Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полиморфизм генов HLA II класса в трех популяциях различной расовой принадлежности

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ГУСЬКОВА Ирина Алексеевна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ НЬАII КЛАССА В ТРЕХ ПОПУЛЯЦИЯХ РАЗЛИЧНОЙ РАСОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат медицинских наук М.Н.БОЛДЫРЕВА

МОСКВА - 1 9 9 9

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр

ВВЕДЕНИЕ........................................................................4

Часть 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................10

Глава 1. Современные представления о строении, функциях и полиморфизме системы НЬА.....................................................................10

1.1. Строение системы НЬ А........................................................10

1.1.1. Структурная организация генов и молекул НЬАII класса..............13

1.2. Функции молекул НЬА..........................................................17

1.2.1. Пути процессинга и презентации антигенных пептидов молекулами

НЬА II класса.......................................................................17

Глава 2 НЬА - полиморфизм...............................................................20

2.1 Модели полиморфизма..........................................................21

2.2 Доказательство отбора............................................................23

2.3. Гаплотипы и неравновесие по сцеплению..................................26

Глава 3 Развитие методов исследования полиморфизма НЬА...................28

3.1. Генотипирование.................................................................29

Часть II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................34

1. Сведения об обследуемых группах индивидуумов........................34

1.1. Историко-этнографическая информация...................................34

2. Выделение ДНК................................................................36

3. Полимеразная цепная реакция..............................................36

4. Статистическая обработка результатов....................................39

Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................41

Глава I. Изучение особенностей частотного распределения групп аллелей гена

ВИВ1 и аллелей генов ОС)А1 и БС)В1 у русских, армян и

бурят..............................................................................41

1.1. Распределение частот специфичностей генов БИВ 1, ОС)А 1 и

БС>В1 в русской популяции..................................................41

1.2. Распределение частот специфичностей генов В11В1, БС^А! и БС>В 1 в армянской популяции...............................................42

1.3. Распределение частот специфичностей генов 1ЖВ1, и Б(2В1 в бурятской популяции...............................................42

1.4. Сравнение распределения частот специфичностей гена БЫВ 1, в

обследованных популяциях.................................................43

1.5. Сравнение распределения аллелей гена БРА 1, в обследованных популяциях.......................................................................47

1.6. Сравнение распределения аллелей гена ОС® 1, в обследованных популяциях......................................................................49

Глава II. Изучение особенностей частотного распределения гаплотипов генов БКВ1, в трех популяциях(русской, армянской и бурятской)........................................................................51

2.1. Сравнение распределения гаплотипических сочетаний генов Б11В1-БС>А1 в трех популяциях......................................................51

2.2. Сравнение распределения гаплотипических сочетаний генов БКВ1-В(2В1 в трех популяциях......................................................57

2.3. Сравнение распределения гаплотипических сочетаний генов БС)А1-БС>В1 в трех популяциях.....................................................62

Часть IV ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...............68

ВЫВОДЫ.......................................................................79

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................81

-4-ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Система генов тканевой совместимости человека (Human Leukocyte Antygen -HLA) является одной из наиболее полиморфных генетических систем, выполняющей в организме человека ряд функций, важнейшими из которых являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание «нормального» иммунного гомеостаза, нарушение которого лежит в основе целого ряда патологических процессов, включая аутоиммунные заболевания и развитие опухолей [1]. В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в изучении роли HLA в развитии или устойчивости к ряду заболеваний является межпопуляционный подход, позволяющий более точно определить значение генетических факторов в развитии заболеваний, возникающих в результате нарушения иммунного гомеостаза [2].

Известно также, что без полного представления о строении системы генов тканевой совместимости человека невозможно успешное развитие клинической трансплантологии. Особенно это касается пересадки аллогенного костного мозга.

Исследование полиморфизма системы HLA является одним из наиболее эффективных подходов к изучению структуры и функции главного комплекса гистосовместимости человека.

До недавнего времени существовала возможность изучать полиморфизм HLA только на уровне белковых молекул (HLA-антигенов), экспрессированных на мембранах клеток. В самые последние годы появилась возможность исследования HLA на качественно новом молекулярно-генетическом уровне при

помощи полимеразной цепной реакции. Принципиальным отличием новых методов явилось использование в качестве объекта исследования непосредственно генетического материала - ДНК человека, что реализовалось в том, что количество известных аллелей HLA изменилось со 150 в 1991г. [134] до 321 в 1997 г. [127]. При этом среди вновь открытых аллелей установлены аллели чрезвычайно высокого уровня ассоциации с заболеваниями [42].

Исследования полиморфизма HLA, постоянно проводящиеся в рамках программ международных рабочих совещаний по тканевой совместимости, позволяют обнаруживать все новые аллельные варианты генов HLA. Это определяется тем, что на международные рабочие совещания представляются данные по HLA-типированию самых различных этнических групп и популяций, принадлежащих к различным расам.

Исследования HLA-полиморфизма вносят также существенный вклад в изучение происхождения и "генетического родства" различных этнических групп и являются составной частью программы международных исследований «Геном человека».

До недавнего времени этническое разнообразие нашей страны, в которой проживает огромное количество народностей, относящихся как к определенным расам (европеоиды и ориенты), так и имеющих смешанное расовое происхождение, не было использовано в полной мере для изучения полиморфизма генов HLA. Только в последние годы распространение в России молекулярно-генетических методов изучения HLA создало условия для выполнения подобных исследований[4].

Учитывая, что сведения, полученные в результате изучения

полиморфизма главного комплекса гистосовместимости в различных этнических группах и популяциях, проживающих на территории многонациональной России, создают основу для развития клинической трансплантологии, направления "НЬА и болезни", криминалистики (идентификация личности) и такой фундаментальной науки, как антропология, являлось целесообразным проведение исследования, посвященного изучению НЬА-полиморфизма в популяциях, проживающих на территории России и СНГ, принадлежащих к различным расовым группам, на новом молекулярно-генетическом уровне.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучить с помощью ранее созданных в Институте иммунологии методов ДНК-типирования полиморфизм специфичностей генов НЬА II класса (БЫВ1, ОС>А1 и ЭС)В1) в трех популяциях различной расовой принадлежности: русской, армянской и бурятской для последующего использования полученных данных для развития фундаментальной биологической науки (антропология и иммуногенетика) и для прикладной медицины (клиническая трансплантология, проблема «НЬА и болезни»). В связи с этим в процессе исследования предполагалось решение следующих задач :

1. Провести анализ распределения специфичностей НЬА-БКВ1, БС)А1 и а также их гаплотипических сочетаний у здоровых представителей

русской, армянской и бурятской популяций в сравнении аналогичными данными для других популяционных групп.

2. Проанализировать генетическое родство исследованных популяций как между собой, так и с некоторыми другими популяциями Азии и Европы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на молекулярно-генетическом уровне был проведен анализ полиморфизма специфичностей генов HLA II класса (DQA1, DQB1 и DRB1) в трех популяциях различной расовой принадлежности: русской (кавказоиды), армянской (кавказоиды) и бурятской (монголоиды).

При обследовании указанных популяций были выявлены ряд особенностей в распределении специфичностей генов HLA II класса и их гаплотипических сочетаний:

- определены профили распределения специфичностей генов HLA II класса (DQA1, DQB1 и DRB1) у русских, армян и бурят

- установлено, что специфичности DRB1*04 и *11 являлись частотными для всех трех обследованных популяций, DRB1*15 часто встречалась у русских и армян, в отличие от бурят, у русских также частотными были специфичности DRB1*07, * 13, а у бурят DRB1 *14. У русских очень редко встречалась специфичность DRB1*09, у армян не было обнаружено DRB1*08 и редко встречался DRB1*09, у бурят не было обнаружено DRB1*16.

- установлено, что межпопуляционные различия трех обследованных популяций по аллелям генов DQA1 и DQB1 касаются только редко встречающихся специфичностей (DQA*0401, DQB* 04), а также редко встречающихся гаплотипических сочетаний: DRB1*14 - DQA1*0501, DRB 1*09 -DQA 1*0301 hDRBI-DQBI -*14 -*0301, -*14 -*0502, -*14 -*0602-

- установлено, что аллель DQB 1*0302 и соответствующий гаплотип DRB 1*04-DQB 1*0302, имеющий ассоциациации с аутоиммунными заболеваниями, у армян встречается в два раза чаще, чем у русских и бурят

- у русских был обнаружен ганлотип Б11В1-0()А1 *13 - *0501, не встречавшийся ни у армян, ни у бурят.

- установлено, что для русской популяции характерен более высокий уровень полиморфизма как отдельных генов, так и гаплотипических сочетаний, по сравнению с армянской и бурятской популяциями

Впервые были установлены генетические расстояния между исследованными популяциями, проведен их кластерный анализ, а также проведено сравнение с рядом европейских и азиатских популяций.

- при сравнении с основными европейскими популяциями было установлено, что наиболее близкими к русской по НЬА-профилю являются чешская, бельгийская и немецкая популяции.

- проведенный анализ говорит об определенной степени родства по НЬА-профилю армянской популяции с евреями ашкенази, итальянской и испанской популяциями, относящимися к средиземноморской группе.

- сравнительный анализ бурятской популяции с такими монголоидными популяциями, как корейцы, японцы, китайцы, эскимосы и тувинцы позволил определить наибольшее сходство только с тувинской популяцией.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Данные о распределении специфичностей генов НЬА-ОЬШ1, -БС>А1, -и их сочетаний в здоровых популяциях русских, армян и бурят могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний, обусловленных нарушениями иммунитета, в разных этнических группах.

Полученные данные о различных НЬА профилях обследованных популяций служат теоретической базой для практических рекомендаций в клинической трансплантологии для поиска доноров аллогенного костного мозга в пределах одной национальности.

Популяционные данные могут быть использованы в судебно -медицинской практике для идентификации личности.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Современные представления о строении, функциях и полиморфизме системы HLA. 1.1. Строение системы HLA.

Генетический комплекс HLA расположен компактно на коротком плече 6-й хромосомы человека и занимает 3500 килобаз (kb) [рис.1]. Ближайшие к центромере гены локуса HLA-D кодируют молекулы Ii класса HLA-DP, -DQ и -DR, в то время как наиболее удаленные от центромеры гены кодируют молекулы I класса HLA-B, -С и -А. В последние годы в пределах локуса HLA I класса открыты новые локусы - Е, F, G, H и J (являющийся псевдогеном и расположенный рядом с HLA-A) [23,97,110,133], для большинства из которых пока не выявлено наличие аллельного полиморфизма и не определены биологические функции. Между генами I и II классов расположены гены, кодирующие молекулы III класса (факторы комплемента), которые вовлечены в процессы элиминации чужеродных антигенов. Среди генов II класса также установлены новые локусы DNA и DOB, между которыми располагаются важные в функциональном отношении гены. Одни из них - RING4 [108,109,118] и RING11 [122,109], называемые в соотвествии с принятой номенклатурой TAPI и ТАР2 соответственно, являются генами с низким уровнем экспрессии и кодируют молекулы, которые предположительно вовлечены в транспорт антигенных пептидов в эндоплазматический ретикулум. Другие локусы -RING12 [85] и RING10 [63], называемые по новой номенклатуре LMP2 и LMP7 соответственно, содержат гены, кодирующие низкомолекулярные белки

CENTROMERIC

PPP1R2P TAP1

RING9

RRS18 KE4RXRB ______ \LMP2 RING9

«т/ -^f/лэт;™ tern

T-1

1000 (1050)

700 800

B144

G5hÇKII(l \1C7.LTB NB6

iTNF/jkBL MICANPB1NOB2 PERB10\\\ (PS-6

N0TCH^nm ïïtzoi

HOD u

ВДТ1 PFRB6 \\\ / DHFRPs ' MICB _J-NOB3

I-1-r

(1050) 1100

"T"

1500

1-1

(2080)

1800

RPL3-HomNOB5 POU5F1 TÇF19 ВД40ВЗ \ СI NOB4 S TUBB

. P5-1

10

Hsqi^ Mipc

n a

PERB3

4 PERB10 PERB1

—I-

2400

-1-

2500

-1-

2700

I I

(2080)

-1-

2200

1-1-

2300

1

2600

1

2000

(3100

tnTin to r-

1Л 1Л 1Л in U3

V-t-1- 1- b

<<< < <

ООО О О

t-<

О

s

о

<

о

30

I

3.8-1.2 hSUP4S.1 PS,-2 / JX-1 IV hTCTEX-5 \ IV-2 // P?-3 ZNF173 \ \ VIII.////IV-,3

" Whim

a 90 M Oil I! 111!

|\^B30.2

M/|D2

T

01

—I-

3300

(3100)

3200

«t Ш to N

£¡2 fEg

<< <<

со о о

«с о

3400

3500

ш

s-â

ё

о

3600

т- о

«о см

ь «

< -I

О >

LU

3800

к z х ¡2

< ft s £ „ g

1 5

2 u.

Sn«

5S<

Il IL

4000

см со i

Pf! < < i

о о

1 X

s

-I CE О

s

Э X

I I I <1100 1 1 1 4200 1 ■1300 1 1 1 4400 1 4500 1 1 4600 1 1 4700 1 1 1 4800 1 4900 1 1

1 1 1 5^00 1 1 5200 1 1 5300 < 1 1 5400 1 5500 1 1 5600 1 1 5700 1 1 1 5800 1 5900 1 1 6000

1 1 1 6100 I 1 сгоо 1 1 6300 1 1 1 6400 1 6500 1 1 6600 1 1 6700 1 1 1 6800 HUj-H 1 6900 1 1 7000

I ! I 7100 1 1 7200 1 1 7300 1 1 1 7400 V TELOMERIC 1 7500 1 1 7600 1 1 7700 1 1 i 7800 1 1 7900 1 1 8000

Рис.1. Молекулярная карта главного комплекса гистосовместимости человека [42]

протеасом, которые участвуют в процессинге антигенов и в образовании антигенных пептидов для последующей презентации их молекулами HLA I класса. Kelly et.al. [84] обнаружили еще два гена - DMA и DMB, которые по строению более сходны с генами I класса, чем с генами II класса. Границы системы HLA расширились также и в сторону центромеры, где рядом с геном бета-цепи DPB2 обнаружен новый локус COL11A2, кодирующий альфа-2 цепь коллагена [69,70]. На этом исследование системы HLA, естественно, еще не завершено. С открытием новых л оку сов представления о системе HLA, вероятно, будут расширяться и далее.

Необходимо отметить, что в целом система HLA является чрезвычайно полиморфной. Благодаря применению наряду с серологическими методами новых молекулярно-генетических подходов к изучению системы HLA,помимо открытия новых локусов происходит также установление все большего количества аллельных вариантов генов ранее известных локусов [23]. Так, например, в настоящее время известно аллелей гена DRA- 2, DRB1 - 101, DRB2 -1, DRB3 - 17, DRB4 - 7, DRB5 - 14, DRB6 - 3, DRB7 -2, DRB8 - 1, DRB9 - 1, DQA1 - 19, DQB1 - 35, DPA1 - 13, DPB1 - 83, DMA - 4, DMB - 5, ТАР1 - 5, ТАР2 -4 [127].

Полиморфизм аллелей HLA на генетическом уровне приводит к образованию молекул, различающихся по структурным и функциональным характеристикам. Но прежде, чем рассматривать полиморфизм аллелей HLA в пределах одного локуса, следует рассмотреть распределение на клетках организма и строение молекул HLA II класса [54,83,126].

1.1.2. Структурная организация генов и молекул НЬА II класса.

Молекулы НЬА II класса - это мембранные гликопротеины, состоящие из двух цепей - альфа-цепи с молекулярным весом 34 Ш и бета-цепи с молекулярным весом 28 Ш, каждая из которых содержит по два домена [рис.2]. Ы-концевые домены (альфа-1 и бета-1) в значительной степени полиморфны, в то время как вторые домены (альфа-2 и бета-2) более консервативны и руктурно гомологичны константным участкам иммуноглобулинов. Обе цепи альфа и бета молекул II класса имеют трансмембранный участок длиной около 25 гидрофобных аминокислотных остатков и короткую С-концевую цитоплазматическую область длиной примерно в 10-20 аминокислотных остатков. Гены, кодирующие различные полипептидные цепи, имеют сходную экзон-интронную организацию, которая коррелирует с доменной структурой кодируемых ими молекул II класса. Первый экзон кодирует 5'-нетранслируемую и лидерную последовательности. Второй экзон - первые внешние домены (альфа-1 или бета-1) и третий экзон - иммуноглобулиноподобные вторые внешние домены (альфа-2 или бета-2). Первый экзон отделен от второго длинным интроном. Такой же интрон отделяет экзон, кодирующий бета-1 домен от экзона для бета-2 домена. Все другие интроны сравнительно невелики по размеру. В случае генов альфа-цепи один экзон кодирует соединительную часть, трансмембранный участок и цитоплазматический домен. Последний экзон содержит З'-нетранслируемую последовательность. На аминокислотном уровне наиболее полиморфными являются внешние альфа-1 и бета-1 домены, которые образуют пептид-связывающую бороздку [рис.3].

Regulatory

Sequences. „, o2 (-¿H_-j

GLASS Ilex S'JI. 11 1 11 'PPf--ШНЯЛ---BE—a-3'

W X, X2 Y TATA j |

leader Transmembrane and

Sequence Cytoplasmic

Рис.2. Схематическая диаграмма молекулы МНС II класса и экзон-интронная организация кодирующего её гена [39]

Рис.3. Схема пептид-связывающей бороздки молекулы HLA II класса [39]

По аналогии со структурной моделью молекулы I класса и исходя из известных нуклеотидных последовательностей моле�