Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Кардиопротективная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при экспериментальной ишемии/реперфузии миокарда

На правах рукописи

ЩЕТИНИН ПЕТР ПАВЛОВИЧ

КАРДИОПРОТЕКТИВИАЯ АКТИВНОСТЬ 4-МЕТИЛ-2,6-ДИИЗОБОРНИЛФЕНОЛА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ МИОКАРДА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

С !

Ыд 2015

005558738

Томск-2014

005558738

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Н.Д. Гольдберга»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Плотникова Татьяна Макаровна

Научный консультант:

доктор медицинских наук Чернышева Галина Анатольевна

Официальные оппонепты:

Ласукова Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Томский государственный педагогический университет», кафедра медико-биологических дисциплин, профессор

Новожеева Татьяна Петровна, доктор биологических наук. Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория клинической психонейроиммунологии и нейробиологин, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт кардиологии»

Защита состоится «cZ&> 2015 г. в /■/ ^часов на заседании диссертационного совета

Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Н.Д. Гольдберга» (634028, Томск, пр. Ленина, 3; адрес сайта: http://\v\vw.pliarmso.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Н.Д. Гольдберга»

Автореферат разослан « !Gt> января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы • исследования. Совершенствование эффективности фармакотерапии Сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе наиболее распространенных и опасных - ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда, сегодня имеет особое значение для глобальной системы здравоохранения [Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2009; Бойцов С.А. и др., 2010]. Это обусловлено распространенностью данных патологий и высокой степенью инвалидизации и летальности больных ИБС и инфарктом миокарда. Так, в ряду всех известных случаев летальных исходов в мире, по последним данным, не менее 30% связывают с сердечнососудистыми заболеваниями, из них более половины приходится на долю ИБС [World Health Statistics,-2011; GoA.S. et al., 2013; Kolesnikova I.E. et al., 2013; Tsverava M.D., 2013]. В Российской Федерации отмечается один из наиболее высоких в Европе показателей распространенности ИБС. По официальным данным от этого заболевания страдает не менее 10 млн. человек, находящихся в трудоспособном возрасте [Бойцов С.А. и др., 2010; Крюков.Н.Н. и др., 2010]. В связи с этим проблема фармакотерапии ИБС является одним из приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в Российской Федерации.

Несмотря на заметный прогресс в лекарственной терапии ИБС, весьма актуальной остается проблема разработки новых лекарственных средств, способных эффективно защищать кардиомиоциты от ишемического повреждения, а также позитивно влиять на течение самого заболевания и улучшать качество жизни пациентов [Рылова Н.В., 2012; Глезер М.Г. и др., 2013].

На сегодняшний день основой лечения ИБС являются классические антиангинальные средства - органические нитраты, блокаторы кальциевых каналов и Р-адреноблокаторы, статины, действие которых, в основном, направлено на изменение условий гемодинамики [Бубнова М.Г. и др., 2010; Werdan К. et al., 2012; Глезер М.Г. и др., 2013].

Вместе с тем, за последние годы во всем мире проведено большое количество экспериментальных и клинических исследований, доказавших эффективность фармакологической защиты миокарда при синдроме ишемии-реперфузии с помощью средств, обладающих кардиопротективной активностью [Пархоменко А.Н., 2006; Jintao W., 2012; Житникова JI.M., 2012]. В этом русле находится концепция метаболического подхода к терапии ИБС, согласно которой внедрены и имеют доказанную клиническую эффективность ряд лекарственных средств, способных повышать устойчивость сердечной мышцы к недостаточному кровоснабжению. К ним относятся препараты с поливалентным действием - триметазидин, ранолазин, мельдоний, сукцинатобразующие средства — мексикор, натрия оксибутират, а также естественные компоненты дыхательной цепи - убихинон, цитохром С и искусственные редокс-системы - олифен [Пархоменко А.И. и др., 2002; Пархоменко А.Н., 2006].

Весьма перспективной группой для разработки новых лекарственных средств, обладающих кардиопротективной активностью, являются пространственно затрудненные фенолы на основе терпенофенолов. Синтез оригинальных соединений данной группы осуществлен в Институте химии Коми НЦ УрО РАН [Чукичева И.Ю., Кучин А.В., 2004; Чукичева И.Ю. и др., 2007; Буравлев Е.В. и др., 2008]. Соединения этого ряда обладают выраженной антиоксидантной и антигипоксической активностью [Жданкина А.А. и др., 2009; Жданкина А.А. и др., 2010; Плотников М.Б. и др., 2010].

Установлено наличие гемореологического, антиагрегантного и антитромбогенного эффектов у представителя терпенофенолов - 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на моделях транзиторной ишемии головного мозга и дегенеративных изменений сетчатки глаза [Максимов И.Б., 2001; Жданкина A.A. и др., 2009; Плотников М.Б. и др., 2010]. Указанные эффекты являются основанием для исследования кардиопротективных свойств 4-метил-2,6-диизоборнилфенола с целью разработки нового лекарственного средства при острой ишемии/реперфузии миокарда.

Полного аналога лекарственного средства, разрабатываемого на основе 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, в России и за рубежом нет. Ближайшим аналогом можно считать триметазидин, обладающий противоишемической и цитопротекторной активностью, но в спектре действия препарата отсутствуют эндотелийпротективный и гемореологический эффекты. Это явилось основанием для разработки лекарственного средства на основе 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, обладающего новым механизмом кардиопротективного действия при острой ишемии/реперфузии миокарда.

Степень разработанности. Среди препаратов, обладающих кардиопротективной активностью, лидирующие позиции занимают лекарственные средства, повышающие устойчивость миокарда к гипоксии посредством влияния на процессы метаболизма в сердце - триметазидин, ранолазин, мельдоний и другие. Вместе с тем, доказана важная роль нарушений функции эндотелия и реологических свойств крови при ишемии миокарда. Однако лекарственные средства, оказывающие целенаправленное действие на данные звенья патогенеза ишемии/реперфузии миокарда, отсутствуют.

Цель исследования. Изучить механизмы кардиопротективного действия 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях модели острой ишемии/реперфузии миокарда.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на процессы перекисного окисления липидов в ткани миокарда при экспериментальной ишемии/реперфузии сердца.

2. Оценить действие 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на реологические свойства крови и агрегацию тромбоцитов у крыс в условиях острой ишемии/реперфузии миокарда.

3. Изучить влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на эндотелиальную дисфункцию при острой ишемии/реперфузии миокарда у крыс.

4. Исследовать антиаритмические эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и его влияние на выживаемость крыс при острой 10-и минутной ишемии с последующей реперфузией миокарда.

5. Оценить действие 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в сравнении с эффектами мексидола на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда, а также выживаемость крыс после 45-и минутной экспериментальной ишемии сердца.

6. Изучить влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на сократительную функцию миокарда у крыс в условиях сердечной недостаточности, сформировавшейся в отдаленный период после острой ишемии/реперфузии.

Научная новизна. Получены новые данные о механизмах кардиопротективного действия 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях острой ишемии/реперфузии миокарда. Впервые установлена способность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола устранять синдром повышенной вязкости крови, уменьшать агрегацию тромбоцитов и эндотелиальную дисфункцию при модели острой ишемии/реперфузии миокарда.

Новыми являются данные о наличии антиаритмической активности у 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и его способности уменьшать зону инфаркта миокарда при ишемии/реперфузии сердца.

Впервые выявлена способность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола предупреждать нарушение сократительной функции левого желудочка в отдаленный период после ишемии/реперфузии миокарда.

Теоретическая н практическая значимость. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах кардиопротективного действия пространственно затрудненных терпенофенолов при экспериментальной ишемии/реперфузии миокарда, которые объективно доказывают целесообразность дальнейшего проведения клинических исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола у больных с нарушениями коронарного кровотока.

Получены приоритетные данные о том, что 4-метил-2,6-диизоборнилфенол при лечебно-профилактическом введении снижает смертность животных в постреперфузионный период и уменьшает размеры зоны инфаркта как относительно общей площади миокарда, так и относительно зоны гипоперфузии (Патент РФ № 2499593 от 27.11.2013 г.).

Проведенные исследования были поддержаны грантом Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в рамках государственного контракта и по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, обладающего эндотелийпротекторным и противоишемическим действием». Материалы по результатам проведенных исследований вошли в отчеты о доклинических исследованиях 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в качестве кардиопротектора при ишемии/реперфузии миокарда.

Методология и методы исследования. В соответствии с поставленными задачами были выбраны современные высокоинформативные методы, имеющиеся в лаборатории фармакологии кровообращения ФГБНУ «НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга». Объектом исследования послужили аутбредные крысы-самцы сток Вистар. Для исследования различных видов активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола воспроизводили модель ишемии/реперфузии миокарда в двух различных модификациях, различающихся временем воссоздаваемой ишемии (10 и 45 мин) с последующей рециркуляцией миокарда.

Основные методы исследования: электрофизиологические (производили анализ сердечного ритма и сократительной активности левого желудочка), гемореологические (определяли вязкость цельной крови и плазмы, содержание фибриногена в плазме, спонтанную агрегацию эритроцитов и их деформируемость, гематокрита, рассчитывали коэффициент доступности кислорода), гистологические (определяли размеры зоны резко сниженной дегидрогеназной активности (зоны инфаркта) и зоны гипоперфузии миокарда (зоны риска) при окраске тканей patent blue violet и нитросиним тетразолием с помощью программных методов исследования поперечных срезов сердца), биохимические (определяли продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) в левом желудочке сердца (диеновые и триеновые конъюгаты, основания Шиффа), содержание а-токоферола в тканях сердца, рассчитывали индекс окисленности липидов), гемостазиологические (исследовали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов,

антиагрегантную активность эндотелия сосудов, рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции).

Положения, выносимые на защиту.

1. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол обладает антиоксидантным, эндотелийпротективным, антиагрегантным эффектами, а также способностью уменьшать повышенную вязкость крови при экспериментальной ишемии/реперфузии миокарда.

2. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол оказывает кардиопротективное действие, проявляющееся способностью препарата снижать число и характер аритмий в реперфузионном периоде, уменьшать размеры зоны инфаркта миокарда и увеличивать выживаемость животных после острой ишемии/реперфузии сердца.

3. В условиях сердечной недостаточности, сформировавшейся в отдаленный период после острой ишемии/реперфузии миокарда, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол предупреждает нарушение сократительной функции левого желудочка у крыс.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности результатов, полученных в ходе исследования, обусловливается достаточным для решения поставленных задач объемом экспериментального материала и использованием современных методов и методологических подходов, а также высокой точностью статистической обработки полученных результатов. Были применены современные программно-аппаратные комплексы и программное обеспечение. Анализ литературы позволил интерпретировать и подтвердить результаты, полученные в ходе исследования.

Основные положения диссертационной работы представлены на научной конференции молодых ученых и аспирантов, посвященной 120-летию кафедры фармакологии и 90-летию со дня рождения профессора A.C. Саратикова (Томск, 2011); конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); Международной междисциплинарной научной конференции «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, 2013); первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); шестой Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2013).

Опубликованные работы. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и входящих в российские и зарубежные реферативные базы данных РИНЦ и Scopus, получен 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и структурно состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 217 источников, из них 135 отечественных и 82 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 5 рисунками и 15 таблицами.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискатель принимал непосредственное участие в планировании и разработке дизайна исследования, а также постановке его цели и задач. Диссертантом

лично проведен библиографический и патентный поиск, проанализированы данные отобранной литературы. Автором получены, проанализированы и интерпретированы основные результаты исследования, выполнена их статистическая обработка. Самостоятельно подготовлены к публикации статьи по теме диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе проведен анализ отечественной и зарубежной научной литературы по теме исследования. В первом пункте главы приведены сведения о причинах возникновения и развития ишемической болезни сердца, современных лекарственных средствах, применяемых для ее профилактики и лечения, современном состоянии и перспективах развития кардиопротекции, как важного подхода в комплексной терапии ишемических повреждений миокарда. Далее, с привлечением большого количества литературных источников, представлены данные о пространственно затрудненных фенолах, как новом высокоперспективном классе химических соединений, являющихся сильными антиоксидантами, обладающими широким спектром биологической активности, что в сочетании с их низкой токсичностью обусловливает перспективность разработки на их основе новых отечественных лекарственных средств, в частности, обладающих кардиопротективной активностью.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материала и методов исследования. Экспериментальные исследования были проведены на 238 аутбредных крысах-самцах сток Вистар массой 230-300 г. Животные были получены из вивария отдела экспериментальных биологических моделей ФГБНУ «НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга» (г. Томск). Крысы находились на стандартном рационе со свободным доступом к пище и воде. Животные из контрольных и опытных групп находились в аналогичных условиях и имели одинаковую исходную среднюю массу, которая контролировалась ежедневным взвешиванием для коррекции дозы вводимого исследуемого соединения. Условия содержания и проводимые манипуляции на крысах соответствовали всем стандартам и правилам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (1986), принципов надлежащей лабораторной практики (ГОСТ Р 53434-2009), ГОСТ 53434 (2010), ГОСТ Р ИСО 10993-2 (2009). Дизайн исследования, проводимого в рамках диссертационной работы, одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ.

В экспериментах использовали субстанцию 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (диборнол®), изготовленную в соответствии с опытно-промышленным регламентом на опытном производстве ФГБУН «Институт химии Коми» научного центра Уральского отделения РАН (г. Сыктывкар). Были использованы 2 режима введения препарата: профилактический (100 мг/кг за 1 сут. и за 10 мин. до воспроизведения модели) и лечебно-профилактический (100 мг/кг в течение трех дней и за 15 мин до воспроизведения модели и далее в течение 5 дней после оперативного вмешательства).

В качестве референтного препарата использовали мексидол (ООО «НПК «Фармасофт», Россия) — таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, содержащие 0,125 г этилметилгидроксипиридина сукцината. Таблетки растирали в

ступке до порошкообразного состояния, предварительно освобождая от пленочного покрытия, и суспендировали в 1% крахмальной слизи.

Для наркотизации животных применяли тиопентал натрия (ОАО «Синтез», Россия), эфир для наркоза (ООО «Кузбассоргхим», Россия). Кроме того, в работе использовался альбумин (ГУЗ «Свердловская областная станция переливания крови», Россия), ацетилхолина гидрохлорид («Acros Organics», USA), натрия нитропуссид (ООО «АО Реахим», Россия).

Для воспроизведения модели ишемии/реперфузии миокарда крыс наркотизировали тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубировали стальным зондом-воздуховодом и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких Rodent Ventilator 7025 (Италия). После торакотомии в 4-м межреберье, проводили перикардотомию и окклюзию левой коронарной артерии на уровне нижнего края auricula sinistra без нарушения топографии сердца в грудной клетке по методу А.Х. Когана [Коган А.Х., 1979]. Для верификации окклюзии коронарной артерии проводили мониторирование электрокардиограммы (ЭКГ) во II стандартном отведении, используя компьютерный электрокардиограф Поли-Спектр-8/Л. О качестве воспроизведения модели судили по появлению на ЭКГ изменений комплекса QRS: уменьшение амплитуды зубца R, элевация зубца Т, а также визуально по побледнению левого желудочка.

В опытах по изучению противоаритмической активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола крысы получали 100 мг/кг препарата в 2%-й крахмальной слизи за 1 сут. и за 10 мин. до оперативного вмешательства (профилактическая схема введения препарата). Длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 10 мин., после чего лигатуру отпускали и проводили реперфузию (10 мин.). Животные из контрольной группы получали эквиобъемное количество 2%-й крахмальной слизи. Выжившие после ишемии/реперфузии миокарда крысы выводились из эксперимента передозировкой эфира для наркоза.

Эксперименты по изучению антиоксидантной, гемореологической, антиагрегантной видов активности, а также определение влияния препарата на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда, оценку действия на антиагрегантную активность сосудистой стенки и вазодилятаторную функцию эндотелия, на сократительную функцию сердца и артериальное давление проводились в условиях модели ишемии/реперфузии, выполненной по аналогичной методике. Однако длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 45 мин. с последующей рециркуляцией, после чего рана послойно ушивалась и обрабатывалась антисептическим средством.

В указанных сериях опытов животные получали 4-метил-2,6-диизоборнилфенол в течение трех дней и за 15 мин. до операции и далее в течение 5 дней после нее (лечебно-профилактическая схема введения препарата), после чего осуществлялась оценка вышеперечисленных показателей. Животные, у которых проводили аналогичное оперативное вмешательство без наложения лигатур на левую коронарную артерию, составили группу ложнооперированных. Ложнооперированные животные и крысы из контрольной группы получали эквиобъемное количество 2%-й крахмальной слизи по аналогичной схеме. Во всех группах препарат и крахмальную слизь вводили 1 раз в сутки.

Для изучения гемореологических показателей и агрегации тромбоцитов забор проб цельной крови проводили из общей сонной артерии у наркотизированных крыс

спустя 5 суток после создания модели острой ишемии миокарда с реперфузией. Для этого у животных под эфирным наркозом выделяли общую сонную артерию, сосуд перевязывали и проксимально вводили тефлоновый катетер. Кровь стабилизировали 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1.

Эксперименты по изучению влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на сократительную функцию сердца и артериальное давление были выполнены через 1 месяц после воспроизведения инфаркта миокарда. В условиях сформировавшейся сердечной недостаточности крыс наркотизировали тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), отпрепаровывали правую общую сонную артерию и через надрез в сосуде в полость левого желудочка вводили микродатчик (TSD104A для аппаратно-программного комплекса Biopac MP 150, США). Осуществляли регистрацию исследуемых параметров сократительной активности левого желудочка, а также систолического и диастолического давления.

Антиаритмическую активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола оценивали электрокардиографически во II стандартном отведении непрерывно с помощью компьютерного электрокардиографа Поли-Спектр-8/JI [Мурашко В.В., Струтынский В.В., 2011].

Вязкость цельной крови определяли на ротационном вискозиметре АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с'1, вязкость плазмы — при скорости сдвига 300 с"1 [Плотников М.Б. и др., 2011]. Концентрацию фибриногена в плазме оценивали при помощи метода тромбообразования Клаусса на коагулометре KG-4 [Плотников М.Б. и др., 2010].

Гематокрит определяли с помощью капиллярной центрифуги МГЦ-8 и выражали в % [Баркаган, З.С., Момот А.П., 2001].

Агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода силлектометрии [Плотников М.Б. и др., 1995]. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации Тц2 - время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза [Богоявленский В.Ф., 1981].

Деформируемость эритроцитов оценивали методом эктацитометрии [Габриэлян Э.С., Акопов С.Э., 1985].

Индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ), рассчитывали по методу Bessis М. [Bessis, М. et а!., 1980].

Доступность кислорода для тканей рассчитывали как отношение гематокрита к вязкости крови на высоких скоростях сдвига (50-300 с"1) [Stoltz J.F. et al., 1991].

Определение размеров зоны гипоперфузии и резко сниженной дегидрогеназной активности миокарда проводили при помощи методов гистохимии [Пирс Э., 1956] с расчетом площади зон в Adobe Photoshop CS6.

Содержание диеновых и триеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически по характерным для сопряжённых двойных связей пикам поглощения при 232 им и 270-280 нм соответственно [Plazor, Z., Kussela L., 1968]. Основания Шиффа определяли по методу A. Tappel [Tappel, A.L., 1978].

Индекс окисленности липидов оценивали по соотношению показателей оптической плотности диеновых конъюгатов и неокисленных липидов [Биленко М.В., 1989].

Агрегацию тромбоцитов определяли нефелометрическим методом по Born [Born G.V.R., 1962] в стандартизированной по числу тромбоцитов плазме.

Антиагрегантную активность сосудистой стенки оценивали по степени угнетения АДФ-индуцированной (в конечной концентрации 4-10"5 М) агрегации тромбоцитов при их инкубации с сегментами сосудов брюшной аорты [Балуда, В. П., 1987].

Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющему собой отношение площади над кривой восстановления артериального давления в ответ на введение натрия нитропруссида к площади над кривой восстановления артериального давления в ответ на введение ацетилхолина [Laursen J.B. et al., 1997; Покровский M.B. и др., 2006].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 9.0» для Windows. В таблицах результаты представлены как средние значения показателей (М) ± стандартные отклонения среднего значения (т). Нормальность распределения оценивали с помощью показателей асимметрии и эксцесса; достоверность различий (р<0,05) между сериями определяли с помощью t-критерия Стьюдента, теста Манна-Уитни и х2-критерия.

Третья глава посвящена описанию результатов исследования механизмов кардиопротективной активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при острой ишемии/реперфузии миокарда. Полученные результаты представлены в виде таблиц и рисунков.

Четвертая глава диссертационной работы посвящена обсуждению полученных результатов исследования с привлечением данных литературы.

Изучение механизмов кардиопротективной активности 4-метил-2,6-ди1побрнилфенола в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда

На первом этапе исследований изучалась антиоксидантная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при модели ишемии/реперфузии миокарда. Использованная нами модель острой ишемии миокарда с реперфузией характеризуется сохранением в сердце во время ишемии редуцированного кровообращения и, следовательно, притока субстратов и кислорода, что способствует активации процессов ПОЛ [Turer А.Т., Hill J.А., 2010]. Особенностью этой модели является также усиление процессов ПОЛ в миокарде вследствие выброса катехоламинов и в результате реоксигенации сердца после восстановления кровотока [Rupp Н. et al., 1994; Spear J. F. et al., 2007; Martindale J.J., Metzger J.M., 2014].

На 5-е сутки после ишемии и реперфузии в тканях левого желудочка крыс контрольной группы наблюдалась активация процессов ПОЛ. Содержание диеновых и триеновых конъюгатов возрастало на 69% и 72% соответственно, содержание вторичных продуктов ПОЛ (основания Шиффа) - в 5,4 раза по сравнению с показателями ложнооперированных животных. Индекс окисленности липидов у контрольных животных достоверно увеличивался в 2,4 раза по сравнению со значениями в группе ложнооперированных крыс. К 5-м суткам после создания модели ишемии/реперфузии миокарда у крыс контрольной группы отмечено снижение содержания в тканях миокарда а-токоферола на 59% по сравнению с показателем ложнооперированных животных (Таблица 1). Полученные данные о повышении содержания диеновых и триеновых конъюгатов в тканях миокарда после ишемии/реперфузии миокарда согласуются с результатами клинических исследований,

в которых также отмечена активация процессов свободнорадикального окисления у больных с ИБС [Капустник В.А., 2014; Ройтман Е.В. и др., 2000].

Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в течение 3-х суток до создания модели ишемии/реперфузии миокарда и 5-и суток после оперативного вмешательства ограничивало интенсивность процессов ПОЛ: уровень диеновых и трненовых конъюгатов был достоверно ниже в сравнении с контролем на 30% и 26% соответственно. 4-метил-2,6-диизоборнилфенол ограничивал накопление и вторичных продуктов ПОЛ - содержание оснований Шиффа снижалось в 5 раз по сравнению с контролем. Индекс окисленности липидов в группе крыс, получавших 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, относительно значений контрольных животных снижался в 2 раза (Таблица 1). Особенности строения пространственно затрудненных фенолов (ПЗФ), к которым относится 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, обусловливает их способность легко взаимодействовать с различными свободными радикалами, нейтрализуя их с образованием малореакционноспособных фенокси-радикалов [Перевозкина М.Г. и др., 2005; Буравлев Е.В. и др., 2008]. Полученные результаты согласуются с имеющимися сведениями о наличии у 4-метил-2,6-диизоборнилфенола антиоксидантной активности, приводящей к снижению накопления ПОЛ в тканях головного мозга при модели неполной церебральной ишемии [Иванов И.С., Смольякова В.И., 2008; Плотников М.Б. и др., 2010].

Кроме того, в проведенных нами исследованиях к 5-м суткам после создания модели ишемии/реперфузии миокарда у крыс опытной группы содержание а-токоферола - эндогенного природного антиоксиданта, оставалось на 29% ниже значений ложнооперированных животных, однако по сравнению с величиной этого показателя у крыс контрольной группы - возрастал в 1,7 раза (Таблица 1). Механизм синергизма а-токоферола и 4-метил-2,6-диизоборнилфенол хорошо известен и заключается в способности пространственно затрудненных фенолов вступать в реакции с токофероксильными радикалами, которые образуются при окислении а-токоферола. Таким образом, под действием пространственно затрудненных фенолов происходит регенерация активной формы а-токоферола, который вновь приобретает способность обрывать цепи свободнорадикального окисления [Перевозкина М.Г. и др., 2006].

Таблица 1 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на показатели перекисного окисления липидов в тканях левого желудочка у крыс после ишемии/реперфузии миокарда _

Группы животных Диеновые конъюгаты, ОПыг/мг липидов Триеновые конъюгаты, ООг7о/мг липидов Основания Шиффа, отн. ед./мг липидов а-Токофе-рол, мкг/мг липидов Индекс окисленности липидов, усл. ед.

Ложнооперирован-ные (п=5) 0,172± 0,012 0,120± 0,010 0,053± 0,003 114,3± 8,8 0,127± 0,014

Контроль(п=10) 0,291± 0,034* 0,206± 0,008* 0,284± 0,056* 46,9± 7,2* 0,310± 0,060*

4-метил-2,6- дшпоборнилфенол (п=10) 0,204± 0,01 Г 0,152± 0,01 Г 0,056± 0,005* 81,5± 9,5** 0,152± 0,008*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы.

Следовательно, антиоксидантная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях ишемии/реперфузии миокарда реализуется как за счет прямого антирадикального действия препарата, так и за счет его способности вступать в синергетические взаимодействия с эндогенной антиоксидантной системой организма.

На сегодняшний день существует достаточно большой массив клинических данных, показывающий, что нарушения реологических свойств крови представляют собой один из важных элементов в каскаде нарушений, происходящих при различных сердечно-сосудистых заболеваниях [Танашян М.М. и др., 2001; Сидельникова Н.С. и др., 2014]. Локальная активация свободнорадикального окисления в зоне ишемии и накопление продуктов деградации свободных радикалов стимулируют повышение свертываемости крови, увеличивают ее вязкость, усиливают агрегацию и адгезию форменных элементов крови [Dianat M. et al., 2014]. При терапии ряда кардиологических заболеваний, в том числе и при остром коронарном синдроме, в составе комплексной терапии показано назначение препаратов, приводящих к снижению вязкости крови [Аникеева Т.В., 2010]. Для оценки гемореологической активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при модели ишемии/реперфузии миокарда было выполнено комплексное исследование влияния препарата на развитие синдрома повышенной вязкости крови (СПВК) в этих условиях.

На 5-е сутки после моделирования ишемии/реперфузии миокарда у животных контрольной группы отмечалось повышение вязкости крови во всем диапазоне скоростей сдвига по отношению к показателям группы ложнооперированных животных (Рисунок 1А). Очевидно, что в возрастание вязкости крови вносит свой вклад увеличение в 1,2 раза вязкости плазмы, что в свою очередь может быть обусловлено увеличением содержания фибриногена в плазме почти в 2 раза (Таблица 2).

Кроме сдвигов макрореологических параметров, ухудшение вязкостных свойств крови при модели ишемии/реперфузии миокарда у крыс обусловлено и изменениями микрореологических параметров. Так, наиболее выраженное повышение вязкости крови (на 23-36%) наблюдались в области низких скоростей сдвига (Рисунок 1А), что может свидетельствовать о нарушении агрегационной активности эритроцитов [Chien S. et al., 1967]. Это подтверждается данными прямого измерения значений этого показателя. Отмечено увеличение агрегации эритроцитов, которое выразилось в сокращении полупериода агрегации на 1/3 по сравнению с показателем ложнооперированных животных (Таблица 2). Повышение агрегации в условиях модели ишемии/реперфузии могло произойти по причине морфологических изменений эритроцитов, которые в свою очередь могут быть обусловлены активацией процессов ПОЛ, способных вызвать повреждение клеточных мембран [Baskurt O.K. et al., 1998]. Кроме того, повышение спонтанной агрегации эритроцитов в этих условиях может быть связано с повышением содержания фибриногена в плазме крови крыс, вызванным ишемией/реперфузией миокарда (Таблица 2).

Рисунок 1 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на вязкость крови (А) и доступность кислорода для тканей (Б) у крыс после ишемии/реперфузии миокарда. По оси абсцисс скорости сдвига, с"1; по оси ординат слева — вязкость крови, мПа-с; по оси ординат справа -доступность кислорода для тканей, усл. ед.

Примечание: ЛО - ложнооперированные животные; * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы.

Таблица 2 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на вязкость плазмы (ВП, мПа с), содержание фибриногена в плазме крови (ФГ, мг/мл), полупериод агрегации эритроцитов (Т1/2, с), гематокрит (Ш, %) и индекс деформируемости эритроцитов (усл. ед.) при различных скоростях сдвига у крыс после ишемии/реперфузии миокарда

Группы животных ВП Т|/2 ЬК ФГ Индекс деформируемости эритроцитов при различных скоростях сдвига

90 с"' 180 с-1 360 с"1 890 с-1

Ложнооперированные (п=7) 1,36± 0,02 7,79± 0,96 44±1 2,86± 0,20 0,147± 0,010 0,223± 0,016 0,278± 0,020 0,364± 0,016

Контроль (п=7) 1,60± 0,04* 5,21± 0,19* 43±1 5,35± 0,50* 0,094± 0,010* 0,162± 0,009* 0,219± 0,011* 0,318± 0,009*

4-Метил-2,6- днизоборнил-фенол (п=7) 1,44± 0,02+ 7,39± 0,80+ 43±1 3,50± 0,31 + 0,151± 0,010* 0,230± 0,017+ 0,282± 0,016* 0,367± 0,018+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы.

Окислительное повреждение клеточных мембран приводит не только к усилению спонтанной агрегации эритроцитов, но также и к снижению их деформируемости. ИДЭ в группе контрольных животных во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига был достоверно ниже значений показателей в группе ложнооперированных животных (Таблица 2). Ухудшение деформируемости эритроцитов и повышение их способности к спонтанной агрегации негативно сказывается на вязкостных свойствах крови и

основной функции эритроцитов - кислородтранспортной [БйИг и. сЧ а1., 1991]. Показатель доступности кислорода для тканей в диапазоне высоких скоростей сдвига у крыс с моделью ишемии/реперфузии миокарда в эксперименте был значительно снижен по сравнению со значением у ложнооперированных животных (Рисунок 1Б).

Следовательно, при ишемии/реперфузии миокарда, в условиях активации процессов ПОЛ, наблюдались патологические изменения всех звеньев, определяющих реологию крови. Совокупность всех наблюдаемых изменений свидетельствует о формировании синдрома повышенной вязкости крови (СПВК) у крыс с ишемией/реперфузией миокарда. Полученные в эксперименте данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями о том, что патологические процессы в сердечнососудистой системе, связанные с формированием оксидативного стресса, влекут за собой тяжелые гемореологические расстройства, значительно отягощающие протекание основной патологии за счет еще большего увеличения гипоксии органов и тканей, и нуждаются в соответствующей коррекции [Голиков А. П. и др. 2003; Н1егео II. е1а1„ 2014].

В литературе имеются сведения о влиянии ПЗФ на нарушение реологических свойств крови, вызванных моделированной неполной транзиторной ишемией головного мозга у крыс. В условиях этой модели показано, что применение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола снижает содержание фибриногена в плазме крови и ее вязкость, улучшает деформируемость эритроцитов и снижет их агрегацию, приводя к ограничению развития СПВК [Плотников М.Б. и др., 2010].

Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при ишемии/реперфузии миокарда приводило к улучшению вязкостных свойств крови как за счет влияния на клеточные (деформируемость и агрегация эритроцитов), так и плазменные (вязкость плазмы) факторы. Так, показатель вязкости крови у крыс опытной группы во всем исследованном диапазоне скоростей сдвига не отличался от значений группы ложнооперированных животных и был достоверно на 9-25% ниже значений в контроле (Рисунок 1А). У крыс опытной группы снижалась также и вязкость плазмы до величины, близкой к показателю у ложнооперированных животных, что было на 10% ниже значения у крыс контрольной группы. Нормализация показателя вязкости плазмы крови в группе с курсовым лечебно-профилактическим введением 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, вероятно, может быть обусловлена снижением содержания в ней фибриногена (Таблица 2). Подобный эффект 4-метил-2,6-диизоборнилфенола был продемонстрирован исследователями ранее при модели неполной ишемии головного мозга [Плотников М.Б. и др., 2010].

Под влиянием 4-метил-2,6-диизоборнилфенола происходило также отчетливое улучшение показателей микрореологии, о чем свидетельствовало не только снижение агрегационной активности эритроцитов, но и улучшение их деформируемости. Полупериод агрегации эритроцитов возрастал на 30%, а ИДЭ у животных данной группы увеличивался на 15-60% по сравнению с показателями в контрольной группе (Таблица 2). Нормализация вязкоэластических свойств эритроцитов при применении 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, очевидно, приводила к нормализации параметров вязкости крови на высоких скоростях сдвига, так как именно в этом диапазоне скоростей сдвига вязкость крови преимущественно зависит от способности мембраны эритроцитов к упругой деформации [Левтов В.А. и др., 1982].

Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола крысам, перенесшим ишемию миокарда с реперфузией, улучшало показатель

кислородтранспортной функции эритроцитов: коэффициент доступности кислорода для тканей возрастал на 9-18% по сравнению со значением в контроле (Рисунок 1Б).

Следовательно, лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда уменьшает повышенную вязкость крови в широком диапазоне скоростей сдвига за счет ограничения агрегационной активности эритроцитов, улучшения их деформируемости и снижения вязкости плазмы. Введение крысам 4-метил-2,6-диизоборнилфенола способствует повышению доступности кислорода для тканей в условиях постишемических изменений реологических свойств крови.

В литературе имеются сведения о том, что существует определенная взаимосвязь между возникновением ишемии/реперфузии миокарда и развитием гиперагрегации тромбоцитов [Tang X. et al., 2013]. Гиперагрегация тромбоцитов - один из важных механизмов развития сосудистого тромбоза, что может значительно усугубить течение сердечно-сосудистой патологии и даже привести к внезапной смерти при окклюзии магистральных сосудов [Ермакова О.В. и др., 2010]. В свою очередь, механизм повышения агрегации тромбоцитов исследователями напрямую связывается с формированием при ишемии/реперфузии окислительного стресса [Бышевский А.Ш. и др., 2005]. Следовательно, антиагрегантная терапия является одним из важных направлений комплексной терапии острых ишемических и реперфузионных процессов в сердечно-сосудистой системе [Лазарева E.H. и др., 2013].

Наличие антиагрегантной активности у 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при ишемии/реперфузии миокарда прогнозировалось в связи с имеющимися литературными сведениями о его доказанной способности снижать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях модели неполной ишемии головного мозга у крыс [Плотников М.Б. и др., 2010].

В проведенных нами исследованиях показано, что при воспроизведении модели острой ишемии/реперфузии миокарда у крыс контрольной группы происходило повышение АДФ-индуцированной обратимой агрегации тромбоцитов до 33%, что на 74% превышало показатель у ложнооперированных животных (Таблица 3). Одной из причин этого эффекта может быть повышение вязкости крови и нарушение деформационных свойств эритроцитов при ишемии/реперфузии миокарда, что может существенно повысить агрегационную активность тромбоцитов [Bhavsar J., Rosenson R.S., 2010].

Таблица 3 - Влияние 4-метил-2,б-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на амплитуду АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (АДФ 410"6 М) на 5-е сутки после ишемии/реперфузии миокарда у крыс

Группы животных Амплитуда агрегации, %

Ложнооперированные (п=6) 19±1

Контроль(п=7) 33±2*

4-Метнл-2,6-диизоборш1лфенол (п=7) 25±2*+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы.

Амплитуда АДФ-индуцированной обратимой агрегации тромбоцитов в плазме крови крыс с острой ишемией и реперфузией миокарда, получавших 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, была достоверно ниже, чем показатель у животных контрольной

группы, но не достигал значений амплитуды агрегации у ложнооперированных животных (Таблица 3). Следовательно, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол при лечебно-профилактической схеме введения достоверно уменьшал гиперагрегацию тромбоцитов, вызванную ишемией/реперфузией миокарда.

Гемореологическая активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, выявленная нами в этих условиях может вносить свой вклад в антиагрегантный эффект препарата, способствовать улучшению перфузии миокарда. Снижение показателя вязкости крови, уменьшение агрегационной способности тромбоцитов при курсовом лечебно-профилактическом введении 4-метил-2,6-диизоборнилфенола способно привести к уменьшению явлений реологической окклюзии, которая сопровождает ишемическое повреждение миокарда, и улучшить коллатеральный кровоток в сердце. В свою очередь, коллатеральный кровоток, наряду с венозной ретроперфузией, остаются единственно возможными факторами компенсаторного ответа на редуцированный сердечный кровоток в зоне ишемии, вызванной окклюзией левой коронарной артерии [Lekven I., Anderssen К., 1980; Harold D., Sanford Р., 1982]. Все это может способствовать улучшению микроциркуляции, ослаблению гипоксии ткани миокарда и, как следствие, уменьшению электрической нестабильности и гетерогенности миокарда как при профилактическом, так и при лечебном применении 4-метил-2,6-диизоборнилфенола.

В соответствии с современными представлениями, в патогенезе невосстановления кровотока после реперфузии миокарда (no-reflow) помимо реологической окклюзии существенное значение имеет и нарушение функции эндотелия [Vrints C.J., 2009; Коноплева Л.Ф., 2011]. В результате развивающейся дисфункции эндотелия происходит нарушение важнейших ее физиологических функций - баланса вазоконстрикции и вазодилятации, потенцирования и ингибирования факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов, а также выработки про- и противовоспалительных факторов [Коноплева Л.Ф., 2011]. При этом нарушаются эндотелийзависимое расширение сосудов, противовоспалительные и антикоагулянтные свойства сосудистого эндотелия [Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2013; Madigan М„ 2013].

Одним из механизмов формирования эндотелиальной дисфункции при ишемии/реперфузии может быть активация липидной пероксидации в тканях с выбросом активных пероксирадикалов в системный кровоток [Vrints C.J., 2009]. Исходя из этого, эффективными эндотелийпротекторами могут быть вещества, обладающие, по крайней мере, двумя видами активности: способностью стимулировать NO-синтазу и/или снижать инактивацию NO активными формами кислорода, а также защищать клетки эндотелия от ПОЛ [Kang S., Yang Y., 2007; Vrints C.J., 2009].

Для оценки эндотелийпротективной активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях модели острой ишемии/реперфузии миокарда изучали следующие важнейшие для сердечно-сосудистой системы функции, зависимые от эндотелия -вазодилятирующую и антиагрегационную активность [Kang S., 2007].

У животных контрольной группы ишемия миокарда с последующей реперфузией вызывала существенное снижение антиагрегантной активности эндотелия сосудов, о чем свидетельствовало повышение амплитуды АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов почти в 2 раза (Рисунок 2) и 2-х кратный рост КЭД (Таблица 4) по сравнению с показателями у ложнооперированных крыс.

Введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на этом фоне повышало антиагрегантную активность сосудистой стенки, о чем свидетельствовало снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после их инкубации с сегментами сосудов крыс опытной группы (Рисунок 2). Кроме того, у животных, получавших 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, КЭД составил 1,09. что характеризует нормализацию эндотелийзависимой вазодилятации (Таблица 4).

Амплитуда агрегации, %

40 35 30 25 20 15 10 5 0

Без инкубации с сегментом аорты После инкубации с сегментом аорты

ИЛожнооперированные 0 Контроь □4-Метил-2,6-диизоборнилфенол

Рисунок 2 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после ишемии/реперфузии миокарда.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями без инкубации с сегментом аорты; * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных: + - р<0.05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы. По оси абсцисс - группы животных, по оси ординат - амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (агрегация, %).

Таблица 4 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД, усл. ед.) у крыс после ишемии/реперфузии миокарда

Группы животных КЭД

Ложнооперированные (п=5) 0,97±0,03

Контроль(п=6) 1,92±0,33*

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол (п=5) 1,09±0,03*+

Примечание: * - р<0.05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + — р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы.

Антиоксиданты повышают образование N0 и эндотелийзависимую вазодилятацию у людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями [Марков Х.М., 2009], потенцируют антиагрегантную активность эндотелия [Гуманова Н.Г. и др., 2007]. 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, являясь мощным антиоксидантом, вероятно, проявляет свою эндотелийпротективную активность прежде всего за счет ингибирования метаболического окисления N0, приводя к повышению его биодоступности и, следовательно, усиливая его антиагрегантное и вазодилятирующее действие [Марков Х.М., 2009].

Таким образом, антиоксидантные свойства 4-метил-2,6-диизоборнилфеиола обеспечивают мультимодальный эффект препарата, заключающийся в его способности улучшать реологические свойства крови, уменьшать эндотелиальную дисфункцию и

ЛЛЛАУ ЕШШШШШ и л.

# рцщш

Вййа

повышенную агрегацию тромбоцитов в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда. Отмеченные эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола способны существенно повлиять на условия гемодинамики и особенно микроциркуляции миокарда и быть основой его кардиопротективного действия при патологии.

Как известно, при ишемическом повреждении сердца смещение равновесия в системе прооксидант-оксидант в строну прооксиданта является одним из ключевых звеньев деструкции кардиомиоцитов и способствует формированию электрической гетерогенности и, как следствие, аритмогенной активности миокарда [Sapa J. et al., 2011].

В проведенных нами исследованиях моделирование 10-и минутной ишемии с последующей 10-и минутной реперфузией миокарда провоцировало развитие всех видов ишемических и реперфузионных аритмий (Рисунок 3). Основную долю нарушений ритма сердца в контрольной группе животных составили желудочковые тахикардии (23,1% и 24%) и фибрилляции (61,5% и 60%), соответственно в период ишемии и реперфузии. Полученные результаты согласуются с данными литературы [Нарыжная П.В. и др.. 2011].

Профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в этих условиях несущественно изменяло структуру нарушения ритма в период ишемии. Отмечалась лишь тенденция к снижению частоты возникновения желудочковых фибрилляций -наиболее тяжелого вида аритмий по сравнению с контролем (Рисунок 3).

В реперфузионном же периоде превентивное введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола значимо повышало число случаев позитивного, без желудочковых аритмий, исхода реперфузионного периода и, напротив, снижало частоту возникновения фибрилляций желудочкового происхождения в эксперименте (Рисунок 3). Предотвращение 4-метил-2,6-диизоборнилфенолом наиболее тяжелых форм аритмии может иметь высокое значение при ишемии/реперфузии, поскольку именно они значительно ухудшают прогноз при инфаркте миокарда. Подтверждением этому является достоверное увеличение выживаемости животных из группы с превентивным введением 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в течение 1-го дня после эксперимента по сравнению с контролем (96% выживших в опыте - против 77% в контроле). При этом, основная гибель животных приходилась именно на период реперфузионных повреждений миокарда.

В механизме антиаритмической активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, по-видимому, особую роль играют антиоксидантные эффекты препарата и способность подавлять ПОЛ [Плотников М.Б. и др., 2010]. Благоприятный эффект препарата также, очевидно, может усиливаться наличием у него антигипоксической активности, выявленной ранее на модели острой гипобарической гипоксии [Иванов И.С., 2009]. Гемореологические эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, доказанные в условиях ишемии/реперфузии миокарда. Они способны нивелировать проявления реологической окклюзии, сопровождающей ишемическое и реперфузионное повреждения миокарда, и, как следствие, ослаблять гипоксию миокарда и уменьшать эффекты электрической нестабильности мышцы сердца.

Важным показателем, характеризующим наличие кардиопротективной активности у препарата, является оценка его влияния на размеры зоны инфаркта и зоны риска в миокарде при модели ишемии/реперфузии у крыс.

Ишемия

Реперфузия

Контроль

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол

Контроль 4-Метип-2,6-

диизоборнилфенол НБЖА НМЖЭ ИЖТ ИЖФ

Рисунок 3 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно, двукратно) при профилактическом введении на частоту (%) и характер аритмий в период ишемии и реперфузии миокарда у крыс.

Примечание: + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы. БЖА - без желудочковых аритмий; МЖЭ - множественные желудочковые экстрасистолы; ЖТ - желудочковые тахикардии; ЖФ - желудочковые фибрилляции.

Данные ЭКГ, полученные в ходе суточного мониторирования, подтверждают наличие очагов ишемии и некроза в миокарде у крыс с перенесенной 45-и минутной ишемией с последующей реперфузией. К первым суткам наблюдения отмечено возрастание амплитуды зубца Q, свидетельствующее о наличии некротических изменений в миокарде, которое сохранялись в течение 5 суток [Мурашко В.В., Струтынский В.В., 2011]. Амплитуды зубцов Т и R оставались сниженными на протяжении всего периода наблюдения. Полученные данные согласуются с результатами, полученными в условиях модели инфаркта миокарда у мышей [Овсепян

A.A. и др., 2011].

В группе животных с введением 4-метил-2.6-диизоборнилфенола отмечалась тенденция к нормализации ЭКГ-показателей к 3-5-м суткам эксперимента. Так, амплитуда зубца Т на протяжение 1-5 суток достоверно превышала показатель контрольной группы, характеризуя тенденцию к нормализации процессов деполяризации желудочков под действием препарата [Мурашко В.В., Струтынский

B.В., 2011]. Снижение амплитуды патологического зубца Q к 5-м суткам достигало статистической значимости по сравнению с контролем. Возрастание амплитуды зубца R к 3-м суткам было достоверно выше контрольной, а к 5-м суткам достигало значений, близких к исходным.

Следовательно, изменения ЭКГ-показателей в контрольной и опытной группах в периоды ишемии и реперфузии миокарда носили сходный характер, однако в группе с введением 4-метил-2,6-диизоборнилфенола отмечалась тенденция к нормализации этих показателей к 3—5-м суткам эксперимента, характеризуя тенденцию к восстановлению электрического потенциала миокарда после полученной им ишемической нагрузки, вызвавшей выключение части сердечной мышцы из процесса сердечной деятельности.

Изучение влияния 4-мети-2,6-диизоборнилфенол на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда было проведено в этой же серии экспериментов. Моделирование 45-минутной острой ишемии миокарда с реперфузией у животных из контрольной

группы приводило к формированию значительного очага инфаркта миокарда, занимающего более половины от величины зоны гипоперфузии и 1/4 от общей площади поперечных срезов миокарда левого желудочка (Рисунок 4).

Размер зоны некроза в левом желудочке является определяющим фактором в долговременном прогнозе исхода инфаркта миокарда [Ferreira R., 2010]. Поскольку установлено, что реперфузионные повреждения являются причиной формирования 50% зоны инфаркта в миокарде [Ferreira R., 2010], именно этот показатель является ключевым звеном в исследовании механизмов кардиопротекции.

В группе животных с лечебно-профилактическим введением 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при воспроизведении модели 45-минутной острой ишемии миокарда с реперфузией размер зоны гипоперфузии от площади срезов соответствовал показателю контрольной группы (33%), а размер очага инфаркта миокарда к 5-м суткам наблюдения был почти в 2 раза меньше, чем у контрольных животных. В группе с введением референтного препарата мексидола были получены аналогичные результаты (Рисунок 4). Это может свидетельствовать о наличии у 4-метил-2,6-диизоборнилфенола цитопротективного эффекта, эквивалентного таковому у мексидола [Приходько В.Ю. и др., 2011]. Размер зоны гипоперфузии у животных, получавших как 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, так и мексидол, не отличался от аналогичного показателя контрольной группы, что свидетельствует о несущественном влиянии препаратов на этот показатель.

Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола у животных этой группы значительно снижало смертность животных в реперфузионный период. В опытной группе в период реперфузии из 16 животных погибло 3, таким образом, смертность составила 19%, что достоверно отличалось от показателя в

контрольной группе - 52% погибших животных.

%

70 ----

йх; + +

; ;-

— I ЩРЯ#МН1 jjjjjPPP^ II

А Б В

0 Контроль (п=12) 04-метил-2,6-диизоборнилфенол (п=12) оМексидол (п=7)

Рисунок 4 - Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг внутрижелудочно) при лечебно-профилактическом введении на размеры зон гипоперфузии (зон риска) и зон резко сниженной дегидрогеназной активности (зон инфаркта) на 5-е сутки после ишемии/реперфузии миокарда у крыс.

Примечание: + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс контрольной группы. А -зона гипоперфузии. в % от общей площади миокарда; Б - зона резко сниженной дегидрогеназной активности, в % от общей площади миокарда; В - зона резко сниженной дегидрогеназной активности, в % от площади гипоперфузии миокарда.

Следовательно, лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при воспроизведении модели ишемии миокарда с последующей реперфузией значительно снижало смертность животных в постреперфузионный период. Размеры зоны гипоперфузии у животных, получавших как 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, так и референтный препарат мексидол, не отличались от аналогичного показателя контрольной группы. Вместе с тем, в группах животных с лечебно-профилактическим введением 4-метил-2,б-диизоборнилфенола и референтного препарата мексидола, размеры зоны инфаркта миокарда были достоверно меньше, чем в контроле.

Выявленные структурные нарушения миокарда, развивающиеся в отдаленные периоды наблюдения после воспроизведения ишемии/реперфузии миокарда, вероятно, могли оказать влияние на главную функцию сердца - насосную и привести к развитию и прогрессированию сократительной дисфункции миокарда, ведущей к фатальным последствиям [Бокерия JI.A. и др., 2010; ТороповаЯ.Г. и др., 2013].

Одной из важных причин нарушений сократительной функции сердца в постишемическом периоде является кислородно-субстратный дефицит вследствие феномена невосстановления коронарного кровотока после реперфузии, развивающегося при активации ПОЛ в кардиомиоцитах, их перегрузки ионами Са2+, нарушения сопряжения возбуждения и сокращения и развития контрактуры [Марголина A.A. и др., 1997; Renaud J. F., 1987].

В наших исследованиях через 1 месяц после моделирования инфаркта миокарда у крыс развивалось нарушение сократительной функции сердца и процессов расслабления миокарда левого желудочка, что отразилось в снижении давления, развиваемого левым желудочком, индекса сократимости миокарда, максимальной скорости сокращения и расслабления миокарда. Отмеченные изменения свидетельствуют о формировании сердечной недостаточности, проявляющейся в достоверном повышении конечного диастолического давления и снижении уровня систолического артериального давления. Учитывая, что частота сердечных сокращений также имела тенденцию к снижению, полученные результаты свидетельствуют об уменьшении сердечного выброса вследствие поражения значительной части сократительного миокарда.

Наиболее уязвимой к воздействию ишемии/реперфузии оказалась функция расслабления миокарда - в контрольной группе наблюдали значительное уменьшение dP/dt min (скорость расслабления левого желудочка сердца) - в 1,5 раза по сравнению с показателем у ложнооперированных животных. Это сопровождалось подъемом диастолического давления в левом желудочке и, очевидно, вносило свой вклад в увеличение конечного диастолического давления в левом желудочке почти в 2 раза.

Описанные изменения довольно типичны для развития инфаркта миокарда и соответствуют данным литературы [Lonborg J., 2014].

Применение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях ишемии/реперфузии привело к достоверному уменьшению конечного диастолического давления на 39% и, напротив, к повышению таких показателей сократительной функции сердца, как давление, развиваемое левым желудочком на 22% и индекс сократимости левого желудочка на 19% по сравнению со значениями в контроле. Отмечено также статистически достоверное повышение максимальной сократительной способности миокарда (dP/dt шах) по сравнению с контролем на 34%.

Следовательно, лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола предупреждало развитие нарушений сократительной функции левого желудочка и способствовало сохранению насосной функции сердца на уровне, близком к значениям у ложнооперированных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол у крыс с ишемией/реперфузией миокарда обладает выраженной кардиопротективной активностью, которая обусловлена комплексом выявленных фармакологических эффектов препарата.

Во-первых, лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола достоверно снижает выраженность окислительного стресса, характерного для ишемизированного миокарда и потенцирующего поражение сердечной мышцы, особенно в период рециркуляции. В этом эффекте, очевидно, особую роль играют антирадикальные свойства препарата, характерные для группы ПЗФ, к которой принадлежит 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, и его способность регенерировать активную форму эндогенного антиоксиданта - а-токоферола.

Во-вторых, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол в условиях острой ишемии/реперфузии сердца приводит к уменьшению проявления СПВК за счет ограничения агрегационной активности эритроцитов и улучшения их деформируемости. Кроме того, препарат предупреждает развитие гиперагрегации тромбоцитов у крыс, перенесших острую ишемию миокарда с реперфузией. Эти эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола способны нивелировать проявления реологической окклюзии, сопровождающей ишемическое и реперфузионное повреждения миокарда и, как следствие, ослаблять гипоксию сердечной мышцы.

В-третьих, в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда 4-метил-2,6-диизоборнилфенол оказывает эндотелийпротективное действие, проявившееся в сохранении способности сосудистой стенки подавлять повышенную агрегацию тромбоцитов и восстанавливать эндотелийзависимую вазодилятацию.

Выявленные эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола являются основой кардиопротективной активности препарата, реализующейся антиаритмическим действием в реперфузионный период, а также способностью препарата уменьшать площадь зоны инфаркта миокарда и нормализовать сократительную функцию сердца в отдаленном периоде после моделированной ишемии/реперфузии миокарда.

Вышеуказанные эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола обеспечили повышение выживаемости животных после моделированной острой 10-и и 45-и минутной ишемии миокарда с последующей реперфузией.

ВЫВОДЫ

1. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол ограничивает активацию процессов ПОЛ в ткани миокарда при экспериментальной ишемии/реперфузии сердца, уменьшая накопление первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации, индекс окисленности липидов и повышая содержание а-токоферола.

2. В условиях острой ишемии/реперфузии миокарда 4-метил-2,6-диизоборнилфенол уменьшает выраженность синдрома повышенной вязкости крови как за счет уменьшения вязкости плазмы, так и в результате улучшения реологических свойств

эритроцитов - повышения их деформируемости и уменьшения агрегации. Препарат также снижает АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов в этих условиях.

3. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол обладает эндотелийпротективной активностью, проявляющейся способностью препарата восстанавливать антиагрегантную активность сосудистой стенки и нормализовать эндотелийзависимую вазодилятацию у крыс после острой ишемии/реперфузии миокарда.

4. Профилактическое применение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола снижает патологические изменения ритма сердца крыс в реперфузионный период, что проявляется увеличением числа животных без желудочковых аритмий и снижением количества крыс с наиболее тяжелым видом аритмий — желудочковыми фибрилляциями. Препарат повышает выживаемость животных с моделью острой 10-и минутной ишемии с последующей реперфузией миокарда.

5. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол и референтный препарат мексидол при курсовом лечебно-профилактическом применении оказывают сопоставимое действие на величину зоны риска и зоны инфаркта миокарда, уменьшая площадь зоны инфаркта миокарда по сравнению с контролем, при этом не изменяя размер зоны риска миокарда. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол в условиях 45-и минутной ишемии и последующей реперфузии миокарда снижает смертность животных в постреперфузионный период.

6. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол при его лечебно-профилактическом введении предупреждает развитие нарушений сократительной функции левого желудочка и способствует сохранению насосной функции сердца у крыс в отдаленный период после острой ишемии/реперфузии миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щетинин П.П. Кардиопротекторы - современное состояние и перспективы // Материалы научной конференция молодых ученых и аспирантов, посвященная 120-летию кафедры фармакологии и 90-летию со дня рождения профессора A.C. Саратикова. - Томск, 2011. - С. 65-72.

2. Щетинин П.П. Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на антитромбоцитарную активность эндотелия сосудов // Материалы конференция молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии». —Томск, 2012. — С. 56-58.

3. Чернышева Г. А. Антитромбоцитарная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола при модели острой ишемии-реперфузии миокарда / Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, П.П. Щетинин, Т.М. Плотникова, A.B. Кучин, А.Ю. Чукичева // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». — Казань, 2012. - С. 195-196.

4. Чернышева Г.А. Антиаритмическая активность диборнола / Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, П.П. Щетинин, Т.М. Плотникова, A.B. Кучин, А.Ю. Чукичева // Материалы Международной междисциплинарной научной конференции «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». — Новый Свет, 2013. — С. 93.

5. Щетинин П.П. Антиаритмическая активность диборнола при модели острой ишемии/реперфузии миокарда // Материалы первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств». - Москва, 2013. - С. 137.

6. Чернышева Г.А. Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на реологию крови при острой ишемии/реперфузии миокарда у крыс / Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, П.П. Щетинин, Т.М. Плотникова // Материалы шестой Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». - Москва, 2013. - С. 434-435.

7. Щетинин П.П. Противоаритмическая активность диборнола в условиях модели острой ишемии/реперфузии миокарда // Бюллетень сибирской медицины. - 2013. - Т. 12, №3,-С. 153-156.

8. Плотникова Т.М. Гемореологические эффекты диборнола в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда / Т.М. Плотникова, Г.А. Чернышева, В.А. Смольякова, П.П. Щетинин, A.B. Кучин, И.Ю. Чукичева, М.Б. Плотников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157, №2. - 173-177.

9. Смольякова В.И. Эндотелийпротективная активность диборнола в условиях модели острой ишемии/реперфузии миокарда / В.И. Смольякова, П.П. Щетинин, Т.М. Плотникова, A.B. Кучин // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 7 (4). - С. 790794.

Патент на изобретение

Пат. 2499593 Российская Федерация, МПК А61К 31/05, А61К 31/015, А61Р 9/10. Противоишемическое средство / Плотников М.Б., Чернышева Г.А., Смольякова В.И., Щетинин П.П., Плотникова Т.М., Кучин A.B., Чукичева И.Ю.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН. - опубл. 27.11.13, Бюл. № 33.-8 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

БТП - богатая тромбоцитами плазма

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИДЭ - индекс деформируемости эритроцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ПЗФ - пространственно затрудненные фенолы

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СПВК — синдром повышенной вязкости крови

ЭКГ - электрокардиограмма