Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Дисбаланс микроэлементов, репарация ДНК и полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1 в патогенезе рака желудка и кишечника

003168584

На правах рукописи

Некрасова Липа Михайловна

ДИСБАЛАНС МИКРОЭЛЕМЕНТОВ, РЕПАРАЦИЯ ДНК И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ С8ТТ1 И СБПП В ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ЖЕЛУДКА II КИШЕЧНИКА

14 00 16 - патологическая физиология 14 00 14-онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

Томск - 2008

003168584

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Хлусов Игорь Альбертович

доктор медицинских наук Севостьянова Наталия Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Степовая Елена Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация- Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 2008г в часов на заседании

диссертационного совета Д 208 096 01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г Томск, ул Московский тракт, 2) С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан 2008 i

Ученый секретарь диссертационного совета

< \ ГА Суханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Россия по уровню заболеваемости злокачественными новообразованиями среди других стран мира занимает 16 место у мужчин и 28 -у женщин В структуре онкологической патологии населения России рак желудка прочно занимает второе место [Старинский В В и др, 2000], рак ободочной кишки - шестое место [Трапезников НН, Двойрин ВВ, 1996] Согласно данным НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН [Писарева J1 Ф и др , 2003], в период 1990-2001 гг в Томской области заболеваемость раком различной локализации в среднем более чем в 2 раза превышала аналогичный показатель по Российской Федерации, а рак желудка у томичей встречался в среднем на 26,8% (мужчины) и 30,4% (женщины) чаще, чем по Российской Федерации в целом В подавляющем большинстве случаев опухоли диагностируются в запущенной стадии, когда самые современные методы лечения оказываются малоэффективны Так, 60-90% больных раком желудка в нашей стране выявляют в III-IV стадии заболевания, причем, удельный вес IV стадии не имеет тенденции к снижению и составляет 50-60% [Давыдов M И , 1997, Чиссов В И и др, 2003] Среди основных факторов, повышающих онкологическую заболеваемость - техногенное загрязнение окружающей среды, урбанизация питания, предшествующие заболевания Во многих странах мира (США, Германия, Дания, Австралия, Мексика, Таиланд и др ) проведены крупные государственные программы по оценке степени загрязнения окружающей среды и их влиянию на здоровье человека Хром и другие тяжелые металлы включены в списки приоритетных загрязняющих веществ рядом международных организаций, в том числе ВОЗ, ЮНЕП, Американским агентством по контролю за токсичными веществами и заболеваниями (CDC) и другими аналогичными государственными организациями

Доказано, что дисбаланс микроэлементов, как токсичных, так и эссенциальных, может приводить к структурно - функциональным изменениям, инициирующим опухолевый рост [Василевская Л С и др , 2004, Спиваковский ЮМ, Спиваковская А10 , 2005, Fox,Wang, 2007] В последнее десятилетие

активно развиваются методики оценки содержания микроэлементов в организме человека по анализу волос Результат определения микроэлементов в волосах человека дает возможность для оценки состояния его экологической ниши (жилище, вода, пища и т д), что позволяет своевременно провести санитарно-эпидемиологические и профилактические мероприятия, методика неинвазивна, не капризна, не требует дорогостоящего оборудования По результатам исследования микроэлементного баланса возможен ранний, быстрый прогноз онкологического риска у больших групп людей, особенно в районах с неблагоприятной экологической обстановкой, на крупных промышленных предприятиях с вредными условиями производства Однако, до сих пор, в литературе встречаются лишь единичные сообщения об особенностях микроэлеменгного статуса у онкологических больных [Громова О А, 2006, Ри)1то1о, 1987, ВогеНа е.а, 1997, Майа1оуа е а, 1999]

В последние годы достигнут значительный прогресс как в идентификации генов, нарушения которых ведут к развитию новообразований, так и в выяснении роли белковых продуктов таких генов в физиологии клетки Рак желудка и кишечника, как и большинство онкологических заболеваний, по своей природе являются мультифакториальными В их патогенез вовлекается множество функционально взаимосвязанных генов (генные сети), включающих наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры), второстепенные гены (гены-модификаторы), эффект которых во многом определяется средовыми факторами [Баранов ВС и др , 2000, Колчанов НА и др , 2000] В связи с этим, большое внимание уделяется генам, ответственным за биотрансформацию поступающих в организм чужеродных веществ (химических агентов, лекарственных средств, вирусов и др) и определяющим реакцию организма на неблагоприятные внешние воздействия Так, токсический эффект промежуточных метаболитов ксенобиотиков в значительной мере определяется функциональным состоянием ферментов 2-ой фазы детоксикации Сниженная активность или отсутствие таких ферментов способствует более длительному сохранению в организме промежуточных продуктов, которые могут

провоцировать и способствовать злокачественной трансформации клеток [Баранов ВС и др,2000, Alexandrie еа, 1994, Brockmollerеа, 1996]

Некоторыми авторами [To-Figueras еа, 1996, Lloyd еа, 2000, Wani е а, 2000, Liu еа, 2001] установлено, что в результате снижения функциональной активное ги белковых продуктов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков, исчезает способность гена р53 регулировать апоптоз и репарационные процессы, что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу В литературе встречаются лишь единичные сообщения

0 результатах исследования функции системы ДНК - репарации и нарушений полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке желудка л кишечника [ Бело1убова Е В., 2000, Spitz е а , 2000, Spurdle е а, 2001] Цель исследования определить роль дисбаланса микроэлементов, нарушений функции системы репарации ДНК и полиморфизма генов глутатион-S-трансфераз Т1 и М1 в патогенезе злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника

Задачи исследования:

1 Определить содержание жизненно важных и токсичных микроэлементов в волосах и операционном материале у больных со злокачественными опухолями и хроническими доброкачественными заболеваниями желудка и толстого кишечника

2 Выявить особенности системы ДНК-репарации лимфоцитов периферической крови у больных с хроническими доброкачественными заболеваниями, злокачественными опухолями желудка и толстого кишечника в зависимости от гистологического типа и распространенности опухоли

3 Изучить соотношение нормальных и патологических генотипов генов глутатион-Б-трансфераз Т1 и Ml (GSTT1 и GSTM1) у пациентов с хроническими доброкачественными заболеваниями и злокачественными опухолями желудка и толстого кишечника, установить их взаимосвязь с клинико - морфологическими особенностями опухолевого процесса

4 Определить взаимосвязь между особенностями микроэлементного статуса, нарушениями системы ДНК репарации и полиморфизмом генов С5ТТ1 и СБТМ! в патогенезе злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника

Научная новизна исследования В настоящей работе проведена комплексная оценка активности ДНК-репарации лимфоцитов периферической крови у больных раком желудка и толстого кишечника с учетом клинических особенностей злокачественного процесса и гистологического типа опухоли Установлено, что опухолевый процесс сопровождается нарушением эксцизионной системы ДНК-репарации Обосновано, что при раке желудка и толстого кишечника выраженное угнетение репаративного синтеза ДНК ассоциируется с прогрессированием опухолевого процесса и с недифференцированным типом опухоли (как наиболее злокачественной гистологической формой заболевания) Впервые проведено исследование у больных раком желудка и толстого кишечника полиморфизма генов ферментов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков (глутатион-Б-трансфераз Т1 и М1) Показано, что у данных пациентов функционально неполноценные генотипы ОЯТ'П и М1 регистрируются чаще, чем в популяционном контроле При этом при недифференцированной форме рака отмечается более высокая частота патологических генотипов вЯТЛ и М1 по сравнению с аденокарциномой и перстневидноклеточным раком Обнаружено значительное увеличение частоты патологических генотипов генов ввТЛ и М1 у больных с распространенным онкологическим процессом по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с локализованным ростом опухоли При прогрессировании рака желудка и толстого кишечника выявлен дефицит эссенциальных минеральных веществ в организме (селен, железо, медь) и перераспределение канцерогенных металлов (кадмий) в опухолевую ткань Обнаружена обратная корреляционная зависимость активности репарации ДНК лимфоцитов крови от уровня накопления шестивалентного хрома в организме

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера расширяют представления о механизмах возникновения и прогрессирования рака желудка и толстого кишечника Результаты исследования могут быть положены в основу разработки принципиально новых направлений патогенетически обоснованной профилактики, ранней диагностики и терапии злокачественных новообразований желудка и толстого кишечника

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Частота патологических генотипов ОЯ'ГП, С8ТМ1 при раке желудка и толстою кишечника выше, чем при доброкачественных заболеваниях данных органов и максимальна при недифференцированной форме опухоли и развитии метастатического процесса

2 Среди больных раком желудка и толстого кишечника преобладают пациенты со снижением и угнетением способности лимфоцитов к репарации поврежденной ДНК Нарушения эксцизионной системы ДНК-репарации наиболее выражены при недифференцированном типе опухоли и в условиях метастазирования

3 При прогрессировали рака желудка и толстого кишечника формируется дефицит эссенциальных минеральных веществ (селен, железо, медь) в организме больного и перераспределите канцерогенных металлов (кадмий) в опухолевую ткань

4 Маркер лейкоцитов С095, индекс стимуляции репарации ДНК в лимфоцитах крови и содержание микроэлементов в волосах (селен, шестивалентный хром) являются информативными неспецифическими показателями прогрессирования рака желудка и толстого кишечника

Реализация и апробация работы Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Тайланд, Бангкок,

2006 год), на VI Всероссийской научно - практической конференции «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 год)

Публикации, По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи в центральных реферируемых журналах

Объем и структура работы Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы Работа иллюстрирована 16 таблицами и двумя рисунками Библиографический указатель включает 253 источника, из них - 152 отечественных и 101 зарубежный

Характеристика клинического материала и методы исследования

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 90 больных с патологией желудка и толстого кишечника, из них 60 пациентов со злокачественными новообразованиями и 30 пациентов с доброкачественными заболеваниями данных локализаций (табл 1, табл 2) Обследованные пациенты находились на стационарном лечении на базе хирургического отделения Томского областного онкологического диспансера и в клинике Научно-исследовательского института гастроэнтерологии СибГМУ (г Северск) Диагноз в каждом случае подтверждался результатами клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследования Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями, тяжелой степенью анемии и пациенты, прожившие на момент обследования на территории Томска и области менее 6 мес Среди злокачественных новообразований аденокарцинома была верифицирована в 47 случаях (78,3%), перстневидноклеточный рак желудка - в 6 случаях (10,0%) и 7(11,7%) пациентов с раком желудка имели недифференцированную форму Среди доброкачественных изменений отмечены эрозия (13,4%) и язвенная болезнь желудка (23,3 %), полипы желудка (40,0%) и толстой кишки (13,4%), дивертикулез с дивертикулитом (3,3%) и ворсинчатая опухоль толстой кишки (6,6%)

1аблицд 1

Распределение обследованных лиц по группам наблюдения в соответствии с использованными методами исследования

Методы исследования Группы наблюдений Всего

Пациенты со злокачественными новообразования ми ЖКТ Пациенты с доброкачест венными заболевании ми ЖКТ Пациенты с доброкачествен ными новообразовани ями кожи Практически здоровые добровольцы

Общеклинические 60 30 14 — 104

Определение микроэлементов в волосах 60 30 14 100 204

Определение МИКроЭ 1СМСН- тов в операционном матерние 60 30 14 104

Оценка репарации ДНК в личфоцшах крови 60 30 100 190

Определение генов ферментов биотрансформации 60 30 100 190

Таблица 2

Распределение пациентов основных обследованных групп по локализации и стадиям

заболеваний

Стадия заболевания Желудок Прямая кишка Ободочная кишка

Доброкачественные заболевания

23 | 3 | 4

Злокачественные новообразования

1 2 1 1

II 4 2 -

Ш 16 7 8

IV 11 5 3

Группу сравнения составили здоровые лица (100 обследованных с

сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту) В ее состав были включены работники ЗАО «Метанол», медицинские работники клиник, участвовавших в исследовании, добровольцы Дополнительно набрана группа сравнения из 14 пациентов, у которых наблюдались доброкачественные

новообразования кожи, верифицированные как папилломы Во все обследованные группы больных и в контрольную группу здоровых были включены индивидуумы только европеоидного происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей [Галеева АР и др, 1998, Коршунова ТЮ и др, 2004, Martinson J J et al, 1997, Yudm N et al., 1998] Средний возраст онкологических больных оказался равным 61±8 лет, пациентов с хроническими доброкачественными заболеваниями 57±2,8 лет, здоровых доноров - 49±5 лет, что позволило сделать заключение о возможности сопоставления обследованных лиц по их возрастной характеристике Материалом для исследования полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 91, ц1 и я1), явилась ДНК, выделенная из лимфоцитов венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [Lahiri DK et al, 1992] Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER, (F 5-caa-gtc-tcc-cct-cac-tcc-cc, R 5'-gtg-cga-gtg-gct-cag-tgt-gt) и генов GSTTl (F* 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg, R 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg), GSTM1 (F 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc, R 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) [Spurdle et al, 2001] Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) генов GSTTl и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов размером 131 и 114 пн соответственно Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии, по крайней мере, одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, +/+ и +/0) Участок гена ER размером 183 пн использовали в качестве внутреннего контроля амплификации Материалом для исследования активности ДНК-репаративной системы лимфоцитов являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак, стабилизированная гепарином (25 Ед/мл) Активность системы репарации ДНК оценивали методом жидкостной сцинтилляционной

радиометрии по рекомендациям Г Д Засухиной [1978] Содержание химических элементов (цинк, медь, селен, железо, йод, ртуть, кадмий, свинец, мышьяк) в вочосах и тканях оценивали методом инверсионной вольтамперометрии [Слепченко Г Б , Захарова Э А , Черемпей Е Г, 2002], внесенным в Государственный реестр методик выполнения измерений, применяемых в сферах распространения государственного метрологического контроля и надзора В периферической крови выявляли мембранный маркер леикоцитов С095 методом проточной цитометрии (комплекс СоикегЕР1С8-ХЬ-МСЬ) с использованием флюоресцирующих моноклональных антител в условиях автоматической пробоподготовки Количественное содержание онкомаркеров СА19-9 и СА-242, циркулирующих в сыворотке крови, концентрацию кортизола и соматотропного гормона (СТГ) определяли методом иммулоферментного анализа (ИФА) с использованием наборов специфических моноклональных антител [Тиц Н, 2003] При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез [Лакин Г Ф , 1980, Сергиенко В И , Бондарева И Б , 2006] Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова) При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием ^критерия Стьюдента Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни(и-тест) Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г Ф , 1989] При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий Пирсона, при условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали двусторонний критерий Фишера Относительный риск (ОК) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывался по стандартной формуле ОИ=а/Ь х с1/с, где а и Ь - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и й и с - количество человек в контрольной

группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип (Ж указан с 95%-ным доверительным интервалом [Флейс Д , 1989] С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г) Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (5%)

Результаты исследования и их обсуждение

Вопросы, касающиеся молекулярно-биологических аспектов возникновения и развития неопластических процессов в желудочно-кишечном тракте, относятся к самым актуальным проблемам современной онкологии Это связано как с прогрессивным ростом заболеваемости и смертности населения от опухолей ЖКТ, так и с трудностями своевременной диагностики и низкой эффективностью существующих методов противоопухолевого лечения [Зырянов Б Н и др, 1997, Чиссов В И , Старинский В В , 2000, Мерабишвили В М , 2001] При этом особый интерес к функциональному состоянию репаративной системы ДНК лимфоцитов обусловлен не только тем фактом, что они принимают непосредственное участие в реализации иммунного надзора, но и тем обстоятельством, что при опухолевом процессе иммунокомпетентные клетки сами по себе являются мишенью

В проведенном нами исследовании выявлено снижение способности лимфоцитов периферической крови к репаративному синтезу ДНК у пациентов с хроническими заболеваниями желудка и толстого кишечника (ИС ДНК-репарации в данной группе составлял 83 % от уровня данного показателя у здоровых лиц) Выявленное прогрессивное снижение интенсивности репаративного синтеза ДНК у больных раком желудка и толстого кишечника от I к IV стадии было связано, по всей видимости, с истощением функциональной активности ферментативной системы ДНК-репарации на поздних этапах развития опухоли В пользу этого предположения говорит глубокое угнетение репаративного синтеза ДНК у больных с распространенным злокачественным

процессом В целом, проведенное исследование показало, чго у обследованных пациентов со злокачественными новообразованиями желудка и толстого кишечника отмечалось снижение вплоть до угнетения способности лимфоцитов к репарации ДНК, степень которого зависела 1) от стадии заболевания, 2) от распространенности злокачественного процесса, 3) от гистологического типа опухоли Уменьшение И С репарации ДНК в лимфоцитах крови позволяет про1 позировать ухудшение клинического состояния пациента (г= -0,44, р<0,002) Анализ полиморфизма генов 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков (С8ТМ1 и СБТИ) позволил выявить ряд закономерностей патогенеза рака ЖКТ (габлЗ) Исследованные нами гены 05ТТ1 и ОБ ГМ1 кодируют две различные формы глутатион-Б-трансфераз — Т1 и М1 Эти ферменты участвуют во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков В настоящее время известны аллельные варианты генов СБТИ и С5ТМ1, так называемые нулевые аллели, которые на уровне фенотипа проявляются отсутствием белковых продуктов Поскольку данные ферменты являются важными компонентами системы детоксикации, гомозиготность по нулевому аллелю одного или другого гена может быть связана с повышенной восприимчивостью организма к вредным воздействиям и, как следствие, с увеличением риска возникновения злокачественной опухоли

В группе больных раком желудка и толстого кишечника, как показали результаты настоящего исследования, отмечается более высокая встречаемость нуль-генотипов С8ТТ1 и С8ТМ1, чем в контроле Значения (Ж свидетельствуют об ассоциации нуль-генотипов с предрасположенностью к раку, причем генотип 0/0 ОЗТ'П обладает большей рисковой значимостью, чем 0/0 ОБТМ! (ОК=5,99, С195%=1,16-3,32 и СЖ=1,96, С195%=3,10-11,73, соответственно) Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют, что носители делеции генов СЗТ'П и С8ТМ1 больше подвержены риску рака желудка и толстого кишечника, чем носители нормального генотипа СЙТТ1(+) и 08ТМ1(+) Представляется очевидным, что в развитии онкопатологии имеет значение баланс активностей различных глутатион-Б-трансфераз, поскольку они имеют перекрывающуюся субстратную специфичность и некоторые из них

полиморфны [Ляхович В В и др, 1997, Reszka, Wasowicz, 2001] Риск возникновения опухоли, связанный с нулевыми генотипами GSTT1 и GSTM1, может снижаться за счет активности других GST.

Таблица 3

Частота нулевых (0/0) и ненулевых (+) генотипов ОвТП и 05ТМ1 у больных с _патологией желудочно-кишечного тракта и у здоровых лиц _

Ген Генотип Здоровые (n=100) Больные с хроническими заболеваниями ЖКТ (п=30) Больные раком желудка и толстого кишечника (п=60)

n | % п % п %

GSTT1 0/0 15 15 19 63,4 49 81,7

+ 85 85 11 36,6 11 18,3

?<?.P — — хМ,54 pi=0,215 Х?=34,51 рг=0,000 ■¿=\ 8,78 р2=0,000

OR — — — — — 5,99

GSTM1 0/0 43 57 18 60 35 58,3

+ 43 57 22 30 25 32,7

X?.p — — 5^=0,02 pi=0,889 5^=7,20 pi=0,007 Х?=4,65 р2=0,031

OR — | — | — 1,96

Примечание pi - уровень статистической значимости различий параметров, достигнутый с помощью теста Хи-квадрат с поправкой Йейтса по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров р2 - уровень статистической значимости различий параметров с аналогичными показателями у больных с хроническим процессами ЖКТ

Возможный механизм опухолевой трансформации клеток на фоне высокого уровня нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 состоит в следующем функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-Б-трансферазы 01 и ц1, кодируемые нулевыми генотипами GSTT1 и GSTM1, способствуют накоплению большого количества активированных канцерогенов В результате этого образуются ДНК-аддукты, которые вызывают повреждения ДНК, не подвергающиеся репарации [Ryberg et al, 1999, Miller et al, 2002] Ранее несколькими исследователями было показано, что в клетках, поврежденных эпоксидами диола бензпирена, возникает мутация в гене р53, вследствие чего исчезает способность гена р53 останавливать клеточный цикл для репарационных процессов [Lloid et al, 2000, Warn et al,

2000, Liu et a!, 2001], что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу

Был проведен анализ взаимосвязи полиморфизма изучаемых генов GSTT1 и GSTM1 с гистологическим типом опухоли, стадией злокачественного процесса, наличием очагов метастазирования, прогнозом заболевания Значение таких оценок состоит в том, что они указывают на возможное участие исследуемых генов в патогенетических механизмах, лежащих в основе клинических проявлений заболевания При изучении особенностей распределения генотипов GSTT1 и GSTM1 у больных с разными гистологическими типами опухоли, нами было показано увеличение частоты нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 как среди больных с недифференцированным раком (71,5% и 71,4% соответственно), так и среди пациентов с аденокарциномой (67,7% и 74,2% соответственно) по сравнению с контрольными значениями (15% и 43% соответственно) Однако, сравнение частоты встречаемости 0/0-генотипов GSTT1, GSTM1 и значения OR показали, что значимость данных генотипов оказалась выше для возникновения и развития недифференцированного рака, который, в свою очередь, является более агрессивной опухолью и приводит к раннему неблагоприятному исходу При этом до сих пор нет точных сведений, объясняющих причину возникновения и механизм развития того или иного гистологического типа опухоли

С клинической точки зрения, метастазирование представляет собой важнейший этап в патогенезе злокачественных опухолей Это свойство злокачественного онкологического процесса в значительной степени зависит от свойств первичной опухоли, а также от активности процесса неоангиогенеза и подвижности опухолевых клеток [Meyer, Hart, 1998, Георгиев Г П, 2000, Пожарисский К М , Леенман Е Е , 2000, Engers, Gabbert, 2000, Аничков Н М , 2003] Проведенное исследование показало значимое превышение частот нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 у больных раком желудка и толстого кишечника с очагами метастазирования относительно аналогичных показателей у больных без метастазов (табл 4)

Таблица 4

Частота нулевых (0/0) и ненулевых (+) генотипов 08ТТ1иС8ТМ1у больных с раком

желудка и толстого кишечника

Ген Генотип пациенты * Р

без метастазов п=8 с метастазами п=52

ОБТП 0/0 2 47 4,55 0,033

6 5

СБТМ! 0/0 1 39 4,56 0,033

+ 7 13

Примечание р - уровень статистической значимости различии параметров, согласно гесту Хи-квадрат с поггравкой Иейгса, по сравнению с аналогичными показателями у больных с метастазами

Следует отметить, что риск метастазирования опухоли для носителей нулевого генотипа С8ТТ1 составил 8,22 (СЬ5,4 3,96-17,26), С8ТМ1 - 2,73 (С19,% 1,47-5,09) В доступной литературе мы не встретили данных по распределению патологических генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в зависимости от клинических особенностей опухолевого процесса, таких как стадия онкологического заболевания, распространенность первичного опухолевого узла, наличие очагов метастазирования По результатам собственного исследования считаем возможным предположить, что нулевые генотипы ОБТП и С5ТМ1, кодирующие функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков (глутатион-Я-трансферазы Т1 и М1), способствуют более длительному сохранению в организме активных промежуточных метаболитов Эти продукты обмена, обладающие мутагенными и канцерогенными свойствами, могут не только провоцировать возникновение злокачественной опухоли, но и способствовать ее метастазированию и прогрессированию заболевания Метастазирование злокачественных новообразований является динамическим, многоэтапным, каскадным процессом Для образования метастатического очага необходимо разъединение, обособление малигнизированных клеток с полной утратой межклеточных кадхерин-катениновых контактов и выход их из первичного опухолевого узла [Георгиев Г П , 2000, Аничков Н М , 2003, Луценко С В и др , 2003, Ег^еге, СаЬЬеП, 2000]

Можно обсуждать следующие гипотезы возникновения метастазов на фоне высокой частоты функционально неполноценных генотипов СБТП и С8ТМ1 1) Дефект ферментов биотрансформации ксенобиотиков (в частности, глутатион-Б-трансфераз) приводит к повышенной восприимчивости клеток к повреждающим воздействиям окружающей среды, что способствует накоплению мутагенных и/или канцерогенных веществ, вызывающих мутации в генах, кодирующих соединения, образующие плотные межклеточные контакты Вследствие этого происходит ослабление сил сцепления между клетками и последующий их отрыв друг от друга, в конечном итоге образуется метастатический очаг, 2) Изменение структуры фермента, например глутатион-Б-трансферазы Т1 и/или М1, может привести к изменению его субстратной специфичности, вследствие чего фермент будет метаболизировать эндогенные соединения, участвующие в образовании плотных межклеточных контактов В результате - снижаются силы сцепления между клетками, опухолевые клетки будут легко отрываться друг от друга и давать новые очаги. Таким образом, блокирование работы ферментов второй фазы биотрансформации приводит к снижению степени дифференцировки опухолевых клеток, повышению их пролиферативной активности, а также, увеличивает способность трансформированных клеток к метастазированию, что определяет прогрессию опухолевого процесса Полученные нами результаты свидетельствуют о важной роли функционально неполноценных аллелей генов, кодирующих ферменты фазы 2 биотрансформации ксенобиотиков, в патогенезе рака желудка и толстого кишечника Такие особенности биологии ферментов биотрансформации ксенобиотиков, как множественность форм, перекрывающаяся субстратная специфичность, позволяют существенно восполнить дефекты индивидуального фермента в метаболизме ксенобиотиков активностью других Поэтому в условиях нормального состояния окружающей среды риск развития заболевания, обусловленный данными ферментами, может быть минимальным Загрязнение окружающей среды, сопряженное с дисбалансом системы детоксикации ксенобиотиков, возрастанием вероятности активирования

онкогенов или инактивирования генов-супрессоров опухоли может иметь важные последствия для эпидемиологии злокачественных опухолей в силу широкой распространенности полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в популяции европеоидов (40-60 и 10-20% носителей гомозиготной делеции GSTM1 и GSTT1, соответственно) [Zong et al, 1991, Warholm et al, 1995, Deakin et al, 1996, Garte et al, 2001] Существует необходимость исследования в качестве маркеров предрасположенности к раку других форм ферментов биотрансформации ксенобиотиков, а также онкогенов и генов-супрессоров опухоли Такой подход сделает возможным выделение в популяциях или производственных контингентах с вредными условиями труда групп повышенного риска для организации профилактических мероприятий

Содержание микроэлементов в волосах отражает микроэлементный статус организма в целом, пробы волос являются интегральным показателем минерального обмена и условий окружающей среды

Выполненное исследование показало относительное благополучие по содержанию токсичных веществ в волосах жителей г Томска Кадмий и мышьяк накапливаются в меньшей степени по сравнению с уровнем их накопления у населения других регионов, в том числе соседних сибирских городов (Новосибирск, Красноярск) С другой стороны, отмечается выраженное снижение, по сравнению с другим регионами, среднего содержания в волосах жителей г Томска жизненно важных элементов, таких как цинк и селен При этом концентрация цинка, особенно у мужчин, оказалась ниже всех рекомендуемых значений для нормальной жизнедеятельности организма

При анализе содержания микроэлементов в волосах пациентов со злокачественными опухолями желудка и толстого кишечника не было выявлено статистически значимых групповых различий соответствующих величин между мужчинами и женщинами, а также и в группах пациентов с разными локализациями первичного опухолевого очага Это позволило объединить исследуемые группы Кроме того, согласно корреляционному анализу по Спирмену, среди 10 микроэлементов, исследованных в волосах здоровых

добровольцев, тесная зависимость их концентрации от возраста установлена только для кадмия (г=0,33, р<0,036) Поскольку не выявлено статистически значимых колебаний его абсолютного содержания в различных группах наблюдения, различия в возрасте обследуемых здоровых и больных людей можно было не учитывать Установлено, что в волосах больных раком желудка и толстого кишечника различных стадий отмечалось значительное снижение, по сравнению с региональными показателями у здоровых лиц, абсолютных концентраций как жизненно-важных, так и токсичных микроэлементов меди - в 2 раза, железа, 6-валентного хрома и свинца - в 2,5 раза Особое внимание обращало прогрессивное снижение содержания селена на 24-79 % у пациентов со злокачественными новообразованиями, относящихся к 4—ой клинической группе, достигавшее статистических различий при сравнении не только с больными, страдающими доброкачественными заболеваниями (как в случае с медью), но и с больными 3-ей клинической группы раковых больных (табл 5) Параллельно с уменьшением абсолютного содержания эссенциальных и токсичных микроэлементов в волосах, имело место однонаправленное снижение абсолютного содержания аналогичных микроэлементов в тканях злокачественных новообразований, достигавшее статистических различий в уровнях свинца и цинка Вызывает интерес практически одинаковое среднее содержание исследуемых химических элементов в доброкачественных новообразованиях эпителия кожи и слизистой ЖКТ Возможно, этот факт является отражением единых механизмов дисбаланса минерального гомеостаза и химического канцерогенеза в различных компартментах эпителиальной ткани, что может быть в дальнейшем использовано для разработки менее инвазивных способов диагностики и прогностики эпителиальных новообразований Резкое уменьшение абсолютного содержания жизненно важных микроэлементов в опухолевой ткани, по сравнению с их содержанием в волосах, обусловило наш интерес к сравнению их процентного соотношения с относительным содержанием токсичных металлов (табл 6)

Таблица 5

Содержание химических элементов в волосах пациентов различных групп наблюдения, X + ш

№ п п Исследуемая группа Содержание элементов мг/кг

Цинк Медь Селен Жечезо Иод Хром 6* Ртуть Кадмий Свинец Мышьяк, х Ш3

Здоровые 122 66±6 73 12 13±1 37 0 90 ± 0 05 23,31±1 24 2 06 ±0 38 1 36 ±0 34 0,08 ± 0 03 0 07 ± 0 02 1 72 ± 0,24 2 90 ±0 18

2 Пациенты с хроническими доброкачественными заболеваниями желудка и кишечника 143 77±18 43 11 18±2 03 0 44 ± 0 09 р1<0 006 19 50±5 50 2,32 ±0 47 2 26 ± 1,22 0 17 ±0 09 0 90 ± 0 31 менее 5

3 Пациенты со злокачественными опухолями желудка и кишечника, 3-я клиническая группа 118 63±8 71 6 20 ±0 31 р1<0 001 р2<0 002 0 69 ±0 08 рКО 03 9 06±130 рЮОО! 2 74 ±0 55 0 57 ±0 09 р1<0 007 0 12 ± 0 05 0 05 ±0 01 0 72 ±0 10 р КО 006 менее 5

4 Пациенты со злокачественными опухолями желудка и кишечника, 4-ая клиническая группа 126 31±14 45 6,01 ±0 53 р1<0 04 р2<0 03 0 19 ±0 05 рКО 001 р2<0 05 р3<0 001 9 87±1 11 р1<0 001 3 46± 1,30 0 49 ±0 12 р1<0 04 0 16 ±0,09 0 05 ±0 02 0 67 ± 0 19 р1<0 0ч менее 5

Примечание отмечены статистические рахчичия согласно 1-критерига Стыодеггга р1 - с I группой р2 - со 2-ой, рЗ - с З-сй группой наблюдения

Таблица 6

Относительное содержание микроэлементов в волосах и тканях у пациентов из различных групп наблюдения ( % от общего количества исследованных минеральных веществ), X

Исследуемая группа Биосубстрат Цинк Медь Хром ь+ Кадмий Свинец

Здоровые добровольцы волосы 89 8,7 1 0,05 1,25

новообразова ния кожи 84 9,5 5,4* 0,1 1

Пациенты с доброкачественными заболеваниями желудка и кишечника волосы 91 7 1,4 0,1 0,5

операцион ный материал 84,5 6 83* 0,2 0,8

Больные со злокачественными опухолями, 3-я клиническая группа волосы 94 4,9 0,45 0,05 0,6

опухолевая ткань 90 8,9* 0,5 0,15* 0,45

Больные со злокачественными опухолями, 4-ая клиническая группа волосы 94,5 4,5 0,45 0,05 0,5

опухолевая ткань 90,5 8,3 0,7 0,15* 0,35

Примечание *) - отмечены статистически значимые различия с соответствующими показателями в волосах согтасно и-кригерию Манна-У етни

Действительно, в доброкачественных новообразованиях кожи и ЖКТ, в отличие от злокачественных, отмечалось 3-4-кратное суммарное накопление (с 2-2,3 % в волосах до 6,5-9,5 % в опухолевой ткани) токсичных металлов (хром, кадмий, свинец) Относительное повышение уровня 6-валентного хрома достигало статистических различий В клетках злокачественных опухолей, в основном, возрастало относительное содержание кадмия, по-видимому, за счет перераспределения в организме, поскольку уровень кадмия в волосах (г = - 0,3, р<0,05) обратно коррелировал со стадией заболевания Канцерогенный и цитотоксический эффекты хрома могут быть одним из механизмов нарушения клеточного гомеостаза, обусловливающих опухолевую профессию и селекцию злокачественных штаммов опухолевых клеток ЖКТ, что ухудшает течение

заболевания и клинический прогноз В то же время, согласно полученным нами результатам, снижение концентрации 6-валентного хрома в опухоли представляется неблагоприятным прогностическим признаком Таким образом, в динамике возникновения и прогрессирования опухолевой патологии можно выделить следующие патофизиологические процессы

- перераспределение канцерогенных металлов в опухолевую ткань Аналогичные результаты мы встретили и у других исследователей, при других локализациях рака, например, молочной железы [ВогеПа е а,1997] Процесс перераспределения токсичных элементов в опухолевую ткань имеет как негативное, так и защитно-приспособительное значение (через стимуляцию процессов апоптоза),

снижение в опухолевых клетках абсолютного содержания антиокислительных элементов (цинк, медь) Однако, у больных 3-й клинической группы в опухолевой ткани практически в 2 раза (р<0,05) увеличивалось относительное содержание меди по сравнению с таковым в волосах Процессы накопления меди в опухолевой ткани имеют, по-видимому, общебиологическое значение, поскольку выявлены ранее в бурно растущих перевиваемых аденокарциномах у мышей [Тимакин Н П и др , 1974]

Среди других изученных лабораторных показателей выявлено, что у пациентов со злокачественными опухолями на 72-76% увеличивался уровень С095 на лейкоцитах крови При этом отмечалась прямая корреляция экспрессии СБ95 маркера на лейкоцитах крови со стадией опухолевой патологии (г = 0,48, р<0,013) Согласно полученным нами данным, только у 6(10%) (3, 2 и 1 пациента соответственно с аденокарциномой желудка, сигмовидной и прямой кишки) из 60 больных раком отмечалось превышение рекомендуемых уровней онкомаркеров карцином СА19-9 и СА242, максимально достигавшее 394 ЕД/мл Показатели не несли прогностического значения, поскольку не коррелировали со стадией заболевания и клинической группой пациентов Таким образом, маркер лейкоцитов С095, ИС репарации ДНК лимфоцитов и содержание микроэлементов в тканях являются информативными

неспецифическими показателями прогрессирования злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника

ВЫВОДЫ

1 У больных раком желудка и толстого кишечника выявляется дефицит жизненно необходимых микроэлементов в волосах (селен, железо, медь) и перераспределение токсичных металлов (кадмий) в опухолевую ткань Степень нарушений микроэлементного баланса возрастает по мере прогрессирования опухоли

2 В процессе возникновения и прогрессирования рака желудка и толстого кишечника происходит снижение активности репарации ДНК лимфоцитов периферической крови Угнетение ДНК-репарации определяется при недифференцированном гистологическом варианте и при метастазировании опухоли

3 У больных раком желудка и толстого кишечника частота патологических генотипов генов глутатион-Б-трансфераз Tl, Ml статистически значимо повышается, достигая максимальных значений при метастазировании и недифференцированной форме опухоли

4 Согласно корреляционному анализу, маркер лейкоцитов CD95, индекс стимуляции репарации ДНК и содержание микроэлементов в волосах (селен, шестивалентный хром), являются информативными неспецифическими показателями прогрессирования рака желудка и толстого кишечника

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Antipov, S A Novel Technologies to determine microelements status and real biological age are the basis of diseases diagnostics and premature aging prophylaxis / Antipov S A , Choukhnova D L , Nekrasova A M , Slepchenko G В , Khlusov I A // Proceedings of International Scientific Interdisciplinary Workshop "New Technology m Integrative Medicine and Biology", "Stress and Extreme Conditions" Bangkok-Pattaya, Thailand, 2006 - P 7

2 Некрасова, A M Полиморфизм генов ферментов 2-ой фазы дстоксикации ксенобиотиков у больных злокачественными новообразованиями ЖК'Г / A M Некрасова, H В Севостьянова,

И Л Хлусов , Г К Жерлов, В В Новицкий // Якутский медицинский журнал - 2007 -№4(20) -С 30-33

3 Некрасова, А М Лабораторные показатели как пато1 енетические маркеры прогрессироваиия рака пищеварптелыюго тракта / А М Некрасова, Н В Севостьянова, И А Хлусов, Г К Жерлов, В В Новицкий // Якутский медицинский журнал -2007 -№4(20) -С 46-51

4 Хлусов, И А Баланс микроэлементов и показатели гомеостаза как прогностические критерии при прогрессировании рака пищеварительного тракта / И А Хлусов, А М Некрасова, Г Б Сленчснко, Г К Жерлов, С А Коломиец, А В Карпович, Т Т Радзивил // Сибирский онкологический журнал - 2007 - №4 -С 72-81

5 Некрасова, А М Полиморфизм генов ферментов 2-ой фазы детоксикации ксенобиотиков у больных злокачественными новообразованиями ЖКТ / А М Некрасова, Н В Ссвостьянова, И А Хлусов, Г К Жерлов, Г Ь Сленченко, В В Новицкий // «Молекулярная диагностика -2007» - 6-ая всероссийская научно - практическая конференция с международным учасшем - Москва, 2007 - Т III - С 380 - 381

6 Некрасова, А М Особенности репаративного синтеза ДНК у больных со злокачественными новообразованиями желудочно - кишечного траста / А М Некрасова, II В Ссвостьяиова, И А Хлусов, Г К Жерлов, Н Н Плотникова, Г Б Слспченко, В В Новицкий // «Молекулярная диапюстика - 2007» -6-ая всероссийская научно - практическая конференция с международным участием - Москва, 2007 - Т III- С 378-379

7 Хлусов, И А Особенности репарагивного синтеза ДНК у больных со злокачественными новообразованиями желудочно - кишечного тракта / И А Хлусов, А М Некрасова, Г К Жерлов, II Н Плотникова, Н В Севостьянова, Г Б Слепченко, В В Новицкий // Вестник Новосибирского государственного университета 2008 - Т 6, Вып 1, С 11-15

Список сокращений

АОС - антиоксидангная система АФК - активные формы кислорода

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ИС - индекс стимуляции

ИФА - иммуноферментный анализ ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПАУ - полициклические ароматические ПОЛ - перекисное окисление липидов

углеводороды ФНО - фактор некроза опухоли

ФБК - ферменты биотрансформации ОБТ - глутатион-5-трансферазы

ксенобиотиков ОЯ - относительный риск

Подписано в печать¿2.0^200$ г. Уел печ листов 0,Печать на ризографе Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г Томск, Московский тракт, 2, тел 53-04-08 Заказ № Тираж Ю0 экземпляров

Россия по уровню заболеваемости злокачественными новообразованиями среди других стран мира занимает 16 место у мужчин и 28 - у женщин. В структуре онкологической патологии населения России рак желудка прочно занимает второе место [Старинский В.В. и др., 2000], рак ободочной кишки - шестое место [Трапезников Н.Н., ДвойрииВ.В., 1996]. Согласно данным НИИ онкологии ТЫЦ СО РАМН [Писарева Л.Ф. и др., 2003], в период 1990-2001 гг. в Томской области заболеваемость раком различной. локализации , в среднем более чем в 2 раза превышала аналогичный показатель по Российской Федерации, а рак желудка у томичей встречался в среднем на 26,8% (мужчины) и 30;4% (женщины) чаще, чем-по Российской Федерации в целом.

В подавляющем . большинстве случаев опухоли диагностируются в запущенной стадии, когда самые современные методы лечения оказываются малоэффективны. Так, 60-90% больных раком желудка1 в нашей стране выявляют в Ш-Щ стадии заболевания, причем, удельный вес IV стадии не имеет тенденции к снижению и составляет 50-60% [Давыдов М.И., 1997; Чиссов В.И. и др., 2003]

Среди основных факторов j повышающих онкологическую заболеваемость - техногенное загрязнение окружающей среды, урбанизация питания; предшествующие заболевания. Во многих странах мира (США, Германия, Дания,-Австралия, Мексика, Таиланд и др.) проведены крупные государственные программы по оценке степени загрязнения окружающей средыи их влиянию на здоровье человека. Хром и другие тяжелые металлы включены, в списки приоритетных загрязняющих веществ: рядом-международных организаций., в том числе ВОЗ, ЮНЕП, Американским агентством по контролю за токсичными веществами и заболеваниями (CDC) и другими аналогичными государственными организациями.

Доказано, что дисбаланс микроэлементов, как токсичных, так и эссенциальных, может приводить к структурно - функциональным изменениям, инициирующим опухолевый рост [Василевская JI.C. и др., 2004; Спиваковский Ю.М., Спиваковская А.Ю., 2005; Fox,Wang, 2007]. В последнее десятилетие активно развиваются методики оценки содержания микроэлементов в организме человека по анализу волос. Результат определения микроэлементов в волосах человека дает возможность для оценки состояния его экологической ниши (жилище, вода, пища и т. д.), что позволяет своевременно провести санитарно-эпидемиологические и профилактические мероприятия, методика неинвазивна, не капризна, не требует дорогостоящего оборудования. По результатам исследования микроэлементного баланса возможен ранний, быстрый прогноз онкологического риска у больших групп людей, особенно в районах с неблагоприятной экологической обстановкой, на крупных промышленных предприятиях с вредными условиями производства. Однако, до сих пор, в литературе встречаются лишь единичные сообщения об особенностях микроэлементного статуса у онкологических больных [Fujimoto, 1987; Borella е.а., 1997; Magalova е.а., 1999; Громова О.А., 2006].

В последние годы достигнут значительный прогресс как в идентификации генов, нарушения которых ведут к развитию новообразований, так и в выяснении роли белковых продуктов таких генов в физиологии клетки. Рак желудка и кишечника, как и большинство онкологических заболеваний, по своей природе являются мультифакториальными. В их патогенез вовлекается множество функционально взаимосвязанных генов (генные сети), включающих наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры), второстепенные гены (гены-модификаторы), эффект которых во многом определяется средовыми факторами [Баранов B.C. и др., 2000; Колчанов Н.А. и др., 2000]. В связи с этим, большое внимание уделяется генам, ответственным за биотрансформацию поступающих в организм чужеродных веществ (химических агентов, лекарственных средств, вирусов и др.) и определяющим реакцию организма на неблагоприятные внешние воздействия. Так, токсический эффект промежуточных метаболитов ксенобиотиков в значительной мере определяется функциональным состоянием ферментов 2-ой фазы детоксикации. Сниженная активность или отсутствие таких ферментов способствует более длительному сохранению в организме промежуточных продуктов, доторые могут провоцировать и способствовать злокачественной трансформации клеток [Alexandrie е.а., 1994; Brockmoller е.а., 1996; Баранов B.C. и др., 2000].

Некоторыми авторами [To-Figueras е.а., 1996; Lloyd е.а., 2000; Wani е.а., 2000; Liu е.а., 2001] установлено, что в результате снижения функциональной активности белковых продуктов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков, исчезает способность гена р53 регулировать апоптоз и репарационные процессы, что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу. В литературе встречаются лишь единичные сообщения о результатах исследования функции системы ДНК - репарации и нарушений полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке желудка и кишечника [Белогубова Е.В., 2000; Spitz е.а., 2000; Spurdle е.а., 2001].

Цель исследования: определить роль дисбаланса микроэлементов, нарушений системы репарации ДНК и полиморфизма генов глутатион-S-трансфераз Т1 и Ml в патогенезе злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника.

Задачи исследования: 1. Определить содержание жизненно важных и токсичных микроэлементов в волосах и операционном материале у больных со злокачественными опухолями и хроническими доброкачественными заболеваниями желудка и толстого кишечника.

2. Выявить особенности системы ДНК-репарации лимфоцитов периферической крови: у больных с хроническими доброкачественными ^ заболеваниями, злокачественными опухолями желудка- и толстого, кишечника в зависимости от гистологического типа и распространенности опухоли. :

3. Изучить соотношение нормальных и патологических генотипов генов глутатион-8-трансфераз Т1 и Ml (GSTT1 и GSTM1) у пациентов с хроническими доброкачественными заболеваниями и злокачественными опухолями желудка, и толстого кишечника^ установить их взаимосвязь с клинико - морфологическими особенностями опухолевого процесса.

4. Определить взаимосвязь между особенностями микроэлементного статуса, нарушениями системы репарации ДНК и полиморфизмом генов GSTT1 и GSTM1 в патогенезе злокачественных опухолей желудка, и толстого кишечника.

Научная новизна. В настоящей работе проведена комплексная оценка активности ДНК-репарации лимфоцитов периферической крови у больных раком желудка и толстого кишечника с учетом клинических особенностей злокачественного процесса и гистологического типа опухоли. Установлено, что опухолевый процесс сопровождается нарушением эксцизионной системы ДНК-репарации. Обосновано, что при раке желудка и толстого кишечника выраженное угнетение репаративного синтеза ДНК ассоциируется с прогрессированием опухолевого процесса и с недифференцированным типом опухоли (как наиболее злокачественной гистологической формой: заболевания). Впервые проведено исследование у больных раком желудка и толстого кишечника полиморфизма генов ферментов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков (глутатион-S-трансфераз Т1 и Ml). Показано, что у данных пациентов функционально неполноценные генотипы GSTT1 и Ml регистрируются чаще, чем в популяционном контроле. При этом при недифференцированной форме рака отмечается более высокая частота патологических генотипов GSTT1 и Ml по сравнению с аденокарциномой и перстневидноклеточным раком. Обнаружено значительное увеличение частоты патологических генотипов генов GSTT1 и Ml у больных с распространенным онкологическим процессом по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с локализованным ростом опухоли. При прогрессировании рака желудка и толстого кишечника выявлен дефицит эссенциальных минеральных веществ в организме (селен, железо, медь) и перераспределение канцерогенных металлов (кадмий) в опухолевую ткань. Обнаружена обратная корреляционная зависимость активности репарации ДНК лимфоцитов крови от уровня накопления шестивалентного хрома в организме.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера расширяют представления о механизмах возникновения и прогрессирования рака желудка и толстого кишечника. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки принципиально новых направлений патогенетически обоснованной профилактики, ранней диагностики и терапии злокачественных новообразований желудка и толстого кишечника. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота патологических генотипов GSTT1, GSTM1 при раке желудка и толстого кишечника выше, чем при доброкачественных заболеваниях данных органов и максимальна при недифференцированной форме опухоли и развитии метастатического процесса.

2. Среди больных раком желудка и толстого кишечника преобладают пациенты со снижением и угнетением способности лимфоцитов к репарации поврежденной ДНК. Нарушения эксцизионной системы ДНК-репарации более выражены при недифференцированном типе опухоли и в условиях метастазирования.

3. При прогрессировали рака' желудка и кишечника формируется дефицит эссенциальных минеральных веществ (селен, железо, медь) в организме больного и перераспределение канцерогенных металлов (кадмий) в опухолевую ткань.

4. Маркер лейкоцитов CD95, индекс стимуляции репарации ДНК в лимфоцитах крови и содержание микроэлементов в волосах (селен, шестивалентный хром) являются информативными неспецифическими показателями прогрессирования злокачественных неоплазий желудка и толстого кишечника.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Тайланд, Бангкок, 2006, год), на VI Всероссийской научно - практической конференции «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 год).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи в центральных реферируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами и одним рисунком. Библиографический указатель включает 248 источников, из них - 160 отечественных и 88 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. У больных раком желудка и толстого кишечника выявляется дефицит жизненно необходимых микроэлементов в волосах (селен, железо, медь) и перераспределение токсичных металлов (кадмий) в опухолевую ткань. Степень нарушений микроэлементного баланса усугубляется по мере прогрессирования опухоли.

2. В процессе возникновения и прогрессирования рака желудка и толстого кишечника происходит снижение активности репарации ДНК лимфоцитов периферической крови. Угнетение ДНК-репарации определяется при недифференцированном гистологическом варианте и при метастазировании опухоли.

3. У больных раком желудка и толстого кишечника частота патологических генотипов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml статистически значимо повышается, достигая максимальных значений при метастазировании и недифференцированной форме опухоли.

4. Согласно корреляционному анализу, маркер лейкоцитов CD95, индекс стимуляции репарации ДНК и содержание микроэлементов в волосах (селен, 6-валентный хром), являются информативными неспецифическими показателями прогрессирования рака желудка и толстого кишечника.