Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование эндотелиопротективных эффектов метформина и пиоглитазона при моделировании фруктоз- и стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета на фоне овариэктомии

На правах рукописи

005014а їй

Маяков Александр Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ МЕТФОРМИНА И ПИОГЛИТАЗОНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ФРУКТОЗ- И СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА НА ФОНЕ ОВАРИЭКТОМИИ

Специальность 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 2 ;.:др 2072

Курск-2011

005014916

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Покровская Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Яснецов Владимир Викторович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства

здравоохранения и социального развития

Российской Федерации

Защита состоится «/Гг. в /Х^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при~Г^дарственном бюджетном образовательном учреждении высшего профес^ионГьнош образования «Курский государственный медицинский $ униве"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан Д-.

Учёный секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В патогенезе и клинике сердечнососудистых заболеваний и их осложнений, в частности сахарного диабета у женщин пожилого возраста, одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия и, как следствие, появление на фоне инсулинорезистентности и гипоэстрогении тяжелых васкулярных изменений. Развитие эндотелиальной дисфункции отличается отсутствием клинической симптоматики и обратимостью ранних этапов изменений сосудистой выстилки, что имеет важное значение для предотвращения сосудистых осложнений (Karen Е. MacKenzie et al., 2006). Нарушение эндотелийзависимой вазодилатации может быть напрямую связано со снижением синтеза и биодоступности эндотелиального оксида азота (NO) и/или повышением образования реактивных образований кислорода в частности супероксида. При сахарном диабете окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе сосудистых осложнений, причем эндотелиальная дисфункция считается ранней стадией этих нарушений (Е. Schulz et al., 2004, М. Britten, 1998). Гипергликемия напрямую способствует развитию эндотелиальной дисфункции, в том числе процессу избыточного образования супероксида и, следовательно, пероксинитрита, который повреждает ДНК и активирует ядерный фермент поли/АДФ-рибозил/полимеразу (U. Hink, Н. Li, Н. Mollnau et al, 2001), что обусловливает развитие острой эндотелиальной дисфункции в пораженных сосудах при сахарном диабете и играет важную роль в патогенезе диабетических осложнений. Коррекцию эндотелиальной дисфункции наряду с контролем традиционных факторов риска сахарного диабета следует рассматривать как стратегическую линию эффективного предупреждения кардиометаболических нарушений.

Очевидна необходимость в сахароснижающих препаратах, которые будут способствовать снижению инсулинорезистентности, гиперинсулинемии и обладать возможностью восстановления нарушенной функции эндотелия (Г. Шернтанер, 2008). В своём аппликативном приложении разрабатываемая концепция нуждается в экспериментальной оценке возможности использования средства, подавляющего глюконеогенез и образование свободных жирных кислот и окисление жиров - метформина и средства, снижающего инсулинорезистентность, выброс глюкозы из печени и увеличивающего расход инсулинозависимой глюкозы - пиоглитазона на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной моделях сахарного диабета, в механизме действия которых опосредованно участвует NO-зависимый компонент.

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств метформина, пиоглитазона и их комбинации при экспериментальном дефиците оксида азота в условиях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного метаболических нарушений.

Цель исследования: провести экспериментальное изучение

эндотелиопротективных свойств метформина, пиоглитазона и их комбинаций на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной моделях сахарного диабета.

Задачи исследования:

1. Изучить в эксперименте развитие эндотелиальной дисфункции на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной модели сахарного диабета с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить в эксперименте развитие эндотелиальной дисфункции на гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной модели сахарного диабета с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

3. Исследовать эндотелиопротективную активность пиоглитазона в дозе 5,5 мг/кг/сут. (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной моделях сахарного диабета.

4. Исследовать эндотелиопротективную активность метформина в дозе 90 мг/кг/сут. (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной моделях сахарного диабета.

5. Исследовать эффективность сочетанной эндотелиотропной терапии метформина (90 мг/кг/сут.) (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) с пиоглитазоном (5,5 мг/кг/сут.) (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) на гипоэстроген-фруктоз-индуцированной и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной моделях сахарного диабета.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложены экспериментальные способы моделирования гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Продемонстрировано, что метформин 90,0 мг/кг (ежедневно однократно внутрижелудочно в течение 42 суток) оказывает эндотелиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированных метаболических нарушений. Пиоглитазон 5,5 мг/кг (ежедневно однократно внутрибрюшинно в течение 42 суток) как монотерапия также обладает эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Сочетанное использование гипогликемических средств метформина 90,0 мг/кг/сут. и пиоглитазона 5,5 мг/кг/сут. показало положительное фармакодинамическое взаимодействие.

Научная новизна подтверждается получением одного патента РФ на изобретение.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность сочетанного применения метформина в дозе 90 мг/кг/сут. с пиоглитазоном в дозе 5,5 мг/кг/сут. для профилактики и коррекции эндотелиальной дисфункции на фоне метаболических нарушений (инсулинорезистентность, гипоэстрогения) в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения

сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с последующим снижением значения коэффициента эндотелиальной дисфункции, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (концентрация стабильных метаболитов оксида азота, экспрессию Ш-синтетазы, уровня гликемии), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности, и т.д.) и нормализовать уровень гликемии.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания комбинации метформина и пиоглитазона в терапевтических дозах для профилактики и коррекции состояний, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией на фоне метаболических нарушений.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности метформина, пиоглитазона и их комбинаций используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет» с целью формирования представления о фармакологической активности данных препаратов.

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных.

В публикациях № 8, 9 , 10 автором лично проведено моделирование дизайна исследования, в публикации № 5, 7 - научное обоснование и обобщение полученных результатов, № 3 - статистическая обработка полученных результатов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2009 и 2010 гг., IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков, XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство», V Конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология», в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»), БелГУ, 2010 г. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО, фармацевтической химии и фармакогнозии, терапии ИПМО, анатомии и гистологии человека, медико-биологических дисциплин, биохимии и фармакологии НИУ БелГУ, клинической фармакологии КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 в изданиях рекомендуемых ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции соответственно в 3,3 и 2,8 раза, резким снижением показателей биохимических маркеров (стабильных метаболитов оксида азота, экспрессия ЫО-синтазы, уровня эндотелина), а также характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, адренореактивности и т.д.) и нарастанием инсулинорезистентности.

2. Применение метформина в дозе 90,0 мг/кг/сут. однократно в сутки внутрижелудочно в течение 42 суток оказывает эндотелиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированных метаболических нарушений. Пиоглитазон в дозе 5,5 мг/кг/сут. также обладает эндотелио- и кардиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Выявлено положительное влияние на функциональные, биохимические и морфологические показатели.

3. Сочетанное использование пиоглитазона в дозе 5,5 мг/кг/сут. с метформином в дозе 90,0 мг/кг/сут. оказывает выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированных метаболических нарушений, что выражается в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота и восстановлении уровня гликемии. При этом достигаются целевые цифры артериального давления, в отличие от монотерапии отдельно пиоглитазоном и метформином. Морфологические исследования позволили обнаружить предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы, включающего 174 источника, из них 73 - отечественных и 101 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 39, рисунков - 34.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Опыты проводились на половозрелых белых крысах самках линии \Vistar массой 250-300 г. Животных рандомизировали по полу и весу.

Моделирование эндотелиальной дисфункции в условиях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета. В первый день эксперимента у самок проводилась

билатеральная овариэктомия: под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) хирургическим путем вскрывали брюшную полость и удаляли оба яичника. В дальнейшем на протяжении 6 недель в корм животных добавляли фруктозу, удельный вес которой равен 60% от общего рациона пищи (S.H. Zhou et al, 2005). Животных разделяли на ряд экспериментальных групп. В первой из групп в течение всего срока кормления ежедневно однократно вызывали болевое раздражение хвоста электрическим током (длительностью 10 мс, напряжением 30 В, силой 0,66 мА) (Г.Н. Кассиль, 1975), пропускаемым через электроды, наложенные на смоченный физиологическим раствором хвост животного. Положительный электрод прикрепляли на расстоянии 1 см от корня хвоста, отрицательный — в полутора сантиметрах книзу от него. В другой группе животным на 6-ой неделе после овариэктомии, помимо кормления фруктозсодержащей диетой, в центральную вену хвоста в течение 5 суток вводили стрептозотоцин (Sigma, USA) в дозе 45 мг/кг (К. Srinivasan, Р. Ramarao, 2007), ежедневно однократно, не нанося электрического раздражения.

Еженедельно, однократно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента измеряли уровень глюкозы в крови, взятой из вены хвоста животных, при помощи глюкометра Satellit Plus (Россия). Также проводился тест толерантности к глюкозе, натощак, путем перорального введения глюкозы (3 г/кг) (З.И. Цюхно и соавт., 1981; В.Г. Баранов, 1983) и регистрации уровня глюкозы на протяжении 120 минут при помощи глюкометра с оценкой результатов по A.B. Древаль (2005). В течение кормления еженедельно измеряли показатели артериального давления (САД, ДАД и СрАД) с использованием неинвазивного датчика измерения кровяного давления у мелких животных на хвосте Doc-NIBP200A, производства Biopac System, Inc., США. На 43-й день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в сонную артерию для регистрации показателей артериального давления, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в левую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление и частоту сердечных сокращений измеряли непрерывно посредством датчика TSD104A аппаратно-программного комплекса МР100, производства Biopac System, Inc., США. Проводили следующие функциональные сосудистые пробы - эндотелийзависимая вазодилатация с внутривенным введением ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг(1В. Laursen, 1997), эндотелийнезависимая вазодилатация -внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (М.Е. Галаган, 1991). Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень её коррекции исследуемыми препаратами оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции, представляющему собой отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (ЭНВД) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (ЭЗВД) (М.В. Покровский, 2005).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании.

Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика TSD104A аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System, Inc., США и компьютерной программы «AcqKnowledge(TM)» регистрировали показатели кардиогемодинамики: левожелудочковое давление, максимальную скорость сокращения, максимальную скорость расслабления, частоту сердечных сокращений и интенсивность функционирования структур (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт.ст. х уд. мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1"10"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г.). При проведении данной пробы проводилась оценка максимального подъема ЛЖД в ответ на введение адреналина (Ф.З. Меерсон, 1980).

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек.). После проведения данной пробы рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва (выраженный в процентах), равный отношению прироста ЛЖД на 5 секунде пережатия аорты к приросту ЛЖД на 25 секунде пережатия аорты (Ф.З. Меерсон, 1980).

3. Трехминутную гипоксию с последующей реоксигенацией (E.H. Пашин,

1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (В.А. Метельская, Н.Г. Туманова, 2005).

Методы морфологического исследования. Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента, почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Сердца рассекали через середину во фронтальной плоскости в виде пластин толщиной 2 мм, в которых содержались оба предсердия, правый и левый желудочки, межжелудочковая перегородка. Окраску срезов гематоксилином и эозином производили в автоматическом режиме в автостейнере HMS 740 (Microm Int. GmbH, Германия) для выявления ранних повреждений кардиомиоцитов. При морфометрии сердца использовано определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова. Просмотр, анализ и морфометрию осуществляли с помощью программы просмотра и анализа изображений Mirax Viewer 1.12.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная активность противодиабетических препаратов метформина и пиоглитазона на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

В хронических экспериментах при моделировании гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета метформин вводился в дозе 90 мг/кг один раз в сутки внутрижелудочно в

течение 42 дней. Пиоглитазон (субстанция «Пиоглитазон», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства») вводился внутрибрюшинно, один раз в сутки в течение 42 дней, в дозе 5,5 мг/кг, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное эндотелио- и кардиопротективное действие препарата в экспериментах.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на лабораторных крысах.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических н морфологических показателей при моделировании гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Измерение уровня глюкозы натощак на протяжении 6-ти недель не выявило изменения значений во всех исследуемых группах животных относительно нормальных показателей. В то время как на 6-ой неделе после начала введения стрептозотоцина у животных уровень гликемии натощак был достоверно выше. При проведении теста толерантности к глюкозе на 6-ой неделе эксперимента, наблюдался стойкий уровень гликемии к 120 минуте в группе с гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологией (ГСИП) относительно интактных животных, в то время как, в группе гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологии (ГФИП) наблюдалось незначительное снижение уровень гликемии к 120 минуте (рис. 1).

Измерение уровня среднего артериального давления неинвазивным способом в течении 6-ти недель выявило достоверное его повышение в контрольных группах по сравнению с интактными животными, при этом отмечалось большее значение гипертензии при ГСИП (рис. 1).

Длительное, в течение 42 суток, воспроизведение метаболических нарушений при ГФИП и ГСИП привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группах с моделированием сахарного диабета в отличие от интактных животных, что выражалось в повышении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин. В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при гипоэстроген-фруктоз-

индуцированной эндотелиальной дисфункции - в 3 раза больше: его значение составило 3,3±0,3, а при гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированном дефиците N0 - 2,8±0,4 (рис. 1).

, „моль/л Тест толерантности к глюкозе ' ^ неинвазивньш способе"

мм рт.ст.

350 300 250 200 150 100 50

-Интактные

■ Гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология - Гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированная патолс

АД

В Интактные

О Гипоэстрогс1н|>руктоа-индч цированная патология 0 Гипоэстроген-стрептозотоцш[-инд}. цированная патология

кэд

186,4* 182,7*

цш 118,1

сдд

ДАД '94,8 131,4* 130,7* -1

Интактные

ГФИП

ГСИП

мм рт-ст. Проба на адренореактнвность -245,7'''

250 240 230 220 210 200 190

206,8

237,7"

Интактные ГФИП ГСИП Нагрузка сопротивлением

89,2%

70 -60 ■

Интактные

ГФИП

ГСИП

мкМоль/1 Концентрация стабильных метаболитов N0

135

66,7%* Ч ♦

_ _63%* -,

-5"-ПГ-те" ЯГ 15й

— Интактные

— Гипоэстроген-фрукгоз-индуиироаанная патология

— -Гипоэстроген-стретгоотоцин-шиуцировакная патология

Диаметр кардиомноцнтов

ГФИП

ГСИП

ГФИП

ГСИП

Рисунок 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Примечание: * - при р < 0,05 в сравнении с данными группы интактных животных.

Моделируемые метаболические нарушения приводили к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением. У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 89,2±2,5%, у животных с гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологией до уровня -66,7±3,0%, а у животных с гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологией значительно ниже-до 63±2,2% (рис. 1).

Характерная динамика биохимических маркеров метаболически обусловленного дефицита N0 представлена на рисунке 1. Обнаружено, что моделирование гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологии приводило к снижению концентрации стабильных метаболитов N0 в 1,61 и 1,51 раза соответственно.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной ЭД, явились результаты морфологических исследований (рис. 2). Наглядно видно, что площадь сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении.

■ИР*

,:......

р

■л*

-

¡¡¡■И

■

«я

щ

'г«,

-.« к .. ^ —

в.

щШг

: Ш

Рисунок 2. Морфология миокарда у интактных и опытных животных: а -гистологическая картина миокарда у интактных крыс на продольном срезе; б -гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крысы с артериальной гипертензией при гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологии на продольном срезе; в -при гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологии - гипертрофия кардиомиоцитов, стенки утолщены, ядра в виде частокола. Окр. гематоксилином и эозином. Масштаб - х440.

Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 8,6±0,2 мкм, у животных с ГСИП - 10,7±0,2 мкм, а у животных с ГФИП - 11,8±0,2 мкм (рис. 1).

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что через 6 недель после проведения билатеральной овариэктомии, у лабораторных животных, которые получали фруктозсодержащую диету и испытывали болевое раздражение или которым последние 5 суток эксперимента внутривенно вводился стрептозотоцин (45 мг/кг), развивается комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с прогрессирующим нарастанием

инсулинорезистентности, утратой эндогенных эстрогенов и опосредованном развитии дефицита N0.

2. Исследование эндотелиопротективной активности метформина, пиоглитазона и их комбинации при гипоэстроген-фруктоз-индуцированном сахарном диабете в эксперименте.

В эксперименте показано, что метформин и пиоглитазон приводят к снижению уровня гликемии в тесте толерантности к глюкозе к 120-ой минуте до исходных значений. При этом сочетание исследуемых препаратов не вызывало резкого подъема гликемии в тесте к 20-ой минуте в отличие от контрольной группы и способствовало плавному снижению уровня глюкозы крови к исходным значениям до 4,5±0,1 ммоль/л на 120 минуте (рис. 3).

Измерение уровня среднего артериального давления неинвазивным способом не выявило достоверное его повышение в исследуемых группах с применением пиоглитазона и метформина по сравнению с интактными животными. Наилучший гипотензивный эффект выявляло сочетанное применение пиоглитазона и метформина, способствуя удержанию уровня АД к концу 6-ой недели на уровне сопоставимом со значениями 2-ой недели эксперимента (рис. 3).

Наши исследования показали, что комбинация метформина в дозе 90 мг/кг/сут. и пиоглитазона в дозе 5,5 мг/кг/сут. обладает выраженным эндотелиопротективным эффектом. Так, КЭД у интактных животных составил

- 1,1±0,1, с гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологией - 3,3±0,3, ГФИП+ метформин - 1,6±0,2, ГФИП + пиоглитазон - 1,4±0,2 и ГФИП + комбинация метформина и пиоглитазона - 1,3±0,1 (рис. 3).

Отмечено, что и монотерапия, и комбинация исследуемых препаратов предотвращали повышение адренореактивности, вызванное гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологией. У интактных животных показатели сократимости левого желудочка сердца составили 206,8± 1,2 мм рт.ст., у ГФИП

- 245,7±4,7 мм рт.ст., в группе с коррекцией метформином - 227,6+3,3 мм рт.ст., в группе с коррекцией пиоглитазоном - 219,6±3,4 мм рт.ст. и в группе с применением комбинации метформина и пиоглитазона - 215+3,0 мм рт.ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением приём исследуемых противодиабетических препаратов предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 3). Сократимость на 25 секунде нагрузки составила у интактных животных - 89,2±2,5% к 5-й сек, взятой за 100%. Гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология - 63±2,2%, с коррекцией метформином - 70,9±1,8%, с коррекцией пиоглитазоном - 73,7±3,7% и с коррекцией комбинацией метформина и пиоглитазона - 75,8±2,1%.

Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие противодиабетических препаратов метформина и пиоглитазона, в большей степени в комбинации, выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых

моделировали гипоэстроген-фруктоз-индуцированный сахарный диабет.

.,.,„„./„ ~ ммрт.ст. СрАД определяемое неинвазивным способом

ммоль/л Гест толерантности к глюкозе >оЛ .

- ИнтактнЫе

- Гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология ■ - ГФИП + пиоглитазон

- ГФИП + метформин

- • ГФИП + пиоглитазон + метформин

1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 5 неделя б неделя Ш Интактные

□ Гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология Ш ГФИП + пиоглитазон

□ ГФИП 1 метформин

□ ГФИП + пиоглитазон + метформин

3,3" кэд

1,1 1,4*" ™ 1,3**

3 Г"

в

ГФИП + ГФИП +

метформин ПИОГЛИТП'ЮП + метформин

Проба на адренореактивность -245,7*-

227,6**

219,6**7

мкМоль/л Концентрация стабильных метаболитов N0

"123^-

ИЗ,2я

1

*

ГФИП + ГФИП +

мсп]>ормш1 пиоглитазон + метформин

Нагрузка сопротивлением

----_ 89,2%

\ -"^♦73,7%** Ч ' 70,9%"

н

мкм

13 ■ 12 ■ 11 ■

10 ■ 9 ■

" Гнпоэстроген-фр\'кто!-индуцированпая - ГФИП + пиоглитазон ГФИП + метформин

• ГФИП + пиоглитазон + метформин

Диаметр кардномноцитов

-11,9*-

10,7**

8,6

9,7**

ГФИП + ГФИП + ГФИП + пиоглитазон метформин пиоглитазон + метформин

Рисунок 3. Влияние пиоглитазона (5,5 мг/кг/сут.), метформина (90 мг/кг/сут.) и их комбинации на функциональные, биохимические и морфологические показатели на фоне гипоэстроген-фруктоз-индуцированного сахарного диабета. Примечание: * - при р < 0,05 в сравнении с данными группы интактных животных; ** - при р < 0,05 в сравнении с данными группы животных с гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологией.

Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие противодиабетических препаратов метформина и пиоглитазона, в большей степени в комбинации, выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали гипоэстроген-фруктоз-индуцированный сахарный диабет.

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота под влиянием исследуемых противодиабетических препаратов как в качестве монотерапии, так и сочетанном их использовании увеличивалась и статистически приближалась к показателям интактных животных (рис. 3).

Монотерапия пиоглитазоном и его комбинация с метформином статистически достоверно предотвращали увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов (рис. 3).

Таким образом, комбинированное использование пиоглитазона 5,5 мг/кг/сут. с метформином 90 мг/кг/сут. оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели гипоэстроген-фруктоз-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в плавном контроле уровня гликемии, в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиапьной дисфункции до уровня, близкого интактным животным, а также в предотвращении снижения концентрации свободных метаболитов оксида азота. Важно подчеркнуть, что при этом достигались заданные цифры артериального давления, что не выявлено при монотерапии отдельно пиоглитазоном и метформином. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и снижение инотропного резерва на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации пиоглитазона с метформином поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с гипоэстроген-фруктоз-индуцированной патологией.

3. Исследование эндотелиопротективной активности метформина, пиоглитазона и их комбинации при гипоэстрогеи-стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете в эксперименте.

Использование на 6-ой неделе после начала введения стрептозотоцина исследуемых препаратов удерживало уровень гликемии натощак и составило в среднем при лечении пиоглитазоном 5,5 мг/кг- 7,5±0,1 ммоль/л, метформином 90 мг/кг - 8,3±0,1 ммоль/л и комбинацией этих препаратов - 7,3±0,1 ммоль/л. При проведении теста толерантности к глюкозе на 6-ой неделе эксперимента уровень гликемии приближались к исходному на 120 минуте в группах с применением метформина и пиоглитазона и соответственно составили 8,5±0,2 и 7,4±0,2 ммоль/л. В комбинации пиоглитазона и метформина этот показатель был 7,2±0,2 ммоль/л, колебания уровня глюкозы в тесте носили плавный характер (рис. 4).

Измерение уровня среднего артериального давления неинвазивным способом в исследуемых группах с применением пиоглитазона, метформина и комбинации исследуемых препаратов после введения животным подопытных групп стрептозотоцина (в/в, 45 мг/кг, однократно в течение 5 дней) на 6-ой неделе эксперимента находилось на уровне 164,4±2,0, 163,7±1,7 и 161,3±2,8 мм рт.ст. соответственно, что в свою очередь достоверно ниже уровня АД в контрольной группе животных- 173±2,8 мм рт.ст. У интактных животных этот показатель составил 135,5±2,1 мм рт.ст. (рис. 4).

Как показали исследования комбинация метформина в дозе 90 мг/кг/сут. и пиоглитазона в дозе 5,5 мг/кг/сут. обладает значимым эндотелиопротективным эффектом на фоне гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологии. Так, КЭД у интактных животных составил -1,1±0,1, с ГСИП - 2,8±0,4, ГСИП+ метформин - 1,8±0,2, ГСИП + пиоглитазон -1,6±0,1 и ГСИП + комбинация метформина и пиоглитазона - 1,5±0,1 (рис. 4).

В экспериментах на открытом сердце обнаружено достоверное предотвращение повышения адренореактивности комбинацией исследуемых препаратов на фоне гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологией. У интактных животных показатели сократимости левого желудочка сердца составили 206,8± 1,2 мм рт.ст., у ГСИП - 237,7±1,9 мм рт.ст., в группе с коррекцией метформином - 231 ±3,0 мм рт.ст., в группе с коррекцией пиоглитазоном - 221,5±3,1 мм рт.ст. и в группе с применением комбинации метформина и пиоглитазона - 219,5±3,9 мм рт.ст. При проведении пробы на нагрузку сопротивлением приём исследуемых противодиабетических препаратов предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 4). Сократимость на 25 сек нагрузки составила у интактных животных - 89,2±2,5% к 5-й сек, взятой за 100%. Гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология - 66,7±3,0%, с коррекцией метформином -68,8±3,6%, с коррекцией пиоглитазоном - 70,6±2,5% и с коррекцией комбинацией метформина и пиоглитазона - 78±4,0%.

Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили кардиопротективное действие противодиабетических препаратов метформина и пиоглитазона, в большей степени при сочетанном применении, выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет.

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота под влиянием пиоглитазона и метформина увеличивалась и статистически приближалась к показателям интактных животных (рис. 4). Наилучшие показатели наблюдались в группе с коррекцией комбинацией метформином и пиоглитазоном.

Исследуемые противодиабетические препараты статистически достоверно предотвращали увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов (рис. 4). Наилучшая эффективность наблюдалась при монотерапии

пиоглитазоном.

Тест толерантности к глюкозе

мМоль/л 18 -16 -14 ■ 12 • 10 ■

СцАД определяемое непнвя'швным способом

"Тіїі-

ТІО^-*'

-Л«4*

—I-1-1-1

— Интактные

т Гипоэстрогсн-стрсптозотоцин-индуц

- ГСИП + пиоглитазон ГСИП + метформин

• ГСИП + пиоглитазон + метформин

1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 5 неделя б недел* ■ Интактные

□ Гипоэстрогсн-стрсптозотоцин-индуцированная патология

□ ГСИП + пиоглитазон

□ ГСИП + метформин

□ ГСИП + пиоглитазон + мет«|юрмин

Концентрация стабильных метаболитов N0

10" 15" 20" 25

[нтактные

■ Гипоэстроген-стрегггозотоцин-индуцировагашя патология - ГСИП + пиоглитазон ГСИП + метформин

• ГСИП + пиоглитазон + метформин

Диаметр кардиомноцитов

Рисунок 4. Влияние пиоглитазона (5,5 мг/кг/сут.), метформина (90 мг/кг/сут.) и их комбинации на функциональные, биохимические и морфологические показатели при гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологии. Примечание: * - при р < 0,05 в сравнении с данными группы интактных животных; ** - при р < 0,05 в сравнении с данными группы животных с гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологией.

Таким образом, сочетанное применение пиоглитазона 5,5 мг/кг/сут. с метформином 90 мг/кг/сут. оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в снижении уровня гликемии, коэффициента эндотелиальной дисфункции, а также в предотвращении снижения концентрации свободных метаболитов оксида азота, повышения адренореактивности и снижения миокардиального резерва. Важно подчеркнуть, что при этом достигались заданные цифры артериального давления, что не регистрировалось при монотерапии отдельно пиоглитазоном и метформином. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и снижение инотропного резерва на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации пиоглитазона с метформином поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной патологией.

ВЫВОДЫ

1. Через 6 недель после билатеральной овариэктомии, фруктозсодержащей диеты и болевого раздражения электрическим током у крыс-самок развивается эндотелиальная дисфункция, выражающаяся в увеличении значения коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3 раза выше по сравнению с интактной группой животных; в высоком уровне гликемии на 120 минуте при проведении теста толерантности к глюкозе относительно интактных животных; развитие выраженной артериальной гипертензии, гиперреактивности на адреналовую пробу и снижении сократительной способности миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением; снижении содержания стабильных метаболитов оксида азота и гипертрофии кардиомиоцитов.

2. Через 6 недель после билатеральной овариэктомии, фруктозсодержащей диеты и внутривенного введения стрептозотоцина (45 мг/кг/сут.) в течение последних 5 дней эксперимента у крыс-самок развивается эндотелиальная дисфункция. В частности, коэффициент эндотелиальной дисфункции оказался в 2,5 раза выше, чем у интактных животных; на 43 сутки отмечался высокий уровень гликемии натощак и в тесте толерантности к глюкозе на 120 минуте относительно интактных животных; развивалась выраженная артериальная гипертензия, гиперреактивность на адреналовую пробу; снижалась сократительная способность миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота и гипертрофии кардиомиоцитов.

3. Пиоглитазон в дозе 5,5 мг/кг/сут. в течение 42 суток проявляет выраженное эндотелиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражается в преобладании эндотелийзависимого

расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до 1,4±0,2 и 1,6±0,1 соответственно, тогда как у интактных животных данный показатель равен 1,1±0,1, а также в предотвращении снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота, плавном снижении уровня гликемии до исходных значений. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и снижения миокардиального резерва. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием пиоглитазона 5,5 мг/кг/сут. увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с метаболическими нарушениями. Монотерапия пиоглитазоном в дозе 5,5 мг/кг/сут. не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

4. Метформин в дозе 90 мг/кг/сут. проявлял эндотелиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей, уступающее пиоглитазону в дозе 5,5 мг/кг/сут. Значения коэффициента эндотелиальной дисфункции, артериального давления, поперечного диаметра кардиомиоцитов, концентрация стабильных метаболитов оксида азота не показали достоверных отличий по сравнению с соответствующими значениями в группах животных, получавших монотерапию пиоглитазоном 5,5 мг/кг/сут. и комбинацию исследуемых препаратов. В пробе на адренореактивность коррекция метформином в меньшей степени предотвращала развитие гиперадренореактивности, чем коррекция пиоглитазоном.

5. Комбинированное использование пиоглитазона 5,5 мг/кг/сут. с метформином 90 мг/кг/сут. оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на моделях гипоэстроген-фруктоз- и гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось как в контроле уровня гликемии как натощак, так и в тесте толерантности к глюкозе, в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, абсолютных значений левожелудочкового давления при проведении пробы на адренореактивность, повышении миокардиального резерва в пробе на нагрузку сопротивлением и в полном предотвращении снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота. При этом достигались целевые цифры артериального давления, что не выявляла монотерапия пиоглитазоном и метформином. Морфологические исследования обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием комбинации пиоглитазона с метформином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / М. В. Покровский, В. И. Кочкаров, А. И. Маяков [и др.] // Russian journal of immunology. - 2006. - Vol. 9, № 3. - P. 59-63. (Перечень ВАК)

2. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М. В. Покровский, В. И. Кочкаров, А. И. Маяков [и др.] / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар, 2006. -№ 10 (91) - С. 72-77. (Перечень ВАК)

3. Маяков, А. И. Метаболически обусловленная эндотелиальная дисфункция / А. И. Маяков // Приволжский научный вестник. - 2011. - № 2. -С. 88-91.

4. Способы экспериментального моделирования эндотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, А. И. Маяков [и др.] // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 327. (Перечень ВАК)

5. Воспроизведение стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс / А. И. Маяков, М. В. Покровский, Т. Г. Покровская [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12. - С. 58-65. (Перечень ВАК)

6. Коррекция гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом импаза в комбинации с эналаприлом / А. С. Белоус, А. А. Арустамова, А. И. Маяков [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. -№ 10, вып. 14. - С. 192-195. (Перечень ВАК)

7. Способ моделирования эндотелиальной дисфункции путем воспроизведения метаболических нарушений / А. И. Маяков, М. В. Покровский, Т. Г. Покровская [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. -2011. -№ 10, вып. 14. - С. 196-201. (Перечень ВАК)

8. Маяков, А. И. Модель фруктоз-индуцированной эндотелиальной дисфункции / А. И. Маяков, М. В. Маякова, М. В. Корокин // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г.) Т. I. / под ред. В.А. Лазаренко - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. -С. 274-276.

9. Эндотелиальная дисфункция на фоне фруктоз-индуцированной модели метаболических нарушений у крыс / А. И. Маяков, Т. Г. Покровская, М. В. Покровский [и др.] // Человек и лекарство: сб. материалов XVII Рос. нац. конгр. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.): тез. докл. - М., 2010. - С. 676-677.

10. Развитие эндотелиальной дисфункции у крыс на фоне стрептозотоцин-индуцированной модели с применением фруктозы / А. И. Маяков, Т. Г. Покровская, М. В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. тр. межвуз. науч. конф., посвященной памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - С. 252-253.

11. Способ моделирования эндотелиальной дисфункции путем воспроизведения метаболических нарушений: пат. на изобретение 2412714 Рос.

Федерация: А61К 31/733. / А. И. Маяков, М. В. Покровский, Т. Г. Покровская [и др.] ; заявитель и патентообладатель Курский гос. мед. ун-т. - № 2009130143/15; заявл. 05.08.2009; опубл. 27.02.2011,Бюл. №6. -8 е.: 1 ил.

Список сокращений

АГ - артериальная гипертензия АД - артериальное давление АХ - ацетилхолин

ГЛЖ - гипертрофия левого желудочка ГМК - гладкомышечная клетка

ГСИП - гипоэстроген-стрептозотоцин-индуцированная патология

ГФИП - гипоэстроген-фруктоз-индуцированная патология

ДАД - диастолическое артериальное давление

ИР - инсулинорезистентность

ИФС - интенсивность функционирования структур

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

MC - метаболический синдром

НП - нитропруссид натрия

РААС - ренин - ангиотензин - альдостероновая система

САД - систолическое артериальное давление

СД - сахарный диабет

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

ЭЗВ - эндотелийзависимая вазодилатация

ЭНЗВ -эндотелийнезависимая вазодилатация

+dp/dt - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления -dp/dt - максимальная скорость снижения левожелудочкового давления NO - оксид азота

PPAR - рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом

Статистические показатели

р - уровень статистической значимости * - достоверность различий, р < 0,05

Маяков Александр Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ МЕТФОРМИНА И ПИОГЛИТАЗОНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ФРУКТОЗ- И СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА НА ФОНЕ ОВАРИЭКТОМИИ

Автореферат

Подписано в печать 27.12.2011 г. Формат 60x80 1/16. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 136.

Отпечатано в ООО «Учитель» 305004, г. Курск, ул. Садовая, 31