Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и регуляции апоптоза в патогенезе рака желудка

4846237

РАКИТИН Сергей Сергеевич

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ, РЕПАРАЦИИ ДНК И РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА В ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ЖЕЛУДКА

14.03.03 - патологическая физиология 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 МАЙ 2011

Томск-20II

4846237

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Новицкий

Вячеслав Викторович

Доктор медицинских наук

Дмитриева Алла Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Хлусов

Игорь Альбертович

Доктор медицинских наук, профессор

Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация: Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН

Защита состоится «1Л» М&-Х 2011 г. в (0~ часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «¿Г » ^л^^ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТИРИСТИКЛ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак желудка (РЖ) стабильно остается на четвертом месте в структуре онкологических заболеваний в мире. Ежегодно регистрируется почти 800 тысяч новых случаев и 628 тысяч смертей от этого заболевания. В России самый высокий показатель заболеваемости раком желудка приходится на Новгородскую область и республику Тыва, минимальные показатели регистрируются в регионах Северного Кавказа, Магаданской области и Чукотском автономном округе. На протяжении последних лет в Томской области отмечается увеличение количества впервые выявленных случаев рака желудка, так в 2008 году было зарегистрировано 247, в 2009 - 253, а в 2010 году - 294 случая [Чиссов В.И., 2011]. По уровню смертности от рака желудка Россия в ранжированном ряду 45 стран занимает 2 место среди причин смерти у мужчин и 3 - у женщин [Имянитов E.H., 2009].

В настоящее время не вызывает сомнения, что рак желудка является мультифакториальным заболеванием, инициирующую роль в развитии которого играют многие гены, формирующие «генные сети». К структурным компонентам, формирующим «патологические» генные сети, можно отнести систему биотрансформации ксенобиотиков, различные системы репарации, регуляторы клеточного цикла. Работа этих систем направлена на предупреждение повреждений генетического материала клеток, исправление возникающих нарушений и поддержание генетической стабильности организма в целом.

Ключевую роль в обеспечении индивидуальной устойчивости организма к агрессивным факторам внешней и внутренней среды играет система биотрансформации ксенобиотиков [Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко И.Н., 2000; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2004], полиморфные варианты генотипов которой в определенных условиях могут предрасполагать, либо, напротив, препятствовать проявлению заболевания [Nebert D.W., Carvan M.J., 1997]. В случае возникновения мутационной изменчивости включается механизм, восстанавливающий целостность генетического аппарата клетки, важнейшим представителем которой является система эксцизионной репарации ДНК, осуществляющая исправления наиболее часто встречающихся изменений в структуре ДНК. Репаративный синтез тесно сопряжен и опосредованно регулируется системой генов-регуляторов клеточного цикла [Yiu G., Tao S., 2009].

Гены-регуляторы клеточного цикла, эксцизионной репарации и

биотрансформации ксенобиотиков, вступая в сложные взаимодействия на уровне белковых продуктов, обладающих разной конформацией, предопределенной наличием полиморфных вариантов, формируют тем самым «генные сети», обусловливающие индивидуальную восприимчивость организма к развитию злокачественных новообразований [Wu Е., 2009].

Цель исследования: установить роль полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла, репарации ДНК и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе рака желудка. Задачи исследования:

1. Выявить частоту встречаемости вариантных генотипов системы эксцизионной репарации ДНК (XRCC1 G280A, XRCC1 G399A, XRCC1 С194Т, XPD А751С) у больных раком желудка и у здоровых лиц.

2. Определить встречаемость полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла (р53 G72C, р21 G1026A,р21 G369C и Rbl Т137С) у больных раком желудка и у здоровых индивидов.

3. Оценить распределение полиморфных вариантов генов ферментов первой (CYP1A1 A4889G) и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков (GSTP1 A105G, GSTM1 и GSTTJ) у больных раком желудка и здоровых доноров.

4. Выявить распределение полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла, эксцизионной репарации и биотрансформации ксенобиотиков у больных раком желудка в зависимости от гистологического типа опухоли.

5. Оценить статистическую ассоциацию вариантных генов системы биотрансформации ксенобиотиков, регуляторов клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК с наличием регионарных и отдаленных метастазов у больных раком желудка.

6. Оценить суммарный эффект вариантных генотипов изучаемых генов трех систем на формирование риска развития злокачественных новообразований желудка.

Научная новизна: В настоящей работе представлены результаты впервые осуществленного комплексного анализа роли полиморфных генов трех систем: эксцизионной репарации, регуляторов клеточного цикла, ферментов биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе рака желудка, а также оценена популяционная частота встречаемости генов эксцизионной репарации ДНК

(XRCCIG280A, XRCCl G399A, XRCCl C194T, ЛТО A751C), генов-регуляторов клеточного цикла (p53 G72C, р2/ G1026A, p21 G369C и iîiy Т137С), генов ферментов первой (CYPIA1A4889G) и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков (GSTI'I A105G, GSTM1 и GSTT1) у относительно здорового населения г. Томска и Томской области. Выявлена статистическая ассоциация «патологических» вариантов генов XRCCl С194Т, XPD А751С, CYP1A1 A4889G, GSTP1 A105G, р53 G72C, Р21 G1026А и p21 G369C с развитием злокачественных новообразований желудка. Вариантные Т-аллель гена XRCCl С194Т и С-аллель гена XPD А751С ассоциированы с формированием опухолей желудка диффузного гистологического типа. Показано увеличение частоты минорных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYPIA1, GSTP1 и GSTM1 и регуляторов клеточного цикла р53 G72C, p21 G1026A и p21 G369C у больных РЖ с выявленными очагами метастазирования. Оценены рисковые шансы развития злокачественных новообразований желудка, а также определены риски метастазирования и формирования опухолей разного гистологического типа при носительстве «патологических» вариантов генотипов. Рассчитан суммарный эффект сочетаний вариантных генотипов изученных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, эксцизионной репарации ДНК и регуляторов клеточного цикла на развитие новообразований желудка, превосходящий вклад в формирование повышенного риска развития рака желудка единичного гена. Впервые выявлен совместный вклад генов эксцизионной репарации, регуляторов клеточного цикла и биотрансформации ксенобиотиков в формирование «генной сети», приводящей к развитию злокачественных новообразований желудка, показана возрастающая рисковая значимость развития злокачественных новообразований желудка при увеличении количества минорных вариантов генов в сочетании.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии полиморфных вариантов генов эксцизионной репарации ДНК {XRCCl G280A, XRCCl G399A, XRCCl С194Т, XPD A751C), генов-регуляторов клеточного цикла (р53 G72C, p21 G1026А, p21 G369C и Rbl Т137С) и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1A4889G, GSTPl A105G, GSTM1 и GSTT1) на развитие злокачественных новообразований желудка. Риск развития метастазов увеличивается при наличии минорных вариантов генов CYP1A1, GSTPI,

GSTM1, p53 G72C,p21 G1026A и p2l G369C. Для носителей «патологических» аллелей гена XRCC1 С194Т и XPD А751С повышена рисковая значимость формирования диффузного рака желудка. Оценен кумулятивный эффект отдельных вариантных генотипов в формировании сочетаний протективного и предрасполагающего характера, как в отношении развития рака желудка, так и очагов метастазирования.

Результаты данного исследования могут быть положены в основу разработки новых методов ранней диагностики рака желудка с учетом полиморфного статуса генов XRCC1С194Т, XPD А751С, p53G72С, p21 GI026A, p2I G369C, CYP1AI A4889G, GSTP1 A105G для формирования групп повышенного онкологического риска, а также как прогностический критерий клинического течения заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Минорные аллели генов XRCC1 С194Т, XPD А751С, GSTP1 A105G, р53 G72C, p21 G1026А и p21 G369C и профицитный G-аплель цитохрома Р-450 CYP1A1 A4889G играют важную роль в этиологии и патогенезе рака желудка, поскольку частота встречаемости данных вариантных генотипов у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых доноров.

2. Функционально неполноценные варианты генов XRCC1С194Т, XPD А751С, GSTP1AI05G, р53 G72C, p21 G1026A и р21G369C и CYPIAIA4889G предопределяют повышенный риск развития злокачественных новообразований желудка.

3. «Патологические» варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYPIAI 4889GG, GSTP1 105GG и GSTM10/0 и минорные варианты генотипов регуляторов клеточного цикла р53 72СС, p21 1026АА, p21 369СС статистически ассоциированы с формированием метастатических очагов у больных раком желудка.

4. Минорные варианты генов XRCC1 С194Т и XPD А751С ассоциированы с развитием диффузного гистологического типа рака желудка.

5. Суммарное предрасполагающее влияние полиморфных функционально неполноценных генов каждой из изучаемых систем: биотрансформации ксенобиотиков, регуляции клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК на формирование предрасположенности к развитию рака желудка превышает индивидуальный эффект вариантных генотипов.

Вклад автора: автором выполнено выделение ДНК из ядросодержащих клеток периферической крови 200 больных раком желудка и 260 здоровых доноров, генотипирование образцов ДНК, статистическая обработка данных, их анализ и оформление диссертации.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на VII съезде онкологов России (г. Москва, 2009); на XIV Российском онкологическом конгрессе (г. Москва, 2010).

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры патофизиологии (раздел «Патофизиология тканевого роста») и кафедры биологии и генетики ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитня России (разделы «Молекулярная генетика» и «ГТопуляционная генетика»), а также в научно-практической деятельности НИИ гастроэнтерологии имени Г.К. Жерлова ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитня России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в ведущих рецензируемых журналах из «Перечш ...» ВАК РФ.

Объем и струю-ура работы. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 рисунками, 41 таблицей. Библиографический указатель включает 261 источник, из них 76 отечественных и 185 зарубежных.

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20072013 годы: Государственный контракт №02.740.11.0311 от 07.07.2009 г. и Государственный контракт № П 805 от 17.08.2009г.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты клинико-лабораторного обследования 200 больных раком желудка и 260 здоровых доноров.

Обследованные пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер», г. Томск (главный врач - канд. мед. наук С.А. Коломиец) и в НИИ Гастроэнтерологии имени Г.К. Жерлова ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитня России, г. Северск (директор - д-р мед. наук, профессор А.П. Кошель) в период с 2008 по 2010 год. Диагноз в каждом конкретном

случае подтверждался результатами клинического, морфологического, рентгенологического, эндоскопического обследований.

Взятие биологического материала (венозная кровь) выполнялось у всех обследованных лиц однократно до начала лечения на базе диагностического отделения ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер» средним медицинским персоналом (заведующая диагностическим отделением - д-р мед. наук А.И.Дмитриева). Впоследствии больным раком желудка были проведены радикальные операции в сочетании с химио-/ лучевой терапией.

Средний возраст онкологических больных, среди которых было 125 мужчин и 75 женщин, на момент взятия материала составил 56±9 лет.

В группу больных раком желудка и здоровых доноров были включены индивидуумы только европейского происхождения, проживающие на территории г. Томска и Томской области, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей.

Для формирования групп больных без метастазов и пациентов, имеющих очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах использовалась международная классификация злокачественных опухолей по системе TNM (1997). Первую группу (T1-4N0M0) составили пациенты без выявленных очагов метастазирования (п=142, 71%); вторую - с очагами метастазирования (п=58, 29%), среди последних больные с поражением регионарных лимфатических узлов (T1-4N1-2M0) - 39 пациентов, с сочетанными метастатическими поражениями регионарных лимфоузлов и отдаленных органов (T1-4N1-2M1) - 19 пациентов.

Гистологическое исследование биопсийного и операционного материала больных раком желудка было проведено в лаборатории патоморфологии диагностического отделения ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер» (врачом-патологоанатомом, канд. мед. наук М.Ф. Яловой). В зависимости от морфологического строения опухоли больные раком желудка были разделены на 2 группы в соответствии с классификацией P. Lauren (1965). В первую группу вошли пациенты, имеющие интестинальный гистологический тип опухоли (п=137, 68,5%), во вторую группу - больные диффузным типом рака желудка (п=63, 31,5%), представленного мелко-, полиморфно- и перстневидноклеточным раком.

Группу сравнения составили здоровые лица (первичные и штатные доноры крови ОГУЗ «Томская областная станция переливания крови»,

главный врач - канд. мед. наук Е.В. Малый) с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, без выявленных заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также заболеваний онкологической природы.

Материалом для генетического исследования явилась ДНК, выделенная из ядросодержащих клеток венозной крови методом осаждения ДНК на сорбенте (набор «ДНК-сорб-АМ», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва).

Праймеры, зонды и условия ПЦР приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Последовательность праймеров, зондов и условия проведения

генотштровапия

Ген (классификация ге) Последовательность праймеров и зовдоа 1° отжига,кТ-ПЦР/ С | ПДРФ Оидо-нуклеаза

С5ТР1Л105С (Ы695) Р5 ■-АСС-ССА-Саа-СТС-ТАТ-ООв-АА-З • Я.5'-ТСА-ССС-САС-ААО-ААС-ССС-СТ-3' 64 ПДРФ В5ТМА1

05777 (п71957720) ГЗ'-СОТ-СЛТ-ТСТ-ОАА-СОС-САА-СО-З' Р5'-ТТТ-ОТО-ОАС-ТОС-ТСА-СОА-СС-3' 63 ПЦР ■

СвТМ! (п7 ¡900371) Г 5 '-ТСС-ТТС-АСС-ТОТ-ТАТ-СОА-ССТ-ТС-З' Я5'-СТТ-ОСС-СТС-ААА-ТАТ-АС0-СТС-0-3' 63 ПЦР -

СУР1А1Мтс (ГБ2858Ш9) Р5'-ТАС-ОАО-ТСТ-ТОТ-СТС-АТС-СС-3' К5'-ОСА-СГГ-АА0-САа-ТСТ-ОТТ-Т0А-0-3' 55 ПДРФ Мзр!

ХЯСа С!94Т (ге1799782) Р5 '-ОСТ-ААО-СТО-ТАС-СТС-ТСА-СТС-З' К5'-ОАС-ССА-ООА-АТС-ТСА-ОСС-3' 5'-ГАМ-ТТСТТСАССТСОАТС-3' 5--ШХ-САСССООАТСААСААС-3' 64 ЯТ-ПЦР

ЛЖа 0280А СгЯ25489) Г5,-ТСО-СОС-СШ-ОАТ-ТаС-ТСС-ОТС-ТС-3' Я5 '-С АО-САС-ТАС-С АС- АСС-СТа-ЛАа-в-З • У-РАМ-аТС-ССА-ССТ-ССА-АСТ-СОТ-АСС-З' 5'-КОХ-ТСС-ААС-ТСА-ТАС-ССС-АСС-С-3' 58 ИТ-ПЦР

ХКСС1 С399А (ГБ25487) Р5'-ТТО-ТСС-ТТТ-СТС-ТСТ-ОТС-СА-3* 115 '-ТСС-ТСС-АСС-СТТ-ТЛС-ТСА-ТА-З' 5'-РАМ-СТС-СГС-ССС-ССС-ТССт-ССС-3' 5,-ЯОХ-СТО-СТС-ССС-ССО-ТСО-ССС-3' 62 ИТ-ПЦР

ХРО А751С (1513181) ' -ТС А-А АС-АТС-СТО-ТСС-СТА-СТ-З' 115'-ТСА-ААС-ЛТС-СТО-ТСС-СТА-СТ-3' 5'-РАМ-СТС-ТАТ-ССТ-СТО-САО-СО-3' З'-ЯОХ-ТАТ-ССТ-СТТ-САС-СОТ-СТ-З' 60 КТ-ПЦР

р53 СПв (гг56275308) Р5'-ЛТС-ААС-СТС-ССА-САА-ТСС-3' Я5'-ОСС-СОТ-СТА-ССА-ССТ-3' 5,-РАМ-СТО-СТС-ССС-ССа-ТОС-ССС-3' 5'-КОХ-СТО-СТС-ССС-ССО-ТС,С.-ССС-3' 58 КТ-ПЦР

11Ы Т137С (Г566624868) F5'-GTG-CAC-AAG-CTC-CAT-AAA-GTT-CTGЗ, аз'-ССТ-ТСА-ССА-ААА-ОАА-ААА-ОСТ-ТСАЗ' 5 '-К АМ-АСТ-ОСТ-АСТ-ССО-СА А-С-3' 5'-ЯОХ-САА-ААС-ТСС-ТАС-ТАС-ССА-АС-3' 58 ПТ-ПЦР

р21 С.1026А (ге 1052150) Р5'-САТ-ТТС-ТТТ-ОСТ-ОСА-ТОА-ТСТ-САО-ТЗ' К5'-ССС-ТАС-АСТ-САС-СТС-ААС-АОА-АОО-3' 5'-РАМ-САА-ССА-САС-ССС-ТТТ-3' 5'-ШХ-САС-СОА-ТТТ-СТТ-СТО-Т-3' 64 ЯТ-ПЦР

р21 0369С (гэ 1052148) Р5'-САТ-'ПС1-ТСС-СТС-ЛСТ-ТСС,-ТСО-Са-3' ЯЗ'-ССТ-ССТ-ООС-ТСС-ССЛ-ОСО-Т-З' 5'-РАМ-САТ-ОТС-САО-ООА-АС-3' 5'-ЯОХ-ОТС-СОО-АСА-ТСТ-ОСА-ССО-А-3' 55 1гг-пцр

Генотипирование ДНК по генам GSTT1 и GSTM1 проводили, используя аллель-специфичную ПЦР. Полиморфный статус генов GSTP1A105G и CYP1AI A4889G определяли методом ПЦР-ПДРФ. Визуализацию продуктов амплификации и рестрикции генов GSTT1, GSTMl, GSTP1 A105G, CYP1A1 A4889G проводили с помощью электрофореза в агарозном геле. Анализ распределения полиморфных вариантов генов XRCC1 G280A, XRCC1 G399A, XRCC1 С194Т, XPD А751С, р53 G72C, p21 G1026A, p21 G369C и Rbl Т137С проводили методом RT-ПЦР, используя амплификатор "iQ ¡Cycler" 5.0 (BioRad, США). Детекция продуктов осуществлялась с помощью системы TaqMan Assay прибора "iQ ¡Cycler" 5.0.

При сравнении частоты генотипов и аллелей использовался стандартный критерий х2 Пирсона [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006].

Относительный риск (OR - oddis ratio) развития заболевания оценивали по стандартной формуле: OR=a/b*d/c, где а и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, d и с - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. OR указан с 95%-ным доверительным интервалом CI (Confidence interval) [Флейс. Дж., 2007].

В соответствии с Указом Президента РФ от 24.12.1993 № 2288 было получено разрешение этического комитета № 1267 от 18 января 2010 на взятие клинического материала для проведения исследования, а также информированные согласия пациентов и здоровых доноров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Множество работ подчеркивают важную роль генетических полиморфизмов, т.е. существование не одной, а нескольких различающихся по структурно-функциональной организации форм гена, предопределяющих ограниченный протективный либо предрасполагающий эффект к онкологическим заболеваниям [Чердынцева Н.В. и д.р. 2006; Имянитов E.H., 2009; Карселадзе А.И., 2009]. Аллельные варианты генов лежат в основе таких мультифакториальных заболеваний, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, бронхиальная астма, опухоли, формируя «генные сети». В каждой из таких сетей выделяют главные гены, обеспечивающие координацию функций остальных элементов, и дополнительные, называемые также генами-модификаторами, которые ускоряют и углубляют патологический процесс [Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко И.Н., 2000].

В ходе проведенного исследования выявлено достоверное увеличение частоты встречаемости профицитного G-аллсля гена CYPJA1 и минорного варианта гена GSTP1 у больных раком желудка (р<0,05) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц (табл. 2).

Таблица 2

Распределение вариантных генотипов (в абс. знач. и в %) генов XRCCI G280A, XRCCI G399A, XRCCI С194Т, XPDA7SIC, р53 G72C, p21 G1026A, p21 G369C, Rbl Т137С, CYP1A1A4889G, GSTP1 A105G, GSTM1 и GSTT1 у больных раком _желудка и здоровых лиц______

Ген Генотип Здоровые лица, | n=260 Больные раком желудка, п=200 р,х2

1 п % п %

XRCC1 G280A GG | 237 91,2 176 88,0 р=0,114

GA 23 8,8 21 10,5 Х2=4,34

АА 0 0 3 1,5

XRCC1 G399A GG 167 64.2 115 57,5 р=2,64 Х*=0,26

GA 72 27,7 62 31,0

АА 21 8,1 23 11,5

XRCCI С194Т СС 242 93,1 167 83,5 р=0.003 ^=4,5

С'Г 18 6,9 31 15,5

ТТ | 0 0 2 1,0

XPD A75IC АА 209 80,4 93 46,5 р=0,000 ^=68,72

АС 44 16,9 62 31,0

СС 7 2,7 45 22,5

Р53 G72C GG 76 29,2 43 21,5 р=0,010 Х2~9,134

GC I 127 48,9 89 44,5

СС 57 21,9 68 34,0

р21 G1026A GG 1 168 64,5 102 51,0 р=0,001 X =13,064

GA 75 28,9 67 33,5

АА 17 6,5 31 15,5

р21 G369C GG 198 76,2 132 66,0 р=0,007 Х2=9,963

GC 53 20,4 48 24,0

СС 9 4,4 20 10,0

Rbl Т137С ТТ 185 71,2 137 68,5 р-0,225 Х2=2,980

тс 66 25,4 49 24,5

СС 9 3,4 14 7,0

CYP1A1 A4889G АА 243 93,5 159 79,5 р=0,000 X2—21,10

AG 17 6,5 38 19,0

GG 0 0,0 3 1,5

GSTPI A105G АА 177 68,1 93 46,5 р=0,000 Х-33,901

AG 74 28,5 107 53,5

GG 9 3,46 0 0,0

+ 203 78,1 169 84,5 р=0,105 Х-2,61

0/0 57 21,9 31 15,5

+ 145 55,8 93 46,5 р=0,060 Х2=3,53

0/0 115 44,2 107 | 53,5

Примечание: р - уровень статистической значимости различий частоты генотипов между группами больных раком желудка и здоровыми донорами, х2 - стандартный критерий Пирсона для сравнения частоты генотипов и аллелей генов

При проведении сравнительного генотипирования ХЯСС1 0399А была выявлена лишь тенденция к увеличению частоты встречаемости минорного А-аллеля у больных РЖ по сравнению с таковой у здоровых (27,0 и 21,9% соответственно). Анализ распределения генотипов ХЯСС1 в399А в группах обследованных лиц достоверных отличий не выявил (рис 1).

60

so

40 30 20 10 О

........

I

I

l.llil

I

■ больные РЖ

здоровые доноры

CYP1A1 GSTP1 Gsm 6STM1 XRCC1 XRCC1 XRCC1 XPD 751 p5J р21-10261)21-369 RM JRfl ÎQq 144

Рис. 1. Частота (в %) G-аллеля гена СУР1А1, G-аллеля гена GSTP1, функционально неполноценных генотипов генов GSTTJ, GSTM1 и «патологических» вариантов аллелей генов XRCC1 G2S0A, XRCCI G399A, XRCC1 С194Т, XPD А751С, р53 G72C, p21 G1026A, p21 G369C, Rbl Т137С у больных раком желудка и здоровых доноров. * - достоверность различий в распределении аллелей у группы больных РЖ по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров.

Реализация главной задачи генетического материала (сохранение целостности и первоначальной структуры ДНК) не возможна без участия регуляторов клеточного цикла, обеспечивающих продвижение клетки по митотическому циклу. Наличие полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, обеспечивает индивидуальную особенность в восприимчивости клетки и организма в целом к факторам внешней и внутренней среды и другим особенностям в реализации метаболических, репаративных и митотических событий [Кузьмина Н.С., и др. 2007; Шилова О.Ю., 2008; Шилова О.Ю., Уразова Л.Н., 2010]. Согласно полученным данным относительно распределения полиморфных вариантов генов клеточного цикла, у больных раком желудка было выявлено значимое увеличение частоты встречаемости «патологического» аллеля С гена р53 в72С (рис. 1), выполняющего центральную регуляторную функцию в клеточном цикле, зачастую называемого в литературе «хранителем генома», по сравнению с таковой у здоровых лиц (56,25 и 46,35% соответственно, при р<0,05). Кроме того, обращало на себя внимание значимое увеличение частоты встречаемости СС-генотипа гена р53 у больных РЖ по сравнению с таковой у здоровых доноров (34,00 и 21,92% соответственно).

Осуществление основной функции р53 является сложным многокомпонентным процессом, требующим экспрессии многих генов, в том числе р21 и Rbl. В ходе проведенного исследования были оценены два генных полиморфизма гена р21 - это G1026A и G369C. Для обоих из них были выявлены значимые отличия при сравнении распределения частоты встречаемости у больных РЖ и здоровых доноров (табл. 2). Было показано статистически значимое увеличение частоты А-аллеля гена p21 G1026A у больных РЖ по сравнению с таковой у здоровых лиц (32,25 и 20,96% соответственно, при р<0,05). Обращало на себя внимание также достоверное увеличение (р<0,05) частоты встречаемости GA- и АА-генотипов (табл.2) у больных раком желудка (33,50 и 15,50% соответственно) по сравнению с таковой у здоровых лиц (28,85 и 6,54% соответственно). Аналогичная закономерность была выявлена при изучении распределения вариантных генотипов гена p21 G369C. Было зарегистрировано, в частности, увеличение частоты встречаемости минорного аллеля гена p21 G369C у больных РЖ по сравнению с таковой у здоровых (32,25 и 10,96% соответственно). Анализ распределения генотипов выявил также наличие статистически значимого увеличения частоты патологических GC- и СС-генотипов гена p2l G369C у больных РЖ (24,00 и 10,00% соответственно) по сравнению с аналогичным показателем у лиц без выявленной онкопатологии (20,38 и 3,46% соответственно, р<0,05).

Увеличение частоты встречаемости минорных генотипов и аллелей гена р21 у больных раком желудка может свидетельствовать о значимости привносимых изменений «патологических» генотипов в конформационную или функциональную характеристику кодируемого белкового продукта, обеспечивающего индивидуальные особенности во взаимодействии компонентов - участников регуляции клеточного цикла.

Изучение встречаемости аллельных вариантов гена Rbl не выявило значимых различий в распределении их частоты у больных раком желудка и здоровых лиц (р>0,05).

В ходе проведенного анализа частоты распределения аллельных вариантов генов XRCC1С194Т, XPD А751С, pSSGHC, p2J G1026A, p21 G369C, CYP1A1 A4889G, GSTP1 A105G были оценены риски развития злокачественных новообразований желудка (рис.2), носительство минорных аллелей которых повышает риск развития интервале 1,6-4,8 раза.

Р21-369

Р21-1026

pS3 4 Ш t/JMi ШШШ XP0 751 : MB Ш

CYP1A1

0

1

2

4

5

e

Рис. 2 Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований желудка для носителей минорных аллелей генов XRCC1 С194Т, XPD 751, р53 G72С,р21 0\Шк,р21 G369C, CYP1A1 A4889G, GSTP1 A105G при р<0,05

В настоящее время достаточно подробно описаны процессы, способствующие реализации агрессивного поведения опухолевого клона. Ключевым фактором в реализации метастазирования, по мнению авторов [Parkin D.M. et al., 2004; Yio J. et al., 2007] эпигелиально-мезенхимальный переход, потеря адгезивных контактов, изменение концентрации ионов, имеет значение также автономность опухолевого клона, приобретение новых свойств клетками опухолевого клона. Существует мнение [Карселадзе А.И., 2009], согласно которому, приобретение вышеописанных свойств оценивается как результат повышенной мутагенности и реализации естественного отбора внутри первично трансформированных клеток опухоли.

С целью изучения участия вариантных генов системы биотрансформации ксенобиотиков, регуляторов клеточного цикла и репарации ДНК в приобретении опухолевым клоном способности к метастазированию в настоящей работе была осуществлена попытка изучения распределения аллельных вариантов генотипов у больных РЖ с очагами метастазирования и без таковых. Для этого всех пациентов в зависимости от распространенности опухолевого процесса разделили на две группы в зависимости от наличия, либо отсутствия очагов метастазирования. Анализ результатов исследования по распределению полиморфных вариантов генотипов и аллелей генов биотрансформации ксенобиотиков первой и второй фазы, регуляторов клеточного цикла показал увеличение частоты минорных вариантов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, р53 G72C, p21 G1026A, p21 G369C у больных РЖ с выявленными очагами метастазирования по сравнению с аналогичным показателем у больных без таковых (рис. 3) при р<0,05. Анализ полиморфного статуса системы эксцизионной репарации ДНК не выявил значимых различий

в распределении полиморфных вариантов генов ХЯСС1 и ХРО у больных с очагами метастазирования и без таковых.

СУР1А1 «5 П1 05ТРЭ ЯМ |»21-1021» ПЛ-^.ЙЧ

Рис. 3. Частота встречаемости (%) «патологических» генотипов генов С5777, <35ТА// и минорных аллелей р53 С72С, р21 ОШ6А, р21 0369С, СУР1Л1 А48890, 05Т/7 А105С у больных раком желудка с метастазами и без таковых. * - достоверность различий по сравнению с больными РЖ без метастазов (р<0,05).

Полученные данные об увеличении частоты встречаемости минорных вариантов аллелей позволяют предполагать важность влияния генетических полиморфизмов изученных генов-регуляторов клеточного цикла и биотрансформации ксенобиотиков на приобретение опухолевым клоном новых свойств, позволяющих увеличивать агрессивность поведения. С целью определения количественной оценки влияния «патологических» генов на развитие очагов метастазирования была осуществлена попытка расчета рисков метастазирования (рис.4).

Рис. 4. Показатели относительного риска ((Ж) метастазирования у больных раком желудка для носителей минорных аллелей генов р53 072С, р21 ОЮ26А, р21 СгЗбЭС, йЗТТ/, СХГМ1, СУР1А1 А4В89С при р<0,05.

Интересным, на наш взгляд, представлялось оценить частоту распределения полиморфных вариантов изученных генов в зависимости от гистологического типа опухоли.

Проведенное изучение частоты распределения вариантных генотипов генов-регуляторов клеточного цикла и биотрансформации ксенобиотиков у

больных с разными гистологическими типами опухоли не выявило значимых отличий. Анализ же распределения генов эксцизионной репарации ДНК показал, что минорные варианты генов Л75£>А751С и ХЯСС1С194Т статистически ассоциированы с развитием диффузного типа рака желудка.

В ходе проведенного анализа распределения вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и регуляторов клеточного цикла в зависимости от размера опухолевого узла (стадия Т) у больных РЖ значимых отличий выявлено не было.

Авторы работ, посвященных изучению влияния полиморфизмов на развитие заболеваний, в том числе онкологической природы, высказывают мнение о том, что вклад одного генного полиморфизма в развитие патологии не является значительным и не может предопределять развитие или течение того или иного заболевания [Пирузян Л.А., 2000; Севостьянова Н.В. и др., 2005; Дмитриева А.И., 2009]. При этом каждый клинически значимый генный полиморфизм несет определенный малый эффект, сумма которых зачастую, формируя «патологические генные сети», способствует реализации патологического процесса на уровне организма.

Оценка вклада генных сетей в развитие РЖ на уровне выявления комбинаций, обладающих протективным или предрасполагающим свойствами, показала наличие подобных комбинаций во всех трех изученных системах. Так, для системы биотрансформации ксенобиотиков нами были выявлены комбинации, предрасполагающие к развитию РЖ. Примером таких сочетаний могут служить следующие комбинации: СУР 1А¡АБ^ТР! ЛСКШМИОЯТТр СУ1ЧЛ1АС/(^ГР1ЛА/ОБПЮ/С,5ГГ1 и С¥Р1А1ЛА/С57Р1АС/СБТМ0./О8ТТ1, частота встречаемости которых у больных раком желудка значимо превосходила аналогичный показатель у здоровых лиц (р<0,05), при этом риск развития РЖ при носительстве данных генотипов у здоровых индивидов возрастает в диапазоне от 3,27 до 9,39. Характерной особенностью выявленных комбинаций генов, обладающих предрасполагающими свойствами к формированию риска развития злокачественных новообразований желудка, явилось наличие двух генов в минорном варианте генотипа. Аналогичным образом выявлены и комбинации, обладающие протективным действием: СУР1АIА/Ь'08ТР 1АА/ОБТЫI/ вБТП, СУР1А1АА/С8ТР1АА/08ТМ1/(}8ГП) и СУР 1АIАА/СЗТРIАА/О8ТШ/О8ТТ0, риск развития (ОИ.) для носителей данных комбинаций колеблется в диапазоне 0,25-0,48 при р<0,05. Особенностью

протекторных комбинаций явилось наличие в них минорных генотипов генов GSTM1 и GSTTI в различных вариантах и отсутствие минорных вариантов генов CYPIA1 и GSTP1.

Проведенный анализ сочетаний генов эксцизионной репарации ДНК также выявил комбинации с выраженным протективным (XRCCI280GG/ XRCC1 399GG/XRCC1 194CC/XPD751AA) и предрасполагающим действием (XRCCÍ 280GG/XRCCI 399GG/XRCCI194CT/XPD 751 AC, XRCCI280GG/

XRCCI 399GG/XRCC1194CC/XPD 751СС, XRCCI 280GG/XRCC1 399 G А/

XRCCI 194CC/XPD 751CQ. Риск развития (OR) РЖ для носителей данных предрасполагающих сочетаний генов, особенностью которых является наличие в генотипе как минимум двух минорных аллелей, одним из которых является обязательно вариантный С-аллель гена XPD А751 С, увеличивается в диапазоне от 6 до 14 раз, при р<0,05.

При изучении сочетаний генотипов регуляторов клеточного цикла было выявлено 5 комбинаций генов, обладающих протективным действием: р53 72GG/p21 \026GAJp21 369GGIRM ТТ, р53 72GС/р21 \026GA/p21 369GG/ Rbl ТТ, р53 11GGÍp21 1026GA 1р21 369СС/Ш ТТ, р53 ПСС1р21 1026GA ¡p21 369GGIRbl ТТ и р53 12GGÍp21 I026GA/p2/ 369GG/Rbl ТС и 4 комбинации с предрасполагающим действием: р5312GG!p21 1026GG ¡p2l 369GG/Rbl ТТ, р53 12QCtp2l \Q26GG/p21 369GG/Rbl ТТ, р53ПСС/ p21 1026GG!p2¡ 369GG/Rbl ТТ, p53 12CC!p21 \026GG/p21 369GC/Rbl TT, увеличивающие риск развития злокачественных новообразований желудка при носительстве у здоровых доноров в диапазоне от 6 до 12 раз. Выявленной характерной особенностью предрасполагающих комбинаций генов эксцизионной репарации явилось наличие в них GG-генотипов гена p21 G1026А и ТТ-генотипа гена Rbl С137Т.

Изучение распределения вариантных генотипов компонентов систем биотрансформации ксенобиотиков, регуляции клеточного цикла и репарации ДНК является не случайным. Выбор этих трех систем в виде объекта исследования обусловлен сложными механизмами, взаимно связывающими эги системы функционально. Слаженная работа на уровне системы биотрансформации ксенобиотиков обеспечивает инактивацию экзо- и эндогенных генотоксических соединений и их выведение из организма.

Первая фаза системы биотрансформации ксенобиотиков является ключевым звеном активации метаболитов, реализация которой проходит при

участии цитохромов Р-450, важную роль среди которых играет изоформный белок, кодируемый геном CYP1A1 [Дмитриева А.И., 2009]. Изученный полиморфный вариант гена CYP1A1, характеризующийся заменой A—>G предопределяет повышенную ферментативную активность продукта транскрипции гена CYP1A1 [Дмитриева А.И., 2009]. Активируя широкий спектр канцерогенных веществ, изученный полиморфный вариант гена CYP1A1 способствует накоплению в клетке большого количества веществ, обладающих генотоксическими эффектами [Wei Q. et al., 1996; Buterin T. et al., 2000; Tang M.S. et al., 2000; Shimada T., 2004]. Однако активированные промежуточные метаболиты при гармоничном сопряжении двух фаз биотрансформации инактивируются в том числе глутатион-Б-трансферазами путем конъюгации [Armstrong R.N., 1997; Townsend D.M., Tew K.D., 2003]. Влияние изученных нами полиморфных вариантов генов четырех ферментов биотрансформации: CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и GSTPI на формирование предрасположенности и увеличение вероятности реализации злокачественного процесса дает возможность на основании выявленной статистической ассоциации встречаемости минорных вариантов и наличия сочетаний генотипов, обладающих явными предрасполагающими свойствами, обосновать значимость вариаций генотипов ферментов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков в развитии злокачественных новообразований желудка. При этом не вызывает сомнения, что реализация злокачественных новообразований желудка не возможна без участия многих других факторов и систем, участвующих в поддержании клеточного гомеостаза.

Наличие минорных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла делает возможным изменение уровня контроля над остановкой клеточного цикла и не обеспечивает полноценной реализации исправления генетического аппарата клетки. С-генотип гена р53 и минорные варианты генов р21 и Rbl оказывают значимое влияние на развитие злокачественных новообразований желудка, уменьшая контроль над прохождением клеточного цикла и не осуществляя элиминации измененных клеток путем апоптотической гибели [Marchenko N.D. et al., 2000], которая в норме осуществляется через р53-опосредованное увеличение экспрессии р21 и активацию каспаз [Fan G. et al. 2004; Bai L., Zhul W.G., 2006]. Важной функцией p53 в поддержании клеточного гомеостаза является контроль над реализацией репаративных процессов. Так, для

полиморфного варианта гена р53 (С-аллель), кодирующего Рго-фенотип, была показана более высокая степень контроля над активацией и реализацией основной функции репаративной системы, а для Arg-фенотипа (G-аллель) р53 - большая специфичность в запуске и реализации апоптоза клетки [Siddique М.М. et al., 2005; Cherdyntseva N.V., et al., 2010]. Регуляторы клеточного цикла запускают экспрессию генов, кодирующих компоненты системы репарации ДНК. В зависимости от степени выраженности повреждения запускаются разные системы репарации ДНК, однако, согласно имеющимся данным, чаще всего при обычных условиях обитания (без чрезмерных канцерогенных нагрузок) активируется система эксцизионной репарации, являющаяся самой ранней по времени запуска и исправляющая однонуклеотидные замены и измененные сахаро-фосфатные остовы в нити ДНК.

Существование множества изоформ генов, тонкая организация работы, многоплановое их функционирование в реализации многих процессов, протекающих в клетке, позволили рассматривать влияние полиморфизмов изученных генов как значимые факторы формирования предрасположенности к развитию новообразований желудка. Об этом могут свидетельствовать полученные нами данные по распределению генотипов и аллелей, а также результаты оценки суммарного вклада генов в комбинации, обладающие предрасполагающим или протсктивным действием.

Проведенное исследование распределения генетических полиморфизмов у больных раком желудка с разными клинико-морфологическими характеристиками выявило значимость вариантных генотипов в формировании предрасположенности к развитию рака желудка и его отдельных клинико-морфологических характеристик. При этом, однако, необходимо отметить, что вклад каждого из генов в реализацию злокачественного процесса не является определяющим для его развития. В большей степени реализации злокачественных новообразований желудка способствует формирование генных сетей, состоящих из множества «патологических» форм генов, в конечном итоге определяющих развитие процесса и характер его течения, о чем может свидетельствовать интегральный вклад суммы «патологических» генотипов в формирование высоких рисковых показателей развития злокачественных новообразований желудка.

ВЫВОДЫ

1. Частота полиморфных вариантов генов XRCC1 С194Т и XPD А751С, характеризующихся меньшим сродством к компонентам репаративного комплекса, у больных раком желудка превышает таковую у здоровых лиц.

2. При распределении вариантных генотипов генов системы регуляции клеточного цикла у пациентов со злокачественными новообразованиями желудка частота встречаемости минорных (дефицитных) вариантов генов р53 G12C,p21 G1026A и p21 G369C выше, чем у здоровых доноров.

3. Частота G-аллеля гена CYP1A1 G4889A и G-аллеля гена GSTP1 G105A у больных раком желудка увеличена по сравнению с таковой у здоровых.

4. Рисковую значимость для развития злокачественных новообразований желудка имеет носительство «патологических» вариантов следующих генов: CYP1A1 G4889A, GSTP1 G105A, XRCC1 С194Т, XPD А751С, р53 G72C, p21 G1026А и p21 G369C.

5. Частота встречаемости минорных аллелей генов XRCCl С194Т и XPD А751С у больных диффузным раком желудка выше таковой у пациентов, имеющих интестинальный тип опухоли.

6. «Патологические» варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYPIAI G4889A, GSTP1 G105A и GSTM1, минорные варианты генотипов регуляторов клеточного цикла: р53 G72C, p21 G1026А и p2l G369C статистически ассоциированы с развитием метастатических поражений у больных раком желудка, обусловливая приобретение агрессивных свойств опухолевыми клонами.

7. Влияние функционально неполноценных генов систем биотрансформации ксенобиотиков, регуляции клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК в комбинациях оказывают более выраженный предрасполагающий эффект на развитие злокачественных новообразований желудка, чем отдельный аллельный вариант гена.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 и GSTPly больных раком предстательной железы / С.С. Ракитин // Материалы Всероссийской 66-ой итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, г. Томск, 23-25 апреля 2007 г. - Томск, 2007. - С. 348-349.

2. Анализ полиморфных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Т1, Ml и PI у больных раком предстательной железы / H.A. Давыдова, А.И. Дмитриева, Н.В. Севостьянова, С.П. Селиванов, С.С. Ракитии, В.В. Новицкий // Материалы XI Российского онкологического конгресса, г. Москва, 20-22 ноября 2007 г. - Москва, 2007. - С. 224.

3. Полиморфизм генов глутатион-5-трансфераз как фактор генетической предрасположенности к раку легкого и раку предстательной железы / Т.А. Никонова, О.С. Шкода, С.С. Ракитин // Материалы Всероссийской 67-ой итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, г. Томск, 2123 апреля 2008 г. - Томск, 2008. - С. 392-393.

4. Исследование полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 и CYP1A1 у больных раком легкого / И.А. Кузнецова, С.С. Ракитин И Материалы Всероссийской 68-ой итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, г. Томск, 20-22 апреля 2009 г. - Томск, 2009. - С. 279-280.

5. Полиморфизм генов эксцизионной репарации ДНК и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных раком желудка / Н.В. Севостьянова, A.M. Некрасова, А.П. Кошель, А.И. Дмитриева, С.И. Мартов, С.С. Клоков, С.С. Ракитин II Якутский медицинский журнал. - 2009. - № 2 (26).-С. 111-113.

6. Роль генов эксцизионной репарации ДНК в патогенезе рака желудка / С.С. Ракитин, А.И. Дмитриева, С.И. Мартов, А.П. Кошель, H.H. Плотникова, Н.В. Севостьянова, И.В. Панкратов, В.В. Новицкий // Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная онкологическая программа» в рамках VII съезда онкологов России, г. Москва, 29-30 ноября 2009 г. - Москва, 2009. - С. 75-76.

7. Полиморфизм гена CYP1 AI у больных раком желудка / А.И. Дмитриева, А.П. Кошель, С.И. Мартов, Н.В. Севостьянова, С.С. Ракитин, С.С. Клоков, P.C. Лобачев, A.B. Красиоперов // Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная онкологическая программа» в рамках VII съезда онкологов России, г. Москва, 29-30 ноября 2009 г. -Москва, 2009. - С. 93-94.

8. Полиморфизм генов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков у больных раком желудка / С.И. Мартов, Н.В. Севостьянова, А.И. Дмитриева, А.П. Кошель, Е.А. Степовая, С.С. Клоков, С.С. Ракитин, Е.В. Залесная, A.B. Карпович, Е.И. Маевский // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 4. С. 30-33.

9. Анализ полиморфизма генов репарации ДНК XRCC1G280A, XRCC1 С194Т, XRCC1 G399A и XPD А751С у больных раком желудка / А.И. Дмитриева, В.В. Новицкий, С.С. Ракитин, Н.В. Севостьянова, С.А. Коломиец // Сборник материалов XIV Российского онкологического конгресса, г. Москва, 23-25 ноября 2010 г. - Москва, 2010. - С. 287-288.

10. Роль генов эксцизионной репарации ДНК и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в ранней диагностике рака желудка / А.П. Кошель, Н.В. Севостьянова, С.С. Клоков, A.B. Карпович, А.И. Дмитриева, С.С. Ракитин, С.И. Мартов, Е.В. Залесная // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2010. - Т. 3, № 4. - С. 339-343.

11. Генетический полиморфизм системы репарации ДНК у больных раком желудка с различными гистологическими типами опухоли / С.С. Ракитин, А.И. Дмитриева, В.В. Новицкий, И.А. Кузнецова, Н.В. Севостьянова // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 3. - С. 125-130.

Подписано в печать ¿5Л 20Щ г. Усл.печ.листов I. О Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № I __Тираж IОС экземпляров

Рак желудка стабильно остается на четвертом месте в структуре онкологических заболеваний в мире. Ежегодно регистрируется почти 800 тысяч новых случаев и 628 тысяч смертей от этого заболевания. В России самый-высокий показатель заболеваемости-раком желудка приходится на Новгородскую область и республику Тува; минимальные показатели» регистрируются в регионах Северного Кавказа, Магаданской области и Чукотском автономном округе. На протяжении последних лет в Томской области отмечается увеличение количества впервые выявленных случаев рака желудка, так в 2008 году было зарегистрировано 247, в 2009 - 253, а в 2010 году - 294 случая (Чиссов В.И., 2011). По уровню смертности от рака желудка Россия в ранжированном ряду 45 стран занимает 2 место среди причин смерти у мужчин и 3 место у женщин (Имянитов E.H., 2009).

В настоящее время не вызывает сомнения, что рак желудка является мультифакториальным. заболеванием, инициирующую роль в развитии которого играют многие гены, формирующие «генные сети». К структурным компонентам; формирующим «патологические» генные сети можно отнести систему биотрансформации ксенобиотиков, различные системы репарации, регуляторы клеточного цикла. Работа этих систем направлена на предупреждение повреждений генетического материала клеток, исправление возникающих нарушений и поддержание генетической стабильности организма в целом.

Ключевую роль в обеспечении индивидуальной устойчивости организма к агрессивным факторам внешней и внутренней среды играет система биотрансформации ксенобиотиков (Баранов B.C., Баранова Е. В., Иващенко И.Н., 2000; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2004), полиморфные варианты генотипов которой в определенных условиях могут предрасполагать, либо, напротив, препятствовать проявлению заболевания (Nebert D.W., Carvan M.J., 1997). В норме система биотрансформации ксенобиотиков обеспечивает безмутационное существование клетки.

В случае возникновения мутационной изменчивости включается механизм, восстанавливающий целостность генетического аппарата клетки, важнейшим представителем которой является! система-эксцизионной репарации ДНК, осуществляющая исправления наиболее часто встречающихся изменений в структуре ДНК. Репаративный синтез тесно сопряжен' и опосредованно регулируется системой- генов-регуляторов клеточного цикла.

Гены-регуляторы клеточного цикла, эксцизионной* репарации и биотрансформации ксенобиотиков, вступая в сложные взаимодействия на уровне белковых продуктов, обладающих разной конформацией, предопределенной наличием полиморфных вариантов, формируют тем самым «генные сети», обусловливающие индивидуальную восприимчивость организма к развитию злокачественных новообразований.

Цель исследования: установить роль полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла, репарации ДНК и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе рака желудка.

Задачи исследования:

1. Выявить частоту встречаемости вариантных генотипов системы, эксцизионной репарации ДНК (XRCC1 G280A, XRCC1 G399A, XRCC1 С194Т, XPD А751С) у больных раком желудка и у здоровых лиц*

2. Определить встречаемость полиморфных вариантов генов-регуляторов' клеточного цикла (р53 G72C, p21 G1026A, p21 G369C и Rbl Т137С) у больных раком желудка и у здоровых индивидов.

3. Оценить распределение полиморфных вариантов генов ферментов первой (CYP1A1 A4889G) и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков (GSTP! A105G, GSTM1 и GSTT1) у больных раком-желудка и здоровых, доноров.

4. Выявить распределение полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла, эксцизионной репарации и биотрансформации ксенобиотиков у больных раком желудка в зависимости от гистологического типа опухоли.

5. Оценить статистическую ассоциацию вариантных генов системы биотрансформации ксенобиотиков, регуляторов клеточного цикла, эксцизионной репарации- ДНК с наличием очагов метастазирования у больных раком желудка.

6. Оценить суммарный эффект вариантных генотипов изучаемых генов трех систем на формирование риска развития злокачественных новообразований желудка.

Научная новизна: В настоящей работе представлены результаты впервые осуществленного комплексного анализа роли полиморфных генов трех систем: эксцизионной репарации, регуляторов клеточного цикла, биотрансформации ксенобиотиков» в патогенезе рака желудка. Выявлена статистическая ассоциация «патологических» вариантов генов XRCC1 С194Т, XPDA751C, CYP1A1 A4889G, GSTP1 A105G, р53 G72C, p21 G1026A и p21 G369C с развитием злокачественных новообразований желудка. Получены новые данные о влиянии полиморфных вариантов генов эксцизионной репарации XRCC1С194Т и XPD А751С на формирование опухолей желудка разных гистологических типов. Показано увеличение частоты минорных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, GSTP1 и GSTM1 и регуляторов клеточного цикла р53 G72C, p21 G1026A и p21 G369C у больных РЖ с выявленными очагами метастазирования. Оценены рисковые шансы развития злокачественных новообразований желудка, а также определены риски метастазирования и формирования опухолей разного гистологического типа при носительстве патологических вариантных генотипов. Рассчитан суммарный эффект сочетаний вариантных генотипов изученных генов трех систем на развитие новообразований желудка, превосходящий вклад в формирование рака желудка единичного гена. Впервые осуществлена попытка выявить вклад генов трех систем в формирование «генной сети», приводящей к развитию злокачественных новообразований желудка.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии полиморфных вариантов генов, на развитие злокачественных новообразований! желудка, на формирование опухоли, определенного гистологического типа и очагов метастазирования. Результаты данного исследования могут быть ■ положены в основу разработки новых методов ранней диагностики, формирования групп повышенного онкологического риска, как прогностический критерий клинического течения заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Минорные аллели генов ЖСС1 С194Т, ХРБА751С, 08ТР1 АКШ, р53 (У12С, р21 (Ег1026А и р21 ОЭ69С и профицитный О-аллель цитохрома Р-450 СУР1А1 А48890 играют важную роль в этиологии и патогенезе рака желудка, поскольку частота встречаемости данных вариантных генотипов у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых доноров.

2. Функционально неполноценные варианты генов ХКСС1 С194Т, ХРО А751С, 08ТР1 А1050, р53 072С, р21 ОЮ26А и р21 0369С и Р-450 С¥Р1А1 А48890 предопределяют повышенный риск развития злокачественных новообразований желудка.

3. «Патологические» варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков СУР1А1, С5ТР1 и 08ТМ1 и минорные варианты генотипов регуляторов клеточного цикла р53 072С, р21 в! 026А, р21 С369С статистически ассоциированы с формированием метастатических очагов у больных раком желудка.

4. Минорные варианты генов ХЖХЛ С194Т и ХРЭА751С в большей степени ассоциированы с развитием диффузного гистологического типа рака желудка.

5. Суммарное предрасполагающее влияние полиморфных функционально неполноценных генов каждой из изучаемых систем: биотрансформации ксенобиотиков, регуляции клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК на формирование предрасположенности к развитию рака желудка . превышает индивидуальный эффект вариантных генотипов.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались в рамках УП съезда онкологов России (г.Москва, 2009); на XIV Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2010).

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры патофизиологии (раздел «Патофизиология тканевого роста») и кафедры биологии и генетики ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (разделы «Молекулярная генетика» и «Популяционная генетика»).

Публикации. По теме работы опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в ведущих рецензируемых журналах из «Перечня .» ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 41 таблицей. Библиографический указатель включает 261 источник, из них 76 отечественных и 185 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Частота полиморфных вариантов генов ХЯСС1 С194Т и ХРБ А751С, характеризующихся меньшим сродством к компонентам репаративного комплекса, у больных раком желудка превышает таковую у здоровых лиц.

2. При распределении вариантных генотипов генов системы регуляции клеточного цикла у пациентов со злокачественными новообразованиями желудка частота встречаемости минорных (дефицитных) вариантов генов р53 072С, р21 01026А и р21 0369С выше, чем у здоровых доноров.

3. Частота О-аллеля гена СУР1А1 04889А и О-аллеля гена 08ТР1 ОЮ5А у больных раком желудка увеличена по сравнению с таковой у здоровых индивидов.

4. Рисковую значимость для развития злокачественных новообразований желудка имеет носительство «патологических» вариантов следующих генов: СУР1А1 04889А, 08ТР1 ОЮ5А, ЖСС1 С194Т, ХРБ А751С, р53 072С, р21 ОЮ26А и р21 0369С.

5. Частота встречаемости минорных аллелей генов ХЯСО С194Т и ХРО А751С у больных диффузным раком желудка выше таковой у пациентов, имеющих интестинальный тип опухоли.

6. «Патологические» варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков СУР1А1 04889А, 08ТР1 ОЮ5А и 08ТМ1, минорные варианты генотипов регуляторов клеточного цикла: 072С, р21 01026А и р21 0369С статистически ассоциированы с развитием метастатических поражений у больных раком желудка, обусловливая приобретение агрессивных свойств опухолевыми клонами.

7. Влияние функционально неполноценных генов систем биотрансформации ксенобиотиков, регуляции клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК в комбинациях оказывают более выраженный предрасполагающий эффект в развитии злокачественных новообразований желудка, чем отдельный аллельный вариант гена.