Ь-10 во время травматического шока, ассоциировано с повреждением клеток головного мозга и нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера, о чем свидетельствует повышение содержания в крови пострадавших белка БЮОр.

3. Значимыми факторами развития гнойных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком, являются функциональная недостаточность нейтрофильных гранулоцитов при дефиците опсонических факторов (иммуноглобулинов) и дисфункция моноцитов в течение первых трёх суток после травмы.

4. Достоверными лабораторными критериями риска развития посттравматического тяжелого сепсиса и системного воспаления являются повышение в крови пострадавших IL-10, ILlra и снижение содержания дефензин -положительных нейтрофильных гранулоцитов в первые 24 часа после травмы.

Возможные области применения и формы внедрения. Клиническая иммунология, реаниматология, экстренная хирургия, травматология. Экономический эффект от внедрения будет определяться снижением частоты гнойных осложнений, сепсиса и летальности, а также длительности лечения пострадавших с механическими поражениями.

Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы теоретический анализ литературы, лабораторные методы и методы статистической обработки данных.

Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.

Основные положения работы, а также содержание её отдельных этапов были представлены на VII Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", Санкт-Петербург (2003); VII Всеармейской международной конференции «Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургической инфекции», Москва (2007); Объединённом иммунологическом форуме, Санкт-Петербург (2008); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Санкт-Петербург (2009); X конгрессе по аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, Казань (2009); VI Российской конференции по нейроиммунопатологии, Москва (2010); XIV Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург (2011); III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург (2011); Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным с нейротравмой и пострадавшим в ДТП» совместно с научно-практической конференцией «Скорая медицинская помощь 2011», Москва (2011); VII Конференции по нейроиммунопатологии, Москва (2012); IV международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Москва (2013); Объединённом иммунологическом форуме, Нижний Новгород (2013). Сделано 2 научных доклада на заседаниях общества иммунологов Санкт-Петербурга (2012), на заседании проблемной комиссии и Ученого Совета Санкт-Петербургского НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (2013).

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отдела анестезиологии и реанимации, отделения сочетанной травмы, отделения лечения сепсиса и тяжелого сепсиса ГБУ «Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе».

По теме диссертации опубликовано 41 работа, в их числе 16 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях.

Личное участие автора. Диссертант лично участвовал в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, обработке, анализе, обобщении и представлении полученных данных.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 242 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 87 таблицами. Список литературы включает 393 публикаций, из них 99 - отечественных авторов и 294 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1.1. Обследованные группы пострадавших с сочетанной травмой

Согласно задачам исследования проведено обследование 88 пострадавших с сочетанной механической травмой и шоком II и III степени (63 мужчины, 25 женщин; средний возраст - 34,8 ( 28,5; 43,5 лет), находившихся на лечении на отделении сочетанной травмы ГБУ СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе с 2007 по 2012 г.г.. Группу сравнения составили 35 здоровых волонтеров (средний возраст - 33,5 (28,3; 39,8) лет, сопоставимых по возрасту и полу с группами пострадавших.

Критерии включения: пострадавшие с тяжелой сочетанной травмой, возраст 20-55 лет, шок 2-3 степени. Из исследования исключали пострадавших с травмой, несовместимой с жизнью (умерших в первые 48 часов), с декомпенсированной соматической патологией, с тяжёлым ушибом головного мозга, имеющих в анамнезе хронический гепатит В и С, ВИЧ-инфекцию, сифилис, эндокринные и аутоиммунные заболевания (сахарный диабет I типа, системную красную волчанку, склеродермию, ревматоидный артрит, антифосфолипидный синдром).

В соответствии с величиной критерия ± 1/Т, разработанного в ГСПб НИИ скорой помощи им. И.И.Джанелидзе (Цибин Ю.Н., 1975), отражающего длительность периода нестабильной гемодинамики, в зависимости от тяжести травматического шока пострадавшие были разделены на 2 группы: 1) с шоком II степени степени (продолжительность шока более 7 часов) (п=46) и 2) с шоком III степени (пострадавшие с прогнозируемым летальным исходом) (п=42), которые в последствии, в зависимости от исхода заболевания, были разделены на подгруппы выживших (1а, 2а) и умерших(1Ь, 2Ь). Общая характеристика групп пострадавших с тяжелой механической травмой, сопровождающейся развитием шока представлена в табл.1.

Таблица 1

Группы пострадавших Количество пострадавших Возраст

всего в группе Выживших (1а, 2а) Умерших (lb, 2b)

1 группа (шок II) 46 (53%) 40 (87%) 6 (13%) 34,0 (27,0; 44,0)

2 группа (шок III) 42 (47%) 23 (55%) 19 (45%) 38,0 (27,5; 45,0)

Тяжесть травмы оценивали, рассчитывая балл шокогенности травмы (БШТ) по шкалам Г.И. Назаренко (1988) и ISS (Injury Severity Score) (S.P. Barker et al.,

1974). Развитие ССВО, сепсиса и тяжелого сепсиса определяли по наличию признаков, представленных в рекомендациях Калужской согласительной конференции (2004). Тяжесть полиорганной недостаточности, связанной с сепсисом, оценивали по шкале SOFA - sepsis related organ failure assessment score -принятой Европейским обществом интенсивной терапии (Vincent J.L. et al., 1996).

На догоспитальном этапе 92% пострадавших получили медицинскую помощь и были доставлены в стационар реанимационно-хирургическими бригадами. Среднее время доставки составило 74 минуты. На месте происшествия и во время транспортировки все пациенты получили лечение, включавшее остановку наружного кровотечения, транспортную иммобилизацию, обезболивание наркотическими анальгетиками, инфузии растворов кристаллоидов (400-1500 мл), в половине случаев пострадавшим вводили холинолитики (атропин), в 20% случаев - седативные препараты (реланиум) и в 85% - глюкокортикостероиды (60-240 мг преднизолона однократно). Обследование и лечение в стационаре начинали в противошоковой операционной, где выполняли стандартный комплекс исследований и противошоковой терапии, включающей хирургические противошоковые мероприятия (обеспечение внешнего дыхания, остановка кровотечения и стабилизация переломов). У всех пострадавших с сочетанной травмой констатировали тяжелую степень кровопотери, объем которой составлял в среднем 2325 мл (от 1600 до 3500 мл). Все пострадавшие получали инфузии эритроцитарной массы (от 199 до 849 мл) и свежезамороженной плазмы (от 500 до 1250 мл). Антибактериальную терапию во всех случаях начинали со стандартной комбинации препаратов (цефалоспорин 1-2 поколения + аминогликозид + метронидазол). При травмах с шоком III степени использовали цефалоспорин 3 поколения - цефтриаксон.

1.2. Материалы и сроки исследования

Материалом исследования служили кровь и пунктаты костного мозга пострадавших с сочетанной травмой. Для проведения исследований из цельной крови кровь забирали из кубитальной вены в стандартные вакуумные пробирки VENOJECT II Lithium Heparin LH STERIL и VENOJECT II Clot Act. Z STERIL (Belgium) для выделения сыворотки. Костный мозг получали пункцией губчатых костей по методу Аринкина с помощью иглы Кассирского, имеющей щиток-ограничитель, который можно установить на необходимую глубину в зависимости от толщины кожи и подкожной клетчатки. Пунктировали грудину в области рукоятки или верхней трети ее тела (на уровне 3-4 ребра) по средней линии.

Исследование крови пострадавших проводили при поступлении в противошоковое отделение, через 24 часа, на 3, 5, 10 сутки после травмы. Исследование костного мозга проводили в течении первых 24 часов после поступления в стационар, на 3 и 5 сутки после инцидента.

1.3. Методы исследования костномозгового кроветворения

Из пунктата костного мозга готовили мазки (окраска по Май-Грюнвальду с докраской по Романовскому-Гимзе). Также выделяли фракцию мононуклеаров на фиколл-верографиновом градиенте плотностью 1,077 г/л. Фенотипирование субпопуляций мононуклеаров (CD) проводили иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител (Novocastra, UK). Исследовали CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CDllb, CD16, CD18, CD20, CD25, CD34, CD38, CD105, CD117, HLA-I, HLA-DR, Defensin 1-3.

1.4. Методы исследования иммунитета и неспецифической резистентности 1.4.1. Гематологическое исследование крови

Гематологическое исследование выполняли на автоматическом анализаторе КХ-21 (Sismex). Оно включало в себя общеклиническое исследование крови, с обязательным определением: количества эритроцитов, количества ретикулоцитов, гемоглобина, гематокрита, среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН), средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС), количества лейкоцитов, количества тромбоцитов, относительного и абсолютного числа популяций лейкоцитов крови (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов)

1.4.2. Иммунофенотипирование клеток крови

Иммунофенотипирование фенотипических и активационных маркеров клеток крови с помощью иммуноцитохимического метода (Novocastra, UK).

Для постановки реакции из 4 мл венозной крови выделяли мононуклеары крови на градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077) и нейтрофильные гранулоциты (плотность градиента 1,119) (Еккерт Р., 1987). Чистота выделения клеточных популяций составляла 90-97%. Клеточную суспензию дважды отмывали при центрифугировании (1200 об/мин) в 10 мл среды Хенкса без фенолового красного. Исследовали содержание CD3, CD4, CD8, CD1 lb, CD 16, CD 18, CD20, CD25, HLA-I, HLA-DR - положительных мононуклеаров и Defensin - положительных нейтрофильных гранулоцитов.

1.4.3. Исследование содержания цитокинов, гормонов и других медиаторов воспаления

Определение содержания иммуноглобулинов классов A, G, М проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Вектор-Бест, Новосибирск).

Концентрацию цитокинов IL-lß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, ILlra, IFNy, TNFa, GM-CSF, EPO в сыворотке крови определяли методом ИФА (Bender Systems, Австрия).

Содержание гормонов в сыворотке крови определяли методом ИФА: кортизола, тиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (Т4св) (АлкорБио, Санкт-Петербург), пролактина (ХЕМА, Москва).

Содержание в сыворотке крови белка S-100ß исследовали методом ИФА (CanAgSlOO EIA, Швеция).

1.4.4. Исследование оксидантной и антиоксидантной активности клеток крови

Исследовали хемилюминесценцию как цельной крови, так и популяций мононуклеаров (эмиссия света определяется преимущественно моноцитами крови, но не лимфоцитами) и полиморфноядерных лейкоцитов крови (Kato Т. Et al., 1981). Клеточные популяции выделяли на двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 и 1,119). Полученные клетки крови трижды отмывали в 10 мл среды Хенкса без фенолового красного. Измеряли люминолопосредованное (раствор люминола l'MO"4 М) спонтанное и индуцированное суспензией зимозана (0,2 % раствор в ФСБ, pH 7,4) свечение клеток крови в течение часа с интервалом 10 мин при 37°С на люминометре 1251, BIO-ORBIT (Финляндия). Индуцирование хемилюминесценции осуществляли, добавляя в инкубационную среду 0,2%

раствор зимозана, опсонизированного комплементом. Измерение и учет результатов производили в автоматическом режиме (персональный компьютер, программа «PHAGOCYTOSIS»). Уровень XJI оценивали по сумме показателей в течение 60 мин и величине пика XJ1 (в мВ). Спонтанная XJI (CXJI) отражает уровень продукции супероксидов и бактерицидность активированных лейкоцитов крови, а величина индуцированной XJI (ИХЛ) - резерв клеточного метаболизма и бактерицидное™.

Для оценки общей антиоксидантной активности (АОА) использовали реакцию рибофлавина с перекисью водорода в присутствии ионов двухвалентного железа. Реакционная смесь содержит 610 мкл 75 мМ фосфатного буфера (рН 9,0), 40 мкл 10 мМ раствора рибофлавина, 50 мкл 25 мМ раствора FeSO^ 200 мкл 20 мМ раствора Н2О2 и 100 мкл бидистиллированной воды. В опытную пробу вместо бидистиллированной воды вносят 100 мкл сыворотки или плазмы крови. Измерение хемилюминесценции осуществляли в течение 2 мин. при температуре 37° С. АОА выражали в условных единицах на 1 мг белка, рассчитывая её по формуле:

АОА = (1 - ССоп./ССк.) / А

Где: ССоп. - величина суммы показателей ХЛ опытного образца; ССк. -величина суммы показателей XJI контрольной пробы; А - содержание белка в реакционной смеси.

1.4.5. Методы оценки активности воспалительного процесса у больных с

сочетанной травмой Определение в крови концентрации С-реактивного белка (СРБ) проводили полуколичественным методом латексной агглютинации (Human, Германия)

Измерение концентрации в крови прокальцитонина (ПКТ) проводили количественным иммунолюминометрическим методом (БРАМС АГ, Германия) на приборе «Lumat LB 9507»(Германия).

1.5.Исследование парциального напряжения О2 и СО2 в артериальной крови у больных с сочетанной травмой

Определение парциального напряжения газов крови, рН крови производилось на газоанализаторе Stat Profile Ultra (Nova biomedical, США). Расчетные параметры газообмена получали, используя формулы, приведенные в стандартах NCCLS, монографиях Г.А. Рябова, М.А. Гриппи (2007). Исследования выполнены в клинико-диагностической лаборатории СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе, зав.лаб. к.м.н. Ковальчук Ю.П.

1.6. Микробиологическая диагностика сепсиса и тяжелого сепсиса Чувствительность микрофлоры к антибактериальным препаратам определяли методом диффузии в агар с использованием стандартных дисков в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Количественное изучение содержания микробов в 1 грамме ткани проводили по классической методике, предложенной Teplitz С. et al. (1964). При количественной оценке диагностически значимыми считали титры микробных тел > 105 КОЕ/мл. Бактериологическое исследование крови осуществляли в бактериологической лаборатории СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе, зав.лаб. Попенко JI.H.

1.7. Методы статистического анализа

Обработку полученных данных проводили с помощью прикладных программ Excel, SPSS 17.0 и Statistica for Windows 6.0. Все данные представлены в виде средних М ± m или медианы с 25% и 75% квартилями, нормальность распределения выборки оценивали при помощи критерия Шапиро-Уилка, в рамках корреляционной связи вычисляли коэффициент Пирсона и Спирмена (г), различие признаков поводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. Для определения пороговых значений предполагаемых лабораторных предикторов развития сепсиса и тяжелого сепсиса применяли построение ROC-кривой и ее анализ. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину Р < 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние этиологических и патогенетических факторов сочетанной травмы на развитие воспаления у пострадавших.

В зависимости от тяжести травматического шока пострадавшие были разделены на 2 группы: 1) с шоком II степени (п=46) и 2) с шоком III степени (п=42), которые в зависимости от исхода заболевания, были разделены на подгруппы выживших (1а и 2а) и умерших (lb и 2Ь) пациентов (табл.2)

Таблица 2

Характеристика групп пострадавших с сочетанной травмой по тяжести травмы.

Группы пострадавших Количество пострадавших БШТ Балл ISS

1 группа(шок П) 46 (53%) 17,0(14,0; 17,3) 16,5(14,0; 20,0)

1а выжившие 40 (87%) 17,0(14,0; 17,2) 16,0(13,5; 20,0)

1Ь умершие 6(13%) 17,0(15,0; 17,5) 18,0(16,0; 23,5)

2 группа (шок III) 42 (47%) 23,0 *(19,5; 25,7) 22,0 *(18,0; 30,7)

2а выжившие 23 (55%) 21,0 (19,5; 22,9) 22,0 (15,5; 26,0)

2Ь умершие 19 (45%) 24,0 (20,5; 26,4) 22,0 (18,0; 33,0)

*- Р < 0,05 - по сравнению с шоком II

У всех пострадавших с сочетанной травмой в отделении противошоковой терапии констатировали тяжелую степень кровопотери, объем которой составлял от 1600 до 3500 мл, в среднем 2325 мл. Однако достоверных различий по объёму кровопотери между группами не выявлено.

Все пострадавшие получили инфузии эритроцитарной массы (от 199 до 849 мл) и свежезамороженной плазмы (от 500 до 1250 мл). При этом мы не наблюдали достоверного отличия по уровню объема перелитой эритроцитарной массы и плазмы между больными обеих групп.

При травматическом шоке у пациентов развивается гипоксия смешанного типа, обусловленная гипоксической гипоксией вследствие нарушения внешнего дыхания, циркуляторной гипоксией в результате расстройств общего и регионарного кровообращения и микроциркуляции, гемической и тканевой

гипоксией, связанной с кровопотерей и нарушениями кислотно-основного состояния. Через 24 часа после поступления в противошоковое отделение у пострадавших всех групп наблюдали уменьшение Ра02 в артериальной крови, но у пациентов с шоком III степени тяжести снижение сохранялось до 5 суток наблюдения.

У всех пострадавших через 1 сутки после поступления в противошоковое отделение наблюдали 2 и более признаков синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), соответствующие классификации Bone (1992).

В первые сутки после травмы на основании только данных о тяжести травмы (БШТ, ISS) трудно определить, ограничится ли патологический процесс развитием ССВО или произойдет развитие сепсиса или тяжелого сепсиса. На 5 сутки после травмы мы наблюдали достоверное уменьшение количества признаков ССВО у выживших пациентов 1 группы. У пострадавших 2 группы к этому сроку уже были диагностированы сепсис и тяжелый сепсис. При этом достоверного различия по количеству признаков ССВО между пациентами с сепсисом и тяжелым сепсисом не обнаружено.

Через 1 сутки после инцидента у пациентов с наиболее тяжелой травмой (БШТ=21,0, ISS=26,0) развилась органная недостаточность (показатель SOFA>4), сохраняющаяся вплоть до 5 суток (табл.3).

Таблица 3

Степень органной дисфункции у пострадавших с шоком II и III степени по

SOFA

Группы пострадавших Сутки после травмы

1 сутки 3 сутки 5 сутки

1 группа (шок II) (п=46) 1,0 (1,0; 2,3) 1,0 (0; 2,0) 1,0 (0,8; 1,3)

Подгруппа 1а выжившие (п=40) 1,0 (1,0; 2,8) 1,0 (0; 2,0) 1,0 (0,5; 1,5)

Подгруппа 1Ь умершие (п=6) 1,0 (0,5; 1,2) 2,0 (1,5; 2,5) 1,0 (1,0; 1,0)

2 группа (шок III) (п=42) 4,0* (1,8; 5,0) 2,5* (1,25; 5,0) 4,0* (2,0; 5,0)

Подгруппа 2а выжившие (п=23) 5,0 (1,0; 5,0) 2,0 (1,3; 3,3) 2,0 (1,3; 3,5)

Подгруппа 2Ь умершие (п=19) 4,0 (2,5; 4,5) 5,0 (2,8; 5,0) 5,0 (3,0; 6,0)

*- Р < 0,05 - по сравнению с шоком II

Таким образом, синдром системного воспалительного ответа на повреждение наблюдался у всех пациентов с сочетанной травмой и шоком II и III степени уже при поступлении. У 19 пострадавших (42%) с шоком II степени в течение 3-5 суток после травмы на фоне ССВО развились гнойные осложнения или, по классификации Bone, сепсис и у 12 пациентов (26%) - тяжелый сепсис (табл.4).

Таблица 4

Группы пострадавших Осложнения

ССВО без гнойных осложнений сепсис тяжелый сепсис

1 группа (шок II) (п=46) 15 (32%) 19 (42%) 12 (26%)

Подгруппа 1а выжившие (п=40) 15 (38%) 16(40%) 9 (22%)

Подгруппа 1Ь умершие (п=6) 0 (0%) 3 (50%) 3 (50%)

2 группа (шок III) (п=42) 0 (0%) 20 (48%) 22 (52%)

Подгруппа 2а выжившие (п=23) 0 (0%) 17 (74%) 6 (26%)

Подгруппа 2Ь умершие (п=19) 0 (0%) 3 (16%) 16 (84%)

У преимущественного числа пациентов с БШТ >24 баллов и ISS>22 баллов и шоком III степени в течение 1 суток после инцидента формировалась полиорганная недостаточность, которая продолжала нарастать на фоне сохранявшегося количества признаков воспаления. Таким образом, тяжесть травмы с БШТ>24 баллов и ISS>24 баллов является критерием развития тяжелого сепсиса после сочетанной травмы. Таким образом, тяжесть травмы и шока определяли тяжесть течения травматической болезни после сочетанной травмы.

Патогенетические факторы тяжелой сочетанной травмы (повреждение тканей, кровопотеря, шок, гипоксия, развитие оксидантного стресса), обусловливают изменение функциональной активности клеток различных тканей и метаболические нарушения в них и ассоциированы с тяжестью шока, высоким риском тяжелого сепсиса и летального исхода.

Результаты проведенных исследований позволили выявить особенности формирования иммунитета, кроветворения и воспаления при сочетанной механической травме, сопровождающейся развитием шока, связь выявленных изменений с развитием гнойных осложнений. Изменения в иммунной системе формировались уже во время шока и определялись, прежде всего, тяжестью травмы и шока.

Наиболее выраженные изменения иммунитета и неспецифической резистентности мы наблюдали в течение 24 ч после инцидента, когда формируется первичный, а после и вторичный флогогенный удар, обусловленный реперфузией тканей. Развитие гипоксии смешанного типа (гипоксической, циркуляторной, гемической) обуславливает изменение окислительного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, что приводит к повышению оксидантной активности клеток крови. Наиболее резкие изменения происходили у пациентов с шоком III степени тяжести. Так, через 12 ч после поступления у пациентов с этой группы мы наблюдали 3-кратное увеличение хемилюминесценции клеток крови в сочетании с заметным уменьшением (в 1,5

раза) антиоксидантной активности крови, что свидетельствовало о нарушении баланса в системе оксиданты-антиоксиданты (рис. 1).

*#

ХЛ

*#

1

пост 12 ч 1 сут Зсут 5сут

0,15 0,125 0,1 0,075 0,05 0,025

АОА

t t t t^j

*# *# *# *#

.*# -

-шок II -шок III -норма

пост 12 ч 1 суг 3 сут 5 сут

Рис.1 Уровень ХЛ (мВ) и АОА (усл.ед.) у пострадавших с сочетанной травмой (* - Р<0,05 - по сравнению с нормой, # - Р<0,05 - по сравнению с шоком И)

Дисбаланс в системе оксиданты-антиоксиданты в конечном итоге приводит к развитию оксидантного стресса и, следовательно, к различным патологическим реакциям в тканях больных, в том числе оказывающим негативное влияние на кроветворение и функции иммунокомпетентных клеток. Избыточная продукция оксидантов на фоне недостатка их инактиваторов повышает уровень внутриклеточных аутоокислительных процессов, ослабляя антимикробные свойства нейтрофилов (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Голиков П.П. с соавт., 2000; Repin J., Parsons P., 1994). Инициированное активными кислородными радикалами перекисное окисление липидов ведет к повреждению клеточных мембран и повышению их проницаемости, образованию перекисей и гидроперекисей, альдегидов, кетонов и других токсичных соединений, обладающих цитотоксическим и мутагенным действием.

Одним из факторов генерализации воспаления, то есть формирования системного воспаления, является активация продукции и секреции различных цитокинов и увеличение их содержания в крови. При этом активированные моноциты и тканевые макрофаги синтезируют как провоспалительные (IL-ip, TNFa, IL-6), так и противовоспалительные цитокины (IL-10, ILlra, TGFP). Несмотря на большое количество исследований, в которых демонстрируется повышение уровня IL-ip и TNFa после травмы (Малыш И.Р., 2005, Ertel W, 1991, Faist, 2004), концентрация данных цитокинов в крови пострадавших в нашем исследовании оставалась на минимальном уровне вне зависимости от тяжести травмы.

При поступлении в противошоковое отделение в крови пострадавших мы наблюдали повышенные уровни в крови IL-6 и IL-10 (в 20 раз и выше по сравнению с верхней границей нормы) - индуцибельных цитокинов, пик продукции которых приходится на первые часы после повреждения (рис.2,3).

Однако уже к 3 суткам содержание данных цитокинов в сыворотке крови возвращалось к норме.

Рис.2 Содержание 1Ь-6 (пг/мл) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

Рис.3 Содержание IL-10 (пг/мл) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

Также в крови пострадавших увеличивалось содержание IL-8 (рис.4) и IL 1га (рис.5), причем у пострадавших с шоком III степени концентрация данных цитокинов была существенно выше, чем у здоровых взрослых и у пациентов с

Рис.4 Содержание ^-8 (пг/мл) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

Рис.5 Содержание ПЛга (пг/мл) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

Развитие травматического шока во всех случаях сопровождалось немедленным усилением продукции стресс-реализующих гормонов - кортизола и пролактина, которое сохранялось в течение 1 суток после инцидента. Содержание в крови как кортизола, так и пролактина достоверно коррелировало с уровнем IL-6 (г=0,73 и г=0,40, соответственно) и IL-10 (г=0,64 и г=0,61, соответственно) в крови.

Увеличение уровня кортизола в тканях и крови способствуют снижению адгезивной активности лейкоцитов крови и эндотелия, ограничению продукции воспалительных цитокинов и экспрессии рецепторов к ним, развитию Т-лимфоцитопении, обусловленной активацией апоптоза зрелых Т-лимфоцитов (Бойчук C.B. с соавт, 2001, Потапнев М.П., 2002).

У пострадавших с сочетанной травмой эндокринная функция щитовидной железы снижена на фоне активации продукции гормонов стресса и шока, что может приводить к ограничению мобилизации энергетических клеточных ресурсов, недостаточности системы кроветворения. Восстановление продукции гипофизарного тиреотропного гормона до нормы происходило только к 5 суткам после травмы. Эта дизрегуляция активности щитовидной железы и гипофиза в условиях системного воспаления содержит в себе и положительный эффект ограничения количества основных эффекторов острого воспаления — нейтрофильных гранулоцитов. Нормальные концентрации гормонов достигались только к 10 суткам, при этом содержание гормонов прямо коррелировало с восстановлением кроветворной функции (достоверная корреляция на 5 сутки между концентрацией Т4 и количеством зрелых нейтрофильных гранулоцитов (г=0,61) и Т-лимфоцитов (г=0,49).

Нарушение мозгового кровотока и гипоксия, оксидантный стресс в условиях сочетанной травмы являются пусковым механизмом повреждения ткани мозга с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера, когда в кровь могут поступать высокомолекулярные соединения, в частности, нейроспецифические белки, выступающие в роли мозгоспецифических антигенов. Одним из таких соединений является растворимый Са2+-связывающий белок S100P, являющийся трофическим фактором для серотонинергических нейронов и специфичный для клеток головного мозга. Повышенное содержание в крови белка S100P при поступлении наблюдали у всех пострадавших с сочетанной травмой, что

свидетельствует о дисфункции клеток центральной нервной системы и нарушении нейроиммунных взаимодействий. Наблюдали положительную корреляционную зависимость между содержанием в крови белка Б 100(3 и медиаторов острого воспаления 1Ь-6 (г=0,73) и 1Ь-10 (г=0,62) во время травматического шока.

2.2. Костномозговое кроветворение при сочетанной травме.

Известно, что резервом восстановления клеточных популяций различных тканей являются клетки костного мозга. У 89% пострадавших обеих групп общее количество миелокариоцитов в костном мозге было снижено по сравнению со значениями нормы (35,2-120,3-109/л). При этом наблюдалась достоверная зависимость количества клеток в костном мозге от уровня Ра02 в крови пострадавших (г=0,81, р<0,01) при поступлении в стационар.

Вне зависимости от тяжести воздействия патогенетических факторов травмы и шока, в периоде ранних проявлений травматической болезни в костном мозге пострадавших сохранялось большое количество ранних предшественников кроветворения (СБ34+клеток) (рис.6). У пострадавших с более тяжелой травмой сразу после инцидента наблюдалось повышенное число клеток, экспрессирующих рецептор к фактору стволовых клеток (СОП7+ клеток). При этом количество СБ 117+ клеток в костном мозге пострадавших с шоком III степени и летальным исходом было в 2,5 раза выше, чем у выживших пациентов начиная с 3 суток после травмы.

СБ34+

СБ117+

И

ш

£

] шок II 3 шок III -норма

пост 1 сут 3 сут ПОСТ 3 сут 5 сут

Рис.6 Содержание С О 34+ и СБ 117+ (%) в костном мозге пострадавших с

сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

У всех пациентов с сочетанной травмой наблюдалось прогрессирующее нарушение созревания клеток миелоидного и эритроидного ряда в костном мозге, прямо ассоциированное с уровнем смешанной гипоксии (г=-0,65 с Ра02). При повышенной продукции ранних клеток-предшественников в костном мозге пострадавших мы наблюдали дефицит дифференцированных клеток-предшественников гранулоцитопоэза (миелоцитов и метамиелоцитов) и эритропоэза (полихроматофильных нормоцитов) (рис.7), уже способных осуществлять специализированные функции. При этом количество лимфоцитов и

моноцитов в костном мозге не отличалось от нормальных значений у пациентов всех групп.

миелоциты

1-Й

г

20

ПХН

ГЙ гЙ гй

1 сут

3 сут

] шок 11 9 шок 111 -норма

пост 3 сут 5 сут

Рис.7 Содержание миелоцитов и полихроматофильных нормоцитов (ПХН) (%) в костном мозге пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой)

Наиболее выраженные изменения костномозгового кроветворения развивались у пациентов с наиболее тяжелой травмой и тяжелым посттравматическим сепсисом. У пациентов с шоком III степени наблюдали усиление свободно-радикального окисления в клетках костного мозга, о чем свидетельствовало усиление хемилюминесценции клеток костного мозга на 40% по сравнению с пациентами с шоком II степени на протяжении 72 часов после инцидента. Избыточная продукция оксидантов отражает усиление внутриклеточных окислительных процессов и нарушение функциональной активности клеток.

Относительное содержание зрелых сегментоядерных НГ в костном мозге незначительно увеличивалось у пострадавших всех групп при поступлении, однако у пациентов с шоком III этот показатель прогрессивно снижался к 5 суткам наблюдения. Содержание зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге снижалось пропорционально уровню Ра02 в крови на 3 сутки после травмы (г= 0,81, р<0,01). Вероятно, снижение пула метамиелоцитов и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге у пострадавших с сочетанной травмой связано с массированным выходом из костного мозга в периферическую кровь незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов и недостаточностью пролиферации предшествующих форм гранулоцитов в костном мозге.

2.3. Иммунитет и неспецифическая резистентность при сочетанной травме

Реакция иммунной системы на факторы травмы на первом этапе характеризуется активацией миграции клеток различных популяций из костного мозга в кровь и в очаг воспаления. Одним из важнейших компонентов нарушений иммунитета является функциональная недостаточность нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Первоначально происходит выход в кровяное русло функционально состоятельных клеток. Нейтрофильные гранулоциты устремляются к очагу повреждения, и в большинстве своем, истощив свой метаболический ресурс, погибают (Пинегин Б.В., Маянский А.Н.. 2007). По мере миграции зрелых

клеток в очаги воспаления из крови и интенсификации гранулоцитопоэза и выхода клеток из костного мозга в кровь наблюдается увеличение числа незрелых форм гранулоцитов. Отличительным признаком больных 2 группы явилось постоянно более высокое содержание метамиелоцитов и палочкоядерных нейтрофилов в крови по сравнению с пациентами 1 группы начиная с 1 суток после инцидента (рис.8).

Метамиелоциты

Палочкоядерные НГ

1 шок II I шок III -норма

пост 1сут 3 сут 5 сут 10 сут пост , сут Зсут 5сут 10сут

Рис.8 Содержание метамиелоцитов и палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов (НГ) (%) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

При этом функциональная активность ранних форм НГ может быть недостаточна для адекватного бактерицидного ответа, что подтверждается данными по числу НГ, содержащих дефензины - основные белки противобактериальной защиты (рис.9). Так, у больных с шоком III степени количество ОеГ+-нейтрофильных гранулоцитов в крови катастрофически снижено до 10 суток после травмы

] шок II 3 шок III -норма

пост 1 сут 3 сут 5 сут 10 сут Рис.9 Количество НГ, содержащих дефенсины (%) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой , # - Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

Кроме того, функциональная недостаточность НГ у пациентов с шоком III степени сочеталась со снижением положительного хемотаксиса гранулоцитов в условиях цитокинемии, в том числе хемотаксического фактора для нейтрофилов -1Ь-8, что ограничивает накопление лейкоцитов в очаге повреждения (рис.4). При этом уровень 1Ь-8 достоверно коррелировал с развитием сепсиса и тяжелого сепсиса, начиная с 1 суток после травмы (г=0,55, п=75)

Дефицит количества и функциональной активности Т-лимфоцитов является наиболее постоянной составляющей посттравматической иммуносупрессии. Кратковременный лимфоцитоз, фиксируемый непосредственно на месте происшествия (Саламатин Б.Н. с соавт., 1993), в раннем периоде травматической болезни быстро сменяется лимфоцитопенией, обусловленной уменьшением числа как Т-, так и В-клеток, несмотря на нормальное количество как предшественников, так и зрелых Т- и В- лимфоцитов в костном мозге. Т-лимфоцитопения у всех пациентов была обусловлена уменьшением количества CD4+ лимфоцитов (рис.10) при неизменном числе CD8+.

-норма -шок II -шок III

пост 1 сут 3 сут 5 сут 10 сут

Рис 10. Содержание CD4+Т-лимфоцитов (х109/л) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой)

При этом, количество лимфоцитов крови в первые часы после травмы отражало тяжесть полученной травмы (i=-0,49 с БШТ) и могло быть опосредовано разнообразными факторами, такими как кортизолемия, дефицит ростовых факторов для лимфоцитов - IL-3, IL-2, IL-4, усиление миграции клеток в ткани. Однако, несмотря на дефицит интерлейкина-2, содержание которого в сыворотке крови пострадавших всех групп оставалось на минимальном уровне на протяжении всего срока наблюдения, сохранялось количество С025+лимфоцитов, т.е. клеток, экспрессирующих активированный рецептор IL-2. Нормальное количество клеток, экспрессирующих CD25, свидетельствовало об активирующем воздействии IL-2 в органах иммуногенеза (тимусе, лимфатических узлах, лимфоидной ткани слизистых оболочек). Восстановление числа как Т-, так и B-клеток происходило к 5 суткам после травмы.

Ведущую роль в формировании иммунной реактивности пострадавших с сочетанной травмой и шоком играют моноциты. Они продуцируют воспалительные, противовоспалительные цитокины, гемопоэтины и интерфероны, оказывая регулирующее влияние на функционирование клеток различных популяций и кроветворение. Моноциты крови сохраняют регуляторные функции, проявляющиеся в синтезе цитокинов, таких как IL-1 и TNF. При этом наблюдается повышенная продукция мононуклеарами противовоспалительных цитокинов: IL-10 - в периоде шока (рис.3), Юга - до 10 сут наблюдения (рис.5).

Анализ содержания мононуклеаров, экспрессирующих молекулы адгезии CD 18, в крови пострадавших показал, что их количество сохранялось в пределах нормальных значений во все сроки наблюдения у больных с шоком II степени,

тогда как у больных с шоком III степени количество СБ 18+ мононуклеаров было достоверно снижено по сравнению с нормой вплоть до 3 суток после инцидента и восстанавливалось только на 5 сутки. Сохранялось на нормальном или повышенном уровне количество Ш_Л-ОК7 мононуклеаров в крови, причем на 5 сутки содержание ПЬА-1Ж мононуклеаров коррелировало с развитием тяжелого сепсиса (г = 0,44, Р<0,05). Однако было снижено количество моноцитов, экспрессирующих корецепторТЬК (СО 14' клеток) у пациентов с сочетанной травмой (рис.11), в особенности у пациентов с шоком III степени (вплоть до 10 суток), что, очевидно, являлось одним из важных условий генерализации бактериальной инфекции у данной категории больных и развития сепсиса и тяжелого сепсиса.

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 о

1

£

д. Т * « , 1

Т"* £ * Н

-норма -шок II -шок III

1 сут 3 сут 5 сут 10 сут

Рис 11. Содержание СБ 14+моноцитов (х10 /л) в крови пострадавших с сочетанной травмой (*- Р<0,05 - по сравнению с нормой)

Острая кровопотеря приводит к уменьшению количества циркулирующих форменных элементов, в том числе эритроцитов. При исследовании крови пострадавших с сочетанной травмой мы наблюдали лабораторные признаки развития анемии, такие как снижение количества эритроцитов и содержания гемоглобина в крови вплоть до 10 суток. Показатели МСУ, МСН и МСНС оставались в пределах референтных значений. Таким образом, у пострадавших с сочетанной травмой мы наблюдали признаки нормохромной нормоцитарной постгеморрагической анемии. При этом, несмотря на нормальный уровень ранних клеток-предшественников (рис.6) в костном мозге пострадавших снижается количество полихроматофильных нормоцитов (рис.7), что, вероятно связано с усилением стресс-эритропоэза и генерацией ретикулоцитов из полихроматофильных нормоцитов с последующей миграцией их в кровоток. При этом восстановление эритропоэза у пациентов с шоком II степени обеспечивается физиологическими механизмами, связанными с нормальным уровнем продукции эритропоэтина (ЕРО) (рис.12) на фоне нормального уровня кислорода, тогда как у больных с более тяжелой травмой на фоне снижения уровня ЕРО восстановление эритроидного пула осуществляется резким усилением костномозгового кроветворения на фоне сохраняющегося гипоксического стимула с более интенсивной миграцией клеток эритроидного ряда из костного мозга в кровоток.

*# Т

^ - т

н--О

Т' 1 у I ' а а

± и / 5 ? 4 * у *#

-ШОК II

-шок III -норма

пост 1 сут 3 сут 5 сут 10 сут

Рис. 12 Содержание эритропоэтина (пг/мл) у пострадавших с сочетанной травмой (* - Р<0,05 - по сравнению с нормой, #- Р<0,05 - по сравнению с шоком II)

2.4. Значение нарушений костномозгового кроветворения, иммунитета и несиецифнческой резистентности для прогноза развития ССВО, сепсиса и тяжелого сепсиса у пациентов с сочетанной травмой

При сочетанной травме характер изменений функций иммунной системы и их выраженность зависели от тяжести травмы. Снижение показателей клеточного и гуморального иммунитета у всех пострадавших с шокогенной травмой наиболее выражено на третьи сутки после травмы. К десятым суткам постшокового периода наблюдалось полное или частичное восстановление иммунокомпетентности организма пострадавших (восстановление числа Т- и В-лимфоцитов, уровня сывороточных иммуноглобулинов, нормализация эндокринного статуса и функций фагоцитов), или же формировался вторичный посттравматический иммунодефицит, клиническим выражением которого явилось развитие тяжелого сепсиса. Определение характера изменений возможно на основании динамического и комплексного анализа показателей клеточного и гуморального иммунитета, концентрации клеточных медиаторов, а также - клинической картины течения постшокового периода.

Совокупность клинических и лабораторных критериев активности воспаления у пострадавших с сочетанной травмой различной тяжести позволяет нам выделить различные уровни реакции организма на травму.

У 32% пациентов с шоком II степени адаптивный вариант реакции на травму проявляется в формировании системного воспалительного ответа на повреждение тканей при отсутствии гнойных осложнений. Развитие ССВО характеризовалось умеренно выраженной активацией нейтрофильных гранулоцитов и увеличением содержания в крови медиаторов острой фазы воспаления в первые сутки после травмы 1Ь-6 (в 20 раз и более), СРБ (в 10 раз и более) и прокальцитонина (в 6 раз и более). Также у пациентов с шоком II степени тяжести наблюдали кортизолемию и пролактинемию при поступлении в противошоковое отделение. При этом уровень хемилюминесценции, как реакции исключительно индуцибельной (например, бактериальными антигенами или воспалительными цитокинами), сохранялся в пределах нормальных значений, отражая состояние инфекционного благополучия.

При сочетанной травме с шоком III степени, сопровождающейся развитием тканевой гипоксии и оксидантного стресса, адаптивный вариант реакции перерастает в патологический в результате функциональных и структурных изменений клеток различных тканей на фоне присоединения бактериальной инфекции, что приводит к развитию системного воспаления как фактора патогенеза тяжелого сепсиса у 52% пострадавших. При тяжелых механических и циркуляторных (вторичных) повреждениях формируется недостаточность функций органов и систем, или полиорганная недостаточность, определяющая тяжелое течение травматической болезни с развитием тяжелого сепсиса. Влияние гипоксии обусловливает и формирование нарушений функционирования системы кроветворения и иммуногенеза: костного мозга, вилочковой железы, периферических органов иммунной системы. Так, тяжесть состояния пострадавших, получивших сочетанную травму с БШТ (по шкале Цибина Ю.Н. с соавт., 1976), превышающим 24 балла, соответствовала наличию синдрома полиорганной недостаточности (уровень органной дисфункции по SOFA > 4 баллов). У больных этой группы наблюдали клинические проявления тяжелого сепсиса и лабораторные признаки вторичного посттравматического иммунодефицита. У пострадавших этой группы наблюдалось усиление лимфоцитактивирующих свойств моноцитов и количества HLA DR мононуклеаров в крови к 5 дню наблюдения в сочетании с угнетением пролиферации моноцитов и лимфоцитов. При этом, вероятно, не происходит полноценного восприятия Т-лимфоцитами активирующего влияния моноцитов в условиях постгипоксической органной недостаточности и бактериальной антигенемии.

Анализ полученных результатов позволил выделить лабораторные критерии развития системного воспаления и иммунодепрессии при травме, позволяющие сформировать алгоритмы ранней диагностики и прогнозирования гнойных осложнений при сочетанной травме. Среди изученных в нашем исследовании показателей различных звеньев иммунной системы, как клеточного иммунитета, так и показателей неспецифической резистентности (цитокинов и других медиаторов воспаления) наибольший размах изменений и наиболее четкую связь с особенностями течения посттравматического периода и развитием тяжелого сепсиса имели следующие:

При поступлении (по уровню корреляции с развитием тяжелого сепсиса):

1. Уровень спонтанной хемилюминесценции полиморфноядерных нейтрофилов - (г= 0,57, п=78, Р<0,01)

2. Содержание в крови Def1' нейтрофильных гранулоцитов - (г= -0,56, п=78, Р<0,01)

3. Концентрация в крови IL-6 - (г= 0,49, п=78, Р<0,05)

4. Концентрация в крови IL-10 - (г= 0,56, п=78, Р<0,01)

5. Концентрация в крови ILlra - (г= 0,57, п=78, Р<0,01)

6. Концентрация в крови кортизола - (г= 0,49, п=78, Р<0,05)

Через 24 часа после травмы:

1. Уровень спонтанной хемилюминесценции полиморфноядерных нейтрофилов - (г= 0,52, п=75, Р<0,05)

2. Содержание в крови Def нейтрофильных гранулодитов - (г= -0,52, п=75, Р<0,05)

3. Концентрация в крови ILlra - (г= 0,70, п=75, Р<0,01)

4. Концентрация в крови IL-8 - (г= 0,55, п=75, Р<0,05)

5. Концентрация в крови прокальцитонина - (г= 0,48, п=75, Р<0,05)

Оценку предсказательной ценности маркеров и выбор их пороговых значений проводили с помощью ROC-кривых. Исследуемую выборку разбили на 2 класса: отсутствие гнойных осложнений и развитие сепсиса и тяжелого сепсиса, соответственно. Предсказательную ценность каждого параметра оценивали по шкале значений площади под ROC-кривой (Area Under Curve - AUC), которая позволяет выделить отличное, очень хорошее и хорошее качество моделей. Чем выше показатель AUC, тем большей прогностической силой обладает модель. При этом выявлена достаточно резко выраженная изогнутость ROC-кривых для следующих параметров:

Для диагностики тяжелого сепсиса хорошую предсказательную ценность имеет концентрация IL-10 в крови при поступлении пострадавших в стационар (рис.13). Установлено, что оптимальным пороговым значением для IL-10 как предиктора тяжелого сепсиса является 130 пг/мл (75% чувствительности и 83% специфичности)

Кривые ROC

Рис.13 Кривая ROC для IL-10

Также хорошей прогностической ценностью обладает концентрация IL 1га при поступлении (рис. 14). Пороговым значением для ИЛ-1РА является 1885 пг/мл (77% чувствительности и 87% специфичности).

Кривые ROC

Рис.14 Кривая ROC для ILlra

Количество нейтрофильных гранулоцитов, содержащих дефензины, при поступлении пострадавших с сочетанной травмой также обладало хорошей прогностической ценностью для предсказания развития тяжелого сепсиса (рис.15). Пороговое значение содержание в крови Def^ нейтрофильных гранулоцитов составило 17% (85% чувствительности и 95% специфичности).

Кривые ROC

Рисунок 15. Кривая ROC для содержания дефензин-положительных нейтрофильных гранулоцитов в крови

Увеличение содержания в крови HLA-DR+ мононуклеаров в крови в периоде ранних проявлений травматической болезни явилось высокочувствительным тестом бактериальной диссеминации у пациентов с тяжелым сепсисом, что подтверждается результатами ROC-анализа. Пороговым значением для содержания HLA-DR+ мононуклеаров в крови для диагностики бактериальной диссеминации является 1,25-109/л (78% чувствительности и 87% специфичности).

Таким образом, предикторами развития тяжелого сепсиса у пациентов с с сочетанной травмой в первые 12 часов после травмы явились: повышение уровня 1Ь-10 (в 50 раз и более), 1Ыга (в 12 раз) и снижение содержания в крови Бе^ нейтрофильных гранулоцитов (в 4 раза и более) (табл. 5). Высокочувствительным тестом бактериальной диссеминации у пациентов с тяжелым сепсисом явилось увеличение содержания в крови НЬА-БЯ+ клеток в крови, что мы наблюдали на 5 сутки после травмы.

Таблица 5

Показатель АиС (площадь под кривой) Пороговое значение

Поступление

Повышение IL-10 0,79 130 пг/мл

Повышение IL-1га 0,79 1885 пг/мл

Снижение содержания в крови Def^ нейтрофильных гранулоцитов 0,95 17%

5 сутки

Повышение содержания в крови мононуклеаров 0,78 1,25-109/л

Комплексный анализ тяжести травмы и изменений информативных иммунологических показателей в первые сутки после травмы позволяет выявить риск развития тяжелых гнойных осложнений. Раннее прогнозирование развития посттравматической иммуносупрессии и инфекционных осложнений позволит оптимизировать лечение пострадавших с сочетанной травмой различной степени тяжести в периоде ранних проявлений травматической болезни.

ВЫВОДЫ

1. В патогенезе развития сепсиса и тяжелого сепсиса у пострадавших с сочетанной травмой, сопряженной с шоком II и III степени тяжести, определяющую роль играют нарушение созревания клеток иммунной системы в костном мозге с последующими изменениями функциональной активности иммуноцитов в периферической крови, тяжесть которых прямо коррелирует с тяжестью травмы и шока.

2. Развитие системного воспаления у пострадавших с сочетанной травмой с шоком III степени и с шоком II степени, осложнившимся тяжелым сепсисом, уже в первые сутки после травмы сопровождается значительным повышением содержания в крови воспалительных (1Ь-18 - в 10 раз по сравнению со средним значением нормы, 1Ь-6 - в 20 раз) и противовоспалительных цитокинов (1Ь-10 - в 30 раз, 1Ь-4 - в 5 раз, 1Ыга - в 8 раз) и развитием оксидантного стресса, что обусловлено усилением продукции активных форм кислорода в 3 раза и уменьшением антиоксидантного потенциала крови в 1,5 раза. При этом в крови пострадавших отмечаются низкие уровни гемопоэтических цитокинов - 1Ь-1р, 1Ь-2,1Ь-3, вМ-СЗР.

3. У пострадавших с сочетанной травмой отмечается нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера, которое проявляется увеличением содержания в крови белка 8100|3 в 6 раз. Концентрация белка 81000 коррелировала с тяжестью травмы и развитием гнойных осложнений.

4. В течение 24 ч после травмы формируются изменения костномозгового кроветворения, степень которых зависит от тяжести травмы и уровня кислорода в крови. В течение 5 суток после травмы количество как ранних предшественников (СВ34+, 17+) в костном мозге сохраняется у пострадавших с шоком II степени и возрастает при шоке III степени. Содержание дифференцированных клеточных предшественников эритроидного и миелоидного ростков кроветворения снижается у всех пациентов с сочетанной травмой в 7-8 раз.

5. Нарушения клеточного и гуморального иммунитета у пострадавших с сочетанной травмой носят транзиторный характер, о чем свидетельствует снижение количества СБ4+ Т-лимфоцитов в 2 раза, уменьшение содержания в крови иммуноглобулинов в 1,5-2 раза в течение 3 суток после травмы и восстановление показателей на 5 сутки. Одновременно в костном мозге пострадавших число предшественников и зрелых Т- и В-лимфоцитов сохранялось на нормальном уровне.

6. Важнейшими факторами развития гнойных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой являются функциональная недостаточность нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов. В течение первых 3 суток количество дефензин-положительных гранулоцитов снижалось в 2,5 раза, что отражало нарушение созревания гранулоцитов в костном мозге. У всех пациентов также снижалось содержание моноцитов, экспрессирующих ТЬЯ (СБ14+ клеток), и только у пострадавших без осложнений количество СЭ14+ клеток восстанавливалось до уровня нормы к 5 суткам после травмы

7. Повышение содержания в крови 1Ь-10 более 130 пг/мл, 1Ыга более 1885 пг/мл, а также снижение содержания в крови дефензин-положительных гранулоцитов до 17% и ниже в первые 24 часа после травмы достоверно коррелирует с уровнем органной дисфункции и риском развития тяжелого сепсиса. Увеличение содержания в крови НЬА-ОЯ+ клеток выше 1,25*109/л на 5 сутки после травмы является высокочувствительным тестом бактериальной диссеминации у пациентов с тяжелым сепсисом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пострадавших с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком, поступающих в реанимационное отделение стационаров скорой помощи, рекомендовано исследование в крови содержания 1Ь-10 и ПЛга и количества в крови Бе^ нейтрофильных гранулоцитов в первые 24 часа после травмы с целью раннего прогнозирования развития тяжелого посттравматического сепсиса.

2. В отделениях сочетанной травмы и отделениях по лечению сепсиса и тяжелого сепсиса стационаров скорой помощи для диагностики бактериемии у пострадавших с сочетанной травмой рекомендуется использовать анализ содержания в крови НЬА-ОЬГ мононуклеаров. Повышение показателя выше 1,25-109/л на пятые сутки после травмы является высокочувствительным диагностическим тестом развития бактериемии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах и изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации

1. Багненко, С.Ф. Функциональная активность моноцитов крови при сочетанной механической травме / С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, Е.Г. Рыбакина, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, А.Е. Чикин, С.Н. Шанин, И.А. Козинец, О.Д. Чесноков, Е.А. Корнева // Медицинский академический журнал. - 2010- Т.10, № 1. - С. 64-72.

2. Сокорнов, И.А. Анестезиологическое пособие и послеоперационный стресс / И.А. Сокорнов, В.Н. Лапшин, Б.Н. Шах, Д.Б. Смирнов, М.Е. Малышев // Эфферентная терапия,-2011,-Т. 17, №4,-С. 105-106.

3. Багненко, С.Ф. Содержание цитокинов в сыворотке крови пациентов с сочетанной травмой, сопровождающейся шоком / С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, А.Е. Чикин, A.C. Ганин // Скорая медицинская помощь,- 2011,- Т.12, № 4,- С. 62-67.

4. Малышев М.Е. Иммунологические маркеры воспаления и сепсиса при сочетанной механической травме / М.Е. Малышев, С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, А.Е. Чикин, A.C. Ганин // Инфекции в хирургии.- 2012.-Т. 10, № 1,- С. 22-27.

5. Багненко, С.Ф. Использование иммунологических показателей для определения степени тяжести острого деструктивного панкреатита и вероятности развития гнойных осложнений / С.Ф. Багненко, В.Р. Гольцов, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, В.Г. Двойнов, Д.А. Дымников, Е.В. Батиг // Инфекции в хирургии,- 2012.-Т. 10, № 1- С. 11-15.

6. Багненко, С.Ф. Влияние смешанной гипоксии на развитие синдрома системного воспалительного ответа при сочетанной травме и острых отравлениях / С.Ф. Багненко, В.В. Шилов, Л.П. Пивоварова, М.Е. Малышев, В.А. Лукин, И.В. Осипова, О.Б. Арискина // Скорая медицинская помощь.-2012,- Т. 13, № 3.- С. 5156.

7. Страхов, И.В. Влияние рексода на оксидантную и антиоксидантную активность крови у пострадавших с травматическим шоком / И.В. Страхов, О.Б. Арискина, И.А. Сокорнов, М.Е. Малышев // Скорая медицинская помощь. - 2012- Т. 13, № 3 -.С. 61-65.

8. Малышев, М.Е. Бактериальная транслокация в системный кровоток у пострадавших с сочетанной травмой / М.Е. Малышев, Д.Ш. Саъдулаев, О.Б. Арискина, Л.Н. Попенко // Вестник Авиценны - Таджикистан.- Душанбе.-2012,- № 4 (53). - С. 50-56.

9. Шилов, В.В. Диагностика и прогнозирование тяжелого сепсиса у пациентов с острыми отравлениями опиатами / В.В. Шилов, Л.П. Пивоварова, В.А. Лукин, М.Е. Малышев, И.В. Осипова, О.Б. Арискина, Л.Н. Попенко // Вопросы наркологии. .-2012.-№ 6,- С. 28-34.

Ю.Малышев, М.Е. Функциональная недостаточность нейтрофильных гранулоцитов при сочетанной механической травме / М.Е. Малышев, С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова // Инфекции в хирургии.-2013.-№ 1.- С. 26-30.

-3011. Малышев, М.Е. Состояние гранулоцитопоэза у пациентов с тяжёлым сепсисом, развившимся после сочетанной механической травмы / М.Е. Малышев, С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова // Инфекции в хирургии,-2013.-№ 1,-С. 44-48.

12. Пивоварова, Л.П. Особенности клеточного иммунитета у пациентов с тяжёлой ожоговой травмой до и после свободной аутодермопластики / Л.П. Пивоварова, И.В. Шлык, Ю.В. Юрова, И.В. Осипова, О.Б. Арискина, М.Е. Малышев // Инфекции в хирургии.-2013.- № 1.-С. 30-34.

13. Пивоварова, Л.П. Развитие Т-лимфоцитопении у пострадавших с сочетанной травмой / Л.П. Пивоварова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, И.В. Осипова //ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии,- 2013.-Т. 5, № 1.- С. 121-125.

14. Малышев, М.Е. Состояние моноцитопоэза и функциональная активность моноцитов при сочетанной травме / М.Е. Малышев, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, Т.Г. Хабирова // Инфекции в хирургии.- 2013.-Т.10, № 3. -С. 19-22.

15. Малышев, М.Е. Посттравматическая анемия у пострадавших с тяжёлой механической травмой / М.Е. Малышев, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова // Скорая медицинская помощь.-2013.-Т.14.-№4.-С.41-47.

16. Ильина, В.А. Клинико-морфологические особенности сепсиса у пострадавших с тяжёлой термической травмой / В.А. Ильина, М.М. Ермолаева, Р.В. Вашетко, О.Д. Ягмуров, М.Е. Малышев // // Инфекции в хирургии.- 2013.-Т.10, № 3. - С. 39-41.

Статьи, тезисы докладов и статей, научные издания, методические

руководства

17. Пивоварова, Л.П. Иммунная реактивность пострадавших с шокогенной ожоговой травмой / Л.П. Пивоварова, H.A. Кладухина, И.В. Шлык, М.П. Логинова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина // Материалы конференции хирургов Украины. - 2002. -С 585.

18. Пивоварова, Л.П. Особенности иммунной реактивности пострадавших с шокогенной ожоговой травмой / Л.П. Пивоварова, H.A. Кладухина, И.В. Шлык, М.П. Логинова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина // Тезисы докл. 5 конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии". - Москва, 2002.- Т. II. - С. 110

19. Арискина, О.Б. Взаимосвязь иммунной реактивности, эндотоксикоза и исхода шокогенной травмы / О.Б. Арискина, Л.П. Пивоварова, И.В. Осипова, М.П. Логинова, H.A. Кладухина, М.Е. Малышев // Материалы 7-ой Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге". Медицинская иммунология. - 2003.-Т.5, № 3-4. - С. 390.

20. Пивоварова, Л.П. Влияние перфторана на функциональную активность моноцитов крови пострадавших с ожоговой травмой / Л.П. Пивоварова, H.A. Кладухина, И.В. Шлык, М.П. Логинова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев // Материалы I Всероссийской конференции по иммунотерапии с международным участием. -Сочи, 2003. - С. 53

21. Багненко, С.Ф. Прогностические критерии сепсиса при ожоговой болезни / С.Ф. Багненко, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, М.П. Логинова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, И.В. Шлык // Russion Journal of immunology. 2004,- Vol.9. - Suppl.l. -P. 176.

22. Пивоварова, JI.П. Клинико-иммунологические критерии инфекционных осложнений при термической травме. Пособие для врачей / Л.П. Пивоварова, K.M. Крылов, И.В. Шлык, М.П. Логинова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, H.A. Кладухина, Е.В. Сорокина, Т.В. Разумова, М.Е. Малышев - Санкт-Петербург, 2005.-49C.

23. Пивоварова, Л.П. Корригирующее влияние препарата «Деринат» на функциональную активность фагоцитов крови и уровень секреторного IgA у больных с гнойными заболеваниями придатков матки / Л.П. Пивоварова, М.И. Громов, Е.И. Новиков, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.П. Логинова, К.Ю. Бобров, М.Е. Малышев, Е.Ф. Лимантова, Е.В. Сорокина // Медицинская иммунология. -2005. - Т. 7, № 2-3. - С. 455-456

24. Пивоварова, Л.П. Иммунопрофилактика инфекционных осложнений у пациентов группы риска при эндопротезировании тазобедренного сустава / Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.П. Логинова, М.Е. Малышев, C.B. Хрыпов, Д.В. Прютц //Тезисы на конференции. VII Всеармейская международная конференция. «Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургической инфекции»,- Москва, 2007. - С.205.

25.Лобзин, Ю.В. Опыт долгосрочного криохранения костного мозга // Ю.В. Лобзин,

B.Н. Александров, Ш.М. Багаутдинов, А.Н. Гребенюк, Л.П. Пивоварова, И. В. Осипова, М.Е. Малышев, А.Н. Богданов, В.П. Румакин, Л.И. Колюжная // Вестник Российской Военно-медицинской академии.-2008. -№ 1(21).- С. 104-107.

26. Пивоварова, Л.П. Оксидантная и антиоксидантная активность крови у пострадавших с травматическим шоком / Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, М.Е. Малышев, И.В. Осипова, В.Н. Лапшин, И.В. Страхов, И.А. Сокорнов // Российский иммунологический журнал -2008. - Т. 2 (11), № 2-3 - С. 183.

27. Крылов, K.M. Прогнозирование, диагностика и лечение инфекционных осложнений и сепсиса у пострадавших с шокогенной механической и ожоговой травмой. Пособие для врачей. / K.M. Крылов, Л.П. Пивоварова, Ю.Б. Шапот, И.В. Куршакова, И.В. Шлык, О.Б. Арискина, М.Е. Малышев, И.В. Осипова - Санкт-Петербург.-2008. - 58с.

28. Пивоварова, Л.П. Содержание секреторного IgA в крови как показатель активности воспаления при остром панкреатите / Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, В.Р. Гольцов, Д.А. Дымников // Аллергология и иммунология . - 2009. - Т. 10, №2,- С.264

29. Пивоварова, Л.П. Бактерицидная активность лейкоцитов и содержание ИЛ-4, ИЛ-6 и СРБ в крови больных острым панкреатитом / Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, В.Р. Гольцов, Д.А. Дымников //Материалы X конгресса по аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. - Казань, 2009.-

C.112

30. Шилов, В.В. Экспресс-диагностика системного воспалительного ответа у пациентов с острым отравлением наркотическими веществами опийной группы. / В.В. Шилов, Л.П. Пивоварова, В.А. Лукин, И.В. Осипова, О.Б. Арискина, М.Е. Малышев //Нейроиммунопатология: Материалы Шестой Российской конференции. Москва - Патогенез. - 2010. - Т. 8., №1 .-С. 64-65.

31. Пивоварова, Л.П. Бактериальная транслокация в системный кровоток у пострадавших с сочетанной травмой/ Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, А.Е. Чикин, Л.Н. Попенко, Д.Ш. Саъдулаев // Материалы

XIV Всероссийского научного Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Тезисы доклада. - Медицинская иммунология.- 2011,- Т.13, № 4-5.- С. 488.

32. Шанин, С.Н. Корреляционные взаимоотношения между показателями активности защитных функций и тяжестью постгравматического состояния пациентов с тяжёлой сочетанной травмой и острой кровопотерей / С.Н. Шанин, О.Д. Чесноков, И.А. Козинец, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, Л.П. Пивоварова, Е.Г. Рыбакина // Тезисы докладов III Международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии».- Санкт-Петербург, 2011.- С. 159.

33.Горанчук, Д.В. Диагностика тяжести повреждений головного мозга в раннем посттравматическом периоде / Д.В. Горанчук, И.В. Осипова, Л.П. Пивоварова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, Ю.А. Щербук //Материалы всероссийской науч,-практич. конф.» «Совершенствование медицинской помощи больным с нейротравмой и пострадавшим в ДТП» совместно с науч.-практич. конф. «Скорая медицинская помощь 2011». - Санкт-Петербург, 2011,- С.58-59.

34. Малышев, М.Е. Иммунологические критерии развития сепсиса при тяжёлой механической травме / М.Е. Малышев, Л.П. Пивоварова, О.Б. Арискина, И.В. Осипова, А.Е. Чикин, А.А. Афанасьев // Материалы всероссийской науч.-практич. конф.» «Совершенствование медицинской помощи больным с нейротравмой и пострадавшим в ДТП» совместно с науч.-практич. конф. «Скорая медицинская помощь 2011». - Санкт-Петербург, 2011,- С.143-144.

35. Пивоварова, Л.П. Критерии развития тяжелого сепсиса при острых отравлениях азалептином. / Л.П. Пивоварова, М.Е. Малышев, В.А. Лукин, И.В. Осипова, О.Б. Арискина // Материалы VII Конференции по нейроиммунопатологии (с международным участием), Москва,- Патогенез. - 2012. - Т. 10. № З.-С. 62-63.

36. Сочетанная механическая травма. Руководство для врачей / Коллектив авторов. Под ред. Тулупова А.Н..- СПб.ЮОО «Стикс», 2012,- 393с.

37. Пивоварова, Л.П. Прогностическое значение белка S100P для течения тяжёлой сочетанной травмы / Л.П. Пивоварова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина // Материалы IV международного симпозиума «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии»,- Санкт-Петербург, 2013.- С.130-131.

38. Шилов, В.В. Применение препарата на основе аминобензойной кислоты у больных с отравлениями нейролептиками, сопровождающимися гиперпротеолизом /В.В. Шилов, Л.П. Пивоварова, В.Ю. Ковтун, Саноцкий В.И., В.А. Лукин, М.Е. Малышев // Профилактическая и клиническая медицина,- 2013.- №1(46).- С.52-56.

39. Пивоварова, Л.П., Ранние маркеры нарушения нейроиммуноэндокринных взаимодействий при тяжёлой ожоговой травме / Л.П. Пивоварова, И.В. Осипова, М.Е. Малышев, О.Б. Арискина, И.В. Шлык, О.В. Орлова // Российский иммунологический журнал. - Т.7 (16), №2-3,- 2013.- С.168.

40. Шилов, В.В. Лабораторные признаки синдрома системной воспалительной реакции и тяжелого сепсиса у пациентов с острыми отравлениями веществами наркотического действия / В.В. Шилов, Л.П. Пивоварова, В.А. Лукин, М.Е. Малышев // Материалы 2 съезда врачей неотложной медицины,- Москва, 2013,-С.122.

41.Lobzin, Yu.V. Expérience of long-term criogenic bone marrow storage. Hemopoietic stem cells transplantation / Yu.V. Lobzin, V.N. Alexandrov, Sh.M. Bagautdinov, A.N. Grebeniuk, L.P. Pivovarova, I.V. Osipova, M.Ye. Malyshev, A.N. Bogdanov, L.I. Koluzhnaia // Abstracts of international meeting dedicated to the memory of Raisa Gorbacheva. - Saint-Peterburg, 2007. - P. 25.

Список сокращений

АОА - антиоксидантная активность

АПК - антигенпрезентирующие клетки

АФК - активные формы кислорода

БШТ - балл шокогенности травмы

ГКГС - главный комплекс гистосовместимости

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови

ИФА - иммуноферментный анализ

КМ - костный мозг

ЛПС - липополисахарид

МКА - моноклональные антитела

НГ - нейтрофильные гранулоциты

НК - натуральные киллеры

НСБ - нейроспецифические белки

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

ПОН - полиорганная недостаточность

СВ - системное воспаление

СВО - системный воспалительный ответ

СРБ - С-реактивный белок

ССВО - синдром системного воспалительного ответа

СТ - сочетанная травма

ТБ - травматическая болезнь

ТКР - Т-клеточный рецептор

ХЛ - хемилюминесценция

ЧМТ - черепно-мозговая травма

CD - дифференцировочные кластеры

ЕРО - эритропоэтин

GM-CSF - гранулоцитарномоноцитарный колониестимулирующий фактор НВ - гемоглобин

HLA-DR- антиген II класса главного комплекса гистосовместимости IFN - интерферон Ig - иммуноглобулин IL- - интерлейкин

ILlra - рецепторный антагонист интерлейкина -1 ISS - Injury Severity Score

МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроците

МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроците

MCV - средний объем эритроцита

PGE - простогландин Е

RBC - количество эритроцитов в крови

SCF - фактор стволовых клеток

SOFA - sepsis related organ failure assessment score

TGF - трансформирующий ростовой фактор

TLR - Toll-like receptor,ТоП-подобный рецептор

TNF - фактор некроза опухолей