Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Молекулярно-генетические маркеры метаболизма соединительной ткани при хронической обструктивной болезни легких и ее сочетании с ишемической болезнью сердца

Нг -

005008887

ТИЛИК Татьяна Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ МЕТАБОЛИЗМА СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ

БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И ЕЕ СОЧЕТАНИИ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

14.01.04 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 0ЕЗ т

Владивосток - 2012

005008887

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Невзорова Вера Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Кулаков Юрий Вячеславович

ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор Шакирова Ольга Викторовна ФГАОУ ВПО ДВФУ Минобрнауки России

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 2012 года

в «¿¿¿>> часов на заседании диссертационного совета К 208.007.01 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета

Автореферат разослан

М / 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент

Шестакова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск эффективных методов предупреждения и лечения состояний с полиморбидным фоном является одной из важнейших медико-социальных проблем в связи с увеличением продолжительности жизни населения и накоплением в популяции пациентов с сочетанными заболеваниями, взаимоотяго-щающими течение друг друга [Бессонова Л.О., 2008]. Учитывая общность факторов риска, одним из которых является курение, наличие коморбидной патологии в виде хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и ишемической болезни сердца (ИБС) чаще является правилом, чем исключением. При ХОБЛ создаются условия для возникновения кардиоваскулярных нарушений и для усугубления проявлений коморбидности [Невзорова В.А., 2007; Воис1ез1ет Ь.С.М., 2009]. Среди лидирующих, но нераспознанных при жизни причин смерти у больных ХОБЛ является ИБС. По данным крупных популяционных исследований, риск смерти от сердечно-сосудистой патологии у больных ХОБЛ повышен в 2-3 раза [НшаП Ь., 2005]. ХОБЛ и ИБС рассматриваются в качестве никотинассоциированных заболеваний, с доказанным взаимоотягощающим течением, в патогенезе развития которых немаловажное значение имеет состояние соединительной ткани, составляющей основу сердечно-сосудистой и дыхательной систем [8ие11еп М. С., 2006]. Признается актуальным поиск наиболее информативных маркеров риска развития сердечнососудистых заболеваний при ХОБЛ, выявление которых на ранних стадиях до развития сердечно-сосудистых катастроф следует относить к вопросам предиктивной диагностики.

Целью исследования является поиск информативных маркеров риска развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией напряжения на основе исследования содержания матриксной метал-лопротеиназы ММР-9, а также генетических полиморфизмов генов-кандидатов патологии метаболизма соединительной ткани.

Задачи исследования:

1. Определить содержание матрикс-разрушающей металлопро-теиназы ММР-9, ее комплекса с тканевым ингибитором Т1МР-1, а также соотношение указанных показателей при ХОБЛ и ее сочетании со стабильной стенокардией напряжения.

2. Изучить распределение делеций генов глутатионтрансфераз (ввТв) ОБТТ! и ОБТМ! при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС.

3. Оценить содержание аллелей G и Т гена коллагена I типа COLI AI при изолированной ХОБЛ и ее ассоциации со стабильной стенокардией напряжения. Охарактеризовать состояние гомозиготных GG и TT, и гетерозиготного GT генотипов гена COLI AI при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.

4. Выяснить вклад изменения содержания ММР-9, комплекса MMP-9/TIMP-1, делеций генов GSTs, наличия аллелей G и Т, генотипов GG, TT, GT гена COLI AI в риск развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией напряжения.

Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований получены данные, расширяющие представления о патогенетических механизмах развития ХОБЛ и ее комбинации с ИБС. Установлен вклад дисбаланса системы «протеолиз-антипротеолиз» в формирование ХОБЛ и ее комбинации с ИБС. Выявлено, что наиболее выраженные изменения содержания ММР-9 и ее комплекса MMP-9/TIMP-1 зафиксированы при кардиореспираторной патологии. Охарактеризовано распределение аллелей и генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTs и коллагена I типа COLI AI при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, в том числе в зависимости от стадии ХОБЛ. Определены возможности предиктивной диагностики развития ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, основанной на данных исследования полиморфизма генов GSTs и COLI AI. Установлено, что наличие делеции GSTT1 увеличивает риск развития изолированной ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии. Наличие генотипа TT и увеличение доли генотипа GT гена COLI AI наиболее значимо увеличивает риск развития ХОБЛ.

Практическая значимость работы. Расширены представления о патогенетических аспектах формирования изолированной ХОБЛ и кардиореспираторной патологии. Установлен вклад дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» в развитие ХОБЛ и ее комбинации со стабильной стенокардией напряжения, с наиболее выраженными изменениями в последней группе. Определена значимость оценки генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при ХОБЛ, ассоциацированной с ИБС. Установлена необходимость оценки генотипов гена COLI AI у пациентов с ХОБЛ. Результаты исследования могут найти применение в практической медицине в программах обследования и лечения ХОБЛ и ее комбинации с ИБС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для ХОБЛ и ее комбинации с ИБС характерно возникновение дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» со сдвигом в сторону активации протеолиза и максимальным повышением в сыворотке крови его маркеров - ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 при сочетанной патологии.

2. Среди выявленных полиморфизмов генов глутатионтрансфе-раз наибольшее значение в риске развития-ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии, имеет нулевой генотип GSTT1.

3. Важным фактором формирования соединительнотканного дисметаболизма при ХОБЛ и ее с ИБС является увеличение частоты содержания аллеля Т, наличие генотипов TT и GT гена COLI AI. Наиболее высокая частота встречаемости генотипа TT и GT установлена при изолированной ХОБЛ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 5 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Внедрение результатов исследования: Материалы диссертации внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений г. Владивостока и используются в учебном процессе при подготовке интернов, ординаторов и врачей на кафедре терапии, функциональной и ультразвуковой диагностики ФПК и ППС.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях регионального, российского и международного уровней: на XVIII - XXI Европейском респираторном конгрессе (Berlin, 2008; Vienna, 2009; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011); VI и VII Дальневосточном регионального конгресса с международным участием (Владивосток, 2009 и 2010); Российском Национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертации изложена на 150 страницах, содержит 14 рисунков и 3 таблицы, состоит из введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 186 источников (33 - отечественных и 153 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Обследовано 120 пациентов, находившихся на амбулаторном наблюдении в аллерго-респираторном центре и поликлиниках г. Владивостока в течение 2008-2011 гг. Для диагностики ХОБЛ применялись рекомендации международной программы GOLD (Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики ХОБЛ, пересмотр 2010 г.). Подтверждение или исключение диагноза ИБС у всех обследованных осуществлялось согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов и МКБ-10.

В исследование были включены лица обоего пола с фенотипи-ческими признаками европейской расы. У 60 пациентов установлена изолированная ХОБЛ II-III стадии заболевания стабильного течения (I группа). У 60 пациентов ХОБЛ II-III стадии заболевания в сочетании со стабильной стенокардией напряжения 1-Й ФК (И группа). Группы обследованных делились на подгруппы в зависимости от стадии ХОБЛ: ХОБЛ II стадии - при 50%<ОФВ!<80% от должных величин, ХОБЛ III стадии - при 30%<0фв,<50% от должных величин, ОФВ!/ФЖЕЛ<70%. Соответственно, были выделены следующие подгруппы: IA - ХОБЛ II стадии (n=30); IB - ХОБЛ III стадии (n=30); НА - ХОБЛ II стадии, ассоциированная с ИБС (n=30); IIB -ХОБЛ III стадии, ассоциированная с ИБС (п=30). Контрольную группу (п=30) составили условно здоровые добровольцы, соответствующие основной группе по возрасту, полу, этнической принадлежности. Определение содержания ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 проводилось методом иммуноферментного анализа [Mosman T.R., 1998] с помощью реактивов R&D Diagnostics Inc. (США). Учет результатов проводили с помощью анализатора Multiscan (Финляндия). Количество ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 рассчитывали путем построения калибровочной кривой и выражали в нанограммах/мл (нг/мл). ДНК выделяли из лейкоцитов с использованием фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфных локусов проводили методом ПЦР. Амплификацию производили на амплификаторе GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems производства США с использованием наборов реагентов для полиморфных маркеров: G1546T гена COLI AI и генов GSTs (производства «ГосНИИгенети-ка» полиморфные маркеры: I/D гена GSTM1, I/D гена GSTT1, G1546T гена COLI AI) в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты амплификации и гидролиза визуализировали на

трансиллюминаторе при помощи гель-документирующей системы Bio-Print 1500/20М (Франция). Для генотипов GSTs гомозиготные делеции определялись наличием одного амплификационного фрагмента длиной 350 п.н. Генотипы COL1А1 по мутации G1546T определялись набором фрагментов: ТТ-генотип - 312 п.н.; GT-генотип -312, 235 и 77 п.н.; GG - 235 и 77 п.н.

Результаты оценены с помощью программы STATISTICA 6.0. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами и контролем оценивали по тесту %2. Вычисляли относительный риск по формуле: OP=axd/bxc, где а - число больных с наличием и b — с отсутствием признака у больных; end- число здоровых соответственно с наличием и отсутствием признака.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, на базе которых проведены биохимические и генетические исследования: руководителю лаборатории химии неинфекционного иммунитета д.х.н., профессору П.А. Лукьянову, старшему научному сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. М.П. Исаевой.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

ММР-9 является одним из основных протеолитических ферментов, отвечающих за ремоделирование соединительной ткани. Установлено повышение ее уровня с сыворотке как при ХОБЛ, так и при ИБС [Zourdidakis Е., 2004; Kim S.E., 2009]. Однако в литературе отсутствуют сведения о содержании ММР-9 при сочетанной патологии. Согласно полученным результатам, при кардиореспираторной патологии содержание ММР-9 достоверно выше, чем в контроле и при изолированной ХОБЛ в 1,9 и в 1,5 раза соответственно (рис.1).

5оо -384,54±36,13*&

400 300 200 100 0

200,37±19,54 _256.42±23.47*<s

Контроль Изолированная ХОБЛ

ХОБЛ ассоциированная с

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,

& - разница между I и II группами достоверна при р<0,05.

Рис. 1. Содержание ММР-9 в сыворотке крови при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.

Полученные нами данные свидетельствуют о более значимом увеличении содержания ММР-9 именно при сочетании ХОБЛ и ИБС. Исходя из предыдущих исследований, указывающих на изменение уровня ММР-9 в зависимости от стадии ХОБЛ, нам представилось интересным исследовать состояние ММР-9 при различных стадиях ХОБЛ в обеих группах (рис. 2).

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

445.17± 4.1.3?.**

в

99,84d =26.24 323.9±28.93**

2

~200,37±19,54 _213±20 ,69*"" 1

В ХОБЛ II стадии

ОХОБЛ III стадии

Контроль

Изолированная ХОБЛ

ХОБЛ, ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, * - разница между подгруппами пациентов 1А и ПА, 1В и НВ достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов 1А и 1В, ПА и ИВ достоверна при р<0,05.

Рис. 2. Содержание ММР-9 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов.

Как следует из представленных данных, концентрация ММР-9 достигает максимальных значений при III стадии ХОБЛ в обеих группах. В то же время при III стадии ХОБЛ содержание ММР-9 выше при сочетанной патологии, чем при изолированной ХОБЛ (299,84±26,24, 445,17±43,32 нг/мл, соответственно, р<0,001). Повышение содержания ММР-9 по мере увеличения стадии ХОБЛ может быть связано с глубокими процессами ремоделирования легочной ткани при более тяжелых стадиях заболевания, что отмечено и в предыдущих исследованиях [Huiart L., 2005]. Увеличение содержания ММР-9 может быть рассмотрено в качестве индикатора более тяжелого течения ХОБЛ и одновременно быть связанным с риском развития ИБС. Для характеристики протеолитической активности используют не только концентрацию ММР-9, но и ее комплекс с ин-

гибитором Т1МР-1. В нашем исследовании содержание комплекса ММР-9/Т1МР-1 имеет сходную динамику с ММР-9 (рис. 3).

14 12 10 В 6 4 2 0

-3,15±03

Контроль

1,44±0,72*

6,41±0,57*&

Изолированная ХОБЛ ХОБЛ ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, & - разница между I и II группами достоверна при р<0,05

Рис. 3. Содержание ММР-9/Т1МР-1 в сыворотке крови при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.

Уровень комплекса повышен в обеих группах по сравнению с контролем (11,44±0,72; 6,41±0,57; 3,15±0,3 нг/мл, соответственно; р<0,001, р<0,001). Установлена достоверная разница между содержанием комплекса при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС в сторону увеличения в последнем случае (6,41±0,57; 11,44±0,72 нг/мл; р<0,001, соответственно). Концентрация комплекса ММР-9/Т1МР-1, также как и содержание свободной ММР-9, зависит как от стадии ХОБЛ, так и от наличия или отсутствия ИБС (рис. 4).

-14,96±0,87*

Ji,82±0,79*#"

7,92±0,56*

4

iiiii В ХОБЛ II

стадии

ШШ шщ

___ в ХОБЛ III стадии

Контроль

Изолированная ХОБЛ

ХОБЛ. ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, * - разница между подгруппами пациентов IA и IIA, 1В и IIB достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов IA и IB, НА и IIB достоверна при р<0,05.

Рис. 4. Содержание MMP-9/TIMP-1 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов.

В обеих группах содержание MMP-9/TIMP-1 достоверно выше при III стадии ХОБЛ. Полученные данные о содержании ММР-9/TIMP-1 согласуются с результатами исследования свободной ММР-9 и указывают на наличие дисметаболизма соединительной ткани в сторону активации процессов протеолиза при стабильном течении ХОБЛ и при сочетании ХОБЛ и ИБС.

Помимо изучения процессов протеолиза нам представилось интересным оценить антипротеазную активность сыворотки, рассчитав соотношение содержания свободной ММР-9 к комплексу ММР-9/TIMP-1 (соотношение «М:К»), Результаты исследования соотношения «М:К» в группе пациентов представлены на рисунке 5.

63,61±5,69

70 -

60-- —

50----—

40 --—

30 --—

20-- —

10-- —

о -—---

Контроль

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, & - разница между ! и II группами достоверна при р<0,01

Рис. 5. Соотношение концентрации ММР-9 и ММР-9/Т1МР-1при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС

Соотношение «М:К» имеет противоположную тенденцию относительно содержания ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1. Так в контроле показатель «М:К» максимальный и составляет 63,61±5,69. В группе изолированной ХОБЛ показатели «М:К» меньше, чем в контроле. Наиболее низкие значения соотношения «М:К» установлены при сочетании ХОБЛ и ИБС. Если расценивать «М:К» в качестве косвенного показателя, отражающего состояние антипротеазной активности сыворотки крови, то следует предположить, что анти-протеазная активность максимальна в контроле и снижена у пациентов ХОБЛ и, особенно, при ее сочетании с ИБС. Анализ соотношения «М:К» в зависимости от стадии ХОБЛ показал, что наименьшее значение «М:К» установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах обследованных (рис. 6). Итак, при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС происходит сдвиг в сторону активации протеолиза с наибольшими изменениями в группе пациентов с кардиореспираторной патологией.

Изолированная ХОБЛ ХОБЛ ассоциированная с ИБС

70 60 50 40 30 20 10 о

Контроль

Изолированная ХОБЛ ХОБЛ, ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, # - разница между подгруппами IA и IIA, IB и ИВ достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами IA и IB, IIA и ИВ достоверна при р<0,05.

Рис. 6. Соотношение концентрации ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов.

Соответственно, исследование содержания ММР-9, комплекса MMP-9/TIMP-1 и расчет их соотношения информативно для характеристики процессов соединительнотканного дисметаболизма при ХОБЛ и для дополнительной оценки сердечно-сосудистого риска.

ХОБЛ и ИБС относятся к никотин-ассоциированным заболеваниям. Гены GSTM1 и GSTT1 играют важную роль в биотрансформации продуктов сгорания табака. Согласно нашим исследованиям частота встречаемости делеции GSTT1 в группе контроля составляет 3,33 % и не отличается от данных крупных популяционных исследований [Imboden М., 2007]. У пациентов с изолированной ХОБЛ частота делеции GSTT1 возрастает по сравнению с контролем в 4 раза (13,33%, %2=6,79, р=0,009), а в группе пациентов с ХОБЛ в сочетании с ИБС -'в 6 раз (20%, х2=14,20, р=0,0002) (рис. 7).

Контроль

20%*

Изолированная ХОБЛ ХОБЛ ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05 Рис. 7. Частота делеции С8ТТ1 у пациентов ХОБЛ и при ее сочетании с ИБС.

Исследование частоты делеции гена GSTT1 в подгруппах пациентов со II и III стадией ХОБЛ показало отсутствие общей закономерности частоты делеции GSTT1 от стадии ХОБЛ (рис. 8). Хотя в ранее проведенном исследовании Imboden М. [2007] были получены данные о наличии прямой связи между частотой встречаемости делеции GSTT1 и увеличением тяжести течения ХОБЛ.

35 30 25 20 15 10 5 0

53,33%*""

8111»

1С (.1 о/ АН Я» ■■в - !<:#Й§§ -

10% -

Ж',,'.;',:-

__3,33% 6,67%

шш

ОХОБЛП стадии

ИХОБЛП стадии

Контроль

Изолированная ХОБЛ ХОБЛ ассоциированная с ИБС

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05 ri" Разница между подгруппами IA и IB, НА и IIB достоверна при р<0,05^ " - разница между подгруппами IA и IIA, IB и IIB достоверна при р<0,05.

Рис. 8. Частота встречаемости гомозиготной делеции гена GSTT1 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов

Обращает внимание факт наибольшей доли делеции GSTT1 в группе с III стадией ХОБЛ в сочетании с ИБС, когда она составляет 33,33% и регистрируется практически у каждого третьего пациента,

Исследование полиморфизма гена GSTM1 показало, что в контроле делеция выявлена у 46,67%, что сопоставимо с данными исследований в других популяциях (42-46%) [Jian-Qing Н., 2002]. Достоверных различий в частоте встречаемости полиморфизма GSTM1 между группами и подгруппами не установлено (48,33%, 58,33% соответственно, х2=2,01, р=0,16). Наличие сочетанного нулевого генотипа GSTM1 и GSTT1 зарегистрировано у четырех пациентов с III стадией ХОБЛ в сочетании с ИБС. Нулевые генотипы являются потенциально патологическими: они не кодируют функционально активные ферменты, которые являются важнейшим компонентом фазы детоксикации продуктов сгорания табака [Jeffery Р.К., 2004].

Таким образом, установлено максимальное значение делеции GSTT1 в группе пациентов с сочетанной патологией при III стадии ХОБЛ, что позволяет рассматривать делецию GSTT1 в качестве по-

тенциального маркера более тяжелого течения ХОБЛ в сочетании с ИБС. В то время как делеция GSTM1 не имеет существенного значения для оценки риска развития и ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.

Вклад в формирование соединительной ткани сердечнососудистой и дыхательной систем вносит коллаген I типа COLI AI, противодействующий силам растяжения и создающий прочность соединительнотканного матрикса. Полученные ранее данные позволяют утверждать, что повышенная экспрессия гена COLI AI связана с дисбалансом процесса синтеза — деградации коллагена при ХОБЛ [Nevzorova V.A., 2005]. Согласно результатам нашего исследования, частота аллеля Т по сравнению со здоровыми достоверно увеличивается при ХОБЛ в 5,3 раза (х2=61,89, р=0,00001) (табл. 1).

Таблица 1

Частота встречаемости аллелей G и Т и генотипов GG, GT и TT гена COLI AI при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС

маркер контроль I группа II группа

Аллель G 86,67% 29,63%*" 51,67%*"

Аллель Т 13,33% 70,37% *" 48,33%*"

Генотип GG 70% 1,85%*" 23,33%*"

Генотип GT 30% 51,85%* 56,67%*

Генотип TT 0% 46,3%*" 20%*"

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, - разница между группами достоверна при р<0,05.

При сочетании ХОБЛ и ИБС частота аллеля Т достоверно повышается по сравнению с контролем в 3,6 раза (%2=25,23, р=0,00001), но менее значительно относительно изолированной ХОБЛ (£= 10,00,' р=0,0016). В ранее проведенных исследованиях показано, что аллель Т является неблагоприятным и чаще встречается при ХОБЛ более тяжелого течения [Невзорова В.А., 2008; Herd R., 2009].

В литературе практически отсутствуют сведения о частоте встречаемости генотипов GG, GT и TT гена COLI Al при ХОБЛ в сочетании с ИБС. Как следует из данных, представленных в таблице 1, первые два генотипа представлены у здоровых, причем гомозиготный генотип GG в данном случае является преобладающим. Патологический генотип TT в контроле не установлен. У пациентов с

ХОБЛ и ее сочетании с ИБС доля генотипа 00 уменьшается наиболее заметно в первом случае, составляя 1,85% (х2=Ю0,35, р=0,00001). В то время как доля генотипа ТТ резко увеличивается с максимальными значениями при ХОБЛ (46,3%, *2=63,16, р=0,00001). В обеих группах почти в 2 раза возрастает содержание гетерозигот СТ (51,85%, х2=ЮД р=0,0016 и 56,67%, х2=М,83, р=0,0001, соответственно). Анализ аллелей и генотипов СОЫА1 при различной тяжести ХОБЛ в обеих группах представлен в таблице 2.

Таблица 2

Частота встречаемости аллелей и генотипов гена COLI AI

при I и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов

кон- I группа II группа

маркер,% троль IA IB IIA IIB

Аллель С 86,67% 40%*"" 16,67%*"" 70%*"" 33,3%*""

Аллель Т 13,33% 60%*"" 83,33% *"" 30%*"ff 66,7%*""

Генотип Сй 70% 3,33%*" 0%*" 40%*"ff 6,7%*""

Генотип ОТ 30% 83,33%*"" 12,5%*"" 60%*" 53,3%*"

Генотип ТТ 0% 13,34% *"* 87,5%*"" 0%"" 40%*""

Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05, " - разница между подгруппами 1А и 1В, НА и ИВ достоверна при р<0,05, * - разница между подгруппами 1А и НА, 1В и ПВ достоверна при р<0,05.

Согласно данным, аллель Т в контроле выявлен у 13,33%, частота его встречаемости увеличивается по сравнению с контролем во всех группах (х2=43,20, р=0,00001; х2=92,52, р=0,00001; Х2=6,45, р=0,01; х2=55,89, р=0,00001). Максимальное содержание аллеля Т установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах. Как следует из данных таблицы 2 наименьшее количество аллеля G и наибольшее аллеля Т установлено при III стадии изолированной ХОБЛ (16,67%, Х2=92,52, р=0,00001 и 83,33%, х2=6,83, р=0,01 по отношению к контролю, соответственно). При сочетанной патологии достоверное уменьшение аллеля G и увеличение аллеля Т зарегистрировано только при III стадии ХОБЛ. При этом их количество достоверно отличается от содержания у пациентов с III стадией изолированной ХОБЛ.

Количество гомозигот GG резко уменьшается по мере нарастания тяжести ХОБЛ в каждой группе и не встречается при III стадией

заболевания. Патологический генотип TT, напротив, преобладает в этой группе пациентов, достигая 87,5% (х2=157,14, р=0,00001 по отношению к контролю), достоверно обнаруживаясь практически во всех подгруппах. Достоверно более высокая частота генотипа GT выявлена в IA подгруппе. Полученные данные могут свидетельствовать об ответственности генотипов GT и TT за развитие изолированной ХОБЛ [Nevzorova V.A., 2005]. При сочетанной патологии изменения в содержании генотипов COLI AI установлены только при III стадии ХОБЛ. В этой группе значительно снижается доля гомозиготного генотипа GG и увеличивается доля генотипа TT (6,7%, Х2=83,81, р=0,00001 и 40%, х2=50,0, р=0,00001, соответственно). Очевидно увеличение доли аллеля Т и появление патологического генотипа TT в большей степени связано с ремоделированием дыхательных путей. Однако высказанное предположение носит гипотетический характер и требует дальнейших исследований. Так или иначе, полученные результаты свидетельствуют о большей предрасположенности к значительным изменениям соединительнотканного метаболизма у пациентов с ХОБЛ при наличии аллеля Т и генотипов GT и TT гена COLI AI [Nevzorova V.A., 2005; Гельцер Б.И., 2006].

Установленные в исследовании данные, касающиеся состояния дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» и процессов соединительнотканного дисметаболизма, связанного с полиморфизмами генов GSTT1 и COL1A1, позволили выяснить вклад указанных изменений в ОР ХОБЛ и ассоциированной патологии.

Примененный в исследовании метод расчета ОР показал, что увеличение содержания свободной ММР-9 выше 200,37±19,54 нг/мл связано с повышением ОР ХОБЛ и ассоциированной ИБС в целом по группе в 13,95 раз (95%ДИ=8,18-23,76). Рассчитать ОР отдельно по группам невозможно, поскольку при сочетанной патологии у всех пациентов содержание ММР-9 выше контрольных значений 200,37±19,54 нг/мл. Также превышение содержания комплекса MMP-9/TIMP-1 выше 3,15±0,3 нг/мл (показатель контроля) увеличивает ОР ХОБЛ и ассоциированной ИБС в целом по группе в 136 раз (95% ДИ=20-914,62). Для того, чтобы рассчитать ОР развития ИБС у пациентов ХОБЛ нами было определено среднее значение ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 в целом по группе, которые составили 320,48±29,8 нг/мл и 8,95±0,64 нг/мл, соответственно. При содержании ММР-9 выше 320,48±29,8 нг/мл, а комплекса более 8,95±0,64 нг/мл увеличивается ОР ИБС у пациентов ХОБЛ в 32 раза (95% ДИ=19,34-52,96) и 3,3 раза (95% ДИ=2,39-4,56), соответственно. Примененный метод

расчета ОР подчеркнул информативность использования содержания ММР-9 и ее комплекса с TIMP-1 в сыворотке для оценки течения ХОБЛ и степени сердечно-сосудистого риска.

Изучение распределения делеций генов GSTT1 и GSTM1 при ХОБЛ и ее комбинации с ИБС продемонстрировало существенные изменения только в состоянии гена GSTT1. Метод ОР показал, что наличие делеции GSTT1 увеличивает ОР изолированной ХОБЛ в 4,46 раза (95% ДИ=3,36-5,94), а сочетанной кардиореспираторной патологии - в 7,26 раза (95% ДИ=5,76-9,15). Соответственно, ухудшение процессов детоксикации ксенобиотиков значимо способствует развитию ХОБЛ, но еще более значительно увеличивает ОР развития ее ассоциации с ИБС.

Полученные данные выявили, что частота аллеля Т гена COL1A1 достоверно больше увеличивается при ХОБЛ, чем при сочетании ХОБЛ и ИБС. Наличие аллеля Т увеличивает ОР изолированной ХОБЛ в 13,45 раза (95% ДИ=9,72-18,63), ее сочетания с ИБС - в 5,3 раза (95% ДИ=4,11-6,84). Частота встречаемости генотипа GT в обеих группах практически одинакова, тогда как частота генотипа TT достоверно повышается как при изолированной ХОБЛ, так и при сочетанной патологии, однако максимальное значение данный показатель имеет именно при изолированной ХОБЛ. Генотип GT более значимо увеличивает ОР изолированной ХОБЛ (ОР=65,4, 95% ДИ=15,62-273,78) по сравнению с сочетанной патологией (ОР=5,67, 95% ДИ=3,86-8,32). Присутствие комбинации генотипов TT и GT сопряжено с повышением ОР изолированной ХОБЛ в 126,13 раз (95% ДИ=30,32-524,66), а ее ассоциации с ИБС - в 7,67 (95% ДИ=5,29-11,11), что подчеркивает значимость указанных генотипов в развитии соединительнотканного дисметаболизма при ХОБЛ.

Итак, исследование состояния маркеров соединительнотканного метаболизма при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС показало, что в обеих группах, несмотря на стабильное течение заболевания, присутствует активация процессов протеолиза в виде повышения содержания ММР-9 и ее комплекса с TIMP-1 с наиболее значимыми изменениями в группе пациентов с сочетанной патологией. Из генов детоксикации ксенобиотиков на развитие ХОБЛ и, особенно, ее сочетания с ИБС наиболее значим полиморфизм гена GSTT1. В то время как изменение содержания аллелей и генотипов COLI AI более тесно связано с развитием изолированной ХОБЛ. Указанные изменения могут быть использованы для формирования программ пре-диктивной диагностики ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.

ВЫВОДЫ

1. При ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС происходит активация про-теолиза, о чем свидетельствует повышение содержания мат-риксной металлопротеиназы 9 и ее комплекса с тканевым ингибитором 1 в сыворотке крови с максимальными изменениями при III стадии ХОБЛ и ее сочетании с ИБС (445,17±43,32 нг/мл, 14,9б±0,87 нг/мл). Антипротеазная активность, оцененная по соотношению матриксной металлопротеиназы 9 к ее комплексу с тканевым ингибитором I снижается по сравнению со здоровыми, как при изолированной ХОБЛ, так и, особенно, при ко-морбидной патологии (41,54±15,81 нг/мл, 35,33±22,93 нг/мл, соответственно). Минимальное значение соотношения установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах.

2. Изучение полиморфизмов генов глутатионтрансфераз Т1 и М1 показало достоверное увеличение делеций глутатионтрансфе-разы Т1 у пациентов ХОБЛ и при наличии ее ассоциации с ИБС. Максимальное присутствие (до 33,33%) нулевого генотипа гена глутатионтрансферазы Т1 установлено у пациентов с III стадией ХОБЛ в комбинации с ИБС.

3. Исследование содержания аллелей G и Т и генотипов гена коллагена I типа показало значительное увеличение частоты встречаемости аллеля Т гена коллагена I типа как у пациентов ХОБЛ, так и при наличии ИБС с максимальный присутствием при III стадией ХОБЛ (83,33%). В обеих группах значительно увеличивается доля генотипа TT и гетерозигот GT по сравнению с контролем. Наибольшее количество гомозигот TT (87,5%) установлено при III стадии изолированной ХОБЛ.

4. При повышение содержания матриксной металлопротеиназы 9 выше 200,37±19,54 нг/мл и ее комплекса с тканевым ингибитором 1 выше 3,15±0,3 нг/мл увеличивается относительный риск ХОБЛ, в том числе в сочетании с ИБС, в 13,95 раз и в 136 раз, соответственно. При содержании матриксной металлопротеиназы 9 выше 320,48±29,8 нг/мл, а комплекса более 8,95±0,64 нг/мл увеличивается относительный риск ИБС у пациентов ХОБЛ в 32 раза и 3,3 раза, соответственно.

5. Полиморфизм генов глутатионтрансферазы Т1 и коллагена I типа у пациентов ХОБЛ и при ассоциации с ИБС может быть использован в программах предиктивной диагностики указанных заболеваний. Так, наличие нулевого генотипа гена глута-

тионтрансферазы Т1 в большей степени определяет относительный риск возникновения сочетанной патологии, чем изолированной ХОБЛ. Наличие аллеля Т, генотипа GT и комбинация генотипов TT и GT коллагена I типа более значимо увеличивает относительный риск изолированной ХОБЛ по сравнению с ассоциированной ИБС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки протеолитической активности сыворотки крови при ХОБЛ и ее комбинации с ИБС может быть использован метод исследования свободной ММР-9 и ее комплекса с TIMP-1. В первом случае содержание выше 200,4 нг/мл, а во втором -выше 3,2 нг/мл в 13,9 и 136 раз, соответственно, увеличивает относительный риск ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.

2. Соотношение ММР-9 и комплекса может применяться для характеристики антипротеазной активности сыворотки крови. Для ХОБЛ характерно снижение этого соотношения до 41,5, а для ассоциированной патологии до 35,3.

3. Исследование протеолитической активности сыворотки крови с помощью определения ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 может быть использовано в программах оценки сердечнососудистого риска при ХОБЛ. Так превышение содержания ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 выше 320,5 нг/мл, а комплекса более 8,9 нг/мл, увеличивает относительный риск ИБС у пациентов ХОБЛ в 32 раза и 3,3 раза, соответственно.

4. Исследование полиморфизма генов глутатионтрансферазы GSTT1 и коллагена I типа COLI AI может быть включено в программы предиктивной диагностики ХОБЛ и ее сочетания с ИБС. Для изолированной ХОБЛ более значимо определение наличия аллеля Т, гомозиготного патологического генотипа TT и его комбинации с GT гена коллагена I типа. В этом случае относительный риск изолированной ХОБЛ возрастает в 13,5 раза, 126,1 раза, 5,7 раза, соответственно. Для сочетанной патологии более значимо присутствие нулевого гомозиготного генотипа GSTT1, когда относительный риск ассоциированной патологии возрастает в 7,3 раза, а изолированной ХОБЛ - в 4,5 раза, соответственно.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Исаева М.П. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при хронической обструктивной болезни легких, ассоциирован* ной с ишемической болезнью сердца // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. №1. С. 13-15.

2. Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Тилик Т.В. Курение табака и функционально-морфологическое ремоделирование слизистой оболочки верхних дыхательных путей // Российская отоларингология. 2010. №4 (47). С. 115-120.

3. Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Тилик Т.В. Клинические проявления патологии верхних дыхательных путей при хронической обструктивной болезни легких // Российская отоларингология. 2010. №6 (49). С. 83-85.

4. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Панченко Е.А., Вахрушева С.Е. Роль матриксных металлопротеиназ в формировании морфофункционального дисбаланса воздухоносных путей при хронической обструктивной болезни легких // Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №2. С. 9-13.

5. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Кудрявцева В.А., Лукьянов П.А. Содержание свободной металлопротеиназы ММР9 и комплекса MMP9/TIMP1 в сыворотке крови при стабильном течении хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Пульмонология. 2011. № 2. С. 75-80.

6. Kochetkova Е., Maistrovskay U., Albavichus S., Tilik T., Massard G., Kessler R. Effect of the matrix metalloproteinase-9 on bone in chronic obstructive pulmonary disease // Abstract of 19-th European Respiratory Society Annual Congress. Vienna, Austria, Barcelona. 2009. P. 3253.

7. Nevzorova V., Tilik T., Vakhrusheva S., Maistrovska J., Gilifanov E., Golotina O. The role of matrix metalloproteinase-9 in the formation of chronic obstructive pulmonary disease associated with coronary heart disease // Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 4296.

8. Tilik T., Vakhrusheva S., Maistrovska J., Gilifanov E., Golotina O., Panchenko E., Nastradin O. Polymorphism of collagen I gene in

chronic obstructive pulmonary disease associated with coronary heart disease // Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 4295.

9. Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S„ Nastradin O., Khasina M., Panchenko E. Association between glutation-S-transferases genotypes and risk of chronic obstructive pulmonary disease and coronary heart disease development.// Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 5211.

10.Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Gilifanov E., Issaeva M. Polymorphism of collagen I gene and glutation-S-transferases T1 and Ml in chronic obstructive pulmonary disease associated with cardiovascular disease //Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. - Amsterdam. 2011. P. 114.

11. Vakhrusheva S., Nevzorova V., Tilik T., Gilifanov E., Issaeva M. Polymorphism of glutation-S-transferases T1 and Ml in chronic obstructive pulmonary disease // Abstract of 21-th European Respiratory Society Annual Congress. - Amsterdam. 2011. P. 114.

12. Невзорова В.А., Тилик T.B., Вахрушева C.E., Минакова Е.Ю. Металлопротеиназа ММР9 как причина коморбидности хронической обструктивной болезни легких и ишемической болезни сердца // Вопросы повышения качества оказания медицинской помощи в муниципальном здравоохранении : Материалы научно-практической конференции. Владивосток. 2010. С. 22.

И.Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Иченко В.Б., Лепейко Ю.Б., Тилик Т.В., Лобода О.В., Елецкая М.П., Красникова A.A. Ремо-делирование слизистой оболочки и клинические аспекты влияния курения табака на органы дыхания // Актуальные вопросы оториноларингологии : Материалы научно-практической конференции оториноларингологов Южного и Северо-Кавказского федеральных округов РФ. Волгоград. 2010. С. 46 - 47.

М.Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Настрадин О.В. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при ишемической болезни сердца в сочетании с хронической обструктивной болезнью легких //Российский Национального конгресс кардиологов: материалы конгресса. Москва. 2010. (Приложение 1 к журналу «Кардиоваскулярная терапия и профилактика». 2010. №9 (6)). С. 328.

15.Тилик Т.В., Вахрушева С.Е. Содержание свободной металло-протеиназы ММР9 и комплекса MMP9/TIMP1 в сыворотке крови при стабильном течении хронической обструктивной болез-

ни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Человек и лекарство : Материалы VII Дальневосточного регионального конгресса ученых с международным участием. Владивосток : Медицина ДВ. 2010. №3. С. 139 -140. 1б.Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Минакова Е.Ю. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз GSTM1 и GSTT1 у курильщиков и при ранних стадиях хронической обструктивной болезни легких // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : Материалы XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток : Медицина ДВ. 2011. С. 76-77. П.Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Исаева М.П., Невзорова В.А. Вопросы предиктивной диагностики развития ишемической болезни сердца у больных хронической обструктивной болезнью легких // Материалы VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине», 2011, Владивосток, С.65-79.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИБС - ишемическая болезнь сердца ОР - относительный риск

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

COLI AI - ген коллагена I типа al цепи

GSTT1 - глутатион-8-трансфераза Т1

GSTM1 - гены глутатион-Б-трансфераза М1

GSTs - гены глутатион-Б-трансфераз

ММР-9 - матриксная металлопротеиназа

TIMP-1 - тканевой ингибитор металлопротеиназы ММР-9

MMP-9/TIMP-1 - комплекс ММР-9 с тканевым ингибитором TIMP-1

Работа выполнена при поддержке государственного контракта № 14.740.11.0186 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Тилик Татьяна Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ МЕТАБОЛИЗМА СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И ЕЕ СОЧЕТАНИИ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 18.01.2012 Формат 60x90 1/16. Усл. п.л. 1,0. Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 18

Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии ООО «Рея» г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 426