Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полиморфизм генов цитокинов в норме и при ВИЧ-инфекции

На правах рукописи

СМОЛЬНИКОВА МАРИНА ВИКТОРОВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ цитокинов в НОРМЕ И ПРИ ВИЧ - ИНФЕКЦИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2002

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,

Профессор Коненков В.И.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бочаров Е.Ф.

Кандидат биологических нате Фрейднн М.Б.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет МЗ РФ

Защита диссертации состоится_2002 г.

в_час._мин. на заседании диссертационного совета Д

001.001.01 в ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск.

Автореферат разослан_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета_

Кандидат биологических наук Кудаева О.Т.

ht4(c зь, о

zrs/s - 2 С п

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) в настоящее время обусловливает пандемию с самой высокой степенью летальности, в результате чего рост заболеваемости ВИЧ является важнейшей медико-социальной проблемой [Хаитов Р.В. и др., 1994; Покровский В.В., 1996; Калинина Н.М. и др, 1997; Петров Р.В., Борисова A.M., 1998; Clerici M. et al., 1994; Rozenberg Z., Fauci A., 1990]. У ВИЧ инфицированных лиц выделяют разный характер течения заболевания - быстро и медленно прогрессирующую ВИЧ инфекцию, обусловливающую темп перехода в терминальную стадию СПИД [Foli A. et al., 1995].

Одним из факторов, влияющих на репликацию ВИЧ в организме, являются цитокины, некоторые из которых, в том числе TNFa, IL-ip, и IL-6, могут способствовать репликации ВИЧ, повышая экспрессию регуляторных генов вируса [Hazan U. et al, 1990; Poli G., Fauci A., 1990, 1992; Biswas P. et al., 1994; Munoz-Femandes M.A. et al., 1997]. По мере прогрессирования заболевания параллельно нарастанию уровня противовоспалительных цитокинов, обусловливающих относительно малоэффективное в данном случае нарастание уровня антител происходит угнетение Thl-хелпсрного ответа, стимулирующего сильный клеточный компонент [Clerici M., Sheares G.M., 1993; Bogner J. et al., 2001; Galli G. et al., 2001]. Функционирование цитокиновой сети при ВИЧ - инфекции зависит от многих причин, в число которых входят индивидуальные различия в продукции цитокинов, обусловленные рядом генетических особенностей [Pantalco G. et al., 1998; Roger M., 1998].

В 1996 году было показано, что существует относительная резистентность людей к ВИЧ - инфицированию, обусловленная наличием у остающихся серонегативньши индивидов с делецией в гене корецептора ВИЧ, хемокинового рецептора CCR5, реализация которой осуществляется посредством блокирования проникновение ВИЧ в клетки не зависимо от пути передачи виру са [Dean M. е( al., 1996; Wang J. et al., 1998, 2000]. Кроме этого, установлена расовая специфика ее распределения мутации Delta32 гена CCR5, - частота встречаемости гетерознготного варианта среди представителей негроидной и монголоидной рас минимальна, а протектпвный гомозиготный вариант у них отсутствует. Тогда как в европеоидной популяции гетерозиготный вариант встречается с частотой 2-25% и гомозиготный с частотой около 0,2-2,0% [Dean M. et al., 1996; Liu R. et al., 1996; Paxton W. et al., 1996; Samson M. et al., 1996].

На современном этапе поиска и изучения генов-маркеров предрасположенности (резистентности), характера течения и скорости перехода ВИЧ - инфекции в собственно СПИД важное место занимает полиморфизм генов цитокинов [Khoo S.H. et al., 1997; Brinkman B.M. et al., 1997; Nakayalna E.E. et al., 2000]. С развитием молекулярно-г'енетических

технологий, анализ наследственных основ детерминированности развития определенного течения заболевания направлен на поиск конкретных генов, ответственных за контроль иммунного ответа на патологическое воздействие. Для столь сложного заболевания, как ВИЧ - инфекция, большую роль играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания. Такие сочетания имеют неодинаковую частоту распределения в различных популяциях и расах, обусловливая различия в подверженности к ВИЧ - инфекции и темп ее прогрессирования у разных народов.

Молекулярно-генетичсские исследовательские работы способствуют изучению механизмов генетически детерминированной реакции иммунокомпстентных клеток на вирус иммунодефицита человека и прогноза темпа прогрессирования ВИЧ - инфекции, и созданию профилактических и терапевтических средств поддержания защитных сил инфицированного организма. Исследования роли полиморфизма генов цитокинов в иммуногенетической предрасположенности организма к ВИЧ - инфекции и особенностей клинического течения этого заболевания, темпе перехода ее в СПИД в нашей стране до сих пор не были проведены.

Цель исследования: изучить характер распределения аллсльных вариантов промоторных участков генов цитокинов 1L2, TNFA, IL4, ILIO, а также степень их ассоциированности с уровнем продукции соответствующих цитокинов и основными параметрами состояния иммунной системы среди ВИЧ - инфицированных лиц с различными вариантами течения инфекционного процесса и здоровых жителей России европеоидного происхождения.

Задачи:

1. Провести сравнительный анализ полиморфизма по четырем точечным заменам промоторных регионов генов цитокинов (T-330G 1L2, G-308A TNFA, С-590Т 1L4 и С-592А ILIO) среди жителей России европеоидного происхождения в сопоставлении с данными по другим этническим группам;

2. Проанализировать характер распределения аллсльных вариантов исследуемых генов цитокинов среди ВИЧ - инфицированных лиц европеоидного происхождения в сравнении со здоровыми индивидами;

3. Исследовать интенсивность спонтанной и индуцированной продукции цитокинов IL2, TNFA, IL4, ILIO мононуклерными клетками здоровых и ВИЧ - инфицированных лиц, обладающих различными аллельными вариантами в промоторных участках генов соответствующих интерлейкннов;

4. Изучить ассоциированность аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, ILIO с показателями состояния клеточного и гуморального звеньев иммунной системы здоровых и ВИЧ - инфицированных лиц;

5. Проанализировать характер ассоциированности аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, ILIO с быстрым и медленным характером

прогрсссирования ВИЧ - инфекции и оценить возможность разработки прогностических критериев развития неблагоприятного

быстропрогрессирующего характера течения ВИЧ - инфекции.

Научная новизна работы: Впервые проведен анализ распределения генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, ILIO среди жителей России европеоидного происхождения, показавший подобный другим европеоидным популяциям характер распределения частот аллельных вариантов. Показаны характерные отличия в распределении частот генов цитокинов, продуцируемых Thl и Th2 клетками, у ВИЧ - инфицированных больных европеоидного происхождения по сравнению со здоровыми лицами. Среди ВИЧ - инфицированных лиц по сравнению со здоровыми показано преобладание Т/Т варианта гена 1L2, G/A варианта гена TNFA, Т/Т варианта гена ¡L4 и С/А варианта гена ILIO. Установлено, что уровень продукции IL-10 в популяции европеоидов ассоциирован с аллельными вариантами промоторных регионов соответствующих генов. Параметры оценки функционального состояния иммунной системы ВИЧ -инфицированных пациентов ассоциированы с аллельными вариантами генов IL2, TNFA, ILIO. Установлена ассоциация генотипа Т/Т гена IL2 со сниженным уровнем абсолютного количества CD3+ лимфоцитов и показателями РБТЛ; ассоциация генотипа G/A гена TNFA со сниженным количеством CD3+ и CD4+ субпопуляций и уровня сывороточного IgG, а также ассоциация генотипа С/А гена ILIO с повышенным абсолютным количеством CD3 и CD8 позитивных клеток. Впервые показана ассоциация аллельных вариантов T/G, G/A, Т/Т, А/А генов IL2, TNFA, IL4 и ILIO, соответственно, с быстрым темпом прогрессирования ВИЧ -инфекции в терминальною стадию СПИД, что может быть использовано для разработки ранних прогностических критериев предрасположенности инфицированных лиц к быстропрогрессирующему характеру течения ВИЧ.

Научно-практическая значимость работы: Впервые получены нормативные характеристики распределения аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IIA0 среди жителей России европеоидного происхождения, проведено сопоставление характера их распределения среди российского населения с распределением среди населения ряда стран различного этнического состава. Впервые получены данные об отклонениях в характере распределения аллелей исследованных генов у ВИЧ - инфицированных пациентов с различным характером течения заболевания. Впервые показана ассоциированность аллельных вариантов генов цитокинов с варьированием параметров иммунного статуса. Предложена прогностическая таблица для оценки вероятности развития у ВИЧ - инфицированного индивида неблагоприятного быстропрогрессирующего темпа инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер распределения аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, ILIO среди населения России европеоидного происхождения в основном соответствует характеру их распределения среди европеоидного населения других стран, хотя отмечены некоторые отличия в частотах генотипов JL2 и TNFA;

2. Среди ВИЧ - инфицированных пациентов имеются отклонения в характере распределения аллельных вариантов некоторых генов цитокинов 1L2, TNFA, IL4, ILIO от нормативных характеристик, установленных для популяции здоровых лиц;

3. Повышенный уровень продукции IL-10 в клеточных культурах ассоциирован с аллельным вариантом С/А гена ILIO:

4. Аллели генов цитокинов ЯД TNFA и ILIO ассоциированы с показателями состояния иммунной системы здоровых и ВИЧ -инфицированных лиц;

5. Полиморфизм генов цитокинов является одним из важных компонентов генетического контроля над процессами индивидуальной резистентности н подверженности человека к развитию ВИЧ -инфекции с различным характером ее прогрессии.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции «Биология цитокинов. Сетевые межклеточные взаимоотношения в норме и патологии» (Новосибирск, 2001), VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), Научно-практической конференции «ДНК-диагностика в медицине» (Новосибирск, 2001), Научной XLI сессии общего собрания СО РАМН (Новосибирск, 2001), 1 съезде иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001), конференции «Актуальные проблемы клинической иммунологии» (Барнаул. 2002) и научном семинаре НИИ клинической иммунологии (Новосибирск, 2002).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 работ, .в том числе 3 в центральной печати.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, трех глав (Обзор литературы. Материалы и методы и Результаты собственных исследований), обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 154 страницах и включает 30 таблиц и 4 рисунка. Список литературы содержит 340 источников, из них 306 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение патогенетической значимости исследуемых генов цитокинов проведено у 127 ВИЧ - инфицированных пациентов, находящихся на разных стадиях инфицирования, среди которых было 86

мужчин и 41 женщина, их возраст в момент забора материала составлял от 13 до 51 года. Критерием отбора пациентов для исследования служило наличие у них антител к ВИЧ-1, обнаруженных в сыворотке крови.

Клиническая диагностика, определение стадий ВИЧ - инфекции у пациентов проводилось по классификации Покровского В.И. (1989). На основании динамического наблюдения клинических и иммунологических данных часть пациентов была разделена на группы с быстро и медленно прогрессирующим течением заболевания. В качестве критериев скорости прогрессии ВИЧ - инфекции были взяты продолжительность стадии генерализованной лимфоаденопатии и уровень CD4+ лимфоцитов [Autran В. et al., 1996; Paroli М. etal., 2001].

Контрольную группу составили 52 здоровых индивида, согласившихся на исследования, в возрасте от 21 до 29 лет, среди них 27 мужчин и 25 женщин, у которых антитела к ВИЧ не обнаружены.

Исследовано четыре полиморфных варианта четырех цитокинов: G-308A TNFA, T-330G IL2, С-590Т IL4, С-592А ILIO. Все изученные ттации локализованы в промоторных участках соответствующих генов и представляют один тип мутации -транзицию (Таб.1).

Для генотипирования здоровых и ВИЧ - инфицированных индивидов использовали образцы ДНК, выделенные из цельной венозной крови методом высаливания с использованием протеиназы К [Greene E.D., Olson M.V., 1990; Savage D. et al., 1993]. Генотипирование осуществляли путем рестрикционного анализа продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием опубликованной структуры праймеров и соответствующих ферментов рестрикции. Все праймеры были синтезированы в НПО «Вектор» (Новосибирск). Для типирования использовали амплификатор "Tercik МС2" («ДНК-технология», Москва).

После проведения ПЦР 3-5 мкл амплификата разделяли в 2% агарозном геле содержащем 0.5 мг/мл этидиум бромида при напряжении 120-130 В в течение нескольких минут для последующей визуализации в УФ-свете. подтверждающей наличие продукта амплификации. Затем продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими эндонуклеазами (Таб. 1): рестрикционная смесь в случае определения полиморфизма генов IL4, ILIO и TNFA включала 7-9 мкл амплификата, 1,01,2 мкл Юхбуфера для рестрикции, поставляемого фирмой-производителем («Сибэнзим». Новосибирск; «New England Biolabs», Великобритания), и 1-2 единицы активности фермента (в зависимости от эффективности его работы); в случае 1L2 рестрикционная смесь включала 5 мкл амплификата, 5 мкл 2хбуфсра для рестрикции и 1-2 единицы \(ае\. Рестрикцию продукта амплификации гена IL2 проводили в течение 4 часов при 45°С, IL4 - в течение 6 часов при 65"С. рестрикцию продуктов ILIO и TNFA проводили в течение 10-12 часов при 37°С. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида при напряжении 120-130 В в течении 30-45 минут и'

визуализировали в УФ-свете. В качестве маркера размера ДНК использовали плазм иду р1'С 19, расщепленную рестриктазон \lspl («Сибзнзим», Новосибирск).

Таблица 1.

Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген ........... Полимо рфизм Структура пранмеров Фермент рестрикц ИИ Литература

IL2 T-330G 5 '-tattcacatgttcagtgtagttct-3' 5' - acaüagcccacacttaggt -3' Mae I John S. et al. 1998.

TKFA G-308A 5' - aggcaataggtittgagggccat-3' 5' - acactccccatcctcccggct -3' Bspl9 I Patino-Garcia A. et al. 1999.

¡L4 С-590Т 5 '-actaggcctcacctgatacg-3' 5 '-gttgtaatecagtcctcctg-3' Bsm FI Cantagrel A. et al. 1999.

ILIO С-592А 5'- atccaagacaacactactaa -3' 5'- taaatatcctcaaagttcc -3' Rsa I Mok C.C. et al. 1998.

Культивирование мононуклеарных клеток периферической крови осуществляли согласно [Воушп А., 1968]. Для получения кондиционной среды МНК(1х106кл/мл) культивировали 48ч. в полной среде RPMI-1640, •дополненной 2 мМ L-глютамина, 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% FCS при 37°С во влажной

■ атмосфере с 5% СО:.

Уровень продукции цитокинов определяли иммунофер.ментным методом с использованием тест-систем "ProCon 1L-2" К100 с чувствительностью от 0,3 до 20 ME/мл; "ProCon TNFa" К050 с

■ чувствительностью от 10 до 2000 пкг/мл («Протеиновый контур». С.Петербург) и "CYTELISA™ Human IL-4"; "CYTEL1SA™ Human IL-10" с чувствительностью от 8 до 500 пкг/мл ("Cytiinmunc Sciences Inc.", USA). Процедуры определения проводили в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Иммунологические исследования ВИЧ - инфицированных лиц включали определение уровня субпопуляций лимфоцитов (CD3. CD4, CDS, CD 16, CD20, CD95). сывороточных иммуноглобулинов, ЦИК; провирусную ВИЧ-нагрузку лимфоцитов PVL, титр специфических анти-ВИЧ-антител, аффинность анти-ВИЧ-антител RHAV; функциональные тесты РБТЛ, HCT.

В работе использовали стандартные алгоритмы биометрии, включая анализ таблиц сопряженности (у~. точный тест Фишера), критерий отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала

(CI) [Mehla C.R., 1985], расчет и сравнение основных статистик распределении (средние, ошибка среднего). Проверку распределений на нормальность осуществляли по критерию Колмогорова-Смирнова; сравнение средних значений - непараметрическим методом Манна-Уитни. Диагностический критерий рассчитывали с использованием метода последовательной прогностической процедуры на основе анализа А. Вальда в модификации A.A. Генкина [Гублер Е.В., 1978]. Все расчеты проводили с помощью программ «STATISTICA for Windows 5.0» и «Microsoft Excel 97».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительный апалш распределения аллельных вариантов и генотипов генов IL2, TNFA, IL4, ILIO среди здоровых •/кителей России европеоидного происхождении в сравнении с другими

популяциями

Исследование четырех полиморфизмов генов цитокинов были проведены в группе практически здоровых лиц европеоидного происхождения. Для сравнения полученных результатов с мировыми, были использованы литературные данные по частотам аллельных вариантов исследованных локусов среди здоровых лиц европеоидного, монголоидного и негроидного происхождения. Полученные данные в целом отражают картину распределения генотипов рассмотренных промоторных участков генов цитокинов в других европеоидных популяциях.

Анализ полиморфизма T-330G промоторного участка гена 1L2 показал преобладание частоты гетерозиготного варианта T/G (51,9%) над гомозиготным Т/Т (42,3%). Наши данные в целом подтверждают доминирующее содержание аллеля Т в европеоидной популяции (частота 0,68 и 0,73, соответственно), однако у англичан преобладает вариант Т/Т по сравнению с T/G [John S. et al., 1998; Reynard M.P. et al., 2000]. Анализ распределения частот генотипов гена IL2 раздельно в подгруппах мужчин и женщин показал значительные различия между лицами разного пола. В мужской подгруппе наблюдается тенденция к преобладанию гомозиготного варианта Т/Т, характерная для европеоидных популяций, тогда как у женщин гетерозигота T/G почти двухкратно преобладает над гомозиготным вариантом Т/Т (56,0% и 32,0%, соответственно).

При анализе полиморфизма промоторного региона гена TNFA в участке G-308A показано значительное преобладание частоты гомозиготного варианта G/G (90,4%) над гетерозиготным G/A (7,7%). Полученное нами распределение генотипов TNFA отражает закономерности, полученные в европеоидных популяциях, среди которых генотип G/G также является преобладающим [Arias АЛ. et al., 1997; Brinkman В.М. et al., 1997; Hohler T. et al., 1998; Louis E. et al., 1998; Fernandc/.-Arqucro M. et al., 1999; Walston J. et al.. 1999]. Однако частота

встречаемости G/A варианта гена относительно ниже, чем имеет сходство с распределением в монголоидной популяции [Yoshida А. et al.. 1998]. При анализе частоты встречаемости аллсльных вариантов гена 7'.\7vl раздельно в подгруппах мужчин и женщин было показано, что нет существенных половых различий в распределении генотипов G-308A.

Для полиморфизма С-590Т гена IL4 среди здоровых лиц выявлено преобладание гомознготного С/С варианта (59,9%) над гетерозиготным С/Т (38.5%), Подобное распределение характерно и для иных европеоидных популяций [Cantagrel А. et al., 1999; Burchard E.G. et al.. 1999]. Среди представителей негроидной и монголоидной популяций напротив, по частоте встречаемости доминируют С/Т и Т/Т варианты данного полиморфизма [Burchard E.G. et al.. 1999; Kaneinitsu S. et al., 1999; Kawasliima T. et al.. 1998; Nakayama E.E. et al.. 2000]. Вариант С/С встречается в этих популяциях с частотой 10-20%. При анализе частоты встречаемости аллсльных вариантов гена IL4 раздельно в подгруппах мужчин и женщин было показано, что нет существенных половых различий в распределении генотипов С-590Т.

Для полиморфного локуса С-592А гена ILIO нами установлено преобладание частоты гомозиготного генотипа С/С (73,1%) над гетерозиготой С/А (26,9%), другой гомозиготный вариант указанного полиморфизма в нашей группе доноров не выявлен. Среди других европеоидных популяций наблюдается подобное распределение частот указанных генотипов, однако, гомозиготный вариант С/С встречается с несколько более редкой частотой, чем у россиян [Turner D.M. et al.. 1997; Koss К. et а!.. 2000]. Дтя гена ILIO нами показаны существенные различия в распределении генотипов между мужчинами и женщинами. Так, для мужчин характерно более чем четырехкратное преобладание варианта С/С (81,5%) над гетерозиготным (18,5%), тогда как у женщин различие выражено не так резко, у них наблюдается тенденция к преобладанию частоты генотипа С/А (36%) по сравнению с мужской подгруппой здоровых лиц.

Сравнение полученных результатов с литературными данными подтвердили положения о своеобразии аллсльных частот по исследованным локусам в разных популяциях и у разных народов. Таким образом, изученные полиморфные варианты генов цитокинов проявляют специфику в отношении распространения аллелей у разных рас. Это обстоятельство представляется важным в связи с тем, что, возможно, закономерности ВИЧ - инфицирования имеет свои особенности в различных популяциях.

2. Распределение аллсльных вариантов п генотипов генов IL2, TNFA, IL4, ILIO среди ВИЧ - инфицированных пациентов

В результате анализа частот генотипов и отдельных аллелей у ВИЧ '- инфицированных пациентов нами показан ряд*отличий в распределении

по сравнению со здоровыми лицами.

В группе ВИЧ - инфицированных лиц показана инверсия в частоте распределения генотипов Т/Т и T/G гена Я.2 по сравнению с группой здоровых индивидов. Так, генотип Т/Т у ВИЧ - пациентов превышает частоту варианта T/G (55.1% и 41,7%, соответственно) (Рис. 1, А). Так как величина относительного риска больше единицы (OR=l,67), можно говорить о тенденции к ассоциации генотипа Т/Т с ВИЧ - инфицированием или, что Т/Т положительно связан с заболеванием. В отличие от здоровых лиц, в группе ВИЧ - инфицированных не наблюдается различий в распределении генотипов IL2 между лицами разного пола.

во

10 ■ 60

50 ■ ;

40 ■ Г ( 30 • I 20 ■ 10 ■ j: О JJ-

ТТ

А В

Рис.1. А. Распределение частот генотипов полиморфного локуса T-330G гена 1L2 среди здоровых и ВИЧ инфицированных лиц европеоидного происхождения; В. Распределение частот генотипов полиморфного локуса G-308A гена TNFA среди здоровых и ВИЧ инфицированных лиц европеоидного происхождения. Примечание: здесь и далее светлые столбцы - здоровые лица, темные - ВИЧ-инфицированные пациенты.

При анализе различий в распределении генотипов полиморфного участка G-308A гена TNFA между группами больных и здоровых лиц показаны статистически значимые отличия. У ВИЧ - инфицированных лиц показано почти трехкратное увеличение гетерозиготного варианта G/A гена TNFA по сравнению со здоровыми лицами (OR=4,2l; р=0,0074), что указывает на его положительную ассоциацию с ВИЧ - инфицированием или, на предрасполагающую роль к инфицированию здоровых лиц. Генотип G/G, напротив, является протективным фактором (СЖ=0,3; р=0,0156) (Рис.1, В). Подобно здоровым лицам, в группе ВИЧ -инфицированных нет различий в распределении генотипов между мужчинами и женщинами.

У ВИЧ - инфицированных пациентов показано снижение частот С/С и С/Т вариантов полиморфизма 'в локусс -590. тогда как частота генотипа Т/Т гена НА троекратно преобладает над его частотой в группе здоровых лиц (OR=3,43), таким образом, наблюдается тенденция к

ассоциации генотипа Т/Т с заболеванием (Рис.2, А). Анализ частоты

встречаемости аллслъных вариантов гена НА цитокинов раздельно в подгруппах инфицированных мужчин и женщин показал некоторые различия в распределении генотипов между ними. Так, генотипы, содержащие аллель Т (С/Т и Т/Т) значительно преобладают у мужчин по сравнению с женской подгруппой (в сумме 47,7% и 34,1%. соответственно).

Среди ВИЧ - инфицированных лиц различия в содержании генотипов С/С и С/А полиморфизма С-592А гена ILIO выражены не настолько резко, как в группе здоровых лиц. Распределение генотипов частично сглаживается за счет появления А/А гомозиготного варианта гена (3.1%), не выявленного среди здоровых лиц. Показано, что содержание варианта С/С в ВИЧ - инфицированной группе на 10% ниже, чем в контрольной (OR=0,65). что может указывать на его отрицательную связь с заболеванием, тогда как генотип С/А имеет тенденцию к ассоциации с ВИЧ - инфекцией (OR=l,34) (Рис.2, В). При анализе различий в распределении генотипов полиморфизма С-592А гена ILIO между инфицированными лицами разного пола выявлено, что в женской подгруппе перераспределение частот генотипов происходит за счет гомозиготных вариантов - параллельно появлению редкого генотипа А/А показано снижении содержания С/С.

А В

Рис. 2. А. Распределение частот генотипов полиморфного локуса С-590Т гена IL4 среда здоровых и ВИЧ инфицированных лиц европеоидного происхождения; В. Распределение частот генотипов полиморфного локуса С-592А гена ILIO среди здоровых и ВИЧ инфицированных лиц европеоидного происхождения.

Суммируя полученные .данные об ассоциации полиморфных вариантов генов IL2, TXFA, НА, ILIO с ВИЧ - инфекцией нужно отмстить, что исследованные цитокины включены в различные звенья иммунного ответа на вирусные антигены: 1L-4 и IL-10 обуславливают гуморальное звено, а TNFa и IL-2 - вовлечены в противовирусный клеточный

иммунным ответ организма. Важным обстоятельством является то, что аллели -330Т, -308А изучаемых нами цитокинов встречаются чаще у ВИЧ - инфицированных, а аллели -590Т и -592А имеют тенденцию к повышенной частоте встречаемости по сравнению со здоровыми лицами.

3. Ассоциированность аллелыин о полиморфизма генов исследуемых цптокниов с уровнем их продукции в культурах клеток здоровых лиц

н внрусоноситслей

Полиморфизм промоторных регионов генов цитокинов влияет на уровень продукции соответствующего генного продукта, не задевая аминокислотной последовательности белка и не изменяя его функции. Таким образом, аллсльные варианты промоторов являются важным звеном в генетической предопределенности иммунного ответа посредством влияния на количество продуцируемого цитокина.

При анализе супернатантов культур клеток здоровых и инфицированных лиц установлено, что МНК ВИЧ инфицированных лиц продуцируют меньшие количества как спонтанного, так и СопА стимулированного уровня 1Ь-2 по сравнению со здоровыми не зависимо от носительства того или иного генотипа И2. Уровень стимулированной продукции 1Ь-2 у здоровых лиц, имеющих генотип Т/С, двукратно превышает исходный уровень белка, чем величина митогенстимулированного фактора у носителей Т/Т гомозиготного варианта (р=0,0841).

Таблица 2.

Уровень продукции 1Ь-2 у здоровых лиц и ВИЧ - инфицированных носителей различных генотипов локуса Т-ЗЗОв. МЕ/т1.

Группа Т/Т ТЮ

обследованных Спонтанн Стимулиро Спонтанн Стимулиро

ая ванная ая ванная

Здоровые лица (п=15) 30,8 42,7 21,4 40,9

ВИЧ- 8,2 26,7 11,4 22,4

инфицированные (п=30)

Р 0,0092 0,0215 0.4935 0,0404

У ВИЧ - инфицированных лиц, имеющих генотип Т/Т стимуляция мононуклеарных клеток митогеном приводит к трехкратному статистически значимому повышению уровня 1Ь-2 по отношению к исходному (р=0,0013). У инфицированных лиц уровень спонтанной продукции 1Ь-2 значимо ниже, чем у доноров, носителей варианта Т/Т (р=0,0092), у лиц с гетерозиготным генотипом наблюдается двукратное снижение 1Ь-2 по сравнению с донорами. Клетки инфицированных лиц в

ответ на стимуляцию СопА продуцируют количества IL-2, сходные по уровню со спонтанной продукцией клеток здоровых лиц. Стиму ляция МНК инфицированных лиц приводит к статистически значимо более низкой продукции 1L-2 по сравнению с донорами, имеющими Т/Т (р=0.0215) и T/G (р=0,0404) варианты локуса -330 гена (Таб.2).

Популяционная частота генотипа -ЗЗОТЛ" у инфицированных лиц повышена. Наличие этого варианта полиморфного локуса гена IL2. возможно, может служить неблагоприятным фактором развития СПИД, приводящим к ранней супрессии клеточного компартмента иммунитета, контролирующегося Thl клетками.

У здоровых лиц европеоидного происхождения мононуклеарные клетки индивидов с генотипом G/G промоторного участка G-308A гена TNFA в среднем спонтанно продуцируют 18,4 pg/ml фактора некроза опухоли альфа. Уровень прироста индуцированной СопА продукции достигает 1175,9 pg/ml TNFa, что достоверно значительней выше исходного уровня (р=0,000007). У инфицированных ВИЧ лиц, имеющих генотип G/A исходный уровень TNFa несколько ниже, чем у носителей гомозиготного варианта. Показан более низкий ответ на стимуляцию митогеном у инфицированных лиц с генотипом G/A по сравнению с носителями G/G, степень индукции СопА клеток этих индивидов снижена. Мононуклеарные клетки -ВИЧ - инфицированных пациентов с G/G генотипом спонтанно продуцируют более высокий уровень TNFa, чем здоровые лица, имеющие этот вариант гена (р=0,8181). Однако уровень их ответа на индукцию митогеном на порядок ниже по сравнению со здоровыми лицами (р=0.0064) (Таб.3).

Таблица 3.

Уровень продукции TNFa у здоровых лиц и ВИЧ - инфицированных носителей генотипа G/G, pg/ml

Группа обследованных Спонтанная Стимул1грованная

Здоровые лица (п=15) 18.4 1175.9

ВИЧ - инфицированные (п=30) 67.9 537.5

Р 0.8181 0,0064

Отмеченный нами факт повышенной спонтанной продукции TNFa клетками инфицированных лиц по сравнению с МНК здоровых лиц. может иметь чрезвычайно важное значение в прогрессии заболевания, так как TNFa обладает способностью усиливать репликацию ВИЧ. находящегося в «дремлющем» состоянии в зараженных клетках и распространению инфекции в организме.

У здоровых жителей России европеоидного происхождения, имеющих различные аллели локуса С-592А гена ILIO, мононуклеарные клетки индивидов с генотипом С/А спонтанно продуцируют в 5 раз больше IL-10 по сравнению с клетками лиц. имеющих генотип С/С (р=0.0676).

Стимуляция митогсном приводит к статистически значимо высокому приросту уровня продукции фактора у носителей обоих генотипов. Однако у доноров с генотипом С/С прирост продукции соответственно в пять раз более выражен, чем у носителей альтернативного варианта. Мононуклеарные клетки ВИЧ - инфицированных лиц, носителей двух вариантов гена ILIO спонтанно продуцируют схожий уровень белкового продукта. Стимуляция митогсном привела более чем к двухкратному статистически значимом)' приросту продукции у лиц с С/С (р=0,0002)и С/А (р=0.0249) (Таб.4). Клетки инфицированных пациентов с С/С генотипом гена ILIO спонтанно продуцируют значительно более высокое количество белкового продукта по сравнению со здоровыми лицами, имеющим этот же вариант гена (р=0,00004). Однако, уровень ответа на индукцию митогеном у ВИЧ - инфицированных пациентов, носителей генотипов С/С и С/А, в 2 раза ниже по сравнению со здоровыми лицами (р=0.0023 и р=0,019, соответственно) и достигает только двукратного повышения по сравнению со спонтанной продукцией IL-10. Популяционная частота аллельного варианта -591А среди европеоидного населения снижена.

Таблица 4.

Уровень продукции II--10 у здоровых лиц и ВИЧ - инфицированных носителей различных генотипов локуса С-592А, р&'т!

Группа С/С С/А

обследованных Спонтан Стимулиров Спонтан Стимулирова

ная анная ная нная

Здоровые лица 11,6 433,7 63.5 450,7

(п=15)

ВИЧ - 78,7 194,6 76.6 188,6

инфицированные (п=30)

Р 0,00004 0,0023 0.669 0,019

Сопоставляя эти результаты с литературными и нашими данными о положительной связи указанного аллеля с ВИЧ - инфекцией, можно подтвердить предположения о возможной ассоциации -597А с пониженной продукцией 1Ь-Ю, приводящей к усилению репликации ВИЧ и прогрсссированию заболевания.

Аллсльныс варианты генов цитокинов отдельно недостаточно информативны для прогнозирования течения ВИЧ - инфекции, тогда как дополнительный анализ их ассоциативных связей с параметрами разных звеньев иммунного системы могут дать более полноценный индивидуальный прогноз.

4. Ассоциированность полиморфизма генов питокинов с показателями иммунного статуса у ВИЧ - инфицированных к

здоровых лиц

Проведенный нами анализ ассоциированности аллельного полиморфизма гена IL2 с параметрами иммунного статуса показал статистически значимое снижение процентного содержания субпопуляции CD3+ клеток у носителей варианта Т/Т по сравнению с носителями гетерозиготного варианта промоторного локуса (Рис.3). Кроме этого, установлено значимое снижение уровня бласттрансформации лимфоцитов и, соответственно, индекса стимуляции пролиферативного ответа на ФГА Однако кислородзависимый метаболизм фагоцитирующих клеток инфицированных лиц с вариантом Т/Т гена IL2 повышен в НСТ-тесте по сравнению с лицами - носителями T/G варианта.

Нами отмечено статистически значимое снижение параметров клеточного звена (содержание CD3 и CD4 позитивных клеток) у носителей генотипа G/A промотора гена TNFA, наиболее часто встречающегося у инфицированных лиц и. как отмечено выше, ассоциированного с инфекцией (Таб. 3). В то же время этот генный вариант ассоциирован с несколько сниженным уровнем сывороточного ïgG по сравнению с носителями генотипа G/G. Кроме этого, носителей генотипа G/A характеризует статистически значимое снижение спонтанной фагоцитарной активности МНК периферической крови, проявляющееся в некотором снижении стимулированной фагоцитарной активности в HCT тесте по сравнению с лицами, несущими G/G вариант гена TNFA.

Отмечено статистически значимое увеличение абсолютного числа CD3+ клеток у носителем генотипа С/А по сравнению с гомозиготным ' вариантом С/С полиморфного локуса -592 гена ILIO за счет субпопуляции CD8+ лимфоцитов (Таб. 3). Вследствие этого у этих ВИЧ инфицированных лиц происходит характерное для неблагоприятного прогноза заболевания снижение индекса отношения хелпернои и супрессорной субпопуляций лимфоцитов по сравнению с лицами, имеющими генотип С/С.

• . . TT-T/G CG-G/A С/СОА

п Ц Г 1 jp

саз .•IL2 CD3 CD4 TNFA CD3 CD3 1110

Рис. 3. Ассоциированность аллельных вариантов генов цитокинов с параметрами иммунного статуса ВИЧ - инфицированных лиц. Примечание: СО - абсолютное количество клеток, *Ю9/л.

Таким образом, исследованные аллельные варианты генов цитокннов оказываются включены в различные звенья реализации иммунного ответа на вирусное инфицирование. Аллели -330Т, -308А более характерны для лиц с выраженным снижением клеточного провоспалительного компонента иммунитета по сравнению с лицами, несущими альтернативные варианты генов IL2 и TNFA. Согласно этим данным, кроме ассоциативных связей аллельных вариантов непосредственно с ВИЧ - инфекцией, нами установлены специфические ассоциации генов цитокинов с вариабельностью иммунологических параметров, сформировавшиеся под воздействием вируса.

5. Анализ прогностической значимости исследования аллсльного полиморфизма генов цшокшкш при различных клинических вариантах прогрессировать СПИД

Иммуногенетические маркеры прогноза применимы лишь к той части инфицированных пациентов, у которых выявляются информативные аллельные варианты, однако путем суммирования разнородных данных можно существенно расширить круг пациентов и значительно повысить уровень достоверности прогностических процедур. Для этого был проведен анализ Вальда. в результате которого при проведении непрерывной диагностической процедуры возможно суммирование отдельных коэффициентов, вычисленных для аллельных вариантов цитокинов у инфицированных лиц с медленной или быстрой скоростью прогрессии и установление их пороговой величины, при достижении которой у отдельного индивида с определенной долей вероятности можно говорить о вероятном характере и исходе заболевания.

Непосредственно табличная диагностика осуществляется путем оценки суммарного ПК всех наиболее информативных критериев, что производится до достижения условно принятого диагностического порога, составляющего величину 9.0 для воплощения 90% всех прогнозируемых результатов; 12,8 для воплощения 95% результатов, а 19,8 - для 99%, соответственно [Гублер Е.В., 1978].

При проведении комплексной оценки аллельных вариантов четырех полиморфных локусов у инфицированных лиц с разной скоростью течения заболевания были выявлены величины диагностических коэффициентов. У инфицированных лиц, для которых характерен быстрый темп прогрессии заболевания, характеризующийся развившейся лимфоаденопатией в течение двух лет после инфицирования, показано преобладание генотипов T/G (DK=1,58), G/A (DK=1,76), Т/Т (DK=1,76) и А/А (DK=6,53) генов IL2, '/'.Y/vi, 1L4 и ¡L10, соответственно, по сравнению с лицами, у которых установлена медленная прогрессия ВИЧ - инфекции. Суммируя величины ПК, указанные для данных генотипов получили цифру 11,6, что соответствует около 94% реализации прогноза неблагоприятного быстрого темпа' прогрессировать ВИЧ - инфекции в СПИД у

инфицированного человека.

Обобщая результаты проведенной работы установлено, что полученные нами данные по распределению полиморфных однонуклеотидных замен промоторных регионов генов провоспалительных IL-2 и TNFa среди здоровых лиц европеоидного населения России в некоторой степени отличаются от частот, характерных для представителей других европеоидных популяций. Выявлены преобладание T/G вариант IL2 и относительное повышение частоты встречаемости варианта G/A ген TNFA, что не характеризует описанные европеоидные популяции. Распределение частот аллельных вариантов генов противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 среди жителей России европеоидного происхождения отражают закономерности, характерные для европеоидного населения в целом. Эти данные представляются важными с точки зрения необходимости создания этнографических нормативов частоты встречаемости отдельных генотипов, а также проведения возможных параллелей между особенностями распределения в популяциях мира аллелей генов цитокинов и спецификой распространения в этих популяциях патологических состояний.

Результат анализа распространения генотипов среди ВИЧ-инфицированных пациентов показал отличия в распределении от группы здоровых лиц. Установленные особенности, по-видимому, могут обеспечить дифференциальную подверженность к ВИЧ - инфицированию и определять характер течения и скорость прогрессирования ВИЧ-инфекции. Показано, что аллельные варианты промоторных регионов генов исследованных цитокинов в некоторой степени определяют исходный уровень . продукции соответствующих белковых продуктов мононуклеарами периферической крови, а также митогенстимулированный уровень, который является условной моделью антигенного воздействия на клетки. Отмеченная вариабельность параметров иммунного статуса у лиц. имеющих разные варианты генов, указывает на то. что полиморфизм генов является частью потенциального наследственного разнообразия, обусловливающего изменчивость количественных факторов, определяющих иммунный ответ на вирусное воздействие.

Результаты проведенного анализа подтверждают предположение о том, что изученные полиморфные гены IL2, TXFA, IL4 и ILIO являются важной составной частью структуры подверженности к ВИЧ - инфекции, ее быстрому темпу прогрессирования. Можно заключить, что полученные нами данные в дальнейшем можно использовать ятя разработки прогноза характера течения инфекции у ВИЧ - инфицированных пациентов, скорости появления клинических проявлений и развития неблагоприятного быстрого темпа прогресагрования ВИЧ в собственно СПИД.

выводы

1. Гетерозиготный вариант T/G полиморфного участка промоторного региона гена IL2 среди здоровых жителей России встречается чаще (51,9%) по сравнению с вариантом Т/Т (42,3%) в отличие от популяции европеоидов, где доминирующим является генотип Т/Т (53,2%). Среди ВИЧ - инфицированных лиц показана инверсия в распределении генотипов локуса T-330G по отношению к обследованным здоровым лицам в сторону преобладания варианта Т/Т (55,1%).

2. Среди жителей России европеоидного происхождения доминирующим вариантом полиморфного участка промоторного региона гена TNFA G-308А является G/G генотип (90,4%) по сравнению с гетерозиготным вариантом G/A (7,7%) и частотой встречаемости редкого варианта А/А (1,9%). Распределение аллельных вариантов гена TN F А в целом отражает закономерности их распределения среди европеоидов, однако несет некоторые особенности монголоидного типа, выраженные в снижении частоты встречаемости G/A варианта. Среди ВИЧ -инфицированных лиц установлено повышенное содержание генотипа G/A (26,0%, р=0,0074) и отсутствие встречаемости А/А варианта гена.

3. Распределение аллельных вариантов полиморфного участка в позиции -590 промоторного региона гена IL4 среди жителей России европеоидного происхождения характеризуется, как и среди других европеоидных популяций, доминированием, хотя и в меньшей степени, гомозиготы С/С (59,6%), частота редкого варианта Т/Т составляет 1,9%. Частоты распределения вариантов полиморфного локуса С-590Т соответствуют закономерностям их распределения среди представителей других европеоидных популяций, где доминирующим является аллель -590С, и отличается от распределения в монголоидной и негроидной расах, где показано преобладание -590Т аллеля. Среди ВИЧ - инфицированных лиц отмечено повышенное содержание генотипа Т/Т (6,3%) и снижение частоты встречаемости гомозиготного С/С варианта (56,7%) по сравнению со здоровыми индивидами.

4. Среди представителей европеоидного населения России частота варианта С/С полиморфного участка промоторного локуса -592 гена ILIO выше, чем частота встречаемости гетерозиготного варианта С/А (73,1% и 26,9%, соответственно), что соответствует преобладанию, частоты аллельного варианта -592С в других европеоидных популяциях (0,87 и 0,76) и отличается от распределения аллельных вариантов гена среди монголоидной и негроидной рас, где показано преобладание частоты аллеля - -592А (0,67). Среди ВИЧ -инфицированных лиц частота' аллеля -592А (0.2) повышена по сравнению со здоровыми индивидами (0,13).

5. Носители генотипа С/А полиморфного локуса -592 исходно продуцируют большее количество IL-10, чем носители варианта С/С

• гена ÏL10 (р=0,0676). Повышение уровня митогенстимулированной СопА продукции IL-2 отмечено у лиц. имеющих генотип T/G по сравнению с другим вариантом гена IL2 (р=0,0841); повышение уровня стимулированной продукции IL-4 наблюдается у носителей генотипа С/С по сравнению с лицами, несущими вариант С/Т гена IL4 (р=0,0023).

6. У ВИЧ - инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми лицами отмечен более низкий уровень продукции IL-2 клетками крови носителей генотипа Т/Т по сравнению с гетерозиготным вариантом; более высокий уровень спонтанной продукции IL-10 мононуклеарами лиц с генотипом С/С. Митогенстимулированная продукция IL-2 снижена у инфицированных лиц с Т/Т и T/G генотипами 7L2; продукция TNFa у инфицированных носителей генотипа G/G снижена по сравнению с клетками здоровых носителей этого варианта гена TNFA:; уровень стимулированной продукции IL-10 у инфицированных лиц с генотипом С/С и С/А ниже, чем у здоровых лиц.

7. Аллели промоторных регионов в исследованных позициях генов ¡12, TS'FA и ILIO здоровых лиц и инфицированных пациентов по-разному ассоциированы с параметрами функционирования клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. У здоровых лиц С/А вариант гена ILIO ассоциирован с повышенным содержанием уровня Ig А по сравнению с генотипом С/С. У ВИЧ - инфицированных пациентов генотип Т/Т локуса -330 ассоциирован у инфицированных лиц со сниженным уровнем CD3+ и показателей РБТЛ. а также с повышенной функциональной способностью нейтрофилов. Генотип G/A локуса -308 TNF.4 ассоциирован со сниженным абсолютным количеством CD3+ и CD4+ клеток, а также со снижением уровня IgG и активности

. нейтрофилов в HCT-тесте. Генотип С/А локуса -592 ILIO ассоциирован с повышенным абсолютным количеством CD3 и CD8 позитивных клеток.

8. Для ВИЧ - инфицированных пациентов с быстрым темпом прогрессирования заболевания установлено повышенная частота генотипов T/G. G/A. Т/Т и А/А генов IL2, TXFA, IL4 и ILIO соответственно, в отличие от лиц с медленной скоростью профессии, у которых повышена частота генотипов Т/Т, G/G. С/С и А/С соответствующих генов цитокинов. Это позволяет использовать иммуногенетические критерии для прогноза характера течения ВИЧ -инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смольникова М.В., Коненков В.И. Цитокины и СПИД. // СПИД: Опыт первого десятилетия: Мат. краевой конф., Красноярск,- 1999.-С. 59-60.

2. Смольникова М.В., Коненков В.И., Сизякина Л.П., Талеб Е. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при ВИЧ-инфекции. // Матер. III съезда иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, Россия - 16-20 сентября 2000): Аллергология и иммунология,- 2000,- Т. 1., №2.-С.88.

3. Konenkov V.l., Prokofjev V.F., Slievchenko A.V., Golovanova O.V., Smolnikova M.V. Polymorphism of Immune Response Genes as a Factor for Predisposition to Development of Disease. // Russian J of Immunology.-2001,-V.6, N2.-P.I23-130.

4. Смольникова M.B., Коненков В.И. Аллельные варианты генов интерлейкинов, как иммуногенетические факторы прогноза ВИЧ-инфекции. // Тезисы научных работ VIII всероссийского съезда дерматовенерологов. Часть II. Москва,- 2001,- С. 162.

5. Смольникова М.В., Коненков В.И. Клиническая имлгуногенетика заболеваний человека. Н Медицинская иммунология,- 2001,- Т.З, №3,-С.379-389.

6. Смольникова М.В., Коненков В.И. Полиморфизм генов цитокинов в норме и при ВИЧ-инфекции. // Матер. IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, Россия - 10-14 сентября 2001): Аллергология и иммунология. - 2001,- Т.2, №2,- С.38.

7. Коненков В.И., Смольникова М.В., Козлов В.А., Сенников С.В., Сизякина Л.П., Талеб Э. Анализ полиморфизма в промоторном участке гена интерлеГшша-4 среди здорового и ВИЧ инфицированного европеоидного населения. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001,-№6,- С.28-32.

8. Смольникова М.В., Коненков В.И. Полиморфизм генов интерлейкина 4, интерлейкина 10 и фактора некроза опухолей при ВИЧ-инфекции. // Клиническая иммунология в практическом здравоохранении// Материалы конференции «Актуальные проблемы клинической иммунологии». Барнаул,- 2002.-С.55-61.

9. М. Smolnikova, V. Konenkov. IL-4, IL-10, TNFa genes polymorphisms in HIV infection in Russian population. // European Journal of Immunogenetics. -2002,-V.29, N2.-P.154.

10. Смольникова M.B., Прокофьев В.Ф., Сизякина Л.П., Шемшура А.Б., Ольховский И. А., Коненков В.И. Аллельные варианты генов IL-4, IL-10 и TNFa при ВИЧ инфекции. // Цитокины и воспаление.-2002.-Т.1, N1.-C.35-

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ ШУ - вирус иммунодефицита человека;

1Ь - интерлейкины;

Л - гены интерлейкинов;

Т№а - (фактор некроза опухолей альфа;

Т.\ТА - ген ТОТ;

ССЯ5, СХСЯ4 - гены хемокиновых рецепторов; ПЦР - полимеразная цепная реакция;

СО - дифференцкровочные антигены клеточных субпопуляций;

СопА - конканавалин А;

МНК - мононуклеарные клетки крови;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

РБТЛ - реакция бласттрансформации;

ОК, ПК - диагностический (или прогностический) коэффициент.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) в настоящее время обусловливает пандемию с самой высокой степенью летальности, в результате чего рост заболеваемости ВИЧ является важнейшей медико-социальной проблемой [10, 17, 19, 31]. По данным Минздрава России на конец 2001 - начало 2002 года на территории нашей страны насчитывалось около 200 тыс. ВИЧ - инфицированных людей. Профилактические и лечебные мероприятия в данный момент не приводят к эффективному положительному результату [8, 18]. Одной из основных сложностей в решении этой проблемы является то, что ВИЧ вызывает в организме человека персистирующий инфекционный процесс с так называемым медленным вариантом клинического проявления [8, 270, 274]. Наряду с генетическими особенностями вируса, реализуемыми в высокой вариабельности антигенных и биологических свойств штаммов, ВИЧ - имеет и фенотипические различия. У ВИЧ - инфицированных лиц по репликативной активности выделяют "rapid/high" - высокоинфекционные, эффективно реплицирующиеся изоляты и "slow/low " - низкоинфекционные, слабо реплицирующиеся изоляты [174, 274]. В этой связи выделяют разный характер течения заболевания - быстро и медленно прогрессирующую ВИЧ -инфекцию, обусловливающую темп перехода в терминальную стадию СПИД [9, 130]. Многочисленные исследования, посвященные расшифровке механизмов патогенеза ВИЧ - инфекции и особенностей формирования различных вариантов течения заболевания не находят однозначного решения [16, 26, 174, 260, 261,274].

Одним из факторов, влияющих на репликацию ВИЧ в организме, являются цитокины, некоторые из которых, в том числе TNFa, IL-lp, и IL-£, могут способствовать репликации ВИЧ, повышая экспрессию регуляторных генов вируса [64, 155, 230, 262, 263]. Дисбаланс продуцируемых Thl и Th2 лимфоцитами цитокинов периферической крови оказывает влияние на силу ответа иммунной системы на антигены вируса [91, 209]. По мере прогрессирования заболевания параллельно нарастанию уровня противовоспалительных цитокинов, обусловливающих относительно малоэффективное в данном случае антительное сопротивление, происходит угнетение Thl-хелперного ответа, стимулирующего сильный клеточный компонент [17, 90]. Функционирование цитокиновой сети при ВИЧ -инфекции зависит от многих причин, в число которых входят индивидуальные различия в продукции цитокинов, обусловленные рядом генетических особенностей [247, 270].

В середине прошлого века была сформулирована концепция, согласно которой подверженность к той или иной болезни обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся при взаимодействии с факторами среды патологическим фенотипом [115, 123]. В 1996 году было показано, что существует относительная резистентность людей к ВИЧ -инфицированию, обусловленная наличием у остающихся серонегативными индивидов, имеющих гомозиготный вариант делеции в гене корецептора ВИЧ, хемокинового рецептора CCR5, реализация которой осуществляется посредством блокирования проникновение ВИЧ в клетки независимо от пути передачи [324, 325]. Кроме этого, данные о распространенности мутации Delta32 гена CCR5 показали расовую специфику ее распределения, показывающую минимальную частоту встречаемости гетерозиготного варианта среди представителей негроидной и монголоидной рас и отсутствие у них наиболее протективного гомозиготного варианта [104, 204, 279]. Показано также, что вариант гена ЗА/ЗА, кодирующего стромальный фактор SDF-1, лиганд хемокинового рецептора CXCR4, ассоциирован с ускорением темпов развития ВИЧ - инфекции [204].

На современном этапе поиска и изучения генов-маркеров предрасположенности (резистентности), характера течения и скорости перехода ВИЧ - инфекции в собственно СПИД важное место занимает полиморфизм генов цитокинов [73, 182, 234, 235]. К данному времени удалось определить, что микросателлит с2 полиморфного гена TNFA достоверно чаще встречается среди ВИЧ - инфицированнных лиц, у которых установлен медленно прогрессирующий тип инфекции [182]. Носители аллельного варианта -592А гена IL10 имеют повышенный риск к ВИЧ - инфицированию и более быстрый темп прогрессирования в СПИД по сравнению с вариантом С/С в этом локусе [285]. Однако, пока не ясно, какие именно мутации генов цитокинов имеют решающее значение в контроле иммунного ответа на вирус. Вероятно, для столь сложного заболевания большую роль играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания. Такие сочетания могут быть неодинаковы в популяциях, обусловливая различия в подверженности к ВИЧ - инфекции и темп ее прогрессирования у разных народов.

Приведенные выше результаты исследовательских работ открывают новые перспективы как в необходимости изучения механизмов генетически детерминированной реакции иммунокомпетентных клеток на вирус иммунодефицита человека и прогноза темпа прогрессирования ВИЧ -инфекции, так и для создания профилактических и терапевтических средств поддержания защитных сил инфицированного организма. Исследования роли полиморфизма генов цитокинов в иммуногенетической предрасположенности организма к ВИЧ - инфекции и особенностей клинического течения этого заболевания, темпе перехода ее в СПИД в нашей стране до сих пор не были проведены.

Цель исследования: изучить характер распределения аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL1Q, а также степень их ассоциированности с уровнем продукции соответствующих цитокинов и основными параметрами состояния иммунной системы среди ВИЧ - инфицированных лиц с различными вариантами течения инфекционного процесса и здоровых жителей России европеоидного происхождения.

Задачи:

1. Провести сравнительный анализ полиморфизма по четырем точечным заменам промоторных регионов генов цитокинов (T-330G IL2, G-308A TNFA, С-590Т IL4 и С-592А IL10) среди жителей России европеоидного происхождения в сопоставлении с данными по другим этническим группам;

2. Проанализировать характер распределения аллельных вариантов исследуемых генов цитокинов среди ВИЧ - инфицированных лиц европеоидного происхождения в сравнении со здоровыми индивидами;

3. Исследовать интенсивность спонтанной и индуцированной продукции цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 мононуклерными клетками здоровых и ВИЧ - инфицированных лиц, обладающих различными аллельными вариантами в промоторных участках генов соответствующих интерлейкинов;

4. Изучить ассоциированность аллельных вариантов генов исследуемых цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 с показателями состояния клеточного и гуморального звеньев иммунной системы здоровых и ВИЧ инфицированных лиц;

5. Проанализировать характер ассоциированности аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 с быстрым и медленным характером прогрессирования ВИЧ - инфекции и оценить возможность разработки прогностических критериев развития неблагоприятного быстропрогрессирующего характера течения ВИЧ.

Научная новизна работы: Впервые проведен анализ распределения генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 среди жителей России европеоидного происхождения, показавший подобный другим европеоидным популяциям характер распределения частот аллельных вариантов. Показаны характерные отличия в распределении частот генов цитокинов, продуцируемых Thl и Th2 клетками, у ВИЧ - инфицированных больных европеоидного происхождения по сравнению со здоровыми лицами. Среди ВИЧ - инфицированных лиц по сравнению со здоровыми показано преобладание Т/Т варианта гена IL2, G/A варианта гена TNFA, Т/Т варианта гена IL4 и С/А варианта гена IL10.

Установлено, что уровень продукции IL-10 в популяции европеоидов ассоциирован с аллельными вариантами промоторного региона гена IL10. Параметры оценки функционального состояния иммунной системы ВИЧ -инфицированных пациентов ассоциированы с аллельными вариантами генов IL2, TNFA, IL10. Установлена ассоциация генотипа Т/Т гена IL2 со сниженным уровнем абсолютного количества CD3+ лимфоцитов и показателями РБТЛ; ассоциация генотипа G/A гена TNFA со сниженным количеством CD3+ и CD4+ субпопуляций и уровня сывороточного IgG, а также ассоциация генотипа С/А гена IL10 с повышенным абсолютным количеством CD3 и CD8 позитивных клеток. Впервые показана ассоциация аллельных вариантов T/G, G/A, Т/Т, А/А генов IL2, TNFA, IL4 и IL10, соответственно, с быстрым темпом прогрессирования ВИЧ - инфекции в терминальную стадию СПИД, что может быть использовано для разработки ранних прогностических критериев предрасположенности инфицированных лиц к быстропрогрессирующему характеру течения ВИЧ.

Научно-практическая значимость работы: Впервые получены нормативные характеристики распределения аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 среди жителей России европеоидного происхождения, проведено сопоставление характера их распределения среди российского населения с распределением среди населения ряда стран различного этнического состава. Впервые получены данные об отклонениях в характере распределения аллелей исследованных генов у ВИЧ -инфицированных пациентов с различным характером течения заболевания. Впервые показана ассоциированность аллельных вариантов генов цитокинов с варьированием параметров иммунного статуса. Предложена прогностическая таблица для оценки вероятности развития у ВИЧ -инфицированного индивида неблагоприятного быстропрогрессирующего темпа инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер распределения аллельных вариантов генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 среди населения России европеоидного происхождения в основном соответствует характеру их распределения среди европеоидного населения других стран, хотя отмечены некоторые отличия в частотах генотипов IL2 и TNFA;

2. Среди ВИЧ - инфицированных пациентов имеются отклонения в характере распределения аллельных вариантов некоторых ■ генов цитокинов IL2, TNFA, IL4, IL10 от нормативных характеристик, установленных для популяции здоровых лиц;

3. Повышенный уровень продукции IL-10 в клеточных культурах ассоциирован с аллельным вариантом С/А гена IL10;

4. Аллели генов цитокинов IL2, TNFA и IL10 ассоциированы с показателями состояния иммунной системы здоровых и ВИЧ - инфицированных лиц;

5. Полиморфизм генов цитокинов является одним из важных компонентов генетического контроля над процессами индивидуальной резистентности и подверженности человека к развитию ВИЧ - инфекции с различным характером ее прогрессии.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции «Биология цитокинов. Сетевые межклеточные взаимоотношения в норме и патологии» (Новосибирск, 2001), VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва,

2001), Научно-практической конференции «ДНК-диагностика в медицине» (Новосибирск, 2001), Научной XLI сессии общего собрания СО РАМН (Новосибирск, 2001), I съезде иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001), конференции «Актуальные проблемы клинической иммунологии» (Барнаул,

2002) и научном семинаре НИИ клинической иммунологии (Новосибирск, 2002).

Объем и структура работы:

ВЫВОДЫ

1. Гетерозиготный вариант T/G полиморфного участка промоторного региона гена IL2 среди здоровых жителей России встречается чаще (51,9%) по сравнению с вариантом Т/Т (42,3%) в отличие от популяции европеоидов, где доминирующим является генотип Т/Т (53,2%). Среди ВИЧ - инфицированных лиц показана инверсия в распределении генотипов локуса T-330G по отношению к обследованным здоровым лицам в сторону преобладания варианта Т/Т (55,1%).

2. Среди жителей России европеоидного происхождения доминирующим вариантом полиморфного участка промоторного региона гена TNFA G-308А является G/G генотип (90,4%) по сравнению с гетерозиготным вариантом G/A (7,7%) и частотой встречаемости редкого варианта А/А (1,9%). Распределение аллельных вариантов гена TNFA в целом отражает закономерности их распределения среди европеоидов, однако несет некоторые особенности монголоидного типа, выраженные в снижении частоты встречаемости G/A варианта. Среди ВИЧ - инфицированных лиц установлено повышенное содержание генотипа G/A (26,0%, р=0,0074) и отсутствие встречаемости А/А варианта гена.

3. Распределение аллельных вариантов полиморфного участка в позиции -590 промоторного региона гена IL4 среди жителей России европеоидного происхождения характеризуется, как и среди других европеоидных популяций, доминированием, хотя и в меньшей степени, гомозиготы С/С (59,6%), частота редкого варианта Т/Т составляет 1,9%. Частоты распределения вариантов полиморфного локуса С-590Т соответствуют закономерностям их распределения среди представителей других европеоидных популяций, где доминирующим является аллель -590С, и отличается от распределения в монголоидной и негроидной расах, где показано преобладание -590Т аллеля. Среди ВИЧ - инфицированных лиц отмечено повышенное содержание генотипа Т/Т (6,3%) и снижение частоты встречаемости гомозиготного С/С варианта (56,7%) по сравнению со здоровыми индивидами.

4. Среди представителей европеоидного населения России частота варианта С/С полиморфного участка промоторного локуса -592 гена IL10 вышЬ, чем частота встречаемости гетерозиготного варианта С/А (73,1% и 26,9%, соответственно), что соответствует преобладанию частоты аллельного варианта -592С в других европеоидных популяциях (0,87 и 0,76) и отличается от распределения аллельных вариантов гена среди монголоидной и негроидной рас, где показано преобладание частоты аллеля -592А (0,67). Среди ВИЧ - инфицированных лиц частота аллеля -592А (0,2) повышена по сравнению со здоровыми индивидами (0,13).

5. Носители генотипа С/А полиморфного локуса -592 исходно продуцируют большее количество IL-10, чем носители варианта С/С гена ILT0 (р=0,0676). Повышение уровня митогенстимулированной СопА продукции IL-2 отмечено у лиц, имеющих генотип T/G по сравнению с другим вариантом гена IL2 (р=0,0841); повышение уровня стимулированной продукции IL-4 наблюдается у носителей генотипа С/С по сравнению с лицами, несущими вариант С/Т гена IL4 (р=0,0023).

6. У ВИЧ - инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми лицами отмечен более низкий уровень продукции IL-2 клетками крови носителей генотипа Т/Т по сравнению с гетерозиготным вариантом; более высокий уровень спонтанной продукции IL-10 мононуклеарами лиц с генотипом С/С. Митогенстимулированная продукция IL-2 снижена у инфицированных лиц с Т/Т и T/G генотипами IL2; продукция TNFa у инфицированных носителей генотипа G/G снижена по сравнению с клетками здоровых носителей этого варианта гена TNFA; уровень стимулированной продукции IL-10 у инфицированных лиц с генотипом С/С и С/А ниже, чем у здоровых лиц.

7. Аллели промоторных регионов в исследованных позициях генов IL2, TNFA и IL10 здоровых лиц и инфицированных пациентов по,-разному

109 ассоциированы с параметрами функционирования клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. У здоровых лиц С/А вариант гена IL10 ассоциирован с повышенным содержанием уровня IgA по сравнению с генотипом С/С. У ВИЧ - инфицированных пациентов генотип Т/Т локуса -330 ассоциирован у инфицированных лиц со сниженным уровнем CD3+ и показателей РБТЛ, а также с повышенной функциональной способностью нейтрофилов. Генотип G/A локуса -3Q8 TNFA ассоциирован со сниженным абсолютным количеством CD3+ и CD4+ клеток, а также со снижением уровня IgG и активности нейтрофилов в НСТ-тесте. Генотип С/А локуса -592 IL10 ассоциирован с повышенным абсолютным количеством CD3 и CD8 позитивных клеток.

8. Для ВИЧ - инфицированных пациентов с быстрым темпом прогрессирования заболевания установлено повышенная частота генотипов T/G, G/A, Т/Т и А/А генов IL2, TNFA, IL4 и IL10, соответственно, в отличие от лиц с медленной скоростью прогрессии, у которых повышена частота генотипов Т/Т, G/G, С/С и А/С соответствующих генов цитокинов. Это позволяет использовать иммуногенетические критерии для прогноза характера течения ВИЧ -инфекции.

110

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю, профессору Коненкову Владимиру Иосифовичу, чьё мудрое и терпеливое руководство помогло в осваивании науки иммуногенетики и обсуждении выполненной работы. Также автор считает необходимым искренне поблагодарить сотрудников лаборатории иммуногенетики, группы молекулярной иммунологии и лаборатории клеточной иммунотерапии за помощь в изучении основ диагностики и дружеское соучастие в ходе работы. Огромное спасибо сотрудникам Ростовского государственного медицинского университета и Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД г. Красноярска за помощь в сборе материала для исследований и плодотворное сотрудничество. Отдельная благодарность моей семье за моральную и материальную поддержку и за удивительное долготерпение.

Ill