Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологические и гистоэнзиматические изменения в почках при массивной кровопотере и восполнении кровезамещающими растворами

На правах рукописи

Тамаева Фатима Арслановна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПОЧКАХ ПРИ МАССИВНОЙ КРОВОПОТЕРЕ И ВОСПОЛНЕНИИ КРОВЕЗАМЕЩАЮЩИМИ РАСТВОРАМИ

14 00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003446677

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Голубев Аркадий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Трусов O.A. (Российский государственный медицинский университет), доктор медицинских наук, профессор Кудрявцев Ю.В. (НИИ урологии РАМН)

Ведущая организация - НИИ морфологии человека РАМН

Защита состоится «_»_2008 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 072 04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу 117997, Москва, ул Островитянова, д 1

Автореферат разослан «_»_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор А И Щеголев

Список сокращений

АД - артериальное давление

АТФ - аденозинтрифосфат

ВК - восходящие канальцы петли Генле

Г-б-ФДГ - глюкозо- 6- фосфат- дегидрогеназа

гдг - глутаматдегидрогеназа

дк - дистальные канальцы

лдг - лактатдегидрогеназа

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид - фосфат

НК - нисходящие канальцы петли Генле

ОПН - острая почечная недостаточность

оцк - объем циркулирующей крови

ПК - проксимальные канальцы

ПФОС - перфторорганические соединения

едг - сукцинатдегидрогеназа

ст - собирательные трубочки

ЩФ - щелочная фосфатаза

югк - юкстагломерулярные клетки

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кровопотеря является одной из важных проблем медицины Высокий уровень травматизма, хирургические вмешательства, при которых возникает массивная кровопотеря, требуют соответствующей коррекции Несмотря на существенные достижения в решении этой проблемы, выбор кровезамещающего препарата, количество введения и другие вопросы являются предметом дискуссии

Большие надежды были связаны с использованием крови и препаратов крови, полученных от доноров Однако, как выяснилось, кровь, извлеченная из сосудистого русла, теряет свои нативные свойства В этом случае она представляет собой суспензию, состоящую из микросгустков, тромбоцитов и неполноценно функционирующих эритроцитов (А И Воробьев, 2003) Совершенно очевидно, что вне организма не существует цельной крови После разделения крови на составляющие ее компоненты, можно говорить о разобщенных клетках или белках, которые вводятся в организм человека Кроме этого, применение крови и ее компонентов сопряжено с риском заражения реципиента опасными инфекционными заболеваниями вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция и т д Кристаллоиды, крахмалы, альбумин, декст-раны, решая отдельные задачи инфузионной терапии (восполнение объема циркулирующей крови, поддержание осмотического и онкотического давления), не обладают очень важным механизмом способность обеспечивать транспорт газов

В связи с этим, в настоящее время ведутся поиски препаратов, которые способны решать этот важнейший вопрос Одним из направлений является создание кровезаменителей, обладающих газотранспортной функцией, на основе перфторуглеродов Перфторуглероды обладают химической устойчивостью, растворяют до 50 % кислорода и в 4 раза больше углекислого газа Целевая комплексная программа завершилась созданием отечественного препарата «Перфто-ран», который в 1997 году был разрешен Министерством здравоохранения Российской Федерации для массового производства, «как новое поколение кровезаменителей, обладающих газотранспортной функцией» (Г Р Иваницкий, 2001) Для человека с большим запасом безопасности установлена

допустимая доза перфторана 30 мл/кг (ЛД 50 для мыши составляет 140 мл/кг перфоторана)

Массивная кровопотеря, сопровождаясь уменьшением объема циркулирующей крови, снижением артериального давления, ведет к гипоперфузии органов и тканей, ограничению доставки кислорода к клеткам и развитию гипоксии Базисным механизмом гипоксии является нарушение функции митохондриальных ферментных комплексов, а восстановление доставки кислорода к клетке при гипоксии имеет положительный эффект в условиях функционирования дыхательной цепи (Л Д Лукьянова, 2001) В противном случае высокие концентрации кислорода, обладая токсическим действием, будут усугублять процессы альтерации клеток

В почках при массивной кровопотере отмечаются значительные нарушения кровообращении, в том числе и на уровне микроциркуляторного русла Особенно уязвим корковый слой почек, так как при снижении артериального давления кровь по дуговым артериям, минуя корковый слой, возвращается в сосуды мозгового слоя Интенсивность повреждения структур почек связана в значительной степени с продолжительностью гипоксии (или ишемии) и своевременным восстановлением почечного кровотока с использованием ин-фузионных препаратов

Решению указанных вопросов и посвящено настоящее исследование

Цель работы. Целью работы явилась оценка протекторного эффекта некоторых кровезаменителей для коррекции морфологических и гистоэнзиматических изменений почек при острой массивной кровопотере

Задачи исследования. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

1 Определить морфологические изменения и нарушения тканевого дыхания в различных отделах почек экспериментальных животных (крыс) при массивной кровопотере (50% объема циркулирующей крови)

2 Оценить структурные изменения и энзимогисто-химические нарушения в различных отделах почек при восполнении кровопотери физиологическим раствором

3 Изучить характер изменения структур почки и метаболические нарушения при восполнении кровопотери гепа-ринизированной аутокровью

4 Оценить морфологические и гистоэнзиматические изменения в различных отделах почек при восполнении массивной кровопотери перфторуглеродной эмульсией «Перфто-ран»

5. Провести сравнительный анализ протекторного эффекта различных кровезамещающих растворов на различные структуры почечной ткани при острой массивной крово-потере

Научная новизна. В работе впервые количественно (морфометрически) изучена динамика изменения активности окислительно-восстановительных ферментов и гидролаз почек при массивной кровопотере в эксперименте Впервые на основании гистологических и количественных энзимогисто-химических методов установлены протективные свойства перфторуглеродной эмульсии «Перфторан» для различных отделов нефрона при массивной кровопотере Впервые, на основе количественной характеристики, определены особенности коррекции гипоксических поражений почек при острой массивной кровопотере различными кровезамещающими растворами (физиологический раствор, гепаринизированная ау-токровь, «Перфторан»)

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных количественных энзимогистохимических исследований позволили установить характер и последовательность метаболических изменений в различных отделах неф-ронов при острой массивной кровопотере в эксперименте, которые могут обьяснить патогенез функциональных нарушений почек

Сравнительный анализ результатов использования различных кровезамещающих препаратов для коррекции массивной кровопотери позволил рекомендовать «Перфторан» в качестве ведущего кровезамещающего препарата при массивной кровопотере, поскольку он обладает наибольшим протекторным эффектом для почек

Практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о благоприятном действии перфторана при острой массивной кровопотере и позволяют рассматривать его применение в составе лечебных мероприятий гипоксических состояний почек Результаты проведенных исследований могут стать основой для последующих клинико-эксперимен-тальных исследований Результаты исследования будут использованы при чтении лекций и проведении

практических занятий на кафедрах патологической анатомии, анестезиологии и реаниматологии

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на Российской научной конференции «Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине» (Санкт-Петербург, 8-10 сентября 2004г), на межвузовской научной конференции с международным участием «Современные проблемы морфологии» (Махачкала,

2005), на республиканской научно- практической конференции, поев 90- летию со дня рожд проф M M Максудова (Махачкала, 2006) , на 4-й научно-практ конф "Новое в хирургии Дагестана» (Махачкала,

2006), на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 1 в центральной печати

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы Список литературы включает 205 публикации, из них 123 отечественных и 82 иностранных Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 22 диаграммами и 58 рисунками (микрофотографиями)

Содержание работы. В качестве материала исследования использовали белых беспородных крыс, выращенных в виварии ДГМА Эксперименты проводились в соответствии с правилами работы с лабораторными животными ("Principles of laboratoiy animal care", 1985, издание Национального Института Здоровья США, № 88-23)

Рацион питания крыс был стандартный Средняя масса крыс составляла до начала экспериментов 200+30 гр

В соответствие с целью нашего исследования были выделены следующие экспериментальные серии

I серия - интактные крысы (без кровопотери) - 30 крыс

II серия - крысы с кровопотерей 50% объема циркулирующей крови (из расчета 2,5 мл крови на 100 гр массы тела крысы) в течение 15 мин с последующей декапитацией крыс и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток - 30 крыс

III серия - крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение 10 мин с возмещением физиологическим раствором (до полного восстановления объема кровопотери) спустя 1 час от начала кровотечения и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток — 30 крыс

IV серия - крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение 10 мин с возмещением спустя 1 час от начала кровотечения гепаринизированной аутокровью (до полного восстановления объема кровопотери) и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток - 30 крыс

V серия - крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение 10 мин с возмещением перфторана в дозе возмещающей объем кровопотери спустя 1 час от начала кровотечения и забором материала в сроки 1,4,7, 14,30 суток - 30 крыс

Острую кровопотерю под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно) вызывали однократным выпусканием крови из катетеризированной хвостовой артерии крысы из расчета 2,0 мл крови на 100 гр массы тела крысы в течение 15 минут Расчет объема кровопотери основывали на данных литературы (Кожура В Л и соавт,1994, Barbosa S Т et al, 1992), согласно которым снижение АД при этом достигает уровня 40 - 60 мм рт ст До начала кровопотери животным вводили через катетер внутриартериально 0,5 мл гепарина (50 ЕД) (Бастрикова H А и др 1999) Восполнение кровопотери производили введением кровезамещающего раствора через тот же катетер спустя 1 час от начала кровопотери в дозе возмещающей объем кровопотери

Всего в эксперименте использовано 186 крыс В ходе эксперимента в разных сериях, в течение первых трех часов, от кровопотери погибло 36 крыс Исследование было проведено на выживших 150 животных Забор материала проводили в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток в соответствии с Приказом МЗ СССР № 755 от 12 08 77 г и Международными рекомендациями по проведению эксперимента

Таблица № 1

Летальность животных в ходе эксперимента

Серия Всего крыс Погибло крыс Исследовано

1 серия 30 - 30

2 серия 50 20 30

3 серия 39 9 30

4 серия 33 3 30

5 серия 34 4 30

Всего 186 36 150

Таблица № 2 Распределение экспериментальных животных

Серия эксперимента Сроки опыта Количество животных

1 - Интактные крысы (контроль) 1 сутки 6

4 суток 6

7 суток 6

14 суток 6

30 суток 6

II - Кровопотеря 50 % объема цирку- 1 сутки 6

лирующей крови 4 суток 6

7 суток 6

14 суток 6

30 суток 6

III - Кровопотеря 50 % объема цир- 1 сутки 6

кулирующей крови с восполнением 4 суток 6

физ раствором 7 суток 6

14 суток 6

30 суток 6

IV- Кровопотеря 50 % объема цирку- 1 сутки 6

лирующей крови с восполнением 4 суток 6

гепаринизарованннои аутокровью 7 суток 6

14 суток 6

30 суток 6

V - Кровопотеря 50 % объема цирку- 1 сутки 6

лирующей крови с восполнением 4 суток 6

перфтораном 7 суток 6

14 суток 6

30 суток 6

По истечении сроков эксперимента крыс забивали под хлороформным наркозом Для изучения брали кусочки ткани почек с захватом коркового и мозгового вещества Для гистоморфологических и гистохимических исследований кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине и в жидкости Карнуа, заливали в парафин и готовили срезы на санном микротоме толщиной 5-7 мкм Для гистоэн-зиматических исследований кусочки ткани почки, замороженные в жидком азоте, помещали в криостат при -15° С и готовили срезы толщиной 10 мкм Мгновенное замораживание в жидком азоте позволяет избежать превращения воды, находящейся в клетках и тканях, в кристаллы (Дьердь Кисели, 1962), что наблюдалось при медленном замораживании Кристаллы эти способны повреждать мембраны внутриклеточных органелл Для исключения возможных ошибок, при оценке

гистоэнзиматических реакций, связанных с разной толщиной срезов, качеством реактивов и растворов, температурным режимом и т д учитывали рекомендации Журавлевой Т Б и соавт (1978) и Автандилова Г Г (1984, 1990), которые считают, что в работе патологов на первый план выступает сравнительная оценка содержания изучаемых веществ в условиях нормы и в разных фазах патологического процесса При этом важно, чтобы исследуемые срезы были одинаковой толщины и обработаны в стандартных условиях

Для исследования кусочки органов от подопытного и контрольного животного монтировали в один блок при замораживании Таким образом, один срез или серию срезов с нескольких кусочков подвергали гистохимической обработке в одинаковых условиях Этот метод дает возможность исключить влияние неодинаковой толщины срезов, качества реактива и растворов, температурного режима и других факторов на ход гистохимических реакций

Важную роль играет изучение ферментных систем Острая массивная кровопотеря вызывает инактивацию некоторых ферментов, необходимых для нормального течения обменных процессов в организме, что сказывается на клинических проявлениях кровопотери (Молоканов КМ и соавт, 1971, Рашевская AM и соавт, 1971) Поэтому гистоэнзиматические и гистохимические исследования необходимы для определения патогенеза действия массивной кровопотери на организм (Тиунов Л А , 1976)

Микроскопическая гистоморфология включала окраску срезов гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, суданами III, IV и черным.

Наряду с общеморфологическими методами для проведения сравнительного анализа полученных результатов использовался комплекс гистохимических и гистоэнзиматических методик

Неспецифическую щелочную фосфатазу (ЩФ) определяли методом азосочетания по Берстону с использованием а-нафтилфосфата и прочного синего РР Активность ЩФ была показателем состояния цитомембран аппарата Гольджи, щеточной каемки Об углеводном обмене судили по активности фермента гликолиза и гли-когенолиза ЛДГ Для суждения об уровне окислительно-восстановительных процессов (повреждение митохондрий) изучали ферменты цикла Кребса - СДГ и терминального окисления - НАД-диафоразу (маркеры внутренней мембраны) Для экстракции липидов, которые могут обуславливать неспецифическое восстановление соли тетразолия при определении активности НАД-диафоразы, срезы перед

инкубацией погружали в ацетон, охлажденный до 4°С, на 15-30 сек после чего проводили обработку по оригинальной схеме

Рассматривалась активность ГДГ (маркера матрикса) По активности Г6ФДГ предполагали о степени повреждения эндоплазмати-ческого ретикулума почек (Гайер Г ,1974, Ленинджер А , 1976)

При определении активности ферментов проводился контроль специфичности гистохимических реакций путем выключения из инкубационной среды соответствующего субстрата Кроме того, все гистохимические и гистоэнзиматические данные в микропрепаратах подвергались денситофотометрии продукта реакции с помощью аппаратно-программного комплекса для определения фотометрических параметров биоматериалов «Мекос - Ц1» производства ЗАО Медицинские компьютерные системы (Мекос, г Москва) Комплекс Мекос - Ц1 позволяет вводить изображение с гистологических препаратов в цифровом формате jpg или Ьтр на магнитный носитель (винчестер компьютера или компакт-диски), выполнять денситофотометрические измерения и количественный анализ продукта гистохимических реакций Программное обеспечение комплекса Мекос - Ц1 позволяет работать с базой полученных данных, проводить статистическую обработку результатов исследования с применением электронных таблиц Microsoft Exel, использованием параметрических методов исследования с определением среднестатистической М, о, р. При анализе результатов гистохимических и гистоэнзиматических исследований, кроме участия в мегаболических процессах, учитывалась также субклеточная локализация изучаемых ферментов Благодаря электронной гистохимии и молекулярной биохимии были установлены ферменты-маркеры ультраструктур клеток (Гайер Г Г, 1974, Ленинджер А , 1976) По изменению интенсивности энзиматических реакций и по характеру отложения и распределения продукта реакции, возможно оценить степень повреждения субклеточных структур (Авцын А П и соавт, 1971, Сар-кисов Д С , 1977 и др)

По данным Авцына А П и соавт (1972) биохимические изменения, выявляемые гистохимическими методами, при различных патологических состояниях предшествуют морфологическим Изменения активности ферментов являются наиболее ранним морфологическим признаком повреждения ткани Следовательно, гистохимические и гистоэнзиматические исследования ткани почек экспериментальных животных позволили выяснить глубину нарушения клеточного метаболизма, судить о морфо - функциональном состоянии почек при острой массивной кровопотере и инфузии различными кровезамещаю-щими растворами

Статистические методы. Основные показатели вычислялись при помощи программного продукта Microsoft Excel с использованием методов параметрической статистики Статистическое исследование было выполнено на 7 600 фотографиях гистологических препаратов экспериментальных животных, полученных с помощью комплекса Мекос - Ц1

Результаты исследований. Проведенные экспериментальные исследования убедительно свидетельствуют о выраженных морфологических и энзимогистохимических измениях в клубочковом и тубулярном аппарате почек при острой массивной (50% ОЦК) кровопотере Количественные показатели продукта гистохимических реакций позволяют с функционально - морфологических позиций оценить характер и степень повреждения клеток

Установлено морфометрически, что при острой массивной кровопотере, без возмещения, у животных в почках кровоток редуцирован Клубочковый аппарат обескровлен Особенно страдает корковый слой Таким образом, поражаются кортикальные и медуллярные канальца, включая функционально важный толстый отдел восходящей части петли нефрона При микроскопическом исследовании почек во II серии с первых суток отмечались дистрофические изменения проксимальных и дис-тальных канальцах в виде умеренной вакуольной и жировой дистрофии, слущивание эпителиальных клеток в просвет канальцев К 7 суткам в просвете канальцев отмечались обрывки поврежденного и некротизирован-ного эпителия К 14 суткам наблюдали участки пролиферации фибробла-стов и отложение извести в участках некроза эпителия проксимальных извитых канальцев На 30 сутки отмечалась пролиферация интерстици-альных клеток между канальцами с последующим очаговым разрастанием соединительной ткани Интенсивность дистрофических изменений варьировала во всех экспериментальных сериях

Во II и III сериях отмечался и интерстициальный отек (жидкость из разрушенных канальцев) Восстановительные процессы эпителия в разных сериях проходили с различной скоростью В III серии отмечались признаки регенерации эпителия на 14 сутки уплощенные эпителиальные клетки с гиперхромными ядрами Во II и IV сериях восстановительные процессы так и не достигали нормы к 14 суткам В V серии с перфузией «Перфтораном» восстановление тканей настолько выражено, что не было выявлено признаков повреждения

При гистофотометрическом анализе активности ферментов выявлены особенности структурно- метаболической гетерогенности различных отделов нефрона, проявляющиеся различиями активности дегидро-геназ В условиях дефицита кислорода происходит нарушение образования богатых энергией фосфатных соединений и развитие анаэробного

метаболизма. Образование энергии осуществляется в результате анаэробного распада глюкозы, жира, белка, сопровождающегося накоплением продуктов клеточного обмена: иона водорода, лактата и кетоновых кислот. Накопление в тканях и крови органических кислот приводит к развитию метаболического ацидоза. Результаты исследований свидетельствуют о метаболических нарушениях в различных структурах почек, как при чистой массивной кровопотере, так и при восполнении ее различными кровезаменителями. Нарушения имелись во всех сериях экспериментов, однако степень выраженности при применении различных кровезаменителей отличалась. На фоне более выраженных нарушений окислительно - восстановительных процессов при чистой кровопотере в экспериментах с восполнением как физиологическим раствором, так и гепаринизированной аутокровью наблюдались так же значительные нарушения тканевого дыхания, о чем свидетельствуют показатели активности СДГ. При массивной кровопотере во всех структурах почки отчетливо прослеживалось снижение активности СДГ, достигавшее наибольшей глубины к 4 суткам и сохранявшееся к концу 30 суток.

Диаграмма № 1. Активность фермента СДГ во II экспериментальной серии (острая массивная кровопотеря).

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

Активность фермента СДГ во 2 экспериментальной серии

|Щ II II II

контроль 1 сутки 4 сутки проксимальные канальца восходящие канальца собира тел ьмые тру боч к и

? сутки 24 сутки 30 сутки диета льны с канальца Ш и исходящие канальца * потляГенле

При сравнительном анализе активности фермента СДГ во всех сериях отмечался ранний подъем показателей в V экспериментальной серии (при восполнении массивной кровопотери перфторуг-леродной эмульсией «Перфторан») Это свидетельствует о меньшем повреждении структур почки в данной серии экспериментов, что очевидно связано с газотранспортной функцией перфторана

Уже на 4 сутки в этой серии отмечалось частичное восстановление активности фермента К 14 суткам показатели активности фермента приближались к контрольным значениям, что свидетельствует о компенсаторных реакциях и более ранней репарации поврежденных структур Самые низкие показатели активности СДГ отмечены к 14 суткам во II серии (при массивной кровопотере (50% ОЦК) и в IV серии (при восполнении утраченной крови гепаринизи-рованной аутокровью), что говорит о слабом восполнении кровопотери, возможно это связано с образованием «микросвертков» в гепа-ринизированной аутокрови В эпителии этих канальцев развивались атрофические и дистрофические процессы, что сопровождается снижением уровня активности ферментов, однако обнаруживались канальцы и с высокой энзиматической активностью, что свидетельствует о функциональном напряжении части нефронов, направленном на компенсацию деятельности атрофированных нефронов

Нарушение активности СДГ сочеталось с угнетением другого митохондриального фермента - НАД-диафоразы Активность фермента была умеренной в III серии, более сниженной при перфузии аутокровью (IV серия) и наиболее высокой у крыс V серии (перфузия пер-фтораном) О повреждении митохондрий (косвенно) судили так же по количеству и характеру отложений гранул диформазана или диффузии продукта реакции НАД-диафоразы и СДГ (Гайер Г ,1974, Ленинджер А, 1976) Митохондриальные нарушения при гипоксии - это фазный процесс, зависящий от тяжести и длительности гипоксического воздействия Положительный эффект, обусловленный доставкой кислорода к клеткам, регистрируется только в условиях интактности дыхательной цепи Ограничивается доставка кислорода к клеткам, где он участвует в реакциях аэробного образования энергии, являясь субстратом терминального фермента митохондриапьной дыхательной цепи -цитохромоксидазы Тканевая гипоксия - это подавление потребления кислорода (дыхания) на терминальном цитохром оксидазном участке Угнетается НАД-оксидазный путь окисления и сопряженное с ним окислительное фосфорилирование Это отражает первую компенсаторную фазу биоэнергетической гипоксии Во всех эксперименталь-

ных сериях в первые сутки после массивной кровопотери отмечалась различная интенсивность снижения активности фермента Лишь в IV и V сериях активность вермента незначительно снижалась К 7 суткам отмечался подъем активности фермента в III, IV и V сериях

Проведенные экспериментальные исследования убедительно свидетельствуют о выраженных морфологических и энзимогистохи-мических измениях в клубочковом и тубулярном аппарате почек при острой массивной (50% ОЦК) кровопотере

Таблица № 3

Сравнительная активность фермента НАД-диафоразы во всех экспериментальных сериях

Структуры почки ПК ДК СТ Петля Генле

Статистический показатель М±а М±а М±а М±а

1 серия - контроль 0,9±0,09 0,7±0 0,79±0,08 0,53±0,08

1 сутки II серия 0,67±0,02 0,61 ±0,03 0,39±0,02 0,32±0,02

III серия 0,42±0,08 0,38±0,08 0,6±0,04 0,39±0,03

IV серия 0,38±0,01 0,47±0,09 0,43±0,06 0,57±0,02

V серия 0,77±0,05 0,8±0,07 0,79±0,03 0,57+0,06

4 сутки II серия 0,96±0,02 0,47±0,09 0,71 ±0,04 0,35±0,08

III серия 0,93±0,09 0,47±0,08 0,77+0,07 0,51±0,09

IV серия 0,41±0,08 0,55±0,06 0,32±0,03 0,4±0,02

V серия 0,89±0,05 0,6±0,08 1,71 ±0,05 0,47±0,09

7 сутки II серия 0,87±0,06 0,84±0,03 0,83+0,06 0,48±0,06

III серия 1,48±0,03 1,18±0,06 0,97±0,02 0,6±0,07

IV серия 0,56+0,03 0,79±0,09 0,78±0,06 0,75±0,04

V серия 0,7±0,05 0,68+0,05 0,87±0,03 0,73±0,06

14 сутки II серия 1,34+0,01 0,98±0,02 0,97±0,05 0,57+0,09

III серия 1,11±0,06 0,91 ±0,08 0,41 ±0,09 0,58±0,04

IV серия 0,75±0,09 0,5±0,07 0,77±0,05 0,67±0,03

V серия 0,93±0,05 0,67 ±0,06 0,73±0,08 0,49±0,05

30 сутки II серия 1,2±0,07 0,97±0,05 0,91 ±0,06 0,77±0,06

III серия 1,2+0,09 0,9±0,04 1,1 ±0,04 0,72±0,09

IV серия 1,04±0,06 1,04+0,02 1,18±0,05 1,12±0,08

V серия 0,89±0,07 0,68±0,05 0,78±0,06 0,48+0,07

М - показатель среднестатистический, о - среднеквадратиче-ское отклонение, р - разница по сравнению с соответствующим показателем интактной (контрольной) серии, достоверна (Р<0,05)

В ходе проведенных исследований, во все сроки, была отмечена низкая активность фермента НАДФ-диафоразы Отмечались низкие показатели активности фермента во II и в IV сериях, что подтверждает наши данные о том, что кровь, извлеченная из сосудистого русла, теряет свои нативные свойства В первые 4 суток отмечалась низкая активность НАДФ-диафоразы во II и III сериях эксперимента В IV серии наблюдалось снижение активности фермента к 7 суткам и ее повышение начиная с 14 суток Компенсация гемопоэза в дальнейшем вела к восстановлению окислительных процессов Активность НАДФ-диафоразы в V серии была умеренно снижена на всем протяжении эксперимента, но оставалась наиболее высокой во всех сериях

Такое поведение митохондриальных ферментов, по-видимому, отражает первую компенсаторную фазу биоэнергетической гипоксии Положительный эффект, обусловленный доставкой кислорода к клеткам, регистрируется только в условиях более сохраненной дыхательной цепи, как при перфузии перфтораном

При исследовании ГДГ, фермента азотистого обмена, наблюдали торможение гликолитической активности постмитохонд-риальной фракции ишеминизированной ткани почек в мозговом слое (собирательных трубочках), наиболее выраженное в IV серии, так и не достигающее уровня контроля к 30 суткам

Н М Назаренко (1989) в опытах на кроликах при острой кровопотере указывала, что в условиях гипоксии происходит угнетение тканевого дыхания в неодинаковой степени в структурах почек Снижение показателей активности ГДГ наблюдалось в различных сериях экспериментов Зарегистрировано максимальное снижение активности фермента в IV серии В III, IV экспериментальной серии (при восполнении массивной кровопотери физиологическим раствором или гепаринизированной аутокровью), кроме снижения показателей активности ГДГ, отмечали угнетение активности всех окислительно-восстановительных ферментов, что говорит об утилизации кислорода и снижении анаэробного гликолиза

Диаграмма № 2.

Сравнительная активность фермента ГДГ во всех экспериментальных

сериях.

Динамика активности ГДГ в эксперименте

проксимальные канальца ■дисшьиые канальца я собирательные трубочки ■ петля Генле

Об углеводном обмене судили по активности фермента гликолиза и гликогенолиза: ЛДГ. Механизм повышения гликолитических процессов в первые сроки экспериментов можно объяснить активацией симпатико - адреналовой системы в результате стрессовой реакции - выбросом в кровь катехоламинов, которые стимулируют фосфорила-зу и липазы (А. Ленинджер, 1976).

М.В. Биленко (1988) отмечает, что при ишемии почки происходит рост активности ЛДГ в лимфе, оттекающей от почки. По данным БгаЬо, Мацуаг (1982.), после 30 - минутной ишемии почки значительно возрастала концентрация ЛДГ в почечной лимфе и моче. Авторы полагают, что на основании изменений активности ферментов почечной лимфы и мочи можно сделать вывод относительно ишемиче-ского поражения почек.

В структурах почек во всех сериях эксперимента в первые сутки отмечалось повышение активности ЛДГ. Однако к 4 суткам актив-

ность ЛДГ во II и III серии значительно снижалась, что, очевидно, связано с деструкцией эпителия канальцев. В IV и V сериях наблюдалась более высокая активность ЛДГ, что по-видимому, обусловлено присоединением процессов гликолиза в условиях умеренной гипоксии, которая обеспечивалась сохранявшимся газотранспортом за счет ау-токрови или перфторана.

Диаграмма № 3.

Сравнительная активность фермента ЛДГ во всех экспериментальных _ ___ __ сериях. __ ___________

Динамика активности ЛДГ в эксперименте

о

X к

0 Ч

С

>s о

X и

CJ у

X

i 1 X

ж «

Ф <М 41 i V о и \ <J I rs xr I/Й™ n *зг i/> 1 N

кофтрф ЛЬ 1 сутки

I сутки

7 суток

14 суток 30 суток

проксимальные канальца Я дистальные канальца I собирательные трубочки Я петля Генле

При оценке активности Г-6-ФДГ отмечалась различная активность фермента. Во всех серия в первые 4 суток наблюдалось снижение активности Г-6-ФДГ. Снижение активности во всех структурах почки наблюдали при массивной кровопотере, где показатели активности так и не достигали контрольных значений к 30 суткам. Снижение активности Г-6-ФДГ так же создает условия для окисления НАДН и ЛДГ, что сопровождается восстановлением пировиноградной кислоты в молочную. Различная активность фермента указывает на возрастание роли пентозного цикла в метаболизме углеводов, от чего зависела степень развития дистрофических изменений.

Таблица № 4

Сравнительная активность фермента Г-6-ФДГ во всех экспериментальных сериях

Структуры почки ПК ДК СТ Петля Генле

Статистический показатель М± а М±ст М±а М±а

1 серия - контроль 0,22±0,02 0,28±0 0,29±0,08 0,33 ±0,09

1 сутки II серия 0,13±0,02 0,19±0,05 0,15±0,02 0,19±0,09

111 серия 0,27±0,02 0,27±0,06 0,17±0,03 0,16±0,05

IV серия 0,13±0,08 0,22±0,05 0,18±0,05 0,16±0,05

V серия 0,14±0,05 0,20±0,07 0,17±0,06 0,17±0,08

4 сутки II серия 0,11 ±0,05 0,19±0,04 0,16±0,08 0,17±0,05

III серия 0,18±0,04 0,21±0,06 0,17±0,06 0,21 ±0,06

IV серия 0,29±0,06 0,21 ±0,08 0,25±0,08 0,2±0,08

V серия 0,20±0,05 0,24±0,09 0,18±0,04 0,22±0,09

7 сутки II серия 0,15±0,06 0,23±0,05 0,23±0,04 0,19±0,03

III серия 0,20±0,08 0,25±0,09 0,29±0,02 0,27±0,09

IV серия 0,19±0,09 0,25±0,05 0,32±0,08 0,27±0,08

V серия 0,21 ±0,07 0,3+0,4 0,21±0,05 0,30±0,04

14 сутки II серия 0,17±0,02 0,20±0,05 0,16±0,05 0,2±0,05

III серия 0,16±0,04 0,17±0,08 0,08±0,06 0,15±0,08

IV серия 0,19±0,03 0,16+0,08 0,09±0,05 0,16±0,01

V серия 0,20±0,08 0,2±0,09 0,27±0,09 0,33±0,04

30 сутки II серия 0,14±0,09 0,21 ±0,05 0,19±0,06 0,18±0,08

III серия 0,12±0,08 0,22±0,09 0,18±0,05 0,24±0,06

IV серия 0,06+0,06 0,19±0,05 0,18±0,06 0,13±0,04

V серия 0,20±0,05 0,27±0,06 0,29±0,03 0,33±0,09

М - показатель среднестатистический, о - среднеквадратиче-

ское отклонение, р - разница по сравнению с соответствующим показателем интактной (контрольной) серии, достоверна (р <0,05)

Темпы восстановления активности различных ферментов варьировали В разных отделах нефрона и собирательных трубочках также отмечались различная скорость восстановления активности и щелочной фосфатазы Так, по данным В Б Брин (1983), через 1 час после ишемии почки у 20- дневных щенков происходило увеличение активности щелочной фосфатазы в эпителиальных клетках канальцев у, а у 3- х месячных снижалась

Исследование ЩФ выявило неравномерную активность фермента У животных, подвергшихся кровопотере с перфузией различными кровезамещающими растворами, развивались изменения двоякого харак-

тера. В канальцах почек во всех сериях опыта активность фермента снижалась и носила мозаичный характер, что отражало различную степень повреждения эпителия. В строме почек разных серий также отмечалось различие активности ЩФ, что, по-видимому, было обусловлено развитием компенсаторных процессов в виде огрубение стромы из-за коллагено-генеза. Восстановления активности ЩФ в эпителии канальцев отмечалось на 4 сутки при перфузии перфтораном, активность фермента в строме была невысокой, что также свидетельствовало о сохранности стромы.

Диаграмма № 19.

Сравнительная активность фермента ЩФ во всех экспериментальных

сериях.

Сравнительная активность фермента ЩФ

проксимальмыекзнальцс! * диаальныеканальцл собиран.\л&мые трубочки * пегля Геиле

В сериях эксперимента с восполнением кровопотери дистрофические и некробиотические изменения канальцев почек зависели от вида кровезамещающего раствора и были менее выражены, чем во II серии. Перфузия физиологическим раствором и гепаринизированной аутокро-вью сопровождалась менее грубыми изменениями в структурах почек, однако наибольшая сохранность канальцев и более выраженные репара-тивные процессы были отмечены при перфузии перфтораном.

Таким образом, удалось установить общие закономерности и морфогенетические особенности репаративного процесса в различных

структурах почек при массивной кровопотере и перфузии различными кровезамещающими растворами Полученные данные свидетельствуют о преимуществе перфторана перед другими кровезаменителями, что позволяет рекомендовать его для дальнейших исследований в области гемотрансфузиологии и реаниматологии

Выводы.

1 Острая массивная кровопотеря вызывает глубокие нарушения энергетического обмена, что ведет к структурным изменениям нефрона и собирательных трубочек, проявляющимся дистрофией и некрозом эпителия канальцев, а в более поздние сроки отложением солеи кальция и формированием соединительной ткани в участках повреждения Дисэнзиматические нарушения в нефроне сохраняются в отдаленном периоде

2 Перфузия физиологическим раствором при острой массивной кровопотере не обеспечивает в полной мере восстановление кровотока и поддержание тканевого метаболизма на необходимом уровне, что документируется угнетением активности окислительно-восстановительных ферментов с развитием дистрофических и некротических изменений изучаемых структур почек

3 Восполнение кровопотери гепаринизированной аутокровью сопровождается выраженным угнетением активности окислительно-восстановительных ферментов, замедленным восстановлением их активности и, как следствие, длительно сохраняющимися морфологическими изменениями тубулярного и клубочкового аппарата почек При сравнительной оценке в этой серии сохраняются некоторые нарушения метаболизма почек после массивной кровопотерей

4 Газотранспортная функция «Перфторана» поддерживает достаточно высокий уровень энергетического обмена в гистологических структурах почки, что снижает альтеративные изменения и способствует раннему развитию репаративных процессов

5 Сравнительный анализ использования различных кровезаменителей показывает, что полифункциональный кровезаменитель «Перфторан» оказывает наибольшее протекторное действие на структуры почки в условия острой массивной кровопотери

Практические рекомендации.

1 Полученные результаты проведенных исследований могут стать основой для последующих клинико-экспериментальных исследований

2 Полученные сведения рекомендуются для использования в учебном процессе в медицинских ВУЗах

3 Детальное и углубленное исследование морфологических и энзимогистохимических изменений в почках при массивной крово-потере и восполнении различными кровезамещающими растворами позволяет научно обосновать и рекомендовать использование перфто-рана в комплексе противошоковых мероприятий у больных с массивной кровопотерей

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 А М Голубев, Ф А Тамаева Исследование активности де-гидрогеназ в нефроцитах при острой массивной кровопотере и ее возмещении //Материалы Российской научной конференции «Перфто-руглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине», Санкт-Петербург, 2004, с 64-65

2 ФА Тамаева, А М Голубев, А С Алкадарский Исследование метаболических изменений в почках при массивной кровопотере //Ж «Современные наукоемкие технологии», М, 2005, №5, с 65-68

3 ФА Тамаева, А М Голубев, А С Алкадарский Изучение характера метаболических изменений в структуре почек при массивной кровопотере и ее коррекции кровезамещающими растворами //Материалы межвузовской научной конференции с международным участием «Современные проблемы морфологии», Махачкала, 2005, с 142-144

4 ФА Тамаева, А М Голубев, А С Алкадарский Гистоэнзима-тическое исследование структур нефрона при массивной кровопотере и при коррекции различными кровезаменителями //Материалы республиканской научно- практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения проф М М Максудова Махачкала, 2006, с 242-244

5 ФА Тамаева, А М Голубев, А С Алкадарский Характеристика различных отделов нефрона при массивной кровопотере // Ж «Современные наукоемкие технологии», М , 2006, №6, с 89 -90

6 Ф А Тамаева, А М Голубев, А С Алкадарский Изучение характера метаболических изменений в структуре почек при массивной кровопотере и ее коррекция кровезамещающими растворами //Материалы 4-й научно-практической конференции "Новое в хирургии Дагестана» - Махачкала, 2006, с 166-167

7 AM Голубев, Ф А Тамаева Коррекция метаболических нарушений в почках при острой массивной кровопотере. Ж «Общая реаниматология», 2007, III, 5-6, с 38-42

Формат 60x84 1/16 Гарнитура Тайме Бумага офсетная Тир 100 экз Размножено ПБОЮЛ «Зулумханова» Махачкала, ул М Гаджиева, 34

Актуальность исследования

Кровопотеря является одной из важных проблем медицины. Высокий уровень травматизма, хирургические вмешательства, при которых возникает массивная кровопотеря, требуют соответствующей коррекции. Несмотря на существенные достижения в решении этого вопроса, выбор кровезамещаю-щего препарата, является предметом дискуссии. Несмотря на существенные достижения в решении этого вопроса, выбор кровезамещающего препарата, количество введения и другие вопросы являются предметом дискуссии.

Большие надежды были связаны с использованием крови и препаратов крови, полученных от доноров. Однако, как выяснилось, кровь, извлеченная из сосудистого русла, теряет свои нативные свойства. В этом случае она представляет собой суспензию, состоящую из микросгустков, тромбоцитов и неполноценно функционирующих эритроцитов (А.И.Воробьев, 2003). Совершенно очевидно, что вне организма не существует цельной крови. После разделения крови на составляющие ее компоненты, можно говорить о разобщенных клетках или белках, которые вводятся в организм человека. Кроме этого, применение крови и ее компонентов сопряжено с риском заражения реципиента опасными инфекционными заболеваниями: вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция и т.д. Кристаллоиды, крахмалы, альбумин, декстраны, решая отдельные задачи инфузионной терапии (восполнение объема циркулирующей крови, поддержание осмотического и онкотического давления), не обладают очень важным механизмом: способность обеспечивать транспорт газов.

В связи с этим, в настоящее время ведутся поиски препаратов, которые способны решать этот важнейший вопрос. Одним из направлений является создание кровезаменителей, обладающих газотранспортной функцией, на основе перфторуглеродов. Перфторуглероды обладают химической устойчивостью, растворяют до 50 % кислорода и в 4 раза больше углекислого газа. Созданная целевая комплексная программа, завершилась созданием отечественного препарата «Перфторан», который в 1997 году был разрешен Мини4 стерством здравоохранения Российской Федерации для массового производства, «как новое поколение кровезаменителей, обладающих газотранспортной функцией» (Г.Р.Иваницкий, 2001). Для человека с большим запасом безопасности установлена допустимая доза перфторана 30 мл/кг (ЛД 50 для мыши составляет 140 мл/кг перфоторана).

Массивная кровопотеря, сопровождаясь уменьшением объема циркулирующей крови, снижением артериального давления, ведет к гипоперфузии органов и тканей, ограничению доставки кислорода к клеткам и развитию гипоксии. Базисным механизмом гипоксии является нарушение функции ми-тохондриальных ферментных комплексов, а восстановление доставки кислорода к клетке при гипоксии имеет положительный эффект в условиях функционирования дыхательной цепи (Л.Д.Лукьянова, 2001). В противном случае высокие концентрации кислорода, обладая токсическим действием, будут усугублять процессы альтерации клеток.

В почках при массивной кровопотере отмечаются значительные нарушения кровообращении, в том числе и на уровне микроциркуляторного русла. Особенно уязвим корковый слой почек, так как при снижении артериального давления кровь по дуговым артериям, минуя корковый слой, возвращается в сосуды мозгового слоя. Интенсивность повреждения структур почек связана в значительной степени с продолжительностью гипоксии (или ишемии) и своевременным восстановлением почечного кровотока с использованием инфузионных препаратов.

Решению указанных вопросов и посвящено настоящее исследование.

Цель исследования: оценить протекторный эффект некоторых кровезаменителей для коррекции морфологических и гистоэнзимотических изменений почек при острой массивной кровопотере.

Задачи исследования

1. Определить морфологические изменения и нарушения тканевого дыхания в различных отделах почек экспериментальных животных (крыс) при массивной кровопотере (50% объема циркулирующей крови).

2. Оценить структурные изменения и энзимогистохимические нарушения в различных отделах почек при восполнении кровопотери физиологическим раствором.

3. Изучить характер изменения структур почки и метаболические нарушения при восполнении кровопотери гепаринизированной аутокровью.

4. Оценить морфологические и гистоэнзиматические изменения в различных отделах почек при восполнении массивной кровопотери перфто-руглеродной эмульсией «Перфторан».

5. Провести сравнительный анализ протекторного эффекта различных кровезамещающих растворов на различные структуры почечной ткани при острой массивной кровопотере.

Научная новизна

• Впервые количественно (морфометрически) изучена динамика изменения активности окислительно-восстановительных ферментов и гидро-лаз почек при массивной кровопотере в эксперименте.

• Впервые на основании гистологических и количественных энзи-могистохимических методов установлены протективные свойства перфто-руглеродной эмульсии «Перфторан» для различных отделов нефрона при массивной кровопотере.

• Впервые, на основе количественной характеристики, определенны особенности коррекции гипоксических поражений почек при острой массивной кровопотере различными кровезамещающими растворами (физиологический раствор, гепаринизированная аутокровь, «Перфторан»).

Практическая значимость работы.

Проведенные количественные энзимогистохимические исследования позволили установить характер и последовательность метаболических изменений в различных отделах нефронов при острой массивной кровопотере в эксперименте, которые могут объяснить патогенез функциональных нарушений почек.

Сравнительный анализ результатов использования различных кровеза-мещающих препаратов для коррекции массивной кровопотери, позволил рекомендовать « Перфторан» в качестве ведущего кровезамещающего препарата при при массивной кровопотере, поскольку он обладает наибольшим протекторным эффектом для почек.

Положения, выносимые на защиту.

1. Острая массивная кровопотеря ведет к существенному изменению активности окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов и, как следствие, структурно- функциональным нарушениям почек.

2. Физиологический раствор, используемый в качестве препарата для восполнения кровопотери, не обеспечивает полной сохранности метаболических процессов в структурах почки.

3. Гепаринизированная аутокровь способна к частичной коррекции энзиматических и морфологических нарушений в клеточных структурах почек при массивной кровопотере.

4. Перфторан, обладая газотранспортными и мембраносберегающими свойствами, оказывает наиболее эффективное протекторное действие в сохранении активности окислительно - восстановительных ферментов, предотвращает морфологические изменения в клетках клубочков, эпителиальных с клетках тубулярного аппарата при острой массивной кровопотере.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены: на Российской научной конференции «Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине» (Санкт-Петербург, 8-10 сентября 2004г); на межвузовской научной конференции с международным участием «Современные проблемы морфологии» (Махачкала, 2005); на республиканской научно7 практической конференции, поев. 90- летию со дня рожд. проф. М.М.Максудова (Махачкала, 2006); на 4-й научно-практ. конф. "Новое в хирургии Дагестана» (Махачкала, 2006); на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 7 работ. Из них 1 работа в издании, рекомендованном ВАК Российской Федерации, в которых публикуются материалы кандидатских и докторских диссертаций, и 4 работы в материалах конференций и съездов. Получено 1 удостоверение на рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 171 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Список литературы включает 205 публикации, из них 123 отечественных и 82 иностранных. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 22 диаграммами и 58 рисунками (микрофотографиями).

Выводы:

1. Острая массивная кровопотеря вызывает глубокие нарушения энергетического обмена, что ведет к структурным изменениям нефрона и собирательных трубочках, проявляющимся дистрофией и некрозом эпителия канальцев, а в более поздние сроки отложением солей кальция и формированием соединительной ткани в участках повреждения. Дисэнзиматические нарушения в нефроне сохраняются в отдаленном периоде.

2. Перфузия физиологическим раствором при острой массивной кровопотере не обеспечивает в полной мере восстановление кровотока и поддержание тканевого метаболизма на необходимом уровне, что документируется угнетением активности окислительно-восстановительных ферментов с развитием дистрофических и некротических изменений изучаемых структур почек.

3. Восполнение кровопотери гепаринизированной аутокровью сопровождается выраженным угнетением активности окислительно-восстановительных ферментов, замедленным восстановлёнием^их активности и, как следствие, длительно сохраняющимися морфологическими изменениями тубулярного и клубочкового аппарата почек. При сравнительной оценке в этой серии сохраняются некоторые нарушения метаболизма почек после массивной кровопотерей.

4. Газотранспортная функция «Перфторана» поддерживает достаточно высокий уровень энергетического обмена в гистологических структурах почки, что снижает альтеративные изменения и способствует раннему развитию репаративных процессов.

5. Сравнительный анализ использования различных кровезаменителей показывает, что полифункциональный кровезаменитель «Перфторан» оказывает наибольшее протекторное действие на структуры почки в условия острой массивной кровопотери.

Практические рекомендации:

1. Полученные результаты проведенных исследований могут стать основой для последующих клинико-экспериментальных исследований, положительные результаты которых позволят рекомендовать включение инфузии эмульсии перфторана в состав лечебных мероприятий гипоксических состояний почек, развившихся на фоне массивной кровопотери.

2. Полученные сведения рекомендуются для использования в учебном процессе в медицинских ВУЗах.

3. Детальное и углубленное исследование морфологических и энзимо-гистохимических изменений в почках при массивной кровопотере и восполнении различными кровезамещающими растворами позволяют научно обосновать и рекомендовать использование перфторана в комплексе противошоковых мероприятий у больных с массивной кровопотерей.