Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Безинструментальный иммуноанализ с использованием новых водонерастворимых цветных меток

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГБ ОД

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

6 ЯНВ 19ГГ)

На правах рукописи

РАЕВ

Михаил Борисович

БЕЗИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВЫХ ВОДОНЕРАСТВОРИМНХ ЦВЕТНЫХ МЕТОК

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нацк

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорг низмов Уральского отделения Российской Академии Наук.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Кеворков H.H.,

кандидат медицинских наук Плаксин Д.Ю.

Официальные оппоненты: академик ЙЕН РФ, доктор медицинских наук, профессор Й.Й.Ярилин чл.корр. ЙЕН РФ, доктор биологических наук, профессор В.Я.Арио!

Ведущая организация: Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г.Н.Габричевского

Защита состоится 'оссь" У*. _1995 г. в/_/_час на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу:

115478, г.Москва, Каширское шоссе, д.24 к.2

С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздравмедрома РФ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С.Сеславт

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Интенсивное развитие исследований в области иммунодиагностики как в наией стране так и за рубежом стимулирует быстрое развитие научных разработок и стремление к скорейшему переходу от лабораторных моделей к промышленному или полупромышленному производству диагностических тест-систем, изготовленных в форме готовых к использовании наборов. Возможность такого перехода является серьезным стимулом к исследованию и разработке новых материалов, методов, реагентов, способных существенно увеличить чувствительность, специфичность, стабильность, скорость и производительность, простоту создаваемых систем анализа, экономичность их производства.

Стремление к повышению чувствительности иммуноанализа, осуществляемого в варианте количественного учета результатов, определило стратегии, направленную на разработку нового прецизионного аппаратурного оснащения и, как следствие, услоянекие и удорожание технологии производства систем количественного анализа и самой процедуры исследования. К таким методам мозно отнести радиоиммунологический (РИА), иммуноферментный (ИФА) и ряд вариантов бис- и хемилюминисцентных типов иммуноанализов. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью. т.е. позволяит определять любое соединение, против которого возможно получение специфических антител, высокой специфичностью и чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, у названных методов есть существенные недостатки. В первую очередь - это зависимость от сложной и дорогостоящей регистрирукией аппаратуры и ограниченно доступных реагентов, используемых либо в технологии изготовления диагностикумов, либо непосредственно в процедуре анализа, опасность для здоровья, которую представляют введение изотопных меток, подготовка и выполнение РИА, а также использование токсичных и/или канцерогенных хромогенов в ИФн.

Наряду с этим, в последнее десятилетие укрепилась тенденция к создании новых, простых и доступных методов иммунохимических исследований, почти или полностью освобожденных от какой-либо аппаратурной и инструментальной зависимости. Эти методы, закрепившиеся в рабочей терминологии как "безинструментальные'', предназначены для быстрых, скрининговнх исследований любых количеств биологического материала в условиях малых клинических и зпидеии-

ологических лабораторий, отделений переливания крови, а такке полевых условиях и в домашней самодиагностике. Очевидно, чт простота техники проведения анализа и его экспрессность н должны уменьшать чувствительность и специфичность определения, этим связана базовые элементы стратегии в разработке методов им муноанализа, способных составить конкуренции РИА и ИФА во все спектре их разнообразия. Все это определило стремление к подбор таких меток, которые, заменив собой изотопные и ферментные, об ладали бы рядом новых необходимых качеств - в первую очередь способностью непосредственно визуализировать происходящие стере оспецифические взаимодействия без дополнительной стадии обнару гения самих меток. Вместе с тем, такие метки долзвны обладат способностью взаимодействовать с иммунореактивннми соединениям с образованием прочных и стабильных конгюгатов. Применение по добных реагентов е системах иммуноанализа помогло бы решить одн из основных задач в конструировании иммунодиагностических сист ем, а именно, освободив от недостатков, имеющих место в совре менных системах иммуноанализа, сохранить и даяе усилить такие и. преимущества как чувствительность и специфичность, дополнив эт: преимущества новыми качествами: простотой, экспрессностью и, чт не менее важно, безопасностью самой процедуры определения.

Цель и задачи работы.

Цель исследования - разработка универсальной технологии по лучения реагентов для прямой визуализации связанных аналитов конструирование эффективных модельных систем безинструментально го иммуноанализа с использованием в качестве новых меток водоне растворимых красителей.

Основные задачи:

1.Подобрать соединения из ряда водонерастворимнх красителе: и исследовать возможность использования их суспензоидных фор: в качестве меток в реагентах для иммунодиагностических целей.

2.Разработать технологически схему и определить оптимальны условия синтеза конъигатов стереореактивных соединений с цветны ми метками.

3.Исследовать стабильность синтезированных реагентов и опре делить оптимальные условия их хранения.

4.Сконструировать ряд модельных систем иммуноанализа.

5.Провести сравнение сконструированных модельных иммунодиагностических систем с существующими по основным параметрам, характеризующим иммуноаналитические наборы: чувствительность, спе-

ричность, стабильность, простота, экспрессность, экономичность готовления.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые использованы частицы водонерастворииых красителей с :окой цветностью в качестве меток детектирующих компонентов :т-систем, что обеспечило увеличение чувствительности определяя различных аналитов.

Впервые разработана двухэтапная схема ковалентного конъюги-зания аффинных реагентов с цветными метками с использованием утаральдегидной активации пептизированных частиц красителей.

Использование разработанной технологии привело к получению агностических реагентов, которые стабильны при длительном храним .

Сконструированная модель тест-системы для определения анти-п к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 продемонстрировала высокую чувствительность :пецифичность анализа при проверке ее работы в официальных папах сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ-1 ]Ка им.Л.Й.Тарасезича.

Сконструированные модельные системы определения хорионическ-з гонадотропина человека, антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, ДНК фага иода позволили значительно упростить и ускорить процедуру зтветствуищих пымунохимических и генно-аналитических исследо-гШЙ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Подобранные красители из групп суданов и формазанов и сус-«зоидного углерода обладают высокой цветностьй и могут быть лользованн для получения на их основе высокоактивных цветных спензоидных конъюгатоз.

- Разработанная универсальная технология ковалентного яъигирования аффинных соединений с суспензоидными частицами ¡^нерастворимых красителей позволяет получать реагенты, стальные при хранении в течение, как минимум, одного года в диа-зоне температур от +4°С до + 22°С.

- Использование полученных реагентов в модельных системах я безинструментального определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, рионического гонадотропина человека и ДНК фага лямбда приводит существенному увеличении чувствительности, специфичности, стельности, экспрессности и простоты анализов.

По материалам работы подана патентная заявка с датой приори-га 30 декабря 1993 года.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на LXII сессии АМН СССР по проблемам СПИДа в 1991 года и на I Международном симпозиуме "Проблемы токсикологии и охраны окружающей среды" в 1991 году.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы три научные работы.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, первой част;:, состояцей из дбу;: глав, второй части, третьей части, состоящей из 2 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на i0G страницах машинописного текста, вкличая 5 таблиц и 12 рисунков. Список литературы содернит 183 наименования работ: 34 на русском и 149 на иностранном языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Материалы и методы исследований.

Для изготовления цветных водонерастворимых меток использовали красители Фирмы "Reanal" (Венгрия): тетразолиевый синий ди-формазан (ТСДФ), тетразолиеЕый фиолетовый формазан (ТФФ), нео-тетразолиевый диформазан (НТДФ); объединения Реахим (Россия): судан II, судан III, судан черный.

5 сравнительных экспериментах использовали конъюгаты: Белок А, меченный пероксидазой хрена фирмы Aaershai (Великобритания), стрептавидин, меченный пероксидазой хрена фирмы Signa (CIA), белок А, меченный коллоидным золотом с размерами частиц 40 нм. фирмы GoidMark Biologicals (США).

При конструировании модельной тест-системы для определения антител к ВИЧ-i и ВИЧ-2 использовали рекомбинантнне полипептидн "enul", "gaßl", "poll" и "envll" 5ТК "Биосервис" (Россия).

В качестве системы сравнения при определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 использовали набор "Блот-ВИЧ" БТК "Биосервис" (Россия).

При исследовании чувствительности и специфичности сконструированной модельной тест-системы для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 использовали стандартные панели сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1 в низких концентрациях серий 003 и 004 и стандартную панель сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ серии 001 НПО "Вектор" (Россия), сертифицированные ГИСК им.Д.А.Тарасевича.

При конструировании системы для определения хорионического гонадотропкиа (ХГЧ) человека использовали моноклональные антитела А8 0420 клона 1001 и AB 0422 клона 1058 против бета-субъеди-

ницы ХГЧ фирмы В1пах (США).

В дот-гибридизационном анализе использовали ДНК фага лямбда фирмы Алеман (Великобритания).

Углерод получали конденсацией на стеклянной поверхности из пламени горящего толуола, с последующей промывкой органическими растворителями.

Проявление пероксидазы в дот-Е1Л5А проводили с использованием субстратной смеси следуищего состава:

3,5 мл. 0,05 Н Трис-НС1 буфера с 0,15 М ЫаС1 рН 7,5, 1,5 мл. 4-С1-1-нафтол (10 мг/мл. этанола), 16 мкл. 3% перекиси водорода.

Ферментную детекции при определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проводили реагентами из набора "Блот-ВИЧ" БТК "Биосервис" по инструкции производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ.

1.Получение диагностикумов на основе водонерастворимых красителей,

1.1.Получение суспензоидных форм водонерастворимых красителей.

Для изготовления меток подбирали красители, обладающие наибольшей цветностью в сочетании с минимальной растворимостью в воде.

Сухие порошки гидрофобных красителей суспендировали в 27. растворе БСА в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,12 М ИаС1 рН 7,25 (ФБР) в течение суток при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Концентрация красителей в пересчете на су' хой вес составляла 52. Полученные суспензии подвергали несткой ультразвуковой обработке циклами по 30 секунд (время нагревания раствора от 0/+4°С до 40°С) с последующим охлаждением после каждого цикла до 0/+4°С. Экспериментально было определено, что эффективное суммарное время озвучивания составляет 60 минут.

С целью удаления оставшихся относительно крупных частиц реагенты центрифугировали 5 минут при 6000 в. В результате получали окраиенные взвеси суспензоидных частиц, на поверхности которых адсорбирован БСА. Протеинизировашше подобным образом частицы устойчивы в растворе (не оседают при хранении в течение длительного времени) и готовы для активации и дальнейшего конъюги-рования.

Сорбированный на поверхности частиц полимер (БСА) экспонирует в растворитель функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо- и/или гетеробифункциональными конъюгируащими

соединениями. Последующая обработка протеинизированных частиц бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам сорбированного белка, приводит к ковалентным сшивкам между сорбированными молекулами БСА и одновременно - к внедрении на поверхность комплекса реакционнос-пособных групп бифункционального реагента.

Суспензоидые реагенты активировали инкубацией в течение 40 минут при комнатной температуре равных объемов суспензоидных красителей и 25'/. раствора глутарового альдегида, после чего ре-акционнуш смесь подвергали гель-фильтрации на колонке с ЗерЬагозе С1.-6В для удаления избытка глутаральдегида и несвязанного БСА. Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие краситель, объединяли и концентрировали сухим полиэтиленгликолем 35000 - 40000 до исходного (наносимого на колонку) объема.

Разработанная схема предварительной механической обработки красителей и хроматография получаемых реагентов позволила получать реагенты с минимальной дисперсией по размеру частиц, максимально стандартизируя каждый из этапов технологической схемы.

Конъвгаты белка А с суспензоидными частицами красителей получали соединением на роторном встряхивателе девяти частей раствора активированного красителя и одной части раствора белка А в ФБР. Для определения оптимальной концентрации последнего сравнивали результаты конъюгигования при конечных концентрациях его в реакционной смеси: 0,1 мг/мл; 1,0 мг/мл; 10,0 мг/мл. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре и встряхивании реак-ционнув смесь выдерживали ночь при +4°С, центрифугировали 5 минут при 6000 д и проводили гель-фильтрацию на колонке с ЗерЬаго-зе СЬ-бВ. Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъшгат, объединяли и добавляли БСА - для стабилизации и блокирования возможно оставшихся непрореагировавших реакционноспособ-ных групп и глицерин - для стабилизации и криопротектирования до конечных концентраций 1 У. и 20Х соответственно.

Проверкой на модельных системах дот-анализа, в которых в качестве детектирующего реагента использовали углеродный конъшгат, а в качестве аналита - 1вБ человека, сорбированные на непористой твердой фазе из разведений, кратных двум, было установлено, что при концентрации Белка А - 0,1 мг/мл в реакционной смеси, чувствительность детекции составила - 320 нг/мл; при концентрации 1,0 мг/мл - 80 нг/мл; при концентрации 10 мг/мл - 80 нг/мл. Таким образом, было определено, что оптимальной для конъюгирования

белка А является его концентрация в реакционной смеси, равная 1,0 мг/мл.

Схема синтеза конъигатов стрептавидина с суспензоидными частицами красителей, а также поликлональных антител овцы против IgG кролика и ыоноклональных антител к бета-субъединице ХГЧ принципиально ничем не отличается от схема синтеза конъигатов с Белком А. При проверке работы конъвгата Стрептавидин-Яглерод в качестве аналита использовали биотинилированные IgG овцы. При этом, было установлено, что оптимальной концентрацией для получения конъигатов стрептавидина с суспензоидными красителями является 1,0 мг/мл в реакционной смеси. Для конъигатов поли- и моноклональных антител, проверку которых осуществляли . с использованием в качестве аналитов, соответственно, IgG' кролика и ХГЧ, оптимальной была определена концентрация - 5.0 - 10.0 мг/мл аффинных соединений в реакционной смеси.

Размеры частиц оценивали при помом счетчика Coulter N4M (данные либезно предоставлены сотрудником лаборатории полимеров для биологии Института биоорганической химии им. Н.М.Яемякина и В.А.Овчинникова с.н.с. Ю.Лукиным). Результаты исследования представлены на Рис.1.

COULTER N4M

VERSION 10.1В

1 ОСТ 1991

UNIMODAL RESULTS SAMPLE ID

MEAN DIAMETER= 162 NM 95% LIMITS

STANDARD DEVIATION

MU 2/GAMMA SQ

155 TO 169 NM 52 NM

.17

DIFFUSION » 2.65 E-M COEFFICIENT CH»»2/SEC

10 100 1000 PARTICLE DIAMETER (NM) UNIMODAL DISTRIBUTION

Рис.1. Исследование размеров частиц суспензоидных красителей Сна примере углерода).

Согласно полученным результатам, средний размер частиц состе вляет 162 ям. При этом, 957. частиц имеют размеры от 155 нн дс 169 ни. Столь невысокий разброс в размерах объясняется оптимальными условиями стандартизации в ходе подготовки реагентов и имеет больвое значение при конструировании тест-систем, в частности, при выборе твердой фазы й определении формата аналитической процедуры.

Стабильность, получаемых на каждом этапе технологической схемы, реагентов исследовали в условиях хранения их при температуре +4вС и +22°С, проверяя качество синтезированных из хранящихся исходных реагентов конъюгатов через 1, 6 и 12 месяцев в сравнении с хранящимися готовыми конъвгатами и со свежеприготовленными реагентами в прямом дот-анализе,

В результате прямых сравнительных экспериментов были получены аналогичные результаты, как с белком А, так и со стрептавиди-ном, а именно: хранение всех реагентов при +4° С не изменяло чувствительность определения на протяжении всего наблюдаемого срока. Хранение при +22*С вызывало снижение эффективности работы систем анализа, как с белком А, так и со стрептавидином в два раза после иести месяцев и в восень раз после года, причем наблюдаемое снижение происходило только за счет изменений качества пептизированного и активированного реагентов.

Что касается стабильности готовых диагностикумов, то в наших экспериментах конъагаты белка А и стрептавидкна с красителями после их хранения, как при +4*С, так и при +22°С в течение года в модельных и в реальных системах анализов обладали той же чувствительностью, что и свежеприготовленные реагенты, Необходимо обратить внимание на то, что при работе с конъвгатами, хранящимися при +22°С в течение года происходит только снижение ин-тенсйвности окраиивания дотов. По-видимому, это связано со специфическими свойствами аффинных соединений, входящих в состав конъюгатов.

Важной характеристикой системы детекции является рабочая, она же оптимальная, концентрация реагента. С одной стороны, этот параметр должен сообщать системе предельно возможную чувствительность, не инициируя появление фона, с другой стороны, он должен отвечать требованиям экономичности самой системы детекции.

Для определения рабочих концентраций конъюгатов на твердой

фазе (белый полистирол) сорбировали Iд& человека из разведений кратных двум. Сорбированные иммуноглобулины детектировали конъигатами Белка й с красителями в различных разведениях. Био-тинилированные 1дБ овцы, сорбированные подобным образом, детектировали конъигатами Стрептавидина с красителями также в различных разведениях. Детекцию осуществляли в течение 15 минут. Данный временной интервал был выбран, исходя из стремления придать системе анализа наибольиую оперативность. Результаты экспериментов представлены на Рис.2.

Чувствительность анализа, (нг/мл.)

700

600

500

400

300

гоо

100

о

Концентрация конъгагатов (У.)

Рис.2. Зависимость чувствительности анализа от концентрации конъюгатов.

Из приведенного графика видно, что для обоих реагентов оптимальной является концентрация 0,03% в пересчете на сухой вес

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

красителя.

Нвеличение концентрации диагностических реагентов не приводило к усилению чувствительности анализа. '

Таким образом, разработанная технология позволяет получать конъшгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах и достаточно стабильны при длительном хранении. То обстоятельство, что полученные реагенты сохраняют свои свойства б широком диапазоне температур от +4°до +22°С, позволяет решить проблемы не только хранения наборов, сконструированных с их использованием, но и транспортные проблемы, в тех случаях, когда невозможно осуществить строгий температурный контроль при перевозках. Стопроцентная воспроизводимость результатов была показана в 32 независимых синтезах. Это свидетельствует об оптимально подобранных,условиях стандартизации всех этапов технологической схемы синтеза.

С использованием разработанной технологии и на основании результатов, полученных в ходе экспериментов по подбору красителей были синтезированы конъигатн различных цветов: черный, темно-фиолетовый, фиолетовый, темно-красный, красный, синий и серый. В дальнейшем описание проведенных исследований будет только на примере углеродных (черных) конъшгатов. По всем параметра» полученные реагенты и разработанные системы анализа обладают одинаковыми свойствами. Различия в работе реагентов разных цветов касаются только интенсивности окрашивания при визуализации стереоспецифических взаимодействий, что объясняется только различиями в цветности красителей.

2. Конструирование моделей безинструментальных тест-систем на основе конъшгатов стереореактивных соединений с суспензоидными красителями.

2.1. Простые модели систем анализа.

В качестве простых моделей использовали системы анализа, демонстрирующие работу иимуноаналитической системы в принципе. Дл5 этого детектируемый аналит из разведений кратных двум сорбировали на непористую твердую фазу (белый полистирол) и осуществлял} детекцию соответствующими конъюгатами в рабочих разведениях н течение 15 минут в сравнении с ферментными и неферментной системами. Результаты экспериментов представлены на Рис.3,4,5.

- il -

Белок А-Углерод

Белок А-ПХ (Aüiershara, UK)

Белок А-Золото 40 нм (GoldMark Biol. СШ

80 нг/мл.

320 нг/мл.

40000 нг/мл.

Рис.3. Сравнительное определение IgG человека с использованием трех систем детекции.

Как видно из Рис.3, чувствительность детекции с использованием в качестве связанного аналита IgG человека и конъюгата Белок А-Углерод, в качестве детектирующего реагента, составила 160 нг/мл, что в 4 раза выше ферментной (пероксидазный конъшгат и 4-С1-1-нафтол как хромоген) и в 500 раз выше системы анализа, в котором в качестве детектирующего реагента применяли конъюгат на основе коллоидного золота.

В экспериментах, когда в качестве аналита использовали био-тинилированные IgG овцы, сравнивали результаты детекции конъюга-тами Стрептавидин-Углерод и Стрептавидин-Пероксидаза Хрена (Sigma, St.Louis, НО, USA) с 4-С1-1-нафтолом в качестве преципи-тирующего хромогена. Результаты сравнительного эксперимента представлены на Рис.4.

Стрептавидин-Углерод

г Гг

, Стрептавидин-ПХ (Sigma, CIA)

40 нг/мл.

80 нг/мл.

Рис.4. Сравнительное определение биотинилированных

овцы с использованием двух систем детекции.

Из Рис.4 следует, что чувствительность детекции с использованием в качестве связанного аналита биотинилированных овцы и конъюгата Стрептавидин-Углерод как детектирующего реагента

составила 40 нг/мл, что в два раза выше чувствительности анализе с использованием ферментного конъюгата С80 нг/мл).

Чувствительность системы детекции при определении Iкролика в качестве связанного аналита противовидовым конъюгато» 1дЕ-9гдерод овцы против 1вЕ кролика) составила 160 нг/мл, В данной модели сравнительные эксперименты не проводили, ввид; отсутствия доступных конъюгатов противовидовых антител с ферментами или коллоидным золотом. Результаты эксперимента представлены на Рис.5.

Рис.5. Определение IвЕ кролика с использованием

противовидового суспензоидного конъюгата. -

Приведенные результаты сравнительных экспериментов наглядш демонстрируют преимущества иммуноаналитических систем, основанных на применении в качестве детектирующих реагентов частиц гидрофобных красителей, а именно, (описанные примеры) суспензоидного углерода. Обращают на себя внимание два обстоятельства Во-первых, сокращение времени анализа за счет отсутствия стади! субстратного проявления и дополнительной промывки при использовании ферментных конъюгатов, во-вторых, высокая чувствительност! анализа за счет применения метки с исключительно высокой степенью оптической плотности.

2.2. Конструирование модельных тест-систем для стерео-специфического анализа.

При конструировании любой модели реальной тест-систем! необходимо учитывать ряд объективных факторов, которые в конеч ном итоге, определяют ее формат (процедурное оформление) структуру (количество операций, последовательность, время), таким факторам, прежде всего, относятся физико-химические и им мунореактивные свойства всех компонентов, без которых невозможн создание тест-системы. 0 некоторых из них уже шла речь выше, это чувствительность и специфичность иммунореактивных соедине ний, от которых в большой мере зависит то, что вкладывается

нг/мл.

понятие "структура" аналитической системы, с другой стороны -это параметры, характеризующие свойства детектирующих реагентов, которые определяют в свою очередь процедурное оформление тест-системы. Учитывая, что 952 частиц получаемых реагентов имеют размеры от 155 до 169 нм., можно высказать предположение о возможности использования в качестве твердых фаз в реальных системах анализа пористые материалы с различным диаметром пор: от 0,2 мкм и ваше. Кроме того, обеспечивается возможность различным образом аранжировать аналитические системы в процедурном отнове-нии, конструируя дот- блот-системы, иммунохроматографические, проточно-адсорбционные.

Принимая во внимание все вышесказанное, мы предприняли попытку сконструировать ряд модельных тест-систем для, безусловно, лабораторного применения, носящих экспрессный характер и не требующих какого бы то ни было инструментального или аппаратурного оформления.

2.2.1, Модель тест-системы для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

В качестве пористой твердой фазы использовали готовые полоски нитроцеллюлозной мембраны (стрипы) белого цвета, размером 4*40 мм с иммобилизованными (поперечные линии) вирусспецифическ-ими и контрольными антигенами из набора "Блот-ВИЧ", выпускаемого БТК "Биосервис".

Схема размещения иммобилизованных вирусспецифических и контрольных антигенов на стрйпах представлена на Рис.б.

а)

б)

в)

г)

я)

е)

envi gagl poli envi I

контроль специфичности реакции контроль правильности проведения реакции

Рис.6. Схема размещения антигеноЕ на твердой фазе.

Готовые стрипы помещали на 10 минут в блокирующий (он же промывающий) раствор, представляющий собой Ф5РТ с 1 "А казеина,

- и -

после чего переносили в 1 ил смеси равных объемов двух сывороток больных СПИДом, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2, раститрованных с шагом 2 с разведения 1/250. После 30-ти минутной инкубации и двухкратной промывки по 5 минут в блокирующем растворе, осуществляли детекцию инкубацией стрипов в 1 мл конъюгата Белок А-9гле-род в течение 15 минут, после чего, двухкратно промыв стрипы дистиллированной водой, учитывали результаты анализа. Параллельно, для сравнения, осуществляли детекцию реагентами из набора "Блот-ВИЧ" по инструкции производителя. Результаты прямого сравнительного анализа представлены на Рис.7.

Белок А - Углерод Бдот-ВЯЧ ■

1 I : г / 1 | ' ? Iй 1

I 1 5 1 г í 1 '1Н ;

4 к 1 3 V ■. , -а' Й " К •

{ 1 * -5 •Ц '

ч 1 / 1

6 ' £ а

■ " 7 1 3

! 3 70

9 71

:г ■

. И Л

■а г л

Разведет« смеси сивороток. содерханкх антитела к вач-1 я шч-г

1:250 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:6000 Л116000 1:32000 1:64000 1:1Е6000 сыаороткл. не содержания лт 'контроль ьез'СЫЗОРОТОК

Рис,7. Сравнительное определение антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с использованием системы анализа на основе суспензоидного углерода (Белок А-Углерод) и ферментной системы "БлотВИЧ".

Результаты сравнительного эксперимента наглядно демонстрируют преимущества использования в качестве детектирующей системы суспензоидного конъюгата на основе углерода. В первую очередь это касается чувствительности по конечной точке, которая в 8-16 раз превышает чувствительность ферментной системы детекции. Что касается специфичности, то при проведении анализов с использованием конъюгата Белок А-Углерод не наблюдали неспецифического связывания и появления фона как при использовании сыворотки крови здорового донора, так и в экспериментах, где сыворотку не использовали вообще, тогда как в варианте ферментной детекции в условиях отсутствия стадии инкубации с сывороткой наблюдали неспецифическое связывание в зоне внутреннего положительного

онтроля (сыворотка против Iчеловека) с конъюгатом (стрип 4).

Кроме того, значительно (более,-чем в два раза) сокращается ремя анализа, за счет уменьиения числа этапов и отсутствия стали субстратного проявления, что делает проще, деиевле и безо-зснее саму процедуру исследования.

Для определения чувствительности сконструированной модельной лстемы анализа использовали официальную стандартную панель сы-эроток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека ЗИЧ-1), состоящую из 16 сывороток. Результаты анализа представ-эны на Рис,8.

Т

- Г »

' и

'Ш

г г ■

■ Ь .';

■

■ .Г -

■ I'. '

- Г-' ■

9 '

' п '.

п.-

«с _

: Я }■''-

1

■ ?

«¡воротки из агнслн

' К.ОПТР. саворотка. ко соаегх. ат к гач коатр. сызороту.а, содерж. ^ е вк-1 ковтр. сыворотка, соп«>х. АТ к ВКЧ-2 контроль Яез смзоротки (ФЕРТ с '.V кззеиаз)

Рис.8. Исследование чувствительности модельной системы определения антител к ВИЧ—I и ВИЧ-2.

Как видно из Рис.8, все 16 входящих в панель сывороток дали тко визуализируемый положительный результат. Хорошо наблюдае-е различия в характере прокрашивания стрипов объясняются раз-чиями в характеристиках использованных в панели сывороток, корне моделируют различные стадии сероконверсии в ходе развития рекции.

Анализ контрольной сыворотки, не содержащей АТ к ВИЧ (стрип ) показал отрицательный результат; двух контрольных сывороток, 5ернацих АТ к ВИЧ-1 (стрип 18) и к ВИЧ-2 (стрип 19) - полояи-чьные результаты. Контроль без сыворотки продемонстрировал от-гствие неспецифического связывания меяду конъюгатом и всеми гигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Все контрольные

- 16 -

сыворотки были взяты из набора "Блот-ВИЧ".

Результаты анализа были воспроизведены в 9 экспериментах использованием 6 панелей сывороток ГИСКА им. Л.А.Тарасевича с рий 003 и 004.

Для определения специфичности сконструированной модельн системы анализа, использовали стандартную панель сывороток, 1 содержащих антитела к ВИЧ, состоящую из 20 сывороток, полученн: от доноров, беременных и лиц из групп риска. Результаты преде авлены на Рис.9,

/ £

1

С

. г *!

»I

■*

«г

л *

а. я 2

'-■■«г:.. #

I Ш ■»'/*; . л

-СКВбРйТКХ КЭ вахеш

кощ^. сыворотка 1. соаер». лт к ВИЧ-1 ковто. сыворотка г. содерж. лт к ОИЧ-1 контр, сыворотка, соаем. ЛТ к ВИЧ-г

Рис.9. Исследование специфичности модельной системы определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Как видно из Рис.9, все 20 сывороток из панели продемонстр: ровали однозначно фиксируемый отрицательный результат. Использ ванные в качестве контроля три сыворотки больных СПИД, инфицир: ванных ВИЧ-1 (стрипы 25 и 26) и ВИЧ-2 (стрип 27) дали полож1 тельную реакцию.

Результаты анализа были воспроизведены в 7 экспериментах использованием панели"сывороток ГИСКА ик. Л.А. Тарасевича сер! 001. '

Таким образом, предложенная модель тест-системы для опред ления антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в серии экспериментов продемо! стрировала высокую чувствительность и специфичность, надежност] простоту в процедурном отношении, оперативность. Это позволи. начать работу по подготовке технической документации с цел]

сертифицирования и серийного выпуска разработанной системы диагностики СПИД.

2.2.2. Модели тест-систем для определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ),

йммунохроматографическое £ иммуномиграционное) определение ХГЧ проводили, используя в качестве твердой фазы наклеенную на прозрачную поливинилхлориднуш клейкую ленту полоску нитроцелля-лозного фильтра с диаметром пор 5 мкм, Один из концов такой полоски при помощи той ие клеющей ленты плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги), используя в дальнейшем этот конец как верхний. На середину нитроцеллязлозной полоски тонкой поперечной линией наносили моноклональные анти-ХГЧ антитела с концентрацией 1,0 мг/мл в ФБР. После высушивания при 37°С в течение 30 минут полоску блокировали, замачивая в IX казеине в ФБРТ на 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ФБРТ и вновь высушивали таким яе образом.

Стандарт ХГЧ (Binax. Portland, ME, USA) разводили кратно двум ФБРТ и, параллельно, в коче здорового мужчины с добавлением Твин-20 до 0,IX. К 50 мкл стандартных разведений ХГЧ, выполненных в лунках мнкротитровального планшета, добавляли по 50 мкл конъюгата моноклинальных антител против бета-субъединицн ХГЧ с суспензоидным углеродом в рабочем разведении 1/100 в ФБРТ. Сразу после этого в лунки опускали никние концы хроматографических полосок. За счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон и детектирующий реагент, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител. Результаты эксперимента представлены на Рис.10.

1 - отрицательный контроль, не содержащий гормон;

2 - проба, содержащая ХГЧ в концентрации 40,0 МЕ/л.;

3 - проба, содержащая ХГЧ в концентрации 10,0 МЕ/л.;

4 - проба, содержащая ХГЧ в концентрации 640,0 МЕ/л.

Рис.10. Исследование чувствительности модельной системы

определения хорионического гонадотропина человека.

Как видно из Рис.10, чувствительность модельной системы о ределения ХГЧ составила 10,0 НЕ/л.

Для осуществления проточно-адсорбционного (более известно как иммунофильтрационного) способа определения ХГЧ использова те же иммунореагенты, что и в иммунсхроматографии. Приспособь нием для осуществления данного способа являлся пластиковый I линдр с отверстием в верхней части, заполненный высокопорист хроматографической бумагой в качестве впитывающего элемента, помещенным сверху иммуносорбентом. Иммуносорбент готовили, сс бируя на нитроцеллшлозном мембранном фильтре с диаметром пор мкм связывающие анти-ХГЧ моноклональные антитела в виде дотое обрабатывали как при иммунохроматографии. 8 качестве внутренне положительного контроля сорбировали описанным выше способом ) в объеме 2 мкл с концентрацией 1000 МЕ/л.

В ходе анализа на поверхность иммуносорбента наносили 500; ФБРТ, после впитывания которого наносили 500 мкл одного из ре ведений стандарта ХГЧ (разведения готовили кратно двум в ФБР" Промывали поверхность мембраны 1 мл ФБРТ, после чего нанос;

500 мкл конъвгата Моноклзнальные антитела-Углерод и вновь промывали 1 мл ФБРТ.

Чувствительность детекции в описанной аранжировке составила 100 МЕ/л, а полное время анализа 2,5-3,0 минуты.

2.2.3. Использование цветных суспензоидных конъюгатов в дот-гибридизационном анализе ДНК фага лямбда. (Данный фрагмент работы был выполнен в лаборатории структуры и функции генов человека ИБХ им. М.М.Шемякина РйН. данные любезно предоставлены ст.н.с. М.Ф. Турчинским и м.н.с. Т.Б,Колесник,)

Чниверсальность детектирующих реагентов, полученных с использованием в качестве аффиннсгс соединения Стрептавидина, проявилась в том, что стала возможной разработка систем определения не только антигенов и антител, но и. практически, любых биотнни-лировзнных агентов. Это нашло свое отраяение в дот-гибрпдизаци-оннсм анализе ДНК фага лямбда, проведенном сотрудниками лаборатории структуры и функции генсБ человека ИБХ им. М.М.Иенякина РйН, с использованием в качестве детектирующих реагентов переданных им суспензоидных конъшгатов 4х цветов,

Мизеневук ДНК фага лямбда иммооилизировали на мембране Biodyne 1,2 мкм. 3 качестве зонда использовали химически биоти-нилированную ДНК фага лямбда. Детекции осуществляли инкубацией с рабочими разведениями конъюгатов: Стрептавидин-Углерод, Стрепта-видин-Судан III, Стрептавидин-ТСДФ, Стрептавидин-НТДФ в течение 30 минут и Зх-кратно отмывали ©БРТ перед Финальным учетом результатов. Параллельно детекцию осуществляли стандартным конъшгатом Стрептавидин-Пероксидаза Хрена инкубацией в течение 30 минут с визуализацией гибркдизоЕанных образцов в колориметрической реакции с о-дианизидином в качестве преципитируящего хромогена.

В результате описанных сравнительных экспериментов в ряде воспроизводимых серий чувствительность анализа с применением обеих систем детекции с использованием как суспензоидных (4х различных цветов), так и Ферментного конъюгатов составила 0.! -1,0 пикограмм миненевой ДНК на точку.

Полученные результаты позволяют заключить, что разработанная оригинальная технология ковалентного конъигирования аффинных со-

единений с водонерастворимыми цветными метками сделала возмокк создание принципиально новых универсальных реагентов. Применен последних в качестве детектирующих систем в безинструментальь иммунодиагностических исследованиях при высокой специфичное существенно повысило чувствительность, стабильность, экспрес ность и простоту анализа. Данные обстоятельства открывг перспективу для создания большого числа надежных систем для £ зинструментальной диагностики различных инфекционных заболеваь и неинфекционннх состояний человека и животных.

ВЫВОДЫ.

1.Исследованы соединения из ряда водонерастворимых краен: лей; углерод, неотетразолиевый диформазан, тетразолиевнй фиси товый формазан, тетразолиевнй синий диформазан. судан III, су; II и судаковый черный. Показана возможность использования с; пензоидных форм выбранных красителей в качестве меток в реап тах для иммунодиагностических целей.

¿.Разработана, надежно воспроизводимая, оригинальная, дв; этапная технология конъшгирования, основанная на предварителы пептизацни частиц красителей в растворе белка с последующей ■ работкой глутаровым альдегидом, приводящая к получении проч! конъзгатое ковалентно связанных аффинных реагентов с цветн: суспензоидными метками.

3.Исследована стабильность полученных детектирующих pear тов в зависимости от времени хранения в различных температур условиях. Показана lOOZ-ная устойчивость конъюгатов при хране б широком диапазоне температур: от +4°С до +22 С в течение го

4.С применением разработанных стабильных универсальных р гентов сконструированы модельные диагностические системы для ределения различных зналитое: антигенов - хорионический гона тропик человека, антител - антитела к ВИЧ—1 и ВИЧ-2, нуклеино кислот - двухцепочечной ДНК фага лямбда.

5.Апробирована сконструированная модель тест-системы для ределения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в формате дот-анализа на ристом твердофазной носителе с использованием в качестве ис с дуемого материала сывороток больных, инфицированных ВИЧ—i и вороток не содержащих антитела к ВИЧ из стандартных пане ГИСКа им.Д.А. Тарасовича. Показано, что при высокой специфич сти сконструированная модель превосходит сертифицированную им

ноферментнуш систему безинструментальной серодиагностики СПИД "Блот-ВИЧ" производства БТК "Биосервис" по чувствительности по последней точке - в 8 - 1В раз, по скорости анализа - в 2,5 раза, а также, по простоте процедуры и экононичности.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Плаксин Д.19., Раев М.Б., Громаковская Е.Т. Новые системы для детекции стереоспецифических взаимодействий с использованием конъюгатов на основе водонерастворимых красителей. //Тез. докл. Мендународного симпозиума "Проблемы токсикологии и прикладной экологии". - Москва-Пермь, - 1991. - с.246-247.

2.Раев М.Б. Тест-система для определения антител к ВИЧ-1,2. // Тзз. докл. Научно-практической конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии".- Пермь, 1994. -с.50-51.

3.Плаксин Д.Ю., Раев М.Б., Громаковская Е.Т. Новые реагенты для безинструментального стереоспецифического анализа на основе суспензоидных частиц углерода. //Тез. докл. Научно-практической конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии",- Пермь, - 1994. - с.48-49,

Отпечатано на Ризографе ЦНИЛ ПГМЛ Тираж 100 зкз