Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

Зинова, Анастасия Александровна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Зинова, Анастасия Александровна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

На правах рукописи

Зинова Анастасия Александровна

РАЗРАБОТКА РИД-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО В. CANIS

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2009

UU3481467

003481467

Работа выполнена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных ФГУ «ВГНКИ», в лаборатории бруцеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, в городских ветеринарных лабораториях Москвы и Санкт-Петербурга, а также в Ленинградской и Волгоградской областных ветеринарных лабораториях в период с 2005 по 2009 год.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

доцент Скляров О.Д.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

доцент Альбертян М.П.

доктор ветеринарных наук, Зенов Н.И.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» (ГНУ«ВНИИБТЖ» СО РАСХН), г. Омск

Защита состоится «¿w » j-ЮЯёрЯ 2009 г. в <<//>Гчасов на заседании диссертационного совета Д.220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, тел/факс 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан « H€J?<Tf>/l 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач РФ

Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллез собак, вызываемый В. canis, на сегодняшний день известен во всех странах мира. В России это заболевание относится к малоизученным. Наряду с эпизоотической и эпидемической опасностью оно препятствует успешному ведению собаководства и наносит значительный экономический ущерб отрасли, который складывается из утраты воспроизводительной функции кобелей, абортов, рождения нежизнеспособного приплода у сук, выбраковки высокопородных и ценных в племенном отношении животных.

Установлены случаи заражения людей В. canis как за рубежом, так и в России (Nidia Е., Lucero et al, 2005; Ying и et al, 1999; Михайлова Ю.П., 2000).

Сообщения о выделении культур бруцелл от собак с отличными от В. abortus, В. melitensis и В. suis свойствами были опубликованы в 60-70 годы прошлого века (Burner D.W. et al., 1968; Carmichael L.E. et al., 1966, 1968, 1981). Впервые возбудитель, ответственный за эпизоотические аборты у сук, был выделен Carmichael L.E. и предложен им совместно с Burner D.W в 1968 г. в качестве нового вида В.canis и принят под таким названием в 1974г.

В Российской Федерации бруцеллез собак, вызванный В.canis, впервые зарегистрирован в 1994г. в Волгоградской области (Шумилов К.В. и др., 1996), а впоследствии это заболевание наблюдали и в других регионах (Алиев A.A. и др., 1999; Дегтяренко JLB. и др., 1999; Малышева J1.A., 2000).

Окончательный диагноз этого заболевания устанавливают по результатам лабораторных исследований и, в первую очередь - бактериологического тестирования. Диагностическая ценность метода существенно снижена из-за ограниченного перечня тестируемых образцов, так как прижизненное бактериологическое исследование сводится преимущественно к исследованию проб крови. Гораздо более широкими представляются возможности серологического исследования, однако до выполнения настоящей работы средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, в РФ зарегистрировано не

N . \

было. Попытки разработать такие средства, одними из первых в стране, предприняли Калмыков В.В., Михайлова Ю.П., Климанов А.И., Шумилов К.В., Желудков М.М., Толмачева Т.А. в 1999-2001 гг. В ходе выполненных серологических (РА и РСК), с использованием собственных разработок, и бактериологического исследования ими были выявлены больные животные. Причем, было установлено, что пробы сыворотки крови примерно от 25 % исследованных собак проявляли антикомплементарные свойства, что ограничивает применение этой реакции (Михайлова Ю.П., 2000). Между тем известно, что в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС-антигеном, также как и в РСК, выявляются иммуноглобулины класса G, но она позволяет исследовать сыворотки, несмотря на их антикомплементарность.

За рубежом для диагностики заболевания применяют ряд серологических тестов: пластинчатую реакцию агглютинации (RSAT), пробирочную реакцию агглютинации (TAT) и реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (AGID) с использованием антигенов, изготовленных разными способами, и полученные при этом результаты часто варьируют (Carmichael L.E. et al, 2006; Hollet R.B., 2006).

С учетом вышеизложенного, разработку чувствительных и специфичных средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сап к, следует считать актуальной.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка тест-системы на основе реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

Для достижения этой цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

- разработать технологию получения активных и специфичных бруцеллезных R-антигена и R-сыворотки для диагностики бруцеллеза собак в РИД;

- изготовить экспериментальные серии бруцеллезных R-антигенов для диагностики бруцеллеза собак в РИД и РА;

- изготовить экспериментальные серии бруцеллезной кроличьей II-сыворотки;

- изучить специфичность и чувствительность РИД с использованием разработанных диагностикумов в сравнении с РА, РСК и бактериологическими методами исследований при диагностике бруцеллеза собак, вызываемого В. сашБ;

- разработать тест-систему для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сашз, основанную на использовании РИД, с полученными бруцеллезными К-антигенами и гомологичной им сывороткой. Изучить активность и специфичность тест-системы в ветеринарных лабораториях РФ.

Научная новизна. Впервые в стране разработана технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного 11-антигена и оптимальная схема получения бруцеллезной И-сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В.сашБ.

Установлена возможность получения эффективных бруцеллезных II-антигенов и К-сыворотки с использованием живой культуры штамма В.аЬог1ш КВ 17/100.

В процессе исследований с использованием набора компонентов для диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, и репрезентативной выборки проб сыворотки крови от собак получены эпизоотологические данные по этому заболеванию в Москве, Санкт-Петербурге, Московской и Ленинградской областях.

Практическая и теоретическая значимость работы. Выявление больных бруцеллезом собак с помощью разработанной тест-системы имеет важное эпизоотическое и эпидемическое значение. Обоснованные теоретически на основании анализа данных литературы и подтвержденные результатами диагностических исследований технологические подходы к разработке активных и специфичных средств для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сагт, могут быть учтены или использованы в дальнейшем при совершенствовании диагностики данного заболевания.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссерта-

ции доложены на конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006, 2007, 2008гг.).

Положения, выносимые па защиту:

- результаты разработки средств диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. canis;

- результаты определения оптимальных параметров изготовления R-антигена и R-сыворотки для диагностики бруцеллеза собак в реакции имму-нодиффузии;

- результаты сравнительного серологического тестирования собак на бруцеллез;

- результаты лабораторных и производственных испытаний разработанных средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis;

- результаты идентификации и дифференциации культур бруцелл, выделенных от собак.

Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 3 научные статьи, в том числе 2 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 2 схемами. Список литературы содержит 185 источника, в том числе 152 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе были использованы: 1) культуры и штаммы бруцелл: референтные штаммы - В. canis RM 6/66, В. melitensis 16М, В. suis 1330 (из коллекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), производственные штаммы В. ovis 424/2,

В. abortus KB 17/100 (из Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, при ФГУ «ВГНКИ»), а также полевые культуры бруцелл; 2) сыворотки: национальная стандартная сыворотка Anti-brucella abortus (ФГУ «ВГНКИ»), негативная сыворотка крупного рогатого скота (ФГУП «Курская биофабрика»), А- и М-монорецепторные сыворотки (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), гипериммунные сыворотки крови кроликов, полученные на штаммы В. canis RM 6/66 и В. abortus KB 17/100; 3) животные: кролики массой 2,5-3,0 кг - 68 голов; 4) питательные среды: агар Альбими, мясопептонный печеночный глюкозоглице-риновый агар (МППГГА) и мясопептонный печеночный глюкозоглицерино-вый бульон (МППГТБ), мясопептонный агар (МПА), мясопеченочный бульон (МПБ), среда Сабуро - агар, среда Китт .-Тароцци под вазелиновым маслом, основной агар для бруцелл (Ml69 Hi-media), основной агар для кампилобак-теров (М994 Hi-media), поддерживающая среда для кампилобактеров (М917 Hi-media); 5) буферные растворы: фосфатный буферный раствор - ФБР (рН = 6,0; 7,0; 8,2), 0,5% фенолизированный фосфатный буферный раствор (ФБР + 0,5% фенола), карбонатно-бикарбонатный буфер (рН=9,8), М-буфер (рН = 9,1).

Постановку РИД осуществляли в агаровом геле в чашках Петри. Компоненты диагностического набора вносили в лунки, пробитые с помощью штампа. В одну центральную лунку геля агара вносили 20 мм3 антигена, а в шесть периферических - 40 мм3 исследуемых сывороток крови. В каждой чашке ставили контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывали фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру ее диаметра, которую увлажняли 0,5%-ным феноли-зированным физиологическим раствором. Чашку плотно прикрывали крышкой и оставляли при 18-24 °С.

Учет результатов реакции проводили визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.

При формировании линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой через 24 или 48 ч реакцию оценивали, как положительную.

Сыворотки крови в РА с S- и R- антигенами исследовали в соответствии с Наставлением по диагностике бруцеллеза животных, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 29 сентября 2003 года. Бруцеллезный R-антиген для РА готовили по технологии, предложенной Калмыковым В.В. и Михайловой Ю.П., в нашей модификации. В частности, вместо B.canis при изготовлении предлагаемого ими антигена, нами была использована культура В.abortus, а также внесены другие изменения, позволившие повысить его специфичность и в четыре раза увеличить срок годности.

Бактериологическое исследование крови от собак с идентификацией и типированием выделенных культур проводили на базе лаборатории бруцеллеза ГУ "НИИЭМ" им. Н.Ф. Гамалеи. Для идентификации использовали двухсуточные агаровые культуры бруцелл, выращенные на МППГГА, МППГГБ, триптозном агаре и среде Альбими. Тинкториальные, морфологические, куль-туральные и ферментативные свойства штаммов В. canis, выделенных от больных собак, изучали в сравнении с культурами референтных штаммов бруцелл В. canis RM 6/66, В. suis 1330 и культурой полевого штамма В. canis К-01.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Подбор оптимальной схемы получения диагностической бруцеллезной R-сыворотки для РА и РИД

Согласно результатам предварительного опыта по получению диагностической бруцеллезной R-сыворотки, четырехкратное внутривенное с интервалом 7 дней введение кроликам живой культуры штамма В. canis RM 6/66 в дозах lxlO9, 2,5х109, 5x109 и 1x10 м.к./мл не обеспечивало выраженного синтеза агглютининов в организме животных. Максимальный титр сыворотки в РА с бруцеллезным R-антигеном составлял 1:200.

Это послужило основанием для выполнения исследований с использованием разных схем и способов получения требуемой сыворотки с последующим

сравнительным изучением ее активности и специфичности (табл. 1). Изготовленные сыворотки взаимодействовали с экспериментальным бруцеллезным R-антигеном в РИД по-разному. В частности, сыворотка, полученная по первой схеме иммунизации, формировала с антигеном тройные диффузные линии преципитации; по второй - двойные диффузные линии преципитации. Кроме того, при такой схеме гипериммунизации в группе из 5 кроликов погибли два; по третьей схеме, заключающейся в четырехкратном внутривенном введении кроликам живой культуры В. abortus KB 17/100 в дозах 5x109, lxlO10, 2хЮ10 и 4x10ю м.к./мл, что обеспечивало синтез агглютининов со средним титром 1:400, при максимальном его показателе у отдельных животных 1:800 - четкую одинарную линию преципитата; по четвертой - хорошо выраженные двойные линии преципитата.

С целью определения влияния дозы и кратности введения культуры на активность бруцеллезной R-сыворотки было выполнено следующее исследование. Кроликов гипериммунизировали живой культурой В. abortus KB 17/100 в дозах 2,5х109, 5 хЮ9, 1 xl 0'° и 2х10ш четырехкратно (табл. 2). Согласно табличным данным, пик активности бруцеллезной R-сыворотки в РА был зарегистрирован на 21-ый день с начала иммунизации. В РИД с гомологичным антигеном сыворотка формировала четкую одинарную линию преципитации. По истечении следующей недели титр агглютининов у части животных снизился.

2.2.2. Разработка способа получения бруцеллезного R-антигсна для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis

R-антиген для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, получали двумя способами: экстракцией антигена «солевым методом» и путем разрушения бактерийных клеток ультразвуковыми волнами. Для получения антигена были использованы производственные, аттенуированые с известными дифференциально-диагностическими свойствами штаммы В. ovis 424/2 и В. abortus KB 17/100. При тестировании антигенов, полученных «солевым методом», была исключена возможность их практического применения по причине низкой активности. В частности, гипериммунные R-сыворотки крови

Таблица1

Схемы гипериммунизации кроликов с целью получения бруцеллезных И-сывороток

№ Метод Штамм 1-е введение Сроки (су т)

крал. введения 7 14 21 28 40 80

Адъюв. вакцина 111 шт. КВ Доза, млрд. АД Доза Тшр АД Доза Титр АД Доза Титр АД Доза Титр АД До>а Титр АД Доза Титр

1 в/в КВ 17/100 живая 5 10 1/100 - 20 1/200 40 1/200 - - 1/400 - - 1/400 - - 1/200

г в/в - «- 5 | 10 1/100 - 20 1/200 1/200 ^ - 40 1/400 - - 1/800 - - 1/400 - - 1/200

3 в/в - «- 5 - 10 1/100 - 20 40 1/400 - - 1/800 " Г ■ 1/200 - - 1/200

4 в/в - «- - 5 | 10 1/100 - 2(1 1/200 ! - 40 1/200 - - 1/800 - - 1/400 - - 1/400

1 в/в, и/к КВ 17/100 жива« + - - - - 5 1/25 - 10 1/200 - 20 1/800 40 1/200 - - 1/400

2 в/в, 11/К - «- + - - - - 5 1/200 - 10 1/200 - 20 1/800 - 40 1/400 - - 1/400

3 в/в, п/к - «- + - - - - 5 1/50 - 10 1/400 - 20 1/800 - ; 40 1 .... 1/400 - - 1/400

4 в/в, п/к - «- + - - - - 5 1/50 10

1 в/в, П/к' КВ 17/100 живая + " | ■ - - + 5 1/100

2 в/в, П К" - «- ■ - - + 5 1/25 и 1/200 - | 20 1/400 40 1/400 ! - | 1/400 1

3 в/в, п/к" - «- + - - - - + 5 1/100

4 в/в, п/к - «- + - - - - + 5 1/100 - 10 1/100 - 20 1/800 - | 40 1/200 - - 1/100

1 в/в, п/к КВ 17/100 живая 4- 1 - - - Б 1/50 - 10 1/100 - 20 1/200 - 1 40 ! 1/400 - - 1/800

2 в/в, п/к - «- + - - - - - 5 - 10 1/400 - 20 1/400 - • 40 1/400 - - 1/800

3 в/в, п/к - «- + 1 - - - 5 1/50 10 1/400 20 1/400 40 1/800 - - 1/800

4 в/и, г|/к - «- + " 1 " - - 5 _____ 1/50 10 1/400 - 20 1/400 - 40 1/400 - -

Таблица 2

Динамика накопления агглютининов и преципитипов

№ к ролика День с начала иммуннзацип

7-И 14-й 21-й 28-й

РА РИД РЛ РИД (характеристика линии прецппитапни) | РИД РА ! (характеристика линии преципитации) РА РИД (характеристика лнннн преципитации)

1 1/50 следы 1/200 Выраженная 1/400 Выраженная 1/400 Выраженная

2 1/50 - 1/100 Выраженная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная

3 - - 1/100 Выраженная 1/400 Выраженная 1/400 Выраженная

4 - - 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная

5 1/50 - 1/100 Выраженная 1/400 Выраженная 1/200 Выраженная, двойная

6 1/50 - 1/100 Выраженная 1/100 Выраженная 1/200 Выраженная

7 - - 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная, диффузная

8 - - 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 1/400 Выраженная 1/200 Выраженная

9 - - 1/50 Умеренно выраженная, диффузная Выраженная, диффузная 1/400 Выраженная, диффузная

10 | - 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 | Выраженная, диффузная 1/100 Выраженная, диффузная

собак и кроликов, полученные к культурам штаммов В. canis RM 6/66 и В. abortus KB 17/100, а также сыворотки крови от собак с диагнозом, подтвержденным выделением гемокультуры В. canis, в РИД с этими антигенами реагировали отрицательно.

В связи с этим следующий этап работы был посвящен получению антигена путем ультразвуковой обработки живой и убитой культуры бруцелл вида В. abortus KB 17/100 с подбором оптимального разбавителя для суспендирова-ния культуры и определением зависимости активности антигенов от показателя концентрации микробных клеток, водородных ионов в суспензии и режима дезинтеграции.

Согласно результатам исследования, наиболее активный и специфичный антиген был получен путем обработки ультразвуком живой культуры В. abortus KB 17/100, суспендированной в ФБР (рН = 7,0).

При сравнительном изучении активности антигенов было установлено, что оптимальной для их разведения в сравнении с другими растворами и в том числе ФБР с (рН = 6,1; 7,1 и 8,3) является 0,3 %-ая формалинизированная дистиллированная вода. При этом было также установлено, что активность антигенов, полученных путем ультразвуковой дезинтеграции бруцелл, уменьшается прямо пропорционально снижению концентрации озвучиваемых суспензий. Таким образом, использовать для получения антигенов суспензии бруцелл с концентрацией менее 100 млрд микробных клеток/мл нецелесообразно.

Выбранный в качестве основного для дальнейших исследований антиген, полученный из живой культуры штамма В. abortus KB 17/100, суспендированной в фосфатном буфере с рН=7,0 путем ультразвукового дезинтегрирования в течение 60 минут, тестировали в РИД с использованием агаровых гелей с содержанием 0,85 %, 5,0 % и 10,0 % NaCl. Наибольшую активность антиген проявлял в случае использования агара, содержащего 0,85 % NaCl. Увеличение концентрации соли приводило к снижению активности антигена.

Стандартизацию активности антигена в РИД проводили с бруцеллезной R- антисывороткой крови кроликов к культуре штамма В. abortus KB 17/100 с

титром агглютининов 1:400, которую приняли в качестве стандартной. Согласно полученным результатам, рабочее разведение антигена составило 1:5. Именно в таком разведении бруцеллезный Я-антиген при взаимодействии со стандартной сывороткой в РИД формировал четкую одинарную линию преципитата.

2.2.3. Специфичность антигена для РИД

Проверка специфичности антигена в РИД с использованием набора гипериммунных и нолевых сывороток к бактериям разных родов показала, что полученный препарат специфичен (табл. 3).

Таблица 3

Изучение специфичности бруцеллезного R-антнгсна в РИД

№ п/п Гипериммунная специфическая сыворотка РИД

1 Кампилобактсрио'шыс моноспецнфнческпе агглютинирующие сыворотки подвидов вснериалис и бубулюс Отр.

2 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая (серотип О 147) Отр.

3 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая (серотип О 149) Отр.

4 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая (серотипы О 157)

5 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая поливалентная (группа 1) Отр.

6 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая поливалентная (группа 2) Отр.

7 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая поливалентная (группа 3) Отр.

8 Сыворотка «О» - коли агглютинирующая поливалентная (группа 4) Отр.

9 Сыворотка О - агглютинирующая монореценторная сальмонелезная (рецептор 8) Отр.

10 Сыворотка О - агглютинирующая монорснепториая сальмонелезная (рецептор 7) Отр.

11 Сыворотка против рожи свиней Отр. " Отр.

12 Сыворотка гипериммунная против лептоспнроза собак

13 Сыворотка гипериммунная к Yersinia enleroeolitica серовар 0:9 (S) Отр.

14 Сыворотка гннериммуннан к Yersinia enterocolitica серовар 0:9 (R) Отр.

15 Сыворотка гипериммуииая к Yersinia enterocolitica серовар 0:3 Отр.

16 Бруцеллезная S -сыворотка из «Набора для серологической дифференциации бруцелл» (НПФ «Биоцентр») Отр.

17 Национальная стандартная сыворотка Anti-brueella abortus с.5 Отр.

18 Негативная сыворотка крови кролика Отр.

19 Негативная сыворотка крови крупного рогатого скота Огр. Отр.

20 Негативная сыворотка крови собак

21 Сыворотка крови собаки, больной лептоспирозом Огр.

22 Сыворотка крови собаки, больной вирусным гепатитом Отр.

23 Сыворотка крови собаки, больной болезнью Лайма Отр.

24 Бруцеллезная R-сыворотка №1 (В. canis RM 6/66) Пол.

25 Бруцеллезная R-сыворотка №2 (В. canis 1Ш 6/66) Пол.

26 Бруцеллезная R-сыворотка (В. abortus KB 17/100) Пол.

Отрицательные результаты были получены с сыворотками крови собак, больных лептоспирозом, вирусным гепатитом, болезнью Лайма, а также с негативными сыворотками крови собак и крупного рогатого скота.

В контроле наблюдали положительную реакцию антигена с бруцеллезными R-сыворотками крови кроликов и собак, иммунизированных культурой В. canis RM 6/66.

2.2.4. Результаты лабораторных испытаний антигена для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis

Часть клинических испытаний разработанных бруцеллезных R-антигенов была выполнена с участием сотрудников «Центра биотехнологии» ФГУ «ВГНКИ», которые проводили молекулярно-гсистические исследования проб крови и сыворотки крови собак.

Всего при исследовании 120 собак было выявлено 19 животных, сыворотки крови которых положительно реагировали в РА и РИД с бруцеллезными R-антигенами (табл. 4).

Таблица 4

Результаты лабораторного испытания бруцеллезного R-антнгена в РИД

№ №№ R-антнген Бакнсследованне S - антиген

п/п сыворотки

РА РИД i РА РСК

1 Трезн 1/100 ++ пол. + отр отр

2 Taiíiucpa 1/100 -ы- пол. + отр отр

3 Дехира 1/100++ кол. + отр отр

4 Макс 1/50++ отр отр отр огр

а Злолсй 1/200 ++ пол + отр отр

6 Саура 1/100+++ пол + отр _9ТР

7 № 10 1/200++ пол отр огр отр

8 № 11 1/400++ пол - отр отр

9 № 12 1/100 +++ отр отр отр отр

1« № 13 1/100+++ пол - отр отр

11 № 14 1/50 ++ отр - отр огр

12 № 15 1/400 ++ пол. - огр отр

13 № 16 1/400++ пол огр огр

14 JV» 17 1/50+++ отр - отр отр

15 № 18 1/800++ пол. - отр огр

16 № 19 1/50 ++ отр. - отр отр

17 №20 1/200++ пол - отр отр

18 №21 1/200 ++++ пол - огр отр

19 №22 1/100++ отр отр отр огр

Как видно из материалов таблицы, из 19 проб сыворотки крови, реагирующих в РА, 4 пробы реагировали в титре 1:50, 7 проб - 1:100, 4 пробы -1:200, 3 пробы - 1:400 и 1 проба - 1:800.

Всего в РИД с положительным результатом были исследованы пробы сыворотки крови от 12 собак. При бактериологическом исследовании 9 проб крови от этих животных было выделено 5 культур бруцелл, идентифицированных как В. canis, что совпадало с результатами исследования этих проб в ПЦР.

2.2.5. Производственные испытания антигенов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis

На основании результатов клинического испытания бруцеллезных R-антигенов для диагностики бруцеллеза собак в РИД были изготовлены экспериментальные серии «Тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого Brucella canis, в реакции нммунодиффузии в агаровом геле (РИД)».

Производственные испытания тест-системы были выполнены с нашим участием в городских ветеринарных лабораториях Москвы и Санкт-Петербурга и ветеринарных лабораториях Ленинградской и Волгоградской областей в период с октября 2006 г. по декабрь 2008 г.

Всего в РА и РИД с разработанными диагностикумами были исследованы 1370 проб сыворотки крови собак, из них в Москве 162 пробы, в Санкт-Петербурге - 892 пробы, в Ленинградской области - 120 проб, в Волгоградской области - 196 проб (табл. 5).

В городской ветеринарной лаборатории Санкт-Петербурга и Ленинградской областной ветеринарной лаборатории при исследовании сыворотки крови с бруцеллезными R-антигенами было выявлено 87 собак, признанных больными. При этом в РА с бруцеллезным R-антигеном 24 пробы сыворотки крови собак реагировали в титре 1:100, 30 проб - 1:200, 32 пробы - 1:400 и 1 проба-1:800.

В РИД с положительным результатом были исследованы 23 пробы сыворотки крови собак. При бактериологическом исследовании проб крови от 11 животных с положительными результатами исследования в РИД от 9 была выделена культура, идентифицированная как В. сашБ. Результаты бактериологического и молекулярно-генетического исследований совпали.

Таблица 5

Результаты производственных испытаний Тест-системы для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В.слш

Регионы Кол-во Положительно Положительно Выяв- Бакнесле-

РФ ИСС.1СД. реагировали с реагировали с лено дование

проб К- бруцеллезны- в-руцеллезным боль- (кол-во ис-

ми антигенам« антигеном пых след./выде-

РА РИД Г РА РСК (гол.) лено куль-

Москва 162 0 0 0 0 0 0

Санкт- 1-1:800

Петербург 29-1:400

892 28-1:200 22-1:100 2-1:50 23 0 0 80 11/9

Ленинград- 3-1:400

ская область 120 2-1:200 2-1:100 11-1:50 0 0 0 7 0

Волгоград и

Волгоград- 196 0 0 4-1:25 1-1:20 0 0

ская область

Всего 1370 100 23 [_4-1:25 1-1:20 87 11/9

Всего в ходе диагностических исследований по теме диссертационной работы было выявлено 106 собак больных бруцеллезом, вызванным В. сашя. Специфичность К-антигена для РИД подтверждена отрицательными результатами исследования 358 проб сывороток крови собак в г ородской ветеринарной лаборатории Москвы и Волгоградской областной ветеринарной лаборатории. Отрицательные результаты были получены при исследовании сывороток крови собак, больных лептоспирозом, вирусным гепатитом,бореллиозом, стафилококкозом, микоплазмозом и «классическим» бруцеллезом.

Следует отметить установленный факт снижения титра Л-агппотининов при повторном исследовании через 15 и 30 дней проб сыворот-

ки крови собак, которые при первичном тестировании с этим же антигеном реагировали в титре 1:25 - 1:50, при отрицательных результатах исследования в РИД. Это явилось основанием для исключения инфицирования данных животных бруцеллами (табл. 6).

Таблица 6

Данные тестирования в РИД проб сыворотки крови собак, исследованных в РА с сомнительным и положительным результатами

№ н/п Сыворотки Результаты серологического исследования с Я-аитигепами

РА РИД

1-е исслед. Через 15 дн. Через 30 дн. 1-е исслед. Через 15 дн. Через 30 дн.

1 № 40845 1/50 +++ 1/50 ++ - - - -

2 № 42504 1/50 ++ 1/50 ++ - - - -

3 № 41513 1/50 ++ - - - - -

4 № 41518 1/50 ++ 1/25 ++ - - - -

5 № 47608 1/50 ++ 1/50 ++ - - - -

6 № 572 1/50 -н- - - - - -

7 №813 1/50 +++ -

8 № 41085 1/50 ++ 1/50 ++ 1/25 ++ - - -

9 № 10880 1/50 ++ 1/100 ++ 1/200 ++++ + + +

10 № 42539 1/50 ++++ 1/100 ++ 1/100 +++ + + +

11 № 6281 1/50 ++ 1/50 ++ 1/100 +++ + + +

12 №101 1/50 +++ 1/100 ++ 1/200 +++ + + +

Кроме того, нами были также зарегистрированы результаты исследования проб сыворотки крови от собак, титр 11-агглютининов в которых не превышал 1/50, но они были исследованы с положительным результатом в РИД с II-антигеном. При повторном исследовании этих животных через 15 и 30 дней наблюдали увеличение титра агглютининов при положительных результатах в РИД и выделении культуры В.сашБ.

С учетом этих данных мы считаем целесообразным проведение комплексной серологической диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, предусматривающей одновременное тестирование в РА и РИД с R-антигенами и предлагаем для практического применения «Набор компонентов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis в РА и РИД».

При бактериологическом исследовании крови собак, положительно реагирующих при серологическом исследовании с R-бруцеллезными антигенами, было выделено четырнадцать культур бруцелл, которые идентифицировали на базе лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Типирование выделенных культур проводили в сравнении с культурами референтных штаммов В. canis RM 6/66, В. suis 1330 и В. canis К-01, выделенной из абортированного плода стаффордширского терьера в 1994 году в г. Волгограде (табл.7).

Согласно полученным результатам, типируемые культуры были представлены грамотрицательными овоидной или в виде коротких палочек бактериями, расположенными одиночно, попарно и в виде скоплений и не требующих для роста повышенного содержания СО2 при инкубировании.

По Уайту-Вилсону колонии бруцелл, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри после посева суспензий выделенных культур и последующего инкубирования при 37 °С в течение 4 суток, окрашивались в синий цвет с тонкими радиальными искривленными трещинами желтого цвета у части из них.

В пластинчатой РА двухсуточные агаровые культуры агглютинировались кроличьей R-сывороткой к В. canis с оценкой на 4 креста и не взаимодействовали с бруцеллезной S-сывороткой.

В пробирочной РА живые культуры в виде 2-х миллиардной взвеси в физиологическом растворе агглютинировались бруцеллезной R-сывороткой в титре 1:800 и не агглютинировались бруцеллезной S-сывороткой.

Все выделенные культуры давали положительный результат с оценкой на 4 креста в пробе с акрифлавином и отрицательный - в пробирочной РА с А-

№№ п/п Наименование штамма Форма колоний Рост на средах с добавлением Продукция Фаг «ТЬ» Агглютинация сыворотками

Фуксин 1:50000 Хиопии 1:100000 Пенициллин в И* А М

5 ЕД /мл 2,5 ЕД/мл 0,5 ЕД/мл

1 №77 И 3+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ - - + 4+ + (нити) -

2 №839 И 3+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ - - +/- 4+ - (пити) -

3 №837 Я 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - +/- 4+ - -

4 №838 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - +/- 4+ - -

5 № 881 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - - 4+ - -

6 № 885 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ - - - 4+ - -

7 № 886 я 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ - - - 4+ - -

8 № 1- ПЛ ы 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - - 4+ - -

9 № 2- ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - - 4+ - -

10 № 3-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ - - - 4+ - -

И № 4-ПЛ я 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+/4+ - - - 4+ - -

12 № 5-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+/4+ - - - 4+ - -

13 № 6-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ - - - 4+ - -

14 № 7-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ - + - 4+ - -

15 В. сашз К-01 и 3+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ - (следы) - 4+ - -

16 В. саше 6/66 и - 4+ +/+ 4+14+ - (следы) +/- 4+ - -

17 В. зшв 1330 в - 4+ -/- -/- 4+14+ 6 мм 4+ - 3+ -

Примечание: (-) - отрицательный результат, (+, 3+, 4+) - положительный результат (оценка интенсивности реакции в крестах); * кроличья сыворотка В. сашэ (Е1-форма)

с титром 1:800

и М-монорецепторными сыворотками

Все культуры не продуцировали H2S и, в отличие от культур референтных штаммов В. canis 6/66 и В. suis 1330, оказались нечувствительными к фуксину в концентрации 1:50000. Однако все они, в том числе и референтные штаммы В. canis 6/66 и В. suis 1330 и штамм В. canis К-01, были чувствительны к тионину в разведении 1:50000 и росли на питательной среде, содержащей краситель в концентрации 1:100000.

Все выделенные культуры бруцелл росли на питательной среде с содержанием натриевой соли бензилпенициллина в концентрации 0,5, 2,5 и 5 ЕД/мл и не отличались по этому свойству от штамма В. canis К-01, тогда как культуры референтных штаммов В. canis RM 6/66 и В. suis 1330 росли только на среде, содержащей антибиотик в количестве, не превышающем 0,5 ЕД/мл.

Таким образом, согласно результатам дифференциации, все культуры бруцелл, выделенные от собак в ходе выполнения настоящей работы, были идентифицированы, как В. canis и отнесены ко «второму биовару» данного вида, как и штамм В. canis К-01.

3. Выводы

1. Культура штамма В. abortus KB 17/100 может быть использована для получения высокоактивных и специфичных R-антигенов для диагностики в РА и РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

2. Продолжительность ультразвуковой дезинтеграции, концентрация бруцелл и водородных ионов в обрабатываемой взвеси являются факторами, определяющими активность и специфичность бруцеллезного R-антигена для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

3. Супернатант, полученный в результате ультразвуковой в течение 60 мин дезинтеграции живой культуры штамма B.abortus KB 17/100, суспендированной в фосфатном буфере с рН=7,0 с последующим центрифугированием при 15000 об/мин в течение 60 мин, является активным и специфичным антигеном, для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis, с содержанием в агаровом геле 0,85 % NaCl.

4. Критерием оценки бруцеллезной Л-сыворотки для РИД, применяемой в качестве положительного контроля антигена, служит положительный результат, проявляющийся формированием четкой одинарной линии преципитации, а не высокий уровень титра гомологичных агглютининов.

5. Собак считают больными бруцеллезом, вызываемым В. сатэ, при титре К-антител в РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной реакции иммунодиффузии в агаровом геле с Я-антигеном и (или) при положительном результате бактериологического исследования.

При положительной РА в титре 1:50 собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 2-4 недели в РА и РИД с бруцеллезными К-антигенами и бактериологически.

В случае получения двух подряд сомнительных результатов при исследовании в РА с интервалом не менее 4 недель при отрицательных результатах тестирования в РИД и бактериологического исследования, заболевание животных исключают.

6. Положительный результат исследования сыворотки крови собак в РИД с К-антигеном свидетельствует о бактериемии у животных В. саше.

7. Выявление в Москве и Санкт-Петербурге собак, положительно реагирующих при серологическом исследовании с бруцеллезными Я-ангигенами и бактериологическом - с выделением культуры идентифицированной, как В.сашэ, с использованием репрезентативной выборки животных, свидетельствует о достаточно широком распространении данного заболевания в РФ и подтверждает актуальность внедрения в ветеринарную лабораторную практику средств его диагностики.

4. Практические предложения

Разработаны:

- технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного 11-антигена и оптимальная схема получения гомологичной ему сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. сатэ;

- «Набор компонентов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого

В. сашэ, в реакции агглютинации и реакции иммунодиффузии в агаровом геле и нормативные документы на него. Регламент изготовления и контроля набора утвержден директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г., Стандарт организации на набор (СТО 00494189-0039-2009) и инструкция по его применению (представлены для утверждения в соответствии с Правилами государственной регистрации лекарственных средств);

- «Методические рекомендации по диагностике бруцеллеза собак, вызываемого В. сашБ», утверждены директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г.

1. Зинова A.A. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. canis. // Ветеринарная патология. - Москва, 2006, № 3 (18) - С. 11-14.

2. Скляров О.Д., Климанов А.И., Шумилов К.В., Желудков М.М, Толмачева Т.А., Зинова A.A., Ульянова М.В. Выделение и идентификация культур В. canis. // Сборник научных трудов ФГУ «ВГНКИ»,- М., 2007-Т.68.-С. 125126.

3. Яшин A.B., Кузина Т.Б., Климанов А.И., Шумилов К.В., Скляров О.Д., Зинова A.A. Бруцеллез собак, вызываемый В. canis - ретроспективный анализ встречаемости по С.-Петербургу за 2006-2007г. // Ветеринарная практика. -Санкт-Петербург, 2007, № 4 - С. 23-26

5. Список работ, опубликованных но теме диссертации

ГНУ ВНИИВСГЭ, 123022, Москва, Звенигородское ш., 5 Заказ 332/2 Тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Зинова, Анастасия Александровна :: 2009 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика бруцеллеза собак, вызываемого 9 В. сашэ

1.2. Характеристика возбудителя 10 1.2.1. Антигенное строение В. саше

1.3. Антителообразование при бруцеллезе собак, вызывае- 14 мом В. сашБ

1.4. Восприимчивость человека к инфекции В. сашэ

1.5. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. сатэ 17 1.5.1. Реакция иммунодиффузии

1.5.1.1. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, в 26 РИД

1.6. Бактериологическая диагностика бруцеллеза собак, 30 вызываемого В. сашэ

1.7. Лечение и профилактика

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. . Материалы и методы

2.2. Методики проведения экспериментов

2.2.1. Разработка схемы получения диагностической 39 гипериммунной бруцеллезной Я-сыворотки

2.2.2. Разработка метода получения антигена для диагности- 43 ки бруцеллеза собак, вызываемого В. сашБ, в РИД

2.2.2.1. Получение антигена «солевым методом»

2.2.2.2. Получения антигена «ультразвуковым» методом

2.2.3. Изучение факторов, влияющих на активность 46 УЗДН-антигена для РИД

2.2.3.1. Повышение активности антигена путем осаждения бел- 46 ков растворами ТХУ и трипсина

2.2.4. Стандартизация антигена для РИД

2.2.5. Изучение специфичности антигена для РИД

2.2.6. Испытание «Тест-системы для диагностики бруцеллеза 49 собак, вызываемого В. сашБ, в РИД» в производственных условиях

2.2.7. Бактериологическое исследование крови собак

2.2.8. Изучение свойств выделенных штаммов В. сагш 50 2.3. Результаты исследований

2.3.1. Отработка схемы получения диагностической гипе- 54 риммунной бруцеллезной Я-сыворотки

2.3.2. Разработка способа получения бруцеллезного Ы- 58 антигена для диагностики бруцеллеза собак в РИД

2.3.3. Результаты стандартизации антигена для РИД

2.3.4. Специфичность антигена для РИД

2.3.5. Результаты лабораторных испытаний антигена для ди- 75 агностики бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, в

2.3.6. Результаты производственных испытаний антигена для 83 диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сатэ, в РИД

2.3.7. Результаты изучения выделенных от собак культур 87 бруцелл

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Зинова, Анастасия Александровна, автореферат

Бруцеллез собак, вызываемый В. cams, на сегодняшний день известен во всех странах мира. В России это заболевание относится к малоизученным. Наряду с эпизоотической и эпидемической опасностью оно препятствует успешному ведению собаководства и наносит значительный экономический ущерб отрасли, который складывается из утраты воспроизводительной функции кобелей, абортов, рождения нежизнеспособного приплода, выбраковки высокопородных и ценных в племенном отношении животных.

В отличие от большинства видов бруцелл, принятых Подкомитетом по таксономии до второй половины прошлого века [4, 30, 33, 35, 45, 47, 98], сообщения о выделении культур бруцелл от собак с отличными от В. abortus, В. melitensis и В. suis свойствами были опубликованы в 60-70 годы прошлого века [45, 46]. Впервые возбудитель, ответственный за эпизоотические аборты у сук, был выделен Carmichael L.E. предложен им и Burner D.W в 1968 году в качестве нового вида В. cards и принят под таким названием в 1974 году.

В настоящее время В. canis обнаружен на всех континентах [65, 67, 70, 80, 82, 85, 89, 104, 108, 115, 129, 150, 154, 167, 168, 178, 184].

В Российской Федерации бруцеллез собак, вызванный В. canis, впервые зарегистрирован в 1994 году в Волгоградской области [33], а впоследствии это заболевание наблюдали и в других регионах [1,7, 14, 22].

Окончательный диагноз этого заболевания устанавливают по результатам лабораторных исследований и, в первую очередь бактериологического тестирования [23, 24, 35, 53, 98]. Однако его диагностическая ценность существенно снижена из-за очень ограниченного перечня* тестируемых образцов при прижизненной диагностике, который сводится- только к. исследованию проб кровй. Гораздо более широкими представляются, возможности серологического исследования, хотя-до выполнения настоящей работы зарегистрированных в РФ средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, не было. Попытки разработки средств диагностики этого заболевания проводили в 1999-2001гг. и в результате исследований, выполненных с помощью

PA, PCK и культурального метода, были выявлены больные животные. При-этом, было установлено, что пробы сыворотки крови примерно от 25% исследованных собак проявляли антикомплементарные свойства, что ограничивало применение этой реакции [1, 24]. Между тем известно, что в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС-антигеном, так же как и в РСК, выявляются иммуноглобулины класса G, но она позволяет исследовать сыворотки, несмотря на их антикомплементарность [26].

За рубежом для диагностики заболевания применяют ряд серологических тестов: пластинчатую реакция агглютинации (RSAT), пробирочную реакцию агглютинации (TAT) и реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (AGID) с использованием антигенов, изготовленных разными способами, и полученные при этом результаты часто варьируют. Весьма перспективной считается диагностика бруцеллеза собак в ИФА (ELISA), а РИД, как правило, применяется для подтверждения сомнительных результатов других реакций, как наиболее специфичный тест [35, 45, 67, 68, 91, 98, 112, 171].

На основании вышеизложенного, мы считаем, что исследования, посвященные разработке чувствительных и специфичных тест-систем или наборов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. cams, являются актуальными.

Для достижения этой цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

- изготовить экспериментальные серии бруцеллезных R-антигенов для диагностики бруцеллеза собак в РИД и РА;

- изготовить экспериментальные серии бруцеллезной кроличьей R-сыворотки;

- разработать тест-систему для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, основанную на использовании РИД, с полученными бруцеллезными R-антигенами и гомологичной им сывороткой. Изучить активность и специфичность тест-системы в ветеринарных лабораториях РФ.

Научная новизна. Впервые в стране разработана технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного R-антигена и оптимальная схема получения бруцеллезной R-сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

Установлена возможность получения эффективных бруцеллезных R-антигенов и R-сыворотки с использованием живой культуры штамма В. abortus KB 17/100.

В процессе исследований с использованием набора компонентов для диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, и репрезентативной выборки проб сыворотки крови от собак получены эпизоотологиче-ские данные по этому заболеванию в Москве, Санкт-Петербурге, Московской и Ленинградской областях.

Практическая и теоретическая значимость работы. Выявление больных бруцеллезом собак с помощью разработанной тест-системы имеет важное эпизоотическое и эпидемическое значение. Обоснованные теоретически на основании анализа данных литературы и подтвержденные результатами диагностических исследований технологические подходы к разработке активных и специфичных средств для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, могут быть учтены или использованы в дальнейшем при совершенствовании диагностики данного заболевания.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006, 2007, 2008гг.).

Положения, выносимые на защиту:,

- результаты разработки средств диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. canis;

- результаты сравнительного серологического тестирования собак на бруцеллез;

- результаты идентификации и дифференциации культур бруцелл, выделенных от собак.

Объем и структура диссертации.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis"

4. ВЫВОДЫ

3. Супернатант, полученный в результате ультразвуковой в течение 60 мин дезинтеграции живой культуры штамма B.abortus KB 17/100, суспендированной в фосфатном буфере с рН=7,0 с последующим центрифугированием при 15000 об/мин в течение 60 мин, является активным и специфичным антигеном, для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В.canis, с содержанием в агаровом геле 0,85 % NaCl.

4. Критерием оценки бруцеллезной R-сыворотки для РИД, применяемой в качестве положительного контроля антигена, служит положительный результат, проявляющийся формированием четкой одинарной линии преципитации, а не высокий уровень титра гомологичных агглютининов.

5. Собак считают больными бруцеллезом, вызываемым В. canis, при титре R-антител в РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной реакции иммунодиффузии в агаровом геле с R-антигеном и (или) при положительном результате бактериологического исследования.

При положительной РА в титре 1:50 собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 2-4 недели в РА и РИД с бруцеллезными R-антигенами и бактериологически.

6. Положительный результат исследования сыворотки крови собак в РИД с Я-антигеном свидетельствует о бактериемии у животных В. сатБ.

7. Выявление в Москве и Санкт-Петербурге собак, положительно реагирующих при серологическом исследовании с бруцеллезными К-ангигенами и бактериологическом - с выделением культуры идентифицированной, как В.сашБ, с использованием репрезентативной выборки животных, свидетельствует о достаточно широком распространении данного заболевания в РФ и подтверждает актуальность внедрения в ветеринарную лабораторную практику средств его диагностики.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны:

- технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного Я-антигена и оптимальная схема получения гомологичной ему сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. сатя;

- «Набор компонентов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, в реакции агглютинации и реакции иммунодиффузии в агаровом геле и нормативные документы на него. Регламент изготовления и контроля набора утвержден директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г., Стандарт организации на набор (СТО 004941890039-2009) и инструкция по его применению (представлены для утверждения в соответствии с Правилами государственной регистрации лекарственных средств);

- «Методические рекомендации по диагностике бруцеллеза собак, вызываемого В. сашэ», утверждены директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Зинова, Анастасия Александровна

1. Алиев A.A. Бруцеллез собак, вызываемый Brucella canis (диагностика, па-тологоанатомические изменения) / Алиев A.A., Кудряшов A.A., Велик В.В и др. // Ветеринарная практика. 1999. - №1 (7).-С. 11-14.

2. Антонов Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции: Справочник. / Под ред. Б.И.Антонова. М.: Агропромиздат, 1986.-352 с.

3. Браун В. Генетика бактерий / В. Браун М.: Наука. - 1968. - С.446.

4. Вершилова П.А. Бруцеллез. / П.А. Вершилова М.: Медицина.-1972.- С. 439

5. Ветеринарные препараты; Справочник / Под, ред. Д.Ф.Осидзе.- М.: Ко-лос.-1981.- С. 448.

6. Воробьева Н.В. Иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез: теория и практика / Воробьева H.B. М.: Научный мир. - 2006. - С. 4 - 28

7. Дегтяренко Л.В. Эффективность некоторых методов диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота / Дегтяренко Л.В., Шпак Н.Г., Власова С.А. // Сборник научных трудов «ВНИИБТЖ». Омск, 2000. — С. 203 - 208.

8. Дегтяренко Л.В. Разработка и совершенствование средств, методов диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов: Ав-тореф. диссерт. на соиск. уч. степени д-ра вет. наук / Л.В. Дегтяренко Новосибирск, 2005. - 20 с.

9. Дубровская И.И. IX Международный конгресс по микробиологии / И.И. Дубровская // Тезисы.-М., 1966.

10. Дубровская И.И. Особенности химического состава антигенных комплексов R-форм бруцелл / И.И. Дубровская // Биохимия, 1964.-Т.29,-№ 5.-С. 846

11. Душкин Д.В. Бордетеллезная инфекция собак (клинико- эпизоотологиче-ские особенности, диагностика и терапия): Автореф. диссерт. на соиск. уч. степени канд. вет. наук: 16.00.03 / Д.В. Душкин -М.,1998.- 22 с.

12. Желудков М.М. Использование дитиотреитола для выявления специфических IgG-антител при бруцеллезе / Желудков М.М., Чернышева MJI // Лаб. дело. 1987. -№11.- С.870 - 871.

13. Иванов П. Нова зооноза, причинена от Bnicella cams / Иванов П. // Ветер. Сб.- 1984. Т. 82. - № 6. - С. 25-27.

14. Иванов П. Серологични и иммунологични проучвания за инфекцию В. canis при ловни и служебни кучета / Иванов П., Лозанов Л., Филинов К., Ча-керов И. // Научн. тр. Высш. Инст. Зоотехн. Вет. Мед., Стара- Загорд. -1989.- Т. 33. № 2. - С. 229-238.

15. Иммунологические методы. / Под ред. Г. Фримеля М.Медицина, 1987.- 95 с.

16. Кайтмазова Е.И. Характеристика культуральных и биологических свойств Brucella canis / Кайтмазова Е.И., Грекова H.A., Драновская Е.А. // ЖМЭИ.-1977.-№ 6.- С. 75-76.

17. Князева Э.Н. Сравнительное изучение иммуноглобулинов и специфических антител в сыворотке крови больных хроническим бруцеллезом / Князева Э.Н., Чернышева М.И., Желудков М.М. // ЖМЭИ.-1982. № 4. - С. 8690.

18. Лакин Г.Ф. Биометрия. / Г.Ф. Лакин М.: Высшая школа, 1990.-382с.

19. Львов В.Л. Молекулярная природа полисахаридного антигена бруцелл (поли-Б)-(ро1у-В) / Львов В.Л., Плужникова Г.К., Маликов В.Е. // Биоорганическая химия.- 1987. Т. 13.- №8. - С. 1070 -1074.

20. Методы, диагностики и борьбы с бруцеллезом собак, вызываемым Brucella canis: методические рекомендации / Л.В. Дегтяренко, В.Г. Ощепков, Г.В. Розницына, С.А. Власова, Л.Н. Гордиенко, Н.Г. Шпак, И.О. Кривошеев: СО РАСХН. ВНИИБТЖ Омск, 2007. - 18 с.

21. Михайлова Ю.П. Разработка средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого Brucella canis: Автореф. диссерт. на соиск. уч. степени канд. вет. наук: 16.00.03 / Ю.П.Михайлова М.: 2000. - 27 с.

22. Наставление по диагностике бруцеллеза животных / Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, Москва, 2004, - 63с.

23. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров М.: Медицина, 1987. - 357 с.

24. Руководство по иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезу / Под ред. Воробьевой Н.В. М.: МГУП, 2000. - 41с.

25. Ройт А. Основы иммунологии / Ройт А. М.: Мир, 1991 - 327с.

26. Справочник биохимика / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.- М.: Мир, 1991.- С.544

27. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / П.А. Три-ленко. Ленинград: Колос, 1976. - 280 с.

28. Шпак Н.Г. Биосинтез специфических Ig у животных, экспериментально зараженных В. canis / Шпак Н.Г., Дегтяренко JI.B, Ощепков В.Г. // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических болезней животных: Сб. науч. тр. Омск, 2003. - С. 318-323.

29. Шпак Н.Г. Изыскания и сравнительная оценка средств и методов диагностики бруцеллеза, вызываемого B.canis у собак: Автореф. диссерт. на соиск. уч. степени канд. вет. наук. / Н.Г.Шпак Новосибирск, 2003. - 14с.

30. Шумилов К.В. Случай выявления бруцеллеза собак в России / Шумилов К.В., Калмыков В.В., Михайлова Ю.П., Желудков М.М., Толмачева Т.А., Белый М.К., Патракова Т.Г. // Ветеринария. 1996.- № 5. - С. 56-59.

31. Асао Larsson M.H.L. Brucellose canina experimental! estudos bacteriologico, serologico e anato-mopatologico. / Acao Larsson M.H.L, Olivera da Costa E. Larsson C.E. Guerra J.L.// Arg. Bras. Med. Vet e Zootechn. 1984.- Vol.36. -№ 2. -P.141-156.

32. Alton G.G. Laboratory techniques in brucellosis. / Alton G.G., Jones L.M. // World Health Organization. Paris, 1988. - 92 p.

33. Anderson-G.I. Discospondylitis and orchids associated with high Brucella titre in a dog / Anderson G.I., Binnington A.G. // Саш Vet. J. 1983; - Vol 24. - P. 249-252.

34. Badakhsh F.F. Improved rapid slide agglutination test for presumptive diagnosis of canine brucellosis. / Badakhsh F.F., Carmichael L.E., Douglass J.E. // Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 15. - P. 286-289.

35. Baldi P.S. Brucella abortus cytoplasmic proteins used as antigens in an ELISA potentially useful for the diagnosis of canine brucellosis / Baldi P.S. // Veter. Microbiol. -1994. VoL 41. -№ 12. - P. 127-134

36. Barg L. Pesguinsa de agglutininas anti-Brucella canis em soros humanos. / Barg L., Goddoy A.M., Peres F.N. // Arg. Esc. Vet. Univ. Fed. M. Gerais. -1977. -Vol.29.-P. 28-31.

37. Bosu W.T.K. A serological survey of dogs for B. canis in Southwestern Ontario. / Bosu W.T.K., Prescott J.F. // Can. Vet. J. 1980. -Vol. 21. -№ 7. - P. 198200.

38. Brown J. A serologic survey of a population of Georgia dogs for Brucella canis and an evolution of the slide agglutination test. / Brown J., Blue J.L., Woo-ley R.E. et al. // J.A.V.M.A. 1976. - Vol. 169. -№ 11. - P. 1214-1216.

39. Brown J. Brucella canis infectivity rates in stray and pet dogs populations. / Brown J., Blue J.L., Wooley RlE., Dressen D.W. // Arner. J. Publ. Hlth. 1976. -№66.-P. 889-991.

40. Carmichael L.E. Canine brucellosis: an annotated review with selected, cautionary comments. / Carmichael L.E. // Theriogenology. 1976. - Vol. 6. - № 2-3.-P. 105-117.

41. Carmichael L.E. Abortion in 200 Beagles. / Carmichael L.E. // J.A.V.M.A. -1966.-Vol. 149.-P. 1126.

42. Carmichael L.E. Canine Brucellosis: isolation, diagnosis, transmission / Carmichael L.E. // Proc. U.S. Livestock San. A. 1968. - Vol. 71. - P. 517-527.

43. Carmichael L.E. Characteristics of a newly recognized species of Brucella responsible for infection canine abortions / Carmichael L.E., Burner D.W. // Cornell Vet. 1968. - Vol. 58. - P. 579-582.

44. Carmichael L.E. WHO mimeographed document. / Carmichael L.E., Flores-Castro R., Zoha S.J. // WHO>Bruc/80.361. -1981.

45. Carmichael L.E. A rapid slide agglutination test for the serodiagnosis of Bnicella canis infection that employs a variant (M-) organism as Ii antigen. / Carmichael L.E., Joubert J.C. // Cornell Veter. 1987. - Vol. 77. - № 1. -P. 3-12.

46. Carmichael L.E. Transmission of Brucella canis by contact exposure. / Carmichael L.E:, Joubert J.C. // Cornell Vet.'- 1988. Vol. 78. - № 7. - P: 63-73.

47. Carmichael L.E. Characterization of B. canis protein antigens and polypeptide antibody responses of infected dogs. / Carmichael L.E., Joubert J.C., Jones L.

48. Veter. Microbiol. -1989. Vol. 19. - №4. - P. 373-387.

49. Carmichael L.E. Canine brucellosis: the clinical disease, pathogenesis and immune response / Carmichael L.E., Kenney R.M. // J.A.V.M.A. 1970. - Vol. 156.-№12. -P. 1726-1736.

50. Carmichael L.E. Problems in serodiagnosis of canine brucellosis: dog responses to cell-wall and internal antigens of Brucella canis / Carmichael L.E., Zoha S.J., Flores-Castro R. // Develop. Biol. Stand. 1984. - Vol. 56. - P. 371383.

51. Carmichael L.E. Canine Brucellosis Caused by Brucella Canis / Carmichael L.E., Shin S. //Diagnostic Laboratory and Baker Institute for Animal Health, College of Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca, New York, USA.

52. Greene CE, Carmichael LE. Canine brucellosis. In: Greene C.E, editor. Infectious diseases of the dog and cat. Philadelphia: WB Saunders, Co; 2006. p. 36981.

53. Corbel M.J. The serological relationship between Brucella spp., Yersinia enterocolitica serotype IX andd Salmonella serotypes of Kauffínann-White group N. // J. Hyg. 1975.-Vol. 75.-№ l.-P. 151-171.

54. Corbel M.J. Use of phage for identification of Brucella canis and Brucella ovis cultures / Corbel M.J., Thomas E.L. // Res. Vet. Sei. 1985. -Vol. 38. -№ 1. -P. 35-40.

55. Cordon J.C. Canine bmcellosis in Nouschold / Cordon J.C., Pue H.L., Rutgers H.C. // J.A.V.M.A. 1985.-Vol. 186.-№7.-P. 695-698.

56. Currier R.W. Brucellosis / Currier R.W. // J.A.V.MA. 1989. - Vol.195. - № 5. - P. 595-599.

57. Currier R.W. Canine bmcellosis / Currier R.W., Raither W.F., Martin R.J., PotterM.E. // J.A.V.M.A. 1982. - Vol. 180. - №2. - P. 132-133.

58. Dees S.B. Fatty acids of Brucella canis and Brucella suis / Dees S.B., Hollis D.G., Weaver. R.E., Moss C.W. // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol. 14. - № 1. -P.lll-112.

59. Deyoe B.L. Studies on the pathogenesis of a canine abortion agent'(Brucella canis) in dogs and other domestic animals / Deyoe B.L. // Thesis, Iowa State Uni-ver., Ames, Jowa. 1970. - P. 1-148.

60. Diaz. R. Identification d'un compose antigenique specifique de la phase rugueuse ( R ) des Brucella / Diaz. R., Bosseray N. // Ann. Rech. Vet. 1973.4. -P.283-292.

61. Diaz R. The immuno-difrusion method for the identification of cattle vaccinated with Brucella abortus strain 45/20 / Diaz R., Jones L.M. // Vet. Res. 1973. -Vol. 93.-P. 300-302.

62. Feniey J. Le chien, vecteur ou reservoir de l'infection brucellique // Rev. Elevage Med. Veter.-1987. Vol. 40. - № 4. -P.331-333.

63. Flores-Caslro R. Estudio sobre brucella canis en Mexico. / Flores-Caslro R., Segura R // Teen. Pec. en Mexico.-1975. №29. - P. 54-58.

64. Flores-Casto R. Canine brucellosis: bacteriological and serological investigation of naturally infection dogs in Mexico city. / Flores-Casto R., Suarez C., Ramires-Pfeiffer C., Carmichael L.E. // J. Clin. Microbiol.- 1977.-№ 6. P. 591597.

65. Flores-Castro R. Canine brucellosis: current status of methods for diagnosis : and treatment. / Flores-Castro R., Carmichael L.E. // Gaines Vet. Symp.-1977. -Vol. 27.-P. 17-24.

66. Flores-Castro R. Canine brucellosis. Current status of method for diagnosis / ' Flores-Castro R., Carmichael L.E // Cornell Vet -1978. Vol. 68.-P. 76 - 88.

67. Flores-Castro R. Characterization of different Brucella canis strains. / Flores-Castro R., Carmichael L.E // Rev. Latinoam. Microb. 1986. - Vol. 28. - P. 145152.

68. Flores-Castro R. Canine brucellosis: bacteriological and serological investigation of naturally infected dogs of Mexico city / Flores-Castro R., Suarez F., Ramirez-Pfeiifer C. //J. Clin. Microbiol. 1977.-Vol. 6.-P. 591-597.

69. Forbes L.B. Brucella canis isolated from Canadian dogs / Forbes L.B., Pante-koek J.F. //Can. Vet. Journal. 1988.- Vol. 29 - №2. - P. 149-152.

70. Galphin S.J. A serological survey for Brucella canis in dogs on a military base. / Galphin S.J. // J.A.V.M.A. 1977. - Vol. 17 - P.727-729.

71. Gaugas J.M. Enhancing effect of antilymphocytic serum on mycobacterial infections in mice. / Gaugas J.M., Rees R.J.W. // Nature. -1968. Vot. 219. - P. 408-409.

72. George L. Antisperm responses in male dogs with chronic B.canis infections / George L., Carmichael L. E. //Am. J. Vet. Res. 1984. - Vol. 45. -№2. - P. 274281.

73. George L.W. Studies on the immune response in canine brucellosis / George L.W. //Thesis, Cornell University, Ithaca, N.Y.-1974. P. 1-124.

74. George L.W. A plate agglutination test for the rapid diagnosis of canine brucellosis. / George L.W., Carmichael L.E. // Am. J. Vet. Res. 1974. - Vol. 35. - P. 905-909.

75. George L.W. Development of a rose bengal stained plate-test antigen for the rapid diagnosis of Brucella canis infection / George L.W., Carmichael L.E // Cornell Vet. 1978. - Vol. 68. - № 4. - P. 530-543.

76. George L.W. Semen examination in dogs with canine brucellosis. / George L.W., Duncan J.R., Carmichael L.E.// Am. J. Vet. Res. 1979. - Vol. 40. - P. 1589-1595.

77. Germano P.M.L. Prevalencia de infecao por Bnicella canis em caes da cidade de Campinas / Germano P.M.L., Vasconcellos S.A., Ishizuka MM, De Camargo Passos E„ Erbolato E.B. // Rev. Fac. Med. Veter. Zootechn. Univ. San Paulo. -1987. -24. -№ 1. P.27-34.

78. Gleiser C.A. Pathologic changes in dogs infected with a Brucella organism / Gleiser C.A., Sheldon W.G., Van Hoosier G.L. // Lab. Anim. Sci.-1971 .- Vol. 21 .-P. 540-545.

79. Godoy A.M. Brucella canis in Brasil / Godoy A.M. //Proc. Y National Meeting on Microbiology (Brasil). 1974. - P. 77-78.

80. Godoy A.M. Isolamento de Brucella canis em Minas Gerais, Brasil. / Godoy A.M., Peres J.N., Barg L. // Arg. Esc. Vet. Univ. Fed. M. Gerais.-1977. 29. - P. 35-42.

81. Greene C.E., George L.W. Canine brucellosis: Clinical microbiology and infection diseases of the dog and cat. / Greene C.E., George L.W. // Philadelphia: Sauuders. 1984. - P: 646-662.

82. Henderson A.A. Discospondylitis in three dogs infected with Brucella canis. / Henderson^ A.A., Hoertein B.F., Kramer T.T., Meyer ME // J.A.V.M.A.-1974.-Vol. 165.-P. 451-455.

83. Higgins R. A serological survey for Brucella canis in dogs in the province of Quebec. / Higgins R., Hoquet F., Bourque R., Gosselin J // Can. Vet. Journal.1979.-Vol.20.-P. 315-317.

84. Hill W.A. Enzootic abortion in a canine production colony. Epizootology, clinical features and control procedures. / Hill W.A., Van Hoosier G.L., McCon-nickN. // Lab. Anim. Care. 1970. - Vol. 20. - P. 205-208.

85. Hoff G.L. Canine brucellosis in Florida: serological survey of pound dogs, animal shelter workers and veterinarians / Hoff G.L., Nichols J.B. // Am. J. Epidemiol.- 1974,-Vol. 100.-P. 35-39.

86. Hoff G.L. Serological survey for agglutinins to Brucella canis in Florida residents / Hoff G.L., Schneider N.J. // Am. J. Trap. Med. Hyg.-1975.-Vol. 24.-P. 157-159.

87. Hollet R.B. Canine brucellosis: Outbreaks and compliance. / Hollet R.B. // Theriogenology. 2006. - Vol. 66. - P. 575-587.

88. Hoyer B. Homologies of deoxyribonucleic acids from Brucella ovis, canine abortion organisms, and other Brucella species. / Hoyer B., McCullough N. // J. Bact.-1968.-Vol. 96.-P. 1783.

89. Huang Jian. Identification, and characterization of 200 strains of Brucella canis under test from China. / Huang Jian. // Wei Sheng Wu Hsueh Pao.-1992.-Vol. 32.-№5.-P. 370-375.

90. Hubbert N.L. Canine Brucellosis: comparison of clinical manifestations with serologic test results. / Hubbert N.L., Bech-Nielsen S., Barta O. // J.A.V.M.A. -1980:-Vol. 177. №2.-P. 168-171.

91. Jennings P.B. The effect of a two-stage antibiotic regiment on dogs infected with Brucella canis. / Jennings P.B., Crumrine M.H., Lewis G.E // J.A.V.M.A. -1974.-Vol. 164.-P. 513-514.

92. Johnson C.A. Effect of combined antibiotic therapy on fertility in blood bitches infected^ with Brucella canis / Johnson C.A., Bennett MJ.F., Jensen R.K. //J.A.V.M.A. 1982. - Vol. 180: - P. 1474-1475.

93. Johnson C.A. Peripheral limphocyte function in dogs with Brucella canis infection / Johnson- C.A., Bull R.W., Schirmer R.G. // Veter. Immunol. Immunopa-thol. 1983 - Vol.4. - №4. - P. 425-431.

94. Joint FAO/VHO Expert Committee on Brucellosis. Sixth Report. // World

95. Health Organization, Geneva.-1986.

96. Jones L.M. Taxonomic position in the genus Brucella of the causative agent of canine abortion / Jones L.M., Zanardi M, Leong D., Wilson J.E. // J. Bacteriol. -1968. Vol. 95. - № 2. - P. 625-630.

97. Jones R.L. Canine brucellosis in a commercial breeding kennel / Jones R.L. //J.A.V.M.A. 1984. - Vol. 184. - № 7. - P. 834-835.

98. Katami M. An epidemiological survey of Brucella canis infection of dogs in the Towada area of Aomori prefecture / Katami M., Sato H., Yoshimura J // J. Vet. Med. Sei. 1991. - Vol. 53. - №6. - P. 1113-1115.

99. Kerwin S. Diskospondylitis associated with Brucella canis infection in dogs: 14 cases (1980-1991) / Kerwin S., Lewis D.D., Hribernik T.N. // J.A.V.M.A. -1992. Vol. 201. - № 8. - P. 1253-1257

100. Kruedener B. Ergebhisse serologischer und bakteriologischer Unersuchun-gen von Hundeblutproben auf Brucella canis / Kruedener B. // ZentbL Vet. Med. 1976. - B.23. - S. 555-565.

101. Laudencia R.V. A serologic survey of Brucella canis agglutinins in various dog populations in Metro Manilla / Laudencia R.V., Rovira H.G. // Philipp. J. Vet. Med. 1979. -№18. - P. 63 -78.

102. Lewis G.E. A serological survey of 650 dogs to detect titers for Brucella canis (B. suis, type 5) / Lewis G.E. // J.A.V.M.A. 1972. - Vol. 8. - P. 102-107.

103. Lewis G.E. Therapeutic value of tetracycline and ampicillin in dogs infected with Brucella canis. / Lewis G.E., Crumrine M.H., Jennings P.B. // J.A.V.M.A. -1973.-Vol. 163.-P. 239-241.

104. Lovejoy G.S. Serologic survey of dogs for Brucella canis infection in Memphis, Tennessee. / Lovejoy G.S., Carver H.D., Moseley I.K // Am. J. Public Health. 1976. - Vol. 66. - PI 175-176.

105. Lucero E.N. Unusual clinical presentation of brucellosis caused by brucella canis / Lucero E.N., Jacob N.O., Ayala S.M. // J. of Med. Microbiol. 2005. -Vol. 54. - P. 505-508.

106. Lucero E.N. Diagnosis of human brucellosis caused by Brucella canis /1.cero E.N., Escobar G.I., Ayala S.M. // J. of Med. Microbiol. 2005. - Vol. 54. -P.457 - 461.

107. Lucero E.N. Buffered plate antigen test as a screening test for diagnosis of human brucellosis / Lucero E.N., Bolpe J.E. // J. Clin. Microbiol. Vol.36. - №5. -P. 1425-1427.

108. Lucero E.N. Sensitivity and specificity of an indirect enzyme-linked immunoassay for the diagnosis of Brucella canis infection in dogs / Lucero E.N., Escobar G.I., Ayala S.M. // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 656 - 660.

109. McKee, M. A., Ballard, J. L. Mycotic aneurysms of the tibioperoneal arteries / McKee, M. A., Ballard, J. L. // Ann. Vase. Surg. 1999. - №5. - P.188-190.

110. Marmur J. A procedure for me isolation DNA from microorganisms / Mar-mur J. // J. Mol. Biol. 1961. - Vol. 3. - P. 208-218.

111. Martin R. Brucellosis canina en area rural de la provincia de Llanquihue, Republica de Chile / Martin R., Kuschel F. // Gac. Veter. 1978. - Vol.40. - № 328.-P. 121-126.

112. Mateu-de-Antonio E.M. Comparision of serologic test used in brucellosis diagnosis / Mateu-de-Antonio E.M., Martin M., Casal J.// J. Vet. Diagn. Invest. -1994.-Vol.6.-P. 257-259.

113. Meyer M.E. Brucella organisms isolated from dogs: comparison of characteristics of members of the genus Brucella / Meyer M.E. // Am. J. of Vet. Res. -1969. Vol. 30. - №10. - P. 1751-1756.

114. Mondde P.W. Seroepidemiological investigation of Brucella canis antibodies in different human population groups / Mondde P.W., Silberg S.L., Morgan P. M., Adess M // J. Clin. Microbiol. 1975. - № 2.- P.382-386.

115. Moore J.A. Brucella canis infection in dogs / Moore J.A. // J.A.V.M.A.-1969. Vol. 15. - P. 2034-2037.

116. Moore J.A. Scientific correspondence: a previously undescribed organism associated with canine abortion / Moore J.A., Bennet M. // Vet. Rec. 1967. -Vol. 80. -P.604-605.

117. Moore J.A. Epizootiology, diagnosis and control of Brucella canis / Moore J.A., Gupta B.N. // J.A.V.M.A. 1970. - Vol. 156. - № 12. - P. 1737-1740.

118. Moore J.A. Male dogs naturally infected with Brucella canis. / Moore J.A., Kakuk TJ. // J.A.V.M.A. 1969. -Vol. 155. - № 8. - P. 1352 -1358.

119. Moreno E. Immunochemical characterization of rough Brucella lipopolysac-charides / Moreno E., Jones L.M., Berman D.T. // J. Inf. and Imm. Vol. 43. - № 3.-P. 779 -782.

120. Morse E.V. Canine brucellosis: a review of the literature / Morse E.V // J.A.V.M.A. 1951. - Vol. 119. - P. 304-308.

121. Munford R. Human disease caused by Brucella canis. A clinical and epidemiological study of two cases / Munford R., Weaver R.E., Patton C. // J. Am. Med. Ass 1975. - Vol. 231. - P. 1267-1269.

122. Myers D.M. Studies of antigens for complement fixation and gel diffusion tests in the diagnosis of infections caused by Brucella ovis and other Brucella / Myers D.M., Jones L.M., Varela-Diaz V.M. // Appl. Microbiol. 1972. - Vol. 23. - № 5 - P.894-902.

123. Myers D.M. Preliminary report on the development of a diffusion-in-gel method for the diagnosis of ram epididymitis / Myers D.M., Siniuk A.A. // Appl. Microbiology. 1970. - Vol. 19. - № 2. - P. 335-337.

124. Myers D.M. Serological and bacteriological detection of B. canis infection of stray dogs in Moreno, Argentina / Myers D.M., Varela-Diaz V.M // Cornell Vet. -1980. Vol.70. - P. 258-265.

125. Myers D.M. Comparative sensitivity of gel-diffusion and tube-agglutination tests for the detection of Brucella canis antibodies in experimentally infected dogs / Myers D.M., Varela-Diaz V.M., Coltorti E.A // Appl. Microbiol. 1974. - Vol. 28. - P. 1-4.

126. Nicoletti P. An evolution of methods to diagnose B. canis infection in dogs / Nicoletti P., Chase A. // Compendium on continuing educat. practic.veter. 1987. -Vol. 9. - № 11.-P. 1071-1073.

127. Nicoletti P. The use of antibiotics to control canine brucellosis / Nicoletti P., Chase A. // Compendium on continuing educat. practic. veter. 1987. - Vol. 9: -№ 11.-p: 1063-1067.

128. North R. J. The action of cortisone acetate-on cell-mediated immunity to infection: histogenesis of the lymphoid cell response and selective elimination of committed lymphocytes / North R. J. // Cell. Immunol. 1971. - № 3; - P. SOS-SIS.

129. Owen R.J., Hill L. R., Lapage S.P. Determination of DNA of base composition from melting profiles in delute buffers / Owen R.J., Hill L. R., Lapage S.P. // Biopolymers. 1969. - Vol. 7. - P. 503-516.

130. Pamas J. Chromatographic analysis of sugars occurring in S- and R-forms of Brucella / Pamas J. // Bull. Acad. Polon. Sc. -1967. Vol. 15. - № 4. - P. 205-209.

131. Pamas J. Sugars and amino acids in Brucella and some other Parvobacteri-aceae / Pamas J. //Bull. Acad. Polon. Sc. 1965. - Vol. 13. - №.6. - P. 331-337.

132. Percy D.H. Experimental Brucella canis infection in the monkey (Macaca arctoides) / Percy D.H., Egwu I.N., Jonas A.M. // Cañad. J. Comp. Med. 1972. -Vol. 36.-P. 221-225.

133. Peres J.N. Isolamento de Brucella canis de Carrapatos (Phipicephalus sanguineus) / Peres J.N., Godoy A.M., Barg L., Costa J.O. // Arg. Escola Vet. Univ. Fed. Minas Gerais. 1981. - Vol. 33. - № 1. - P. 51 -55.

134. Piampiano, P. Brucellosis: unusual presentations in two adolescent boys / Piampiano, P., McLeary, M., Young, L. W., Janner, D. // Pediatr. Radiol. 2000. -Vol.30.-P. 355-357.

135. Pickerill P.A. Canine brucellosis: serological host ranger and epidemiological studies / Pickerill P.A. // Thesis, Cornell University, Ithaca, N.Y. 1970. - P. 1086-1088.

136. Pickerill P.A. Comments on epizootology and control of canine brucellosis / Pickerill P.A. // J.A.V.M.A. 1970. - Vol. 156. - P. 1741-1742.

137. Pickerill P.A. Canine brucellosis: control programs in commercial kennels and effect on reproduction / Pickerill P.A., Carmichael L.E. // J.A.V.M.A. 1972. - Vol.160. - № 12. - P. 1607-1615.

138. Pilet C. La bruceilose du chien a Brucella canis / Pilet C., Quintin-Colonna F. //Ree. Med. Vet. 1978. - Vol. 154. - P. 615-620.

139. Pollock R.V.H. Canine brucellosis: Current status / Pollock R.V.H. // Com-pend. Contin.Educ. Pract. Vet. 1979. - Vol. 1. - P. 255-267.

140. Ramacciotti F. Rislamiento de Brucella canis efectuado por primera vez en la República Argentina con transmisión humana / Ramacciotti F. // Rev. Med. Veter.- Buenos Aires. 1978. - Vol. 59. - №2. - P. 69-73.

141. Reike J.A. Brucella canis isolated from the eye of a dog. / Reike J.A., Rhoades H.E //J.A.V.M.A.-1975. Vol. 156. - P. 1734-1736.

142. Rousseau P. Brucella canis infection in a woman with lever of unknown origin / Rousseau P. // Postgrad. Med. 1985. - Vol. 78. - P. 253-254.

143. Saegusa G. A survey of Brucella canis infection in dogs from Tokyo area / Saegusa G., Ueda K., Goto Y., Fugiwara K. // Jap. J. Vet. Sci. 1978. - Vol. 40. -P. 75-80.

144. Sandoval L.A. Incidencia da brucellose canina na cidade de Sao Paulo / Sandoval L.A., Ribeiro L.O.C., Amaral L.B.C., Feitosa M.H., Bazan J.M. // Biologico. San Paulo. 1976. - Vol. 42. - P.128-132.

145. Sarris K. Isolation of Brucella canis and serologic investigation among dogs in the area of Thessaloniki / Sarris K., Bourzi-Hatzopoulou E., Kontos B. // Bull. Hellen. Veter. Med. Soc. 1987. - Vol. 38. - №1. - P. 24-29.

146. Schoeb T.R. Scrotal and testicular changes in canine brucellosis: a case report / Schoeb T.R., Morton R. // J.A.V.M.A. 1978. - Vol. 172. - P. 598-600.

147. Schoemann J. Brucella canis infection in a man / Schoemann J. // Deutch. Med. Woch. Schr. 1986. - Bd. 3. - № 1. - S. 20-22.

148. Seguin P., Higgins R. La brucellose canine / Seguin P., Higgins R. // Med. Vet. Quebec. 1984. - №10. - P. 2-5.

149. Serikawa T. Multiplication of Brucella canis in male reproductive organs and detection of autoantibody to spermatozoa in canine brucellosis / Serikawa T., Tacada F.L, Kondo Y // Develop. Biolog. Standard, Basel. 1984. - Vol. 56. -P.295-305.

150. Serikawa T. Spermagglutination and spermagglutinating activity of serum and tissue extracts from reproductive organs in male dogs experimentally infected withB. Canis / Serikawa T. //Nippon. Juigaku. ZasshL. 1981. - Vol. 43. -№ 4. - P. 469-490.

151. Serikawa T. Significance of urine in transmission of canine brucellosis / Serikawa T., Mugaruchi T. // Jap. J. Vet. Sci. 1979. - Vol. 41. - P: 607-616.

152. Serikawa T. Significance of urine-culture for detecting with Brucella canis in dogs / Serikawa T., Muraguchi T.T., Nakao N., Irie Y // Japan. J. Veter. Sc. -1978. Vol. 40. - №3. - P! 353-355.

153. Serikawa T. Purification of a brucella canis cell wall antigen by using imu-nosorbent columns and use of the antigen in enzyme linked imunosorbent assay for specific diagnosis of canine brucellosis / Serikawa T., Muraguchi T., Iwaki S.

154. J. of Clinic. Microb. Vol. 27. - № 5. - P. 837-842.

155. Shimizu T. A technique of agglutination test with R-type Brucella as a antigen / Shimizu T., Shibata S. // Nation. Institute of Animal Health quarterly (Tokyo) 1962. - Vol.2. - P. 15-20.

156. Spink W.W. Comments on canine brucellosis due to Brucella canis / Spink W.W. //J.A.V.M.A. 1970. - Vol. 156. - № 12. - P. 1734-1736.

157. Swensen R.M. Human infection with Brucella canis / Swensen R.M., Carmi-chael L.E., Cundy K.R // Ann. Intern. Med. 1972. - Vol. 76. - P. 435-438.

158. Taul L.K. Canine abortion due to an unclassified Gram-negative bacterium / Taul L.K., Powell H.S., Baker M.D. // Vet. Med. Small Anim. Clin. -1967. Vol. 73. - P. 543-544.

159. Terakado N. Drag susceptibility of Brucella canis isolated from dogs / Tera-kado N., Ueda H., Sugawara H. // Japan. J. Veter. Sc. 1978. - Vol. 40. - № 3. - P. 291-295.

160. Tosi, M. F. Brucella canis infection in a 17-month-old child successfully treated with moxalactam / Tosi, M. F., Nelson, T. J. // Pediatr. 1982. - Vol.101. -P. 725-727.

161. Ueda K., Spontaneous Brucella canis infection in beagles: bacteriological and serological studies / Ueda K., Magaribuchi T., Saegusa J // Jap. J. Vet. Sci. -1974.-№36.-P. 381-389.

162. Van Duijkeren E. Significance of the vaginal bacterial flora in the bitch: a review / Van Duijkeren E. // Vet. Rec. 1992. - Vol. 131.- P. 367-369.

163. Voreno E. Purification and characterization of rought and.smooth lipopoly-saccharides from Brucella abortus / Voreno E., Pitt M. N., Jones L.M. // J. Bact. Biol. 1979. - Vol. 38: - P. 361-369.

164. Wanke M. M. Comparative performance of test using cytosolic or outer membrane antigens of Brucella for the serodiagnosis of canine brucellosis / Wanke M. M., Delpino M. V., Baldi P. C. // Vet. Microb. 2002. - Vol. 88. - P. 367-375.

165. Watarai M. A rapid agglutination assay for canine brucellosis using antigen coated beads / Watarai M., Yamamoto J., Kim S., Suzuki H. // J. Vet. Med. Sci.2007. Vol. 69. - № 5. - P. 477 - 480.

166. Weber A. Brucella canis / Weber A. // Handbuch der Bacteriollen Infectionen bei Tieren., B. 4, Jena:VEB Gustav Fisher Verlag. 1982. - S. 329369.

167. Weber A. Untersuchungen zur niicrobiologischen Diagnose und Epidermiologie der Brucella canis infection des Hundes / Weber A. // Thesis, Giessen.-1975,-P.57-69.

168. Weber A. Isolienmg von Brucella canis aus Citrablut über das embryomerte llulinerel / Weber A., Schliesser T. // Zbl. Vet. Med. Reihe B. 1977. - Vol. 24. -№7.-P. 576.-581.

169. Weber A. Serologischer und kultureller Nachweis von Brucella canis bei Beagle-Hundes einer Versuchstierhaltung / Weber A., Schliesser T. // Zbl. Vet. Med. 1975. - B.22. - S. 403-410.

170. Weber V.A. Uber de Brauchbarkeit des Agargel-Prazipitationtestes zum Nachweis von Brucella canis-lnfectionen bei Beagle-Hunden / Weber V.A., Krauss H. // Ber. Munch. Tierarztl. Wsch. 1975. - Vol. 88. - P. 425-427.

171. Williams J.M. Protecting dogs against Brucella canis bacteremia with killed Brucella abortus strain 45/20 vaccine / Williams J.M. // United States Patent Office, Ser.No. 707,432; Int.Cl. C12k 3/00; A61k 23/00; U.S.C1. 1970. - P. 424492.

172. Wooley R.E. Serosurvey of Brucella canis antibodies in urban and rural stray dogs in Georgia / Wooley R.E., Brown J., Shorts Junior E.B. // Vet. Med. Small Anim. Clin. 1977. - Vol. 72. - P. 1581-1584.

173. Wooley R.E. Isolation of Bnicella canis from a dog seronegative for Brucellosis / Wooley R.E., Hitchcock P.L., Blue J.L. // J.A.V.M.A. 1978. -Vol. 173. -№4. -P. 387-388.

174. Yamauchi C., Suzuki T., Nomura'T. Canine brucellosis in a beagle-breeding colony / Yamauchi C., Suzuki T., Nomura T //Jap. J. Vet. Sei. 1974. - Vol. 36. -P.175-182.

175. Ying, W. Brucella canis endocarditis: case report / Ying, W., Nguyen, M. Q., Jahre, J. A. // Clin. Infect. Dis. 1999. - Vol.29. - P.1593-1594.

176. Zaraora J., Alonso O., Martin R. Brucellosis canina en Valdivia, Chile. Estudio serologico y bacteriológico en perros de ciudad / Zaraora J., Alonso O., MartinR. //Zbl. Vet. Med. 1980. - B. 22. - S. 149-153.

177. Zoha S.J., Carmichael L.E. Properties of cell wall antigens of virulent

178. Brucella canis and a less mucoid variant of reduced pathogenicity / Zoha S.J., Carmichael L.E. // Am. J. Res.- 1982. Vol. 43. - №1. - P. 171-174.

179. Zoha S.J., Carmichael L.E. Serological responses of dogs to cell wall and internal antigens of Brucella canis (B. canis). // Vet. Microbiol. 1982. - №1.-P. 3550.

180. Zoha S.L., Walsh R. Effect of a two-stage antibiotic treatment regimen on dogs naturally infected with Brucella canis / Zoha S.L., Walsh R. // J.A.V.M.A. -1982. Vol.180. - P. 1474-1475.