Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Повреждение сосудистого эндотелия в процессе лечения острых миелоидных лейкозов

На правах рукописи

ЧЕРВОНЦЕВА Алевтина Михайловна

ПОВРЕЖДЕНИЕ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗОВ

14 00 29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□0317081Э

Москва 2008

003170819

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители

член-корреспондент РАМН, профессор В Г Савченко

доктор биологических наук ЮА Романов

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор А А Масчан

доктор биологических наук, профессор Н С Сергеева

Ведущая организация

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им М Ф Владимирского

со

час

Защита состоится" 18" июня 2008 г в на заседании диссертационного Совета Д 002 042 01 при Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу 125167, г Москва, Новозыковский проезд, д 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан" 16 " мая

2008г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е Е Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

До настоящего времени химиотерапия остается основным методом лечения острых лейкозов Несмотря на большое разнообразие цитостатических средств, базисными препаратами в терапии острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) являются цитозин-арабинозид (цитозар, цитарабин) и даунорубицин Семидневная инфузия цитарабина в комбинации с трехдневным введением антрациклинового антибиотика является основой всех ныне существующих программ и проводится большинству больных на всех этапах терапии ОМЛ индукции, консолидации и поддержания ремиссии [Савченко, 1999] Одним из прогрессивных методов лечения ОМЛ считается применение высоких доз цитарабина, благодаря чему удается существенным образом увеличить процент общей и безрецидивной выживаемости пациентов [Cassileth, 2005] Использование высоких или средних доз цитарабина в сочетании с митоксантроном и идарубицином наиболее эффективно у больных с рецидивами и резистентными формами ОМЛ [Савченко, 2004, Tallman, 2005] Поскольку основным в тактике современной химиотерапии острых лейкозов является принцип интенсификации лечения, риск возникновения различных осложнений со стороны многих органных систем (нервной системы, желудочно-кишечного тракта, печени и тд), включая сердечно-сосудистую, возрастает

Сосудистый эндотелий является одной из основных тканевых систем организма человека Покрывая всю поверхность сосудистого русла, эндотелий характеризуется высокой функциональной активностью и участвует в обменных процессах, регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, формировании новых сосудов, работе свертывающей-противосвертывающей системы крови и т.д [Cines, 1998] Воздействие различных неблагоприятных факторов приводит к "дисфункции" эндотелия, следствием чего могут являться нарушения сосудистого тонуса, проявление признаков провоспалительных и протромботических изменений [Esper, 2006, Endemann, 2004]

В условиях in vivo эндотелий обладает сравнительно низкой пролиферативной активностью и относится к медленно обновляемым тканям [Hopson, 1984] Однако, скорость его регенерации в отдельных участках сосудистого русла при некоторых состояниях (как патологических, так и физиологических) и воздействиях может значительно возрастать и достигать десятков процентов в сутки [Schwartz, 1977, Folkman, 1995] По всей видимости, пролиферирующие и, в меньшей степени, покоящиеся эндотелиальные клетки могут становиться потенциальной мишенью для цитостатических препаратов, применяемых в терапии лейкозов Кроме того, являясь внутренней оболочкой сосудов, эндотелий первым контактирует с препаратами, вводимыми в кровеносное русло пиковые концентрации цитостатических препаратов, по-видимому, могут оказывать прямое повреждающее действие на эндотелиальные клетки В то же время, эндотелий может обладать

чувствительностью и к более низким концентрациям препаратов, длительное время находящихся в кровотоке [de Vos, 2004]

Спектр сосудистых осложнений, возникающих на фоне применения химиотерапевтических препаратов, достаточно широк от асимлтоматических флебитов до потенциально смертельных васкулопатий (вено-окклюзионная болезнь, тромботическая микроангиопатия) [Shahab, 2006] При этом индуцированное токсическое воздействие на эндотелий сосудов в той или иной мере усугубляется в случае его исходной неполноценности [Баркаган, 2001] Несмотря на то, что клинические проявления сосудистой патологии для многих препаратов хорошо известны, детальные механизмы ее развития в большинстве случаев изучены недостаточно

В настоящее время лабораторная диагностика поражений сосудистого эндотелия в основном заключается в определении в крови растворимых маркеров, специфичных для эндотелиальных клеток (фактор Виллебранда, тромбомодулин, эндотелин-1, растворимые формы молекул клеточной адгезии и др ) Однако их содержание может зависеть от ряда сопутствующих патологий, не связанных с поражением эндотелия, что указывает на недостаточную достоверность их анализа [Borawski, 2001, Woywodt, 2004, Endemann, 2004] Одним из перспективных методов диагностики сосудистых заболеваний является определение уровня циркулирующих эндотелиальных клеток [Dignat-George, 2000] Детекция клеток эндотелия в крови по совокупности специфичных маркеров позволяет оценить не только функциональные изменения и степень поражения эндотелия, но также и последующее его восстановление

Цель исследования*

Основной целью данного исследования явилось изучение некоторых механизмов развития сосудистой патологии, обусловленной возможным повреждением эндотелиальных клеток в процессе цитостатической терапии

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи

1 Разработать экспериментальную модель для оценки эффектов цитостатических препаратов с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека

2 Изучить влияние цитостатических препаратов с различным механизмом действия на пролиферацию, жизнеспособность эндотелиальных клеток и организацию монослоя эндотелия

3 Исследовать функциональные изменения культивируемых эндотелиальных клеток при воздействии цитозин-арабинозида и даунорубицина, включая экспрессию различных классов молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелия с клетками периферической крови

4 Исследовать основные механизмы репарации эндотелия после применения цитостатических препаратов wfro

5 Отработать методические приемы и исследовать в динамике содержание циркулирующих эндотелиальных клеток в крови здоровых доноров и больных OMJ1 в процессе лечения

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые охарактеризовано влияние основных цитостатических препаратов (цитарабина и даунорубицина) и их сочетаний, применяемых в терапии больных ОМЛ, на структурные и функциональные особенности клеток эндотелия с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека Оценено влияние препаратов на целостность монослоя и жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия

Впервые установлено, что инкубация культивируемых клеток с цитозин-арабинозидом вызывает ряд изменений, имеющих провоспалительную направленность усиливается экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Е- и Р-селектинов, ICAM-1, VCAM-1 и РЕСАМ-1) и возрастает адгезивность эндотелия для клеток периферической крови

В ходе экспериментов in vitro удалось прояснить основные способы репарации поврежденного монослоя эндотелиальных клеток после воздействия цитостатических препаратов

Отдельный раздел исследования был посвящен изучению повреждающего действия проводимой химиотерапии на эндотелий сосудов больных ОМЛ Впервые методом проточной цитометрии проведено динамическое исследование содержания циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, CD146+/CD45- в крови больных ОМЛ на фоне разных программ лечения Установлено, что введение цитостатических препаратов сопровождается увеличением содержания циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке, что подтвердило данные, полученные в экспериментальной модели in vitro

Впервые установлено, что после цитостатического воздействия в период миелотоксического агранулоцитоза в крови больных ОМЛ выявляются клетки-предшественники эндотелия, появление которых может быть связано с процессами регенерации поврежденного эндотелия Доказательством жизнеспособности и функциональной активности этих клеток явились результаты культивирования мононуклеарных клеток крови, показавшие наличие колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд)

Полученные экспериментальные данные позволили расширить существующие представления о механизмах развития сосудистой патологии у больных на фоне проводимой химиотерапии Детекция циркулирующих эндотелиальных клеток может иметь

практическое значение в диагностике поражения эндотелия при использовании различных цитостатических препаратов в онкологической практике Кроме того, определение исходного числа эндотелиальных клеток и динамический контроль их содержания в крови могут быть использованы в практическом здравоохранении для оценки эффективности противоопухолевого лечения

Апробация работы Результаты работы были представлены на заседании Проблемной комиссии ГУ ГНЦ РАМН (04 03 2008), 46-й Ежегодной конференции Американского общества гематологов (США, 2004), 25-й Международной гематологической школе (Москва, 2004), Ежегодной сессии Международной ассоциации по клеточной терапии ISCT (Берлин, 2006), Международном конгрессе «Моделирование болезней крови» (Лион, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисных сообщения

Структура и объем работы Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы» Работа изложена на 118 страницах и включает 22 рисунка, 4 таблицы и список литературы, содержащий 239 ссылок

Положения, выносимые на защиту

1 Препараты, применяемые в терапии острых лейкозов (цитозин-арабинозид и даунорубицин), оказывают различное по характеру повреждающее действие на эндотелиальные клетки человека т vitro

2 Воздействие цитозин-арабинозида приводит к изменениям функциональных параметров культивируемых эндотелиальных клеток

3 Цитостатическая терапия острых лейкозов индуцирует повреждение эндотелия т vivo, проявлением чего является выявление в крови пациентов циркулирующих эндотелиальных клеток

4 Регенерация эндотелия после повреждения химиотерапевтическими препаратами in vitro и in vivo происходит за счет различных механизмов изменения формы и размеров дифференцированных эндотелиальных клеток, а также пролиферации и вступления в дифференцировку колониеобразующих единиц эндотелия

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток человека Среда 199 с солями Эрла, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), сбалансированный солевой раствор Эрла, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), L-глутамин,

пируват натрия, пенициллин-стрептомицин, трипсин-ЭДТА, фосфатный буфер Дульбекко (ФБД) были получены от фирмы GIBCO (США) Диспаза (нейтральная протеаза из В Polymyxa), гепарин (натриевая соль), желатин (культуральной степени чистоты), бычий сывороточный альбумин (БСА) - произведены фирмой Sigma (США) Фактор роста эндотелиальных клеток (ECGS - Endothelial Cell Growth Supplement), выделенный из ткани мозга человека, был предоставлен Научно-практической лабораторией стволовых клеток человека ФГУ РКНПК Росмедтехнологий

Чашки Петри, культуральные планшеты, центрифужные пробирки, пипетки и другие расходные материалы для культивирования клеток - продукция фирм Corning (США) или Costar (Голландия)

Для получения первичных культур эндотелиальных клеток пупочной вены человека применяли метод Gimbrone et al [1974] в модификации А С Антонова и соавт [1981] Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 10 минут при 600g, осадок ресуспендировали в среде культивирования (среда 199 с добавлением 25 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина, 2 мМ 1-глутатна, 1 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% ЭТС, 25 мкг/мл ECGS и 5 Ед/мл гепарина) и высевали на предварительно покрытые 0,1% желатиной чашки Петри диаметром 100 мм Культуры клеток помещали в СО-инкубатор и выращивали при температуре +37°С и 5% С02 Через 18-24 часа культуры отмывали раствором Эрла и заменяли среду культивирования на свежую В дальнейшем смены сред проводили через 2-3 суток

После достижения клетками состояния конфлуэнтности культуры отмывали раствором Эрла, снимали трипсином-ЭДТА, ресуспендировали в свежей порции среды культивирования и в разведении 13-15 использовали для посадки под конкретные эксперименты В работе использовали монослойные культуры 1-2 пассажа Ежедневный контроль культур проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии (Diaphot-TMD, Nikon, Япония)

Моделирование химиотерапевтического воздействия in vitro Для моделирования повреждающего действия на эндотелий в работе использовали два препарата цитозин-арабинозид и даунорубицин Цитозин-арабинозид, относящийся к антиметаболитам, был представлен тремя фармацевтическими препаратами, использующиеся в нашей клинике цитозар (Upjohn&Pharmacia, Бельгия), алексан (Henrich MACK, ФРГ), цитарабин (Therabel Pharma, Бельгия) В качестве представителя антрациклиновых антибиотиков исследовали фармацевтический препарат даунорубицина - рубомицина гидрохлорид производства фирмы Лэнс-Фарм, Россия

Исходные препараты разводили в стерильном растворе Эрла до концентрации 10 мг/мл, разделяли на аликвоты и хранили при температуре -20'С Рабочие разведения получали путем непосредственного добавления расчетного количества препарата в среду

культивирования или серией последовательных двукратных разведений Диапазон концентраций в культуральной среде цитозин-арабинозида составлял - 10 нг/мл - 1 мг/мл, даунорубицина - 0,1 мкг/мл - 0,1 мг/мл В ряде экспериментов использовали сочетание различных концентраций обоих препаратов После добавления препаратов среды тщательно перемешивали, и культуры возвращали в С02-инкубатор Оценку морфологических и количественных изменений проводили ежедневно с помощью фазово-контрастной микроскопии

Оценка цитостатического и цитотоксического эффекта

По числу прикрепленных клеток Клетки высаживали в 24- или 48-камерные культуральные планшеты с плотностью порядка 103 клеток/см2 и культивировали до формирования монослоя После 24-часовой инкубации с препаратами в исследуемом диапазоне концентраций эндотелиальные клетки отмывали раствором Эрла, фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на ФБД рН=7 2-7 4, окрашивали 0,1% водным раствором толуидинового синего, отмывали дистиллированной водой и высушивали Для подсчета числа клеток применяли метод компьютеризированной видеомикроскопии [Романов, 2003, Мерзликина, 2005, Romanov, 2007] На распечатках нескольких случайно выбранных полей зрения микроскопа производили подсчет количества прикрепленных к пластику эндотелиальных клеток для каждой концентрации препаратов За 100% принималось число клеток в контрольных культурах

По включению меченого предшественника синтеза ДНК Перед проведением эксперимента исходный концентрат бромодеоксиуридина (БДУ, Cell Labeling Kit, BRDU, Amersham, США) разводили в стерильной культуральной среде в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя Через 24 часа после добавления исследуемых препаратов в контрольные и опытные культуры эндотелиальных клеток добавляли БДУ и инкубировали на протяжении последующих 18 часов Пролиферирующие клетки выявляли с помощью иммуногистохимии культуры отмывали раствором Эрла, фиксировали 15 мин охлажденным до -18 С метанолом и высушивали После регидратации культуры обрабатывали смесью нукпеазы и моноклональных антител к БДУ в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя Дальнейшие этапы окрашивания проводили с использованием биотин-стрептавидин-пероксидазной техники с применением набора реактивов Histoscan в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Monoclonal Detector Kit, Biomeda, США) Результаты оценивали с помощью световой микроскопии

Выявление колониеобразуюших единиц эндотелия (КОЕ-Энд) Эксперименты выполняли в двух модификациях В первом случае культуры эндотелия инкубировали по отдельности с цитарабином и даунорубицином в течение 7 суток Смена культуральных сред на свежие и новые добавления препаратов проводились ежедневно Затем культуры отмывали и заменяли среду культивирования на стандартную Последующие смены сред производили

через 48 часов Динамическое наблюдение за морфологическими и количественными изменениями культур, а также выявление очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-х последующих недель

Во втором случае для подтверждения наличия КОЕ-Энд контрольные и прединкубированные с цитостатическими препаратами в течение 24-48 часов и 5-7 суток культуры эндотелиальных клеток снимали трипсином-ЭДТА и пересаживали на чашки Петри диаметром 60 мм в разведении 1 200 от исходной плотности монослоя Через 3 недели культуры фиксировали и окрашивали толуидиновым синим, после чего подсчитывали число колоний, видимых невооруженным глазом

Оценка адгезивных параметров эндотелиальных клеток и моделирование межклеточных взаимодействий Для оценки изменения экспрессии клетками различных классов молекул клеточной адгезии культуры инкубировали в течение 48-72 часов с цитарабином в концентрации 10-20 мкг/мл Контролем служили культуры, выращенные без добавления препарата Клетки отмывали раствором Эрла и снимали раствором трипсина-ЭДТА, затем осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 45 минут с ФИТЦ-или ФЭ-мечеными мышиными моноклональными антителами к CD54 (1САМ-1), CD106 (VCAM-1), CD62-E (Е-селектан), CD31 (РЕСАМ-1) и CD62-P (Р-селектин) (Becton Dickinson) В качестве негативного контроля использовали неиммунные IgG соответствующего класса (Becton Dickinson) После отмывки ФБД-БСА клетки ресуспендировапи в растворе FaxFlow и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson)

Для подтверждения результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали иммуногистохимический анализ Контрольные и инкубированные с цитарабином 10-20 мкг/мл в течение 48-72 часов культуры фиксировали на пластике в течение 15 мин раствором CellFix (Becton Dickinson), отмывали ФБД и ФБД с добавлением БСА (ФБД-БСА) Следующий этап включал в себя применение того же спектра нативных мышиных моноклональных антител, которые использовались при выявлении молекул клеточной адгезии методом проточной цитометрии Дальнейшее окрашивание проводили с помощью набора реагентов, входящих в Monoclonal Detector Kit (Biomeda) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя Результаты оценивались с помощью световой микроскопии

Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров и больных методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1 077 г/л) с использованием готовой коммерческой среды LymphoSep (ICN) или Histopaque (Sigma-Aldrich) Полученные лейкоциты отмывали центрифугированием в избытке раствора Эрла и ресуспендировали в среде культивирования в концентрации 2х106 кпеток/мл Затем клеточную суспензию в равных объемах добавляли в культуральные среды контрольных и

подвергшихся воздействию цитарабина эндотелиальных клеток Через 30 минут инкубации неадгезировавшие клетки бережно отмывали раствором Эрла, культуры фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом на ФБД и окрашивали по методу Гимза Количество адгезированных лейкоцитов оценивали с помощью метода компьютеризированной видеомикроскопии, описанного в предыдущих разделах

Выявление циркулирующих эндотелиальных клеток

Характеристика больных В работе использовали образцы венозной крови здоровых доноров и больных ОМЛ, находящихся на лечении в клинике химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (руководитель отделения член-корреспондент РАМН, д м н , профессор В Г Савченко) В исследование были включены 7 больных (5 женщин и 2 мужчин) в возрасте от 21 до 51 года (среднее 40+11) Основные характеристики пациентов приведены в Таблице 1 В контрольную группу было включено 3 здоровых донора 2 женщины и 1 мужчина в возрасте 24, 31 и 34 лет

Таблица 1 Характеристика пациентов

№ Пациент Возраст пол Диагноз " Предшествующее лечение Терапия на момент исследования

1 САА 32/М ОМЛ (М2) 1 курс "7+3 с вепезидом-16", "НАМ" "НАМ"

2 ТАЖ 44/Ж ОПЛ (МЗ) 1 курс "7+3" с весаноидом "7+3"

3 ЗТФ 50/Ж ОМонЛ (М5) 2 курса "7+3 с вепезидом-16", "НАМ" "НАМ"

4 тво 21 /М ОММЛ (М4) 1 курс "7+3 с вепезидом -16", 2 курса "НАМ" "HD-Ara-C"

5 шом 36/Ж ОМЛ (М2) 2 курса "7+3 с вепезидом -16", "HAD" "HAD"

6 КИА 51 /Ж ОМЛ (М1-2) 1 курс "7+3 с вепезидом -16" "НАМ"

7 А О С 45/Ж ОМЛ (М1-2) 2 курса "7+3 с вепезидом -16" "7+3"

Варианты химиотерапии, проводимой больным на момент исследования

• курс "7+3" цитарабин 100 мг/м2 2 раза в сутки 1-7-й день, даунорубицин 45 мг/м2 или 60 мг/м21 раз в сутки 1-3-й день

• курс "НАМ" цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-3-й день, митоксантрон 10 мг/м21 раз в сутки 3-5-й день

• курс "HD-Ara-C" цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-й, 3-й, 5-й день

• курс "HAD" цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 3-5-й день, даунорубицин 45 мг/м21 раз в сутки 1-3-й день

Интервал менаду предшествующим курсом химиотерапии и моментом начала обследования составлял от 33 до 63 дней (в среднем 44 дня) Определение и анализ количества эндотелиальных клеток в периферической крови проводились всем больным перед началом лечения, в процессе введения цитостатических препаратов и в течение длительного периода после химиотерапии Каждому больному было выполнено от 5 до 7 повторных исследований В день взятия образцов параллельно выполняли исследование уровня лейкоцитов крови

Подготовка и исследование образцов крови Для определения циркулирующих эндотелиальных клеток у больных с ОМЛ применяли метод мультипараметрической проточной цитометрии Из цельной гепаринизированной (50 Ед/мл) крови отбирали аликвоты в объеме от 100 мкл до 1000 мкл (в зависимости от содержания лейкоцитов) Образцы объемом более 100 мкл предварительно центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения всех клеточных элементов После удаления избытка плазмы до получения конечного объема 100-150 мкл клетки инкубировали в течение 30 минут при температуре +2-8'С с антителами к С045-ФИТЦ и одному из исследуемых маркеров С054-ФЭ, С034-ФЭ, С0146-ФЭ (Becton Dickinson) После лизиса эритроцитов (BD FACS Lysing Solution) клеточные суспензии анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson) Накопление данных прекращали после получения от 100000 до 250000 С045-положительных событий (лейкоцитов) в каждом образце За основу анализа был взят стандартный протокол выявления гемопоэтических стволовых клеток ISHAGE [Barnett,1999] Циркулирующими эндотелиальными клетками считали события, определяемые как клетки с фенотипом CD45-/CD34+ или CD45-/CD54+, или CD45-/CD146+, располагающиеся в левом верхнем углу графика FL1/FL-2 События с размерами меньше, чем у лимфоцитов, из анализа исключались В дальнейшем проводился пересчет относительного содержания эндотелиальных клеток в соответствии с уровнем лейкоцитов крови на момент исследования

Культивирование эндотелиальных клеток крови Гепаринизированную кровь (20 мл) переносили в стерильную пробирку и оставляли на 30-60 минут для седиментации эритроцитов Обогащенную лейкоцитами плазму переносили в отдельную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин Осадок ресуспендировали в 10 мл среды для культивирования эндотелиальных клеток и помещали в культуральные флаконы с площадью поверхности 75 см2, заранее покрытые желатином Через 5-7 дней среду с неприкрепившимися клетками удаляли и заменяли на свежую Динамическое наблюдение за прикрепившимися клетками производили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-6 недель

При достижении колониями размеров около 1 - 4 мм культуры отмывали раствором Эрла и пассировали на желатинизированные флаконы площадью 25 см2 и продолжали культивирование до формирования монослоя При необходимости клетки вновь пересевали с разведением 13

Для подтверждения эндотелиальной природы полученных клеточных колоний и культур, полученных в результате пассирования, клетки анализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания и проточной цитометрии В данной части исследования использовали мышиные моноклональные антитела к CD54 (ICAM-1), CD106 (VCAM-1), CD31 (РЕСАМ-1), CD62P (Р-селектину), CD62E (Е-селектину), CD34, CD146, VEGFR-2/KDR (R&D Systems, США) и кроличьи поликлональные антитела к фактору фон Виллебранда (Sigma, США)

С целью выявления в составе сформированного монослоя сохранных функциональных колониеобразующих единиц эндотелия культуры 2-3 пассажа пересевали на покрытые желатином культуральные флаконы 75 см2 в разведении 1 100 от исходной плотности монослоя (5-6x104 кл/см2) Динамическое наблюдение за формированием очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии в течение 4 недель В дальнейшем полученные колонии окрашивали толуидиновым синим либо фенотипировали с помощью ранее применявшихся антител к Р-селектину и фактору фон Виллебранда

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1 Повреждение и репарация эндотелия «л vitro

Культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека 1-го и 2-го пассажей, использованные в работе, были представлены гомогенной популяцией одноядерных клеток веретеновидной или полигональной формы При культивировании в среде, содержащей дополнительный фактор роста (ECGS) клетки активно пролиферировали, и при использовании БДУ индекс мечения культур в стадии активного роста достигал 40-60% По мере достижения конфлюэнтного состояния (состояния монослоя) скорость роста клеток

замедлялась вследствие контактного торможения, а культуры приобретали характерный вид "булыжной мостовой"

Влияние цитозин-арабинозида на морфологию и пролиферацию эндотелиальных клеток В процессе отработки экспериментальной модели был исследован широкий диапазон концентраций препарата в среде культивирования, с запасом перекрывающий его содержание в крови больных при использовании средних (100 мг/мг) и высоких (3 гр/м2) доз

При исследовании различных препаратов группы цитозин-арабинозида, полученных от различных фирм-производителей (цитозар, цитарабин, алексан), существенных различий в их активности выявлено не было (Рис 1) Для оценки эффективности препаратов был проведен анализ их активности в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1 мг/мл При фазово-контрастной микроскопии культур уже через 3-4 часа наблюдалось появление открепившихся свободно плавающих клеток, число которых визуально возрастало пропорционально времени инкубации и концентрации препарата в среде культивирования

150 * 125

2 § 100

ш

§ | 75 50 25 0

О £

¡1 зг

*— цитарабин

цитозар о— алексан

Л

Рисунок 1

Сравнительный анализ цитостатического действия различных препаратов на основе цитозин-арабинозида

500 31 8 2 0,5 0,06 КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА, ыкг/мл

При 24-часовой инкубации действие цитозин-арабинозида сохранялось практически неизменным в широком диапазоне концентраций от 0,5 мкг/мл до 1 мг/мл и прекращалось (число клеток достигало контрольного уровня), при концентрации менее 100 нг/мл (Рис 2А) В серии экспериментов с применением БДУ было установлено, что мишенью цитозин-арабинозида являются клетки, вступающие в митотический цикл Добавление препарата приводило в течение 18-24 часов к полному исчезновению из культуры БДУ-меченых клеток Жизнеспособность пролиферирующих клеток сохранялась (меченые БДУ клетки выявлялись в составе монослоя) лишь при концентрациях препарата, не превышающих 500 нг/мл (Рис 3), что соответствовало данным, приведенным на рисунке 2А

Параллельно с откреплением части клеток в культурах эндотелия, инкубируемых в присутствии цитарабина, наблюдалось снижение плотности монослоя по сравнению с контрольными (Рис 4 А, Г) При времени инкубации, не превышающем 24-48 часов, действие препарата было обратимым уже через 18-24 часа после отмывки и замены среды на свежую в культуре появлялось значительное количество БДУ-меченных, а в последующие сутки делящихся клеток

El'»

150

Si

5 в m § i

Sí so

А цитарабин j Л ii............................../ . Б ДНР

ч i

500 31 8 2 0,5 0,06 1 00 25 6 1.5 0.4 0,1 КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА, мкг/мл

В —°— цитарвбин —*—ДНР, 75 мкг/мл + цитараби* Г -о-ДНР —•—ДНР + цитарабин, 100 мкг/мл

U —ьЗ

Рисунок 2.

Изменение числа жизнеспособных ЭК при инкубации с различными концентрациями цитозин-арабинозида (А), даунорубицина(Б)и их комбинаций (В и Г).

1000 250 63 16 100 25 6 1,5 0,4 0,1

КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА, «кг/ил

* Ч

, * - * * У *'«

■М-*, V ..

Л> »'■ . V

• V».,** V

Sk i . * * .N

«Mi %

'i

v.»*;

A

ík: '» i

. * ^

, í < ■ fc.VS

* . * '' 't * • «

** - ~ ■ * k *

i S '-i.'*-

,»* * •

»4 * .

Рисунок 3. Влияние цитозин-арабинозида на включение БДУ в культуре эндотелиальных клеток человека. А - контрольные клетки; Б и В - то же, в присутствии цитозин-арабинозида, 100 мкг/мл и 200нг/мл, соответственно. Иммунопероксидазная техника, Х200.

Морфологические изменения эндотелиальных клеток под действием даунорубицина. В широком диапазоне концентраций (от 1,5 мкг/мл до 0.1 мг/мл) даунорубицин оказывал выраженное цитотоксическое действие, приводящее в течение 24 часов к повреждению значительной части эндотелиальных клеток (Рис. 2Б) и нарушению целостности монослоя (Рис. 4Б). При уменьшении концентрации препарата до 0,4-0,75 мкг/мл число прикрепленных к пластику клеток возрастало, но монослой по-прежнему был нарушен. Лишь при концентрации даунорубицина в среде, равной или менее 200 нг/мл жизнеспособные эндотелиальные клетки были способны оставаться в состоянии монослойной культуры, несмотря на гибель части из них (Рис. 4В). Увеличение времени инкубации с препаратом до 48 часов приводило к возрастанию его эффекта примерно вдвое.

Рисунок 4. Морфологические изменения в культуре эндотелиальных человека при инкубации с даунорубицином (Б-В) и цитозин-арабинозидом (Г-Е).

А - контрольные клетки; Б и В - клетки после 48 часов инкубации с ДНР, 5 мкг/мл и 200 нг/мл, соответственно; Г и Д - вид культур через 48 часов и 7 суток инкубации с цитозин-арабинозидом, 10 мкг/мл; Е - культура Д: появление колоний ЭК через 10 суток после удаления цитозин-арабинозида из среды культивирования. Фазовый контраст, Х100.

Изменения эндотелиальных клеток при совместном применении цитозин-арабинозида и даунорубицина. С целью выявления возможного потенциирования действия двух препаратов, было проведено исследование по их одновременному добавлению в культуральные среды, Как видно из рисунка 2 В и Г, разница между количеством эндотелиальных клеток, инкубированных с цитозин-арабинозидом в широком диапазоне концентраций и даунорубицином в дозе 0,75 мкг/мл и "монотерапией" цитозин-арабинозидом составила 25%. В тоже время кривые, соответствующие содержанию клеток после воздействия разных доз даунорубицина в присутствии или отсутствии цитарабина (100 мкг/мл), практически идентичны.

Таким образом, при совместном использовании препаратов было установлено, что цитозин-арабинозид практически не оказывает влияния на эффекты даунорубицина, а цитотоксичность смеси определяется в основном антрациклиновым антибиотиком. Репарация культуры эндотелия. Колониеобразующие единицы эндотелия. На основании ранее полученных данных о схожести воздействия доз цитозин-арабинозида на эндотелиальные клетки в широком диапазоне концентраций для последующих

экспериментов был выбран препарат цитарабин в условной "терапевтической" дозе, равной 10 мкг/мл среды

При увеличении времени инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином до 6-8 суток в культуре наблюдалось прогрессивное снижение их плотности, вплоть до 15-20% от исходной При этом целостность монослоя сохранялась за счет сильно распластанных клеток, оставшихся на пластике (Рис 4Д) После "отмены" препарата, те отмывки и последующего культивирования клеток эндотелия в стандартной среде, морфология культур оставалась практически неизменной на протяжении последующих 7-9 суток Однако при дальнейшем культивировании на фоне разреженного монослоя было отмечено возникновение отдельно расположенных островков, состоящих из мелких активно пролиферирующих клеток (Рис 4Е) В последующие несколько суток размеры возникших клеточных колоний продолжали возрастать, в результате чего культуры практически полностью восстанавливались

Для подтверждения присутствия в составе культур колониеобразующих клеток была предпринята попытка их выявления с помощью метода клонирования В результате проведенных экспериментов было установлено, что при плотности посадки порядка 10-20 эндотелиальных клеток/см2 отдельные клетки способны пролиферировать и в течение 2-3 недель формировать колонии, содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен клеток Способность культур к клонированию сохранялась после инкубации клеток с цитарабином Однако число колониеобразующих единиц после длительной инкубации с цитарабином было ниже, чем в контрольных культурах (в среднем 1 на 1000 посаженных клеток) и к 14-15 суткам составляло около 1 на 2-3 тысячи

Ни появления отдельных колоний эндотелиальных клеток, ни восстановления целостности монослоя, ни присутствия колониеобразующих клеток в культурах, подвергнутых клонированию после инкубации с даунорубицином, в аналогичных условиях культивирования выявлено не было

Влияние цитарабина на адгезивные параметры эндотелия При изучении экспрессии молекул клеточной адгезии было установлено, что контрольные культуры практически не содержали клеток, зкспрессирующих на своей поверхности Р- и Е-селектины и \/САМ-1 (Рис 5А) В то же время почти все клетки содержали умеренное количество 1САМ-1 и положительно окрашивались на РЕСАМ-1 (Рис 5Д и Ж) В результате 48-72-часовой инкубации с цитарабином эндотелиальные клетки претерпевали ряд структурно-функциональных изменений, описанных выше Одновременно, при иммуногистохимическом анализе в культурах было отмечено появление клеток, зкспрессирующих на поверхности Р-селектин, Е- селектин, а также молекулу клеточной адгезии семейств иммуноглобулинов УСАМ-1 (Рис 5, Б-Г, соответственно) Окрашивание на РЕСАМ-1 становилось более интенсивным по сравнению с контролем (Рис 5, 3) Наиболее выраженные изменения (значительное увеличение экспрессии) были выявлены в отношении 1САМ-1 (Рис 5, Е)

Рисунок 6.

Адгезия мононуклеарных клеток здорового донора к контрольным эндотелиальным клеткам (А) и культурам после инкубации с цитарабином (Б). Окрашивание по методу Гимза. Увеличение, X 250.

Рисунок 5.

Экспрессия молекул клеточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток после 48 часов инкубации с цитозин-арабинозидом.

А - контрольные клетки (рисунок соответствует негативному окрашиванию на Р-селектин, Е-селектин и Ч/САМ-1); Б-Г-экспрессия Р-селектина, Е-селектина и \/САМ-1 в культуре после инкубации с препаратом, соответственно; Д-Е и Ж-3 -экспрессия 1САМ-1 и РЕСАМ-1 до и после добавления цитозин-арабинозида в культуральную среду, соответственно. Иммунопероксидазное окрашивание, Х200.

Результаты гистохимического окрашивания были подтверждены методом проточной цитометрии Число клеток, экспрессирующих Р-селектин, Е-селектин и VCAM-1 увеличивалось и в ряде случаев достигало 2-3% Доля ICAM-1-положительных клеток и интенсивность окрашивания также возрастали после инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином Некоторое усиление окрашивания клеток по сравнению с контрольными культурами отмечалось и в случае РЕСАМ-1

При исследовании адгезивных свойств клеток в контрольных культурах наблюдалась лишь незначительная адгезия мононуклеаров периферической крови - 1,1±0,3 лейкоцита на 10 эндотелиоцитов (Рис 6 А) После 48-72-часовой инкубации с цитарабином, несмотря на объективное снижение плотности монослоя эндотелиальных клеток, количество адгезировавших лейкоцитов значительно возрастало по сравнению с контрольными культурамии составляло 24,3±5,7 лейкоцитов на 10 эндотелиоцитов (Рис 6 Б) При этом значительная часть мононуклеаров за 30 минут эксперимента успевала мигрировать в субэндотелиальное пространство Сходные результаты были получены при анализе адгезии мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациентов, проходящих курс химиотерапии по поводу острого лейкоза

2 Циркулирующие эндотелиальные клетки Колониеобразующие единицы эндотелия

Динамика изменения содержания эндотелиальных клеток в крови больных в процессе лечения Результаты экспериментов, описанные в предыдущих разделах, показали, что цитарабин и даунорубицин обладают способностью приводить к гибели и появлению в культуральной среде значительного количества свободно плавающих эндотелиальных клеток По аналогии с исследованиями т vitro, можно предположить, что клетки, подвергшиеся воздействию цитостатических препаратов, также слущиваются с поверхности сосудистой стенки и оказываются в периферическом кровотоке

Поскольку экспрессия исследуемых маркеров (CD54, CD34, CD146) описана и на активированных лимфоцитах, для исключения ложнололожительных результатов проводили двойное окрашивание с использованием антител к общелейкоцитарному антигену CD45 За циркулирующие эндотелиальные клетки принимали события с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- (Рис 7) Динамика изменений количества клеток с характерным антигенным профилем (молекула клеточной адгезии эндотелия+/С045-) суммирована на рисунке 8

Перед началом введения цитостатических препаратов уровень эндотелиальных клеток в крови больных OMJ1 варьировал в широких пределах (CD54+/CD45- от 10 до 466, CD34+/CD45- от 32 до 453, CD146+/CD45- от 53 до 104 клеток/мл) Наименьшее их количество выявлялось у больных после предшествующего лечения стандартными дозами цитарабина с даунорубицином В контрольной группе здоровых доноров среднее число клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- составило 44, 22,5 и 20

клеток/мл, соответственно, что согласуется с результатами большинства исследователей [Del Papa, 2004; Khan, 2005].

1 fíW"'CT" 1 ÍÍ 0 ' 1 i 1 Se

г-" "1 ^ м | "

« ... - " "гаи* "

i; 'í-i

....."ТТ." i,

CD 54 CD 34 CD 146

ДО ЛЕЧЕНИЯ

CD 54 CD 34 CD 146 В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

Рисунок 7. Результаты выявления циркулирующих клеток с фенотипом С054+/С045-, С034+/СБ45- и С0146/С045- в крови больного Т.В.О. до лечения и на 5 сутки терапии.

Рисунок 8. Динамика изменения содержания циркулирующих клеток с фенотипом С054+/СР45-, С034+/С045- и С0146/С045- в крови больного З.Т.Ф. в процессе лечения и в послекурсовом периоде.

Как следует из рисунка 8, динамика выброса С034+/45- клеток в кровоток практически совпадала с данными, полученными при анализе клеток с фенотипом С054+/С1Э45-Количество циркулирующих эндотелиальных клеток, экспрессирующих 00146, также повышалось в процессе химиотерапии, но в отличие от предыдущих популяций, изменения наблюдались в более ранние сроки и были менее выражены

Сравнительный анализ количественных изменений эндотелиальных клеток в крови больных показал различную степень повреждения сосудистого эндотелия в зависимости от используемых схем цитостатической терапии При проведении курсов высоких доз цитарабина в сочетании с митоксантроном в первые три дня лечения наблюдалось повышение С054+/СР45- клеток в 3,6-5,3 раз по сравнению с исходным уровнем, что совпадало с введением цитозин-арабинозида Последующее применение митоксантрона поддерживало достаточно высокие значения эндотелиальных клеток, превышающие, в одном случае, число клеток, определяемых в первые дни курса В случае использования высокодозной монотерапии цитарабином кратность увеличения уровня С054+/С045-кпеточной популяции составила 5,6 раз Использование в терапии антрациклинового антибиотика даунорубицина приводило к нарастанию числа эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке в 9-24 раза Существенный подъем С034+/45-клеток наблюдался у двоих больных на программах "7+3" и "НТОАта-С" (в 25 и 44 раза, соответственно) При анализе клеток крови с фенотипом С0146+/С045- их количественное содержание увеличивалось в 3-8 раз по сравнениюс исходными значениями

В послекурсовом периоде заметное повторное увеличение клеточных популяций Сй54+/С[Э45- и С034+/С045- отмечалось на 7-9 сутки после окончания курса химиотерапии У большинства больных количество циркулирующих Сй54+/С045- клеток возрастало по сравнению с исходными данными в 6-25 раз, а Сй34+/СС)45- в 4-22 раза, что превышало значения, полученные на фоне проведения цитостатической терапии При этом уровень лейкоцитов крови у шести больных находился в пределах от 0,2 до 0,9x109/л, лишь у одной пациентки он составлял 2х105/л Таким образом, наблюдаемое увеличение содержания циркулирующих эндотелиальных клеток приходилось на период агранулоцитоза или выраженной цитопении В течение дальнейшего наблюдения количество клеток (С054+/С045-, С034+/С045-) у всех пациентов в крови снижалось, но сохранялось выше значений, которые имелись в начале исследования Число клеток, экспрессирующих С0146, напротив, оставалось повышенным или несколько увеличивалось на вторые сутки после лечения с последующим плавным снижением их количества в крови практически до исходного уровня

В целом полученные результаты подтверждают предположение о массивной деэндотелизации сосудистой поверхности в ходе цитостатической терапии Включение в программу лечения даунорубицина значительно повышает риск нарушения целостности эндотелиального слоя, что согласуется с приведенными выше результатами исследований

in vitro. Последующий подъем («вторая волна») числа циркулирующих эндотелиальных клеток, предшествующий по времени началу выхода пациентов из агранулоцитоза дает основание предположить, что эти клетки жизнеспособны и, возможно, являются клетками-предшественниками, способными участвовать в регенерации эндотелия. Доказательством этому могло бы стать выявление функциональных КОЕ-Энд в крови.

Формирование колоний эндотелиальных клеток в культуре лейкоцитов крови. Через 4-6 дней от момента посадки мононуклеаров крови, забранной на пике «второй волны», в культуре отмечалось появление единичных распластанных клеток, морфологически сходных с эндотелиальными. В дальнейшем эти клетки формировали очаги роста, которые со временем увеличивались в размерах. К 9-15 суткам культивирования некоторые колонии достигали диаметра 3-5 мм и насчитывали до нескольких тысяч клеток (Рис. 9).

- - Ч . . ' ■ Г <• , *:

Рисунок 9

Вид колоний эндотелиальных клеток после 3-4 недель

культивирования лейкоцитов крови больных ОМЛ. (Нижнее фото соответствует 4 полям

зрения микроскопа).

Фазово-контрастная

микроскопия, хЮО .

. • - • -. * - • - - ■ -< • '<";.«> Л",, S.T » 1 ' • , '.< ~

' j * г - -i *- Ш" ~

Число клеточных колоний, возникающих на 10-15 сутки культивирования, варьировало у изолятов, полученных из крови пациентов после проведения комбинированной терапии, и составляло от 9 до 25 при посадке лейкоцитов в количестве от 9 до 28x107мл (среднее 14,5+7,8x106/мл), выделенных из 20 мл крови. При посадке лейкоцитов крови пациента после проведенной монотерапии высокими дозами цитозин-арабинозида роста клеточных колоний

отмечено не было. Аналогичные негативные результаты были получены при исследовании крови здоровых доноров и пациентов на момент введения цитостатических препаратов. Фенотипическая характеристика получаемых культур. Для доказательства эндотелиальной природы клеток, формирующих колонии, были использованы методы иммуногистохимии и проточной цитометрии. Несмотря на вариабельность по интенсивности окрашивания, преобладающее число клеток в колониях содержало фактора Виллебранда (ФВ), что подтверждает их эндотелиальную природу. Кроме этого, в некоторых крупных колониях на поверхности клеток, распластанных на пластике и составляющих монослой, наблюдались клеточные тяжи, напоминающие капилляроподобные структуры. Клетки, формирующие эти образования, также положительно окрашивались на ФВ.

При пассировании культур, содержащих несколько крупных эндотелиальных клонов, клетки сохраняли высокую пролиферативную активность и через 10-12 дней культивирования формировали конфлуэнтный монослой. Высокие темпы роста клеток сохранялась и при последующих пассажах. При иммунофенотипическом анализе клетки характеризовались наличием совокупности маркеров, подтверждающих их эндотелиальную природу (1САМ-1, РЕСАМ-1, СР146, ФВ, УЕСРР!-2, С034) (Рис. 10).

Рисунок 10,

Фенотипическая характеристика

эндотелиальных клеток (3 пассаж).

Представленные экспериментальные данные позволяют заключить, что через определенный период после проведения противоопухолевой терапии в крови появляются клетки, способные к инициации культуры эндотелия и к образованию калилляроподобных

структур По-видимому, появление в крови клеток с высоким уровнем пролиферации и способностью к колониеобразованию может быть обусловлено высокой потребностью к восстановлению целостности поврежденного сосудистого эндотелия Несовпадение данных, полученных с помощью проточной цитометрии и культивирования, может быть объяснено тем, что лишь часть выявляемых по фенотипу циркулирующих клеток клоногенны в описанной системе культивирования Отсутствие функциональных КОЕ-Энд в крови пациентов в период введения препаратов и в крови здоровых доноров может объясняться либо их нежизнеспособностью, либо слишком малым их количеством, выходящим за пределы чувствительности метода

Вопрос о происхождении циркулирующих эндотелиапьных клеток, составляющих "вторую волну", не имеет однозначного ответа С одной стороны, возможным источником эндотелиальных клеток может быть сама сосудистая стенка Об этом свидетельствуют данные, полученные Lin и соавт большинство клеток-предшественников эндотелия, циркулирующих в крови (более 95%), имеют не костномозговое происхождение [Lin, 2000] Результаты работ нескольких других коллективов доказывают присутствие в сосудистой стенке резидентных клеток-предшественников, являющихся источником постнатального васкулоогенеза Так называемые "васкулярные" зоны имеются в артериях большого и среднего калибра, а также в венах всех органов и систем [Zengin, 2006, Hu, 2004, Ingram, 2005] Результаты наших собственных исследований и ранее полученные данные также показали присутствие в монослое сосудистого эндотелия популяции "камбиальных" эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным потенциалом и обладающих клоногенными свойствами в культуре клеток [Романов, 1998, 1999] С другой стороны, нельзя исключить, что клетки, выделенные из крови больных, имеют костномозговое происхождение и способны мигрировать в места повреждения эндотелия с восстановлением его целостности, что согласуется с данными, представленными другими авторами [Hur, 2004, Gulati, 2003, Shi, 1998] В эту же пользу говорят и наблюдения, сделанные в ходе данного исследования клетки «второй волны» негативны в отношении маркера дифференцированных эндотелиальных клеток - CD146

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведения экспериментов удалось установить, что и цитарабин, и даунорубицин способны оказывать повреждающее воздействие на культуру эндотелиальных клеток человека Однако характер влияния этих двух препаратов на клетки оказался различен Основной мишенью цитарабина являются пролиферирующие эндотелиальные клетки, и его цитостатическое действие можно охарактеризовать как фазовозависимое При этом, несмотря на гибель значительной части клеток, целостность монослоя эндотелия не нарушается Диаметрально противоположное действие на культуру эндотелиальных клеток продемонстрировал антрациклиновый антибиотик даунорубицин В

широком диапазоне концентраций препарат оказывал выраженный цитотоксический эффект вне зависимости от фазы клеточного цикла Подобное повреждение эндотелиальных клеток приводило к нарушению целостности монослоя, те деэндотелизации поверхности При совместном применении цитарабина и даунорубицина выявлено, что эндотелиотоксичность смеси определяется, главным образом, антрациклиновым антибиотиком

Моделирование цитостатического воздействия с использованием культур эндотелия позволило оценить функциональные изменения эндотелиальных клеток на фоне "терапии" цитарабином Полученные данные доказывают, что в ответ на добавление препарата происходит активация эндотелиоцитов, которая проявляется, прежде всего, изменением экспрессии различных классов молекул клеточной адгезии и усилением взаимодействия с клетками периферической крови Можно предположить, что аналогичные (генерализованные) провоспалительные изменения могут возникать и в сосудистой стенке в процессе лечения Нельзя также исключить, что дисфункция эндотелия является ведущим патогенетическим фактором в развитии сосудистых осложнений у онкогематологических больных в ответ на цитостатаческую терапию

Исследования репаративной способности эндотелия in vitro показали, что восстановление эндотелиальной ткани может осуществляться несколькими путями При незначительных повреждениях, вызванных кратковременным присутствием цитостатического препарата, целостность монослоя поддерживается за счет распластывания сохранившихся клеток В последующие несколько дней количество эндотелиальных клеток и плотность культуры восстанавливаются в результате интенсивной клеточной пролиферации При увеличении продолжительности цитостатического воздействия и истощении пула пролиферирующих клеток поддержание целостности монослоя осуществляется практически исключительно за счет распластывания клеток, оставшихся в культуре Интересно, что даже после длительного присутствия в среде цитарабина и полной элиминации клеток, способных к делению, эндотелий все же сохраняет способность к регенерации Это связано с сохранением в составе моноспоя покоящихся клеток, не подверженных воздействию фазозависимого препарата Данные клетки по праву можно назвать "тканевыми клетками-предшественниками эндотелия" или "колониеобразующими единицами эндотелия" После окончания "курса" эти клетки способны активироваться и продуцировать клоны клеток, приводящих к восстановлению структуры эндотелия Приведенные факты свидетельствуют о "физиологичности" процессов репарации эндотелия в описанной культурапьной системе, чего нельзя сказать об изменениях эндотелиальных клеток в ответ на добавление даунорубицина В результате проведенных экспериментов по выявлению КОЕ-Энд было установлено, что их реакции на этот препарат, по всей видимости, необратимы

Доказательством правоты концепции повреждения эндотелия при цитостатической терапии пациентов с ОМЛ, а возможно, и с другими патологическими состояниями, является выявление циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке

Исследование крови больных ОМЛ, которым проводилась цитостатическая терапия, полностью подтвердило высказанное предположение Уже в первые дни лечения содержание циркулирующих эндотелиальных клеток возрастало (иногда, в десятки раз) по сравнению с исходным уровнем и снижалось после окончания курса Результаты анализа фенотипа циркулирующих эндотелиальных клеток с использованием нескольких маркеров эндотелия (С054, С034, С0146) свидетельствуют, что в процесс повреждения вовлечены клетки, выстилающие как магистральные сосуды, так и капиллярное русло

Одним из возможных механизмов регенерации эндотелия связан с участием недифференцированных эндотелиальных клеток Если данный механизм задействован и в случае регенерации эндотелия после проведенной химиотерапии, то жизнеспособные эндотелиальные клетки-предшественники, способные к кпональному росту, должны присутствовать в крови пациентов в период восстановления Действительно, проведенный анализ показал, что через 7-9 суток после окончания курса в кроаи пациентов определяется популяция С045-негативных клеток, экспрессирующих эндотелиальные маркеры - СР54 и С034 (но не С0146) Высокий уровень таких клеток сохраняется на протяжении 1-2 недель и затем снижается При посадке суммарной фракции лейкоцитов периферической крови, выделенной в период выброса предполагаемых предшественников, и последующем культивировании вначале выявлялись единичные клетки, в дальнейшем - колонии клеток с морфологическими и фенотипическими признаками эндотелия

Таким образом, проведенное исследование доказывает высокий уровень повреяедения сосудистого эндотелия у пациентов, получающих цитостатическую терапию, и расширяет сложившиеся представления о механизмах регенерации эндотелия и развития сосудистой патологии у больных гемобластозами

выводы

1 Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить повреждающее действие цитостатических препаратов (цитозин-арабинозада, даунорубицина) на эндотелиальные клетки человека

2 Повреждающее действие цитозин-арабинозида проявляется в широком диапазоне концентраций (0,1 мкг/мл - 1 мг/мл) и связано с элиминацией из состава моноспоя пролиферирующих клеток, не приводящей к нарушению целостности клеточного пласта Действие даунорубицина в концентрациях от 0,1 мкг/мл до 0,1 мг/мл сопровождается нарушением целостности монослоя сспсдстсие необратимых токсических повреждений эндотелиальных клеток

3 При короткой экспозиции цитозин-арабинозида (1-3 суток), целостность монослоя эндотелиальных клеток сохраняется за счет распластывания сохранившихся клеток и последующего восстановления плотности культур в результате их пролиферации При продолжительной (7-9 суток) инкубации культур с препаратом поддержание целостности монослоя происходит исключительно за счет распластывания эндотелиальных клеток

4 После продолжительной инкубации с цитозин-арабинозидом, в культуре сохраняется популяция колониеобразующих клеток (КОЕ-Энд), способных к пролиферации с последующей регенерацией монослоя В культурах эндотелиальных клеток, инкубированных с даунорубицином, КОЕ-Энд не выявлены и восстановления целостности монослоя не происходит

5 Функциональные изменения эндотелиальных клеток при культивировании в присутствии цитозин-арабинозида аналогичны провоспалительным возрастает экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Р- и Е-селектинов, 1САМ-1, \/САМ-1 и РЕСАМ-1) и увеличивается адгезия клеток крови на эндотелий

6 В крови здоровых доноров и больных ОМЛ выявлены популяции клеток с фенотипом С054+/С045-, С034+/СР45- и С0146+/С045-, соответствующим циркулирующим эндотелиальным клеткам На фоне введения цитостатических препаратов содержание циркулирующих клеток эндотелия увеличивается в среднем в 10 раз и снижается после окончания курса цитостатической терапии

7 Через 1-2 недели после окончания курса химиотерапии в крови пациентов наблюдается "вторая волна" увеличения количества циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом СР54+/С045-, С034+/С045-, но не С0146+/С045-, среди которых присутствуют клетки-предшественники эндотелия (КОЕ-Энд)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Романов Ю А, Червонцева А М . Савченко В Г Повреждение сосудистого эндотелия в процессе лечения острых лейкозов исследование in vitro Терапевтический архив 2004, № 7, стр 34-40

2 Романов Ю А, Червонцева А М . Савченко В Г Влияние цитарабина на экспрессию молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелий-лейкоцит in vitro Терапевтический архив, 2006, № 7, стр 67-72

3 Chervontseva А М , Savchenko VG, Romanov YA Injury of endothelium during the cytostasic therapy of AML patients The American Society of Hematology 46th Annual Meeting and Exposition Abstract 3907 2004

4 Romanov Y A , Chervontseva A M , Savchenko V G Vascular endothelium target or victim of cytostatic therapy7 ISCT Annual Meeting, May 2-5 2006, Berlin, Germany, abstr/poster

5 Romanov Y A , Chervontseva A U , Savchenko V G Vascular endothelium target or victim of cytostatic therapy' Can J Physiol Parmacol 2007, 85 396-403

6 Savchenko V G , Chervontseva A M , Romanov Y A Vascular damage by cytostatic drugs in acute leukemia patients Workshop "Modelling of blood diseases", November 5-8 2007, Lion, France, abstract p 9

Подписано в печать 13 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ №401 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы

До настоящего времени химиотерапия остается основным методом лечения острых лейкозов. Несмотря на большое разнообразие цитостатических средств, базисными препаратами в терапии острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) являются цитозин-арабинозид (цитозар, цитарабин) и даунорубицин. Семидневная инфузия цитарабина в комбинации с трехдневным введением антрациклинового антибиотика является основой всех ныне существующих программ и проводится большинству больных на всех этапах терапии ОМЛ: индукции, консолидации и поддержания ремиссии [Савченко, 1999]. Одним из прогрессивных методов лечения ОМЛ считается применение высоких доз цитарабина, благодаря чему удается существенным образом увеличить процент общей и безрецидивной выживаемости пациентов [Cassileth, 2005]. Использование высоких или средних доз цитарабина в сочетании с митоксантроном и идарубицином наиболее эффективно у больных с рецидивами и резистентными формами ОМЛ [Савченко, 2004; Tallman, 2005]. Поскольку основным в тактике современной химиотерапии острых лейкозов является принцип интенсификации лечения, риск возникновения различных осложнений со стороны многих органных систем (нервной системы, желудочно-кишечного тракта, печени и т.д.), включая сердечно-сосудистую, возрастает.

Сосудистый эндотелий является одной из основных тканевых систем организма человека. Покрывая всю поверхность сосудистого русла, эндотелий характеризуется высокой функциональной активностью и участвует в обменных процессах, регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, формировании новых сосудов, работе свертывающей-противосвертывающей системы крови и т.д. [Cines, 1998]. Воздействие различных неблагоприятных факторов приводит к "дисфункции" эндотелия, следствием чего могут являться нарушения сосудистого тонуса, проявление признаков провоспалительных и протромботических изменений [Esper, 2006; Endemann, 2004].

В условиях in vivo эндотелий обладает сравнительно низкой пролиферативной активностью и относится к медленно обновляемым тканям [Hobson, 1984]. Однако, скорость его регенерации в отдельных участках сосудистого русла при некоторых состояниях (как патологических, так и физиологических) и воздействиях может значительно возрастать и достигать десятков процентов в сутки [Schwartz, 1977; Folkman, 1995]. По всей видимости, пролиферирующие эндотелиальные клетки и, в меньшей степени, покоящиеся клетки могут становиться потенциальной мишенью для цитостатических препаратов, применяемых в терапии лейкозов. Кроме того, являясь внутренней оболочкой сосудов, эндотелий первым контактирует с препаратами, вводимыми в кровеносное русло: пиковые концентрации цитостатических препаратов, по-видимому, могут оказывать прямое повреждающее действие на эндотелиальные клетки. В то же время, эндотелий может обладать чувствительностью и к более низким концентрациям препаратов, длительное время находящихся в кровотоке [de Vos, 2004].

Спектр сосудистых осложнений, возникающих на фоне применения химиотерапевтических препаратов, достаточно широк: от асимптоматических флебитов до потенциально смертельных васкулопатий (вено-окклюзионная болезнь, тромботическая микроангиопатия) [Shahab, 2006]. При этом индуцированное токсическое воздействие на эндотелий сосудов в той или иной мере усугубляется в случае его исходной неполноценности [Баркаган, 2001]. Несмотря на то, что клинические проявления сосудистой патологии для многих препаратов хорошо известны, детальные механизмы ее развития в большинстве случаев изучены недостаточно.

В настоящее время лабораторная диагностика поражений сосудистого эндотелия в основном заключается в определении в крови растворимых маркеров, специфичных для эндотелиальных клеток (фактор Виллебранда, тромбомодулин, эндотелин-1, растворимые формы молекул клеточной адгезии и др.). Однако их содержание может зависеть от ряда сопутствующих патологий, не связанных с поражением эндотелия, что указывает на недостаточную достоверность их анализа [Borawski, 2001; Woywodt, 2004; Endemann, 2004]. Одним из перспективных методов диагностики сосудистых заболеваний является определение уровня циркулирующих эндотелиальных клеток [Dignat-George, 2000]. Детекция клеток эндотелия в крови по совокупности специфичных маркеров позволяет оценить не только функциональные изменения и степень поражения эндотелия, но также и последующее его восстановление.

Все эти неизученные вопросы послужили поводом для проведения нашего исследования

Цель исследования:

Основной целью данного исследования явилось изучение некоторых механизмов развития сосудистой патологии, обусловленной возможным повреждением эндотелиальных клеток в процессе цитостатической терапии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать экспериментальную модель для оценки эффектов цитостатических препаратов с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека.

2. Изучить влияние цитостатических препаратов с различным механизмом действия на пролиферацию, жизнеспособность эндотелиальных клеток и организацию монослоя эндотелия.

3. Исследовать функциональные изменения культивируемых эндотелиальных клеток при воздействии цитозин-арабинозида и даунорубицина, включая экспрессию различных классов молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелия с клетками периферической крови.

4. Исследовать основные механизмы репарации эндотелия после применения цитостатических препаратов in vitro.

5. Отработать методические приемы и исследовать в динамике содержание циркулирующих эндотелиальных клеток в крови здоровых доноров и больных OMJ1 в процессе лечения.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Впервые охарактеризовано влияние основных цитостатических препаратов (цитарабина и даунорубицина) и их сочетаний, применяемых в терапии больных OMJ1, на структурные и функциональные особенности клеток эндотелия с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека. Оценено влияние препаратов на целостность монослоя и жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия.

Впервые установлено, что инкубация культивируемых клеток с цитозин-арабинозидом вызывает ряд изменений, имеющих провоспалительную направленность: усиливается экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Е- и Р-селектинов, ICAM-1, VCAM-1 и РЕСАМ-1) и возрастает адгезивность эндотелия для клеток периферической крови.

В ходе экспериментов in vitro удалось прояснить основные способы репарации поврежденного монослоя эндотелиальных клеток после воздействия цитостатических препаратов.

Отдельный раздел исследования был посвящен изучению повреждающего действия проводимой химиотерапии на эндотелий сосудов больных ОМЛ. Впервые методом проточной цитометрии проведено динамическое исследование содержания циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, CD146+/CD45- в крови больных ОМЛ на фоне разных программ лечения. Установлено, что введение цитостатических препаратов сопровождается увеличением содержания циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке, что подтвердило данные, полученные в экспериментальной модели in vitro.

Впервые установлено, что после цитостатического воздействия в период миелотоксического агранулоцитоза в крови больных ОМЛ выявляются клетки-предшественники эндотелия, появление которых может быть связано с процессами регенерации поврежденного эндотелия. Доказательством жизнеспособности и функциональной активности этих клеток явились результаты культивирования мононуклеарных клеток крови, показавшие наличие колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд).

Полученные экспериментальные данные позволили расширить существующие представления о механизмах развития сосудистой патологии у больных на фоне проводимой химиотерапии. Детекция циркулирующих эндотелиальных клеток может иметь практическое значение в диагностике поражения эндотелия при использовании различных цитостатических препаратов в онкологической практике. Кроме того, определение исходного числа эндотелиальных клеток и динамический контроль их содержания в крови могут быть использованы в практическом здравоохранении для оценки эффективности противоопухолевого лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Препараты, применяемые в терапии острых лейкозов (цитозин-арабинозид и даунорубицин), оказывают различное по характеру повреждающее действие на эндотелиальные клетки человека in vitro.

2. Воздействие цитозин-арабинозида приводит к изменениям функциональных параметров культивируемых эндотелиальных клеток.

3. Цитостатическая терапия острых лейкозов индуцирует повреждение эндотелия in vivo, проявлением чего является выявление в крови пациентов циркулирующих эндотелиальных клеток.

4. Регенерация эндотелия после повреждения химиотерапевтическими препаратами in vitro и in vivo происходит за счет различных механизмов: изменения формы и размеров дифференцированных эндотелиальных клеток, а также пролиферации и вступления в дифференцировку колониеобразующих единиц эндотелия.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить повреждающее действие цитостатических препаратов (цитозин-арабинозада, даунорубицина) на эндотелиальные клетки человека.

2. Повреждающее действие цитозин-арабинозида проявляется в широком диапазоне концентраций (0,1 мкг/мл - 1 мг/мл) и связано с элиминацией из состава монослоя пролиферирующих клеток, не приводящей к нарушению целостности клеточного пласта. Действие даунорубицина в концентрациях от 0,1 мкг/мл до 0,1 мг/мл сопровождается нарушением целостности монослоя вследствие необратимых токсических повреждений эндотелиальных клеток.

3. При короткой экспозиции цитозин-арабинозида (1-3 суток), целостность монослоя эндотелиальных клеток сохраняется за счет распластывания сохранившихся клеток и последующего восстановления плотности культур в результате их пролиферации. При продолжительной (7-9 суток) инкубации культур с препаратом поддержание целостности монослоя происходит исключительно за счет распластывания эндотелиальных клеток.

4. После продолжительной инкубации с цитозин-арабинозидом, в культуре сохраняется популяция колониеобразующих клеток (КОЕ-Энд), способных к пролиферации с последующей регенерацией монослоя. В культурах эндотелиальных клеток, инкубированных с даунорубицином, КОЕ-Энд не выявлены и восстановления целостности монослоя не происходит.

5. Функциональные изменения эндотелиальных клеток при культивировании в присутствии цитозин-арабинозида аналогичны провоспалительным: возрастает экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Р- и Е-селектинов, 1САМ-1, \/САМ-1 и РЕСАМ-1) и увеличивается адгезия клеток крови на эндотелий.

В крови здоровых доноров и больных ОМЛ выявлены популяции клеток с фенотипом С054+/С045-, С034+/С045- и С0146+/Сй45-, соответствующим циркулирующим эндотелиальным клеткам. На фоне введения цитостатических препаратов содержание циркулирующих клеток эндотелия увеличивается в среднем в 10 раз и снижается после окончания курса цитостатической терапии.

Через 1-2 недели после окончания курса химиотерапии в крови пациентов наблюдается "вторая волна" увеличения количества циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом С054+/С045~, СР34+/С045-, но не С0146+/С045-, среди которых присутствуют кпетки-предшественники эндотелия (КОЕ-Энд).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование большинства цитостатических препаратов неотъемлемо связано с развитием широкого спектра сосудистых осложнений. Эта проблема особо актуальна в современной терапии гемобластозов, отдающей приоритеты интенсификации лечения с целью полной эрадикации опухолевого клона. В тоже время применение в схемах химиотерапии комбинаций препаратов значительно повышает риск поражения сосудистого эндотелия в результате сочетанного эндотелиотоксического действия Патогенез и механизм развития различных сосудистых нарушений, в зависимости от использующегося агента, отличен, так же как и спектр, и степень тяжести их проявлений. В этой связи использование термина "дисфункция" эндотелия представляется наиболее приемлемым.

Целью данного исследования явилось изучение некоторых механизмов генеза сосудистой патологии с участием сосудистого эндотелия в процессе применения цитостатической терапии больных ОМЛ. Основными препаратами, использующимися в их лечении, являются цитарабин и даунорубицин; влияние на эндотелий именно этих препаратов стало основным предметом исследования.

В серии экспериментов in vitro установлено, что и цитарабин, и даунорубицин способны оказывать повреждающее воздействие на культуру эндотелиальных клеток человека. Однако характер влияния этих двух препаратов на клетки оказался различен. Основной мишенью цитарабина являются пролиферирующие эндотелиальные клетки. И его цитостатическое действие можно охарактеризовать как фазовозависимое. При этом, несмотря на гибель значительной части клеток, целостность монослоя эндотелия не нарушается. Диаметрально противоположное действие на культуру эндотелиальных клеток продемонстрировал антрациклиновый антибиотик даунорубицин. В широком диапазоне концентраций препарат оказывал выраженный цитотоксический эффект вне зависимости от фазы клеточного цикла. Подобное повреждение эндотелиальных клеток приводило к нарушению целостности монослоя, т.е деэндотелизации поверхности. При совместном применении цитарабина и даунорубицина выявлено, что эндотелиотоксичность смеси определяется, главным образом, антрацикпиновым антибиотиком.

Моделирование цитостатического воздействия с использованием культур эндотелия позволило оценить функциональные изменения эндотелиальных клеток на фоне "терапии" цитарабином. Полученные данные доказывают, что в ответ на добавление препарата происходит активация эндотелиоцитов, которая проявляется, прежде всего, изменением экспрессии различных классов молекул клеточной адгезии. Повышение экспрессии молекул клеточной адгезии опосредует начальные стадии адгезии лейкоцитов, затем их плотную адгезию на эндотелиальные клетки и миграцию сквозь монослой эндотелия. Можно предположить, что аналогичные (генерализованные) провоспалительные изменения могут возникать и в сосудистой стенке в процессе лечения. Нельзя также исключить, что дисфункция эндотелия является ведущим патогенетическим фактором в развитии сосудистых осложнений у онкогематологических больных в ответ на цитостатическую терапию.

Исследования репаративной способности эндотелия in vitro показали, что восстановление эндотелиальной ткани может осуществляться несколькими путями. При незначительных повреждениях, вызванных кратковременным присутствием цитостатического препарата, целостность монослоя поддерживается за счет распластывания сохранившихся клеток. В последующие несколько дней количество эндотелиальных клеток и плотность культуры восстанавливаются в результате интенсивной клеточной пролиферации. При увеличении продолжительности цитостатического воздействия и истощении пула пролиферирующих клеток поддержание целостности монослоя осуществляется практически исключительно за счет распластывания клеток, оставшихся в культуре. Интересно, что даже после длительного присутствия в среде цитарабина и полной элиминации клеток, способных к делению, эндотелий все же сохраняет способность к регенерации. Это связано с сохранением в составе монослоя покоящихся клеток, не подверженных воздействию фазозависимого препарата. Данные клетки по праву можно назвать "тканевыми клетками-предшественниками эндотелия" или "колониеобразующими единицами эндотелия". После окончания "курса" эти клетки способны активироваться и продуцировать клоны клеток, приводящих к восстановлению структуры эндотелия. Приведенные факты свидетельствуют о "физиологичности" процессов репарации эндотелия в описанной культуральной системе, чего нельзя сказать об изменениях эндотелиальных клеток в ответ на добавление даунорубицина. В результате проведенных экспериментов по выявлению КОЕ-Энд было установлено, что их реакции на этот препарат, по всей видимости, необратимы.

Как бы то ни было, в зависимости от продолжительности воздействия до 50-80 % клеток, изначально составляющих монослой, теряют контакт с подложкой и оказываются в культуральной среде. Еще одним доказательством правоты концепции повреждения эндотелия при цитостатической терапии пациентов с ОМЛ, а возможно, и с другими патологическими состояниями, является выявление циркулирующих в периферическом кровотоке эндотелиальных клеток.

Исследование крови больных ОМЛ, которым проводилась цитостатическая терапия, полностью подтвердило высказанное предположение. Уже в первые дни лечения содержание циркулирующих эндотелиальных клеток возрастало (иногда, в десятки раз) по сравнению с исходным уровнем и снижалось после окончания курса. Результаты анализа фенотипа циркулирующих эндотелиальных клеток с использованием нескольких маркеров эндотелия (CD54, CD34, CD146) свидетельствуют, что в процесс повреждения вовлечены клетки, выстилающие как магистральные сосуды, так и капиллярное русло.

Как уже отмечалось, репарация эндотелия может осуществляться несколькими путями. Еще один возможный механизм регенерации эндотелия связан с участием недифференцированных эндотелиальных клеток. Если данный механизм задействован и в случае регенерации эндотелия после проведенной химиотерапии, то жизнеспособные эндотелиальные кпетки-предшественники, способные к клональному росту, должны присутствовать в крови пациентов в период восстановления. Действительно, проведенный анализ показал, что через 7-9 суток после окончания курса в крови пациентов определяется популяция С045-негативных клеток, экспрессирующих эндотелиальные маркеры - С054 и С034 (но не С0146). Высокий уровень таких клеток сохраняется на протяжении 1-2 недель и затем снижается. При посадке суммарной фракции лейкоцитов периферической крови, выделенной в период выброса предполагаемых предшественников, и последующем культивировании вначале выявлялись единичные клетки, в дальнейшем - колонии клеток с морфологическими и фенотипическими признаками эндотелия. Следует отметить, что количество клеточных колоний, появляющихся при культивировании лейкоцитов крови, было значительно ниже числа циркулирующих клеток, определяемых с помощью проточной цитометрии. Однозначно объяснить подобное несоответствие не представляется возможным, хотя можно предполагать, что не все выявляемые клетки «второй волны» обладают клоногенными свойствами, или для их успешного культивирования необходимы иные условия.

Таким образом, проведенное исследование доказывает высокий уровень повреждения сосудистого эндотелия у пациентов, получающих цитостатическую терапию, и расширяет сложившиеся представления о механизмах регенерации эндотелия и развития сосудистой патологии у больных гемобластозами.