Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Полиморфизм генов детоксикации ксенобиотиков у курильщиков и пациентов с ранними стадиями хронической обструктивной болезни легких

На правах рукописи

«ВТ

005019857

ВАХРУШЕВА Светлана Евгеньевна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У КУРИЛЬЩИКОВ И ПАЦИЕНТОВ С РАННИМИ СТАДИЯМИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ

БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

14.01.04 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 ДПР Ш1

Владивосток - 2012

005019857

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Невзорова Вера Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Дубиков Александр Иванович ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, Дюйзен Инесса Валерьевна УРАН Институт биологии йоря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится лсОЯ 2012 года в «/(Я часов

на заседании диссертационного совета К 208.007.01 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « Лгус^^ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент

Шестакова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хроническая обструктивная болезнь легких занимает одно из ведущих мест в структуре смертности и заболеваемости современного цивилизованного общества и, согласно прогнозам ВОЗ, к 2020 году займет четвертое место, уступая только сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям [GOLD, 2010]. Несмотря на высокий интерес медицинского сообщества к причинам роста распространенности ХОБЛ, вопросам диагностики ранних стадий заболевания уделяется небольшое внимание. Так, согласно данным Европейского Респираторного Общества, только 25% случаев заболевания диагностируются своевременно.

Важнейшим фактором риска ХОБЛ является курение. Ежегодное снижение ОФВ] у курильщиков может составлять до 80 мл в год, у некурящих лиц - 20-30 мл в год, начиная с третьего десятилетия жизни. Кумулятивное потребление сигарет от 20 пачка-лет сопровождается ограничением функции легких на 10-15%, при 60 пачка-лет - на 50% [Баур К., 2010].

Несмотря на тесную связь между интенсивностью курения табака и скоростью падения легочной функции, заболевание развивается не у всех курильщиков. Согласно данным Mannino D.M., 2002, Hu G., 2008, только 10-25% курильщиков имеют стойкое снижение показателей функции внешнего дыхания, приводящее к ХОБЛ. Кроме того, около 5% больных ХОБЛ не являются курильщиками [Не J.Q., 2004].

Ведущее значение в индивидуальной реакции организма на продукты сгорания табака имеют генетически опосредованные реакции. Поиск значимых генетических маркеров предрасположенности к ХОБЛ остается актуальным вопросом предиктивной диагностики для наиболее эффективного планирования профилактических мероприятий и выявления ранних стадий заболевания.

Цель исследования - определение значимости полиморфизмов генов второй фазы детоксикации ксенобиотиков в виде распределения частот встречаемости делеционных вариантов и точечных мутаций для оценки риска развития ХОБЛ.

Задачи исследования:

1. Изучить распределение частот встречаемости делеционного генотипа глутатионтрансферазы Т1 у активных курильщиков и пациентов с ранними стадиями ХОБЛ в сравнении с некурящими добровольцами.

2. Проанализировать распределение частот встречаемости деле-ционного генотипа глутатионтрансферазы М1 у некурящих лиц, курильщиков и пациентов с ранними стадиями ХОБЛ.

3. Изучить распределение полиморфных вариантов точечных мутаций гена глутатионтрансферазы Р1 у курильщиков и пациентов с ранними стадиями ХОБЛ в сравнительном аспекте с некурящими лицами.

4. Выяснить распределение полиморфных вариантов точечной мутации гена микросомальной эпоксидгидролазы у некурящих лиц, курильщиков и пациентов с ранними стадиями ХОБЛ.

5. Определить вклад изученных мутаций генов глутатионтранс-фераз TI, MI, Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы в относительный риск развития ХОБЛ.

Научная новизна

Определены возможности предиктивной диагностики ранних стадий ХОБЛ, основанной на данных исследования генов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков глутатионтрансфераз TI, М1, Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы. Максимальный вклад в относительный риск развития ранних стадий ХОБЛ вносит гетерозиготная мутация локуса Не 105Val гена глутатионтрансферазы Р1, в меньшей степени гетерозиготные варианты локуса Alai 14Val гена глутатионтрансферазы Р1 и локуса Tyrl 13His гена микросомальной эпоксидгидролазы. Выявлено протективное влияние «нормальных» генотипов глутатионтрансферазы Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы на риск развития ХОБЛ как у некурящих лиц, так и у курильщиков.

Практическая значимость

Расширены представления о влиянии полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков на механизмы развития ранних стадий ХОБЛ. Выявлена необходимость исследования точечных гетерозиготных мутаций, а также «нормальных» вариантов генотипов глутатионтрансферазы Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы у лиц из групп повышенного риска развития ранних стадий ХОБЛ, в частности, у курильщиков.

Результаты нашего исследования могут применяться в практической медицине при составлении персонифицированных программ ранней диагностики и профилактики ХОБЛ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение риска развития ХОБЛ у курильщиков и некурящих лиц в большей степени связано с наличием точечных мутаций 105I/V и 114A/V гена глутатионтрансферазы Р1 и точечной мутации 113Т/Н гена микросомальной эпоксидгидролазы, а не с увеличением доли де-леционных генотипов глутатионтрансфераз Т1 и М1.

2. Наибольший вклад в относительный риск развития ХОБЛ у курильщиков вносит наличие гетерозиготных вариантов 1051 Л/ и 114A/V гена глутатионтрансферазы Р1. У некурящих лиц увеличение относительного риска развития ХОБЛ обусловлено присутствием гетерозиготного варианта 113Т/Н гена микросомальной эпоксидгидролазы.

3. Уменьшение риска развития ХОБЛ у безусловных курильщиков связано с наличием делеционного генотипа глутатионтрансферазы Т1 и «нормальных» генотипов 105I/I и 114А/А глутатионтрансферазы Р1, а у некурящих лиц - с присутствием генотипа 113Т/Т микросомальной эпоксидгидролазы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах регионального, российского и международного уровней: на XX и XXI Европейском респираторном конгрессе (Барселона, 2010; Амстердам, 2011); VI, VII Дальневосточном региональном конгрессе ученых с международным участием (Владивосток 2009, 2010); XI, XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток 2010, 2011).

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 127 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего в себя 152 источника (28 - отечественных и 124 - зарубежных авторов). Материал иллюстрирован 15 рисунками и 4 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Обследовано 64 мужчины и 36 женщин, находившихся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении КГБУЗ «Владивостокская клиническая больница № 1», а также под амбулаторным наблюдением в Аллерго-респираторном центре г. Владивосток и КГБУЗ «Владивостокский клинико-диагностический центр» в течение 2008-2011 гг. Группу контроля составили 30 условно здоровых некурящих лиц (12 мужчин и 18 женщин) в возрасте 46.5±3.8 лет с постбронходилатационными значениями ОФВ!>80%,

ОФВ1/ФЖЕЛ>70%. Пациенты были проинформированы о цели и методах проведения исследования в полном объеме и выразили свое согласие.

Диагноз ХОБЛ был выставлен в соответствии с рекомендациями GOLD (Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких, пересмотр 2010г.). Исследуемые были распределены по группам: 1 группа - 40 курящих лиц со средним стажем курения 19.1 ±1.5 лет без признаков ХОБЛ в возрасте 48.7±3.9 лет; 2 группа - 60 курящих пациентов со средним стажем курения 23.5±1.7 лет с ХОБЛ I и II стадий стабильного течения в возрасте 52.6±4.8 лет. Во 2 группе были выделены следующие подгруппы: 2А - 30 пациентов с ХОБЛ I стадии; 2Б - 30 пациенты с ХОБЛ II стадии. Критериями исключения из исследования являлись ассоциированные тяжелые соматические заболевания.

Средний индекс курящего человека (ИКЧ) в 1 группе составил 226±30.8, во 2 группе - 252.6±32.4, что позволило отнести указанные группы к безусловным курильщикам. Среднее число пачка-лет в первой группе было 43.2±7.5, во второй - 58.32±7.9. Сравниваемые группы были сопоставимы между собой по среднему стажу и интенсивности курения.

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием набора Genomics DNA Purification Kit («Fermentas», Евросоюз). Анализ полиморфных локусов генов GSTM1, GSTT1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», CIIIA) с использованием наборов реагентов для детекции полиморфных маркеров («ГосНИИгенетика», Россия). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле и визуализировали при помощи трансиллюминирующей гель-документирующей

системы Bio-Print 1500/20М («Vilber Lourmat», Франция). Для генотипов GSTM1 и GSTT1 гомозиготные делеции определялись наличием одного амплификационного фрагмента длиной 350 п.н., а гетеро-зиготы и нормальные гомозиготы - двух амплификационных фрагментов длиной 480 (для GSTT1) и 215 п.н. (для GSTM1).

Определение полиморфных вариантов генов GSTP1 и ЕРНХ1 проводили методом ПЦР с последующим прямым секвенированием ПЦР фрагментов. Для ПЦР амплификации 3-5 экзонов GSTP1 использовали праймеры GstP-E32-I105-For (5'-CCGGTCCCCACATCTCGTACTT-3') и GstP-E32-I105-Rev (5~-TAAGGGGGGTGAGGGCACAAGAAG-3"), для ПЦР 6-7 экзонов GSTP1 - праймеры GstP-А114-R18 7-For (5'-ATCTGGGACTCTGGTGTCTGG-3') и GstP-A114-R187-Rev (5'-CCAACCCTCACTGTTTCCCGT-3'). ПЦР амплификацию 3 экзона ЕРХН1 и генотипирование замены Tyrl 13His проводили с помощью праймеров EPXH1-Y113H-For (5'-GTGCTCTGTCCTTCCCATCCC-3') и EPXH1-Y113H-Rev (5' -TGCATGTATGTGTTCCTGCCT-3'). Дизайн праймеров был выполнен с помощью программ Vector NTI 10 (Invi-trogen, США).

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, на базе которых проведен ряд генетических исследований, особенно старшему сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н., доценту Исаевой М.П.

Результаты оценивали с помощью программы STATISTICA 6.0. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами пациентов и здоровых лиц оценивалась по тесту %2 (частотный критерий Фишера). Относительный риск заболевания по конкретному признаку вычисляли с определением 95% доверительного интервала для оценки достоверности полученных результатов.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Одним из ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, играющих важную роль в обезвреживании продуктов табачного дыма, является глутатионтрансфераза Т1 (рис.1).

<3STT1

Рис. I. Идентификация делеционного генотипа 08ТТ1 методом ПЦР-анализа.

Согласно результатам нашего исследования, в популяции лиц, проживающих на территории Приморского края, встречаются как де-леционные генотипы, так и функционально полноценные варианты гена 05ТТ1 (рис.2).

14 .......................................

12...............

i^'ifflP-

...... • :-----

контроль курящие лица вез пациенты о ХОБЛ |-||

признаков ХОБЛ стадий

Рис.2. Частота встречаемости гомозиготной делеции GSTT1 в исследуемых группах.

В контрольной группе гомозиготная деления GSTT1 установлена в 5% случаев. По данным Chan-Yeung М., 2007, делеционный полиморфизм GSTT1 у здоровых некурящих лиц встречается в большем числе случаев. Указанное исследование проводилось в азиатской популяции, чем могут быть обусловлены различия с нашими результатами. В группе курильщиков без признаков ХОБЛ «нулевой» генотип GSTT1 выявлен в 14.3% случаев, в группе пациентов с ранними стадиями ХОБЛ - в 17.6% без достоверной разницы между группами. Полученные результаты согласуются с данными исследований Chen S.L., 2004, Castaldi P.J., 2010, Корытиной Г.Ф., 2009, не показавших влияния изолированной делеции гена GSTT1 на развитие ХОБЛ.

Учитывая отсутствие значимой разницы частоты встречаемости делеционного генотипа GSTT1 в группе курильщиков и общей группе пациентов с ХОБЛ, было решено провести анализ распределения «нулевого» полиморфизма GSTT1 в подгруппах пациентов в зависимости от степени тяжести заболевания. Гомозиготная делеция гена

08ТТ1 обнаружена в 13.2% в подгруппе пациентов с I стадией ХОБЛ и в 20% в подгруппе пациентов со II стадией заболевания. Сравнение показателей 2Б подгруппы с контролем показало наличие достоверной разницы в частоте встречаемости делеционного генотипа ОБТИ (20% и 5%, соответственно, х2=Ю, р=0.02).

Учитывая тот факт, что во 2Б подгруппе, где выявлено достоверное увеличение частоты гомозиготной делеции ОБТИ, все пациенты являлись безусловными курильщиками с ИКЧ>160, было решено выделить контингент лиц с ЖЧ>160 в 1 группе и 2А подгруппе. Установлено достоверно большее содержание делеционного генотипа С8ТТ1 в группе безусловных курильщиков с ИКЧ>160 по сравнению с пациентами I стадии ХОБЛ (22% и 15%, соответственно, х2=1°> р=0.015). Соответственно, увеличение встречаемости «нулевого» генотипа 08ТТ1 у безусловных курильщиков скорее отвергает появление ХОБЛ, чем предсказывает его.

Для оценки вклада гомозиготной делеции 08ТТ1 в риск развития ХОБЛ был вычислен относительный риск между I группой и 2А подгруппой среди лиц с ИКЧ>160. ОР составил 0.6 (011=0.6; 95% ДИ=0.55-2.82, р<0.05), что указывает на снижение риска развития ХОБЛ почти в 2 раза при наличии делеционного генотипа 08ТТ1 у безусловных курильщиков. В то же время, определение относительного риска развития ХОБЛ в условиях присутствия делеционного полиморфизма ОБТИ у некурящих лиц показало, что данная мутация вносит значимый вклад в развитие II стадии ХОБЛ. ОР в указанной группе при наличии «нулевого» генотипа С8ТТ1 составил 4.75 (95% ДИ=3.17-7.09).

Помимо глутатионтрансферазы Т1 в метаболизме ксенобиотиков, в том числе продуктов табачного дыма, принимает участие глутати-онтрансфераза М1, которая способствует конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с глутатионом (рис.3).

Рис. 3. Идентификация делеционного генотипа С8ТМ1 методом ПЦР-анализа.

По нашим данным, в контрольной группе гомозиготная делеция гена 08ТМ1 выявлена в 46.6% случаев (рис.4).

контроль курящие лица пациенты с

без признаков ХОБЛ 1-М стадий ХОБЛ

Рис.4. Частота встречаемости гомозиготной делеции 08ТМ1 в исследуемых группах.

В европейской популяции у здоровых некурящих лиц данная делеция встречается в 50% случаев [1тЬос1еп М., 2007], что сопоставимо с нашими результатами. В группе курильщиков частота встречаемости «нулевого» генотипа 08ТМ1 составила 46.4%, в группе пациентов с ХОБЛ - 47% без достоверных различий между группами. Соответственно, во всех группах обследованных частота встречаемости «нулевого» варианта 08ТМ1 была приблизительно одинаковой.

Учитывая возможность связи между увеличением доли делеци-онного генотипа С8ТМ1 и возникновением более тяжелых стадий ХОБЛ, проведен анализ его встречаемости среди подгрупп пациентов с ХОБЛ. Во 2А подгруппе частота гомозиготной делеции составила 42.8%), во 2Б подгруппе - 50% без достоверных различий между собой. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии связи частоты встречаемости делеционного генотипа С8ТМ1 как с возможным риском возникновения ХОБЛ, так и с прогрессированием заболевания.

С учетом того, что делеционные полиморфизмы генов глутатион-трансфераз Т1 и М1 в нашем исследовании не показали значимого влияния на риск развития ХОБЛ у курильщиков, решено было изучить распределение точечных мутаций гена глутатионтрансферазы Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы у пациентов с ХОБЛ и курильщиков в сравнении с некурящими добровольцами. В отличие от деле-ционных генотипов, ведущих к полной потери активности фермента, появление точечных мутаций сопровождается изменением его функ-

ции с утратой способности метаболизироватъ те или иные соединения.

Нами исследованы частоты встречаемости шести известных мис-сенс-мутаций, а именно Е32У (экзон 3), 058Ы (экзон 4), И05У (экзон 5), А114У (экзон 6), 0147У и R187W (экзон 7). При исследовании полиморфизмов Е32У, 058И, 0147У, R187W гена 65ТР1 эти мутации не были зарегистрированы ни в одной из групп. Данный факт может быть связан с их редкой встречаемостью, а также быть обусловлен недостаточно большой выборкой обследованных. При исследовании гомозиготного генотипа 105У/У полиморфного локуса 11е105Уа1 гена 08ТР1 было выявлено, что в контрольной группе данная мутация встречается в 3.2% случаев (рис.5).

контроль курящие лица пациенты с без признаков ХОБЛ 1-И ХОБЛ стадий

Примечание: ^разница по сравнению с контролем достоверна (р<0.05), # разница по сравнению с 1 группой достоверна (р<0.05).

Рис.5. Распределение полиморфных вариантов локуса 11е105Уа1 гена 08ТР1 в исследуемых группах.

В группе курильщиков без признаков ХОБЛ гомозиготный генотип 105У/У локуса 11е105Уа1 выявлен в 14.8% случаев, в группе пациентов с ХОБЛ - в 6.2% без достоверных различий между собой. Все случаи присутствия генотипа 105У/У установлены у пациентов с I стадией заболевания. В отличие от наших результатов, исследования Ыш Т., 1999, Не И}., 2004, показали, что наличие гомозиготной мутации 105У/У вносит наибольший вклад в развитие тяжелых стадий ХОБЛ. В то же время, Корытина Г.Ф., 2009, ІтЬосІеп М., 2007, Сазіаісіі РЛ., 2010, не выявили ассоциации данной мутации с риском развития ХОБЛ. Противоречивость результатов диктует необходи-

мость проведения исследований в более широких выборках пациентов.

Гетерозиготный генотип 105I/V гена GSTP1 зарегистрирован в 65.5% случаев в контрольной группе. Наименьшая частота встречаемости данного варианта обнаружена в группе курильщиков без признаков ХОБЛ (55.5%) с достоверными различиями с показателем контрольной группы (х2=17.4, р=0.009). Наибольшее число данной мутации установлено в группе пациентов с ХОБЛ, когда оно составило 75%, достоверно превышая показатели контрольной группы (%2=17.8, р=0.011). Различий в частоте гетерозиготных мутаций 105I/V у пациентов с I и II стадиями ХОБЛ не получено.

Согласно результатам исследований Ishii Т., 1999, Корытиной Г.Ф., 2009, гетерозиготные мутации локуса Ilel05Val также не влияют на риск развития тяжелых стадий ХОБЛ, что согласуется с нашими данными. Установлено, что наличие гетерозиготного генотипа 105I/V локуса Не 105Val в большей степени связано с развитием ХОБЛ у курильщиков без связи со стадиями заболевания.

Помимо изученных полиморфизмов гена GSTP1 нами проанализирована доля «нормального» генотипа 105I/I локуса Ile 105Val для оценки его влияния на развитие заболевания. Частота встречаемости генотипа 1051/1 локуса Ile 105Val у некурящих лиц достоверно выше показателей в группе курильщиков (31.3% против 29.7%; х2=9.9, р=0.025) и пациентов с ХОБЛ (31.3% против 18.8%; %2=10.1, р=0.022). Наименьшие значения встречаемости «нормального» генотипа GSTP1 установлены у пациентов с ХОБЛ, когда они достоверно ниже не только по отношению к некурящим лицам, но и по сравнению с курильщиками (29.7% и 18.8%, соответственно; х2=11-0, р=0.027). Таким образом, наблюдается статистически значимое увеличение содержания «нормального» генотипа 105I/I локуса Ile 105Val гена GSTP1 в контрольной группе и минимальное значение данного показателя в группе пациентов с ХОБЛ.

Для определения вклада полиморфизмов гена GSTP1 в развитие ранних стадий ХОБЛ нами исследованы частоты встречаемости полиморфных вариантов локуса Alall4Val. По данным Imboden M., 2007, Castaldi P.J., 2010, наличие мутаций в данном локусе не влияет на развитие ХОБЛ тяжелой степени. Нам представилось интересным оценить их роль в развитии ранних стадий заболевания (рис.6).

гз

Ш гомозиготная мутация 114V/V

S гетерозиготная мутация 114A/V

"нормальный" генотип 11 4 А/А

Примечание:*разница по сравнению с контролем достоверна (р<0.05), # разница по сравнению с I группой достоверна (р<0.05).

Рис.6. Распределение полиморфных вариантов локуса Alai 14Val гена GSTP1 в исследуемых группах.

Согласно данным, полученным в нашем исследовании, гомозиготный генотип 114V/V полиморфного локуса Alai 14Val гена GSTP1 встречается только у курильщиков в 3.7% случаев. Гетерозиготная мутация 114A/V гена GSTP1 выявлена в контрольной группе у 18.8% обследованных, что сопоставимо с результатом исследования Ada А.О., 2007, в котором вариант 114A/V обнаружен в 14.3% случаев. В группе курильщиков гетерозиготный вариант 114A/V обнаружен в 14.8% случаев без достоверных различий с контрольной группой (%2=7.9, р=0.09). Наибольшая частота встречаемости указанной мутации зарегистрирована у пациентов с ХОБЛ с достоверной разницей относительно показателей некурящих лиц (25% и 18.8%, соответственно; %2=10.0, р=0.024) и курильщиков (25% и 14.8%, соответственно; %2=11.1, р=0.04). Следует отметить, что все случаи гетерозиготной мутации 114A/V выявлены у пациентов с I стадией ХОБЛ.

Помимо изучения патологических генотипов полиморфного локуса Alai 14Val нам представилось интересным провести анализ частоты обнаружения «нормального» варианта 114А/А в исследуемых группах.

Согласно полученным результатам, доля генотипа 114А/А локуса Alai 14Val является преобладающей в контрольной группе и составляет 81.2%. В группе пациентов с ХОБЛ «нормальный» генотип 114А/А обнаружен в 75% случаев, что достоверно ниже показателей в группе курильщиков (81.5%, х2=16Л, р=0.009) и некурящих лиц (Х2=14.9, р=0.02). Итак, выявлено достоверное снижение доли вариан-

контроль курящие лица без пациенты с ХОБЛ 1-11

признаков ХОБЛ стадий

та 114A/A локуса Alai 14Val у пациентов с ХОБЛ как относительно курильщиков без признаков ХОБЛ, так и относительно некурящих добровольцев. «Нормальный» генотип 114А/А локуса Alall4Val, очевидно, носит протективный характер, что подтверждает важность сохранения неизмененной активности глутатионтрансферазы Р1 для обезвреживания продуктов табачного дыма.

Помимо изучения полиморфизмов глутатионтрансфераз нами было исследовано распределение полиморфных вариантов гена мик-росомальной эпоксидгидролазы - одного из ключевых ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, метаболизирующего промежуточные реактивные соединения в водорастворимые с последующим выведением их из организма [Raaka S., 1998].

По данным метаанализа Ни G,, 2008, выявлена связь между наличием гомозиготной мутации локуса 113с заменой тирозина на гисти- | дин и развитием ХОБЛ. В то же время метаанализ Brogger J., 2006, J показал наличие протективного эффекта данной мутации. Castaldi P.J., 2010, установил отсутствие ассоциации полиморфных вариантов данного локуса с развитием ХОБЛ. Следует отметить, что, в отличие от нашей работы, указанные выше исследования включали пациентов с тяжелыми стадиями заболевания.

Исходя из целей и задач нашего исследования, было проведено изучение частоты встречаемости полиморфных вариантов локуса Tyrl 13His гена ЕРНХ1 у курильщиков без ХОБЛ и пациентов с ХОБЛ (рис.7).

контроль курящие лица без пациенты с ХОБЛ

признаков ХОБЛ 1-Н стадий

Примечание: *разница по сравнению с контролем достоверна (р<0.05), # разница по сравнению с 1 группой достоверна (р<0.05).

Рис.7. Распределение полиморфных вариантов локуса Тугі ІЗНІб гена ЕРНХ1 в исследуемых группах.

В группе контроля гомозиготный генотип 113Н/Н гена ЕРНХ1 установлен в 14.7% случаев. В группе курящих лиц гомозиготная мутация 113Н/Н локуса Tyrll3His выявлена в 7.4% случаев, в группе пациентов с ранними стадиями ХОБЛ - в 18.8% без достоверных различий между группами. Для изучения связи гомозиготного генотипа 113Н/Н со стадиями заболевания проведен анализ частоты его встречаемости среди подгрупп пациентов с ХОБЛ. В подгруппе пациентов с I стадией заболевания данный вариант обнаружен в 12.5% случаев, в подгруппе пациентов с ХОБЛ II стадии - в 25%. Достоверных различий между сравниваемыми подгруппами и группами курильщиков и контроля не выявлено, что может быть объяснено отсутствием связи между наличием гомозиготной мутации 113Н/Н локуса Tyrll3His и стадиями ХОБЛ.

При исследовании гетерозиготной мутации 113Т/Н локуса Tyrl 13His гена ЕРНХ1 выявлено, что в контрольной группе она регистрируется у 38.3% обследованных, что сопоставимо с результатами работы Ada А.О., 2007. Обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа в группе курильщиков без признаков ХОБЛ по сравнению с некурящими лицами (44.4% против 38.3%, х2 ~ Ю.9, р=0.015), а также в группе пациентов с ХОБЛ по сравнению с контролем (43.7% против 38.3%, х2 = 13.4, р=0.009). Однако различий в содержании генотипа 113Т/Н у пациентов с ХОБЛ и курильщиков не получено. Можно предположить, что наличие гетерозиготного генотипа 113Т/Н локуса Tyrll3His вносит больший вклад в развитие ХОБЛ именно у некурящих лиц.

Учитывая полученные нами данные о значительной частоте встречаемости «нормального» генотипа глутатионтрансферазы Р1 у некурящих лиц, нам представилось интересным провести анализ частоты встречаемости «нормального» варианта 113Т/Т гена ЕРНХ1. Согласно полученным результатам, в контрольной группе доля «нормального» генотипа 113Т/Т составила 47% случаев. В группе курильщиков «нормальный» вариант 113Т/Т локуса Tyrl 13His встречался в 48.2%, в группе пациентов с ХОБЛ - в 37.5% с достоверной разницей относительно контрольной группы (х2 - 18.9, р=0.009, и х2 = 19.4, р=0.012, соответственно). У пациентов со II стадией ХОБЛ частота встречаемости данного генотипа была наименьшей - 25%, что достоверно ниже значений в группе курильщиков без ХОБЛ (х2 = 10.6, р=0.017) и некурящих лиц (х2 = 18, р=0.009). Более значимая

доля «нормального» генотипа 113Т/Т гена ЕРНХ1 у некурящих лиц и курильщиков по сравнению с пациентами с ХОБЛ и наименьшее его содержание у пациентов со II стадией ХОБЛ позволяет предположить его «защитную» роль относительно риска развития ХОБЛ как у некурящих, так и у курящих лиц.

В соответствии с целью исследования для определения вклада изученных мутаций в риск развития ХОБЛ был произведен расчет относительного риска возникновения заболевания.

Согласно полученным результатам, относительный риск развития ХОБЛ при наличии гетерозиготной мутации 105I/V локуса Не 105Val гена GSTP1 у курильщиков без признаков ХОБЛ повышен в 2.4 раза (OR=2.4, 95% ДИ=0.93-6.19, р<0.05). Данный результат указывает на существенный вклад гетерозиготной мутации 105I/V в развитие ХОБЛ у курильщиков.

Выявлена положительная ассоциация наличия гетерозиготной мутации 114A/V локуса Alai 14Val с развитием ХОБЛ для пациентов с ХОБЛ и некурящих лиц (OR=1.44, 95% ДИ=0.59-3.52, р<0.05), а также для пациентов с ХОБЛ и курильщиков (OR=1.91, 95% ДИ=0.83-4.4, р<0.05). Полученные результаты позволяют предполагать, что наличие гетерозиготной мутации 114A/V способствует развитию заболевания как у некурящих лиц, так и, в большей степени, у курильщиков.

Относительный риск заболевания был несколько выше при наличии гетерозиготной мутации 113Т/Н локуса Tyrll3His гена ЕРНХ1 для пациентов с ХОБЛ и некурящих лиц - в 1.25 раза (OR=1.25, 95% ДИ=0.55-2.82, р<0.05). Более высокий относительный риск установлен для подгруппы больных с ХОБЛ II стадии и контрольной группы (OR=1.6, 95% ДИ=0.бЗ-4.4, р<0.05), что свидетельствует о вкладе гетерозиготной мутации 113Т/Н в развитие заболевания у некурящих лиц.

В условиях присутствия «нормальных» вариантов генов GSTP1 и ЕРНХ1 регистрируется отрицательная ассоциация между наличием того или иного варианта генотипа и риском развития ХОБЛ. Так, наличие генотипа 105I/I гена GSTP1 у курильщиков и некурящих лиц уменьшает риск возникновения ХОБЛ почти в 2 раза (ОР=0.54, 95% ДИ=0.19-1.56) и 1.3 раза (ОР=0.62, 95% ДИ=0.17-1.49), соответственно. Присутствие генотипа 114А/А гена GSTP1 в одинаковой степени (более чем в 2 раза) снижает риск развития ХОБЛ как у курящих, так и у некурящих лиц - ОР 0.44 (95% ДИ=0.19-1.12) и ОР 0.45 (95%

ДИ=0.28-1.68), соответственно. Полученный результат подчеркивает важность неизмененного функционирования ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, в частности, глутатионтрансферазы 08ТР1, в обеспечении резистентности организма к возникновению ХОБЛ как у курящих лиц, так и при отсутствии употребления табака.

В присутствии генотипа 113Т/Т гена ЕРНХ1 риск снижения угрозы возникновения ХОБЛ как для курильщиков, так и для некурящих лиц снижается в одинаковой степени, ОР составляет, соответственно, 0.64 (95% ДИ=0.28-1.45) и 0.67 (95% ДИ=0.29-1.57). Также наличие варианта 113Т/Т гена ЕРНХ1 снижает относительный риск возникновения ХОБЛ II стадии как у курящих лиц, так и у некурящих добровольцев (ОР=0.35, 95% ДИ=0.08-1.53 и ОРЮ.37, 95% ДИ=0.08-1.64, соответственно).

Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о необходимости использования комплексного подхода в составлении линейки генетических маркеров нарушений механизмов детоксикации ксенобиотиков для оценки риска развития ХОБЛ. Наличие «нулевого» полиморфизма гена 08ТМ1 не может рассматриваться в качестве информативного показателя, влияющего на риск развития ХОБЛ или имеющего протективное значение. В свою очередь, повышенное содержание делеционного варианта гена ОБГЛ у курильщиков может быть обусловлено напряжением процессов детоксикации ксенобиотиков и имеет защитное значение для развития ХОБЛ. Однако его наличие у некурящих лиц увеличивает риск развития заболевания.

Точечные гетерозиготные мутации 1051/У и 114А/У гена 08ТР1 и 113Т/Н гена ЕРНХ1 усиливают возможность развития ХОБЛ как у курящих, так и у некурящих лиц. Соответственно, выявление их наличия может быть использовано для составления программ предик-тивной диагностики риска развития ХОБЛ у лиц вредных производств и контактирующих с иными поллютантами окружающей среды.

В свою очередь, определение «нормальных» вариантов 1051/1 и 114А/А гена в8ТР1 и 113Т/Т гена ЕРНХ1 следует рекомендовать в качестве показателей, имеющих протективное значение для детоксикации ксенобиотиков.

ВЫВОДЫ

1. Делеционные полиморфизмы генов глутатионтрансфераз Т1 и М1 по сравнению с точечными мутациями локусов Не 105Val и Alall4Val гена глутатионтрансферазы Р1 и локуса Tyrl 13His гена микросомальной эпоксидгидролазы имеют меньшее значение для развития ХОБЛ у курильщиков и некурящих лиц. «Нулевой» вариант гена глутатионтрансферазы М1 встречается с одинаковой частотой у некурящих лиц, курильщиков и пациентов с ХОБЛ (46.6%, 46.4% и 47%, соответственно).

2. Наличие делеционного полиморфизма гена глутатионтрансферазы Т1 имеет неоднозначное значение для риска развития ХОБЛ. В группе безусловных курильщиков без признаков заболевания частота «нулевых» генотипов глутатионтрансферазы Т1 в 1,5 раза выше, чем у пациентов с ХОБЛ I стадии с уменьшением относительного риска возникновения заболевания в 2 раза (ОР=0.6, ДИ=0.55-2.82). При II стадии ХОБЛ встречаемость делеционного генотипа глутатионтрансферазы Т1 в 4 раза выше, чем у некурящих лиц с увеличением риска развития ХОБЛ в 4,7 раза (ДИ=3.17-7.09).

3. У пациентов с ХОБЛ по сравнению с курильщиками увеличивается частота встречаемости гетерозиготной мутации локуса AlalHVal и гетерозиготной мутации локуса Ilel05Val гена глутатионтрансферазы Р1 в 1,7 и 1,4 раза соответственно. Среди пациентов со II стадией ХОБЛ достоверно чаще встречается гетерозиготное носительство мутации локуса Tyrl 13His гена микросомальной эпоксидгидролазы по сравнению с некурящими лицами (50% против 38.3%, f = Н.4, р=0.022).

4. Среди безусловных курильщиков наблюдается более высокое содержание «нормальных» генотипов глутатионтрансферазы Р1 по сравнению с пациентами ХОБЛ, при этом вариант 105I/I локуса Не 105Val регистрируется в 1,6 раза, а вариант 114А/А локуса Alai 14Val - в 1,2 раза чаще. У здоровых лиц по сравнению с пациентами ХОБЛ носительство «нормального» варианта 113Т/Т локуса Tyrl 13His гена микросомальной эпоксидгидролазы определяется с достоверно более высокой частотой (47% против 37.5%, f = 19.4, р=0.012).

5. Наибольший вклад в возникновение ХОБЛ у курильщиков вносят гетерозиготные мутации 105I/V и 114A/V гена глутатион-

трансферты PI (ОР=2.4, ДИ=0.93-6.19 и 0Р=1.9, ДИ=0.83-4.4, соответственно). Присутствие гетерозиготного варианта 113Т/Н гена микросомальной эпоксидгидролазы увеличивает относительный риск возникновения II стадии ХОБЛ у некурящих лиц в 1.6 раза (ДИ=0.63-4.4).

6. Наличие «нормальных» генотипов 105I/I и 114А/А гена глута-тионтрансферазы Р1 в одинаковой степени снижает риск развития ХОБЛ у курильщиков (ОР=0.54, ДИ=0.19-1.56 и ОР=0.44, ДИ=0.19-1.12, соответственно), а присутствие генотипа 113Т/Т гена микросомальной эпоксидгидролазы уменьшает риск возникновения ХОБЛ у некурящих лиц (ОР=0.64, ДИ=0.28-1.45).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для предиктивной диагностики ранних стадий ХОБЛ может быть использовано определение наличия точечных мутаций генов глутатионтрансферазы Р1 и микросомальной эпоксидгидролазы в сыворотке крови методом ПЦР. Присутствие гетерозиготной мутации локуса Ile 105Val указывает на повышение риска развития ХОБЛ у курильщиков в 2.4 раза, а наличие гетерозиготной мутации локуса Alall4Val гена глутатионтрансферазы Р1 свидетельствует об увеличении угрозы возникновения ХОБЛ у курящих лиц в 1.9 раза. Присутствие гетерозиготной мутации локуса Tyrll3His гена микросомальной эпоксидгидролазы следует расценивать в качестве фактора, повышающего риск развития ХОБЛ у некурящих лиц в 1.6 раза.

2. Исследование делеционного полиморфизма гена глутатионтрансферазы Т1 в сыворотке крови методом ПЦР следует включить в программы диагностики ХОБЛ. Наличие данного генотипа у курильщиков снижает риск развития ХОБЛ в 2 раза, однако его присутствие у некурящих лиц повышает риск возникновения II стадии ХОБЛ в 4.7 раза.

3. Определение наличия «нормальных» вариантов 105I/I и 114А/А гена глутатионтрансферазы Р1 и варианта 113Т/Т гена микросомальной эпоксидгидролазы в сыворотке крови методом ПЦР может быть использовано при составлении персонифицированных программ предиктивной диагностики ХОБЛ в связи с их протективным эффектом относительно риска развития заболевания.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Невзорова В.А., Турло Е.Б., Тилик В.В. Генетические маркеры при хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // В мире научных открытий. 2010. №4 (10). С. 99-101.

2. Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Исаева М.П. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. №1. С. 13-15.

3. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Панченко Е.А., Вахрушева С.Е. Роль матриксных металлопротеиназ в формировании морфофункционального дисбаланса воздухоносных путей при хронической обструктивной болезни легких // Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №2. С. 9-13.

4. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Кудрявцева В.А., Лукьянов П.А. Содержание свободной металлопротеиназы ММР9 и комплекса MMP9/TIMP1 в сыворотке крови при стабильном течении хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Пульмонология. 2011. № 2. С. 75-80.

5. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Исаева М.П., Невзорова В.А. Вопросы предиктивной диагностики развития ишемической болезни сердца у больных хронической обструктивной болезнью легких // Материалы VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине». Владивосток. 2011. С. 65-79.

6. Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Nastradin О., Khasina M., Panchenko E., Turlo E. Association between glutation-S-transferases genotypes and risk of chronic obstructive pulmonary disease and coronary heart disease development // Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 5211.

7. Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Maistrovska J., Panchenko E., Nastradin O. Polymorphism of collagen I gene in chronic obstructive pulmonary disease associated with coronary heart disease // Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 4295.

8. Vakhrusheva S., Tilik Т., Nevzorova V., Gilifanov E., Issaeva M., Samoilenko E. Polymorphism of glutation-S-transferases T1 and Ml in chronic obstructive pulmonary disease // Abstract of 21-th European Respiratory Society Annual Congress. Amsterdam. 2011. P. 114.

9. Tilik Т., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Gilifanov E., Issaeva M., Openchuk E., Atamas O. Polymorphism of collagen I gene and glutation-S-transferases T1 and Ml in chronic obstructive pulmonary disease associated with cardiovascular disease // Abstract of 21-th European Respiratory Society Annual Congress. Amsterdam. 2011. P. 114.

10. Тилик T.B., Вахрушева C.E. Гены-кандидаты патологии метаболизма соединительной ткани при хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Человек и лекарство: материалы VI Дальневосточного конгресса ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ. 2009. (Приложение к Тихоокеанскому медицинскому журналу. 2009. № 4). С. 195.

11. Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., На-страдин О.В., Тилик В.В. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при ишемической болезни сердца в сочетании с хронической обструктивной болезнью легких // Российский Национального конгресс кардиологов: материалы конгресса. Москва. 2010. (Приложение 1 к журналу «Кардиоваскулярная терапия и профилактика». 2010. № 9 (6)). С. 328.

12. Вахрушева С.Е., Тилик Т.В., Минакова Е.Ю. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз GSTM1 и GSTT1 у курильщиков и при ранних стадиях хронической обструктивной болезни легких // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: материалы XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ. 2011. С. 76-77.

13. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Колесникова Н.Г. Полиморфизм генов коллагена I типа и глутатионтрансфераз GSTM1 и GSTT1 при хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: материалы XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ. 2011. С. 111-112.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДИ - доверительный интервал ИКЧ - индекс курящего человека ОР - относительный риск

ОФВ, - объем форсированного выдоха за 1 секунду

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

вБТИ- глутатион-Б-трансфераза Т1

С8ТМ1- глутатион-Б-трансфераза М1

ОБТРІ- глутатион-Б-трансфераза Р1

ЕРНХ1 - микросомальная эпоксидгидролаза

Работа выполнена при поддержке государственного контракта № 14.740.11.0186 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Вахрушева Светлана Евгеньевна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У КУРИЛЬЩИКОВ И ПАЦИЕНТОВ С РАННИМИ СТАДИЯМИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ

БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 03.04.2012 Формат 60x90 1/16. Усл. п.л. 1,0. Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 182

Отпечатано в типографии ВГУЭС 690600, г. Владивосток, ул. Гоголя, 41