Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Инактивация генов глутатион-S-трансфераз в патогенезе рака легкого и рака предстательной железы

рукописи

Давыдова Наталья Александровна

ИНАКТИВАЦИЯ ГЕНОВ ГЛУТАТИОН-в-ТРАНСФЕРАЗ В ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ЛЕГКОГО И РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14 00 16 - патологическая физиология 14 00 14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

оозоегэ!^

Томск 2007

003061912

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Областном государственном учреждении здравоохранения «Томский областной онкологический диспансер»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Новицкий

Вячеслав Викторович

Севостьянова Наталия Владимировна

Сгеповая

Елена Алексеевна,

профессор кафедры биохимии и

молекулярной биологии ГОУ ВПО

СибГМУ Росздрава

Кондакова

Ирина Викторовна,

заведующая лабораторией биохимии

опухолей ГУ НИИ онкологии ТНЦ

СО РАМН

Ведущая организация: ФГУ Российский онкологический научный центр им Н Н Блохина РАМН

Защита состоится « г в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096 01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г Томск, ул Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомится в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Ученый секретарь диссертационного совета

Г А Суханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет К причинам этого можно отнести неблагоприятную экологическую обстановку, образ жизни и генетические факторы Факт, что рак является генетическим заболеванием уже не вызывает сомнений, а количество генов прямо или косвенно вовлеченных в канцерогенез неуклонно возрастает

Одно из важнейших достижений в области онкологии - открытие нестабильности ДНК Рак называют болезнью генетической нестабильности ДНК -не статичная, а высокодинамичная структура Ее нестабильность является основой эволюции, нормального индивидуального развития и одновременно злокачественной трансформации [Coleman WB, Tsongahs GJ, 1995, Kirsch I.R, Lista F , 1996, Wells R D , 1996, Wells R D et al, 2005] Без нестабильности генома практически невозможно возникновение в одной клетке достаточного числа мутаций в ключевых генах, ответственных за контроль над клеточным циклом, апоптозом, ангиогенезом, адгезией, трансмембранными сигналами, репарацией ДНК, определяющих злокачественный характер роста солидных опухолей Создавая гетерогенность клеточных популяций, генетическая нестабильность постоянно предоставляет материал для отбора все более и более автономных и агрессивных клеток [Новик А А, Комилова В А , 2001, Копнин Б П , 2002, Тимошевский В А , Назаренко С А., 2006, Wells R D , 1996, Vanasse G J, Concannon P , Willerford D M 1999, Wells R D et al, 2005]

У каждого организма имеется свой собственный видовой и индивидуальный уровень общей и тканевой генетической нестабильности и, соответственно, -наследственной предрасположенности к раку, который, в свою очередь, не является константным, а изменяется с возрастом и под влиянием среды Многими исследователями было показано [Засухина Г Д , 2005], что в мутационном процессе, как и в других физиологических процессах, можно экспериментально определить ключевые моменты, определяющие индивидуальную реакцию генома данного организма на внешние воздействия К таким ключевым моментам относятся различия между людьми по особенностям метаболизма генотоксикантов, оксидантному и гормональному статусу, эффективности систем репарации ДНК Все они генетически детерменированы, поэтому систему оценки нестабильности генома человека можно расширять практически бесконечно Свой вклад в формирование первичной генетической нестабильности могут вносить эпигенетические модификации генома [Залетаев Д В и др , 2002, С А Назаренко, 2004] и индивидуальные вариации ферментных систем [Ревазова Ю А и др, 2006]

В данном исселедовании сделана попытка объединить две позиции в изучении нестабильности генома человека - нарушение статуса метилирования и генетический полиморфизм системы детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-Б-трансферазы При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии -рак легкого и рак предстательной железы

Противоречивость данных литературы по полиморфизму генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке легкого, раке простаты и отсутствие информации о влиянии комбинаций генотипов глутатиоя-8-трансфераз, о совокупном анализе всех способов инактивации данных генов при злокачественных новообразованиях делает целесообразным, на наш взгляд, проведение исследования по оценке вклада сочетаний полиморфных вариантов этих генов в предрасположенность к раку легкого и предстательной железы Не менее актуальным представляется установление взаимосвязи повреждения исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями онкозаболеваний, а так же проведение сравнительного анализа вариантных генотипов глутатион-Б-трансфераз и их комбинаций при раке легкого и предстательной железы

Цель исследования: установить роль инактивации генов глутатион-Э-трансфераз Т1, М1 и Р1 в патогенезе рака легкого и предстательной железы Для достижения цели были поставлены следующие задачи

1. Выявить роль делеционных (0/0, АГ/ГГ) и нормальных (+/+ , 0/+, АА) вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 (ОБТИ, С8ТМ1 и ОвТР 1) и их комбинаций в патогенезе рака легкого и предстательной железы

2 Установить взаимосвязь функционально неполноценных генов глутатион-Э-трансфераз Т1, М1 и Р1 с клинико-морфологическими особенностями опухолей легких

3 Определить соотношение делеционных и полноценных вариантов генов глутатйон-8-трансфераз Т1, М1, Р1 и их комбинаций в зависимости от прогностических критериев рака легкого и предстательной железы.

4 Провести сравнительный анализ индивидуальных эффектов и комбинаций полиморфных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 при раке легкого и предстательной железы.

5 Выявить комбинации полиморфных вариантов генов глутатион-в-трансфераз Т1, М1, Р1 специфичные для рака легкого и предстательной железы

6 Определить инактивированные (делецией и метилированием) варианты генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 в опухолевых клетках легкого и установить роль гиперметилирования промотора гена С8ТР1 в развитии рака легкого

Научная новизна. Впервые проведено комплексное молекулярно-биологическое исследование суммарного вклада инактивированных вариантов генов глутатион-в-трансфераз Т1,М1 иР1 в развитие рака легкого.

Получены новые данные, касающиеся профиля поражения генов глутатион-8-трансфераз в опухолях легкого, учитывающие все возможные способы инактивации генов данного семейства Выявлена роль гиперметилирования промотора гена 08ТР1 и его сочетаний с полиморфными вариантами генов ОБТП, ОБТШ и С8ТР1 в патогенезе рака легкого.

Впервые установлена ассоциация клинико-морфологических особенностей злокачественных опухолей легкого и предстательной железы и делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Т1, М1, Р1.

Впервые представлены данные исследования вариантных генотипов глутатион-Б-трансфераз и их комбинаций у больных раком предстательной железы Показано, что делеционные варианты генов этого семейства могут служить прогностическим критерием развития рака предстательной железы

Получены новые данные сравнительного анализа по участию глутатион-5-трансфераз в патогенезе рака легкого и предстательной железы Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов глутатион-8-трансфераз Т1, М1 и Р1 и их комбинаций при злокачественных процессах в легких и в предстательной железе На основании полученных данных обоснована роль полиморфизма генов ОБТИ, С8ТМ1 и 08ТР1 и их комбинаций в развитии злокачественных опухолей легких и простаты, что дает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к профилактике и ранней диагностики онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачествнных опухолей Основные положения, выносимые на защиту:

1 Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз Т1, М1 и Р1 играют важную роль в патогенезе рака легкого, рака предстательной железы, поскольку доля инактивированных генов у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых лиц

2 Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз Т1, М1 и Р1 участвуют в формировании повышенного риска возникновения рака легкого и предстательной железы

3 Инактивированные варианты генов глутатион-8-трансфераз Т1, М1 и Р1 ассоциированы с клинико-морфологическими особенностями опухолей легкого и предстательной железы и участвуют в формировании неблагоприятного прогноза данных заболеваний

4 Исходя из постулата - суммарный эффект генотипа превосходит сумму эффектов отдельных генотипов, выявлены протекторные (защитные) комбинации, интактные (не влияющие на развитие онкологических заболеваний данных локализаций) и неблагоприятные (способствующие развитию рака легкого и рака предстательной железы)

5 Ген 08ТР1 в опухолях легкого инактивируется делецией и метилированием, что увеличивает частоту поражений генов семейства глутатйон-8-трансфераз в опухолях легкого

Реализация и апробация работы Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (г Новосибирск, 2004), на конкурсе молодых ученых СО РАМН, посвященном 50-летию установления структуры ДНК «Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики» (г Новосибирск, 2004), на конгрессах Российского общества онкологов (г Баку и г Москва, 2005-2006), на I конгрессе Российского общества онкоурологов (г Москва, 2006), на региональной конференции

«Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г Томск, 2006), на 5 региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» (г Томск, 2006), на российской научлопрактической конференции «Современные методы лечения онкологических больных» (Барнаул, 2006) и на научных семинарах кафедры патологической физиологии ГОУВПО «СибГМУ» (г. Томск, 2004-2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале из «Перечня .» ВАК РФ

Объем и структура работы Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы Работа иллюстрирована 1 рисунком и 18 таблицами Библиографический указатель включает 307 источников, из них 102 отечественных и 205 зарубежных

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 255 больных раком легкого и 100 больных раком предстательной железы (табл 1)

Обследованные пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в клиниках ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г Томска, в областном онкологическом диспансере г Томска, областной клинической больнице и лечебно-диагностическом центре г Томска Диагноз в каждом случае подтверждался результатами клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследования Забор клинического материала у всех обследованных лиц производился однократно до начала лечения Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями, а также больные, перенесшие инфекционный мононуклеоз

Группы сравнения составили здоровые лица (первичные и штатные доноры крови Томской областной станции переливания крови) (172 обследованных с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту).

Средний возраст онкологических больных оказался равным 56±9 лет, у здоровых доноров - 49±5 лет, что позволило сделать заключение о возможности сопоставления обследованных лиц по их возрастной характеристике (р<0,05)

Таблица I

Распределение обследованных лиц по группам наблюдения в соответствии с использованными

методами исследования

Методы исследования Количество наблюдений

Здоровые доноры Больные раком легкого Больные раком предстательной железы

1 Определение полиморфизма генов С8ТТ1, ОЯТМ! 172 255 100

2 Анализ полиморфизма гена ОЗТР1 72 100 100

3 Анализ комбинаций полиморфных вариантов генов глугатион- 5-трансфераз Т1, М1, Р1 72 100 100

4 Определение гиперметилирования промотора гена СБТР! - 30 -

Во все обследованные группы больных и в контрольную группу здоровых были включены индивидуумы только европеоидного происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых

генотипов и аллелей [Martinson J J et al, 1997, Галеева А Р и соавт, 1998, Yudin N et al, 1998, Коршунова Т Ю и соавт, 2004]

Материалом для исследования полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1, GSTP1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 91, ц1 и ж1), явилась ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [Lahm DK et al, 1992] Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER (F. 5'-caa-gtc-tcc-cct-cac-tcc-cc, R. 5'-gtg-cga-gtg-gct-cag-tgt-gt) и генов GSTT1 (F 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg, R 5-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg), GSTM1 (F 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc, R 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) [Spurdle AB et al, 2001] Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов размером 131 и 114 пн соответственно Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии, по крайней мере, одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо-и гетерозиготы, +/+ и +/0) Участок гена ER размером 183 пн использовали в качестве внутреннего контроля амплификации

Для гена GSTP1 определяли полиморфизм, связанный с наличием в пятом экзоне гена «дикого типа» или «мутантного» аллелей, характеризующихся соответственно наличием или отсутствием сайта рестрикции для BSTMA I [Miller D Р, 2002] Для определения полиморфизма данного гена использовался ПДРФ анализ, проводимый в 2 этапа, на первом этапе проводили амплификацию фрагмента гена GSTP1 с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена GSTP1 (forward, 5'-АСС CCA GGG СТС TAT GGG АА-3', и reverse 5'-TGA GGG САС AAG AAG CCC CT-3')[Spurdle А В , 2001], на втором этапе проводили инкубацию проб с добавлением рестриктазы BSTMA1 («СибЭнзим» Новосибирск) Гомозиготую делецию (ГГ) гена GSTP1 определяли по наличию на электрофореграммах фрагментов размером 91 и 85 п н о, гетерозиготную делецию (АГ) выявляли по присутствию на электрофореграммах трех фрагментов размером 176, 91 и 85 п н о , наличие на электрофореграмме одного фрагмента размером 176 п н о говорило о наличии нормального (без делеции ) гена GSTP1

Для изучения метилирования промотора гена GSTP1 из опухолей больных раком легкого была выделена ДНК (метод фенол-хлороформной очистки) Перед постановкой метил-специфичной ПЦР [Jerommo, С, 2001, Susan VH, 2002] ДНК подвергалась бисульфитной модификации и очистке с помощью набора реактивов «Wizard DNA clean-up system» Promega [Jerommo, С, 2001, Susan V H 2002] Наличие сайта метилирования определяли по присутствию на электрофореграмме участка длиной 173 п н о , контролем амплификации служило обязательное наличие на электрофореграмме участка ДНК такой же длины соответствующее неметилированной области гена GSTP1

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез [Лакин Г Ф , 1980]

Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова)

При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием критерия Стьюдента Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни(и-тест) Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г Ф , 1989]

При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий Пирсона, при условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали двусторонний критерий Фишера Относительный риск (ОЯ) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывался по стандартной формуле ОЯ=а/Ь х с!/с, где а и Ь - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и с! и с - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип ОЯ указан с 95%-ным доверительным интервалом [Флейс Д, 1989]

С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г) Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (5%)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из главных современных областей исследования предрасположенности к раку легкого является идентификация генетических факторов и полиморфизмов, которые предрасполагают к никотиновой зависимости и вовлечены в метаболизм продуктов сгорания табачного дыма, а генетические изменения, необходимые для злокачественного перерождения легочной ткани, могут быть индуцированы попаданием в легкие канцерогенных агентов, причем, как правило, такое воздействие носит хронический характер К таким агентам относятся канцерогены табачного дыма, асбест, каменноугольная смола, радиоактивные элементы и др.

Поскольку главной причиной заболеваемости раком легкого является курение, основное направление исследования роли полиморфных вариантов генов глутатион-S-трансфераз (GSTT1, GSTM1, GSTP1) в патогенезе рака легкого обосновано недостатком или сокращением ферментативной активности по отношению к некоторым субстратам, включая компоненты табачного дыма [Strange R.C et al 1984, Armstrong RN 1991, Ali-Osman F et al 1997, Strange R С , 2000, M L Cote et al , 2005]

Полиморфизм гена GSTM1, картированного на хромосоме 1р13 3, ведет к полной потере фермента [Seidegard J, Pero RW 1985], таким образом самоустраняясь из пути сопряжения и детоксикации реактивных метаболитов, особенно эпоксидов ПАУ [Smith G et al, 1995] Аналогичный вариант полиморфизма, приводящего к полной потере ферментативной активности, был обнаружен для гена GSTT1, расположенного на хромосоме 22ql 1 23 [Pemble S et al, 1994] GSTT1 участвует в детоксикации канцерогенных промежуточных продуктов сгорания табачного дыма, а именно моногалогенметанов и бутадиена GSTP1 - это самая представленная изоформа глутатион-Б-трансфераз в легких, которая детоксицирует ПАУ [Anttila S et al, 1993] Полиморфизм замены единственного нуклеотида в 5 экзоне гена GSTP1 (Ilel05Val), расположенного на хромосоме llql3, проявляется значительным снижением активности фермента среди индивидуумов, которые несут одну или более копий Г (гуанина) (Ile/Val или Val/Val) по сравнению с теми, кто имеет А/А (аденин/аденин, Ile/Ile) генотип [Watson MA et al, 1998] Наличие, по крайней мере, одной копии аллеля Г в гене GSTP1 также связано с увеличением уровня ДНК-аддуктов в ткани легкого [Butkiewicz D et al, 2000]

Учитывая количество известных канцерогенных веществ и путей их метаболизма, в которых они, предположительно, взаимодействуют, исследование комбинаций этих генотипов может обеспечить лучшее понимание механизмов онкогенеза легкого Представленные далее результаты показывают, что оценка вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз и (особенно) их комбинаций связаны с риском развития рака легкого и играют немаловажную роль в прогнозе течения заболевания

В настоящем исследовании было установлено, что индивидуальные эффекты каждого из исследуемых генов ведут к увеличению риска развития рака легкого (табл 2) Наименьший относительный риск (OR) выявлен для носителей делеционного варианта гена GSTM1, он составил 2,41 (С195% 1,28-3,65)

Таблица 2

Частота морфологически полноценных и неполноценных генотипов ОЗТТ), ОЭТМ! и ОЗТР1 у больных раком легкого и здоровых доноров

Ген Генотип Здоровые Больные раком легкого OR(CÏ95%)

п % п %

GSTT1 + 140 81,4 131 51,4 38,65 р=0,000 OR=4,14 CI95% 2,57-6,71

0/0 32 18,6 124 48,6

GSTM1 + 104 60,5 99 38,8 х^ 18,43 р= 0,0000176 OR =2,41 CI95% 1,28-3,65

о/о 68 39,5 156 61,2

GSTP1 АА 51 70,8 39 39 15,75 р=0,0000722 OR= 3,8 CI95% 1,89-7,67

АГ/ГГ 21 29,2 61 61

Примечание р - уровень статистической значимости различий параметров между группами больных раком легкого и здоровыми донорами, OR - относительный риск развития рака легкого по сравнению с контролем

Большинство западных исследователей не находили значимого увеличения риска развития рака легкого, связанного с GSTM10/0 генотипом в популяциях американцев европеоидного происхождения, однако объединение разрозненных данных и проведение мета-анализа позволило достигнуть статистически достоверных значений [Benhamou S et al, 2002] В крупном исследовании американцев европеоидного и африканского происхождения также сообщается об умеренном увеличении относительного риска развития рака легкого (1,3 и 1,5 соответственно), связанного с GSTMl-нуль генотипом [Cote M L, 2005] Немногочисленные же российские источники, напротив, сообщают о высоком риске рака легкого при носительстве нулевого аллеля гена GSTM1 [Ляхович В В , 1997] Акцент на страну проведения исследования и антропологические характеристики обследованных лиц нам кажется уместным, поскольку имеются значительные межрасовые и межпопуляционные различия в полиморфизме генов глутатион-S-трансфераз [Watson MA et al,1998] Учитывая данные современной литературы [ссылка], GSTMl-нуль генотип оценивается как вероятный фактор риска для развития рака легкого, хотя для некоторых популяций и с малой величиной эффекта Анализ доли гомозигот по нулевому аллелю глутатион-8-трансферазы Т1 показал достоверную связь делеционной формы данного гена и риска развития рака легкого (OR=4,14), что согласуется с данными современной литературы, которые также постулируют увеличение относительного риска связанного с GSTT10/0 [Spitz M R et al, 2000, Hou S M et al, 2001, Sorensen M et al, 2004]

Из генов глутатион-8-трансфераз полиморфизм GSTP1 наименее представлен в публикациях по раку легкого Аллельные варианты данного гена (А/Г и Г/Г),

кодирующие синтез белка со сниженной ферментативной активностью, нами были объединены в одну группу показателей При этом частота делеционных вариантов гена С8ТР1 (61%) более чем в два раза превышала таковую у здоровых доноров (29,5%), а относительный риск развития рака легкого составил 3,8 (С195% 1,89-7,67)

В настоящем исследовании установлено, что нулевые генотипы ОБТТ1, С8ТМ1 играют важную роль в прогрессии рака легкого, поскольку нами была обнаружено достоверное увеличение доли делеционных вариантов 08ТТI и тенденция к преобладанию нулевых вариантов гена С8ТМ1 у больных с метастазами (табл 3) и на четвертой стадии заболевания по сравнению с более ранними (табл 4) Стадия, на которой диагностировалась патология, и наличие очагов метастазирования рассматривалась нами только как прогностические показатели Выявленные закономерности свидетельствуют о возможности дальнейшего изучения вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз в качестве прогностических критериев у больных раком легкого

Таблица 3

Частота вариантных генотипов 05ТТ1, С8ТМ1 и ОВТР1 _у больных раком легкого с метастазами_

Ген Генотип Больные раком легкого У? >9

Без метастазов С метастазами

п % N %

ОЭТТ1 + 69 58,9 61 44,5 ^=4,71 р=0,029

0/0 48 41,1 76 55,5

вЗТМ! + 52 44,4 46 33,6 ^=2,7 Р=0,1

о/о 65 55,6 91 66,4

ОЭТР! АА 19 41,3 21 38,9 0,00 р=0,96

АГ/ГГ 27 58,7 33 61,1

Примечание р - уровень статистической значимости различий параметров между группами больных раком легкого с метастазами и без таковых

На сегодняшний день является общепризнанной многоударная модель канцерогенеза, и все злокачественные новообразования расцениваются как сложные патологические процессы, в патогенез которых включено повреждение многих генов Исследуя риск, связанный с комбинациями инактивированных вариантов генов глутатион-8-трансфераз, в нашем исследовании признается сложность основных механизмов развития рака легкого Нами сделана попытка построить анализ данных таким образом, чтобы оценить суммарный вклад повреждения нескольких генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в патогенез рака легкого. Изучение комбинаций повреждений глутатион-8-трансфераз обосновано также некоторыми особенностями ферментов этого семейства Представляется очевидным, что в развитии онкопатологии имеет значение баланс активностей различных глутатион-Б-трансфераз, поскольку они имеют

перекрывающуюся субстратную специфичность, и некоторые из них полиморфны [Кашпо Н., РеИсопеп О , 1995, Ляхович В В и соавт, 1997, Левгка Е, Wasowlcz \¥., 2001] В связи с этим, риск онкопатологии модулируется всеми представителями семейства глутатион-8-трансфераз

Таблица 4

Частота вариантных генотипов генов С57Т7, С5ТМ1 и С5ТР1 у больных раком легкого в

зависимости от стадии заболевания

Ген Генотип Здоровые Больные раком легкого

1 стадия п=15, п(%) 2 стадия п=41, п(%) 3 стадия п=119, п(%) 4 стадия п=80, п(%)

ОвТТ! 0/0 32 4 (26,6) 20 (48) 53 (44,5%) 47 (58,8)

+ 140 10 21 66 33

Р Р1-0.57 Р1,0,0001, Р2-0,3 р1я0,0000, рг-0,40, Рз-0,7 р 1-0,0000, Р2=0,07, Рз-0,39, Р4=0,05

С8ТМ1 о/о 68 8 (53,3%) 25 (60,9) 66 (55,5%) 57(71,3)

+ 104 7 16 53 23

Р р,.0,53 Р1=0,02, рз-0,832 Р1-0,01, Рг-0,9, Рз=0,б6 Р1-0,0000, Рг=0,29, Рз-0,34, р4-0,030

ОЗТР1 АА 51 0 10 18 12

АГ(ГГ) 21 2 11(52,4) 33 (64,7) 14 (53,84)

Р Р1=0,91 Р1=0,18 , Р2=0,58 Р1=0,0001, р2-0,78, Рз-=0,47 р1=0,04, Рг-0,59, рз-0,84, Р4-0.49

Примечание р1 - уровень статистической значимости различий параметров по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров, рг - уровень статистической значимости различий параметров с аналогичными показателями у больных с I стадией, рз - уровень статистической значимости различий параметров по сравнению с аналогичными параметрами у больных со II стадией, р4 - уровень статистической значимости различий параметров по сравнению с аналогичными параметрами у больных с III стадией злокачественного процесса

При анализе данных исследования все генотипы были разделены на протекторные (защитные), снижающие риск развития рака легкого, интактные (не влияющие на развитие заболевания), и рисковые, статистически значимо повышающие риск рака легкого у здоровых носителей данного генотипа

Было показано, что доля носителей протекторной комбинаций морфологически и функционально полноценных аллелей генов семейства глутатион-8-трансфераз у здоровых доноров в пять раз превышает этот показатель у больных раком легкого (^=16,76, р=0,00004), при этом относительный риск ((Ж)

развития рака легкого при носительстве одного из функционально неполноценных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз увеличивается в 6,89 (С195% 2,44-20,44)

Таблица 5

Комбинации полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у _GSTP1 у больных раком легкого___

Комбинации аллелей Здоровые (n=72) Больные раком легкого (n=100) x2,P

n % п %

GSTT1/GSTM1/ GSTP1/ GSTP1 22 30,5 6 6 16,76, 0,00004

GSTT 10/GSTM1/ GSTP1/ GSTP1 1 1,4 9 9 3,15, 0,07

GSTT1/GSTM10/ GSTP1/ GSTP1 16 22,2 18 18 0,24, 0,62

GSTT10/GSTM 10/ GSTP1/ GSTP1 12 16,7 7 7 4,51, 0,08

GSTT1/GSTM1/GSTP1/ del 105 7 9,7 4 4 1,43, 0,23

GSTT 10/GSTM 1/ GSTP1/ del 105 0 0 13 13 8,35, 0,003

GSTT1/GSTM10/GSTP 1/del 105 7 9,7 15 15 0,63, 0,42

GSTT 10/GSTM 10/ GSTP 1/ del 105 4 5,6 14 14 2,35, 0,12

GSTTl/GSTMl/GSTPlde!105/de! 105 2 2,8 3 3 0,14, 0,7

GSTT 10/GSTM 1/GSTP1 del 10 5/del 105 0 0 2 2 0,24, 0,62

GSTT 1 /GSTM10/GSTP1 del 105/del 105 1 1,4 6 6 1,25, 0,26

GSTT 10/GSTM 10/GSTP1 del 105/del 105 0 0 3 3 0,8, 0,37

Примечание р - уровень статистической значимости различий параметров между группами больных раком легкого и здоровыми донорами

Выявлены две рисковые комбинации

GSTT10/GSTM1 /GSTP1 /del 105(del 105/del 105) и GSTT10/GSTM10/GSTPl/dell05(del 105/ del 105). Первая из этих комбинаций не встречается у здоровых лиц и в 15% случаях определяется у больных раком легкого, вторая (сочетание делеционных вариантов генов GST) у здоровых определяется только как сочетание нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 с гетерозиготной делецией GSTP1 Полученные данные свидетельствуют о том, что основной вклад в формирование риска развития рака легкого вносят гены GSTT1 и GSTP1 Несмотря на феномен перекрестной субстратной специфичности, нормальная экспрессия гена GSTM1 не способна компенсировать делеционные формы генотипов GSTT1 и GSTP1 и приводит к увеличению риска развития рака легкого в 8 раз (р=0,00005) Такое увеличение

риска подтверждает постулат о том, что сумма эффектов отдельных генотипов всегда ниже суммарного эффекта генотипа и оправдывает проведенное исследование

Прогноз для больных раком легкого коррелирует со стадией, на которой установлен диагноз, при этом пациенты с I клинической стадией болезни имеют 5-летнюю выживаемость приблизительно 60 %, а на IV стадии процесса 5-летние диапазоны выживаемости колеблются от 5 до 40% [Mountain С.Т, 1997] Неблагоприятный прогноз в значительной степени вызван недостатком эффективных диагностических методов для раннего обнаружения рака легкого и отсутствием эффективных методов лечения больных с очагами метастазирования [Jean-Charles Soria et al, 2002] Таким образом, усилия, направленные на раннюю диагностику рака легкого имеют самое высокое значение, а анализ аномального метилирования при достаточном экспериментальном обосновании, может быть использован в ранней неинвазивной диагностике рака легкого

Гиперметилирование промоторных областей генов приводит к ингиброванию транскрипции В качестве механизма инактивации генов этот процесс является столь же значимым и настолько же эффективным, как и мутация ДНК [Cameron Е Е et al,1999, Jones Р А, Laird P.W. 1999, Robertson K.D, Jones P.A., 2000, Herman J G, Baylm SB, 2003, Запетаев Д В , 2002], Кроме того, аномальное гиперметилирование промоторов генов описано как опухолеспецифичное изменение, которое появляется в очаге поражения на самых ранних этапах онкогенеза [Залетаев Д В , 2002, Залетаев Д В, Немцова M В, 2007] Так, в исследовании Jean-Charles Soria et al (2002) гиперметилирование промотора гена GSTP1 было выявлено у бывших курильщиков в 6% случаев (п=100), при этом анализировался материал эпителия бронхов с признаками дисплазии

По данным литературы, в опухолях легкого доля инактивированного метилированием гена GSTP1 составляет от 7 до 33% [Zochbauer-Muller S et al, 2002, Ozlem Topaloglu et al, 2004]. Недостатком этих и нашего исследований является то, что, все они выполнены на малых выборках, что связано прежде всего со сложностью получения материала Нами было проанализировано 30 образцов ДНК опухолей, после бисульфитной модификации которой, определяли гиперметилирование промотора гена GSTP1 Было показано, что в 16,7% проанализированных опухолей легкого ген GSTP1 инактивируется метилированием Причем в двух случаях участки аномального метилирования гена GSTP1 обнаруживались в мелкоклеточных опухолях легкого и в трех случаях у больных немелкоклеточным раком легкого

Метилирование промоторной области гена GSTP1 нами было рассмотрено прежде всего как способ инактивации данного гена, для проведения комплексной оценки всех способов инактивации генов глутатион-8-трансфераз Был построен профиль инактивированных вариантов генов глутатион-8-трансфераз (рис.1) Во всех 30 образцах опухолей легкого присутствовали инактивированные (делецией или метилированием) варианты генов глутатион-Б-трансфераз В 33,3% случаев был инактивирован один из вариантов генов GSTT1, Ml и PI, наиболее часто обнаруживалось поражение двух их этой группы генов (46,7%), в 5 случаях

нарушение коснулось трех генов глутатион-5-транефераз и в I случае выявлено все 4 исследуемых типа нарушений.

СЭГП

СЗТМ1

Рис.1 Профиль инактивации генов алутатион-$-трансфераз 77. М1 иР1 в опухолях легкого

Инактивированнме варианта генов йБ'ГП., М1 и Р1

Полноценные варианты генов С^'ГП. МI и Р1 Выявление всех четырех типов нарушений не является артефактом, поскольку в данном случае глу тати он-тр ансф е р аз ная активность была полностью заблокирована только в опухолевой ткани за счет метилирования гена ОЗТР1 и делеции генов ОЯТТI и ОЯТМ1, при этом продукт делеционного варианта [-сна С$ТР], вероятнее цсего проявлял ферментативную активность на уровне же макроорганизма, полное же отсутствие ферментов этой группы состояние не совместимое с жизнью. Нужно отметить, что все выявленные случаи

гиперметилирования промотора гена GSTP1 сопровождались гетерозигоной делецией этого же гена Возможно, деления в 5 экзоне влияет на состояние этого участка гена и облегчает метилирование в данном регионе, где содержится большое количество CpG нуклеотидов

Jerónimo С et al (2002) пытались найти связь между полиморфизмом гена GSTP1 и метилированием промотора этого гена при раке предстательной железы Их поиски были сосредоточены на образцах, в которых метилирование не было обнаружено, и предположение этих исследователей о том, что отсутствие в ткани метилирования промотора гена GSTP1 приводит к обязательной инактивации гена за счет делеции, не подтвердилось Однако, в этом же исследовании было показано, что в тех образцах, в которых не было обнаружено метилирование в 62,5% случаев глутатион-8-трансферазная активность была резко снижена Мы полагаем, что только дальнейшие комплексные исследования суммарного влияния полиморфных вариантов глутатион-Б-трансфераз и метилирования могут объяснить взаимодействия ферментов внутри этого семейства

Аномальное метилирование промоторной области гена GSTP1 в трансформированной ткани простаты было выявлено многочисленными исследователями [Lee W-H et al 1997, Millar D S et al 1999, Cairas P et al 2001, Jerónimo С et al. 2002] это одно из немногих генетических изменений которое имеет высокую специфичность именно к раку предстательной железы

По крайней мере, семь регионов генома были предложены в качестве кандидатных на содержание аутосомно-доминантного гена наследственного рака простаты, включая Iq24-lq25 (НРС1), Iq42-q43 (РСАР), Xq27-q28 (НРСХ), 1р36 (САРВ), 20ql3 (НРС20), 17pll (ELAC2) и 16q23 [Nwosu V et al, 2001, Bratt O, 2002; Simard J et al, 2002] Ни один из данных регионов не был последовательно идентифицирован в различных популяциях, и ни один из данных генов не был столь же специфичным для рака предстательной железы, как, например, делеция в районе 5q21 при колоректальном раке Это дает основание считать, что генетическое предрасположение к раку простаты не может следовать стандартной схеме Вместо мутаций в определенных генах, приводящая к высокому риску, генетическая восприимчивость к раку простаты может зависеть от распространенных полиморфизмов, умеренно увеличивая риск болезни у гетерозигот или гомозигот Полиморфизмы в генах, связанных с рецепторами и метаболизмом гормонов, защитой клетки, репарацией ДНК и метаболизмом нуклеотидов могут быть вовлечены в канцерогенез Среди них особое место занимают глутатион-S-трансферазы, которые защищают против потенциально мутагенных эндогенных и экзогенных соединений Действительно, полиморфизмы в GSTT1 и GSTP1 были описаны, как связанные с увеличением риска развития рака простаты в работах Stemhoff С et al (2000), Gsur A et al (2001), Kote-Jarai Z et al (2001) Изучая особенности распределения вариантных генотипов GSTT1, GSTM1 и GSTP1, мы обнаружили, что у больных раком предстательной железы доля патологических вариантов гена GSTT1 (43%) достоверно (р=0 000 ) превышает таковую у здоровых лиц (18,6%), при этом относительный риск (OR) развития РПЖ для здоровых носителей данной мутации оказался увеличен в 3,3 раза (С19з% 1,83 - 5,95) Аналогичные изменения были показаны для нулевого варианта гена GSTM1 и

делеционных вариантов гена GSTP1 (АГ и ГГ), относительные риски (OR) для которых составляли 2,39 (С1«% 1,4 - 4,09) и 2,85 (С195% 1,43 - 5,72), соответственно Jerónimo С et al, (2001) утверждают, что потеря функции глутатион-Б-трансфераз играет критическую роль на ранних этапах онкогенеза простаты Такие выводы были сделаны на основании иммуногистохимического исследования ткани предстательной железы у больных раком простаты и с преднеопластическими изменениями в предстательной железе Было обнаружено, что экспрессия ферментов резко снижена в опухолевой ткани и в метапластически измененных образцах, причем такие изменения коснулись не только ткани, в которой ген GSTP1 был инактивирован метилированием Тем не менее, С Ntais et al (2005) на основании анализа литературы подверг сомнению наличие высокого риска развития рака предстательной железы при наличии делеционных вариантов генов GST, и выдвинул предположение, что GST выступают предрасполагающими факторами к раку вообще

Таблица 6

Частота морфологически полноценных и неполноценных генотипов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком предстательной железы и здоровых доноров

Ген Генотип Здоровые Больные раком предстательной железы OR(CI95%)

п % п %

GSTT1 + 140 81,4 57 57 ■£= 17,64 р-0,000 OR=3,30 CI95% 1,83-5,95

0/0 32 18,6 43 43

GSTM1 + 104 60,5 39 39 10,94 р= 0,0009 OR =2,39 CI95% 1,4-4,09

о/о 68 39,5 61 61

GSTP1 АА 51 70,8 46 46 ^=9,51 р=0,0022 OR =2,85 CI95% 1,43-5,72

АГ/ГГ 21 29,2 54 54

Примечание р - уровень статистической значимости различий параметров между группами больных раком предстательной железы и здоровыми донорами, OR - относительный риск развития рака предстательной железы

Большая часть исследований, посвященных изучению полиморфизмов GST, на которые ссылается С Ntais et al, 2005, была совмещена с изучением гиперметилирования промотора гена GSTP1 и проведена на операционном материале, а, следовательно, в исследование были включены пациенты с благоприятными прогностическими характеристиками на ранних стадиях развития рака предстательной железы

В нашем исследовании мы также не нашли статистически значимого увеличения доли мутантных генотипов GST на ранних стадиях онкогенеза простаты (уровень достоверности для гена GSTT1 составил 0,94 GSTM1 - 0,46 и для гена GSTP1 - 0,27) Частота патологической формы гена GSTT1 на третьей стадии

превышала таковую у здоровых доноров г Томска в 2,6 раза, а на четвертой - в 4,5 раза При этом были показаны статистически значимые отличия частот вариантных генотипов гена СвТП между всеми обследованными группами больных раком предстательной железы с различными стадиями злокачественного процесса Доля носителей делеционных вариантов генов С8ТМ1 и ОБТР 1 также статистически значимо увеличивалась с третьей стадии онкологического процесса

Более того, изучение комбинаций вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз в зависимости от стадии злокачественного процесса показало, что доля протекторных генотипов (ОБТП, С8ТМ1, 08ТР1А/А) у больных раком предстательной железы последовательно снижалась, начиная со второй стадии заболевания, и не обнаруживалась совсем на четвертой стадии процесса, а частота комбинаций делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз (С8ТТ1 0/0, С8ТМ1 0/0, С8ТР1А/Г (Г/Г)), напротив увеличивалась, начиная со второй стадии заболевания и достигала максимума (41,6%) на четвертой стадии процесса При этом относительный риск прогрессии рака предстательной железы ((Ж) при носительстве комбинации делеционных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 составил 12,14 (С1<ь% 2,91-54,83) Поскольку стадия, на которой диагностирован процесс, является важной прогностической характеристикой, то связь между стадией и исследуемыми показателями позволяет отнести полиморфизм генов глутатион-Б-трансфераз к прогностическим критериям рака предстательной железы

Увеличение доли делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз описано для многих злокачественных новообразований Чтобы определить вклад глутатион-8-трансфераз в формирование онкологического риска в ограниченной группе (п=72) здоровых лиц был проведен анализ связи доли носителей делеционных вариантов С8ТТ1, ОЗТМ1 и ОБТР1 с отягощенной и неотягощенной онкологической наследственностью в анамнезе обследованных безотносительно локализации процесса Показано, что существенных различий носительства делеционных вариантов генов С8ТТ1 и С8ТМ1 в группах здоровых доноров с отягощенной и неотягощенной онкологической наследственностью не обнаруживалась (табл 4) Для гена в8ТР1 выявлено, что несмотря на двукратное превышение доли неполноценных форм данного гена у лиц с отягощенной онкологической наследственностью (42,3% и 21,7% соответственно), была обнаружена лишь тенденция (р=0,1) к увеличению доли носителей патологических форм гена 08ТР1 в группе здоровых доноров с отягощенной онкологической наследственностью Кроме того, при проведении данного анализа приходилось ориентироваться на субъективное мнение обследованных, что значительно снизило репрезентативность выборки Несмотря на это, существенное увеличение доли мутантных генотипов вБТР! в этой группе обследованных лиц может свидетельствовать о значительном вкладе гена 0!5ТР1 в формирование онкологического риска

Противоречивость данных литературы о влиянии глутатион-8-трансфераз на формирование онкологического риска при различных онкологических заболеваниях побудило нас исследовать две различные по механизмам развития онкопатологии и сделать заключение о специфичности участия этих ферментов в канцерогенезе

При анализе частот генотипов каждого отдельного гена GST значимых различий между группами больных раком предстательной железы и раком легкого выявлено не было Специфичным для рака легкого оказалось сочетание нулевого варианта гена GSTT1, полноценного гена GSTM1 и функционально неполноценных вариантов гена GSTP1 (А/Г и Г/Г) Данная комбинация не встречалась в выборке здоровых жителей г Томска, а у больных раком простаты была обнаружена только в 2% случаев В группе больных раком легкого статистически значимой (р=0,008) также оказалась более высокая по сравнению с раком простаты частота носительства комбинации GSTT1/GSTM1 0/0 /GSTPIA/Г (Г/Г) Для рака предстательной железы специфичной оказалась комбинация ненуллевых вариантов генов GSTT1, GSTM1 и делеционных вариантов гена GSTP1 у больных раком простаты по сравнению с группой больных раком легкого

Таблица 7

Сочетания полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком

предстательной железы и раком легкого

Комбинации аллелей Здоровые (п=72) Больные раком предстательной железы (п=100) Больные раком легкого (n=100)

п(%) п(%) n (%)

ввТТ!, С8ТМ1, вЭТР 1 А/А 22 (30,55) 10 (10) 6(6)

Р Р1=0,001 pi=0,000 P2=0,43

вБТТ! 0/0, 08ТМ1, вБТРША 1 (1,4) 7(7) 9(9)

Р Pi=0,17 Pi=0,06 P2=0,79

ОБТЛ, С8ТМ1 0/0, вБТРША 16 (22,2) 18 (18) 18(18)

Р Pi=0,62 p i=0,62 P2=l

С5ТТ1 0/0, ввТМ! 0/0, вБТРША 12(16,7) 12 (12) 7(7)

Р Pi=0,5I P i=0,08 P2=0,51

08ТТ1, С8ТМ1, 08ТР1А/Г (Г/Г) 9(12,5) 21 (21) 7(7)

Р P.=0,21 Pi=0,33 P2=0,008

ввТП 0/0, ввтш, СвТРШГ (Г/Г) 0 2(2) 15(15)

р Pi=0,62 pi=0,00I P2=0,002

сети, ОЗТМ1 0/0, 08ТР1А/Г (Г/Г) 8(11,1) 7(7) 21 (21)

Р Pi=0,5 Pi=0,13 p2=0,008

08ТТ1 0/0, 08ТМ1 0/0, С8ТР1А/Г (Г/Г) 4 (5,55) 23 (23) 17(17)

Р Pi=0,003 Pi=0,04 P2=0,37

Примечание р! - уровень статистической значимости различий параметров по сравнению с анал01ичными показателями у здоровых доноров, р2 - уровень статистической значимости различий параметров больных раком легкого и раком предстательной железы

Мы полагаем, что такие сочетания генотипов говорят о преобладании эффекта делеционного варианта гена в патогенезе специфичной для данной патологии комбинации, не исключая при этом модулирующего эффекта остальных генов Это доказывает тот факт, что в обеих группах больных онкологическими заболеваниями наиболее неблагоприятной является комбинация делеционных вариантов всех, способных образовывать полиморфные варианты генов глутатион-Б-трансфераз

Универсальность вовлечения данных генов в формирование онкологического риска может быть обосновано некоторыми важными свойствами этих ферментов значимых для патогенеза злокачественных новообразований 1 GST имеют большое количество субстратов экзогенного происхождения, многие из которых являются канцерогенами, нарушение работы этих ферментов может создать условия для реализации канцерогенного потенциала вещества и генотоксическому эффекту, 2 Учитывая важную роль ферментов GST в метаболизме липофильных и стероидных соединений, можно утверждать, что снижение активности или потеря этих ферментов может привести к нарушению элиминации метаболитов стероидных гормонов, в том числе и метаболитов тестостерона 3 Исходя из важной роли GST в обезвреживании продуктов ПОЛ и пероксидов ДНК, можно утверждать, что снижение их активности приведет к усилению свободно-радикальной агрессии на ДНК 4 Исходя из известного факта о важной роли GST в метаболизме эйкозаноидов (простагландинов и лейкотриенов), можно предположить, что дисфункция этих ферментов неизбежно скажется на состоянии противоопухолевого иммунитета и процессах метастазирования

Выводы:

1 Частота делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI у больных раком легкого и предстательной железы превышает таковую у здоровых лиц Суммарное влияние делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml, PI превышает эффект индивидуальных инактивированных вариантов генов, что увеличивает риск развития рака легкого и предстательной железы

2 Выявлена взаимосвязь носительства делеционных вариантов генов GSTT1,GSTM1,GSTP1 со стадией злокачественного процесса, а также показано модулирующее действие гистологического типа опухоли на показатели относительного риска развития рака легкого

3 У онкологических больных на поздних стадиях онкологического процесса увеличена частота делеционных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Tl, Ml (GSTT1, GSTM1) и комбинации GSTT1 0/0, GSTM1 0/0, GSTP1A/T (Г/Г), среди больных раком легкого с III и IV стадией заболевания увеличено число носителей комбинации GSTT1 0/0, GSTM1, GSTP1A/T (Г/Г)

4 В результате сравнительного анализа выявлено, что частота делеционных вариантов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1 и их комбинации при раке легкого аналогична таковой при раке предстательной железы

5 Специфичным для больных раком легкого является носительство комбинации GSTT1 0/0, GSTM1, GSTPIA/Г (Г/Г)

6 В опухолях легкого ген С8ТР1 инактивируется делецией и метилированием, причем инактивированные варианты генов глутатион-8-трансфераз обнаруживаются в 100% случаев

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Севостьянова, НВ Влияние потенциально онкогенного вируса Эпштейна-Барр на онкологические заболевания легких/ Севостьянова, Н В Гусакова, С В , Давыдова, НА, Султанова, АН // Материалы II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» - Москва - 2001 -С 414

2 Севостьянова, Н В Молекулярно-биологическое исследование рака легкого ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр/ Севостьянова, Н В, Гусакова, С В, Давыдова, Н А, Султанова, АН// Материалы II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» » - Москва -2001 -С 423-424

3 Давыдова, НА Иммунологические и молекулярно-биологические методы изучения ВЭБ-ассоциированных форм плоскоклеточных раков легкого/ Давыдова, Н А, Гусакова, С В // Сборник статей по материалам 59 Пироговской научно-практической конференции -2002 -Томск - С 125-126

4 Неруш, Е В Состояние системы ДНК-репарации клеток периферической крови у больных хроническими заболеваниями легких / Неруш, Е В, Плотникова, Н Н, Севостьянова, Н В, Дмитриева, А И, Давыдова, НА// Тезисы докладов "Вестник РГМУ" - Москва -2003 -№2-С280

5 Неруш, Е В , Дмитриева А И, Давыдова Н А, Рябова Е А Исследования системы ДНК-репарации у больных раком легкого / Неруш, Е В , Дмитриева, А И , Давыдова, Н А , Рябова, Е А // Тезисы докладов "Вестник РГМУ" - Москва - 2003 - №2 - С 280

6 Севостьянова, Н В Исследования системы ДНК-репарации у больных раком легкого/ Севостьянова, Н В , Бабышкина, Н Н, Неруш, Е В , Жукова, О Б, Давыдова, Н А, Рябова, Е А Дмитриева, А И // Сборник научных работ молодых онкологов Уральского федерального округа «лечение раков в XXI веке» - Челябинск - 2003 - С 73

7 Неруш, Е В Сравнительный анализ активности системы репарации ДНК лимфоцитов периферической крови у онкологических больных/ Неруш, Е В, Плотникова, Н Н, Коломиец, С А , Давыдова, Н А, Рябова, Е А // Сборник статей по материалам четвертого конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» - Томск -2003 -С275

8 Рябова, ЬА Активность системы ДНК-репарации и частота мутации гена ¡3-хемокинового рецептора ССЯ-5 у больных диспластическими процессами и раком легкого/ Рябова, Е А, Дмитриева, А И, Давыдова, НА // Сборник статей по материалам четвертого конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» -Томск -2003 -С275

9 Неруш, Е В Сравнительный анализ функциональной активности системы ДНК-репарации в лимфоцитах переферической крови у больных с разными гистологическими типами рака легкого / Неруш, Е В, Дмитриева, А И, Плотникова, Н Н, Коломиец, С А, Давыдова, Н А // Сборник тезисов по материалам 79-ой Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной 190-летию Казанского медицинского университета - Казань -2004 -Том1 -С 89

10 Неруш, ЕВ Функциональная активность системы ДНК-репарации в лимфоцитах периферической крови у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких, дисплазиями и раком легких/ Неруш, Е В , Плотникова, Н Н, Коломиец, С А, Дмитриева, А И, Давыдова, НА // Сборник тезисов по материалам 79-ой

Всероссийской студенческой научной конференции, посвяшенной 190-летию Казанского медицинского университета - Казань -2004 -Том1 - С 87

11 Неруш, Е В Особенности репаративного синтеза ДНК у больных раком легкого / Е В Неруш, В В Новицкий, Н В Севостьянова, Н В Чердынцева, Н Н Плотникова, С А Коломиец, О В Черемисина, А И Дмитриева, Н А Давыдова // Бюллетень СО РАМН, 2005 - №2-с 79-81

12 Неруш, ЕВ Особенности полиморфизма генов ферментов 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков у больных центральным раком легкого/ Е В Неруш, Н В Севостьянова, Е Л Чойнзонов, Н В Чердынцева, В В Новицкий, С А Коломиец А И Дмитриева, Н А Давыдова // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием — Барнаул - 2005 - С 284-285

13 Флеминг, МВ Сравнительный анализ функционального полиморфизма генов ССТ*5, р53, ОБТИ и 05ТМ1 у больных раком легкого и атопической бронхиальной астмой/ М В Флеминг, П А Гервас, Н В Чердынцева, В В Климов, А Ю Добродеев, Н В Севостьянова, НА Давыдова // Материалы VI Съезда аллергологов и иммунологов СНГ, Российского национального конгресса аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии - Москва -2006 - 7(3) -С 311

14 Дмитриева, А И Изучение полиморфизма генов ввТЛ, 08ТМ1 у больных плоскоклеточной и мелкоклеточной формами рака легкого / А И Дмитриева, С А Коломиец, Н В Севостьянова, Е Л Чойнзонов, О В Черемисина, Н А Давыдова, В А Авхименко, В В Новицкий // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных достижения и неудачи» - Барнаул - 2006 - С 183

15 Давыдова, НА Исследование полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных раком предстательной железы / НА Давыдова, А И Дмитриева, С П Селиванов, Н В Севостьянова. В В Новицкий // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных достижения и неудачи», Барнаул, 2006 - с 183

16 Давыдова, Н А Исследование полиморфных вариантов генов глутатион-5-трансфераз Т1, М1 и Р1 у больных раком предстательной железы /НА Давыдова, А И Дмитриева, С П Селиванов, Н В Севостьянова, С А Коломиец, В В Новицкий // Материалы V-региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» -Томск -2006 - С 149-150

17 Дмитриева, А И Полиморфизм генов ОЭТТ], ОвТМ! у больных плоскоклеточной и мелкоклеточной формами рака легкого / А И Дмитриева, С А Коломиец, Н В Севостьянова, Е Л Чойнзонов, О В Черемисина, Н А Давыдова, В А Авхименко, В В Новицкий И Материалы X Российского онкологического конгресса - Москва - 2006 -С 203

Список сокращений. ПЦР - полимеразная цепная реакция ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПАУ - полициклические ароматические углеводороды РЛ - рак легкого

MKPJI — мелкоклеточный рак легкого НМКРЛ — немелкоклеточный рак легкого РПЖ- рак предстательной железы GST - глутатион-Б-трансферазы

Автор выражает искреннюю признательность научным руководителям диссертации - зав кафедрой патофизиологии СибГМУ, заслуженному деятелю науки РФ, академику РАМН, профессору, д-ру мед наук Новицкому В В и профессору кафедры биологии и генетики СибГМУ, заведующей диагностическим отделением Томского областного онкологического диспансера, д-ру мед наук, Севостьяновой Н В за неоценимую помощь в проведении исследования Выполнение настоящей работы было бы невозможным без содействия главного врача Томского областного онкологического диспансера, к м н Коломийца С А и главного врача Лечебно-диагностического центра г Томска Селиванова С П Благодарю коллектив лаборатории онковирусологии НИИ онкологии ТНЦ (лично зав лабораторией д м н Уразову Л Н , сотрудников Жуковскую Л А , Дедюхину Л.С ), ведущего научного сотрудника НИИ онкологии ТНЦ, д м н Черемисину О.В , коллектив лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики ТНЦ, сотрудников кафедры патофизиологии, биологии и генетики СибГМУ, коллектив диагностического отделения ТООД (лично к м н Дмитриеву А И) за теоретическую и методическую помощь в выполнении работы

Особая благодарность моему мужу, родителям и сестрам, которые все эти годы были со мной рядом

В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. К причинам этого можно отнести неблагоприятную экологическую обстановку, образ жизни и генетические факторы. Факт, что рак является генетическим заболеванием уже не вызывает сомнений, а количество генов прямо или косвенно вовлеченных в канцерогенез неуклонно возрастает.

Одно из важнейших достижений в области онкологии - открытие нестабильности ДНК. Рак называют болезнью генетической нестабильности. ДНК - не статичная, а высокодинамичная структура. Ее нестабильность является основой эволюции, нормального индивидуального развития и одновременно - злокачественной трансформации [Coleman W.B., Tsongalis G.J., 1995, Kirsch I.R., Lista F., 1996, Wells R.D., 1996, Wells R.D. et al., 2005]. Без нестабильности генома практически невозможно возникновение в одной клетке достаточного числа мутаций в ключевых генах, ответственных за контроль над клеточным циклом, апоптозом, ангиогенезом, адгезией, трансмембранными сигналами, репарацией ДНК, определяющих злокачественный характер роста солидных опухолей. Создавая гетерогенность клеточных популяций, генетическая нестабильность постоянно предоставляет материал для отбора все более и более автономных и агрессивных клеток [Новик А.А., Комилова В.А., 2001, Копнин Б.П., 2002, Тимошевский В.А., Назаренко С.А., 2006, Wells R.D., 1996, Vanasse G.J., Concannon P., Willerford D.M. 1999, Wells R.D. et al., 2005].

У каждого организма имеется свой собственный видовой и индивидуальный уровень общей и тканевой генетической нестабильности и, соответственно, - наследственной предрасположенности к раку, который, в свою очередь, не является константным, а изменяется с возрастом и под влиянием среды. Многими исследователями было показано [Засухина Г.Д., 2005], что в мутационном процессе, как и в других физиологических процессах, можно экспериментально определить ключевые моменты, определяющие индивидуальную реакцию генома данного организма на внешние воздействия. К таким ключевым моментам относятся различия между людьми по особенностям метаболизма генотоксикантов, оксидантному и гормональному статусу, эффективности систем репарации ДНК. Все они генетически детерменированы, поэтому систему оценки нестабильности генома человека можно расширять практически бесконечно. Свой вклад в формирование первичной генетической нестабильности могут вносить эпигенетические модификации генома [Залетаев Д.В. и др., 2002, С.А.Назаренко, 2004] и индивидуальные вариации ферментных систем [Ревазова Ю.А. и др., 2006].

В данном исселедовании сделана попытка объединить две позиции в изучении нестабильности генома человека — нарушение статуса метилирования и генетический полиморфизм системы детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-Б-трансферазы. При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии - рак легкого и рак предстательной железы.

Противоречивость данных литературы по полиморфизму генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке легкого, раке простаты и отсутствие информации о влиянии комбинаций генотипов глутатион-8-трансфераз, о совокупном анализе всех способов инактивации данных генов при злокачественных новообразованиях делает целесообразным, на наш взгляд, проведение исследования по оценке вклада сочетаний полиморфных вариантов этих генов в предрасположенность к раку легкого и предстательной железы. Не менее актуальным представляется установление взаимосвязи повреждения исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями онкозаболеваний, а так же проведение сравнительного анализа вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз и их комбинаций при раке легкого и предстательной железы. Цель исследования: установить роль инактивации генов глутатион-S-трансфераз Tl, Ml и PI в патогенезе рака легкого и предстательной железы. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить роль делеционных (0/0, АГ/ГГ) и нормальных (+/+ , 0/+, АА) вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) и их комбинаций в патогенезе рака легкого и предстательной железы.

2. Установить взаимосвязь функционально неполноценных генов глутатион-Б-трансфераз Tl, Ml и PI с клинико-морфологическими особенностями опухолей легких.

3. Определить соотношение делеционных и полноценных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml, PI и их комбинаций в зависимости от прогностических критериев рака легкого и предстательной железы.

4. Провести сравнительный анализ индивидуальных эффектов и комбинаций полиморфных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI при раке легкого.и предстательной железы.

5. Выявить комбинации полиморфных вариантов генов глутатион-S-трансфераз Tl, Ml, PI специфичные для рака легкого и предстательной железы.

6. Определить инактивированные (делецией и метилированием) варианты генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI в опухолевых клетках легкого и установить роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 в развитии рака легкого.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное молекулярно-биологическое исследование суммарного вклада инактивированных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI в развитие рака легкого.

Получены новые данные, касающиеся профиля поражения генов глутатион-8-трансфераз в опухолях легкого, учитывающие все возможные способы инактивации генов. данного семейства. Выявлена роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 и его сочетаний с полиморфными вариантами генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 в патогенезе рака легкого.

Впервые установлена ассоциация клинико-морфологических особенностей злокачественных опухолей легкого и предстательной железы и делеционных вариантов генов глутатион-S-трансфераз Tl, Ml, PL

Впервые представлены данные исследования вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз и их комбинаций у больных раком предстательной железы. Показано, что делеционные варианты генов этого семейства могут служить прогностическим критерием развития рака предстательной железы.

Получены новые данные сравнительного анализа по участию глутатион-S-трансфераз в патогенезе рака легкого и предстательной железы. Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI и их комбинаций при злокачественных процессах в легких и в предстательной железе. На основании полученных данных обоснована роль полиморфизма генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 и их комбинаций в развитии злокачественных опухолей легких и простаты, что дает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к профилактике и ранней диагностики онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачествнных опухолей. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и PI играют важную роль в патогенезе рака легкого, рака предстательной железы, поскольку доля инактивированных генов у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых лиц.

2. Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml и Р1 участвуют в формировании повышенного риска возникновения рака легкого и предстательной железы.

3. Инактивированные варианты генов глутатион-Б-трансфераз Tl, Ml и Р1 ассоциированы с клинико-морфологическими особенностями опухолей легкого и предстательной железы и участвуют в формировании неблагоприятного прогноза данных заболеваний.

4. Исходя из постулата - суммарный эффект генотипа превосходит сумму эффектов отдельных генотипов, выявлены протекторные (защитные) комбинации, интактные (не влияющие на развитие онкологических заболеваний данных локализаций) и неблагоприятные (способствующие развитию рака легкого и рака предстательной железы).

5. Ген GSTP1 в опухолях легкого инактивируется делецией и метилированием, что увеличивает частоту поражений генов семейства глутатион-8-трансфераз в опухолях легкого.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (г. Новосибирск, 2004); на конкурсе молодых ученых СО РАМН, посвященном 50-летию установления структуры ДНК «Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики» (г. Новосибирск, 2004); на конгрессах Российского общества онкологов (г.Баку и г.Москва, 2005-2006); на I конгрессе Российского общества онкоурологов (г.Москва, 2006); на региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г.Томск, 2006); на 5 региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» (г.Томск, 2006); на российской научно-практической конференции «Современные методы лечения онкологических больных» (Барнаул, 2006) и на научных семинарах кафедры патологической физиологии ГОУВПО «СибГМУ» (г. Томск, 2004-2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале из «Перечня.» ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает 161 источник, из них 58 отечественных и 103 зарубежных.

ВЫВОДЫ:

1. Частота делеционных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, Ml и PI у больных раком легкого и предстательной железы превышает таковую у здоровых лиц. Суммарное влияние делеционных вариантов генов глутатион-Э-трансфераз Tl, Ml, PI превышает эффект индивидуальных инактивированных вариантов генов, что увеличивает риск развития рака легкого и предстательной железы.

2. Выявлена взаимосвязь носительства делеционных вариантов генов GSTT1,GSTM1,GSTP1 со стадией злокачественного процесса, а также показано модулирующее действие гистологического типа опухоли на показатели относительного риска развития рака легкого.

3. У онкологических больных на поздних стадиях онкологического процесса увеличена частота делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз Tl, Ml (GSTT1, GSTM1) и комбинации GSTT1 0/0, GSTM1 0/0, GSTPIA/Г (Г/Г), среди больных раком легкого с III и IV стадией заболевания увеличено число носителей комбинации GSTT1 0/0, GSTM1, GSTPIA/Г (Г/Г).

4. В результате сравнительного анализа выявлено, что частота делеционных вариантов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1 и их комбинации при раке легкого аналогична таковой при раке предстательной железы.

5. Специфичным для больных раком легкого является носительство комбинации GSTT1 0/0, GSTM1, GSTPIA/Г (Г/Г).

6. В опухолях легкого ген GSTP1 инактивируется делецией и метилированием, причем инактивированные варианты генов глутатион-8-трансфераз обнаруживаются в 100% случаев