Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Получение и характеристика клеточных линий меланомы человека для создания противоопухолевых вакцин

00460УЬИО

На правах рукописи

БУРОВА

Ольга Семеновна

Получение н характеристика клеточных линий мелаиомы человека для создания противоопухолевых вакцин

Специальность: 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о СЕН 2010

Москва -2010

004609603

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Барышников Анатолий Юрьевич

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник Михайлова Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Голенков Анатолий Константинович

доктор биологических наук Сураева Наталья Михайловна

Ведущая организация:

ФГУ МНИОН им. П.А. Герцена Росмедтехнологнй

Защита состоится «/ » 2010 г. в /-/ часов

на заседании диссертационного совета Д. 001.017.02 РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМ по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан « Ь » О У 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсукс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из направлений в лечении онкологических заболеваний является иммунотерапия. Благодаря развитию биотехнологии активно разрабатываются новые методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета. Большое место в этих исследованиях занимает разработка противоопухолевых вакцин. Вакцины создаются на основе модифицированных аутологнчных или аллогенных опухолевых клеток. Широко исследуются вакцины с использованием дендритных клеток.

Принцип вакцинотерапии основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов. Т-клетки, играющие роль в клеточно-опосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикацией по антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). Поэтому идентификация опухолевых антигенов и молекул ГКГ представляет несомненный интерес для разработки вакцин с использованием линий клеток, полученных из опухолей человека.

Одним из объектов для изучения вакцинотерапии является меланома -опухоль, растущая из меланоцитов, которая считается «антигенной», т.е. экспрессирующей опухолеассоциированные антигены. Этот факт и послужил основанием в выборе меланомных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

За последние годы достигнут значительный прогресс в идентификации антигенов, ассоциированных с меланомой, узнаваемых цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ). Антигены можно разделить на три главные группы: опухолеассоциированные, раково-тестикулярные и дифференцировочные антигены. Цельные опухолевые клетки, как правило, содержат большое количество разнообразных опухолевых антигенов, часть из которых может быть иммуногенной, что является важным условием для создания вакцины.

Использование аллогенных опухолевых вакцин базируется на представлении, что клетки опухоли от разных индивидуумов могут иметь общие опухолеассоциированные антигены, которые способны индуцировать значимый иммунный ответ. Аллогенные вакцины получают из клеточных линий,

\

\

подобранных таким образом, чтобы обеспечить максимальное представительство опухолеассоциированных антигенов.

В связи с этим получение клеточных линий меланомы, изучение их антигенной структуры и определение иммуногенности является актуальной задачей.

Цель исследования: получение и характеристика меланомных клеточных линий, пригодных для создания противоопухолевых вакцин.

Задачи исследования

1. Получить клеточные линии из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани пациентов с диссеминированной меланомой и создать клеточный банк для наработки вакцин.

2. Изучить морфологический и кариологический фенотип полученных клеточных линий.

3. Определить экспрессию опухолеассоциированных антигенов, раково-тестикулярных антигенов и их генов.

4. Изучить в динамике экспрессию антигена главного комплекса гистосовместимости первого класса и определить аллели антигена -главного комплекса гистосовместимости первого класса.

Научная новизна работы

Полученные клеточные линии меланомы человека охарактеризованы по ряду многочисленных параметров: морфологических, кариологических и иммунологических.

12 клеточных линий защищены патентами Российской Федерации, из них 5 патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2009 г.

Научно-практическое значение

Создан рабочий и посевной банк 19 полученных клеточных линий. Линии охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генным параметрам, что позволяет проводить адекватный их выбор для создания

противоопухолевых вакцин. На базе коллекции получены две генномодифицированные клеточные вакцины с использованием клеточных линий mel Kor и mel Р. Вакцины прошли первую фазу клинических испытаний и получили разрешение в Этическом комитете и ФГУНЦ ЭСМП РОСЗДРАВНАДЗОРА на проведение второй фазы клинических испытаний.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 21 января 2010 г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории лучевых методов лечения опухолей НИИ ЭДиТО, а так же отделения биотерапии НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Материалы работы были представлены на I Всероссийской научно-практической конференции (Москва, 2002 г.), на 11th Annual Congress European Society of gene therapy (Edinburg, 2003 г.), на IV Всероссийской научно-практической конференции (Москва, 2005 г.), на 15-й Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 г.), на V Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2006 г.), на 8lh International Biological Therapy of Cancer (Dresden, 2006 г.), па IX Международной конференции молодых онкологов (Москва, 2008 г.) и на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2009 г.).

По материалам диссертации опубликовано 28 работ: 8 статей, 9 тезисов докладов и 11 патентов на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (183 источника). Материалы

диссертации нзложеиы на 120 страницах машинописного текста и включают 41 рисунок и 17 таблиц.

Материалы и методы исследования.

Материалом для исследований послужили образцы опухолевых тканей, полученные хирургическим путем из метастатических очагов пациентов с диссеминированной меланомой. Опухолевую ткань измельчали до суспензии клеток. Клетки сначала культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной сыворотки 2мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл) стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar); при дальнейшем культивировании содержание сыворотки снижали до 10%, а в некоторых культурах - до 5%.

Полученные 19 стабильных клеточных линий охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генетическим параметрам. Клеточные линии прошли более 30 пассажей, это характеризует клетки как обладающие неограниченным жизненным потенциалом.

Для длительного хранения клетки консервировали путем замораживания в жидком азоте при температуре минус 196°С. Культуры меланомных клеток замораживали на разных пассажах, начиная от первых (первичные культуры) и кончая стадией выхода в клеточную линию.

В результате создан посевной и рабочий банк полученных культур меланомных клеток. Запас клеток, заложенных на хранение в качестве рабочего и посевного банка, заморожен одновременно на одном уровне пассажа из одного клеточного пула, полученного путем субкультивирования. Полученные клеточные линии хранятся в банке криоконсервации биоматериалов РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН. 16 клеточных линий переданы в специализированную коллекцию клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Для морфологического исследования клетки меланомных линий выращивали на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри. После образования монослоя (на 3-4-е сутки) стекла извлекали из чашек Петри, клетки фиксировали и окрашивали по методу Лейшмана.

Для кариологического исследования цитогенетические препараты готовили по стандартной методике [Short protocols in human genetics: a compendium of methods from current protocols in human genetics / Dracopoli N.C. et al. (eds) - Willey, 2004]. Для каждой культуры анализировали не менее 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно международной номенклатуре ISCN (2005). Препараты анализировали под световым микроскопом при увеличении хЮОО.

Для иммуноцитохимического исследования из полученных клеточных линий цитопрепараты готовили осаждением клеток на цитоцентрифуге Universal 16А. Для иммуноцитохимического исследования использовали следующие антитела против дифференцировочных антигенов меланоцитов: CD63, MelanA/MART-1, НМВ45, тиразнназа (производства Novocastra Laboratories).

Определение фенотипа клеточной поверхности проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценцин. Антитела, использованные в работе, представлены в таблице 1.

Экспрессию антигенов на клеточной поверхности оценивали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson), укомплектованным аргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения CELL Quest. В каждой пробе анализировали до 5000 событий. Анализируемый гейт устанавливали на основании комбинации светорассеивания и размера клеток.

Определение антигенов главного комплекса гистосовместимости HLA-A,B,C клеточных линий проводили набором сывороток антилейкоцитарных HLA-A, В, С (Межрегиональный центр иммунодиагностики и гистотипирующих реагентов «Гисанс» г. Санкт-Петербург).

Исследование генов антигенов на клеточных линиях проводили методом ПЦР. Определяли экспрессию дифференцировочных антигенов меланомы (ДАМ): MLANA, TYR, S1LV, S100B и 15 раково-тестикулярных генов: семейства GAGE; MAGE; В AGE, NY-ESO-1; а также контрольные гены - HLA-G, HLA-E, GAPDH. Последовательности нуклеотидов ген-специфических праймеров были выбраны при помощи программы ОН99 фирмы «Техноген» (Москва, Россия), синтезированы на фирме «Синтол» (Москва, Россия) и получены из лаборатории генной инженерии НИИ экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения Российского кардиологического научно-

производственного комплекса Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Таблица 1

Моноклинальные антитела, использованные в работе

МКА Кластер дифферепцпровки Клеточная специфичность

'IC090 CD3 Зрелые Т-лимфоциты

ICO 180 CD20 В-лимфоциты

IC053 HLA-АДС Антиген I класса гистосовместимости, экспрессирован на клетках разных типов и разных стадиях дифференцировки

IC01 HLA-DR Антиген II класса гистосовместимости экспрессирован на клетках разных типов и разных стадиях дифференцировки

ICO 184 CD54 Молекулы адгезии ICAM-1, лиганд для LFA-1 и МАС-1

ICO 160 CD95 FAS- антиген, опосредующий апоптоз

IC0218 Предположительно HMW Поверхностный антиген клеток меланомы

"CD63 CD63 Меланомный маркер, используется для идентификации меланоцитных клеток

CD34 CD34 Маркер гемопоэтнческих стволовых клеток, экспрессирован на эмбриональной и нервной ткани.

CD80 CD80 Ко-регулятор активированных CD86 Т-клеток

CD86 CD86 Ко-регулятор активированных CD80 Т-клеток

* - Моноклональные антитела ICO предоставлены фирмой НПЦ «МедБиоСпектр» (Россия).

** — Моноклональные антитела CD - фирмы Serotec.

Статистическую обработку проводили с помощью стандартного пакета программ Excel и программы Cell Quest.

Результаты и обсуждение исследований.

Из образцов опухоли, полученных хирургическим путем от пациентов с диагнозом метастатическая меланома кожи, получено 19 стабильно растущих клеточных линий (табл. 2). Количество пассажей, указанных в таблице, соответствует моменту депонирования клеточных культур.

Полученные клеточные лппнн меланомы человека

№ п/п Название линии Дата получения материала Количество пассажей

1 ше1 Р .27.01.99 >100

2 те1 Ког 6.12.02 >100

3 ше1 М1р 15.01.02 35

4 ше1 И 02.04.01 >100

5 те1 Ь 16.01.04 30

6 те1 Б! 19.03.03 30

7 те1 Ме 22.11.02 25

8 те1 Сиэ 13.01.04 30

9 те1 Ъ 26.06.03 28

10 ше1 Квеп 07.06.01 25

11 те1 Нп 19.11.04 20

12 те1 01 11.09.01 30

13 те11Ьг 24.01.01 >100

14 те1Я .29.06.99 25

15 те1 Яас 15.03.02 30

16 те1 СЬ 06.12.02 30

17 те1 ВвР 09.04.03 30

18 те1Н 27.09.01 30

19 те1 СЬег 16.04.03 30

Морфологический анализ показал наличие в культурах трех видов клеток: эпителиоподобных, веретенообразных и невусоподобных или их сочетания. Линии различались по степени полиморфизма и атипии, количеству пигмента, митозов, гигантских многоядерных и одноядерных клеток. Среди полученных клеточных линий пигмент в цитоплазме присутствовал в четырех культурах. Клеточные элементы с морфологическими признаками лимфоцитов в цитограммах не выявлялись.

По преобладанию морфологических форм клеточные линии были разделены на три группы: высокодифференцированные, умереннодифференцированные и низкодифференцированные (табл. 3). Данная характеристика отражает не только морфологические, но и сочетается с кариологическими и генными характеристиками. Умереннодифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризуются большим объёмом кариологических нарушений

и большей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умереннодифференцированными линиями.

Таблица 3

Степень дифферепцнровкн опухолевых клеток полученных линий

Степень дифферепцнровкн клеток Число лшшп Название .пиши

Высоко -дифференцированные 2 ше1 в!; ше1 Ме

Умеренно -диффференциро ванные 7 ше1 ше11Ь; те1 Р; те1 Я; ше1 Кзеп; те1 Ъ\ те1 Нп

Низко -дифференцированные 10 те! СЬег; те111ас; те1 Ког; те! М1р; те1 виз; те1 к; те! 1Ьг; те1 И; те! СИ; те! Н

Кариологическое исследование показало, что в двух высокодифференцированных клеточных линиях модальное число хромосом соответствовало околодиплоидному набору: 46-49 хромосом в клетках культуры те1 81 и 47-50 хромосом в те! Ме. Общее число идентифицированных хромосомных повреждений, включая структурные и числовые (анеусомии), составило в обеих культурах 4 на клетку. В семи умереннодифференцированных клеточных линиях число обнаруженных хромосомных аномалий в культурах было от 5 до 7 на клетку; линии были различной плоидности: ди-, три- и тетраплоидные. Среди низкодифференцированных клеточных линий в шести культурах модальное число хромосом соответствовало триплоидному набору, в трех - тетраплоидному и одна была околодиплоидной. Число идентифицированных структурных и числовых хромосомных аномалий в большинстве низкодифференцированных культур было больше 5 на клетку, в диплоидной культуре ше1 виз, в частности, достигло 11.

Обнаружен также высокий уровень нестабильных хромосомных аберраций: хроматидные обмены, ди- и трицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы, клетки с множественными аберрациями. Среди крайне разнообразных числовых и структурных хромосомных нарушений (транслокации, делеции, дупликации, инверсии, кольцевые хромосомы, изохромосомы, маркерные хромосомы)

некоторые встречались с высоким постоянством, в том числе полисомия по хромосоме 7, полисомия по короткому плечу хромосомы 6, моносомия по короткому плечу хромосомы 9, различные транслокации с участием хромосомы 1, что является характерными нарушениями для меланомы (Bale S.J., et al.,1989, Hoglund M. et al., 2004) и связывается с наличием в указанных хромосомах генов, участвующих в инициации или прогрессии меланомы (Sargent L.M. et al., 2001).

Иммуноцитохимическое исследование проведено на всех 19 клеточных линиях меланомы (табл. 4).

Таблица 4

Экспрессия дпффереицпровочных антигенов при иммуноцитохимическом исследовании

№ п/п Название лшшп Антигены

CD63 Melan A HMB45 Тирозиназа

1 melP pos neg pos neg

2 mel Kor pos pos pos pos

3 mel Mtp pos neg neg neg

4 mel IL pos pos pos pos

5 mel Is pos pos pos pos (слабо)

6 mel Si pos neg pos pos

7 mel Me pos pos pos neg

8 mel Gus pos pos pos neg

9 mel Z pos pos pos pos

10 mel Ksen pos neg pos neg

11 mel Hn pos pos pos (слабо) pos

12 mel Gi pos neg neg neg

13 mel Ibr pos neg neg neg

14 mel R pos neg neg neg

15 mel Rac pos neg neg neg

16 mel Ch pos neg neg neg

17 mel BGF pos neg neg neg

18 mel H pos neg neg neg

19 mel Cher pos neg pos pos

Экспрессию исследуемых маркеров наблюдали в цитоплазме клеток с различной интенсивностью окрашивания. Окрашивание клеток со средней и сильной интенсивностью считали положительной реакцией, отсутствие окрашивания или слабое окрашивание принимали за негативную реакцию. Экспрессию СЭ63 наблюдали во всех исследованных образцах, Ме1апА/МА11Т1 и тиразиназе в 7 из 19 образцов, НМВ45 - в 11 из 19 образцов.

С помощью проточного цитометрического анализа определяли иммунофенотип клеточных линий (табл. 5).

Таблица 5

Иммунологический фенотип культивируемых клеточных лшшн, определенный проточной цитометриеп

№ п/п Название лишш Антигены

Отр. контроль соз С020 НЬА-АВС

1 те1 Р 0,2±0,1 0,1±0,2 0,2±0,1 92,7±5,5 2,3±1,5

2 те1 Ког 0,1±0,1 0,4±0,1 0,4±0,1 0,8±0,3 0,5±0,3

3 те1 М1р 0,4±0,2 0,9±0,2 1,0±0,2 94,0±5,0 70,8±7,5

4 те11Ь 1,2±0,5 0,1±0,2 0,9±0,2 94,4±3,0 3,0±1,1

5 те! Ь 0,5±0,2 1,2±0,1 0,6±0,3 72,6±10,6 25,9±1,5

6 те1 в! 0,1 ±0,1 0,5±0,1 0,1 ±0,1 88,6±10,1 91,1±5,1

7 ше1 Ме 0,2±0,1 0,5±0,1 0,3±0,1 88,7±6,5 36,7±7,0

8 те1 вив 1,4±0,7 1,5±0,3 0,7±0,3 93,1 ±5,3 93,9±3,1

9 те1 Ъ 1±0,5 2,4±0,5 0,3±0.5 93,3±6,4 4,4±1,2

10 те1 Кзеп 1,0±0,3 1,9±0,4 0,8±0,4 81,3±13,7 94,7±3,1

11 те1 Нп 0,4±0,2 0,6±0,2 0,4±0,2 70,4±18,9 19,5±3,4

12 те1 2,1 ±0,7 2,8±0,5 1,6±0,5 89,8±5,0 34,8±2,2

13 ше11Ьг 1,0±0,5 1,8±0,3 1,8±0,3 88,6±10,4 46,7±1,3

14 те1 Я 0,8±0,4 0,5±0,4 0,1±0,4 80,7±5,1 3,0±1,5

15 те11Ъс 2,1 ±0,2 1,6±0,4 1,6±0,4 84,5±9,4 63,2±3,5

16 те! С1\ 0,3±0,1 1,0±0,2 0,5±0,5 82,5±14,0 25,Ш,5

17 те1 ВОР 0,7±0,3 0,9±0,3 1,9±0,3 76,1±11,6 14,3±0,5

18 те1Н 0,2±0,1 0,6±0,1 0,6±0,1 84,8±14,5 6,9±1,5

19 те1 СЬег 1,2±0,5 1,2±0,5 1,0±0,5 85,7±9,5 61,0±3,5

На поверхности всех клеток отсутствовали лимфоидные маркеры Т- и В-лимфоцитов (CD3 и CD20), см. табл.5.

Все 19 клеточных линий, за исключением одной (mel Kor), экспрессировали антиген гистосовместимости первого класса (HLA-ABC). В 13 случааях отмечена экспрессия антигена гистосовместимости второго класса (14,3-97,8% антиген положительных клеток). При этом линия mel Kor, не имеющая антигена гистосовместимости первого класса, также не экспрессировала антиген гистосовместимости второго класса.

Экспрессия антигена CD95 (FAS- антиген, опосредующий апоптоз) была отрицательной во всех исследуемых случаях (табл. 6). Все исследованные клеточные линии экспрессировали на своей поверхности антиген CD54 (молекулы адгезии ICAM-1).

Экспрессия антигена CD80 была оценена в 19 образцах (см. табл. 6), при этом положительная реакция отмечена в 9 случаях (10-24,4% антиген положительных клеток). Экспрессия антигена CD86 также была оценена в этих образцах. Положительная реакция отмечена лишь в одном случае на линии mel Р, которая экспрессировала обе молекулы и CD86 и CD80 (рис.1). Эта клеточная линия была положительной по молекуле гистосовместимости первого класса и отрицательной по молекуле второго класса.

CD80 14,4%

PöfrnTiäf

10° 101 ю2 ю3 ю4

CD86 24,3%

Рис. 1. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции на клеточной линии те! Р; темно-окрашенпаи кривая — негативный контроль, наложенная сверху кривая - клетки, положительно окрашенные моноклональнымн антителами к СЭ80 и С1586

Иммунологический фенотип культивируемых клеточных линий

Антигены

№ ; Название: Il/u линии I

Отр. контроль

CD95

melP | 0,2±0,1 [ 0,5±0,2

CD54 ! CD80

i

64,0±5,5'14,4±0,9

CD86 CD34

21,5±0,7

88,7±3д! 3,3±1,0 ! 0,3±0,1 11 Д±3,5 ; 7,1 ±0,5 , 0,7±0,1

3,9±0,7

2 ; mel Ког

3 ; mel Mtp

4 i mel IL

5 : mel Is

6 mel Si

0,1 ±0,1 0,4±0,2

1,2±0,5 0,5±0,2 0,1 ±0,1

0,3±0,1 1,2±0,2

0,1±0,1 1,7±0,3 0,6±0,4

65,3±2,4 67,8±3,2

24,4±3,2 16,7±0,5

86,8±2,0i 8,1±0,6

0,6±0,3 1,5±0,1 0,3±0,1

7,1 ±2,2 6,7±1,5

I__________

Г6,2±1,2

:15,5±1,0 3,2±0,5

mel Me

0,2±0,1 0,8±0,2

mel Gus

mel Z

10 | mel Ksen

1,4±0,7 1±0,5 1,0±0,3

0,5±0,3 0,2±0,2

—

mel Hn j 0,4±0,2

0,5±0,3 0,3±0,1

76,5±3,5 42,6±1,7 87,2±2,3

14,4±0,4

0,6±0,1

2,1±0,3

10,0±1,2 9,1±1,7

2,7±0,2

6,1±0,2

12 mel Gi | 2,1±0,7 i 2,3±0,2

13 ; mel Ibr 14l mel R

15 mel Rac

1,0±0,5

mel Ch mel BGF

18. mel H

0,8±0,4 2,1±0,2 0,3±0,1 0,7±0,3 0,2±0,1

0,4±0,2 0,1±0,1

80,6±1,5

35,7±5,0

90,4±1,3 73,6±2,5

1,6±1,1 0,1 ±0,1 11,5±0,5

19. ; mel Cher 1,2±0,5

0,8±0,2

2,l±-,3

41,7±1,1 71,9±1,7

4,4±2,2 7,3±1,5

1,0±0.1

12,8±2,3 ;

0,9±0,1

5,1±1,1 7,3±1,6

6,2±2,0

17,9±1,5

0,4±0,2 0,1±0,1

1,6±0,5 2,4±0,2

83,7±1,2

76,3±1,5

62,3±2,1

1,0±0,5 3,3±1,5 2,0±0,8

0,3±0,1 0,2±0,1

12,2±0,2

0,8±0,2

0,4±0,1 3,9±0,3

11,5±3,3

2,7±0,4

10,7±1,2 ;

17,0±3,0 12,9±1,5 6,9±2,0 6,5±0,5

10,6±0,5 4,3±0,3 ¡44,5±3,0

В 8 случаях из 19 отмечена положительная экспрессия антигена CD34 (10,723,0% антигенположительных клеток) (табл. 6). Примеры положительной экспрессии CD34 представлены на двух клеточных линиях, прошедших более 100 -пассажей mel Ibr и mel Cher (рис. 2, 3).

Рис. 2. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции на клеточной линии те1 1Ьг; темно-окрашенная кривая - негативный контроль, наложенная сверху кривая — клетки, положительно окрашенные моноклональными антителами к С 1)34

Рис. 3 Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции на клеточной линии mel Cher; темно-окрашенная кривая - негативный контроль, наложенная сверху кривая — клетки, положительно окрашенные моноклональными антителами к CD34

Экспрессию антигенов гистосовместимости I (HLA-A,B,C) и II (HLA-DR) класса смотрели в динамике на 10-м, 20-м и > 30-м пассаже (табл. 7). При исследовании экспрессии антигенов гистосовместимости первого и второго класса в одном случае выявили их полное отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других - тенденцию к увеличению антигенов гистосовместимости второго класса. Только на одной из 19 клеточных линий, при исследовании десятого пассажа, антиген гистосовместимости первого класса отсутствовал (Mel Kor). На этой линии так же отсутствовал антиген гистосовместимости второго класса. При исследовании последующих пассажей экспрессия антигенов гистосовместимости на этой линии так же отсутствовала (рис. 4).

Рис. 4. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции на клеточной линии inel Kor; темно-окрашенная кривая — негативный контроль, наложенная сверху кривая - клетки, положительно окрашенные моноклональными антителами к HLA-ABC и IILA-DR

Изменения экспрессии антигенов гистосовместнмости I (НЬА-А, В, С) и II (НЬЛ-Б!*) класса в динамике

№ п/п Клеточная линия НЬА-АВС НЬА-ОЯ

пассаж пассаж

10 20 30 10 20 30

1 те1 Р 88,9±1,5 89,9±1,7 99,3±0,5 6,9±1,5 4,3±0,6 2,3±1,5

2 те1 К.ог 1,0±0,1 0,1±0,1 0,1±0,1 1,5±0,5 0,1±0,1 0,4±0,2

3 ше11Мр 99,3±0,3 99,1±0,2 83,5±1,5 10,Ш,2 78,2±1,2 63,3±1,3

4 те111 98,8±0,5 91,5±0,6 92,9±0,5 6,4±0,8 0,9±0,9 1,9±0,2

5 те1 43,0±5,3 88,5±3,5 86,2±2,3 4,3±0,5 24,5±0,5 26,2±1,0

6 те1 81 80,0±4,5 86,2±4,0 99,5±0,2 3,8±1,2 30,7±0,5 96,0±0,5

7 те! Ме 87,6±3,7 84,3±3,5 94,1 ±0,5 9,7±2,1 29,7±1,0 43,7±1,3

8 те1 Оиэ 81,8±5,2 98,4±0,5 98,2±0,5 2,6±0,9 97,8±0,5 90±1,5

9 те1 Ъ 85,5±4,2 94,8±1,4 98,7±0,3 3,0±0,8 5,1±0,1 5,1±0,1

10 те1 Квеп 60,4±1,5 61,8±2,5 97,4±0,5 42,9±1,2 91,Ш,9 91,7±1,0

11 те1 Нп 93,3±0,8 86,3±3,4 31,7±10,8 24,9± 2,1 16,5±1,1 17,2±1,5

12 те1 О 95,2±1,5 97,9±1,6 89,8±3,5 4,7±0,3 32,0±1,0 37,6±1,0

13 те11Ьг 84,5±3,4 81,9±3,5 99,5±0,3 9,5±1,1 46,2±1,2 47,2±1,2

14 те1 Я 85,1±2,5 83,7±2,4 73,3±4,4 4,7±1,2 2,9±0,9 1,4±0,5

15 те1 Яас 80,9±3,1 78,8±2,3 93,8±2,1 0,1 ±0,2 17,7±1,0 63,2±2,2

16 ше1 СЬ 83,5±5,0 68,0±5,5 96,0±1,2 2,2±0,1 12,6±0,6 25,1±1,1

17 Ме1 ВдГ 87,4±3,3 73,7±3,5 67,1±5,7 1,4±0,1 1,3±0,3 14,3±1,4

18 те1 Н 78,0±5,0 77,4±5,1 98,9±1,2 1,6±0,3 1,7±0,3 6,9±0,9

19 те1 СЬег 76,0±5,4 83,1±5,3 98,1±1,0 34,1±1,0 35,3±1,0 61,0±1,0

Количество антиген положительных клеток НЬА-А,В,С на 10-м пассаже на всех клеточных линиях колебалось от 43% до 99,3%. После длительного культивирования (20 и 25 пассаж) экспрессия антигена НЬА-А,В,С только в одном случае значительно снизилась (от 93,3% до 31,7%).

Исследование экспрессии антигенов гистосовместнмости второго класса выявило в одних случаях полное их отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других - тенденцию к увеличению. Количество антигенположительных клеток антигена гистосовместнмости второго класса (НЬА-ОЛ) на 10-м пассаже определялось на четырех линиях и составило от 10,1% до 42,9%. К 20-му пассажу

уже 12 клеточных линий имели повышенный уровень экспрессии НЬЛ-БЯ (от 16,5 до 78,2% антигенположительных клеток), а к 30 пассажу 13 линий имели повышенную экспрессию НЬА-ОЯ (от14,3% до 96% антигенположительных клеток).

Пример повышения экспрессии НЬА-ВЯ в процессе культивирования представлен для клеточной линии те1 81 (рис. 5).

ю ю ю Я.1-Н

ю' ю1- 10

Я.1-Н

ю' ю' ю ВЛ-Н

Рис. 5. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции на клеточной линии ше1 81; темно-окрашенная кривая - негативный контроль, наложенная сверху кривая - клетки, положительно окрашенные моноклональнымн антителами к ПГЛ-1)К, А-3-й пассаж-2% антигенположительных клеток; Б - 10-й пассаж - 61% антигенположительных клеток; В-30-й пассаж-96% антигенположительных клеток.

Наличие антигена гистосовместимости второго класса влияет на иммунологическую реакцию, которая может развиваться через взаимодействие комплекса НЬЛ-БЯ с Т-клеточным рецептором (С^гапё-КозгпЬе^ 8. й а1., 1999). Потеря или снижение экспрессии антигена гистосовместимости первого класса может приводить к ускользанию меланомных клеток от иммунного ответа (Кавв К. й а1„ 2008).

При использовании МКА 1С0218 к меланомаассоциированному антигену (HMW), полученных в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, положительная экспрессия НМ\У выявлена в 11 из 14 образцов клеточных линий (71%) (табл. 8).

Экспрессия меланомаассоцнированного антигена

на клеточных линиях меланомы

№ Клеточная Отрицательный. IC0218

п/п линия контроль (HMW)

1 MelP 0,2±0,1 89,5±3,5

2 Mel Kor 0,1±0,1 79,2±5,5

3 Mel Mtp 0,4±0,2 59,7±10,3

4 Mel II 1,2±0,5 46,9±5,1

5 Mel Si 0,1 ±0,1 62,0±3,5

6 Mel Me 0,2±0,1 10,5±0,5

7 Mel Gi 2,1±0,7 91,8±2,5

8 Mel Ibr 1,0±0,5 66,8± 7,2

9 Mel R 0,8±0,4 78,2±8,2

10 Mel Rae 2,1±0,2 60,0±7,6

И Mel Ch 0,3±0,2 78,1±5,5

12 Mel BGF 0,2±0,3 11,7±0,3

13 Mel H 0,2±0,1 11,7±0,1

14 Mel Cher 1,2±0,5 6,5±4,5

Экспрессия раково-тестикулярных антигенов рестректирована определенными аллелями антигена гистосовместимости I класса. В связи с этим мы изучили фенотип НЬА I класса на клеточных линиях (табл. 9).

Самые часто встречаемые гены А26 (10) - выявлен на 6 линиях; НЬАЗ - на 6 линиях; и на 5 линиях НЬА2 и НЬА23. Остальной фенотип отмечен менее чем на 4 линиях, см.табл. 9.

При исследование клеточных линий методом ПЦР выявлена экспрессия опухолевыми клетками пяти дифференцировочных антигенов меланомы и 15 раково-тестикулярных генов, а также контрольные гены - НЬА-С, НЬА-Е, ОАРОН.

При анализе отмечено, что гены дифференцировочных антигенов экспрессированы на клеточных линиях в 17 случаях из 19 - ген ЭЮОЬ; в 12 из 19 -ген ТУЛ; в 13 случаях из 19 - ген МЬАИ ив 16 из 19 - ген БИ.У. Определена неоднородная экспрессия раково-тестикулярных генов клеточными линиями.

Для создания рабочего и посевного банка линии исследованы на стерильность: микробиологическими методами на бактерии и грибы, методами иммуноферментного анализа и ПЦР на отсутствие ДНК- и РНК-содержагцих вирусов, хламидий, токсо- и микоплазм. Результаты - отрицательные (табл. 10). Клеточные линии, заложенные на хранение в качестве рабочего и посевного банка,

заморожены одновременно на одном уровне пассажа из одного клеточного пула,

полученного путем субкультивирования.

Таблица 9

НЬА-фсиотпп аптпгенов гистосовместнмостн I класса

№ п/п Клеточпаи линия Фенотип Рестрнктировапность

1. ше1 Р А23(9),А2б(10); В7,В56(22) НЬА23: МАвЕ-б; В7 (ЯАОЕ)

2. ше1 Ког АЗ,А26(10),В62(15),В55(22) НЬАЗ: МАОЕ-1 ,МАОЕ-З

3. ше1 М1р АЗ,А26(10),В13,В41 НЬАЗ: МАОЕ-1,МАОЕ-З

4. ше111 А23(9),А26(10); В7,В56(22) НЬА23: МАйЕ-б

5. ше1 к А2,В7,В64(14) НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО; МАЯТ-1

6. ше1 А1,АЗ,В51(5),В39(16) НЬА1: МАОЕ-1, МАОЕ-З

7. те1 Ме А2,АЗ 1 (19),В58( 17),В56(22) НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО; МАЯТ-1

8. те1 виз А1,АЗ,В8,В60(40) НЬАЗ: МАОЕ-1,МАОЕ-З

9. те1 Z А11,А26(Ю);В62(15),В44(12) НЬА2б: эагМ

10. те1 Кэеп А24(9),А30( 19);В39( 16),В60(40) —

11. те1 Нп А1 ,А23(9);В51 (5),В8 НЬА1: МАОЕ-1, МАОЕ-З

12. те1 01 А1,А30(19),В8,В44 (12) НЬА1: МАОЕ-1, МАОЕ-З

13. те11Ьг А2,А24(9),В35,В62(15) НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО; МАЯТ-1

14. те1 Я А2, В27, В64(14) НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО;МАЯТ-1

15. те1 Яас А23 (9),А26( 10),В39(16),В8 НЬА23: МАйЕ-б

16. те1 СИ А1,АЗ, В8,В63(15) НЬА1: МАОЕ-1, МАОЕ-З

17. Ме1 Bgf А2,А23(9),В62( 15),В18 НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО; МАЯТ-1

18. те1 Н АЗ,А30(19),В13,В7 НЬАЗ: МАОЕ-1,МАОЕ-З

19. те1 СЬег А2, А25(10),В51(5),В49(21) НЬА2: Тирозиназа; ОрЮО; МАЯТ-1

Результаты микробиологического обследования клеточных линий

Предмет исследования

CMV

ВИЧ

Гепатит С

Вирус папилломы человека Mycoplasma species

Гепатит В

Herpes В virus

Методы исследования

Результаты исследования

Молекулярные исследования

Бактерии и грибы

: Микробиологические i исследования ;

отр.

отр.

отр.

отр. отр. отр. отр.

отр.

Полученные клеточные линии хранятся в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Для создания противоопухолевых вакцин отобраны две клеточные линии mel Ког и mel Р. Клеточные линии получены из метастатического подкожного очага диссеминированной меланомы кожи. Клеточные линии прошли более 100 пассажей.

Клеточная линия mel Р характеризуется наличием полиморфных меланомных клеток преимущественно веретенообразной и вытянутой удлиненной формы с четкими границами базофильной цитоплазмы и гипер- и нормохромными ядрами с одиночными нуклеолами. Отмечаются почкование и фрагментация в отдельных крупных ядрах. Присутствуют гигантские многоядерные клетки с 3-5 ядрами и многочисленные фигуры клеточного деления. Число хромосом в клетке -от 55 до 84. Модальное число - 79 хромосом. Постоянные маркеры: mi, m2, m3, т4, т5 и тб.

Клеточная линия mel Р культивируется в питательной среде RPMI 1640 с содержанием 10% эмбриональной сывороткой, антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). При посевной концентрации 70-100 тыс.клеток/мл монослой формируется на 2-3-е сутки. Клетки снимают с использованием стандартного раствора Версена.

Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, тест на микоплазму отрицателен. Полученная клеточная линия mel Р, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости) с помощью методов иммунофлуоресценции, иммуноцитохимии и ПЦР. Клеточная линия mel Р характеризуется экспрессией меланомных дифференцировочных маркеров: CD63, НМВ45 и HMW, подчеркивающих ее специфичность. Положительная экспрессия раково-тестпкулярного маркера MAGE-3 соответствует онкологическому профилю и позволяет использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса. На этой линии также представлена экспрессия Ко-стимулирующих молекул CD86 и CD80 (см. рис. 1).

Таким образом, клеточная линия меланомы человека mel Р имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов (CD63, НМВ45, HMW) и раково-тестикулярного (MAGE-3), что позволяет ее применять для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. Клетки посевного банка были одобрены и зарегистрированы Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JT.A. Тарасевича. Клетки линии mel Р трансфецированны геном tag-7 и на их основе создана вакцина «Аллоген».

Клеточная линия mel Kor характеризуется множественными плотными центрами роста опухолевых клеток, полиморфными меланомными клетками вытянутой, округлой и неправильной формы. В клетках обнаруживаются нормо- и гиперхромные ядра округлой и овальной формы, содержащие одиночные нуклеолы, базофильная негомогенная, иногда вакуолизированная цитоплазма. Имеются гигантские многоядерные клетки, митозы.

Клеточная линия mel Kor культивируется в питательной среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной сывороткой, антибиотиками (пенициллином со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). При

посевной концентрации 70-100 тыс.клеток/мл монослой формируется на 2-3-и сутки. Клетки снимают раствором Версена. Для длительного хранения клетки замораживавают в жидком азоте. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%. При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены, тест на микоплазму отрицателен. Полученная клеточная линия mel Kor, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости) с помощью методов иммунофлуоресценции, иммуноцитохимии и ПЦР. Клеточная линия меланомы кожи человека mel Kor имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в многообразии дифференцировочных антигенов (CD63, НМВ45, HMW, MelanA, тирозиназа) и экспрессии раково-тестикулярного - MAGE-3, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. Отсутствие антигенов гистосовместимости первого и второго класса позволяет использовать клеточную линию mel Kor в создании противоопухолевых вакцин. Клетки посевного банка были одобрены и зарегистрированы Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича. Клетки линии mel Kor трансфецированны ГМ-КСФ и на их основе создана вакцина «Мелавак».

Обе клеточные линии хранятся в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 687Д и под номером РККК (П) 688Д. Представленные клеточные линии трансфецированны генами tag-7 (mel Р) и ГМ-КСФ (mel Kor), обладающими хемоатрактантными свойствами к дендритным клеткам. К настоящему времени проведена первая фаза клинических испытаний с этими вакцинами, и на них получено разрешение в Этическом комитете ФГУНЦ ЭСМП РОСЗДРАВНАДЗОРА на проведение второй фазы клинических испытаний.

ВЫВОДЫ

1. Создан клеточный банк на основе полученных из меланомы кожи человека 19 аттестованых клеточных линий, необходимый для создания противоопухолевых вакцин.

2. Выявлена стабильная экспрессия меланомаассоциированного антигена CD63 во всех полученных клеточных линиях и, в части, из них меланома-ассоциированных антигенов тирозиназы, Melan А и НМВ-45.

3. Показано, что уровень хромосомных нарушений в клетках увеличивается по мере снижения уровня морфологической дифференцировки от высокодифференцированных до низкодифференцированных.

4. Выявлена неоднородная иммунофеиотипическая характеристика клеточных линий, что позволяет использовать их для получения опухолевых лизатов в различных комбинациях.

5. Выявлено возрастание экспрессии антигенов гистосовместимости II класса. 11 из 19 клеточных линий, антиген-негативных на первых пассажах, к 10-му пассажу стали антиген-позитивными. В одной клеточной линии отсутствовали антигены гистосовместимости I и II класса. Выявлено, что клеточные линии неоднородны по гаплотипу антигенов гистосовместимости I класса.

6. Показана высокая гетерогенность клеточных линий по иммунологическому фенотипу клеток И по экспрессии мРНК раково-тестикулярных антигенов.

8. Отобраны клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин «Аллоген» (mel Р) и «Мелавак» (mel Kor).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Михайлова И.Н., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Козлов А.М, Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., Тюляндин С.А., Гарин A.M., Носов Д.А., Киселев С.Л., Ларин С.С., Барышников АЛО., Георгиев Г.П. Активная специфическая иммунотерапия меланомы и рака почки вакциной tag7. I фаза клинического изучения. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 17-20 марта 2002. Российский биотерапевтический журнал. -2002. -Т.1, Ks 2.-С.133.

2. Михайлова И.Н., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Козлов А.М, Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., Тюляндин С.А., Гарин A.M., Носов Д.А., Кадагидзе З.Г., Буркова А.А., Заботина Т.Н., Киселев С.Л., Ларин С.С., Барышников А.Ю., Георгиев Г.П. Вакцина tag7. I фаза клинического изучения. // I Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака» Москва 18-20 июня 2002. -№ 30. - С.63-64.

3. Mikhaylova I., Morozova L., Burova О., Palkina Т., Kozlov A., Wainson A., Kadagidze Z., Zabotina Т., Khatyrev S., Jordania K., Nosov D., Tulandin S., Garin A., Demidov L., Barishnikov A., Kiselev S., Larin S., Georgiev G. // Autologous tag7 modified anti-cancer vaccine: preliminary study of Phase. I clinical trial. I clinical trial. European Society of gene therapy. 11th Annual Congress, Edinburg, UK, November 14-17. -2003. Abstract book. P.95.

4. Михайлова И.Н., Демидов Л.В., Барышников А.Ю., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Харкевич Г.Ю., Палкина Т.Н., Козлов А.А., Вайнсон А.А., Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н., Буркова А.А., Дорошенко М.Б., Хатырев С.А., Носов Д.А., Гарин A.M.,Тюляндин С.А., Киселев С.Л., Ларин С.С., Георгиев Г.П. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7. // Сибирский онкологический журнал. -2005.-№ 1 (13). - С.23-27.

5. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Палкина Т.Н., Козлов А.А., Голубева В.А., Черемушкин Е.А., Дорошенко М.Б., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Ларин С.С., Георгиев Г.П. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин. // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2005. - №7. -С.37-40.

6. Бережной А.Е, Ларин С.С., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н., Киселев С.Л., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - №1. - С.6.

7. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С., Лукашина М.И., Морозова Л.Ф., Голубева В.А., Петренко Н.Н., Черемушкин Е.А., Демидов Л.В.,

Барышников А.Ю., Киселев C.JI., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Бибилашвили Р.Ш. Клеточные линии меланомы. // Материалы V Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2006. - Т.5, № 4 -С.15.

8. Михайлова И.Н., Воронина Е.С., Дышева Н.М., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Черемушкин Е.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Кариологические исследования клеточных линий меланомы кожи человека. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 21-24 марта 2006. Российский биотерапевтическин. журнал. - 2006. - Т.5, №1. - С.5.

9. Михайлова И.Н., Бурова О.С., Лукашина М.И., Морозова Л.Ф., Утяшев И.А, Петенко H.H., Барышников К.А., Иванов П.В., Парсункова К.А., Черемушкин Е.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками. // Материалы 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» 22-26 мая 2006. Санкт-Петербург. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2006. - Т. 10, № 2. - С.25

10.Mikhaylova I.N., Burova O.S., Lucashina M.I., Morozova L.F., Utyashev U.A., PetenkoN.N., Barishnikov K.A., Ivanov P.V, Parsunkova K.A., Cheremushkin E.A., Demldov L.V., Barishnikov A.U. Gene modified tumor cell based vaccine therapy of advanced melanoma 8th International Biological Therapy of Cancer, Dresden. - 2006. -June 21-24.

П.Михайлова И.H., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л..В., Палкина Т.Н., Козлов A.M., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В. Патент на изобретение «клеточная линия mel Р». № 2287575. Российский патент июнь 2006.

12.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Козлов A.M., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В. Патент на изобретение «клеточной линии Mel Kor». № 2287578. Российский патент июнь 2006.

13. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Лукашина М.И., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев

H.B. Патент на изобретение «клеточной линии Mel И». № 2287577. Российский патент июнь 2006. Н.Михайлова И.Н., Барышников К.А., Бурова О.С., Лукашина М.И., Смирнова

A.Л., Петенко H.H., Утяшев H.A., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированой вакцины. Оценка иммунного статуса. // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т.5, №3. - С.51-54.

15.Барышников К.А., Михайлова И.Н., Бурова О.С., Иванов П.К. Повышение экспрессии активационных маркеров и увеличение содержания лимфоцитов в коже при вакцинотерапии препаратом аллоген. // Тезисы IX Международной конференции молодых онкологов. - 2008. - С.15. ló.Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Morozova L.F., Golubeva V.A., Cheremushkin E.A., Lukashina M.I., Voronina E.S., Burova O.S., Utyashev I.A., Kiselev S.L., Demidov L.V., Beabealashvilli R.Sh., Baryshnikov A.Y. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. // Melanoma Res. -2008.-Oct; 18(5):303-13, 11.

17.Ковалевский Д.А., Михайлова И.Н., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Голубева

B.А., Воронина Е.С., Черемушкин Е.А., Утяшев И.А., Аллахвердян Г.С., Петенко H.H., Кондратьева Т.Т., Киселев С.Л., Демидов Л.В., Бибилашвили Р.Ш., Барышников А.Ю. Экспрессия раково-тестикулярных генов при определении дифференцировки клеток меланомы кожи. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва 21-22 апреля 2009. Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, № 2. С.64.

18.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Mtp, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2360963. Российский патент июнь 2009.

19.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Si, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2363734. Российский патент 10 августа 2009.

20.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев СЛ., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Cher, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2364624. Российский патент 20 августа 2009 .

21. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Gus, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2373280. Российский патент 20 ноября 2009.

22. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Ch, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2373279. Российский патент 20 ноября 2009.

23.Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С., Голубева В.А., Морозова Л.Ф., Воронина Е.С., Утяшев И.А., Аллахвердян Г.С., Субраманиан С., Кондратьева Т.Т., Черемушкин Е.А., Киселев С.Л., Демидов Л.В., Барышников А.Ю., Бибилашвили Р.Ш. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. //Сибирский онкологический журнал.- 2010. -№ 1(37). - С.29-39.

24. Михайлова И.Н., Иванов П.И., Петенко H.H., Барышников К.А., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Черемушкин È.A., Субраманиан С., Чкадуа Г.З., Барышников А.Ю., Демидов Л.В. Внутрикожиая клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №1.- С.63-67.

25.Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н., Барышников АЛО. Сравнение уровня экспрессии HSP70 на клеточных линиях меланомы. // Российский биотерапевтический журнал. -2010. - Т.9, №1- С.43-47.

26.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Bgf, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2390557. Российский патент 27 мая 2010.

27. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Z, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2390556. Российский патент 27 мая 2010.

28.Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А. Патент на изобретение «Клеточная линия меланомы человека mel Ksen, используемая для получения противоопухолевых вакцин». № 2008151673. Российский патент 20 июня 2010.

Подписано в печать о 2. о 7.1 о Формат 60 х 84/16 Бумага офисная «ЗуеюСору». Тираж 100 экз. Заказ №577 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы. Одним из направлений в лечении онкологических заболеваний является иммунотерапия [9]. Благодаря развитию биотехнологии, активно разрабатываются новые методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета. Большое место в исследованиях этой области занимает создание противоопухолевых вакцин и вакцинотерапия [4, 5, 9, 139, 141, 180]. Вакцины создаются с использованием модифицированных аутологичных или аллогенных опухолевых клеток [7, 23, 24, 36, 58, 95]. Широко исследуются вакцины с использованием дендритных клеток [4, 10, 22, 25, 123, 171].

Принцип вакцинотерапии основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов.[4, 5, 20, 23] Т-клетки, играющие роль в клеточно-опосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикацией по антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) [35, 44, 46]. Поэтому идентификация опухолевых антигенов и молекул ГКГ"представляет несомненный интерес для разработки вакцин с использованием линий клеток, полученных из опухолей человека.

Одним из объектов для изучения вакцинотерапии является меланома - опухоль, растущая из меланоцитов [1]. На ранних стадиях меланома эффективно лечится с помощью хирургического метода. Однако диссеминированная меланома поддается терапии чрезвычайно плохо. Только у очень ограниченной группы больных с помощью стандартной химио-, лучевой и биотерапии удается добиться лечебного эффекта. Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей опухолеассоциированные антигены. Этот факт послужил основанием в выборе меланомных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

За последние годы достигнут значительный прогресс в идентификации антигенов, ассоциированных с меланомой, узнаваемых цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) [34, 42]. Антигены можно разделить на три главные группы: опухолеассоциированные, раково-тестикулярные и дифференцировочные антигены [28].

Цельные опухолевые клетки, как правило, содержат большое количество разнообразных опухолевых антигенов [12, 13], часть из которых может быть иммуногенной, что является важным условием для создания вакцины.

Использование аллогенных опухолевых вакцин базируется на представлении, что клетки опухоли от разных индивидуумов могут иметь общие опухолеассоциированные антигены [2, 12, 28, 116], которые способны индуцировать значимый иммунный ответ. Аллогенные вакцины получают из клеточных линий, подобранных таким образом, чтобы обеспечивать максимальное представительство опухолеассоциированных антигенов [4, 20, 23].

В связи с этим получение клеточных линий меланомы, изучение их антигенной структуры, определение иммуногенности является актуальной задачей.

Цель исследования: получение и характеристика клеточных линий, адаптированных к росту in vitro, из образцов меланомы человека, пригодных для создания противоопухолевых вакцин.

Задачи исследования

1. Получить клеточные линии из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани пациентов с диссеминированной меланомой и создать клеточный банк для наработки вакцин.

2. Изучить морфологический, и кариологический фенотип полученных клеточных линий.

3. Определить экспрессию опухолеассоциированных антигенов, раково-тестикулярных антигенов и их генов.

4. Изучить в динамике экспрессию антигена главного комплекса гистосовместимости первого класса и определить аллели антигена — главного комплекса гистосовместимости первого класса.

Научная новизна

Полученные клеточные линии меланомы человека охарактеризованы по ряду многочисленных параметров: морфологических, кариологических и иммунологических.

12 клеточных линий защищены патентами Российской Федерации, из них 5 патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2009 год.

Научно-практическая значимость

Создан рабочий и посевной банк 19 полученных клеточных линий. Линии охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генным параметрам, что позволяет проводить адекватный их выбор для создания противоопухолевых вакцин. На базе коллекции получены две генномодифицированные клеточные вакцины с использованием клеточных линий mel Kor и mel Р. Вакцины прошли первую фазу клинических испытаний и получили разрешение в Этическом комитете и ФГУНЦ ЭСМП РОСЗ ДРАВ НАДЗОР А на проведение второй фазы клинических испытаний.

выводы

1. Создан клеточный банк на основе полученных из меланомы кожи человека 19 аттестованых клеточных линий, необходимый для создания противоопухолевых вакцин.

2. Выявлена стабильная экспрессия меланомаассоциированного антигена CD63 во всех полученных клеточных линиях и, в части, из них меланома-ассоциированных антигенов тирозиназы, Melan А и НМВ-45.

3. Показано, что уровень хромосомных нарушений в клетках увеличивается по мере снижения уровня морфологической дифференцировки от высокодифференцированных до низкодифференцированных.

4. Выявлена неоднородная иммунофенотипическая характеристика клеточных линий, что позволяет использовать их для получения опухолевых лизатов в различных комбинациях.

5. Выявлено возрастание экспрессии антигенов гистосовместимости II класса. 11 из 19 клеточных линий, антиген-негативных на первых пассажах, к 10-му пассажу стали антиген-позитивными. В одной клеточной линии отсутствовали антигены гистосовместимости I и II класса. Выявлено, что клеточные линии неоднородны по гаплотипу антигенов гистосовместимости I класса.

6. Показана высокая гетерогенность клеточных линий по иммунологическому фенотипу клеток и по экспрессии мРНК раково-тестикулярных антигенов.

8. Отобраны клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин «Аллоген» (mel Р) и «Мелавак» (mel Kor).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы явилось получение клеточных линий, адаптированных к росту in vitro из образцов опухолевых тканей человека (меланома), для создания противоопухолевых вакцин. В ходе данного исследования была проведена адаптация клеток к росту in vitro, выделенных из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани. Полученные 19 стабильных клеточных линий охарактеризованы по- морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генетическим параметрам. Это позволило создать рабочий и посевной банк стабильно растущих клеточных линий, используемый для разработки противоопухолевых вакцин. Материалом для исследований послужили образцы опухолевых тканей человека, взятых из метастатических очагов пациентов с диссеминированной меланомой. Полученные клеточные линии1 прошли более 30 пассажей, это характеризует клетки как обладающие неограниченным жизненным потенциалом. Клеточные линии были адаптированы к среде RPMI-1640 и активно росли в присутствии 10% эмбриональной сыворотки, что является приемлемым фактором в создании вакцин, что отмечено также и в работе А.О. Данилова и др. [11] Полученные клеточные линии хранятся в банке криоконсервации биоматериалов Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН, в жидком азоте при температуре минус 196°С, в созданном рабочем и посевном банке. 16 клеточных линий хранятся специализированной в коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург).

При кариологическом исследовании 19 клеточных линий выявлены значительные хромосомные аномалии генетического аппарата клеток (до 11 на клетку) и различный набор хромосом (триплоидный, тетраплоидный, околодиплоидный). В исследуемых линиях часто встречались аномалии 1, 6, 1,9, 10 хромосом, что является характерными нарушениями для меланомы [38, 91] и связывается с наличием в указанных хромосомах генов, участвующих в инициации или прогрессии меланомы [152]. По некоторым данным, определенные аберрации коррелируют с неблагоприятным прогнозом - выживаемостью и метастазированием опухоли. В работе Balazs et al. [39] показано, что агрессивное поведение меланомы сопровождается накоплением множественных генетических повреждений.

По морфологическим признакам клеточные линии были разделены на три группы высокодифференцированные, умереннодифференцированные и низкодифференцированные. Данная характеристика отражала не только морфологические, но и сочеталась с кариологическими и генными чертами. Умереннодифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались бойлыпим объёмом кариологических нарушений и боПлыпей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно- дифференцированными линиями.

Проведено исследование иммунофенотипа клеточных линий. Отмечено отсутствие маркеров CD3 и CD20, характеризующих лимфоидную специфичность. При имммуноцитологическом исследовании все клеточные линии экспрессировали дифференцировочные меланомные маркеры (CD63, MelanA/MARTl, НМВ45), что является характерным для меланомы [115].

Ко-стимулирующие молекулы (CD86) экспрессирована в одном случае и (CD80) в 9 из 19. При этом только одна клеточная линия экспрессировала обе молекулы. Ко-стимул'ирующие молекулы очень важны для взаимодействия опухолевых и лимфоидных клеток, что приводит к увеличению иммуногенности [16, 122].

Все 19 исследованных клеточных линий экспрессировали на своей поверхности антиген CD54 (молекула адгезии ICAM-1, лиганд для LFA-1 и МАС-1). Положительная экспрессия CD54 считается отрицательным прогностическим фактором; проведенные эксперименты с anti-CD54 МКА замедляли рост опухоли [49, 177].

При использовании МКА IC0218 (HMW), положительная экспрессия HMW выявлена в 10 из 14 образцов клеточных линий (71,4%). Известно, что перевиваемые клеточные линии меланомы человека Вго и MS05 также не экспрессируют на своей поверхности HMW антиген [27]. Экспрессия маркера CD95 (FAS- антиген; опосредующий, апоптоз) была отрицательной во всех исследуемых случаях [55, 71]. Интересным фактом оказалась положительная- экспрессия- маркера стволовой гемопоэтической клетки/или эндотелиальной CD34 (в 8 случаях из 19). Клетки этих линий экспрессировали антиген гистосовместимости первого класса и в 6 из 9 случаев — второго. Доказать принадлежность этих клеток к стволовым в данной работе нам не удалось, однако многочисленные исследования подтверждают их существование [67].

Исследование экспрессии антигенов гистосовместимости первого и второго класса выявили в одном случае полное их отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других - тенденцию к увеличению антигенов гистосовместимости второго класса. Наличие антигена гистосовместимости второго класса влияет на иммунологическую реакцию, которая может развиваться через взаимодействие комплекса HLA-DR с Т-клеточным рецептором, [134]. Снижение антигенов гистосовместимости первого класса и появление антигена второго класса, представляющего фенотип непрофессиональных антиген-презентирующих клеток [85], является характерным фактором для меланомных клеток. Злокачественная трансформация меланоцитов и опухолевая прогрессия часто ассоциируется с потерей антигена первого класса [90], 15% и 55% хирургически удаленной первичной опухоли и метастатической меланомы, соответственно, показало при иммуногистохимическом окрашивании отсутствие HLA I класса гистосовместимости. Потеря или снижение экспрессии антигена гистосовместимости первого класса может приводить к ускользанию меланомных клеток от иммунного ответа - узнавания или даже разрушения цитотоксическими Т-клетками, необходимости презентования антигенами первого класса ассоциированных антигенов [147].

Изучение HLA-фенотипа I класса гистосовместимости клеточных линий по аллелям, выявило неоднородность фенотипа по классам, что является важным, так как соответствующий рестракционный элемент, обуславливает экспрессию белка и определяющего иммуногенность клетки; способствуя выработке лимфоцитов. У пациентов с фенотипом НЬААЗ/11 и В7/4, получающих рестриктированную по указанным НЬА поливалентную аллогенную вакцину, отмечена более продолжительная выживаемость (Р < 029). Анализ экспрессии НЬА пациентов вне зависимости от НЬА вакцины показал, что наиболее благоприятным в отношении выживаемости является фенотип НЬА-А25 (Р = 006), тогда как фенотип НЬА- В35 оказывает неблагоприятное влияние на выживаемость (Р = 019) [94]. Таким образом, знание НЬА-фенотипа может играть важную роль для индивидуального подбора вакцины. (Клеточная линия^ по фенотипу аналогичная фенотипу клеткам хозяина).

Проведенный анализ раково-тестикулярных и дифференцировочных антигенов выявил неоднородную картину. Опухолеассоциированные антигены, узнаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами, играют важную» роль в специфической- противоопухолевой иммунотерапии [116]. Знание антигенов исследуемых клеточных линий, поможет комплементарно подбирать их для создания противоопухолевых вакцин [183].

Для создания противоопухолевых вакцин важным моментом является создание клеточного банка. Повседневные потребности клиники могут быть обеспечены только клеточным банком, содержащим стандартный, всесторонне обследованный клеточный материал, находящийся в условиях, способных обеспечить его длительное хранение без изменения свойств.

Полученные клеточные линии, учитывая их уникальность, хранятся в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН в городе Санкт-Петербурге.

Двенадцать клеточных линий защищены патентами на изобретение, из них пять патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2009 год.

На основе двух клеточных линий разработаны две противоопухолевые генно-инженерные вакцины, на которые в настоящее время получено разрешение в Этическом комитете ФГУНЦ ЭСМП РОСЗДРАВНАДЗОРА на проведение второй фазы клинических испытаний.