Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полиморфизм систем HLA у представителей разных славянских этнических групп (русской, белорусской и украинской)

АКГГУАЛЪНОСТЪ ПРОБЛЕМЫ

Система генов тканевой совместимости человека {Ншпап 1,еикосу1с АлКудо - ША) является одной из наиболее полиморфных генетических систем, пи пол плющей « организме человека ряд функций Важнейшими из них являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунного гомсостаза, нарушение которых лежит о основе таких патологических процессов, как аутоиммунные заболевания и развитие опухолей [I], Исследование полиморфизма системы Ш.А является одним из наиболее эффективных подходов к изучению структуры и функции гдааиого комплекса гнсгосовместимоети человека. Необходимость таких научных работ обусловлена, а том числе и тем фактом, что без полного представления о строении системы генов тканевой совместимости невозможно успешное развитие клинической трансплантологии. Особенно это касается пересадки аллогенного костного мозга.

Обеспечивая регуляцию иммунного ответа, система Ш.А (главный комплекс гистосовместимостн человека) осуществляет генетический контроль взаимодействия всех нммунокомпетентных клеток организма, распознавание своим н чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа н, в целом, обеспечивает выживание человека как вида в условиях экзогенной н эндогенной агрессии. Многообразие указанных функций обеспечивается особенностями строения главного комплекса гиетосовмсстнмосгн [19]. Одна из этих особенностей - экстремальный аллслышй полиморфизм комплекса генов Н1.А. являющийся "мощным механизмом вариабельное! и и естественного огбора" человека как вида, - позволяет ему противостоять постоянно июлюннонируюшему множеству патогенов.) 18| ранее существовала возможность изучать полиморфизм Н1-Л только на уровне белковых молекул (КЬЛ - антигенов), депонированных на мемфраиах клеток В последние годы появилась возможность исследовании HLA im качественно новом молекулярно-гежтнееском уровне iipit немощи полимеразной цепной редкими (fill?). Принципиальным отличием новых методов «вилось использование а качестве объекта исследования непосредственно гснеткческо! о материала (участков ДНК. определяющих аыелъиый полиморфизм снегами HLA).(I9]

Развитию и интенсификации >тих исследований способствует организация национальных (Американское. Британское и Французское обществ» гнстосоимсегичоети и иммуногенетики) и международных (Ьвропейская федерация ннмуногенетнков) организаций, наечншвашоа в своих рядах тысячи исследователей. а также создание el lei Jna.1 н зиро ванных периодических международных научных изданий, таких как Tissue Antigens. European Journal of Immunogcneiics. Human Immunology и других [46J. Результатом тгого стало заметное увеличение количества нэаесшыхадделеД ULA - со 1 SO в 1991 году [111], 472 в 199Я голу [30) до примерно 1900 {данные на 2004 год) аллелей. ПанГюяее полиморфны локусы ItLA-B и DRBJ • 501 н 316 аллелей соогветственно. Сообщения о иовых спеинфнчностях HLA поступают практически каждую неделю. [931 При этом среди вновь открытых аллелей установлены аллели чрезвычайно высокого уровня ассоциации с заболеваниями [431,

Сведения, полученные в результате изучения полиморфизма главного комплекса гистоеовмеетимостн в популяциях различной этнической принадлежности, создают основу для развития ряда направлений клинической граисплангологни, диагностическою направления (о предел einte предрасположенности к различным заболеваниям}. криминалистики (ндектнфихацни личности) и могут рассматриваться также с шпрОЕЮЛОГИчеекой точки трения. ">то является предпосылкой для проведения исследований Н1А-разнообразия всех нопуляинй, в том чнеле славянских, проживающих на территории России и вне се, на современном молекуляр1Ю-генетнчееком уровне

ЦЕЛЬ. И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить подпморфшм специфичиостей гении HLA И класса (DRBI, DQAI н DQBI) в трСх различных восточнославянских зтнсчрафи'кских популяциях; русской» белоруской и украинской с помощью ран« созданных в Институте Иммунологии методов ДНК-гнннровакня (выделение геномной ДНК m периферической кропи, тнпнрошшне генов HLA класса II методом чудьпшраПмерной полимеразной псиной реакции, электрофорез продукте Г1ЦР в агарозном геле) для последующего использования подученных данных в развитии фуНДаМС1ГП1ЛЬНОЙ бИОЛОГИЧССКОЙ 1IUVKH (шггропологня II НМ MV HOlïHCfH KU) и для прикладной медицины (клиническая трянсплапгологня. проблема «HLA н болезш»).

В процессе исследования предполагалось решение следующих залам:

I Провести анализ распределения снецнфичностей HLA- DRBL. DQAI к DQB1, а также их гипнотических сочетаний у здоровых предстоятелей русской, белоруской и украинской популяций н сравнении с аналогичнымн данными ДЛЯ других noire ляциониых групп.

2. Проанализировать генетическое родство исследованных популяций, как между собой, так и с некоторыми народами Европы.

3. Па примере восточных славян продемонстрировать способность системы генов HLA отражать геиогеографно этнических групп и возможность использования этой системы в иоиуляцнонных исследованиях.

В процессе работы впервые был проведен сравни тельный анализ особенностей распределения спсцнфкчвостей генов HLA il класса (DR1Î1, DQAI и DQBI) и их гаилотиинческнх сочетаний на молекулярио-тенегическом уровне среди представителей белорусских, украинских и русской популяций.

На основе полученных данных был проведен расчет генетических расстояний, что позволил«) оценить генетическое родство между исследованными этническими группами:

Оценена генетическая близость (по профилю распределения ген« DRBI) исследованных популяций с некоторыми народами Квропы и выявлены мсжпопулянноииые различия

Впервые на примере восточных славян, показано, что, несмотря на влияние направленного естественного отбора, гены HLA II класса плекиа i ко отражают геногеографню этнических групп, и могут быть использованы в полуляцнониых исследованиях

Впервые получены данные для восточносда&я неких попу линий, которые могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний, для поиска доноров аддогеиного костного мозга в пределах генетически б.никих Етопуляпионных групп, для идентификации личности в судебной медицине. прл>сгичкская значимость

Данные о распределении спецнфнчностей генов I ILA 11 класса и их сочетаний у здоровых представителей белорусских, украинских и ру сской популяций могут быть яспописинны в качестве контрольны* для поиска маркеров генетической предрасположенности к ранни ню различных заболеваний

Полученные данные служат теоретической базой для практических рекомендаций в клинической транеплантолоти для поиска доноров аллогенного костного мозга в пределах генетически близких полуляцнонных групп,

Популяцноииые лонные могут быть использованы в судебно-мслннинской практике для идентификации личности.

Полученные данные могут был. использованы дня изучения истории формирования таких генетически близких народов» как восточные славяне

ВЫВОДЫ:

1. Самыми частыми отдельными вариантами DRB! гена для всех изученных популяций являются: DRB1*07, *11, *13, *15, что соответствует западиоеврадийскому типу распределения,

2. При попарном сравнении распределения спсинфнчностеЙ retía DRBI между восточными украинцами и русскими выявлены достоверные различия в частотном содержании DRB 1 * 11 и ORB 1*163. При попарном сравнении распределении аллелей гена DRB1 выявлено» что западные украинцы достоверно отличаются от русских частотным содержанием ORB1*11,

4. Сравнительный анализ представленных данных отмечает» что у всех популяций часто встречаемыми являются следующие трехлокусиые гаплотипы: DRBl*Il-DQAl*0501-DQB 1*0301, DRB1*I5-DQA1 '0102-DQBl*0602»8. DRB 1 * 01-DQAl*0101 -DQBI*0501, DRBl'04-DQA1*0301 -DQBI *0302 и DRB 1 '07-DQA 1*0201 -DQB1-0201

5. Отличительной особенностью являсгся отсутствие или низкие частоты пшлотипов: DRB I *09-DQA 1 *0301-DQB 1 *0303 и DRB I • 12-DQA 1*0501 -DQB 1 *0301

6. При попарном сравнении частот распределения трехлокусных гаплопшов (DRBt-DQAI-DQBl) восточных украинцев с русскими было установлено, что достоверными являются различия в частотном содержании DRBI#U'DQAI*0501-DQB 1*0301 и DRBl*16-DQA l*0102-DQB 1*0502/4.

7. Результаты многомерного статистического анализа выявили, что щученные популяции образуют два кластера»: «южный», включающий украинцев (Хмельницкая и Львовская области), н «северный», включающий белорусов {Витебска* и Брестская области) и русских из Вологодской обласгн.

8. При проведении многомерного кластерного анализа изученных популяций и некоторых пародов Вероны выявлено, что белорусы ш Витебской и Брестской областей и украинцы Hi Хмельницкий и Львовской областей генетически близки с «цектрально-европейекнми» популяциями. Русские из Вологодской области сходны по HLA-профилю с «сеаероеироиейскнчнм и «центрально-европейскими» популяциями.

9. На примере восточных славян покатано, что, несмотря ив влияние естественного направленного отбора, система генов HLA адекватно отражает геногеографню этих этнических групп, и может быть использован» я (инфляционных иссл ел сияниях.

Часть IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплекс генов HLA (главного комплекса гиспковмесгимостн человека) компактно расположен на коротком плече 6-Й нутосомной хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований) н содержит более 220 генов [98В состав HLA входят три группы генов; экс премирующие охарактеризованные гены, псевдогены и гены с неустановленной функцией [21]. Гены локуса HLA -DI'. -DQ н -DR. ближайшие к центромере, кодируют молекулы II класса. Молекулы II класса определяются на поверхности так называемых антиген-представляющнх (вспомогательных) клеток - дендритных, активированных макрофагов, В-лнмфоцнтов, а также активированных эндотелнолькых, эпителиальных и тучных клеток. Т-хелнеро» [22},

Система HLA является самой полиморфной из известных систем о геноме человека- Важнейшими функциями этой системы являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунного гомсостаэа, нарушение которых лежкгг в основе таких патологических процессов, как аутоиммунные заболевания н развитие опухолей, Обеспечивая регуляцию иммунного опита, гены I-ILA осуществляют генетический контроль взаимодействия вссх нммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа и, в целом, обеспечивает выживание человека как айда в условиях экзогенной и эндогенной агрессин 11) Эти функции, в первую очередь, обусловлены двумя свойствами системы HLA: участием в презентации антигенного пептида и широким разнообразием - полиморфизмом аллельных вариантов каждого Гена.

Для «запуска» адаптивного иммунного ответа на патоген, его антигенные пептиды для распознавания Т-хелпером должны быть представлены антиген-представляюшей клеткой только а контексте с молекулой IILA класса IL

Несмотря на мощное действие направленного отбора, полиморфизм системы HLA сохранялся и является необходимым элементом при взаимодействии человека с окружающей средой, Дело в том, что каждый из аллелей генов HLA обеспечивает возможность реагировать на определенный набор пептидов антигенов, к индивидуумы, которые гетерозиготны 110 HLA, MOiyr иметь эффективный иммунный ответ ив более разнообразный спектр антигенов и имеют намного больше авансов противостоять нифскиин, что способствует поддержанию HLA-разнообразия на высоком уровне.

Исследование полиморфизма системы HLA является одним из наиболее эффективных подходов к изучению структуры и функции главного комплекса гистосавместимостн человека,

Ранее существовала возможность изучать полиморфизм HLA только на уровне белковых молекул (HLA ■ антигенов), экспонированных иа мембранах клеток. В настоящее время появилась возможность исследования !TLA иа качественно новом молекулярно-генетичееком уровне при помощи полнмеразиой ценной реакции (ГЩР). отличием которого явилось использование в качестве объекта исследования непосредственно генетического материала (участков ДНК. определяющих вллсльный полиморфизм системы HLA).[ 19]

Сведения, подученные в результате изучения полиморфизма главного комплекса гистосовмеетнмости в популяциях различной этнической принадлежности, создают основу для развития ряда направлений клинической трансплантологии, диагностического направленна (определение предрасположенности к различным заболеваниям), криминалистики (иде1ГГнфнкацня личности) и могут рассматриваться также с антропологической точки зрения. Это является предпосылкой для проведения исследовании HLA-разнообразия всех популяций, а том числе славянских, проживающих на территории России и вне ее, на современном молекулярно-генетичееком уровне,

Представленный в это Я работе анализ полиморфизма аллелей генов HLA является одним из множества понуляцнонных исследований, проводимых среди восточнославянских этносов: антрополошческне исследования* анализ м нтохондриал иных н Y-хромосомных, а также других вутосомных маркеров ДНК- Целью нашей работы было проанализировать особенности распределения аллелей генов HLA II класса у восточнославянских популяций и оценить способность генов HLA отражать геногеографкю этих попудяиноиных групп, и, следовательно, исследовать возможность использования данной системы дли изучения формирования генетически близких народов

Для изучения были взяты взрослые здоровые и неродственные между собой представители пита популяций, представляющих все три восточнославянских этноса: две популяции белорусов (Витебская и Брестская области), две популяции украинцев (Львовская и Хмельницкая области) и русская популяция (Вологодская область).

Для данного исследования был выбран метод mSSP (mixture of sequence specific primers), разработанный в отделе иммунснснсгнкн Института Иммунологии МЗ РФ (Л.П. Алексеев и лр. 1995, Д.Ю. Трофимов 1996)

Основной особенностью этого метода является использование во время одной амплификации смеси из нескольких праймеров различной специфичности. Праймеры выбирали так, что при амплификации различных аллелей генов HLA класса II образуются продукты разной длины, Такой смесью можно одновременно амплнфнцнровать различные ал дельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по положению PCR-продуигга а обычном геле, окрашенным бромистым этилием, Вторым важным отличием предлагаемого метода является диухсгадийна* схема амплификации. Во время первого раунда используются праймеры «обшей специфичности», амплифнпируюшне осе аллели исследуемого гена. На тором раунде происходит тнпнрованне с помощью см et ii специфических праймеров в условиях, позволяющих различить олигонуклсотндныс замены.

Для определения частоты аллелей и грехлокусных гаплотипов использовали компьютерную программу «Арлекин», версия 2.1. Анализ генетических расстояний проводили с помощью компьютерных программ «DJgenetic» и «Sutisiica 6.0». Сравнение частот снецифнчностей и трехлокусных гаплотипов а 1кследованных популяциях проводилось с использованием точного критерия Фишера и коэффициента Бонфсроннн

В процессе работы были проанализированы особенности распределения спецнфнчностей DRBI, DQAl, DQB1 н нх гаплотипнческнх сочетаний у северных н южных белорусов, восточных н западных украинцев и русских. Было установлено, что самыми частыми для всех изученных популяпнй являются аллельные варианты: DRB1*07, DRBI* 11, DRBt'13. DRBI* 15; D(JAI*0IÖ2, DQAI*0201, DQAI*050l; DQB l *020 (» DQB 1*0301 и DQB 1*0602-8

В дальнейшем был проведен попарный сравнительный анализ данных тнпирования но трем генам HLA - DRBI. DQA1 и DQBI, который показал, что основные различия между щученными популяциями связаны с геном DRÖI и в меньшей степени с DQA1 н DQB1. В результате было выявлено, что все популяции, за некоторым исключением, достоверно не отличаются друг от друга частотным содержанием алледьиых вариантов DRBI. Исключение составляют восточные украинцы из Хмельницкой области, которые различаются с русскими и 1 Вологодской области частотным содержанием DRBI*И н DRB]*I6, западные украинцы из Львовской области с русскими из Вологодской области - частотным содержанием DRBI* 11

На основе полученных данных был проведен расчет генетических расстояний по методу М. Нея между изученными популяциями, позволяющий оценить степень генетического родства этих этнических групп.

Результаты многомерного статистического анализа выявили, что изученные нами популяции образуют два кластера, соответствующие географической и зтнопенсгической близости популяций. «Южный» кластер включил в себя обе украинские популяции. «Северный» кластер включил обе белорусские (Витебской и Брестской областей) н русскую (Вологодской области) популяции. Неожиданной оказалась несколько большая близость русских Вологодской области с популяцией белорусского Полесья, а не с «верными белорусами Возможными причинами генетических отличий северных белорусов могут быть влияния балтсккх племен, фиксируемые антропологами на севере Белоруссии. А приближение Вологодской популяции к полесской может быть связано с существенным генетическим вкладом русской колонизации Вологодских земель по сравнению с новгородской.

При анхтнзе особенностей распределения трехлокусных гаплотнпов у всех изученных популяций было установлено, часто встречаемыми являются DRBI*lbDQAl*050l-DQBI*0301, DRB145-DQA]*0102-DQB!*0&02-8, DRB!*Ol-DQAl*010l.DQBI*050t. DRBI4M-DQA1 * 030 [ -DQBI *0302 и DRB1 *07-DQA 1*020 NDQB 1*0201; редко встречаемыми ■ DRBl*09-DQA 1*0301-DQB 1*0303 и DRBI42-DQA1 * 0501 -DQB 1*0301, характерные для монголоидных популяций [38, 63, 70].

При проведении попарного сравнительного анализа распределения трехлокусных гвплоткпов, было выявлено, что между изученными популяциями нет достоверных различий, кроме того, что восточные украинцы из Хмельницкой области отличаются от русских из Вологодской области частотным содержанием DRBI* 11-DQA 1*0501-DQB1 *0301 и DRBI • 16'DQA 1 *0102-DQB 1 *0502/4.

Изучение распределения гаплотнпических сочетаннП показало, что наиболее информативным был сравнительный анализ трехлокусных гаплотнпов. Неходя кз этого, нам хотелось провести сравнение распределения трехлокусных гаплологических сочетании а исследованных популяциях с аналогичными данными других народов на литературных источников. К сожалению, данные по трехлокусным гагшгтипам а литературе практически не представлены, поэтому в анализ включены также сведения о НЬА-профиле некоторых популяций но локусу ОКВ1 как наиболее полиморфному нз исследованных Сравнивая значения частот епеинфичноелей ГЖВ1 у исследованных популяций со значениями, характерными для некоторых народов Европы, Азии, Африки н Америки, пришли к заключению, что особенности распределения спецнфнчностей гена РЯВ1 соответствует типичному занодноевразнйскому варианту

На основе данных распределения аллелей гена ОКВ1 был проведен расчет генетических расстояний между изучаемыми популяциями н некоторыми гюпуляцноннымн группами Европы, позволяющий оценить их генетическое родство, Результаты кластерного анализа, представленные на ленлрогрдмме, выявили следующие особенности, Все популяции образовали зри кластера: «североевропейский», «центрально-европейский» н «южно-европейский». В «североевропейский» кластер вошли русские нз Вологодской области, немцы, датчане голландцы, финны, ирландцы и англичане «Центрально-европейский» кластер включил в себя белорусов, чехов, бельгийцев, австрийцев, швейцарцев, французов, хорватов, украинцев, словаков и венгров. Внутри этого кластера в зависимости от генетической близости популяции распределяются следующим образом: белорусы (Витебская и Брестская области) составляют одну группу с чехами, бельгийцами, австрийцами и швейцарцами, украинцы (Хмельницкая и Львовская области) - со словаками и венграми. В «южно-европейский» кластер вошли болгары, греки и итальянцы.

На двухмерном графике многомерного шкалирования эти же популяции расположены следующим образом. Центральное место занимают популяции, составляющие '.«центрально-европейский:» кластер.

Северные белорусы (Витебская область) несколько отдалены от основного «ядра" популяций. что, вероятно, обусловлено своеобразием указанной популяцнонной фуппы (возможным влиянием балтекнх племен) или недостаточным количеством выборки, взятым для анализа

С одной стороны к «центрально-европейскому» кластеру примыкают «североевропейские» популяции, из которых ближе ьсек к центру расположены русские из Вологодской области. Положение русских на графике свидетельствует о сочетании в генофонде указанной группы «североевропейских» и «среднеевропейских» генов- С другой стороны ог «ядра» основных популяций расположились «южноевропейские» популяции: болгары, греки и итальянцы

Из всего выше сказанного следует, что белорусы и украинцы генетически близки с «центрадьно-еаропейскими» популяциями. Русские из Вологодской области включили в свой генофонд гены как «североевропейских», так «центрально-европейских» популяций.

Представлен ны с нами данные о HLA-разнообраз кн у восточнославянских популяций и генетическом родстве, кок между собой, так и с популяциями различных стран Европы, сопоставимы с нсторнко-этнснрафнческнми сведениями и антропологическими данными, полученные в ходе нескольких антропологических экспедиций: «Русской антропологической экспедиции» (В.В. Бунак. 1965), «Украинской и Прибалтийской антропологических зхспеднинй» (Дьяченко, 1965, Битов. Чебоксаров. 1959),

На примере аосточнославянских популяций, в сравнении с данными анализа других генетически наследуемых факторов - системы ABO, некоторых биохимических маркеров было показано, что гены HLA И класса адекватно отражают геногсографню разных популяционных фуп» и в совокупности с другими методами исследования (изучение антропологических признаков, анализ мнтохондрнальных и Y-хромосомных. а также других аутосомных маркеров ДНК) Motyr быть использованы дяя изучения истории формирования различных популяций.

Данные полиморфизма генов Н1-А II класса и их сочетаний, полученные а ходе роботы, также могут быть использованы в качестве контроля для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию заболеваний, в основе которых лежит нарушение функционирования иммунной системы, а судебно-медицинской практике для илеигифнкашш личности, Данные служат теоретической базой для практических рекомендаций в клинической трансплантологии дяя поиска доноров аллогеиного костного мозга в пределах генетически близких популяцнонных групп.