Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Постадийный контроль производства и стандартизация лекарственного средства кемантан

На правах рукописи

ТОЛКАЧЕВА АННА ВАЛЕНТИНОВНА

ПОСТАДИЙНЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА КЕМАНТАН

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

9 ГГН 2015

Москва-2015

005562008

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Прокофьева Вера Ивановна - доктор фармацевтических наук, профессор Грушевская Любовь Николаевна - доктор фармацевтических наук

Официальные оппоненты:

Саканян Елена Ивановна — доктор фармацевтических наук, профессор, директор Центра фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России.

Шпрах Зоя Сергеевна — кандидат фармацевтических наук, заместитель директора Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина»

Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».

Защита диссертации состоится: «А^» ¿'¿/Т?2015 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.04(П)9 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России - http://wwvv.mma.ru.

Автореферат разослан «_».

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

2015 г.

Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Работа по синтезу и изучению фармакологических свойств производных адамантана осуществляется в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» с 60-х годов прошлого века. В результате скринига соединений ряда адамантана было выявлено вещество с иммунотропной активностью - 5-гидроксиадамантан-2-он (син.: 1-гидроксиадамантан-4-он), получившее название «кемантан».

Экспериментально установлено, что кемантан влияет как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет: он активирует выработку В-лимфоцитами иммуноглобулинов, стимулирует Т-клеточные иммунные реакции, а также миграцию стволовых клеток, способствует образованию интерлейкинов 1 и 2 (Арцимович Н.Г., 1990).

Помимо иммуномодулирующей активности, препарат обладает противопаркинсоническим, стрессопротекторным действием. Он способен улучшать состояние ишемизировагаюго мозга путем усиления кровотока.

Доказана эффективность кемантана в терапии заболеваний смешанной этиологии, ассоциированных нервно-психических и иммунных расстройств с сопутствующей вирусной и бактериальной патологией. В частности, прием кемантана рекомендуется при лечении заболеваний сосудистой системы конечностей аутоиммунного генеза, хроническом бронхите, бронхиальной астме, афтозном стоматите, герпесе и т.д. Своевременный прием кемантана способствует нормализации иммунологических показателей, более быстрому восстановлению физической и умственной работоспособности.

В связи с вышеизложенным актуальна разработка иммуностимулирующего препарата кемантан с последующим внедрением его в медицинскую практику.

Синтез кемантана проводится в несколько стадий, при этом в субстанции в виде примесей может присутствовать как исходный продукт синтеза, адамантан-2-он, так и промежуточные и побочные продукты реакции - производные адамантана. Присутствие данных примесей может негативно сказаться на качестве получаемой субстанции, а в дальнейшем - на качестве лекарственного препарата. В связи с этим важной задачей является разработка методов идентификации и количественного определения различных технологических примесей на каждой из стадий синтеза лекарственного вещества.

Таким образом, помимо проведения фармакологических испытаний, для внедрения препарата в медицинскую практику требуется разработка комплекса методик для постадийного контроля производства, а также стандартизации субстанции и нового лекарственного препарата - таблеток кемантана 100 мг, создание соответствующей нормативной документации.

Степень разработанности темы исследования

Ранее в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова проводились исследования по разработке метода синтеза субстанции и созданию лекарственной формы кемантана. Для контроля качества субстанции и лекарственной формы были разработаны соответствующие методики: подлинность субстанции оценивали с помощью качественной реакции на кето-группу, идентификацию примесей проводили методом ТСХ, количествегаюе определение - методом оксимирования, для постадийного контроля были разработаны методики ТСХ и газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на набивных колонках с низкой эффективностью разделения. Содержание остаточных

органических растворителей (OOP) в субстанции не нормировалось. Для контроля качества таблеток применяли метод УФ-СФМ (количественное определение) (Кисляк H.A., 1989) и качественную реакцию на кето-группу (идентификация), определение посторонних примесей в таблетках не проводилось.

Технологический процесс получения кемантана из адамантан-2-она впоследствии был усовершенствован, что потребовало дополнительных исследований с целью разработки комплекса методик контроля производства субстанции и качества готового продукта. Был предложен новый состав вспомогательных веществ таблеток. Все это привело к необходимости совершенствования методик анализа кемантана на промежуточных и конечных этапах синтеза, а также методик контроля качества лекарственного препарата-таблетки кемантана 100 мг.

Цель н задачи настоящего исследования

Цель исследования: разработать комплекс методик для контроля производства, качества субстанции и таблеток кемантана, а также провести их стандартизацию в соответствии с современными требованиями.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1) разработать комплекс методик постадийного контроля производства субстанции кемантана;

2) изучить физико-химические свойства, спектральные характеристики субстанции кемантана методами ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии, а также хроматографические характеристики методом ГЖХ, разработать методики анализа субстанции;

3) определить фармакопейные показатели качества таблеток кемантана 100 мг и разработать методики их определения;

4) изучить стабильность субстанции и таблеток кемантана, определить условия хранения и сроки годности;

5) установить экспериментально обоснованные нормы качества субстанции и таблеток кемантана, оформить соответствующие проекты фармакопейных статей предприятия.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный анализ физико-химических и спектральных характеристик фармацевтической субстанции кемантана.

Изучено хроматографическое поведение кемантана и его технологических примесей методом ГЖХ с пламенно-ионизационым детектором. Показана возможность разделения кемантана и других кислородсодержащих производных адамантана на среднеполярных и полярных неподвижных фазах. Предложены методики количественного определения примесей (адамантан-2-она, адамантан-2,6-диона) и действующего вещества в субстанции и таблетках кемантана 100 мг.

Установлены оптимальные параметры для парофазного способа пробоподготовки, а также подобраны хроматографические условия разделения для контроля OOP в субстанции кемантана.

Изучена стабильность субстанции и таблеток кемантана 100 мг при хранении методом «ускоренного старения». Экспериментально доказано, что как субстанция, так и таблетки кемантана 100 мг стабильны в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях.

Теоретическая значимость работы

В работе представлены подходы для обоснования методов стандартизации кислородсодержащих производных адамантана как потенциальных лекарственных

средств на основе современных достижений фармакопейного анализа.

В целях обеспечения надлежащего качества фармацевтической субстанции показана необходимость определения содержания OOP при ее очистке.

Практическая значимость работы и внедрение в практику

Разработан новый комплекс методик постадийного контроля производства субстанции кемантана. Установлены научно обоснованные показатели и нормы качества субстанции и таблеток кемантана. Разработаны методики стандартизации субстанции и таблеток кемантана 100 мг.

По результатам исследований оформлены проекты ФСП на субстанцию и таблетки кемантана 100 мг.

Новые методики включены в лабораторный регламент на производство субстанции кемантана в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», в нормативную документацию на субстанцию и таблетки кемантана 100 мг, предназначенную для использования промышленными предприятиями (Акт внедрения от 12 февраля 2015г.).

Методология и методы исследования

В работе использованы методы фармакопейного анализа, представленные в зарубежных и отечественных источниках: в Европейской Фармакопее, Фармакопее США, Государственной Фармакопее СССР XI издания, Государственной Фармакопее РФ XII издания. Также были учтены требования и рекомендации, представленные в руководствах ICH и GMP, руководствах под редакцией В.В. Береговых: «Валидация аналитических методик для производителей лекарств» и под ред. Н.В. Юргеля и др.: «Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств», в отраслевом стандарте 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", в инструкции «Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре» И 42-8-82. Статистическая обработка полученных результатов проведена в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып. 1, с.199 и с применением программы обсчета данных Microsoft Office Excel.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Степень достоверности результатов

Для проведения экспериментальных работ использовано современное сертифицированное оборудование; проведена валидация аналитических методик; анализ полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012, 2014), на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012), на IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выполнении экспериментальных исследований, разработке и валидации методик, анализе и обобщении полученных результатов, проведении аналитической и статистической обработки результатов,

написании публикаций и нормативных документов. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01201261653).

Основные положения, выносимые на защиту:

- обоснование выбора комплекса методик постадийного контроля производства субстанции кемантана;

-результаты изучения физико-химических, спектральных и хроматографических характеристик субстанции кемантана;

- комплекс испытаний для обеспечения надлежащего уровня качества субстанции и таблеток кемантана;

- результаты изучения стабильности субстанции и таблеток кемантана при хранении методом «ускоренного старения»;

- результаты исследований по установлению экспериментально обоснованных норм качества субстанции и таблеток кемантана.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 214 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы, 58 рисунков, приложения А, Б. Диссертационная работа состоит из содержания, списка используемых сокращений, введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав описания экспериментальных исследований, библиографии. Список цитированной литературы включает 153 источника, в том числе 50 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Объектом наших исследований являлись исходные и промежуточные продукты синтеза кемантана (адамантан-2-он, адамантан-2,6-дион), образцы субстанции и таблеток кемантана 100 мг, полученные в лабораторных условиях.

В качестве веществ-свидетелей при разработке методик анализа использовались промежуточные и побочные продукты синтеза: адаманган-2-он, адамантан-2,6-дион, адамантан-1-ол, адамантан-2-ол, адамантан-2,6-диол, адамантан-1,4-диол, адамантан-1,4-диол («цис»-изомер), а также органические растворители, применявшиеся в процессе производства субстанции: четыреххлористый углерод, хлороформ, н-гексан, толуол. В качестве стандартов при разработке методик использовали: адамантан (100277 Aldrich), 1-адамантилэтанол (188115 Aldrich), адамантан-2-он (99,8%, АО «Олайнский химико-фармацевтический завод», Латвия), ацетон (414689 Fluka).

Методы исследования

В ходе работы использовали следующие методы анализа: ИК-, УФ-, ПМР-спектроскопшо, титрование в водной и неводной средах, хроматографию в тонком слое сорбента (ТСХ), газовую хроматографию (ГЖХ).

Оборудование:

УФ-спектрофотометр UV-1700 фирмы "Shimadzu", Япония; однолучевой ИК-Фурье-спектрометр «BrukerTensor 27» (ФРГ) с валидированным программным обеспечением «OPUS-NT»; ПМР-спектры регистрировали на спектрометре Bruker АС-250 (Германия) в растворах CDC13, внутренний стандарт - тетраметилсилан. ГЖХ анализ проводили на двух приборах: на «Chrom-5» (Чешская Республика) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), программным обеспечением - «Экохром» (ООО Прибор, Россия) и на «Varían GC-450» (Нидерланды) с ПИД, автосамплером «Vanan CombiPAL Autosampier» (Нидерланды) и программным обеспечением - «Galaxie».

ПОСТАДИЙНЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА СУБСТАНЦИИ КЕМАНТАНА

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» был разработан и усовершенствован способ получения 5-гидроксиадамантан-2-она, основанный на реакции окисления адамантан-2-она смесью концентрированных серной и азотной кислот при 40-50°С в присутствии катализаторов: оксидов металлов переменной валентности, калия или натрия нитритов. По окончании реакции массу выливают на лед, а затем, для полного разложения комплексов с азотной кислотой, кипятят с активированным углем и алюминия оксидом или силикагелем с одновременной отгонкой с острым паром исходного адамантан-2-она. Отгонку проводят до полного отсутствия в кубе адамантан-2-она и прекращения выделения окислов азота. Кислую реакционную массу после отгонки с паром фильтруют, из фильтрата экстрагируют кемантан с помощью хлороформа. Далее растворитель упаривают. К остатку прибавляют гексан и отфильтровывают. Проводят очистку субстанции от адамантан-2,6-диона путем ее кристаллизации из четыреххлористого углерода. Полученный кемантан высушивают до постоянной массы.

На основании ранее предложенных в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и разработанных нами методик контроля качества был сформирован комплекс методик постадийного контроля производства субстанции кемантана.

Основные этапы контроля производства 5-гидроксиадамантан-2-она:

1 .Контроль качества исходных и вспомогательных веществ.

- Анализ адамантан-2-она: определение температуры плавления; потери в массе

при высушивании, количественное определение.

- Анализ концентрированных азотной и серной кислот: определение массовой

доли кислот в индивидуальном виде и в составе смеси методом титрования.

2.Аналитический контроль на стадии получения 5-гидроксиадамантан-2-она:

- Анализ реакционной массы на конец реакции: определение процентного содержания кемантана в реакционной массе методом ГЖХ.

- Определение конца отгоню! адамантан-2-она из кислой водной массы методом ТСХ.

- Определение полноты экстракции кемантана из «водного слоя» методом ТСХ.

- Анализ технического кемантана: оценка содержания примесей в субстанции методом ТСХ, определешк нитратов/нитритов посредством проведения качественной реакции.

3. Контроль на стадии очистки технического 5-гидроксиадамантан-2-она

-Анализ субстанции кемантана после кристаллизации из четыреххлористого углерода.

Как показали результаты наших исследований (стр. 14), в субстанции кемантана, полученной после кристаллизации из четыреххлористого углерода, содержание этого растворителя значительно превышает допустимую норму. Нами введена дополнительная стадия очистки субстанции путем кристаллизации кемантана из смеси толуол-хлороформ. Были разработаны методики контроля как технического продукта (полученного до и после кристаллизации из четыреххлористого углерода), так и фармацевтической субстанции кемантана. Методики включены в лабораторный регламент на производство субстанции кемантана.

-Анализ готового продукта (после кристаллизации кемантана из смеси хлороформ-толуол). Проводится полный анализ субстанции по проекту ФСП.

Физико-химические свойства субстанции кемантана

Субстанция кемантана после кристаллизации из четыреххлористого углерода представляет собой белый или почти белый кристаллический порошок, легко растворимый в воде, спирте этиловом 95%, хлороформе и практически нерастворимый в гексане.

2% водные растворы субстанции бесцветны и прозрачны или по степени мутности не превышают эталон I (ГФ XII), значения рН данного препарата лежат в интервале от 4,6 до 6,8.

Спектральные характеристики субстанции кемантана

ИК-спектры пропускания субстанции в дисках с КВг имеют следующие характеристические полосы (см'1): 3404-3399 - полоса валентных связанных колебаний вторичной спиртовой группы 0-Н(3413), 2923 (2927) и 2855 (2856) -полосы валентных колебаний метиленовых групп (С-Н) адамантанового цикла, 17251707 - полоса валентных колебаний карбонильной группы (С=0), 1451 и 1351 -деформационные колебания С-Н, 1288 и 1115-деформационные колебания С-0 и О-Н.

УФ-спектры 0,2% растворов субстанции кемантана в воде в области длин волн от 200 до 350 нм имели максимум поглощения при длине волны 285 ± 2 нм и минимум - при 242 ± 1 нм (удельный показатель поглощения при 285 нм - около 1,5).

ИК- и УФ-спектроскопия включены в раздел «Подлинность» на субстанцию кемантана.

Контроль субстанции кемантана, кристаллизованной из четыреххлористого углерода

Определение посторонних примесей

В субстанции кемантана возможно присутствие примесей исходного и побочного продуктов синтеза кемантана: адамантан-2-она и адамантан-2,6-диона. Определение содержания примесей в субстанции проведено с помощью методов ТСХ (методика воспроизведена) и ГЖХ (методика разработана).

Ранее для определения родственных соединений в субстанции кемантана была разработана методика ТСХ: анализ проводили на пластинках Kieselgel 60 F254, в системе н-гексан - диоксан (5:3). На пластинку наносили 10 мкл (200 мкг) растворов субстанции кемантана в спирте этиловом 95%, в качестве свидетелей использовали спиртовые растворы адамантан-2-она и адамантан-2,6-диона. Детектирование зон адсорбции проводили смесью раствора 2,4-дипитрофенил гидразина в хлористоводородной кислоте и спирта этилового 95% (1:1). Rf кемантана - 0,43 ±

0,03, адамантан-2,6-диона - 0,63 ± 0,03, адамантан-2-она - 0,89 ± 0,03. Предел обнаружения адамантан-2-она - 0,5 мкг, адаманатан-2,6-диона - 0,2 мкг.

Адамантан-2-он в образцах субстанции обнаружен не был, содержание адамантан-2,6-диона не превышало 2,5%.

В целях совершенствования методов контроля качества субстанции по показателю «Посторонние примеси» нами разработана новая методика с применением ГЖХ. Для анализа методом ГЖХ были предложены следующие условия: кварцевая капиллярная колонка «УР-624шз» 60 м х 0,32 мм х 1,8 мкм, температура испарителя - 250°С, термостата - 200°С, детектора - 300°С, газ-носитель - азот, 1,5 мл/мин; детектирование - ПИД, скорость водорода - 30 мл/мин, газа-поддува (азот) - 25 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин; объем вводимой пробы - 1 мкл, деление потока - 1:20.

Для оценки содержания примесей использовали метод внутреннего стандарта (стандарт - адамантан). В качестве свидетелей выступали адамантан-2-он, адамантан-2,6-дион, а также другие продукты окисления адамантана, которые могут присутствовать в субстанции: адамантан-1-ол, адамантан-2-ол, адамантан- 1,4-диол, адамантан-1,4-диол («цис»-изомер), адамантан-2,6-диол. В качестве растворителя для проб использовали спирт этиловый 95 %.

Идентификацию примесей проводили по относительным временам удерживания (Таблица 1). Концентрацию единичной примеси в субстанции рассчитывали по формуле:

К х Здрлу х С51 х Р

Х,(%) = .........--.................х 100,

X Скем

где вприм - площадь пика примеси на хроматограмме испытуемого раствора, мВ х мин; - площадь пика внутреннего стандарта (адамантана) на хроматограмме

испытуемого раствора, мВ х мин; С51 - концентрация адамантана в испытуемом растворе, мг/мл; Скм- концентрация кемантана в испытуемом растворе, мг/мл; К -коэффициент пересчета для каждой идентифицированной примеси (для неидентифицированных примесей К=1); Р - содержание основного вещества в стандартном образце адаматана, в десятичных долях.

Специфичность разработанной методики подтверждена анализом модельной смеси, содержащей все изучаемые вещества, концентрация каждой из примесей -

адамантан-1-ол, IV — адамантан-2-ол, V - адамантан-2-он, VI — адамантан-2,6-дион, VII -адамантан-1,4-диол, VIII- адамантан-1,4-диол («цис»-изомер), IX- адамантан-2,6-диол.

Таблица 1 - Времена удерживания, пределы качественного и количественного обнаружения, параметры разделения кемантана и его вероятных примесей

№ Соединение ЯТ, мин М1Т ПО, мкг ПКО, мкг

1 адамантал 8,№0,05 0,280±0,005 - 0,0005 0,0010

2 адамантан-1-ол 13,23±0,04 0,460±0,002 39,58±2,27 0,001 0,005

3 адамантан-2-ол 15,76±0,06 0,549±0,001 14,21±0,63 0,001 0,005

4 адамантанон-2 16,54±0,07 0,576±0,003 3,79 ± 0,56 0,001 0,005

5 адамантан-2,6-дион 28,0б±0,13 0,977±0,002 41,03±4,13 0,002 0,005

6 кемантан 28,70±0Д2 1,000 1,83 ±0,02 0,002 0,005

7 адамантан-1,4-диол 29,45±0,10 1,026±0,001 2,28 ± 0,26 0,002 0,01

8 адамантан-1,4-диол («цис»-изомер) 30,15±0,08 1,050±0,002 2,48 ± 0,76 0,002 0,01

9 адамантан-2,6-диол 36,62± 0,15 1,276±0,001 15,1б±0,26 0,002 0,01

ЯТ - время удерживания; - относительное время удерживания; Яб — разрешение между соседними пиками; ПО - предел обнаружения; ПКО - предел количественного определения.

Линейный характер зависимости площадей пиков от концентрации растворов кемантана подтвержден в пределах интервала от 0,002 до 2 мг/мл, его примесей и внутреннего стандарта - от 0,001 до 0,5 мг/мл.

Критерии «правильность» и «прецизионность» разработанной методики определяли на модельных смесях внутреннего стандарта и основных технологических примесей - адамантан-2-она и адамантан-2,6-диона. Коэффициент вариации (1180) не превышает 2,1%: 2,09% (адамантан-2-он) и 1,12% (адамантан-2,6-дион). Результаты не отягощены систематической ошибкой: I выч. < I табл. (2,71 < 3,18 (адамантан-2-он) и 0,64 < 2,78 (адамантан-2,6-дион)).

Для проверки робастности методики было изучено влияние отклонений температуры термостата в диапазоне от 190° до 220°С и изменение скорости потока газа-носителя (азота) на ±0,5мл/мин. Увеличение температуры приводило к ухудшению разделения пиков кемантана и адамантан-2,6-диона при сокращении времени анализа, снижение температуры улучшало разделение, но приводило к увеличению времени анализа до 38 мин.

Увеличение скорости потока азота способствовало сокращению времени анализа до 24 мин, однако ухудшало разрешение пиков кемантана и адамантан-2,6-диона и снижало эффективность колонки. Снижение скорости потока азота до 1 мл/мин привело к более эффективному разделению пиков кемантана и адамантан-2,6-диона на фоне увеличения времени анализа.

В Таблице 2 представлены результаты определения содержания посторонних примесей в серийных образцах технической субстанции кемантана, полученные с помощью методов ТСХ и ГЖХ-ПИД.

Таблица 2 - Сравнение данных, полученных на серийных образцах технической _субстанции кемантана методами ТСХ и ГЖХ-ПИД_

Метод ТСХ

№ образца 01 25 А-2-011 04 709 162

адамантан-2,6-дион, % = 2,5% = 2,5% < 2,5% < 2,5% ~ 2,5% < 2,5%

адамантан-2-он, % отсутствует в образцах

Метод ГЖХ-ПИД

№ образца 01 25 А-2-011 04 709 162

адамантан-2,6-дион, % 2,96 1,09 1,47 2,74 3,27 1,47

адамантан-2-он, % отсутствует в образцах

Как видно из представленных результатов, метод ГЖХ-ПИД позволяет более точно установить содержание примесей в субстанции кемантана.

Для получения фармацевтической субстанции кемантана надлежащего качества в качестве нормы для технической субстанции (полученной после кристаллизации из четыреххлористого углерода) установлено отсутствие адамантан-2-она (стр.15). Содержание адамантан-2,6-диона на данном этапе не нормируется, поскольку данную субстанцию далее подвергают повторной очистке путем кристаллизации из смеси толуол-хлороформ, посредством которой добиваются значительного сокращения содержания в фармацевтической субстанции адамантан-2,6-диона (см. Таблицу 12).

Разработка и валидация методики определения остаточных органических растворителей (OOP) в субстанции кемантапа

Технология синтеза субстанции кемантана предусматривает применение четыреххлористого углерода, хлороформа, н-гексана, толуола. Контроль содержания этих растворителей проводили методом ГЖХ с ПИД.

В результате выполненных исследований были выбраны следующие условия проведения анализа: кварцевая капиллярная колонка «VF-624ms» 60м х 0,32мм х 1,8мкм, температура испарителя - 210°С, детектора - 230°С, температурная программа термостата: изотерма при 40°С - 5мин, затем повышение до 130°С со скоростью 10°С/мин, изотерма при 130°С - 5 мин, затем повышение до 190°С со скоростью 20°С/мин, изотерма при 190°С - 8 мин; скорость газа-носителя (азот) - 1,6 мл/мин, газа-поддува (азот) — 28 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, деление потока - 1:5.

Для пробоподготовки использовали статическую парофазную экстракцию (СПЭ, «head-space»). Для оптимизации процесса экстракции целевых соединений из субстанции применяли два варианта пробоподготовки: для определения хлороформа и четыреххлористого углерода (способ 1), а также толуола и гексана (способ 2).

Пробоподготовка по способу 1: готовили раствор образца субстанции (200мг/мл) в водном растворе ацетона (0,005мг/мл или 50 ррт). Стандартный раствор - водный раствор СО четыреххлористого углерода, хлороформа и внутреннего стандарта (ацетон): с содержанием 4, 60 и 50 ррш, соответственно.

Пробоподготовка по способу 2: готовили раствор образца субстанции (20мг/мл) в растворе ацетона в ДМСО (0,005мг/мл). Стандартный раствор - раствор СО гексана, толуола и внутреннего стандарта (ацетон) в ДМСО в концентрациях: 290, 890 и 50 ррт, соответственно.

Параметры парофазного отбора пробы для пробоподготовки по способу 1: температура шприца — 85°С, температура испарителя - 80°С, скорость введения пробы - 100 мкл/сек, скорость отбора пробы шприцом - 500 мкл/сек, объем пробы - 1 мл.

Параметры парофазного отбора пробы для пробоподготовки по способу 2: температура шприца — 110°С, температура испарителя - 105°С, скорость введения пробы — 100 мкл/сек, скорость отбора пробы шприцом — 500 мкл/сек, объем пробы -1 мл.

Специфичность разработанной методики была доказана путем анализа модельных смесей, содержащих ацетон (50ррт), четыреххлористый углерод (4. ррт), хлороформ (60 ррт), гексан (290 ррт) и толуол (890 ррт). Подготовку проб проводили по методикам, представленным выше. Хроматограмма модельной смеси представлена на рисунке 2.

44 000 42 ООО 40 000 38 000 36 000 34 ООО 32 000 30 000 28 000 26 000 24 000 22 000 20 000 18 ООО 16 000 14 ООО 12 ООО. 100001 8000: 6 ООО 4 000 2 ООО

Рисунок 2 - Хроматограмма раствора, содержащего внутренний стандарт (ацетон) и технический образец кемантана. I - ацетон, II - гексан, III — хлороформ, IV-четыреххлорстый углерод (ЧХУ)

Времена удерживания, пределы обнаружения и параметры разделения исследуемых соединений представлены в Таблице 3.

Таблица 3 - Основные параметры пиков OOP

№ Вещество RT, мин RRT Rs ПО, MKT ПКО, MKT

1 ацетон 9,10 ±0,10 - - - -

2 гексан** 11,26 ±0,05 1,23 ±0,02 между 1 и 2: 21,0 ±2,0 0,001 0,002

3 хлороформ* 13,33 ± 0,07 1,46 ± 0,02 между 2 и 3:21,5 ±1,0 0,02 0,04

4 ЧХУ* 13,95 ±0,05 1,54 ±0,02 между 3 и 4: 6,7 ± 0,5 0,04 0,08

5 толуол** 18,35 ±0,05 2,00 ± 0,03 между 4 и 5: 41,5 ± 1,5 0,02 0,035

RT - время удерживания; RRT - относительное время удерживания; Rs - разрешение между соседними пиками; ПО - предел обнаружения; ПКО - предел количественного определения. * пробоподготовка проводилась по способу №1; **пробоподготовка проводилась по способу №2

Определение правильности и прецизионности проводили методом добавок на модельных смесях, состоящих из субстанции кемантана, внутреннего стандарта (ацетона) и целевого органического растворителя, вносимого в концентрации от 50% до 200% от номинального значения (Таблица 4). В качестве номинального выбрали значение, соответствующее предельно допустимому содержанию OOP в субстанции, согласно ОФС 42-0057-07 (ГФ XII, с. 115).

Расчет содержания OOP в модельных смесях проводили по формуле:

KxS^opxCstX 100%

X = ----------------------------- - Х00р, %,

Sst х Скем

где К - поправочный коэффициент; S\op - площадь пика OOP, мВ х мин; Cst-концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; Sst - площадь пика внутреннего стандарта, мВ х мин; Скем - концентрация субстанции кемантана в испытуемом растворе, мг/мл; Хоор — исходное содержание целевого OOP в субстанции, в %.

Поправочный коэффициент вычисляли по следующей формуле:

Sst х Соор

К = .............— ,

Soop Х Cst

U,yV г I 1 -Т-г"-Г--1-^—I- г S J г I 1 ООО ? ш 500 0 ,,.............. Р IV 14 16 RT Imin)

2 4 $ 8 10 12 [ 14 16^ 18 20 22 24 26 28 30

где Sst - площадь пика внутреннего стандарта, мВ х мин; Soop - площадь пика OOP, мВ х мин; Cst - концентрация внутреннего стандарта в растворе СО, мг/мл; СооР - концентрация OOP в растворе СО, мг/мл.

Значения поправочных коэффициентов: 3,30±1,00 (четыреххлористый углерод), 1,70±0,45 (хлороформ), 0,36±0,05 (гексан), 1,0 ±0,10 (толуол).

Таблица 4 - Оценка правильности и прецизионности методики определения _OOP на модельных смесях_

Результат Четыреххлористый углерод Хлороформ Гексан Толуол

Найдено, % 95,45; 98;75, 93,75; 112,20; 93,90; 120,24; 115,12; 98,86; 95,63 96,36; 98,34; 99,42; 102,49; 96,43; 107,79; 99,25; 91,79; 93,22 106,08; 104,73; 99,12; 99,30; 94,62; 96,88; 102,26; 90,21 97,86 100,12; 99,19; 98,27; 99,78; 102,69; 98,22; 99,50; 100,61; 99,97; 100,37; 100,49

Метрологические характеристики (Р=95%) X = 102,66% АХ = 7,90 RSD=10,00 t выч.=0,78 t табл.=2,31 £ =7,70 % X = 98,34% АХ = 3,70 RSD=4,89 t выч.=1,04 t табл.=2,31 £ =3,76 % X =99,01% АХ = 3,81 RSD=5,00 t выч.=0,60 t табл.=2,31 ~£ =3,85 % X =99,93% АХ = 0,83 RSD=1,23 t выч.=0,19 t табл.=2,23 £ =0,83 %

Оценка правильности методики: согласно полученным данным, максимальная относительная ошибка определения составляла для четыреххлористого углерода -20,24 % (т.е. ± 1ррш), для хлороформа - 8,21 %, для гексана - 9,79 %, для толуола -2,69 %. Относительная погрешность методики определения: 7,7 % - для четыреххлористого углерода; 3,76 % - для хлороформа; 3,85 % - для гексана; 0,83 % -для толуола.

Оценка прецизионности методики: коэффициенты вариации: 10,0 % - для четыреххлористого углерода; 4,89 % - для хлороформа; 5 % - для гексана; 1,23% - для толуола. Результаты не отягощены систематической ошибкой.

Данные по пригодности хроматографической системы были получены на основе анализа растворов, содержащих ацетон (50 ррт), хлороформ (60 ррт), четыреххлористый углерод (4 ррт), н-гексан (290 ррт) и толуол (890 ррт). Результаты представлены в виде Таблицы 5.

Таблица 5 - Параметры пригодности хроматографической системы

OOP/параметр пригодности RRT As N

для контроля содержания хлороформа и четыреххлористого углерода

хлороформ 1,46±0,02 1,0±0,1 150000±50000

четыреххлористый углерод 1,54±0,02 1,0±0,1 150000±50000

Крптерпи приемлемости:

хлороформ 1,46±0,02 Не более 1,5 Не менее 100000

четыреххлористый углерод 1,54±0,02

для контроля содержания гексана и толуола

н-гексан 1,23±0,02 1,0±0,1 90000±40000

толуол 2,00±0,03 1,0±0,1 150000±50000

Критерии приемлемости:

н-гексан 1,23±0,02 Не более 1,5 Не менее 50000

толуол 2,00±0,03

С помощью разработанной методики нами было показано, что в образцах субстанции, полученной после кристаллизации из четыреххлористого углерода, содержание этого растворителя значительно превышало допустимые значения (Таблица 6).

Таблица б - Результаты определения содержания остаточных растворителей в субстанции кемантана после кристаллизации из четыреххлористого углерода

OOP / № серии ПДК, ррт 162 709 04 736

четыреххлористый углерод, ррш 4,0 10800 10495 14500 10933

хлороформ, ррт 60,0 6,0 5 4 60

н-гексан, ррт 290,0 18,0 - 9 70

Экспериментально мы установили, что достичь нормируемого ГФ XII предела содержания OOP в субстанции кемантана при длительном высушивании не удается, в связи с чем была проведена повторная очистка субстанции кемантана путем кристаллизации из смеси органических растворителей: толуол - хлороформ. Соотношение субстанция (г) : хлороформ (мл) : толуол (мл) - 1: 0,25 : 6,5.

Разработка и валидация методики количественного определения субстанции

кемантана

Ранее для количественного определения кемантана в субстанции использовали метод оксимирования. Нами была воспроизведена данная методика.

Оксимирование проходило по кето-группе гидроксиламина гидрохлоридом в присутствии спиртового раствора Ы,Ы-дифенилгуанидина, избыток гидроксиламина титровали 0,2 М спиртовым раствором кислоты хлорной, конечную точку титрования определяли потенциометрически.

Мы получили результаты (Таблица 10), свидетельствующие о недостаточной специфичности предложенной ранее методики. В связи с этим мы посчитали целесообразным разработать новую методику количественного определения кемантана в субстанции методом ГЖХ.

Анализ методом ГЖХ осуществляли на газовом хроматографе «Varían GC-450» (Нидерланды) с ПИД.

В результате проведенных исследований были выбраны следующие условия: кварцевая капиллярная колонка "CP-WAX 52 СВ" 50м х 0,32мм х 1,2 мкм, температура испарителя - 220 °С, термостата - 200 °С, детектора - 230 °С; скорость газа-носителя (азот) - 5 мл/мин, газа-поддува (азот) — 25 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, деление потока - 1:40, внутренний стандарт - 1-адамантилэтанол, пробы растворяли в спирте этиловом 95%.

В этих условиях наблюдалось полное разделение кемантана, его технологических примесей и внутреннего стандарта (рис. 3).

Линейная зависимость площадей пиков кемантана и 1-адамантилэтанола от концентрации наблюдалась в интервале от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, значения коэффициентов корреляции составляли 0,9999. Предел обнаружения кемантана -0,01мкг, 1-адамантилэтанола - 0,005мкг. Предел количественного определения кемантана - 0,02мкг, 1-адамантилэтанола - 0,01мкг. Концентрация кемантана и внутреннего стандарта в испытуемом растворе - 0,5 мг/мл каждого соединения.

Рисунок 3 - Хроматограмма модельной смеси (концентрация каждого соединения по 0,5 мг/мл): I — кемантан, II - адамантан-2,6-дион, III — 1-адамантилэтанол, IV — адамантан-2-он

Содержание кемантана (X, %) рассчитывали по следующей формуле:

Sx х К х Cst х Р

Х(%)= .........................х 100% (мг/мл),

Ss, х Сх

где Sx — площадь пика кемантана на хроматограмме испытуемого раствора, мВ х мин; Sst — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора, мВ х мин; Cst- концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; Сх— концентрация кемантана в испытуемом растворе, мг/мл; К -поправочный коэффициент; Р - содержание основного вещества в стандартном образце адамантана в десятичных долях.

Расчет поправочного коэффициента производили на модельных смесях кемантана и внутреннего стандарта.

Формула расчета поправочного коэффициента: Sst * Скем х Р ]

К= ......................,

Srcm х Cst х Р2

где: Sst - площадь пика внутреннего стандарта, мВ х мин; SKe„ - площадь пика PCO кемантана, мВ х мин; Cst - концентрация раствора внутреннего стандарта, мг/мл; Скем - концентрация раствора PCO кемантана, мг/мл; Р, - содержание основного вещества в PCO кемантана в десятичных долях; Р2 - содержание основного вещества в стандартном образце адамантана, в десятичных долях.

Валидационные характеристики: правильность, прецизионность (повторяемость и внутрилабораторную прецизионность) оценивали по результатам анализа модельных смесей кемантана и 1-адамантилэтанола (Таблицы 7 и 8).

Оценка правильности методики: отклонение среднего результата определения от истинного значения не превышает 1 %, относительная погрешность методики — менее 1 % (0,45 %, Таблица 7).

Оценка прецизионности методики как сходимости получаемых результатов: коэффициент вариации меньше 2% (0,63%). Результаты не отягощены систематической ошибкой: t выч. < t табл. (1,20 < 2,26, Таблица 7).

Таблица 7 - Результаты количественного определения кемантана в субстанции на _модельных смесях методом ГЖХ_

Взято, Найдено, Абсолютная Относительная Найдено Метрологические

мг/мл мг/мл ошибка, мг/мл ошибка, % кемантана, характеристики

(с) (с2) (d=c2 - с,) (У^хЮО/с,) % (Р=95%,п=10)

0,422 0,424 +0,002 0,47 100,47 X =100,24% 5 =0,63 Эх =0,20 ДТ= 0,45 1180=0,63 1 выч.=1,20 1 табл.=2,26 £ "0,45 %

0,450 0,451 +0,001 0,22 100,22

0,478 0,478 0 0 100,00

0,502 0,497 -0,005 1,00 99,00

0,504 0,501 -0,003 0,60 99,40

0,508 0,513 +0,005 0,98 100,98

0,512 0,515 +0,003 0,59 100,59

0,524 0,525 +0,001 0,19 100,19

0,576 0,580 +0,004 0,69 100,69

0,600 0,605 +0,005 0,83 100,83

Коэффициент вариации, вычисленный по полученным в разные дни средним результатам, составлял менее 2 % (0,94%, Таблица 8). Ошибка методики также не превышала 2%. Разработанная методика обладает приемлемой степенью внутрилабораторной прецизионности.

Таблица 8 - Результаты определения содержания кемантана в разные дни анализа

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4

Содержание кемантана в пробах, в %

97,21; 100,00; 99,40; 99,40; 98,41; 100,98; 100,20; 100,59; 101,37; 99,61; 99,80;

98,61; 100,00; 99,20 100,00; 99,60 102,36; 100,39 101,17; 101,37

Метрологические характеристики (Р=95%)

А" =99,00 А" =99,3 6 Х=100,90 Х=100,66

АХ = 1,44 ДА'=0,72 ДХ = 1,07 ДА" =1,09

£"=1,45% £=0,72% £=1,06% £•=1,08%

X =99,99%; 5 =0,94; Sx =0,47; &Х= 1,49; £ =1,49%

RSD=0,94; t выч.= 0,04; t табл.=3,18

Проверку пригодности хроматографической системы проводили на растворах кемантана и 1-адамантилэтанола с концентрацией каждого из соединений по 0,5 мг/мл (Таблица 9).

Таблица 9 - Параметры пригодности хроматографической системы

Параметры пригодности RRT As N RSD,%

Кемантан 2,15 ±0,02 1,50 ±0,09 20351±1571 0,96

1,58 ±0,02 19507±1345 0,44

1,55 ±0,17 18562±1872 0,33

Критерии приемлемости: 2,15 ±0,02 Не более 1,6 Не менее 10000 Не более 2%

В таблице 10 представлены результаты количественного определения субстанции кемантана, кристаллизованной из четыреххлористого углерода, методом ГЖХ и методом оксимирования (для сравнения).

Таблица 10 - Результаты количественного определения кемантана в субстанции

№ серии 736 04 01 162

Метод оксимирования. Метрологические характеристики, Р=95%, п=5 А=100,05 £х= 0,26 ДА" =0,72 £=0,12% Х= 100,44 S?0,30 .Ух =0,13 ДА'=0,37 £"=0,37% А= 103,81 S^0,68 5х=0,30 ДА'=0,85 £•=0,82% Х = 100,23 Ss=l,28 Sx=0,57 ДА"=1,59 £■=1,59%

Метод ГЖХ. Метрологические характеристики, Р=95%, п=4 А=97,10 5^=1,23 £х= 0,62 ДА'=1,96 £=2,02% А = 100,70 S==0,72 &Х=0,36 ДА' = 1,14 £"=1,13% Х= 99,20 fel,48 £х=0,74 ДА'=2,3 5 £"=2,37% X =99,66 fe0,30 Sx=0,15 ДХ=0,48 £"=0,48%

Как следует из данных, представленных в Таблице 10, результаты количественного определения некоторых образцов кемантана методом оксимирования и методом ГЖХ значительно отличаются. Присутствие примеси адамантан-2,6-диона мешает количественному определению: содержание этой примеси в образцах № 736, № 04 и № 01 превышает 2,5% и составляет 2,82%, 2,74% и 2,96% соответственно, тогда как в образце № 162 оно составляет 1,47%.

Метод оксимирования давал воспроизводимые результаты, однако, имел существенные недостатки: длительность приготовления реактивов, сложность определения точки эквивалентности, а также недостаточную специфичность.

В связи с этим нами было принято решение проводить количественное определение кемантана в субстанции методом ГЖХ.

В результате проведенных исследований установлены нормы качества субстанции кемантана, кристаллизованной из четыреххлористого углерода, позволяющие получать фармацевтическую субстанцию надлежащего качества (Таблица 11).

Таблица 11 - Показатели, методы анализа и нормы качества субстанции кемантана, кристаллизованной из четыреххлористого углерода_

Показатели Метод испытания Нормы

Описание Визуально Белый или почти белый кристаллический порошок

Растворимость ГФ XII, ч. 1,с. 92 Легко растворим в воде, спирте этиловом 95 %, хлороформе, практически нерастворим в н-гексане

Прозрачность ГФ XII, ч. 1,с. 98 2 % раствор субстанции в воде должен быть прозрачным или по степени мутности не превышать эталонный раствор I

Цветность ГФ XII, ч. 1,с. 93 2 % раствор субстанции в воде должен быть бесцветным или окрашен не более интенсивно, чем эталон В9

рН ГФ XII, ч.1 с.85; потенциометрически От 4,5 до 7,0 (2 % водный раствор)

Посторонние примеси ГЖХ примеси адамантан-2-она - не должно быть

OOP ГФ XII, ч.1, с.155, ГЖХ Четыреххлористый углерод - не более 15000 ррт, Хлороформ - не более 60 ррт, Гексан - не более 290 ррт

Количественное определение ГЖХ От 98,5 % до 101,5 %

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ КЕМАНТАНА

Контроль качества серийных образцов очищенной субстанции был проведен по разработанным нами методикам анализа.

Фармацевтическая субстанция кемантана - белый или почти белый кристаллический порошок, легко растворимый в воде, спирте этиловом 95%, хлороформе и практически нерастворимый в н-гексане. 2% растворы субстанции в воде прозрачны и бесцветны, рН - от 5,1 до 6,1. Содержание воды в субстанции, определенное методом К. Фишера, не превышало 0,7%.

В ИК-спектрах, снятых в дисках калия бромида, присутствовали те же характеристические полосы, что и в спектрах образцов, кристаллизованных из четыреххлористого углерода (рис. 4).

УФ-спектры 0,2 % водных растворов субстанции в области длин волн от 190 до 350 нм имели максимум поглощения при длине волны 285 ± 2 нм и минимум - при 242 ± 1 нм (рис. 5).

250.0 300.0 350.0 HWBLEHem ы

400:0

Рисунок 4 - ИК-спекгр кемантана (КВг)

Рисунок 5 - Кемантан 2,0мг/мл, в воде

В ЯМР'Н-спектре, полученном в CDC13, наблюдались следующие сигналы: 2,69 (2 Н, д, С'Н, С3Н), 2,32 (1Н, т, С7Н), 1,90-2,10 (10 Н, м, С7Н2, С6Н2, С8Н2, С|0Н2), 1,89 (1Н, с, -ОН).

Определение посторонних примесей, OOP и количественное определение образцов фармацевтической субстанции проведено по методикам, разработанным для анализа субстанции, кристаллизованной из четыреххлористого углерода (Таблица 12).

В качестве стандартного образца (СО) для количественного определения субстанции методом ГЖХ был выбран синтезированный в отделе ОТО очищенный образец субстанции кемантана. Содержание посторонней примеси (адамантан-2,6-диона) в данном образце составляло менее 1,0%.

Таблица 12 - Содержание посторонних примесей, остаточных растворителей и

Номер образца 110 114 115 227

Содержание OOP, ppm: - четыреххлористый углерод 3,0 4,0 4,0 нет

- хлороформ 60,0 58,0 50,0 56,9

- н-гексан 5,8 18,6 239,0 нет

- толуол 90,7 278,0 289,0 423,0

Посторонние примеси, %: - адамантан-2-он нет нет нет нет

- адамантан-2,6-дион 0,94 1,15 1,16 1,32

Количественное определение, % 98,83 99,20 99.40 99,23

Чистота СО определялась по формуле:

G' x(100%-RS-W-A)

G(%)= ...................................,

100

где G - содержание стандартного образца, в %; О'- содержание стандартного образца, полученное посредством ГЖХ (расчет: метод 100% площадей или нормализации), в %; RS - содержание OOP, в %; W - содержание воды и летучих веществ, в %; А — содержание сульфатной золы и тяжелых металлов, в %.

Стабильность субстанции кемантана изучена методом «ускоренного старения» при температурном режиме 60°С в соответствии с инструкцией И 42-8-82. Качество образцов субстанции кемантана в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях, не изменилось, все образцы по истеченшо экспериментального срока хранения удовлетворяли требованиям проекта ФСП на субстанцию кемантана.

Показатели и нормы качества стандартного образца и фармацевтической субстанции кемантана представлены в Таблице 13.

Таблица 13 - Нормы качества стандартного образца и фармацевтической субстанции __кемантана

Показатели Метод испытапия Нормы качества СО субстапции кемантана Нормы качества фармацевтической субстанции

Описание Визуальный Белый или почти белый кристаллический порошок

Растворимость ГФ XII, ч. 1, с. 92 Легко растворим в воде, спирте этиловом 95%, ацетоне, хлороформе, практически нерастворим в н-гексане

Подлинность ИК-спектроскопия ИК-спектр субстанций по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра кемантана

УФ-спектроскопия УФ-спектр поглощения 2% растворов субстанций в воде в области от 250 до 350 нм должен иметь максимум поглощения при 285±2нм

Прозрачность раствора ГФ XII, ч. 1, с. 98 2 % раствор субстанции в воде должен быть прозрачным или по степени мутности не превышать эталон I

Цветность раствора ГФ XII, ч. 1, с. 93 2 % раствор субстанции в воде должен быть бесцветным 2 % раствор субстанции в воде должен быть бесцветным или окрашен не более интенсивно, чем эталон В9

рН ГФ XII, ч. 1, с.85 От 4,5 до 7,0 (2 % водный раствор)

Посторонние примеси ГЖХ Примесь адамантан-2-она — должна отсутствовать; примесь адаманган-2,6-диона — не более 1,5% Примесь адамантан-2-она -должна отсутствовать; примесь адамантан-2,6-диона — не более 2,5%

Сульфатная зола ГФ XII, ч. 1, с. 115 Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XII, ч. 1, с. 121 Не более 0,001%

Вода ГФ XI, вып. 1, с. 176 (метод К.Фишера) Не более 1,0%

Остаточные органические растворители ГЖХ Четыреххлористый углерод — не более 4 ррт Хлороформ — не более бОррт Гексан — не более 290 ррт Толуол - не более 890 ррт

Показатели Метод испытания Нормы качества СО субстанции кемантана Нормы качества фармацевтической субстанции

Микробиологическая чистота ГФ XII, ч. 1, с. 160 Категория 2.2

Количественное определение ГЖХ Не менее 98,5% От 98,5 до 101,5%

Упаковка В соответствии с ФСП

Маркировка В соответствии с ФСП

Область применения Для определения показателей «Подлинность», «Посторонние примеси» и «Количественное определение» субстанции

Хранение В сухом, защищенном от света месте при температуре от + 15°С до + 25°С

Срок годности 2 года

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА - ТАБЛЕТКИ КЕМАНТАНА 100 МГ

Таблетки кемантана дозировкой 100 мг были получены методом прямого прессования, средняя масса таблетки - 0,200 г.

Таблетки белого или почти белого цвета, плоскоцилиндрической формы, без риски, средняя масса, отклонения от средней массы, распадаемость таблеток соответствовали требованиям ГФ XI издания.

Для контроля качества таблеток кемантана по разделам ФСП «Подлинность», «Посторонние примеси», «Количественное определение» использовали методики ГЖХ и УФ-спектрофотометрии, разработанные для субстанции кемантана. Методики были повторно валидированы, доказано отсутствие влияния вспомогательных веществ на результаты определения.

Примеси адамантан-2-она во всех образцах обнаружено не было, содержание адамантан-2,6-диона не превышало 2,5%. Количественное определение кемантана в таблетках - от 0,0971 г до 0,1050 г, что соответствовало требованиям ГФ XI изд.

Разработка методики испытания по тесту «Растворепие» таблеток кемантана

Ранее для количественной оценки степени высвобождения кемантана из таблеток был предложен метод УФ-СФМ (285±2нм). В качестве среды растворения использовали воду очищенную, концентрация кемантана в испытуемых растворах составляла около 2 мг/мл. В связи с низкой чувствительностью и воспроизводимостью методики было принято решение разработать альтернативную методику посредством метода ГЖХ-ПИД.

В результате проведенных исследований были выбраны следующие условия: кварцевая капиллярная колонка геЬгоп «2В-624»: 30м х 0,53 мм х 3,0мкм (РЬепотепех, США), температура испарителя - 220°С, температура детектора -250°С, градиент температуры термостата: изотерма при 180°С - 13 мин, повышение до 200°С со скоростью 5°С/мин; изотерма при 200°С - 13мин. Газ-носитель - азот, 1,5мл/мин, скорость газа-поддува (азота) - 25 мл/мин, скорость водорода - 30 мл/мин, скорость воздуха - 300 мл/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл, деление потока -1:5. Общее время анализа - 30 мин, внутренний стандарт - адамантан.

Параметры разделения кемантана, адамантана и свидетелей технологических примесей представлены в Таблице 14. Таблица 14 - Параметры разделения адамантана, кемантана и его технологических

№ Соединение ЯТ, мин ЯЯТ Яэ

1 адамантан 8,50 ± 0,05 - -

2 адамантан-2-он 18,30 ±0,05 2,15 ±0,02 41,50

3 адамантан-2,6-дион 28,52 ± 0,02 3,36 ±0,02 27,58

4 кемантан 29,05 ± 0,05 3,42 ± 0,02 1,13

Я.Т - время удерживания пика вещества, мин; ЯЯТ - относительное время удерживания, рассчитанное по формуле: ЯИТ^ЯТ компонента/ЯТ адамантана; ¿э -разрешение между пиками двух соседних компонентов смеси.

Линейная зависимость площадей пиков от концентрации растворов кемантана и адамантана подтверждена в интервале концентраций от 0,008 до 0,08 мг/мл (коэффициенты корреляции 0,999). Концентрация кемантана и адамантана в испытуемых растворах - 0,04 мг/мл, пробы фильтровали через фильтр типа «Миллипор» с диаметром пор 0,22 мкм. Относительная ошибка методики, определенная на модельных растворах, не превышала 2,8%, результаты не отягощены систематической ошибкой.

Условия проведения теста «Растворение»: прибор «Лопастная мешалка», среда растворения - вода очищенная, объем среды растворения - 500 мл, скорость вращения - 50 об/мин, температура среды - 37±0,5°С.

Зависимость высвобождения кемантана из таблеток в среду растворения от времени анализа представлена на рисунке 6.

Установлено, что за 5 минут в раствор высвобождается не менее 64 % кемантана, а за 15 минут в раствор переходит более 90 % лекарственного вещества.

Кинетика высвобождения кемантана из таблеток

О 3 5 10 15 20

Время, мин

Рисунок б - Кинетика высвобождения кемантана из таблеток в водной среде

Изучение стабильности таблеток кемантана 100 мг при хранении, установление срока годности

Стабильность таблеток кемантана 100 мг изучена методом «ускоренного старения». Качество таблеток после срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях, практически не изменилось.

На основе проведенных исследований и полученных результатов были установлены нормы качества таблеток кемантана 100 мг (Таблица 15).

Таблица 15 - Нормы качества таблеток кемантана 100 мг

Показатели Метод испытания Нормы

Описание Визуально Таблетки белого или почти белого цвета, плоскоцилиндрической формы, без риски

Подлинность УФ-СФМ УФ-спектр испытуемого водного раствора в области от 250 до 350 нм должен иметь максимум поглощения при длине волны (285 ± 2) нм

ГЖХ Относительное время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно совпадать с относительным временем удерживания пика кемантана на хроматограмме раствора стандарта

Средняя масса ГФ XI, вып.2, с.154 От 0,185 г до 0,215 г (0,2 ± 7,5%)

Отклонение от средней массы ГФ XI, вып.2, с.154 18/20: ±7,5%; 2/20: ± 15%

Распадаемость ГФ XI, вып.2, с.154 не более 15 мин

Посторонние примеси ГЖХ адамантан-2-он - должен отсутствовать; адамантан-2,6-дион - не более 2,5 %

Микробиологическая чистота ГФ XII, часть 1, с.160 Категория ЗА

Растворение ГФ XI, вып.2, с.154 и ОФС 42-0003-04, ГЖХ не менее 80%(Q) за 15 минут

Количественное определение ГЖХ от 0,095 г до 0,105 г (0,1 ± 5%)

Упаковка В соответствии с ФСП

Маркировка В соответствии с ФСП

Хранение В сухом, защищенном от света месте при температуре от +15°С до +25°С

Срок годности 2 года

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработан комплекс испытаний и обоснованы нормы для получения субстанции и таблеток кемантана 100 мг надлежащего уровня качества. Оформлены проекты ФСП на субстанцию и таблетки кемантана 100 мг, а также раздел лабораторного регламента на производство субстанции кемантана.

ВЫВОДЫ

1. Для постадийного контроля производства субстанции кемантана предложен комплекс методик, включающий определение качества исходных и вспомогательных веществ, контроль критических этапов получения кемантана из адамантан-2-она, очистки технической субстанции и стандартизацию готового продукта. Обоснована необходимость проведения дополнительной стадии очистки субстанции кемантана кристаллизацией из смеси толуол-хлороформ.

2. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристики субстанции кемантана методами ИК-, УФ- и ЯМР 'Н - спектроскопии. Показано, что эти методы могут быть использованы в контроле качества субстанции.

3. Изучено хроматографичеекое поведение кемантана и его примесей на набивных и капиллярных колонках различной полярности. Установлено, что наилучшее разделение кемантана и основной примеси, адамантан-2,6-диона, достигается на колонках со среднеполярной и полярной неподвижной фазой. Разработана и валидирована методика определения посторонних примесей в субстанции кемантана методом ГЖХ-ПИД. Обоснованы нормы их содержания.

4. Разработана и валидирована методика количественного определения субстанции кемантана методом ГЖХ с ПИД. Доказаны ее преимущества по сравнению с ранее предложенной методикой оксимирования.

5. Определены фармакопейные показатели и нормы качества таблеток кемантана 100 мг, предложен комплекс испытаний подтверждения подлинности, определения посторонних примесей и высвобождения действующего вещества в тесте «Растворение» с помощью метода ГЖХ-ПИД.

6. Изучена стабильность фармацевтической субстанции и таблеток кемантана при хранении методом «ускоренного старения». Доказано, что предварительный срок годности субстанции и таблеток составляет 2 года.

7. Разработаны проекты Фармакопейных статей предприятия на субстанцию и таблетки кемантана 100 мг, а также раздел «Контроль производства» лабораторного регламента на производство субстанции кемантана.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЖХ - газожидкостная хроматография, ДМСО - диметилсульфоксид, ИК — инфракрасная область, OOP — остаточные органические растворители, ПИД - пламенно-ионизационный детектор, PCO - рабочий стандартный образец, СО — стандартный образец, СПЭ — статическая парофазная экстракция, ТСХ - тонкослойная хроматография, УФ — ультрафиолетовая область,

УФ-СФМ - УФ-спекгрофотометрия, ФСП - Фармакопейная статья предприятия, ЧХУ - четыреххлорстый углерод, ЯМР - ядерно-магнитный резонанс.

ICH (International Conference on Harmonisation) — Международная конференциия по гармонизации, GMP (Good Manufacturing Practice) -Надлежащая производственная практика

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Толкачева, A.B. Определение содержания посторонних примесей в субстанции кемантана / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская Л.Н., Л.М. Гаевая, М.С. Сергеева, М.Е. Дуденкова, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, Р.Ф. Большакова, М.И. Устинова // Материалы сборника тезисов докладов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2012. - С. 429 - 430.

2. Толкачева, A.B. Применение метода ИК-спектроскопии в анализе субстанции кемантана / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, А. Д. Малинкин, Л.М. Гаевая, М.С. Сергеева, М.Е. Дуденкова, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, Р.Ф. Большакова, М.И. Устинова, Н.М. Зайцева // Материалы сборника тезисов докладов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 2012. — С. 430.

3. Толкачева, A.B. Установление подлинности лекарственного средства кемантан методом инфракрасной спектроскопии в ближнем диапазоне / A.B. Толкачева, К.С. Балыклова, Л.Н. Грушевская, Б.М. Пятин, Н.И. Авдюнина, В.И. Прокофьева // Материалы сборника тезисов докладов XIV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы

медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств». -Волгоград, 2012. - С. 72 - 73.

4. Авдюнина, Н.И. Синтез и постадийный контроль субстанции кемантана / Н.И. Авдюнина, A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Б.М. Пятин, Р.Ф. Большакова, Н.М. Зайцева, М.И. Устинова, В.И. Прокофьева//Материалы сборника тезисов докладов IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». — Казань, 2012.-С. 7.

5. Толкачева, A.B. Применение метода газожидкостной хроматографии в анализе остаточных органических растворителей в субстанции кемантана / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Л.М. Гаевая, М.Е. Дуденкова, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, В.И. Прокофьева, Р.Ф. Большакова, Н.М. Зайцева, М.И. Устинова // Материалы сборника тезисов докладов IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С. 179-180.

6. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения посторонних примесей в фармацевтической субстанции кемантана методом ГЖХ-ПИД / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, В.И. Прокофьева, Л.М. Гаевая // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, № 6. - С.44- 50.

7. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения субстанции кемантана с помощью газожидкостной хроматографии / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, В.И. Прокофьева, Л.М. Гаевая // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, № 12. - С.42 - 47.

8. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения кемантана в таблетках методом газовой хроматографии / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, В.И. Прокофьева // Материалы сборника тезисов докладов XXI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2014. - С. 339 - 340.

9. Толкачева, A.B. Количественное определение субстанции кемантана химическим методом и методом газожидкостной хроматографии / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, В.И. Прокофьева // Материалы сборника тезисов докладов XXI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2014. - С. 340.

10. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения действующего вещества в таблетках кемантана методом газо-жидкостной хроматографии / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, Л.М. Гаевая, A.C. Михеева, В.И. Прокофьева, Е.В. Блынская // Вестник ВолГМУ. -2014. - Вып. 1, № 49. - С. 97- 100.

11. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения действующего вещества в таблетках кемантана методом газо-жидкостной хроматографии в тесте «Растворение» / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин, Л.М. Гаевая, В.И. Прокофьева, К.В. Алексеев, A.C. Михеева, Е.В. Блынская // Естественные и технические науки. - 2014. - № 8. -С.62 - 67.

12. Толкачева, A.B. Разработка и валидация методики количественного определения остаточных органических растворителей в фармацевтической субстанции кемантана методом ГЖХ-ПИД / A.B. Толкачева, Л.Н. Грушевская, Н.И.Авдюнина, Б.М. Пятин, Л.М. Гаевая, В.И. Прокофьева, Н.М. Зайцева // Химико-фармацевтический журнал. - 2015. - Т. 49, № 1. - С.42 -47.

Подписано в печать 13.05.2015 Объем 1,5 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 159 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, пр-т Мира, д.38 +7(495)979-98-99, www.reglet.ru