Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Полуколичественный экспресс-метод определения С3 и С4 компонентов системы комплемента

На правах рукописи УДК 615 38+612 017-576 8 097 37

тоинов

Александр Александрович

ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЗ И С4 КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

14 00 29 - гематология и переливание крови 14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3г:

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2008

Работа выполнена в ГУРК «Кардиологический диспансер», г Сыктывкар, на кафедре нормальной физиологии Коми филиала ГОУ ВПО "Кировская государственная медицинская академия", г Сыктывкар

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор

Шардаков Виктор Иванович

доктор медицинских наук, Мороков Владимир Аркадьевич

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Калинина Наталия Михайловна

кандидат медицинских наук, доцент Волкова Ольга Ярославовна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение

дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования»

заседании диссертационного совета Д 208 074 01 Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (193024, г Санкт-Петербург, ул 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии Автореферат разослан «¿?Л> uitUL 2008г

Ученый секретарь

диссертационного совета ^ ^

Защита диссертации состоится Uhpt~t~e. 2008г в «. 1Н

» часов на

доктор медицинских наук

ГЛАЗАНОВАТВ

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Система комплемента является важным участником разнообразных реакций иммунитета С одной стороны, адекватная активность системы комплемента очень важна в защите организма от различных (главным образом инфекционных) агентов С другой стороны, активированный комплемент может представлять серьезную опасность для собственных клеток организма и способен повредить их Доказательством тому является участие комплемента в патогенезе различных, главным образом, аутоиммунных реакций В силу этих причин система комплемента, признанная одной из т н «сторожевых» систем крови, привлекает внимание клиницистов Система комплемента очень сложна и состоит из более чем 20 компонентов и субкомпонентов Она может быть активирована несколькими путями (Lambris J D , 2005, Козлов Л В , 2005)

Известно, что ключевыми по своей значимости компонентами комплемента являются СЗ и С4, первый из них участвует во всех путях активации системы Следовательно, оценка их количественных и качественных характеристик in vitro представляется актуальной Достигнуты определенные успехи в изучении компонентов системы комплемента, предложены различные количественные методики, которые, однако, не лишены своих недостатков Так, методы, основанные на учете гемолиза, являются длительными и трудоемкими в исполнении о состоянии компонентов комплемента в этих случаях судят не прямо, а косвенно, по гемолизу эритроцитов-мишеней (Козлов Л В, 2002) Еще одним существенным недостатком этих техник является использование ксеногенной индикаторной системы, когда эритроциты барана сенсибилизированы кроличьими антителами Более того, для определения некоторых компонентов используется сыворотка крови морской свинки, также ксеногенный по своей природе материал Нефелометричекие методики, когда с помощью моноклональных антител можно определить количественное содержание различных компонентов, более современны и прогрессивны Вместе с тем, и эти методические варианты имеют свои недостатки Они являются дорогостоящими, поскольку необходимы специальные оборудование (нефелометры) и тест-системы (диагностические наборы моноклональных антител), преимущественно импортного производства Таким образом, несмотря на достигнутые успехи, возможности прогресса в этом направлении отнюдь не исчерпаны По нашему мнению, могут быть разработаны и с успехом использованы быстрые в исполнении методики определения СЗ и С4, основанные на принципиально других методических подходах При определенных условиях такие клетки крови как эритроциты человека могут быть очень быстро сенсибилизированы компонентами СЗ и С4 Их последующее полуколичественное определение с помощью простых в исполнении гемагглютинационных реакций не представляет каких-либо затруднений

Помимо количественных аспектов существуют и качественные аллогенные маркеры,

Список со!фащений на 23 стр

связанные с системой комплемента Так, компонент С4 несет аллоантигены групповой системы Chido/Rodgers, которые могут служить причиной аллоиммунизации во время беременности или в результате гемотрансфузии (Daniels G L 2007) В отечественной литературе мы не обнаружили каких-либо сведений о частоте встречаемости антител системы Chido/Rodgers и, тем более, о распределении этих факторов в популяции Известно, что выявление антител этой системы стандартными иммуногематологическими методами сопряжено с трудностями, поскольку, присутствуя даже в высоких титрах, они часто дают слабо выраженные реакции Таким образом, для выявления антител системы Chido-Rodgers необходимы другие методические подходы Наконец, в отечественной литературе, в отличие от неоднозначных данных зарубежных источников (Lambin Р, 1984, Nordhagen R, 1979, Westhoff СМ, 1992, Wibaut В, 1995), нет каких-либо сведений о клинической значимости антител этой системы

Цель исследования• разработка нового метода оценки СЗ и С4 компонентов системы комплемента, основанного на их адсорбции на аллогенных эритроцитах и изучение частоты распределения антител системы Chido-Rodgers у жителей республики Коми Задачи исследования:

1 Изучить особенности связывания компонентов СЗ и С4 системы комплемента с аллогенными эритроцитами в растворах низкой ионной силы

2 Разработать информативный и быстрый в исполнении метод определения компонентов СЗ и С4 комплемента, который не требовал бы для своего выполнения специального дорогостоящего оборудования, при этом результаты оценивались бы с помощью реакции гемагглютинации

3 Определить возможность определения антител системы Chido-Rodgers с использованием эритроцитов, сенсибилизированных С4, установить частоту встречаемости антител этой групповой системы у жителей республики Коми и оценить их клиническую значимость

Научная новизна. Установлено, что сенсибилизация аллогенных эритроцитов компонентами СЗ и С4 системы комплемента наступает в течение 3-х минут в растворах низкой ионной силы с использованием сахарозы При использовании КзЭДТА можно достичь сенсибилизации указанных клеток только компонентом С4 Такие эритроциты могут быть использованы как для оценки качества тест-систем анти-С4, так и наличия примесей анти-С4 в антиглобулиновых реагентах Показана возможность использования данного методического приема для полуколичественного определения СЗ и С4

Впервые предложен простой скрининговый метод выявления антител системы Chido-Rodgers, установлена частота их встречаемости у жителей республики Коми Показано, что в ряде случаев указанные антитела обнаруживают у лиц, не имевших беременностей и гемотрансфузий

Данных, которые могли бы указывать на клиническую значимость антител системы Оис1о-Ш^егв при проведении гемотрансфузиониой терапии, не получено

Практическая значимость Разработан простой и быстрый в исполнении полу количественный метод определения СЗ и С4 компонентов системы комплемента с оценкой результатов исследования в реакции гемагглютипации Показана возможность использования эритроцитов, сенсибилизированных С4, для оценки качества антиглобулиновых реагентов

Результаты работы внедрены в практику работы лаборатории иммуногематологии Коми республиканского кардиологического диспансера Основные положения, выносимые на защиту

1 Аллогенные эритроциты могут быть в течение короткого (до 3 минут инкубации) времени сенсибилизированы большими количествами СЗ- и С4 компонентов системы комплемента в растворах низкой ионной силы с использованием 10% раствора сахарозы Степень сенсибилизации эритроцитов СЗ и С4 прямо пропорциональна их содержанию в исследуемых сыворотках

2 Разработан полуколичественный ангиглобулшювьш метод определения компонентов СЗ и С4 системы комплемента, не требующий специального оборудования, а также ксеногенных материалов

3 Эритроциты, сенсибилизированные компонентом С4, позволяют в течете минуты выявить антитела системы С1пс1о/К.ос%егз в прямых агглютинационных методах Последние не имеют клинического значения в практике трансфузиологии и встречаются у жителей Республики Коми с частотой 0,67%

Апробация работы. Публикации Материалы диссертации представлены на научно-практической конференции, посвященной 10-летию Коми республиканского кардиологического центра (Сыктывкар, 2007), секции «Экологические аспекты демографической политики и особенности жизнеобеспечения населения на Российском Севере» 1У-го Северного социально-экологического конгресса (Сыктывкар, 2008), заседании кафедры медико-биологических дисциплин ГОУ ВПО «Коми Филиал Кировской государственной медицинской академии» (Сыктывкар, 2007), заседании Ученого Совета Кировского НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий (Киров, 2007) По результатам исследования опубликовано 8 работ Личное участие автора в получении результатов Автором лично разработаны методы определения СЗ и С4 компонентов системы комплемента и антител системы СМо/Шх^егв, лично осуществлялась экспериментально-клиническая апробация методов, определение антител системы СЬк1о/Кос^сг$ и статистическая обработка полученных результатов Структура и объем работы

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов исследования, результатов

исследования, заключения, выводов и списка литературы Список литературы включает 264 источника, из них 9 отечественных и 255 иностранных авторов Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 6 рисунками

Материалы и методы исследования

Материалы исследования

Материалом исследования служили сыворотки крови доноров, беременных женщин, родильниц, а также больных с аутоиммунными заболеваниями соединительной ткани и сердечно-сосудистой латологиеи На наличие антител системы Оидо/Яос^еге обследовано 890 человек При разработке метода определения СЗ и С4 компонентов комплемента исследовано 92 образца сывороток крови доноров Обшее количество исследований составило 1269

Таблица 1

Количество и характер исследований

п/п Наименование исследований Количество

1 Определение СЗ нефелометрическим методом 92

2 Определение С4 нефелометрическим методом 92

3 Определение СЗ антиглобулиновым методом 92

4 Определение С4 антиглобулиновым методом 92

Всего 368

Таблица 2

Определение антител системы Chido/Rodgers, группы обследованных

п/п Группа обследованных Количество

1 Доноры 610

2 Беременные 99

3 Больные артерио-венозными тромбозами 102

4 Больные системной красной волчанкой 33

S Дети с онкогематологическими (острые миело- и лимфолейкозы) заболеваниями 46

Всего 890

Общее число исследований (включая нефелометрические исследования) 1258

Методы исследований Для нефелометрического определения СЗ и С4 применяли наборы фирмы Turbox®, Финляндия в соответствии с рекомендациями производителя Были использованы поликлональные кроличьи сыворотки анти-СЗ и анти-С4 производства ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г H Габричевского»

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили методами, общепринятыми для медико-биологических исследований (Гланц) с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2000 в среде Windows 2000 Связь между переменными

величинами устанавштати путем вычислешм коэффициента ранговой коррелящш Спирмена г = 1- 6Id2/n(n2-l), где Id2 - сумма квадратов разностей рангов сравниваемых признаков, п - число парных наблюдений Направленность связей оценивалась по знаку коэффициентов корреляции Достоверность различий признаков в связанных выборках оценивали с использованием критерия Вилкоксона При значешш р<0,001 мы пршшмали результаты статистического анализа высоко значимыми, при р<0,01 и р <0,05 - достоверными

Результаты исследований I Особенности сенсибилизации эритроцитов комплементом в растворах низкой ионной силы

Известно, что ионная сила изотонических растворов и различных биологических жидкостей, включая кровь и сыворотку, в среднем составляет 0,154 моль/т Она формируется главным образом, в результате разведения низкомолекулярных ионов, таких как Na+, К+, СГ, Са2+, Mg24, Р042-, НСО3" и других Помимо этого в формировании ионной аиы среды участвуют различные высокомолекулярные соединения (ВМС), прежде всего белки При снижении концентрации низкомолекулярных ионов m vitro сила взаимодействия ВМС может стать существенной за счет электростатических, водородных и Ван-дер-Ваальсовых связей Такое взаимодействие с участием проферментов носит характер аггрегации При этом в структуре проферментов происходят конформационные изменения и далее наступает их активация Своеобразны ситуации, когда взаимодействие протеинов происходит в изотоническом растворе низкой ионной силы при участии эритроцитов, адсорбирующих протеины В этом случае агрегация протеинов, в частности белков системы комплемента, сопровождается адсорбцией образующихся агрегатов мембраной клеток Далее происходит каскадный запуск активации системы комплемента при участии всех вариантов ее активации, преимущественно из-за агрегации иммуноглобулинов Нам удалось показать этот эффект при использовании растворов низкой ионной силы (РНИС) на основе 10% раствора сахарозы с ионной силой 0,02-0,04 моль/л

В процессе инкубации ABO- и Rh- совместимых эритроцитов с сыворотками доноров в РНИС при температуре 37°С в течение 15 минут развивался гемолиз клеток Для уточнения динамики развитая гемолиза мы учитывали показатель экстинкшш надосадочной жидкости Выявленные особенности изображены ниже (рис 1) Кривая изменения коэффициента экстинкции имеет антисигмоидный тип и демонстрирует неравномерную динамику гемолиза Обращает на себя внимание резкий подъем кривой в течение первых 1,5-2,5 мхшут, далее следует стадия «плато», продолжающаяся с третьей по десятую минуту На этом этапе, вероятно, связыванию комплемента препятствуют мембранные ингибиторы комплемента. После 12-й минуты инкубации гемолиз становился ярко выраженным, его не удавалось остановить даже путем многократного отмывания инкубированных эритроцитов

Рис 1 Динамика изменения коэффициента экстинкции супернатанга эритроцитов (0451) в зависимости от времени их инкубации в РНИС при 37°С

По-видимому, это обусловлено полным истощением потенциала мембранных ингибиторов комплемента с развитием необратимых изменений со стороны мембраны эритроцитов Кроме того, можно полагать, что в данной фазе проявляют свою активность компоненты С5 - С9 системы комплемента

Такой характер связывания комплемента, особенно в первые минуты инкубации, позволяет полагать, что последнее количественно зависит от исходной концентрации комплемента в сыворотке, в первую очередь, его компонентов СЗ и С4 Для проверки этого предположения было нроведено сравнение характера связывания комплемента в ангиглобулиновом и нефелометрическом методах

Для количественной оценки связывания комплемента с использованием предлагаемой техники одни и те же сыворотки были параллельно исследованы антиглобулиновьш и нефелометрическим методами Для сравнительного определения связывания компонента СЗ изучено 49 образцов сывороток крови здоровых людей в возрасте от 21 до 51 года (средний возраст 36 лет, медиана 29 лет), С4 - 60 (средний возраст 36 лет, медиана 28 лет) В качестве сравнительных единиц принимали степени концентрации изучаемых компонентов (единицы в системе СИ) С4 и СЗ В антиглобулиновом методе для сравнения принимались номера лунок с минимальной интенсивностью реакции агглютинации Для сенсибилизации эритроцитов компонентами СЗ и С4 в РНИС после серии предварительных экспериментов был выбран варишгг инкубации эритроцитов в течение 90 секунд (рис 1) При этом не происходило существенной потери клеток, которая наблюдалась при более продолжительной инкубации

Выявление адсорбированного комплемента проводили с использованием кроличьих поликлональных антисывороток против СЗ и С4 компонентов производства МНИИЭМ им Г Н Габрического (Москва), которые готовились к работе следующим образом во флаконы с высушенными антисыворотками вносили по 1 миллилитру дистиллированной воды, добиваясь их полного растворения В таком состоянии антисыворотки сохраняют свою исходную

активность более 1,5 месяцев при условии их хранения при температуре 2 - 4°С Непосредственно перед работой готовая антисыворотка к С4 разводится 0,75% раствором желатина в соотношении 121, антисыворотка к СЗ - 131 Эти тест-системы были стандартизованы производигелями в реакции преципитации как имеющие титр 1 10 Наши наблюдения показали, что указанные антитела реагируют в гораздо более высоких разведениях в реакции гемагглютинации Гак, разные образцы сывороток вызывали сенсибилизацию эритроцитов комплементом, клетки реагировали с антителами анти-СЗ и анти-С4 в разведениях от 1 64 до 1 2048 Поскольку антитела сывороток относились к классу 1вО, в систему были введены следовые количества желатина (0,75% раствор, приготовленный на основе 10% желатина, производтюго Коми республиканской станцией перелнвшпы крови) в качестве конглютинирующей среды

При сравнении результатов, полученных антнглобулиновым и нефелометрическим методами, оказалось, что они полностью коррелировали между собой (рис 2 и 3) Таким образом, количество компонентов СЗ н С4 комшемеота, адсорбируемое эритрогцггами в РНИС, потностью соответствует их содержанию в исследуемых сыворотках

СЗ, г = 0,64 р<0,001

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2

концентрация СЗ г/л Нефелометрия

_I

Рис 2 Определение СЗ нефелометрическим и антиглобулиновым методами Показатели корреляции демонстрируют четкую зависимость тигров агглютинации эритроцитов в ангиглобулиновой методике от исходной концентрации СЗ и С4 в опытных сыворотках, определяемых нефелометрическим методом При этом метод отличает высокая скорость определения, доступность недорогих в производстве отечественных реагентов Для проведения исследования не требуется использование дорогостоящего оборудования (иммуноферментные анализаторы, лазерные нефелометры) Результаты исследования не подвержены искажениям в связи с использованием ксеногенных материалов, таких как эритроциты барана или сыворотка крови морских свинок, применяемых в методах, основанных на оценке гемолиза Все это создает предпосылки для успешного создания быстрого и простого в исполнении полуколичественного метода определения указанных компонентов

С4, г =0,54 р<0,001

0,6

Рис 3 Определите С4 нефечометрическим и антиглобулиновым методами 2 Разработка антиглобулинового метода определения СЗ и С4 компонентов системы комплемента Наши наблюдения показали, что перед проведением исследования целесообразно приготовить разведения антисывороток против СЗ и С4 С этой целью в 8 горизонтальных рядов микропланшеты вносили по 25 мкл 0,75% раствора желатина, в первую лунку каждого ряда добавляли 50 мкл антисыворотки в рабочем разведении в лунки нечетных стрипов вносили анти-С4, а четные - анти-СЗ Используя многоканальный шшеточный дозатор, готовили ряд разведений (10 лунок) с двукратным шагом, в последней лунке выполняли контрольный тест Таким образом, количество пар разведений мгта-СЗ и анти-С4 соответствовало количеству исследуемых сывороток (в одном мпкропланшете возможно одновременное исследование четырех образцов сывороток) Кроме того, одна пара разведений (первая или последняя) резервировалась в качестве контроля для оценки активности СЗ и С4 в контрольной сыворотке, которая, в свою очередь готовилась путем смешения равных объемов сывороток крови не менее 10 доноров любой группы крови Такой свежезаготовленный пул сывороток можно использовать в течение двух суток при температуре хранения 2 - 8°С, в течение месяца при температуре минус 30°С и неограниченно долго - при минус 75°С (в двух последних вариантах допускается только однократное размораживание сыворотки)

Во избежание высыхания разведенных антисывороток непосредственно до исследования микропланшеты накрывали крышками

В пробирки (по числу исследуемых образцов) вносили 25 мкл плотной взвеси эритроцитов группы 0(1) Ш1- Этому фенотипу отдано предпочтение во избежание искажений из-за возможного присутствия в отдельных образцах сывороток аллоиммунных антител анти-Ш)о(О) Плотную взвесь эритроцитов готовили следующим образом дефибринированную или нитратную кровь здоровых доноров в объеме 4-5 миллилитра отмывали 2 раза 3-5 кратными объемами физиологического раствора, который после второго отмывания должен быть бесцветным Затем

2 о 1-1-,-1-,-г-

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Концентрация С4 г/л Нефелометрия

максимально удаляли супернатапт, а полученную суспензию эритроцитов дополшггелыю цешрифугировали в течение 7-9 минут до образования плотного осадка упакованных эритроцитов При этом гематокрит такого осадка должен быть не менее 0,7, а концентрация гемоглобина составляла примерно 230-250 г/л при концентрации эритроцитов выше 9,0*1012/л Рабочая взвесь эритроцитов хранешпо не подлежала и готовилась ex tempore Затем добавляли исследуемые сыворотки в количестве 100 мкл, пробирки встряхивали для ресуспеидирования эритроцитов Далее в проб1грки вносили по 1 миллилитру раствора низкой ионной силы (РНИС) на основе 10% раствора сахарозы Наши наблюдения показали, что наилучшие результаты дает использовшше РНИС, предварительно подогретого до 37°С В экспериментах по времени инкубации было установлено, что последнее не должно превышать 90 секунд Более продолжительная сенсибилизация приводила к потере клеток Поэтому по истечении этого времени дальнейшую адсорбцию комплемента останавливали, добавляя во все пробы по 2 миллилитра изотонического раствора NaCl Пробы центрифугировали в течение 30 секунд при 1000g, полностью удаляли суиернатант Далее проводили троекратное отмывание осадка эритроцитов изотоническим раствором путем центрифугирования в указанном режиме После заключительного отмывания полностью удаляли супернатшгт, оставляя на дне пробирки только осадок клеток, который ресуспендировали в 1 миллилитре 0,75% раствора лелалша, приготовленного на изотоническом растворе NaCl Полученные 3% суспензии СЗ/С4-сенсибилизированных эритроцитов вносили в лунки микропланшет с разведениями антисывороток, включая контрольные лунки, планшеты центрифугировали при 2000 об/мин (750 g) в течение 30 секунд Результаты учитывали по наличию агглютинации при осторожном встряхивании планшет для ресуспендирования осадка эритроцитов За титр принимали последнее разведение, в котором наблюдалась слабоположительная (1+) реакция Результаты учитывали в ступенях разведения

Итак, окончательная версия разработанного и предлагаемого нами метода выглядит следующим образом

1 Приготовление разведений антисывороток в восемь горизонтальных рядов вносят по 25 мкл 0,75% раствора желатина на физиологическом растворе NaCl В первую лунку каждого ряда добавляют 50 мкл анлисыворотки в рабочем разведении в лунки нечетных стршюв вносили анти-С4, а четные - антп-СЗ Готовят ряд разведений (11 лунок) с двукратным шагом, в последней, 12-й, лунке выполняют контрольный тест Количество пар разведений анти-СЗ и анги-С4 должно соответствовать количеству исследуемых сывороток (в одном микропланшете возможно одновременное исследование четырех образцов сывороток) Дополнительно одна пара разведений (первая или последняя) резервируется в качестве контроля для оценки активности СЗ и С4 в контрольной сыворотке Во избежание высыхания антисывороток до исследования микропланшеты накрывают крышками

2 Сенсибилизация эритроцитов СЗ и С4 компонентами комплемента в пробирки (по числу исследуемых образцов + одна для пробы с контрольной сывороткой) вносят 25 мкл плотной взвеси эритроцитов группы O(I) Rh- Затем добавляют исследуемые сыворотки в количестве 100 мкл, пробирки встряхивают для ресуспендироваиия эритроцитов Далее в пробирки вносят по 1 миллилитру 10% раствора сахарозы (РНИС), подогретому до 37"С, немедленно устанавливают их на водяную баню и инкубируют в течение 90 секунд, по окончании которых во все пробирки вносят 2 миллилитра изотонического раствора NaCl комнатной температуры Затем пробы с целью отмывания эритроцитов 3-кратно центрифугируют в течение 30 секунд при 1000g, при первом и последнем центрифугировании супернатант удаляют полностью, не допуская потерн эритроцитов После заключительного отмывания осадок эритроцитов ресуспендировали в 1 миллилитра 0,75% раствора желатина, приготовленного на физиологическом растворе NaCl

3 Проведение реакции гемагглютинации сенсибилизированных эригроцитов и антисывороток по 15 мкл полученных суспензии СЗ/С4-сенсибилизированных эритроцитов вносят в лунки микропланшет с разведениями антисывороток, включая контрольные лунки, планшеты центрифугируют при 2000 об/мин (750 g) в течение 30 секунд Результаты учитывают по наличию агглютинации при осторожном встряхивании планшет для ресуспендироваиия осадка эригроцитов, дополнительно сравнивая с силой реакции в ряду с контрольной сывороткой За титр принимают последнее разведение, в котором наблюдается слабоположительная (1+) реакция Результаты учитывают в ступенях разведения

Наши наблюдения показали, что введение в реакцию следовых количеств желатина, обладающего конглютинирующими свойствами, делает агглютинацию более выраженной, неспецифических реакций при этом не отмечено, в контрольных лунках результаты во всех случаях были отрицательными

Таким образом, принцип предлагаемого метода определения компонентов СЗ и С4 методологически не отличается от непрямой реакции Кумбса Различия состоят лишь в том, что в первом случае эритроциты сенсибилизируют комплементом, во втором - специфическими противоэритроцитарными антителами класса IgG

Важным моментом при проведении исследования представляется то, что исследователь, проводящий указанные тесты, должен обладать определенными навыками Поскольку время инкубации эритроцитов и сыворотке в РНИС составляет всего 90 секунд, оптимальное количество сывороток, которые можно исследовать одновременно, должно составлять не более восьми При исследовании большего количества сывороток для остановки связывания комплемента может потребоваться большее количество времени и, как результат, время инкубации может превысить 90 секунд Это, в свою очередь приведет к потере клеток при их последующем отмывании

Разработанный нами антиглобулиновый метод благодаря своей быстроте, отсутствию необходимости в использовании специального дорогостоящего оборудования может, на наш взгляд, быть использован в качестве предварительного, ориентировочного Очевидно, что дальнейшие исследовашы более дорогостоящими методами (например, нефелометрическое определение CI - С5 с использованием МКА) могут быть оправданы лишь в тех случаях, когда при первичном исследовашш были выявлены выраженные количественные нарушения в содержании СЗ и/или С4 компонентов

Нами установлено, что удлинение времени инкубации эритроцитов и сыворотки в РНИС приводит к постепенному развитию гемолиза клеток Это может свидетельствовать о том, что помимо СЗ и С4 в швкоионныгч средах на эритроцитах также происходит адсорбция и других компонентов системы комплемента Следовательно, можно предположить, что при наличии в распоряжении исследователя антиглобулщювых реагентов против других (например, С1, С2, С5) компонентов системы комплемента предлагаемый нами методический прием в виде предварительной сенсибилизации эритроцитов в РНИС может бьггь с успехом использован В настоящее время коммерчески доступны моноклональные реагенты к нескольким компонентам и субкомпонентам системы комплемента

Антитела системы Chido/Rodgers Определение антител системы Chido/Rodgers.

Наблюдая агглютинацию эритроцитов, предварительно сенсибилизированных СЗ и С4 компонентами комплемента в растворе низкой ионной силы (РНИС), мы предположили, что использование этого методического приема позволит выявить антитела аллоиммунной природы, относящиеся к групповой системе Chido-Rodgers Данная групповая система не является эритрошггарной в строгом понимании, поскольку антигенные эпитопы Chido-Rodgers песет компонент С4 системы комплемента, который клетки адсорбируют из плазмы Тем не менее, поскольку эти антигены впервые были идентифицированы гемагппотинационнымн реакциями, система Chido-Rodgers продолжает оставаться в поле интереса специалистов изучающих эритроцитарвые аллоантигены Указанная система продолжает оставаться и в сфере интересов трансфузиологов, поскольку антитела системы Chido-Rodgers были описаны в качестве причины анафилактических посттрансфузионных реакций

Антитела этой системы, как правило, относятся к классу IgG и активны только в непрямом антиглобушшовом тесте Oini обладают низкой авидностью даже в тех случаях, когда присутствуют в высоких титрах За рубежом ашитела указанной системы относят к типу HTLA («high titer, low avidity», высокий тигр, низкая авидность) Это свойство обусловлено тем обстоятельством, что на эритроцитах периферической крови присутствует небольшое количество С4 компонента системы комплемента Однако, если на клетках предварительно адсорбировано большое количество С4 в РНИС, то такие эритроциты обретают способность прямо

агглютинироваться антителами групповой системы Chido-Rodgers Большинство антигенов указанной системы имеет высокую частоту, поэтому эритроциты, сенсибилизированные комплементом из смеси сывороток нескольких здоровых лиц практически всегда имеют фенотип Ch/Rg+

Мы не располагали возможностями более детального определения специфичности выявленных антител (определение тн «fine specificity» с дифференциацией специфичиостей анти-Chl, -Ch2, -Rgl, -Rg2 и т д) Такие исследования в рутинной практике, как правило, не проводятся и за рубежом, поэтому выявленные антитела принято обозначать как анти-Ch/Rg Установление точной специфичности доступно лишь некоторым референс-лабораториям Литературные данные свидетельствуют, что в подавляющем большинстве случаев выявленные антитела являются смесью анти-Chl и анти-СЬ4, или aHTH-Rgl+Rg2

С целью повышения чувствительности теста и получения прямой агглютшации эритроциты сенсибилизировали в растворе РНИС с добавкой КзЭДТА (РНИС-2) Это соединешге в определенных концентрациях связывает свободные ноны Mg2+, сохраняя ионы Са2' в количестве, достаточном для адсорбции на эритроцитах компонента С4, сенсибилизации эритроцитов компонентом СЗ при этом не происходит Предварительное приготовление раствора сахарозы с КзЭДТА (РНИС-2) происходило следующим образом К 10 миллилитрам 10% раствора сахарозы в дистиллированной воде добавляли 15 мг K3EDTA, производили встряхивание до тех пор, пока ЭДТА не растворится полностью При этом необходимое количество K3EDTA содержится в пробирках типа "Venoject", для приготовления раствора достаточно добавить 10 миллилитрам раствора сахара в пробирку и перемешать

Адсорбцию С4 на эритроцитах в РНИС-2 проводили в течение пятнадцати минут при 37°С, далее клетки, нагруженные С4, трижды отмывали изотоническим раствором NaCl

Таким образом, эритроциты, предварительно сенсибилизированные большими количествами компонента С4, способны выявлять антитела системы Ch/Rg в прямых агглютинашюшшх тестах Подобные исследования в Российской Федерации и странах СНГ ранее не проводились

Окончательная версия использованного нами метода определения антител системы Chido/Rodgers выглядит следующим образом

1 В сухую пробирку вносят 150 мкл плотноупакованной взвеси эритроцитов фенотипа 0(1) Rh-, затем добавляют 350 мкл контрольной сыворотки, после чего содержимое пробирки тщательно перемешивают

2 После ресуспецдирования эритроцитов в пробирку вносят 5 миллилитров РНИС-2, подогретого до 37°С и инкубируют ее на водяной бане при 37°С в течение 15 минут

3 После окончания инкубации эритрошгты трижды отмьшают физиологическим раствором №С1 и готовят их 4% взвесь путем добавления к сухому осадку эритроцитов 6 миллилитров физиологическою раствора №С1

4 В микропланшеты в произвольном порядке по числу проб вносят сыворотки в объеме 50 мкл, затем к сывороткам добавляют по 20 мкл эритроцитов, сенсибилизированных С4 После этого платы аккуратно встряхивают и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 секунд, по окотании центрифугирования, осторожно встряхивая микроплаты, учитывают результаты

Для оценки частоты встречаемости шггител системы были выбраны следующие категории людей, пробы крови которых поступали в лабораторию пммуногематологии РКД доноры в возрасте 21-42 года (средний возраст 31,5 года, медиана 27 года, мужчины - 504 чел , женщины -106 чел ) в составе супружеских пар, обследованных на тшуногематологичсскую совместимость (610 образцов), беремишые женщины (в возрасте 20 - 36 лег) в 3-м триместре нормально протекающей беременности с одной и более беременностями в анамнезе (99 образцов), больные артерио-венозньшп тромбозами (возраст 30 - 49 лет, медиана возраста 45 лет, муж - 91 чел, жен - 11 чел), перенесших успешное хирургическое лечение, в отсутствие инфекционной и аутоиммунной патологии как причинного фактора тромботического процесса Кроме того, в исследование вошли 33 образца сывороток лиц с системной красной волчанкой (возраст 25 - 46 лет, медиана 32 года, жен - 27 чет, муж - 6 чел) получавших консервативное лечение по поводу обострения заболевашы в ревматологическом отделении РКД, 46 образцов сывороток детей в возрасте 3-12 лет (медиана 10 лет), страдающих лимфо- и миелопролиферативной патологией и получавших трансфузии компонентов донорской крови (ОЛЛ - 14 чел, ОМЛ - 32 чел)

При проведении скрининга 890 образцов сывороток крови доноров и вышеперечисленных групп больных лиц на наличие анти-СМ^ были обнаружены шесть образцов, которые давали отчетливо положительную реакцию с эр1ггроцитами, сенсибилизированными в РНИС-2 компонентом С4 Реакция становилась отрицательной после ингибшцш антител свободным С4 из смеси сывороток крови здоровых лиц Это доказывало принадлежность антител к системе СЫс1о/Ко11§ег5 Кроме того, эти сыворотки не реагировали с тем же образцом эритроцитов, не сенсибилизированных предварительно комплементом в РНИС-2 Мы выявили антитела анти-СМ^ в 0,67% случаев

Распределение частоты встречаемости тпч-СЫЯа антител среди различных обследованных групп имело свои особенности (табл 3) Среди сывороток от 610 доноров антитела были найдены только у одного мужчины в возрасте 45 лет (частота 0,16%)

Другие образцы антител анти-СЬ/!^ были получены от больных и беременных Так, они были выявлены в сыворотке крови одного мужчины в возрасте 79 лет с тромбозом глубоких вен нижних конечностей Два других образца анти-СЬЛ1£ были найдены у двух из 99 женщин в

возрасте 28 и 32 лет, имевших несколько беременностей В одном случае антитела были выявлены у больной с системной красной волчанкой Еще одним сенсибилизированным оказалась девочка в возрасте 7 лет с острым лимфобластным лейкозом Больная получала трансфузш! компонентов (эритрошггсодержащие среды, плазма, концентраты тромбоцитов) донорской крови

Таблица 3

Частота встречаемости антител системы Chldo/Rodgeгs в зазличных группах обследованных

Группы п С наличием антител анти-Ch/Rg Частота (%)

Доноры 610 1 0,16

Беременные женшины 99 2 2 02

Больные сосудистой патологией 102 1 0,98

Больные системной красной волчанкой 33 1 3,03

Дети с лимфо- и миелопролиферативной патологией, получавшие повторные гемотрансфузии 46 1 2,17

Таким образом, антитела анти-Ch/Rg были выявлены не только у лиц, имевших повторные беременности или гемотрансфузии В трех случаях причины их образования остались неизвестными Мы полагаем, что помимо аллоиммунных могут встречаться и аутоиммунные антитела указанной специфичности

Как уже отмечено выше, в одном случае антитела выявлены у девочки с острым лимфолейкозом Она получала повторные трансфузии компонентов донорской крови (эритроцитсодержащие среды, концентраты тромбоцитов, плазму), при этом каких-либо посггрансфузионных реакций не наблюдалось У новорожденных двух сенсибилизированных женщин не было симптомов гемолитического заболевания Таким образом, нам удалось показать, что антитела системы Chido/Rodgers не способны вызвать гемолиз ш vivo Вместе с тем следует отметить, что наличие таких антител в сыворотках крови реципиентов может создать большие затруднения при проведении индивидуального подбора эритроцитов для трансфузий В случае присутствия анти-Ch/Rg с большинством образцов эритроцитов доноров наблюдаются слабоположительные или сомнительные реакции В такой ситуации иммуносерологу сложно решить вопрос о совместимости подбираемой крови Еще одна опасность состоит в том, что антитела системы Chido/Rodgers могут маскировать другие, которые действительно способны вызвать гемолиз перелитых эритроцитов ш vivo В этой связи можно рекомендовать нейтрализацию антител системы Chido/Rodgers путем смешивания в равных объемах сывороток реципиента и здоровых лиц группы AB(IV), предпочтение должно отдаваться донорам-мужчинам Исчезновение активности сыворотки указывает на принадлежность выявленных антител к системе

ОшЬ/Лос^ек При получении отрицательных результатов с нейтрализованной сывороткой реципиента и эртроцитов донора последние могут быть перелиты

Свойства антител системы С11и1о/Яо^ег5 Два выявленных образца антител системы СШо/Ш^еге были детально изучены нами в серологических реакциях Проведено параллельное титрование сывороток от беременных М и С в непрямом антиглобулиновом методе с нативными эритроцитами, а также прямых агглютинацпонных тестах с тем же образцом клеток, предварительно сенсибилизированным С4 в РНИС-2 При проведении исследований, как в непрямом анпштобулиновом, так и агглютинациошюм тестах, пробы инкубировали в термостате при 37°С в течение 60 мин Результаты титрований с оценкой выраженности по четырехбатльной шкале (в плюсах) приведены ниже в табл 4

Таблица 4

Серологические характеристики ангител анти-СЬЖ^ сывороток беременных М и С в непрямом антиглобулиновом тесте (11АТ) и реакции агглютинации (РА) в методе с эритроцитами, предварительно

сенсибилизированными С4

Сыворотка беременной М

Разведения 1 1 1 2 1 4 1 8 1 16 1 32

HAT ++ ++ + + + -

РА ++++ ++ ± - - -

Сыворотка беременной С

Разведения 1 1 1 2 1 4 1 8 1 16 | 1 32

HAT + + + + ± |

РА +++ ++ + - 1 -

Как видно из табт 4, оба образца антител имели невысокий титр и демонстрировали слабо выраженные реакции в HAT как в неразведенных сыворотках, так и при проведении титрования Реакции исследованных сывороток с эритроцитами, предварительно сенсибилизированными С4, были более выраженными, однако титры и в этом методе также оказались низкими Принимая во внимание тот факт, что прямые агглютинацнонные тесты менее трудоемки в исполнении в сравнении с антиглобушшовыми, мы пришли к выводу, что для выявления антител системы Chido/Rodgers более предпочтителен тест с эритроцитами, предварительно сенсибилизированными С4 в РНИС-2

Присутствие фракций антител анти-СЗ и анти-С4 в антиглобулиновых реагентах

Как уже отмечалось выше, эритроциты, предварительно сенсибилизировшшые большими количествами С4, могут быть использованы для оценки качества антиглобулиновых реагентов (аши-IgG), приметаемых при проведении проб Кумбса Присутствие в этих тест-системах фракции анти-СЗ является важным для выявления антител групповых систем Lewis, Duffy и, особенно, Kidd Количество антигенных сайтов этих систем на одном эритроците сравнительно невелико, поэтому антитела могут остаться не выявленными при использовании антиглобулиновых реагентов, содержащих только анти-IgG без фракции анти-СЗ Каждая

молекула ^О способна связать в 5-10 раз большее количество СЗ, поэтому использование ангиглобулиновых реагентов со специфичностью анти-^О + анти-СЗ имеет решающее значение для выявления слабых антител вышеперечисленных групповых систем Вместе с тем, присутствие в антиглобулиновых реагентах фракции анти-С4 может явиться причиной ложноположительных результатов Особенно это относится к ускоренным вариантам антиглобулинового теста с применением РНИС (РНИС-АГТ), поскольку в этих условиях эритроциты связывают не только специфические 1§0, но и достаточно большие количества С4 Вероятность получения ложноположительных результатов увеличивается, если для проведения исследований используются консервированные эритроциты длительных сроков хранения Равным образом ложноположительные результаты могут быть получены, если тесты на совместимость перед гемотрансфузией с консервированными донорскими эритроцитами проводятся с использованием ангиглобулиновой техники

В лаборатории иммуногематологии Коми республиканского кардиологического диспансера на наличие фракций анти-СЗ и анти-С4 проверяются все серии антиглобулиновых реагентов, приобретенных в ТОО «Гематолог», Москва Фракцию анти-СЗ содержали все без исключения серии антиглобулшювых сывороток от указанного производителя Эритроциты, сенсибилизированные СЗ/С4 в РНИС-1, реагировали с антиглобулиновыми сыворотками в разведениях 1 16 - 1 64 Антиглобулиновые реагенты, произведенные в 1998 - 2002 гг, помимо анти-СЗ содержали также и фракцию анти-С4, которая в ряде научных исследований создавала некоторые неудобства при работе с панелями эритроцитов редких фенотипов, присланных по почте и заготовленных на растворе Олсвера Данное «неудобство» состояло в том, что данные эритроциты адсорбировали большое количество С4 и в РНИС-АГТ взаимодействовали с анти-С4 указанных антиглобулиновых сывороток Только использование непрямого антиглобулинового метода с инкубацией проб при 37°С в течение 60 мин позволяло избежать проявлений действия фракции анти-С4 антиглобулиновых реагентов и получать отчетливо различимые положительные и отрицательные реакции

Таким образом, качество антиглобулшювых реагентов может быть оценено с эритроцитами, сенсибилизированными СЗ/С4 в РНИС-1 и только С4 - в РНИС-2 Тест-системы высокого качества не должны содержать фракции анта-С4, поскольку в противном случае могут быть получены ложноположительные результаты

Следует отметить, что производство таких ангиглобулиновых реагентов является достаточно трудоемким, поскольку сыворотки иммунизированных животных приходится освобождать от гетероагглютшпнюв и фракции анти-С4 путем повторных адсорбций Такая процедура неминуемо приводит к снижению специфической активности антиглобулиновых реагентов и, более того, приводит к их удорожанию Поэтому в настоящее время многие фирмы,

производящие аитиглобулиповые тест-системы, изготавливают их путем смешившим поликлональных (кроличьих или козьих) антител аиш-^О с моноклональными анти-СЗ<1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, система комплемента играет важную роль в различных реакциях иммунитета Она очень сложна и представлена многочисленными компонентами и субкомпонентами

Тем не менее, для оценки состояния системы комплемента часто оказывается достаточным оценить лишь общую гемолитическую активность и содержание компонентов СЗ и С4 Последующие углубленные дорогостоящие исследоватшя комплемента могут быть оправданы лишь в случаях, когда предварительно выявлены отклонения в общей гемолитической активности и/или выраженные количественные отклонешш в содержании СЗ и/или С4 компонентов

В 60-х годах XX в было установлено, что связывание некоторых компонентов комплемента с аллогенными эритроцитами происходит очень быстро в низкоиошюй среде Этот феномен использовался пммуносерологами лишь для оценки качества антиглобулнновых реагентов Вместе с тем, его оказалось возможным использовать и для количественных тестов В доступной нам литературе мы не нашли описаний таких методических подходов к определения СЗ и С4 Это побудило нас изучить такие возможности

Таким образом, целью исследования являлась разработка нового метода оценки системы комплемента, основанного на адсорбции ее компонентов на аллогенных эритроцитах Кроме того, использование эритроцитов, сенсибилизированных С4 дает возможность быстро выявить и дифференцировать антитела групповой системы С1ис1о/К.ос1§ег5 Это позволило изучить частоту их встречаемости среди различных групп обследованных (доноры, больные с различной патологией, реципиенты) жителей Республики Коми

Нами изучены особенности динамики связывания комплемента в растворе с низкой ионной силой Оказалось, что адсорбция основного количества СЗ и С4 компонентов аллогенными эритроцитами происходит уже в течение первых трех минут инкубации Количество связавшегося СЗ и С4 точно отражает его концентрацию в исследуемой сыворотке Степень адсорбции СЗ и С4 на эритроцитах достаточно точно может быть определена методом титрования и, таким образом, вполне поддается стандартизации Разработанная техника по своей методологии не отличается от непрямой реакции Кумбса, когда на первом этапе проводят сенсибилизацию эритроцитов, на втором - связавшиеся иммуноглобулины выявляют с помощью антиглобулиновых реагентов В данном случае производилась предварительная сенсибилизация эритроцитов компонентами СЗ и С4 комплемента Соответственно, на втором этапе исследования использовались антиглобулиновые реагенты против СЗ и С4 Достоинствами метода оказались его простота, минимальные затраты времени на выполнение исследования

Такое исследование в состоянии провести специально подготовленный средний медицинский персонал Кроме того, удалось избежать возможных искажений результатов, связанных с использованием ксеногенных материалов, например эритроцитов барана, используемых в гемолитических методах Реакция агглютинации оказалась гораздо чувствительнее в сравнении с преципитацией, поэтому сыворотки против компонентов СЗ и С4 можно использовать в больших разведениях Это делает метод весьма экономичным в отношении расхода тест-систем и, следовательно, удешевляет стоимость исследования Еще одним прогрессивным методическим приемом, позволяющим ускорить агглютинацию эритроцитов и существенно сократить время проведения теста, явилось центрифугирование планшет после смешивания эритроцитов, предварительно сенсибилизированными этими протеинами, в лунках с предварительно приготоЕлеппыми разведениями сывороток против СЗ и С4 В отсутствие центрифугирования учет реакций с антиглобулиновыми реагентами анти-СЗ и анти-С4 был бы возможен не ранее, чем через 60-120 минут Это время, необходимое для седиментации агглютинированных эритроцитов и формирования их характерного осадка

Так как нами установлено, что удлинение времени инкубации эритроцитов и сыворотки в РНИС приводит к постепенному развитию гемолиза клеток, то это позволило высказать предположение, что помимо СЗ и С4 в низкоионных средах на эритроцитах также происходит адсорбция и других компонентов системы комплемента Следовательно, при наличии в распоряжении исследователя антиглобулиновых реагентов против других (например, С1, С2, С5) компонентов системы комплемента предлагаемый нами методический прием в виде предварительной сенсибилизации эритроцитов в РНИС может быть с успехом использован В настоящее время моноклональные реагенты к нескольким компонентам и субкомпонентам системы комплемента коммерчески доступны

Нами также показано, что солевые суспензии эритроцитов, сенсибилизированных компонентом С4, способны прямо агглютинироваться антителами групповой системы СШо/Ыос^егз без использования каких-либо коллоидных конглютинационных аддитивов Антитела этой системы описывались в качестве причины посттрансфузионных анафилактических реакций, поэтому нашей целью являлось также информации об их клинической значимости При этом имеется в виду способность вызывать патологию новорожденных, родившихся от сенсибилизированных женщин и/или вызывать постгрансфузионные реакции Нами впервые в России проведены скршшнговые исследования антител этой системы среди различных групп обследованных При исследовании 890 образцов сывороток антитела анти-СЬЛ1$ выявлены в 0,67% случаев Антитела были выявлены как среди лиц, имевших беременности и гемотрансфузии, так у людей без указаний на это в анамнезе По-видимому, помимо аллоиммунных, существуют и аутоиммунные анли-СЫ!^ или т и «естественные» антитела этой системы В одном случае антитела выявлены у девочки с острым

лимфолейкозом Она получала повторные трансфузш! компонентов донорской крови (эритроциты, тромбоциты плазму), при этом не было отмечено каких-либо патологических проявлений У новорожденных двух сенсибилизированных женщин не бы то симптомов гемолитического заболевания Таким образом, антитела системы Chido/Rodgers оказались не способными вызвать гемолиз in vivo Нам не удалось получить доказательств их клинической значимости и способности вызвать какие-либо клинические осложнешы во время беременности или при проведении гемотрансфузиошюй терапии

При оценке качества антиглобулиновьгх реагентов отечественного производства оказалось, что они являются полиспецифическими Так, все без исключения серии антиглобулиновой сыворотки производства ООО «Гематолог» (Москва) помимо aimi-IgG антител содержали также фракцию антл-СЗ Ее активность была неодинакова в различных сериях и варьировала между значениями 1 8 - 1 64 в то время как активность фракции антн-IgG во всех сериях была 1 128 и выше Алтиглобулшювые тест-системы от указанного производителя, приобретенные для лаборатории в 1999 - 2002 гг, помимо анти-IgG и анги-СЗ содержали также достаточно активную фракцию анти-С4 Последняя вызывала прямую агглютинацию эритроцитов, которые были предварительно сенсибилизированы компонентом С4 в растворе РНИС-2

В нескольких других случаях при исследовании сывороток крови беременных с Rh-отрицательной кровью на наличие антител системы Rh со стандартными консервированными эритроцитами группы 0(I)Rh+ наблюдались положительные результаты, в то время как параллельные исследования со свежезаготовленными клетками той же группы демонстрировали отрицательные реакции По-видимому, эритроциты длительных сроков хранения способны адсорбировать существенно большие количества комплемента в сравнении со свежезаготовленными в РНИС, в качестве которых вполне могут выступать консервирующие растворы Присутствие фракции акги-С4 в антнглобулиновых реагентов вынудило нас при проведении исследовании сывороток крови беременных полностью отказаться от использования консервированных стандартных эритроцитов Для работы антиглобулиновой техникой мы были вынуждены использовать только свежезагоговленные эритроциты подходящих фенотипов (для стандартизации антител системы Rh используются клетки групп О DCCee, DccEE и ddccee), которые, как показала наша практика, не всегда бывают доступны исследователю

Таким образом, качество антпглобулиновых реагентов, используемых при проведении иммуногематологических исследований, имеет очень большое значение С одной стороны, отсутствие фракции анти-СЗ может не обеспечить выявление клинически значимых антител некоторых групповых систем, особенно Кидд Эти антитела представляют определенную трансфузионную опасность, поскольку вызывают гемолитические посттрансфузионные реакции замедленного типа Они обладают выраженным «эффектом дозы», когда эритроциты лиц,

гомозиготных по генам Ж или Jkb дают положительные реакции, в то время как клетки гегерозигот Jk"/.Jkb - нет Таким образом, антитела системы Кидд могут остаться не выявленными Следовательно, обнаружить и, тем более, идентифицировать такие антитела можно, лишь располагая антиглобулиновыми тест-системами высокого качества

С другой стороны, присутствие в антиглобулиновых реагентах фракции анти-С4 является нежелательным, поскольку может служить причиной ложноположительных результатов Это, прежде всего, относится к исследованиям, проводимым с консервированными стандартными эритроцитами длительных сроков хранения Считается весьма важным, чтобы антиглобулиновые реагенты высокого качества помимо анти-IgG содержали антн-СЗ, но не аши-С4 фракцию

ВЫВОДЫ

1 Адсорбция компонентов СЗ и С4 системы комплемента эритроцитами в растворе низкой ионной силы на основе сахарозы происходит быстро, со связыванием их основного количества с клетками в течение первых трех минут инкубации Количество адсорбированного эритроцитами СЗ и С4 прямо пропорционально их содержанию в исследуемой сыворотке

2 Эритроциты, сенсибилизированные СЗ и С4, могут использоваться для оценки качества антиглобулиновых реагентов, применяемых при проведении иммуногематологических исследований

3 Разработан полуколичественный антиглобулиновый метод определения СЗ и С4, являющийся простым, быстрым в исполнении, не требующий специального дорогостоящего оборудования

4 Впервые в отечественной практике изучена частота встречаемости антител групповой системы Chido/Rodgers у населения Республики Коми, которая составляет 0,67% случаев

5 Показано, что выявленные антитела системы Chido/Rodgers не обладают способностью вызвать гемолиз m vivo во время беременности или в результате гемотрансфузии

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 По результатам работы разработаны методические рекомендации для иммуногематологической и клинико-диагностической лабораторий КРКД по использованию анпотюбулинового метода с применением РНИС на основе раствора сахарозы как скршшнгового с целью предварительной (до этапа выполнения более трудоемких и количественных методик) оценки активности СЗ и С4 компонентов системы комплемента

2 Разработаны и внедрены в практику лаборатории иммуногематологии КРКД методические рекомендации по оценке качества антиглобулиновых реагентов,

применяемых для иммуносерологпческих исследований (помимо клеток, сенсибилизированных IgG) с использованием эритроцитов, на которых в РНИС адсорбированы большие компонентов комплемента СЗ и С4

Список публикаций по теме диссертации:

1 Тоннов А А Изучение особенностей сенсибилизации эритроцитов комплементом в растворе низкой ионной силы // Вестник службы крови России, 2007, №2, С 16-17

2 Тоипов А А , Мороков В А Антитела системы Chido/Rodgerb среди некоторых контингентов населения Республики Коми// В кн «Материалы региональной научно-практической конференции Северо-Западного федерального округа «Болезни системы кровообращения проблемы и пути их решения» - Сыктывкар - Санкт-Петербург, 2007, С 62-65

3 Тоипов А А, Мороков В А Быстрый полу количественный антиглобулиновый метод определения СЗ и С4 компонентов системы комплемента// Russian Journal of Immunology 2004, vol 9, suppl I, С 76

4 Тоннов A Мороков В А Определение антител системы Chido/Rodgers и их частоты // Вестник службы крови России, 2007, №2, С 14-15

5 Тоипов А.А, Мороков В А, Рождественская H Б Быстрый полуколичественный метод определения СЗ и С4 компонентов комплемента// В кн «Материалы региональной научно-практической конференции Северо-Западного федерального округа «Болезни системы кровообращения проблемы и пути их решения» - Сыктывкар - Санкт-Петербург, 2007, С 59 -61

6 Тоипов А А, Мороков В А , Рождественская H Б Полуколичественный антиглобулиновый метод определения СЗ- и С4-компонентов комплемента// Клиническая лабораторная диагностика, 2008, №2, С 48-49

7 Фатьянов С А , Мороков В А Тоинов А А Аллоантитела к редкому антигену Wra(Wright) системы Diego // Вестник службы крови России 2004, №2, С 43-46

8 Шардаков В И Тоинов А А Ускоренный метод выявления антител групповой системы Chido/Rodgers и их частоты среди жителей Республики Коми // Приложение "Наука" - 2008 В печати

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ МКА - моноклональные антитела OJIJI - острый лимфобластный лейкоз OMJI - острый миелобластный лейкоз PHIIC - раствор низкой ионной силы CK - система комплемента ABO - эритроцитарная групповая система ABO IgG - иммуноглобулины (immunoglobulins) класса G Rh - эритроцитарная групповая система Rhesus Rh0(D) - антиген D системы Rh

Подписано в печать 20 05 2008 Объем 1,0 п л Тираж 100 экз Заказ № 130 Отпечатано в типографии ООО «КОПИ-Р», СПб, пер. Гривцова 6 Б Лицензия ПЛД № 69-338 от 12 02 99г

Система комплемента является важным участником разнообразных реакций иммунитета. Последние не могут быть оценены однозначно, поскольку, с одной стороны, адекватная активность системы комплемента очень важна в защите организма от различных (главным образом инфекционных) агентов. С другой стороны, активированный комплемент может представлять серьезную опасность для собственных клеток организма и способен повредить их. Доказательством тому является участие комплемента в патогенезе разнообразных, главным образом, аутоиммунных реакций. В силу этих причин система комплемента, признанная одной из т.н. «сторожевых» систем крови, привлекает внимание клиницистов. Система комплемента очень сложна и состоит из более чем 20 компонентов и субкомпонентов. Она может быть активирована несколькими путями.

Известно, что ключевыми по своей значимости компонентами комплемента являются СЗ и С4, первый из них участвует во всех путях активации системы. Следовательно, оценка их количественных и качественных характеристик in vitro представляется актуальным. Достигнуты определенные успехи в их изучении, предложены различные количественные методики. Вместе с тем, они не лишены своих недостатков. Так, методы, основанные на учете гемолиза, являются длительными и трудоемкими в исполнении: о состоянии компонентов комплемента в этих случаях судят не прямо, а косвенно, по гемолизу эритроцитов-мишеней. Еще одним существенным недостатком этих техник является использование ксеногенной индикаторной системы, когда эритроциты барана сенсибилизированы кроличьими антителами. Более того, для определения некоторых компонентов используется сыворотка крови морской свинки, также ксеногенный по своей природе материал. Нефелометричекие методики, когда с помощью моноклональных антител можно определить количественное содержание различных компонентов, более современны и прогрессивны. Вместе с тем, и эти методические варианты имеют свои недостатки. Они являются дорогостоящими, поскольку необходимы специальные оборудование (нефелометры) и тест-системы (диагностические наборы моноклональных антител), преимущественно импортного производства. Таким образом, несмотря на достигнутые успехи, возможности прогресса в этом направлении отнюдь не исчерпаны. По нашему мнению, могут быть разработаны и с успехом использованы быстрые в исполнении техники определения СЗ и С4, основанные на принципиально других методических подходах. При определенных условиях такие клетки крови как эритроциты человека могут быть очень быстро сенсибилизированы компонентами СЗ и С4. Их последующее полуколичественное определение с помощью простых в исполнении гемагглютинационных реакций не представляет каких-либо затруднений.

Помимо количественных аспектов существуют и качественные аллогенные маркеры, связанные с системой комплемента. Так, компонент С4 несет аллоантигены групповой системы Chido/Rodgers, которые могут служить причиной аллоиммунизации во время беременности или в результате гемотрансфузии [99, 144]. В отечественной литературе мы не обнаружили каких-либо сведений о частоте антител системы Chido/Rodgers и, тем более, о распределении этих факторов в популяции. Известно, что выявление антител этой системы стандартными иммуногематологическими методами сопряжено с трудностями, поскольку первые, присутствуя даже в высоких титрах, часто дают слабо выраженные реакции. Таким образом, для выявления антител системы Chido-Rodgers необходимы другие методические подходы. Наконец, в отечественной литературе, в отличие от неоднозначных данных зарубежных источников [119, 154, 166, 223, 247, 249], нет каких-либо сведений о клинической значимости антител этой системы.

Цель работы - разработка нового метода оценки системы комплемента, основанного на адсорбции ее компонентов на аллогенных эритроцитах и изучение частоты распределения антител системы Chido-Rodgers у жителей республики Коми.

Основные задачи

1. Изучить особенности связывания компонентов СЗ и С4 системы комплемента с аллогенными эритроцитами в растворах низкой ионной силы.

2. Разработать информативный и быстрый в исполнении метод определения компонентов СЗ и С4 комплемента, который не требовал бы для своего выполнения специального дорогостоящего оборудования, при этом результаты оцениваются с помощью реакции гемагглютинации.

3. Определить возможность определения антител системы Chido-Rodgers с использованием эритроцитов, сенсибилизированных С4, установить частоту антител этой групповой системы у жителей республики Коми и оценить их клиническую значимость.

Научная новизна

Впервые в отечественной практике установлено, что сенсибилизация аллогенных эритроцитов компонентами СЗ и С4 системы комплемента наступает в течение 3-х минут в растворах низкой ионной силы с использованием сахарозы. При использовании К3ЭДТА можно достичь сенсибилизации указанных клеток только компонентом С4. Такие эритроциты могут быть использованы, как для оценки качества тест-систем против С4, так и наличия примесей анти-С4 в антиглобулиновых реагентах. Показана возможность использования данного методического приема для полуколичественного определения СЗ и С4.

Впервые в отечественной практике предложен простой скрининговый метод выявления антител системы Chido-Rodgers, установлена их частота у жителей республики Коми. Показано, что в ряде случаев указанные антитела встречаются у лиц, не имевших беременностей и гемотрансфузий.

Данных, которые могли бы указывать на клиническую значимость антител системы Chido-Rodgers при проведении гемотрансфузионной терапии, не получено.

Практическая значимость

Разработан простой и быстрый в исполнении полуколичественный метод определения СЗ и С4 компонентов системы комплемента. Результаты исследования учитываются с использованием реакции гемагглютинации. Показана возможность использования эритроцитов, сенсибилизированных С4, для оценки качества антиглобулиновых реагентов.

Результаты работы внедрены в практику работы лаборатории иммуногематологии Коми республиканского кардиологического диспансера.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аллогенные эритроциты могут быть в течение короткого (до 3 минут инкубации) времени сенсибилизированы большими количествами СЗ-и С4 компонентов системы комплемента в растворах низкой ионной силы с использованием 10% раствора сахарозы. Степень сенсибилизации эритроцитов СЗ и С4 прямо пропорциональна их содержанию в исследуемых сыворотках.

2. Разработан полуколичественный антиглобулиновый метод определения компонентов СЗ и С4 системы комплемента, не требующий специального оборудования, а также ксеногенных материалов.

3. Эритроциты, сенсибилизированные компонентом С4, позволяют в течение минуты выявить антитела системы Chido/Rodgers в прямых агглютинационных методах. Последние не имеют клинического значения в практике трансфузиологии и встречаются с частотой 0,67%.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на: научно-практической конференции, посвященной 10-летию Коми республиканского кардиологического центра (Сыктывкар, 2007), секции «Экологические аспекты демографической политики и особенности жизнеобеспечения населения на Российском Севере» IV-ro Северного социально-экологического конгресса (Сыктывкар, 2008), заседании кафедры медико-биологических дисциплин ГОУ ВПО «Коми Филиал Кировской государственной медицинской академии» (Сыктывкар, 2007), заседании Ученого Совета Кировского НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий (Киров, 2007). По результатам исследования опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 264 источника, из них 9 отечественных и 255 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 6 рисунками.

выводы

1. Адсорбция компонентов СЗ и С4 системы комплемента эритроцитами в растворе низкой ионной силы на основе раствора сахарозы происходит быстро, основное их количество связывается с клетками в течение первых трех минут инкубации.

2. Количество адсорбированного эритроцитами СЗ и С4 прямо соответствует их содержанию в исследуемой сыворотке.

3. Эритроциты, сенсибилизированные СЗ и С4, могут использоваться для оценки качества антиглобулиновых реагентов, применяемых при проведении иммуногематологических исследований.

4. Разработан полу количественный антиглобулиновый метод определения СЗ и С4, являющийся простым, быстрым в исполнении, не требующий специального дорогостоящего оборудования.

5. Впервые в отечественной практике изучена частота встречаемости антител групповой системы Chido/Rodgers среди различных контингентов. Установлено, что последние встречаются в 0,67% случаев; выявлены также у лиц, не получавших гемотрансфузий, не имевших беременностей.

6. Показано, что антитела системы Chido/Rodgers не обладают способностью вызвать гемолиз in vivo во время беременности или в результате гемотрансфузии и, следовательно, не являются препятствием для проведения гемотрансфузионной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использовать антиглобулиновый метод с применением РНИС на основе раствора сахарозы как скрининговый с целью предварительной (до этапа выполнения более трудоемких и количественных методик) оценки активности СЗ и С4 компонентов системы комплемента.

2. Оценивать качество всех без исключения серий аитиглобулиновых реагентов, применяемых для иммуносерологических исследований, (помимо клеток, сенсибилизированных IgG) с использованием эритроцитов, на которых в РНИС адсорбированы большие компонентов комплемента СЗ и С4. Антиглобулиновые тест-системы высокого качества должны реагировать с клетками, сенсибилизированными СЗ, но не С4.