Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Порфирин-фуллереновые наночастицы ([25Mg2+])4РМС16 в коррекции митохондриальных дисфункций, индуцированных в клетках миокарда крыс 1-метилникотинамидом

На правах рукописи

АМИРШЛХИ НИМА

ПОРФИРИН-ФУЛЛЕРЕНОВЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ([25М«2+])4РМС16 В КОРРЕКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДИСФУНКЦИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ МИОКАРДА КРЫС 1-МЕТНЛНИКОТИНАМИДОМ

14.00.25 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Москва 2008

003454145

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и в Институте химической физики им. H.H. Семёнова РАН, Москва

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Аляутдин Реиад Николаевич

Доктор биологических наук, профессор Кузнецов Дмитрий Анатольевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук профессор Чехонин Владимир Павлович

Кандидат фармацевтических наук, доцент Кулешова Светлана Анатольевна

Ведущая организация:

ГУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН, Москва

Защита диссертации состоится Л » дО<0.0р£,_2008 года в >э часов

на заседании Диссертационного совета Д1208.069.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск-32, пр. Калинина 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

HotufJL

Автореферат разослан «16» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.фарм.н., проф. /у " Компанцева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Миокардиоциты являются, наряду с нейронами коры головного мозга, клетками, наиболее чувствительными к дефициту кислорода (Leder & Waugh, 1980; Sallivan et al, 2001). Поэтому последствия тканевой гипоксии миокарда, нередко необратимые, способствуют формированию устойчивых нарушений строения и контрактильной функции сердечной мышцы (Chomsky et al, 2000). В основе патогенеза этих нарушений лежит падение уровня синтеза АТФ, связанное с невозможностью нормального протекания внутримитохондриалышх электрон-транспортных реакций окислительного фосфорилирования в отсутствие кислорода (Liu & Pratt, 2002). Таким образом, как профилактика, так и лечение митохондриальных дисфункций и гипоксических миокардиопатий должны включать способы быстрого восстановления истощённого пула АТФ в клетках сердца.

При этом этиология этих нарушений весьма разнообразна: это и врождённые нарушения метаболизма (синдром Ледерера-Вальдека), и отравления (нитрофенолы), и побочные эффекты лекарств — ингибиторов окислительного фосфорилирования (Доксорубицин), и ингаляторное кислородное голодание, и чрезмерные физические нагрузки, и спровоцированные электрошоком разновидности электролитного дисбаланса в миокарде (Barthels et al, 1998; Asher & Ramsey, 2000; Buchanan et al, 2002; Dupret et al, 2005; Kerr et al, 2005; Telashima et al, 2006). Общим же звеном в молекулярных механизмах всех этих нарушений является нарастающий дефицит АТФ в миокардиоцитах (Radczek et al, 2003; Jalenski & Tropp, 2007).

Значительно компенсировать или даже восполнить этот дефицит возможно путём стимулирования резервных, т.е. не зависящих от потребления кислорода клеткой, реакций синтеза АТФ — реакций субстратного фосфорилирования. Большинство этих реакций обеспечиваются в митохондриях ферментами семейства киназ, осуществляющими Mg^-зависимый перенос фосфата от молекулы-донора (креатинфосфат, а-глицерофосфат, фосфоенолпируват и др.) на АДФ (Tomassetti & Darnell, 2001). Адресная доставка активирующих катионов Mg2T в места локализации этих ферментов могла бы способствовать снижению остроты дефицита АТФ.

Однако быстро и эффективно ликвидировать этот дефицит в условиях гипоксии возможно лишь при участии катионов единственного парамагнитного изотопа магния,

( ,

^ \

25Ме:+ (ВисИасЬепко & Клш^оу, 2008; ВисЬасЬепко е/ а!, 2004-2008, Кигпе150У е/ а! 2004-2008). Этот стабильный изотоп (распространённость в природе 11%) отличается от двух других, немагнитных, изотопов 241^2+ и тем, что обладает отличным от нул;

ядерным спином (+2,5) и, как следствие, выраженным ядерным магнитным моментом (0,8. МБ). Магнитный изотопный эффект ионов 25М§2+, проявляемый в киназных реакциях сводится к гиперактивации синтеза АТФ, не требующей присутствия кислород; (ВисЬасЬепко е/ а!, 2005). Образование ион-радикальных пар с последующей синглет триплет спиновой конверсией в них лежит в основе этого уникального эффекта (Бучаченк и соавт., 2006).

Приведённые данные говорят в пользу того, что ткань-селективная доставка I миокард ионов 25Mg2+ могла бы стать радикальным средством борьбы с его тканево! гипоксией и её последствиями

В этом случае исключительно важное значение приобретает вопрос о "миокард нацеленном" переносчике этих ионов: введение чистых солей 25Mg экономичесю нецелесообразно и чревато созданием хаоса в системе энергетического обмена во все? иных, нежели миокард, органах и тканях. Последнее обстоятельство (отсутствие ткань селективного эффекта) является также фактором, серьезно ограничивающи\ эффективность фармакологического применения препаратов солей АТФ в терапии I профилактике локальных гипоксий миокарда (Ьое\уепЬаир1 е1 а!, 2004)

Для направленного транспорта 25Mg2+ в миокард разработана углеродная наночастиц' (1,8-2,0 нм) на основе К-порфинового аддукта циклогексил-фуллерена-С60, структура I технология синтеза которой защищены патентами Европейского Союза (Багкаг ег о/, 200 а, Ь). Данное соединение, получившее название "Порфиллерен-МС16" или РМС16 впервы исследуется как фармакологический агент в настоящей работе, которая являете фрагментом обширной программы его всестороннего исследования в России, Италии Иране (2005-2008).

Являясь водорастворимым амфифильным катеонитом (Багкаг а а1, 2007 а), РМС1 имеет Mg2+-yдepживaющий тетрапиррольный порфириновый домен, что позволяе надеяться на его "узнавание" миокард-специфическими порфирин-связывающими белкам1 (ПСБ) мембран миокардиоцитов млекопитающих, известных благодаря работам ¡ОБЫёа о/ (1997-2004) и \Vallerstr0m е/ а! (2002-2006). С этим связана возможность использовани наночастиц РМС16 для адресной доставки микроколичеств 25М§2+ в ткань миокарда

Изучению такой возможности и её фармакологического потенциала и посвящена эта работа. В качестве экспериментальной модели тканевой гипоксии использована модель Rilke-Bohmer (1994), основанная на избирательном ингибировании окислительного фосфорилирования нуклеотидов in vivo 1-метилникотинамидом.

Таким образом, актуальность диссертационной работы связана с изучением важной проблемы современной медицины - проблемы профилактики и лечения острых гипоксических нарушений энергетического метаболизма в миокарде с помощью магнитного изотопного эффекта ионов 2SMg2+, реализуемого в клетках миокарда, благодаря направленному транспорту в них этого изотопа катионообменными наночастицами.

Цель работы

Оценка возможности коррекции биохимических проявлений гипоксии миокарда, вызванной у крыс введением 1-метшшикогинамида, с помощью порфирин-фуллерековых наночастиц [2iMg2+]PMC16 ("Porphylleren-MCló", EU Pat. No. 07009882.7 / EP07009882, EU Pat No. 07009881.9/ЕР07009881).

Задачи исследования:

1. Определение основных параметров фармакокинетики наночастиц РМС16 при их однократном внутривенном введении крысам.

2. Определение эффективности и селективности адресной доставки ионов 25Mg2+ в миокард крыс наночастицами РМС16 и последующего высвобождения этих ионов в норме и при гипоксическом тканевом ацидозе, вызванном введением 1-метилникотштмида (МНА).

3. Оценка основных биохимических параметров, характеризующих состояние энергетического метаболизма в миокарде крыс, на фоне действия in vivo наночастиц [24Mg2+]PMC16, [2îMg2t]PMC16 и [26Mg2+]PMC16 в норме и при МНА-индуцированной тканевой гипоксии.

4. Выделение, очистка, изучение внутриклеточной локализации и основных структурных особенностей миокард-специфического РМС16-узнающего рецептора, предположительно входящего в состав пула порфирин-связывающих белков (ПСБ) мембран.

5. Изучение функционирования РМС16-рецептора in vitro: определение констант аффинности, анализ изотерм селективности связывания «белок-лиганд».

Научная новизна исследования

1. 2"Mg2+-MarHHTHbiü изотопный эффект, как элемент регуляции АТФ-продуцирующей активности клеток миокарда, не изучался ранее на моделях химически индуцированной гипоксии (1-метилникотинамид) in vivo

2. Фармакологическая перспектива применения магнитного изотопного эффекта 25Mg2+ для профилактики и лечения гипоксических нарушений энергетического обмена в клетках миокарда впервые является предметом научного исследования.

3 Впервые проведено изучение эффективности применения 25Mg2+-nepeHOCRumx катионообменных наночастиц «Порфиллерен-МС16» (РМС16), созданных jr основе К-порфиринового производного фуллерена-С60 {Бакминсгпсрфучлереи (С(о)-2-(бутадиен-1-ил)-тетра-(о-у-аминобутирил-о-фтапил)-ферропорфирин), для профилактики и коррекции метаболической гипоксии миокарда индуцированной 1 -метилникотинамидом.

4. Впервые решена задача структурно-функионального изучения взаимодействи наночастиц РМС16 с тканеспецифическим К-порфирин-узнающим рецепторов клеток миокарда.

Научно-практическая ценность

1. Представленная работа является фрагментом обширной международюп программы исследований РМС16 и, следовательно, в случае её успешног завершения, данные работы по фармакокинетике и фармакодинамике буду элементом научного планирования дальнейших испытаний [25Mg]PMC16.

2. Обнаруженная и изученная способность наночастиц [25Mg]PMC16 избирательн доставлять катионы 25Mg2+ в миокард и высвобождать их там в ответ н гипоксический ацидоз с последующей гиперактивацией синтеза АТФ по канал субстратного фосфорилирования позволяет применять эти наночастицы ка новый инструмент исследования Mg2+-3asncHMbix ферментативных реакцш энергетического обмена.

Внедрение полученных результатов

Разработана и внедрена новая высокоэффективная методика аффинно хроматографии для выделения и очистки порфирин-связывающих белков биологическ мембран (митохондрии клеток миокарда), основанная на использовании РМС16 в качеств лиганда стационарной фазы.

Получен акт внедрения 25М§2*-переносящих катионообменных наночастиц «Порфиллерен-МС16» на базе ООО «Нановита» (г. Москва) с целью планирования дальнейших испытаний.

Апробация работы

Результаты работы доложены на научных конференциях молодых ученых ИХФ РАН (Москва, 2007, 2008), на научно-практической конференции «Индустрия здоровья-2008» (Крокус-Экспо-2008, Москва, 2008), на 2й Пан-Азиатской конференции по нанобиотехнологиям (Аль-Айн, ОАЭ, 2006); на 31н Конгрессе ФЕБО (РЕВБ-2006, Будапешт, Венгрия); на Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии стран Центральной Азии (Шираз, Иран, 2007); на 4- Европейской конференции по метаболизму лекарств (Охрид, Республика Македония, 2007); на 7- Европейском совещании по наночастицам в медицине и ветеринарии (Солоники, Греция, 2007), на 2м Европейском совещании по нанофармакологии (Лимерик, Ирландия, 2008); на 3-Конференции по наномедицине стран Северной Европы (Копенгаген, Дания, 2008).

Основные положения, выносимые на защиту

1. «Порфиллерен-МС16» (РМС16) представляет собой низкотоксичный водорастворимый катионит с размерами частиц 1,8-2,0 нм, обладающий способностью избирательно и прочно удерживаться миокард-специфичными порфирин-связываюшими белками, что позволяет использование данных наночастиц для адресной доставки в клетки миокарда катионов парамагнитного изотопа 25М62+, обеспечивающих гиперактивацию реакций субстратного фосфорилирования нукдеотидов и, благодаря этому, эффективный синтез АТФ в условиях гипоксии.

2. Частицы РМС16 являются «умными» наноконтейнерами для катионов гsMg2+: находясь в состоянии устойчивого аффинного взаимодействия с порфирин-связывающими белками (рецепторами РМС16) мембран митохондрий миокардиоцитов, наночастицы высвобождают г5Mg2+ только в ответ на метаболический ацидоз, возникающий вследствие тканевой гипоксии миокарда.

3. Рецептором для связывания наночастиц РМС16 служит миокард-специфический гидрофобный а-глобулярный мономерный триптофан-богатый белок с молекулярной массой 17,6 Ша (122 аминокислотных остатка), локализованный в трансмембранном канале внешней мембраны митохондрий миокардиоцитов. Этот

рецептор обеспечивает узнавание порфиринового домена РМС16 с высокой степенью селективной аффинности

4. Особенности метаболизма РМС16 т vivo соответствуют представлениям о высокой степени биологической безопасности этого нанокатионита, порфириновый домен которого служит предшественником в реакциях биосинтеза тема, а фуллереновое ядро которого, являясь нетоксичным, вообще не метаболизируется и выводится с мочой

5. Параметры фармакокинетики и фармакодинамики [25Mg]PMC16 позволяют использовать данный агент для профилактики и коррекции острых экспериментальных митохондриальных дисфункций, вызванных подавлением окислительного фосфорилирования с помощью 1-метилникотинамида.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ: 4 в виде тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах и 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК; из них 2 - в России и 4 - за рубежом.

Личный вклад автора

Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задачи, проведении всех экспериментов, представленных в диссертации и обработке данных Выводы диссертации сформулированы соискателем.

Структура и объём работы

Материалы диссертации изложены на 14В страницах машинописного текста, включая иллюстрации: 6 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 ссылок на работы отечественных (29) и зарубежных (191 ) авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

Все эксперименты были выполнены на самцах крыс линии Wistar Albino Glaxo, масса тела 180-220 г. Все животные прошли период предварительной адаптации к условиям лаборатории в течение одной недели до начала эксперимента. Каждая крыса использовалась только один раз. Животных содержали группами в пластиковых клетках по

10 крыс в каждой, при температуре в помещении 18-20°С и влажности 50-60%. Животные имели свободный доступ к воде и пище. Для минимизации возможных сбоев циркадных ритмов, и исключения хронофармакологических влияний все инъекции проводились в утренние часы. Животные голодали в течение 24 часов перед экспериментом Для получения каждой экспериментальной точки использовали трёх животных, при этом каждое измерение проводили 4-6 раз.

Экспериментальная модель тканевой гипоксии

Использовали следующие экспериментальные модели тканевой гипоксии in vivo:

(1) синдром медикаментозной гипоксии А (1-метилникотинамид (МНА), 10-20 мг/кг в/в один раз в 24 ч.);

(2) синдром медикаментозной гипоксии Б (Доксорубицин (ДКР), 60-80 мг/кг в/в один раз в 24 ч.). Оба варианта гипоксии, А и Б, хорошо известны как модели гипоксии по Р ильке-Бомеру (Rilke & Böhmer, 1994). В обоих случаях выраженный дефицит АТФ в миокарде достигался 8-12 часов спустя однократной инъекции.

Выделение клеточных органелл

Для выделения органелл (ядер, плазматических мембран, митохондрий и их мембран, цитозоля) гомогенат ткани сердечной мышцы фракционировали дифференциальным ультрацентрифугированием при 800 g, 12000 g, 35000 g, 125000 g на ультрацентрифуге Beckman Spinco L5-65B в роторе SW27.1 (Randall et al., 1992). Выделение и очистку фрагментов митохондриальных мембран (SW 27.5, 110000 об/мин, 2 ч.) проводили в ступенчатых градиентах сахарозы 0,8-2,0 M после деструкции органелл в результате осмотического шока и обработки нуклеазой S/РНКазой A (Thallerström et al, 2002). Измерение концентрации белка проводили обычным колориметрическим методом Брэдфорд. При необходимости растворы белков предварительно концентрировали с помощью мембраны Amicon Diaflo У5.0 при 800 psi.

Измерение потребления кислорода сердечной мышцей

В гомогенате сердечной мышцы и в образцах изолированных митохондрий оценивали концентрацию кислорода [О2] и изменение кислотности среды [ДН*] с помощью фосфоресцентного [О^ДН^-анализатора Bio Rad Oxy-Redox Analyser SJ80. Длительность измерений не превышала 60 мин для того, чтобы гарантировать жизнеспособность клеток. Измерения [02] в реаэрироваиных суспензиях служили контролем того, что образец был достаточно стабильным и не зависел от типа клетки. Стехиометричное титрование

кислорода аскорбатом в присутствии аскорбат-оксидазы (2 аскорбат + Oj —» 2 дегидроаскорбат + 2 Н20) осуществляли по методике (Ashbey et al, 2000) Концентрацию ионов Н+ в гомогенатах ткани определяли потенциометрически с использованием Pt/Ar микроэлектрода в хорошо аэрируемой ячейке, сопряженной с кислородным анализатором (Baidock & Carry, 2004).

Определение РМС16 и его метаболитов в биологическом материале

При исследовании лиофилизированных образцов изолированных клеточных органелл, образцов плазмы крови и мочи, или необработанного гомогената ткани сердечной мышцы в качестве универсального экстрагента использовали чистый CSa (8,0-12,0%), экстракцию проводили при 22-25°С и интенсивном перемешивании Экстракты последовательно обрабатывали 7,5-кратным объемом пиридина (3-5 раз), все порции пиридина после экстракции объединяли и концентрировали на роторном испарителе. Аликвоты 15-20 мкл концентрированных РМС16-содержащих экстрактов фракционировали с помощью ВЭЖХ на 20x250 мм колонке с сорбентом CosmoSil 5-РВВ (силикагель, модифицированный пентабромбензольными группами, подходящий для разделения порфиринилированных фуллеренов) при 22°С, 1200-1500 psi, 10 мл/мин с использованием чистого 1,2,4-трихлорбензола в качестве подвижной фазы (Richter & Dillmeck, 1998). Заключительное определение количества РМС16 проводили по площади хроматографических пиков с автоматизированной коррекцией молярных коэффициентов экстинкции по профилю элюирования, записанному при детектировании поглощения на длинах волн 180, 210, 320 и 470 нм на хроматографе Perkin Elmer 266QL (Wóller et al, 2000)

Для идентификации PMC 16 и продуктов его метаболизма регистрировали масс-спектры с применением быстрой атомной бомбардировки (FAB) на приборе Varían GT800 LC-MS и обрабатывали с помощью аналитического модуля HP6100-J2A с использованием базы данных Sigma Delta Chem АХ2000 согласно методике (Ohata et al., 2001)

Изотопный анализ

Оценку содержания стабильных изотопов магния (25Mg, 24Mg, 26Mg) проводили на изотопном масс-спектрометре Olivetti Prism DL600 с возможностью анализа гетерогенных образцов биологического происхождения (Niemer et al., 1999) Для насыщения PMC 16 катионами магния 23Mg2+ была применена методика (Sarkar et al, 2004, 2007). При изучении внутриклеточного распределения [59Fe]PMC16 и скорости синтеза у-[32Р]АТФ

количественные измерения радиоактивности 59Fe (у-излучатель) и 32Р(Р-излучатель) проводили в диоксане с использованием сцинтилляционных жидкостей LKB с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков LKB SK260 и Wallac 410В соответственно. Для 59Ре-авторадиографии изолированных органелл использовали пленки Fuji RX40 с последующей микроденситометрией негатива, совмещённой с просвечивающим электронным микроскопом Farrand XL30 (Leder & Wiesta£ek, 2000).

Определение биохимических параметров энергетического метаболизма в миокарде

Суммарную скорость синтеза АТФ в гомогенате ткани и в изолированных митохондриях определяли по включению [32Р]ортофосфата в АТФ за 1 мин, отнесённому на 1 мг общего белка (Jatsenti & Slater, 1990).

Величины индекса АТФ/АДФ определяли в изолированных митохондриях по методике (Kuznetsov et al, 1986). Для этого сразу же после выделения митохондрий их обрабатывали Triton Х-100 (2,0%, об.%, 4°С, 2 ч., 10 мМ трис-HCl pH 7,45) с последующей экстракцией всей совокупности низкомолекулярных соединений 10-кратным объёмом ацетона, охлажденного до 0°С. Полученный ацетон-растворимый экстракт фракционировали с помощью ВЭЖХ (неподвижная фаза ODS-S5CN, подвижная фаза 10% водный метанол с линейным градиентом пиридина 10-60%, колонка Altex 1800 15><280 мм, 22°С, 2000 psi, УФ-детектор Gilson W100) для того чтобы затем планиграфически определить количество АТФ и соотношение АТФ/АДФ.

Активность креатинкиназы (КК) измеряли по методу (Lackermann et al, 1989) в модификации (Kuznetsov et al, 2004).

Количественное определение железосодержащих белков в крови u тканях

Радиоиммунодетекцию белков проводили в образцах тканевых экстрактов и плазмы крови по методу (Sherman & Pitzel, 1996) с использованием готовых наборов реагентов для быстрой двойной иммунопреципитации, включающих моноклональные [1311]-антитела к миоглобину, трансферрину, ферритину и гемоглобину крыс (Sigma-Aldrich, R600-7A Kit).

Препаративное фракционирование и выделение эритроцитов и лимфоцитов проводили на мини-колонке с фиколлом (Brinney et al., 1992).

Возможную сорбцию исследуемого вещества белками плазмы крови изучали с использованием [59Fe]PMC16 согласно методике (Donovan & Mlieczinski, 1998).

Все полученные результаты обрабатывали статистически с использованием классической двухкомпартментной модели распределения вещества (Turchin & Bradshavv, 1996)

Оценка морфологии изучаемых структур

Для измерения размеров частиц РМС16 и прямого мониторинга pH-зависимого образования нанокластеров РМС16 двумерные массивы и конгломераты изучали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) на атомно-силовом микроскопе ERA МЗ (ООО «Эра», Зеленоград, Россия) Помимо АСМ, размер нанокластеров РМС16 оценивали методом гель-фильтрации на Сефадексах G10, G15 и G50 в диапазоне pH элюента 5,0-9,5 (Amirshahi et al, 2006). Одновременно в том же диапазоне pH изучали кинетику высвобождения Mg2+ наночастицами РМС16 путем определения соотношения Mg/Fe с использованием стандартной методики атомно-абсорбционной спектрофотометрии с пламенной атомизацией (DX800-B6 Carl Zeiss AAS, Carl Zeiss Jena). Спектры MPH (малоуглового рассеивания нейтронов) мономеров и димеров РМС16 регистрировали и анализировали с помощью ускорителя SANS 2TD в Международном Институте Ядерных Исследований, Дубна, Россия при технической поддержке в.н.с. М.Н. Осмолова.

Для морфологического исследования частиц РМС16 внутри мембран клеточных органелл использовали метод «проявления» железосодержащих частиц с помощью АСМ с железохелатирующим зондом (a metal-chelating iron response AFM toolbox) наряду с классической визуализацией биологических объектов с помощью АСМ (Erlanger & Weber, 1999).

In situ-морфологию митохондрий в миокардиоцитах и самих клеток наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с использованием платинового контрастирующего покрытия (Button et al, 2002). Дополнительно использовали лазерную контрастную конфокальную микроскопию, исследования проводили с помощью микроскопа Nanofmder-SlôE по методике, описанной в руководстве производителя (NanoFmd Co., Минск, Белоруссия).

Изучение РМС16-узнак>щего рецептора миокарда крыс

Для выделения и очистки рецептора был использован новый аффинно-хроматографический сорбент, содержащий РМС16 в качестве лиганда стационарной фазы (Амиршахи и соавт., 2008). Этот лиганд был иммобилизован на ОН-группах агарозы

(Sepharose CL-4B, Bio-Rad) через циклогексильный остаток обычным методом эпокси-активации, используя диглицериновый эфир 1,4-бутандиола (биоксиран) в качестве источника эпоксидных групп (pH 9,0,25 ч., 22°С).

Для установления молекулярной структуры свободного лиганда и его комплекса с предварительно эпокси-активированной агарозой, образованного через циклогексильные остатки, была применена обычная методика ГХ-МС с использованием бомбардировки быстрыми атомами (FAB) с помощью прибора Varían МХ707 FAB Analytical Unit (Амиршахи и соавт., 2008). Измерение силы аффинного взаимодействия (Kj) лиганда с белком проводили согласно методике Purse-Rebek (Purse & Rebek, 2005).

Митохондрии были изолированы из миокарда крыс и затем фракция внешних мембран была очищена (Wieng et al, 1999). Мембраны, согласно обычной методике, были растворены в Triton Х-100 (2,0 об.%), совокупная фракция мембранных белков была осаждена охлажденным ацетоном (0°С, 10-кратный объем), и, затем, собранный осадок был хорошо промыт ацетоном на стекловолоконном фильтре (4°С). Осадок был растворен в 10 мМ Трис-HCl (pH 8,20)/1,0 мМ ЭДТА/5,0 мМ MgClj/1,5 мМ KCl и, затем, обработан фосфолипазой А2 (Sigma, 120-140 Ед/мг белка), нуклеазой S (Serva, 80-100 Ед/мг белка) и РНКазой A (Bio Rad, 10 мкг/мг белка), 37°С, 1 ч. Обработанная таким образом смесь была обычным образом фракционирована в растворах сульфата аммония с линейно увеличивающейся концентрацией от 40% до 70% (от концентрации насыщенного раствора) Полученный в результате осадок был растворен в 2,5 мМ фосфате калия (pH 7,80) и подвергнут диализу относительно раствора А в течение ночи (4"С). Полученные образцы были лиофилизированы и, в дальнейшем, перед введением в колонку были растворены в буферном растворе (раствор А).

РМС16-несущая аффинная гелевая матрица была упакована в колонку с размерами 1,7 х 52,0 см и уравновешена с раствором А (10 мМ калий-фосфатный буферный раствор (pH 8,40) / 15 мМ ЭДТА) при комнатной температуре. В колонку вводили приблизительно 100-120 мг белка, растворенного в 3,0-4,0 мл раствора А. Для определения концентрации белка использовали обычный колориметрический метод Брэдфорд. Сразу же после ввода образца колонку промывали раствором А для удаления несвязывающихся компонентов (60 мл, 0,5 мл/мин, 4°С). Далее проводили градиентное элюирование (140 мл, 0,5 мл/мин, 4°С) с использованием синхронных линейных градиентов pH (убывающий, с 8,40 до 5,30) и ионной силы (возрастающий, с 0,1 до 0,9). Для формирования градиента в потоке с

помощью смесителя LK.B D60-2A Automated Gradient Former смешивали два раствора раствор В (10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 8,40)/15 мМ ЭДТА/2,5 мМ NaCl) и раствор С (18 мМ калий-фосфатный буфер (pH 5,30)/15 мМ ЭДТА/7,0 мМ NaCl) В результате выделяли фракцию с высокой избирательной аффинностью к РМС16 (Амиршахи и соавт., 2008, Amirshahi et al, 2008). Для того, чтобы охарактеризовать гетерогенность выделенных белковых фракций, использовали блочный гель-электрофорез в 0,25% ДЦС-10% ПААГ (Laemmli et al, 1976).

Для определения аминокислотного состава и первичной структуры рецептора (RcPMClö) использовали автоматизированное секвенирование белка по Эдману-Миллю в модификации (Gupta & Salazar, 2001).

Для получения общих сведений о вторичной и третичной структурах RcPMC16 в водной среде использовали стандартные методики спектроскопии кругового дихроизма, КД (Marlow & Scott, 1998) и ЭПР-спектроскопии (Yoshida, et al, 1996)

Особенности внутримембранной топологии рецептора изучали с помощью сканирующей КД-спектро метрик поверхностей изолированных митохондрий и фрагментов их мембран (Rumminighe et al., 1998), а также используя FRET-спектрометршо (спектры флуоресцент-резонансного переноса энергии) этих поверхностей (Baldwin & Kerr, 2004)

Статистическая обработка данных

Непараметрическую статистическую обработку (для "п" меньше или равно 6) с целью оценки различий эксперимента и контроля проводили обычным способом с использованием программного обеспечения Sigma Biostat А6. Применение метода аппроксимации Пенманна-Далбрё показало, что для любой пары среднеквадратическое отклонение среднего (standard error of the mean, SEM) не превышало 6,5% среднего значения (диапазон значений 0,020М - 0,065М).

Для построения и обработки графиков использовали программные модули HP LabRun-06 и HP6100-J2A (Helenwerk et al., 2001) Данные о фармакокинетическом распределении РМС16 обрабатывали с использованием классической двухкамерной модели по алгоритму Calphar-JX08 в аналитическом модуле HP600-2AS (Pratt et al, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение катионитных свойств наночастиц РМС16 in vitro

Поскольку неизбежным следствием любой тканевой гипоксии является ацидоз, важно было убедиться в наличии у Mg-переносящих наночастиц катионообменных (т.е. катионитных) свойств. Из наших данных, полученных в экспериментах ка водных растворах РМС16 с

1Ь 14 12 10 -

2 0

14,8 нм

'.о вл 5 ■

й ^ 45 rfü PI

1 ° и °

Я S

оН

10

помощью гель-фильтрации на Сефадексе G25 и мониторинга атомно-силовой микроскопией (АСМ). видно, что ацидоз стимулирует высвобождение магния из наночастиц, размер которых составляет 1,8 нм (мономер).

Увеличение рН, напротив, ведёт к «запиранию» катионов в частицах и к образованию нанокластеров, состоящих из 4~-8—и более мономеров (Рис 1).

Аналогичные данные получены нами и при изучении наночастиц, удерживаемых на нитроцеллюлозных мембранах и в искусственных белок-липидных плёнках, с помощью лазерной конфокальной и

Рисунок 1 — Катионитные свойства и образование нанокластеров РМС16 в зависимости от рН

атомно-силовои микроскопии и спектроскопии малоуглового рассеяния нейтронов (Рис. 2). Полученные данные позволяют ожидать ацидоз-индуцированное высвобождение ионов 25Mg2T ш vivo и, как следствие, проявление гиперактивации синтеза АТФ в клетках, страдающих от гипоксии.

1.Q 0.25

0.20

0.(14 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.Т8

« I

Q.A"1

Рисунок 2 — Данные малоуглового рассеяния нейтронов на мономерах/'димерах РМС16, рН 6,50 (шкала 1,0 нм)

Проверке этой гипотезы были посвящены дальнейшие исследования.

Изучение фармакокинетнки [мМ£]РМС16

Данные, представленные в Таблице 1, обобщают основные особенности системного клиренса (верхний сегмент Таблицы), выведения из тканей и печёночного метаболизма изучаемых наночастиц. Обращает на себя внимание факт ткане-специфического накопления вещества в миокарде, что, при его весьма невысокой острой токсичности (ОЬ50 = 896 мг/кг для крыс, в/в, Загкаг е( а1, 2007), делает привлекательным для использования в схемах адресной

доставки 25М82+. Этот факт также подтверждён данными о распределении наночастиц в тканях после однократного в/в введения. Так, вещество полностью выводится из лёгких, скелетных мышц, почек и печени в течение 18-20 часов, в то время как его концентрация только дости-

миокардиоцитов при нулевой концентрации в остальных органеллах этих клеток (Рис. 3). Атомно-силовая микроскопия позволила визуализировать наночастицы

гает максимума к 24— часу в митохондриях

Таблица 1 — Фармакокинетика [М%]РМС16 у крыс

Т1/2 = 9,0ч Ттох = 2,5 Ч С| = 32 ± 4 мл/мин/кг к - 0,685 С0 = 62 мкг/мл Спач = 260±83 нг/мл

УР = 16,2 мл/кг Ус = 12,4 мл VI = 0,08 мл

Почечная экскреция: 28 ± 4,3%

Печеночная экскреция: (метаболизм) 16 ±4,0%

Связывание с белками плазмы: 1,2 ±0,3%

ВКЛЮЧЕНИЕ КЛЕТКАМИ КРОВИ

Лимфоциты: 28,6 ± 5,5%

Эритроциты: 8,0 ±3,2%

ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОЕ НАКОПЛЕНИЕ

Миокард. 18,4 ±3,40%

Мозг: 0,6 ±0,02%

ВЫВЕДЕНИЕ МЕТАБОЛИТОВ РМС16

С МОЧОЙ (258±4,0 мкг/мл)

Деаланилированные производные: 56,4 ±8,7%

Деацетилированные производные: 27,0 ±6,1%

Циклогексил-Сбо: 16,2 ±3,3%

Содержание РМС16 в моче: 462 ± 11 мкг/мл

Содержание С60 в моче: 2,9 ± ОД мкг/мл

РМС16 и их кластеры в липидном слое мембран митохондрий миокарда крыс 12 часов спустя однократного внутривенного введения.

Таким образом, можно предположить присутствие в митохондриях клеток миокарда тканеспецифического рецептора, связывающего РМС16 in vivo. Исключительно

низкии уровень

связывания вещества с белками плазмы крови соответствует ряду опубликованных другими авторами данных о фармакокинетике фуллеренов и тетра-пирролов (Buchanan & Cuozzo, 1999;

Dragovic et al., 2002; Versavian & Mlody, 2005).

При этом в суточной моче обнаруживаются метаболиты трёх групп, надёжно идентифицированные и оцененные количественно с помощью ГХ-электрон-рассеивающей тан-демной масс-спектро-метрии в её FAB-версии (см. «Методы»,

МИОКАРД

/ * I

. I, " < '.W . _ 1

7 V

МИТОХОНДРИИ

ЦИТОПЛАЗМА

ПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ

МЕМБРАНЫ

ЯДРА

Время, ч

Рисунок 3 — Распределение [59Ре]РМС16 в органеллах клеток сердечной мышцы крысы после однократной в/в инъекции (30 мг/кг, 470-520 Кюри/кг)

Время, ч

Рисунок 4 — Распределение '9Ре между пулом молекул гема и ферропротеинов крыс после введения [59Ре]РМС16 (20 мг/кг, 380-420 Кюри/кг [59Ре]РМС16, однократная в/в инъекция)

Табл. 1). Анализируя эти данные, можно заметить, что

печёночный метаболизм PMC 16, очевидно, не затрагивает гидрофобного фуллеренового ядра, ограничиваясь неглубокой биотрансформацией порфиринового домена (Таблица 1). Это также подтверждается нашими данными о судьбе радиоактивного железа 59Fe, «перетекающего» из частиц РМС16 во фракции ферропротеинов после однократной инъекции меченого вещества. Видно, что метаболизм РМС16 включает биотрансформацию порфиринового домена как возможного предшественника гема (Рис. 4). Сам по себе этот факт согласуется с представлениями о порфирин-содержащих продуктах как о безопасных в биологическом отношении агентах вследствие их быстрого вовлечения в обычный порфириновый анаболизм (Dupret-Ledoc et al., 2000; Neurath, 2006).

Изучение биохимических параметров фа р м а ко д и и а м и к и [25Mg]PMC16

В комбинированных экспериментах in vivo и in vitro биохимические показатели измеряли в «дышащих» изолированных митохондриях миокарда крыс, получивших инъекции МНА в дозе, достаточной для полного подавления окислительного фосфорилирования, и затем, 6-8 часов спустя, инъекцию [Mg]PMC16 в дозе 0,25 DL50-В отдельных сериях экспериментов использовали разные изотопы магния.

Из данных, обобщенных на Рисунке 5, хорошо виден синергизм магний-зависимых процессов внутри митохондрий. МНА-индуци-рованная гипоксия ведёт к ацидозу, выражающемуся в нарастании избытка свободных протонов. Это, в свою очередь, стимулирует высвобождение ионов магния катионитными наночастицами РМС16 в

протонов

Рисунок 5 — Синергизм активности креатинкиназы (КК) в митохондриальном матриксе, притока катионов магния из РМС16 и величины избытка свободных протонов

мембранах митохондрий. В результате растет активность магний-зависимой креатинкиназы (КК), синтезирующей АТФ из креатинфосфата и АДФ без участия кислорода.

Сходный эффект был достигнут и в экспериментах с Доксорубициновой моделью гипоксии миокарда. Так, введение наночастиц PMC 16, несущих различные (магнитный 25Mg2" и немагнитные, 24Mg2+ и 26Mg2+) изотопы магния способно восстановить пониженный Доксорубипином уровень синтеза АТФ в миокарде. Примечательно, насколько сильнее активирующее воздействие 25Mg2~ по сравнению с немагнитным изотопом 24Mg2r. Это - магнитный изотопный эффект в действии (Рис. 6).

Такие же закономерности выявлены при поиске корреляций между выходом АТ'Ф. магниевым «выбросом» и потреблением кислорода в аналогичных изолированных митохондриях. Суммарное образование АТФ, сниженное на фоне падения потребления кислорода вследствие

действия МНА, повышается синхронно с з'величением магниевого выброса «умными» наночастицами РМС16. При этом, стимулирующий синтез АТФ эффект значительно выше для магнитного изотопа 25Mg (Рис. 7).

Подчеркнём, что у нас есть основания называть наночастицы РМС16 «умными», поскольку они высвобождают магний только в ответ на ацидоз, чем, в частности, и определяется их ценность как средства борьбы с тканевой гипоксией, приводящей к этому ацидозу. Установлено также, что 12 часов спустя однократного внутривенного введения [25Mg]PMC16, 30 мг/кг, в миокарде создавался запас 25Mg2+, достаточный

100 -90 -j

so ' 70 60 50 40 -30 20 10 i 0

— [:5Mg2"]PMC16 ■ - [MMg2"]PMC16

[МЛ

кг тсяя

Рисунок 6 — Влияние направленной доставки Mg посредством РМС16 на предварительно подавленный Доксорубицином синтез АТФ в миокарде крысы (0,8 DL50 ДКР в/в, 6 ч РМС16, в/в, 6 ч)

для значительного превентивного ослабления гипоксической дисплазии митохондрий, вызываемой МНА.

г.ыс&очождение

потребление О-

высвооожление

Рисунок 7 — Синергизм выхода АТФ, потребления кислорода и высвобождения РМС16 в сердечной мышце крысы (30 мг/кг РМС16, в/в, экспозиция 12 ч). А - Эксперименты с изотопами магния с нулевым спином 26М^); Б - Эксперименты с магнитным изотопом магния (25М§)

Данные электронно-микроскопических исследований говорят о способности вещества серьёзно ослаблять степень деструкции митохондрий даже при однократном введении [25М^]РМС16 (Рис. 8).

А Б В Г

Рисунок 8 — Микрофотографии перинуклеарной области миокардиоцитов крысы, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа А, В - эффект предотвращения гипоксии РМС16

(30 мг/кг [25Ме]РМС16, в/в -> 12 ч -» 20 мг/кг МНА, в/в -» 12 ч — тест); Б - МНА-модель гипоксии (20 мг/кг МНА —♦ 12 ч —> тест); Г - Контроль (ткань здоровой интактной крысы)

А Л

.-'''в i .-'* S4'

<

Ve, мл

Рисунок 9 — Аффинная хроматография митохондриалъных мембранных белков из миокарда крысы на Сефарозе CL-4B, модифицированной PMCI6. Выделение/очистка R<;PMC!6 (заштрихованный пик)

Достичь подобного, глубокого и быстрого, эффекта при аналогичном использовании наночастиц, «загруженных» немагнитными изотопами 2,Mg и 26Mg не удалось.

Таким образом, вызываемая магнитным изотопным эффектом магния-25 гиперактивация синтеза АТФ в страдающем от тканевой гипоксии миокарде способна предотвратить развитие патоморфологических деструктивных изменений в случае адресной доставки в миокардиоциты ионов 25Mg2+, осуществляемой нанокатионитными частицами РМС16.

Выделение и изучение РМС16-связывающего рецептора миокарда крыс

Поскольку известно, что мембраны митохондрий миокарда содержат тканеспецифические порфирин-связывающие белки (Рйо1 & НегэЬа^', 1998; а!., 2006), мы предположили, что Р.СРМС16, вероятно, относится к этой группе компонентов мембран. Поэтому в качестве источника КсРМС16 мы использовали суммарный препарат белков внешней мембраны митохондрий миокарда интактных крыс.

(RcPMC16)

Для одновременного выделения-очистки RcPMC16 нами предложена оригинальная методика аффинной колоночной хроматографии на сорбенте из агарозы, в структуре которого РМС16 использован в качестве лиганда (см. «Методы»)

Как ясно видно из Рис. 9, несвязывающаяся фракция (Ve = 20-120 мл), так же, как и низкоаффинная фракция (Ve = 120-160 мл), адсорбирующиеся неспецифически (Табл 2), были хорошо отделены от высокоаффинной фракции (Ve= 162-178 мл), представленной порфирин-связывающими белками, т.е. молекулами рецептора, RcPMClô.

Согласно данным электрофоретического анализа в полиакриламидном геле, рецептор (Рис. 9) представляет собой мономерный белок с молекулярной массой около 17 kDa. Белковые или пептидные примеси обнаружены не были Примечательно, что значение молекулярной массы само по себе служит доказательством отсутствия связи этого белка с пероксидазами и цитохромами (Wittieg, 2005; Rallenbrough étal, 2007).

Таблица 2 — Аффинность фракций, полученных при хроматографии мембранных белков митохондрий миокарда крысы на колонке Sepharose CL-4B - РМС16

Параметры элкжрования % Специфического связывания, х 100 мкМ (M ± SEM, и = 6) К,, мкМ (M ± SEM, п-6)

I, M Ve, мл

0,10-0,30 40-60 4,47 ±0,77 3,18 ±0,87

0,38-0,47 140-160 11,40 ±0,98 58,62 ±3,91

0,50-0,58 160-180 24,75 ±2,96 216,09 ±11,64

Проведенное нами секвенирование очищенного рецептора дает надежную информацию не только о его точной молекулярной массе (17,6 ГОа), но и о высоком содержании гидрофобных аминокислот, что является обычным для белков, локализованных внутри мембраны (МоПпа-Мепёег е/ а/., 2004). Найдено, что первичная структура RcPMC16 содержит 122 аминокислотных остатка (от ДО- к С-концу):

ATVILLMPWILWDTWFPHGDNHSCEHKREMSDHNKPNHKPDNHKRRNDA MTDNHRGPNTDHRPVLLVINHKVLPKRCNMDGGHNKPHDNSKRDPGDKRHRRHN KGMPWVFLAWDEFFVILPI

Спектры кругового дихроизма RcPMClô говорят об а-глобулярной природе RcPMClô, содержащего незначительное количество элементов р-складок. Спектры FRET (флуоресцент-резонансный транспорт энергии), ЭПР и КД (кругового дихроизма), измеренные для свободного RcPMC16 и для фрагментов мито-хондриальных мембран свидетельствуют в пользу внутримембранной (траьс-мембранной) локализации рецептора, предположительно, в непосредственной близости от трансмембранных каналов (пор)

Особый интерес представляют данные о функциональных особенностях рецептора, полученные в отдельной серии экспериментов m vitro. Так, семейство изотерм аффинности наночастиц к рецептору, отражающих кинетику реассоциа-ции комплексов «гость-хозяин», ясно указывает на высокую степень стехиомет-рического узнавания и прочность взаимодействия в паре PMC16-RcPMC16 (Рис. 10).

В то же время, как это видно из данных Таблицы 3, взаимодействие рецептора с изучаемыми наночастицами является высокоизбирательным. Уровень селективности этого взаимодействия, демонстрируемый РМС16, сопоставим с таковым для порфирина-К и сильно отличается от величин, получаемых при тестировании

Время, с

Рисунок 10 — Кинетика реассоциации комплексов "гость-хозяин" для пары РМС1б-РсРМС16. N(0 -доля молекул порфирин-связывающего белка (Р<;РМС1б), которые не успели связаться с молекулами "гостя" (РМС16) к моменту времени / после УФ-облучения, в системе глицерин-вода

лигандов непорфириновой природы. Это обстоятельство, вероятно связанное с принадлежностью рецептора к пулу миокард-специфичных мембранных порфирин-связывающих белков, можно считать молекулярно-биологическим объяснением устойчивого (длительного) удерживания РМС16 в миокарде, выявленного в данной работе. Именно это делает возможным избирательное проникновение наночастиц данного типа в миокард, что может служить одним из аргументов в пользу перспективности их дальнейшего фармакологического изучения

Таблица 3 — Аффинность различных лигандов к ЕсРМС16

ЛИГАНД СОКРИСТАЛЛИЗА-ЦИОННЫЙ ДОКИНГ, константа скорости второго порядка ¿(М^с1) СВЯЗЫВАНИЕ «ГОСТЬ-ХОЗЯИН» В ВОДНОЙ ФАЗЕ

% Специфического связывания (хЮОмкМ) К„ мкМ К,МЛ

Порфирин К 3867 ±78 38,7 ±4,2 348 ±17,0 33020 ± 619

Гем 3101± 66 34,0 ±3,9 319± 16,3 28930 ± 680

Ъ^РМС16 2488 ± 62 27,9 ±2,8 247 ±12,6 24863 ±721

М§АТФ 217± 18 6,3 ± 0,8 37 ±3,9 2333 ± 266

МяАДФ 269 ±22 4,4 ± 0,9 42 ±4,0 2806 ±217

Рибофлавин 172 ± 18 6,0 ±2,4 39 ±3,8 1907 ±93

ТГФК 98 ± 7 3,2 ±0,6 22 ±2,6 1201 ±83

Данная работа субсидировалась из средств грантов РФФИ, ШТА8, и из фонда нанотехнологий РАН за 2005-2007гг. Исследования по изучению рецептора проводились за счет средств фонда наноматериалов Шанхайской Организации Сотрудничества.

выводы

1 PMC 16 является низкотоксичной мембранотропной катионообменной наночастицей, пригодной для направленной доставки в миокард ионов 25 Mg2*, вызывающих гиперактивацию синтеза АТФ в условиях МНА-индуцированной тканевой гипоксии.

2. Фармакокинетика [25Mg]PMC16 указывает на наличие в миокарде тканеспецифических рецепторов, связывающих и удерживающих наночастицы in vivo.

3. Метаболическая биотрансформация РМС16 включает вовлечение порфиринового домена в реакции синтеза гема, фуллереновое ядро не метаболизируется

4 Парамагнитные ионы *5Mg2+ высвобождаются в митохондриях миокардиоцитов из состава мембраносвязанных наночастиц РМС16 только в ответ на ацидоз, вызываемый тканевой гипоксией (МНА, ДКР), что приводит к быстрой компенсации дефицита АТФ и предотвращает развитие патоморфологических дефектов (дисплазия и фрагментация митохондрий) на клеточном уровне

5. Разработана оригинальная методика аффинной хроматографии, основанная на использовании наночастиц РМС16 в качестве лиганда стационарной фазы, позволившая выделить и очистить мембранный рецептор РМС16 (RcPMCló) из митохондрий миокарда крыс.

6. Изучены основные физико-химические свойства, а также особенности структуры, внутриклеточной локализации и функционирования in vitro рецептора RcPMCló из мембран митохондрий клеток миокарда крыс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Porphylleren-MC16: a new family of the fullerene-based medicinal nanoparticles for the heart local hypoxia cases // Abstracts, 2nd Pan-Asian Meeting on Nanobiotechnology - Al-Ain, U.A.E., 2006. - R17-R18 (co-authors Alyautdin R.N., Sarkar S., Rezayat S.M., Orlova MA., Buchachenko A.L., Kuznetsov D A.).

2. Magnesium-25 related overactivation of the ATP synthesis in 1-methylnicotinamide affected myocardiocytes. The cation nanocarrier application // Abstracts, 31- Congress of the Federation of European Biochemical Societies.

- Budapest, Hungary, 2006. - S109 (co-authors Kuznetsov D.A., Buchachenko A L., Alyautdin R.N., Orlova M.A.).

3. PMC16 nanoparticles to treat and prevent the chemical-induced ATP depletion in myocardium // Abstracts, 9~ Central Asia Congress on Biochemistry and Molecular Biology. - Shiraz, Iran, 2007. - B48 (co-authors Alyautdin R.N., Rezayat S.M., Sarkar S., Orlova M.A., Buchachenko A.L., Kuznetsov D.A.).

4. The fullerene-interfaced porphyrin ligand in affinity chromatography of membrane proteins // Journal of Chromatography. - 2008. - V. 68. - P. 708-712 (co-authors Alyautdin R N., Rezayat S M., Sarkar S., Orlova M.A., Orlov A P., Poloznikov A.A., Kuznetsov D.A.).

5. Magnesium-carrying porphyrinated fullerenes. Using the 23Mg2* effect for the treatment of hypoxia-induced mitochondrial dysfunction in rat myocardium // Archives of Medical Research. - 2008. - V. 39. - P. 549-556 (co-authors Alyautdin R.N., Sarkar S., Rezayat S.M., Orlova M.A., Trushkov I.V., Buchachenko A.L., Kuznetsov D.A.).

6. New porphyrin adduct of fullerene-Qo" a promising nano-tool for medicinal use in the heart muscle hypoxia cases // International Journal of NanoScience. -2008. -V. 8. - P. 947-956 (co-authors Alyautdin R.N., Sarkar S., Rezayat S M., Orlova M.A., Trushkov I.V., Buchachenko A L., Kuznetsov D.A.).

7. The porphyrin-fullerene nanoparticles to promote the ATP overproduction in myocardium. 25Mg2+-Magnetic isotope effect // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2008. - V. 36. - P. 833-844 (co-authors Rezayat S.M, Boushehri S.V.S, Samanian В., Omidvari A.O., Tarighat S., Esmaeli S., Sarkar S., Alyautdin R.N., Oilova M.A., Trushkov I.V., Liu P.K., Buchachenko A.L., Kuznetsov D.A.).

8. Фуллерен-С60 в основе лиганда стационарной фазы для аффинной хроматографии мембранных порфирин-связывающих белков // Журнал физической химии. 2008. - Т. 82. - № 9. - С. 1-7 (соавт. Аляутдин Р.Н., Орлов А.П., Полозников А.А., Кузнецов Д.А.).

9. Порфирин-фуллереновые наночастицы для лечения гипоксических нарушений метаболизма в миокарде // Российские нанотехнологии. - 2008.

- Т. 3. - № 9/10. - С. 967-975 (соавт. Аляутдин Р.Н., Саркар С., Резаят С.М., Орлова М.А., Трушков И.П., Бучаченко А.Л., Кузнецов Д.А.).

10. Porphyrin-fullerenes. A novel trend in medicinal chemistry and nanopharmacology // Abstracts, 3!i North Europe's Meeting on Nanotechnology in Medicine. - Copenhagen, Denmark, 2008. - J63 (co-authors Alyautdin R.N., Orlova M.A., Buchachenko A L., Kuznetsov D.A ).

АМИРШАХИ НИМА

ИОРФИРИН-ФУЛЛЕРЕНОВЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ([25Mg2+])4PMC16 В КОРРЕКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДИСФУНКЦИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ МИОКАРДА КРЫС 1-МЕТИЛНИКОТИНАМИДОМ

14.00.25 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано в печать 11.11.2008 Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ №1154

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 www.autoreferat.ru