Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полигенный контроль противотуберкулезного иммунитета и резистентности (экспериментальное исследование)
- Ученая степень
- доктора медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Автореферат диссертации по медицине на тему Полигенный контроль противотуберкулезного иммунитета и резистентности (экспериментальное исследование)
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ
На правах рукописи
НИКОНЕНКО Борис Владимирович
ПОЛИГЕННЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ИММУНИТЕТА И РЕЗИСТЕНТНОСТИ
(экспериментальное исследование)
(14.00.36 — аллергология и иммунология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва — 1992
Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской АМН.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук В. Г. Нестеренко доктор медицинских наук, профессор Л. В. Ковальчук доктор медицинских наук, профессор В. Я. Гергерт
Ведущее учреждение — Институт иммунологии Минздрава Российской Федерации.
Защита состоится « 1992 г. в «ча-
сов на заседании специализированного совета Д 001.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Р АМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ имени Н. Ф. Гамалеи АМН.
Автореферат разослан « ^у г"
Ученый секретарь специализированного совета
доктор медицинских наук Е. И. Коптелова
' '. ■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕ ИСТИКА РАБОШ
Актуальность тещ.
Разработка адекватных экспериментальных моделей инфекционных заболеваний в сочетании с использованием достаточно большого набора инбредных линий мышей, а также иммунологических и генетических методов исследования привели в последние 10-15 лет к формированию новых научных направлений и школ, в рамках которых проводятся интенсивные исследования в области имцуногенетики туберкулеза и других микоба ктериаль них инфекций /Авербах ММ. и др.,
/W
1985; Lagrange P. et al., Slcamene Е., 1989; Skamene Е. et al., 1982 И др./.
Данные, накопленные в области тщуногенетики и иммунологии экспериментального туберкулеза, можно подразделить на несколько основных разделов.
I. На модели вирулентной туберкулезной инфекции генетический анализ показал, что восприимчивость к м.tuberculosis H37Kv контролируется не менее чем двумя генами, сегрегирующимися в паре линий мышей i/st - x/sn, а повышенная восприимчивость к туберкулезу мышей l/st детерминируется рецессивным аллелем Tbc-l", который в гомозиготном состоянии обладает эпистатическш действием, подавляя проявление всех других неаллельных генов противотуберкулезной резистентности /Апт А.С. и др., 1982; Иороз A.M. и др., 1983; Hikonenko B.V. et al., 1986/. У мышей I/St или гомозигот тъс-1а/гьс-1в крайне угнетены показатели всех феноменов противотуберкулезного иммунитета /Мороз A.M., 1984/.
В связи с этим возникает ряд вопросов, ответов на которые пока нет. Прежде всего неизвестно, какое звено противотуберкулезной защити контролирует ген тъс-i, дефект которого приводит к
таким глубоким нарушениям противотуберкулезной защиты; неизвестно, участвует ли ген тъс-i в контроле ответа на авирулентные ш-кобактерии, не изучено взаимодействие гена тъс-l с другими генами, не известна локализация гена Tbc-I, как ген Tbc-I контролирует иммунный ответ к антигенам (к неяивым шшобактериям) м.tuberculosis H37ßv. Кроме того, неизвестно, сколько генов сегрегируются в других парах линий мышей, не изучены показатели иммунитета и резистентности к туберкулезу у гибридов К.
2. В первой хромосоме мыши локализован ген Beg, регулирующий размножение в органах Mycobacterium bovis (EOG) в ранние сроки (естественная резистентность) после внутривенного введения микобакторий /Forget A. et al., I08I; Gros Р. et al., I9ßl/.
Ген Beg имеет два аллелышх варианта (виг), при этом обладает плейотропным эф^охугом, регулируя не только уровень естественной резистентности к и.bovis (вса), но и иммунный ответ к всо /Denis и. et al., 1988/. Ген Beg в настоящее время довольно подробно изучен, однако совершенно не исследована роль гена Beg в (нормировании резистентности и иммунитета к туберкулезной инфекции, вызванной вирулентными м.tuberculosis B37Bv, не изучено взаимодействие генов Beg и Tbc-I, более того, пока не исключена возмояность того, что это один ген, но изучаемый на разных моде-, лях. Ничего не известно об участи гена Beg ' в контроле формирования протективного противотуберкулезного иммунитета при вакцинации ВСс.
3. В настоящее время среди инфекционных заболеваний с внутриклеточным паразптированием возбудителя по существу лишь туберкулез мо::;от быть предупрежден яцзой вакциной - всо, однако эфйектив-пость отой вакцины варьирует от 0 до 80% /Chaparas, 1982/. Одной из причин такого разброса эффективности несомненно- является
генетическая неоднородность вакцинируемых. Влияние генетических факторов на резистентность к туберкулезу, вызванную вакцинацией всо, изучали в эксперименте /Авербах М.М. и др., 1985; Lagrange Р. et al., 1985; Buschman S. et al., 1988 И Др./, однако во всех подойник исследованиях не проводилось четкого разграничения механизмов защиты при первичном заражении и механизмов, сформировавшихся в результате вакцинации bcg (и не ставился вопрос о возможности раздельного генетического контроля этих механизмов. Свидетельством в пользу раздельного контроля может быть наличие, по крайней мере, двух линий мышей, обладавших одинаковой резистентностью к первичному заражению вирулентными и.tubérculosis, но резко различающихся по резистентности после вакцинации всо.
4. Исходя из предварительных данных о немоногенной природе противотуберкулезной защиты, зависящей в числе прочего и от иммунных реакций /Авербах М.М. и др., 1985/, а также наличия ряда наследуемых иммунодефицита состояний мыши (как и человека), мы считали важным исследовать влияние мутаций иммунодефицитов на течение экспериментального туберкулеза и эффективность вакцинации всо.
Цель и задача исследования.
В соответствии с вышеизложенным ■ .целью настоящей работы было исследование иммунологических и генетических основ полигенной природы противотуберкулезной защиты при экспериментальном туберкулезе у мышей, формирование концепции генетического контроля иммунитета и резистентности при туберкулезе и противотуберкулезной вакцинации.
Для её достижения были сформулированы следующие задачи:
I. Изучить иммунологическую и генетическую природу гена
Tbc-I, детерминирующего "сверхвосприимчивость" мышей к туберкулезу.
2. Провести оценку числа генов противотуберкулезной резистентности, сегрегирующихся в различных парах линий мышей; изучить их взаимодействие и имэдунологические проявления.
3. Определить иммунологическую и генетическую основы повышенной резистентности к туберкулезу некоторых гибридов первого поколения (ri).
4. Сделать попытку раздельного изучения генетического контроля протективного эффекта вакцинации все и резистентности мышей к первичному заражению K.tuterculosio H37Bv.
5. Проанализировать роль гена Beg в контроле ответа мыши , на заражение вирулентными микобактериями туберкулеза H37Hv.
6. Осуществить комилементационный анализ противотуберкулезных полигенов.
7. Исследовать некоторые мутации, детерминирупцие иммунодефицит ы мыши,в противотуберкулезном шлмукитете_н резистентности.
Научная новизна.
Впервые на основе конкретного экспериментального материала формулируется концепция полигенного контроля противотуберкулезного иммунитета и резистентности.
Выявлено существование новых генов противотуберкулезного иммунитета и резистентности, исследован характер их взаимодействия. Показано, что для формирования интегральной противотуберкулезной резистентности характерны такие явления, как гетерозис (высокая резистентность многих гибридов pi ) и эпистатическое взаимодействие генов.
Впервые продемонстрировано участие гена Bog в регуляции
пролиферативного ответа in vitro на антигены вирулентных м.tuberculosis H37KV, показано, что регуляция ответа реализуется через различную антигенпредставляпцуа способность макрофагов Bcgr и Beg".
Впервые выявлено, что мыши СВА/Й (носители мутации xld ) проявляя более высокую резистентность, чем ряд других линий к первичному заранению м.tuberculosis H37Sv, характеризуются практически отсутствием протективного эффекта вакцинации всо, генетический анализ показал, что дефект сцеплен с Х-хромосомой (ген xia).
Исследования генов lbo-l и Beg в различных феноменах противотуберкулезного иммунитета и резистентности, а также компле-ментационнов исследование, показали, что гены тьс-i и Beg неидентичны.
На основании исследований, проведенных в работе, выявлены широкий спектр генетически детерминированного уровня резистентности мышей к туберкулезу - от сверхвосприимчивых (x/st} до высокорезистентных гибридов уКash * i/st), и различная эффективность вакцинации все. Все эти варианты моделируют варианты генетически детерминированного противотуберкулезного статуса человека.
Практическая значимость.
Сформулированная по результатам работы концепция полигенной природы противотуберкулезного иммунитета и резистентности указывает на необходимость поиска гомологичных генов у человека и особенно вне комплекса НХА. Следует предполагать наличие у человека гена(ов) гомологичного Tbc-I мши, один (или более) из ал-лельных вариантов которого обусловливает быстротекущий туберку-
лезный процесс независимо от других наследственных особенностей пациента, а также плохо поддавдийая химио- и иммунотерапии. Следует ожидать наличие также индивидов с генетически детерминиро- . , ванной (но необязательно передавдейся по наследству следушцему поколению) повышенной резистентностью к туберкулезу.
Если экстраполировать на человека результаты экспериментов по вакцинации БС&, то, по-видимому, существуют люди с тем или иным уровнем врожденной резистентности к туберкулезу, но генети- ' чески дефектные в отношении вакцинации все, которая для них бесполезна.
Из результатов работы следует, что'наследуемые иммунодефицита, как правило, затрагивают то или иное звено и противотуберкулезного иммунитета, а генетически детерминированная низкая специфическая противотуберкулезная резистентность в той или иной ' степени связана с иммунодефицитом. ■.
Материалы диссертации вошли в монографии "Имвдногенетика ин-: секционных заболеваний" (1985), "Проблемы наследственности при легочной патологии" (1990), в "Руководство по инфекционной имму-нологил", готовящееся к печати. Ряд методов изложен автором'в ;> -методическом пособии Минздрава СССР "Практические рекомендации. ■ по проведению иммунологических исследований, при туберкулезе и других заболев.' иях легких" (1984). Материалы, вошедшие, в,диссер-... тацию, используются в курсе лекций и семинаров для аспирантов и ординаторов ЩШТ и курсантов ВДУВ. Значительная часть матерка- . лов диссертации получена при проведении совместных с ВОЗ. исследований.
Апробация работы.
Основные .результаты, диссертационной работы были доложены на: Нон.Терегщзм 'Механизмы.противоппйекццонного шадунзтета". в Сарато- . •
ве (1387), Симпозиума "Генетические маркёры в антропогенотгасе и медицине" в Хмельницком (1988), на Симпозиуме "Проблемы наследственности при туберкулезе и другой легочной и инфекционной патологии "(Винница, 1989), Симпозиуме "фундатенталыю-пршдалше исследования в фтизиатрии", Москва (1989), на ХУТ11 Всемирном генетическом конгрессе в Торонто (1989), на Меялабораторном семинаре по имцуногенетике экспериментального туберкулеза в институте гигиены Чехословацкой академии наук (Прага, 1989), на заседании общества иммунологов (Москва, 1990), на семинаре по иммуно-генетике в Джексоновской лаборатории (Бар Харбор, США, 1991), - Симпозиуме "Иммунодефицита при туберкулезе, ШЖ и других заболеваний легких (Ташкент, 1991).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Работа выполнена на У 85" страницах 'машинописного текста и состоит из введения, двух глав литературного обзора, главы '"Материал и методы", 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, списка цитируемой литературы, состоящей из 303 работ. Работа иллюстрирована /8 таблицами и У8 рисунками.,
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в лаборатории экспериментальной иммуногене-тики на базе питомника инбредных мышей Центрального ШИ туберкулеза.
Кивотнш. Работа проведена на 30 независимых инбредных, кон-генных, мутантных и рекомбпнантно-инбредных (Н4-) линиях мышей,
большинство из которых поддерживаются в питомнике института в соответствии с общепринятыми правилами /Медведев H.H., 1968; Блан-дова S.K. и др., 1973/. Список линий, использованных в работе, приведен в табл. I. Гибриды к,гг и потомки возвратных скрещиваний (ВСЯ) приготовлены автором в питомнике линейных животных ЦНИИТ, их конкретное описание приводится в соответствующих главах собственных исследований.
В экспериментах были использованы мыши обоего пола, весом около 18 г в возрасте 2-4 месяцев, за исключением тимэктомирован-ных мышей, которые были использованы через 5 месяцев после тим-эктомии.
Микобактещи. Для работы использовали замороженные (-70°С) в физиологическом растворе (концентрация I мг/мл) суспензии трехнедельных культур микобактерий, выращенных на среде Левенштейна-йенсена.
Заражение и вакцинация мышей. Для заражения туберкулезом мышам в латеральную хвостовую вену вводили ло 0,5 мл суспензии, содержащей 25 мкг M.tuberculouie, что соответствует-2-IO® КСЕ на среде Левенштейна-Йенсена. Через две недели ежедневно регистрировали состояние и гибель мышей.
ы.bovis (bcg) вводили при внутривенном заражении таким же образом, а для; вакцинации использовали подкожное введение в две точки спины в дозе 500 мкг/шшь; через 5 недель после вакцинации, мышей использовали' в экспериментах.
Иммунизация шкобактериальными антигенами. Для исследования пролиферативной активности клеток регионарных лимфатических узлов без предварительной системной иммунизации или заражения мышам ззодили в подушечки задних лап по 40 мкя препарата, содержащего дезинтегрированный ультразвуковой обработкой препарат (УЗ-сош-
Таблица ï
Инбредные линии мышей, использованные в работе
Название линии Сокраще1Шое обозначение линии Генетические особенности Происходдегаю
I 2 3 4
C57BL/6jato Вб а-2ъ Из питомника
BALB/c Sto DBA/2 Sto С DBA/2 H-2d H-2d АШ СССР "Столбовая"
AXH/StO AKS Xhy-Ia, H-2k
CBA/lac Sto СВА Thy-Ib, H-2k
A/Sn Sto Clt* А H-2k
CBA/H Clt СВА/К xld, H-2k Из Бетезды (США)
C3H/3n Clt сзн H-2k Из Дяексоновской
СЗН/HeJ Clt СЗН/HeJ lped, H-2k лаборатории (США)
I/Stï Clt I/St Ibc-l", H-21 Из питомника
вазинтА ввзгаг H-23 Ш1ЛЭШ АМН СССР
C57BI/XOY Clt вхО H-2b
BIO.BH/JY вю.вв H-2k
B6-goA Вб-go go, H-2b
BIO-f*y/Y , BIO-f« tz, H-2b
BIO.SM/Sn Bg oit BIO. SN н-г^
BIO.fB/Dv Clt BIO.WB H-2*
BAIB/c Clt ВАХВ/о Bcg" Университет Мак-
C.D2 - Bcgr/Clt BIO.A/Cit C-Bcgr BIO.А Bcgr Bcg" Гилла (Монреаль, Канада)
BIO.A-Bcgr/Clt BIO.A-Bc*r Bcgr
Окончание таблицы I
I 2 3 4
ВЮ.В2о/Д СП В10.П2О Из Бетезды (США)
БЮ.В2п/«Г Си В10.П2&
СХВ1)/Ву Cit СХВй Н-2й Из ДкексоновскоЙ
СХВЕ/Ву Си СХВВ Н-2Ъ лаборатории (США)
схво/ву си схвз Н-2Ъ
схвн/Ву си схвн Н-2а
СХВ1/Ву си СХВ1 Н-2Ъ
СХВ1/Ву си схвг Н-2Ъ
СХВК/Ву си СХВК Н-2Ъ
* - линии, обозначенные символом СИ, поддерживаются в питомнике Центрального НИИ туберкулеза.
кат) м.»иЬегсиаов1в Н37В* или Ы.ЬоуАв (ВСС) в неполном адаован-те Фрейнда в соотношении 1:1. При этом концентрация сониката составляла I мг/мл ДЛЯ Н37КУ и 6 мг/мл для всс.
Реакция ГЗГ на туберкулин. Определение туберкулиновой чувствительности зараженных или вакцинированных мышей (реакция Г31 в подушечке лаш) проводили по методу, описанноцу М.М.Авербахом и соавт. (1980). . • ,
Получение суспензии лгойоидных клеток.- обогащенных 1-ш.гЬо-цптаг.ш. Для получения популяций клеток с высоким содерканием Т-люлфоцитов клетки лимфатических узлов двакда фильтровали через колонки с нейлоновой ватой (?вш»а11). На уравновешенную колонку с 700 мг ваты в объеме 6 мл наносили около 100 млн. клеток в 2 мл теплой среды 199 с эмбриональной телячьей сывороткой, 10 ъМ
hkïes, ■ IOQ ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина (все plow, Великобритания). Через -час инкубирования при 37°С неприлипшле клетки элшровала 10 мл теплой среды со скоростью I мд/мин. Клот-ки концентрировали, и процедуру повторяли.
Приготовление антиген-презентирующих клеток (АПК). Клетки селезенки интактных мышей отмывали, эритроциты лизировали лизиру-вдям раствором, состоящим из 0,83 г нндс1, 0,1 г к2со3, 0,С037г ЭДГА в I л дистиллированной воды, pH 7,2-7,4 (Ortho Diagnostic Systems, США).
Для отмены способности клеток селезенки пролиферировать их обрабатывали митомицином С в течение I часа при 37°С, концентрация митомицина С - 50 мкг/мл. Клетки отмывали, подсчитывали и использовали в качестве АПК.
Определение пролиферативного ответа лимфоцитов. Те или иные популяции лим£оидных клеток ресуспендировали в полной питательной среде (Bftix-1640, 5/a-эмбриональной телячьей сыворотки, 10 ri.l нв-PBS, 4 í.í.1 xi -глюташша и антибиотики) и вносили по 400 тыс. клеток (для неразделенных клеточных популяций лимфатических узлов) в объеме 200 мкл в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета (ноне, Дания). Контрольные и экспериментальные лунки группировали триплетами, в экспериментальные лунки вносили по 10 мкл антигена: РИ> (Serum st&atena institut, Дания) в конечной концентрации 10 мкг/ыш, соникат M.tuberculosis Н37К▼, (10 мкг/мл), соникат вса (10 мкг/мл), Кон A (Pharmacia) - 2,5 мкг/мл или ФГА - 5 мкг/нл.
В случае использования смеси различных клеточных популяций 200 мкл суспензии содержали 300 тыс. АПК и 100 тыс. или 200 тыс. Т-клеток. Планшеты "с клеткакга культивировали в течение 72 часов в COg-инкубаторе (Quene, США), на последние 16 часов в лунки
о
вносили I мк Ci °Н-тимидина в 10 мкл физиологического раствора (Ленинград). Клетки собирали с помощью харвестера на фильтры из стекловолокна ( »low, Великобритания), фильтры высушивали и переносили во флаконы для счета, содержащие 10 мл толуольного сцин-тиллятора (3 г рро и ОД г ророр на I л толуола). Подсчет активности проводили на сцинтшинционном JJ-счетчике "Бета-2" (СССР).
Высоваемость микобактерий из селезенки зараженных мышей. Через определенный промежуток времени после заражения мышей забивали, извлекали селезенки, взвешивали и гомогенизировали в 0,02$ растворе Берсена с 0,05$ Твин-20. Готовили серию 10-кратных разведений гомогената в физиологическом растворе и по 0,3 мл из 4-го
с
и 3-го разведения наносили на 90 мм чашки Петри олеиновым агаром Дюбо (Difco). Через три недели инкубирования в термостате при 37°С производили подсчет колоний и пересчитывали содержание колоний на орган зараженной мыши.
Определение уровня противотуберкулезных антител в сыворотке , крови мышей. У мышей в различные сроки после вакцинации или зара- . жения кровь собирали из ретроорбитального синуса. После отделения сыворотки содержание в ней антител к антигенам микобактерий определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) /Bngvar в., Perlm&n Р., 1971/.
Статистическая обработка.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили,
используя методы вариационной статистики, для оценки значимости
различий средних величин применяли Т-критерий Стьюдента, при ис-
ri
следовании генетического сцепления - метод У. /Плохинский ЕЛ., 1970/.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. Участие генов Bcg и tbc-I в контроле противотуберкулезного иммунитета, и резистентности
Ген Bog всесторонне изучен в отношении «.bovis (все), а также других инфекций /Воигаава О. et al,, 1985; Skamene В. et •!•# 1982/, но практически нет данных о контроле геном Beg развития вирулентной туберкулезной инфекции и иммунного ответа против антигенов H37Hv.
Мы, исследуя конгенных по гену Beg мышей ВАЬВ/о— C.D2 - Bogr и BIO.i — вю.А - Bogr, не обнаружили различий выкиваемости мышей, зараженных в/в ö.tuberculoeio H37Bv d зависимости от алле-ля Bcg, так же как различий выживаемости мышей, предварительно вакцинированных bcoi не выявлены и различия у этих мышей и реактивности ГЗТ на туберкулин в зависимости от аллеля Bog (таблицы 2 и 3), Следовательно, в этой модели туберкулеза ген Bog не играет регулирупцей роли, в отличие от гена ТЪс-i* рецессивный аллель которого tbo-l® детерминирует крайне низкое значение среднего времени выживаемости.
При сравнительном исследовании пролифоративной активности in vitro клеток лимфоузлов мышей, конгенных по гену Bog, иммунизированных соникатом H37RV в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), оказалось, что клетки мышей Bcgr пролиферирупт активнее, чем клетка мышей Bog" как а присутствии антигенов (?и>, соникаты H37HV или всо), так и без антигенов. Далее мы исследовали роль антигенпредстазляпцих клеток в реализации генетического контроля
для этого г.шеой (с.вг - Bcgr X BALB/c )п (гонотип Bcg'/
Bcg") имг.ьгнизирошли сонякатом H37Bv в I!A5, через дво недели
Таблица 2
Выживаемость и реакция Г31 у мышей, контента по гену Beg, зараженных M.tuberculoaie H27RV
Среднее время Линия Число выживаемости
мышей - мышей (дни) - и
ГЗГ i В (ш)
I* BIO.A - Bog" 19 40,7 + 2,3 0,25 t 0,03
2. BIO.А - Bogr 19 37,6 + 3,5 0,29 t 0,03
3.* BALB/o - Bog" 16 30,4 + 1.8 не исследов,
4. C.D2 - Bogr 14 32,4 + 2,3 0,20 t- 0,02
* - Различия между показателями для груш I и 2, 3 и 4 статистически недостоверны
Таблица 3
Выживаемость и реакция ГЗГ у мышей, конгенных по гену Beg, зараженных и.tuberculosis Н37&т после предварительной вакцинации воо
Линия мышей
Среднее время , _ —
Число выживаемости ГЗТ -в щ©* ИУГЗг^
мышей (дни) - о (мл)
1« BIO,A - Bog8 9 74,3±4,5 0,36^0,03 1,8 1.5
2. Bio.A - Bcgr 6 72,4*4,2 0,37k),06 1,9 1.3
3«« BALB/o - Bog® 7 60,0^4 ,e 0,24t0,03 2,0 -
4. C.D2 - Bogr 15 64,5i5,I 0,26*0,04 2,0 1.3
* - ШШ - индекс пролонгирования выживаемости;
** - ШТЗТ - индекс усиления ГЗТ;
^^ - Различия между показателями для групп I и 2, 3 и 4 статистически недостоверны.
извлекали регионарные лимфоузлы, клетки которых дважды пропускали через колонки с нейлоновой ватой. Эти клетки использовали в качестве отвечающих Т-клеток. В качестве антигенпредставлявдих использовали клетки селезенки штактных мышей Bogr, Beg" или Beg1"/", обработанные Мит С. Оказалось, что в присутствии клеток Bogr Т-клегки пролиферировали значительно активнее, чем в присутствии Bog" (рис. I). Удаление прилипающих к пластику, клеток из суспензии антигенпредставлявдих клеток нивелировало различие между пролиферацией в присутствии антигенпредставлящих клеток Bcgr и Beg". По-видимому, в этом случае антигенную презентацию и фидерную функцию выполняют другие метки, например, В-клетки, на которых ген Beg но зкспрессируется.
При иммунизации мшей не соникатом H37Rv, а живыми М.tuberculosis H37RV в НАФ пролиферация Т-клеток также зависела от ал-леля Bog интактных антигенпредставлявдих клеток, однако в этом случав пролиферативная активность клеток нефракционировашшх лимфоузлов была резко подавлена. По-видимому, вводя в подушечку лапы живые микобактерии в адъюванте, мы создаем в регионарном лимфоузле хронический туберкулезный процесс о выраженным супрессор-ным компонентом со стороны макрофагов, чего не происходит при иммунизации соникатом H37HV. При заражении вирулентными H.tubsrou-loete H37Bv чероз две недели уровень Igo, реагирующих в ИФА с соникатом H37Bv, был достоверно вша у мышей Всвг. чем Bog" • (табл. 4).
При исследовании уровня антител а сыворотке вакцинированных всо мышей, конгенных по гену Beg, некоторые различия (более высокий уровень у мышей Bcgr) в уровне igO, связывающих соникат H37Bv, выявлены через I мес. после вакцинация, через 2,5 месяца эти разл:гчия не обнаруживаются. Возможно, что всё это связано с
о а к
N 10
5 _
200 тыс. Т-кл./лунку
..
$
X
ч N
\
\
\
N
Т-кл
Bog'
Bog'
Рис. I. Пролиферация иммунных Т-клеток Bcgr/Bcg8 в зависимости от генотипа антпгенпредставлявдих клеток. Для получения Т-клеток клетки лимфоузлов от 3-х мышей (c.d2 - Bcgr х baib/c)?i, кл:.\ ¡у низлрова ннкх соникатом H37fiv в НАФ; 2-кратно фильтровали через нейлоновую вату, АПК - клетки селезенки от 2-х мышей c.d2 -Bcgr или вахв/с в каядоы случае, обработанные !Лит С. Ответ на :
соникат ,H37Rv
KPD
|~] контроль
более низкой аятигенпрадставлявдей способностью макрофагов Bog" по сравнению о Вод*, что проявляется в ранние сроки, в силу более медленного развития ответа у этих мышей.
Таблица 4
Уровень- ig« в сыворотке крови мышей, конгеннкх по гену Bog через 2 недели после в/в заражения M.tuberculoaio Н37ВГ
Мыши Число мышей Коэффициент экстинции в ИФА*
BAIiB/o 7 0,053 t 0,004 t4 = 2,8
Р< 0,01
C.D2 - Bogr 7 0,094 t 0,014
* - В качестве антигена использовали соникат H37Hv.
Что касается контроля геном Bog естественной резистентности (высеваемосгь микобакторий из селезенки), то мы выявили лишь некоторую тенденцию к более высокой скорости размножения и.tuberculosis H37Bv в Bog"-селезенке по сравнению с Bogr. в то же время высеваомость H37HV из селезенки мышей i/st существенно (в 15-30 раз) превышает высеваемость из селезенок конго шик по Bog и всех других исследованных мышей. При заражении M.bovis (все) мыши i/st от других не отличаются. Таким образом, естественная резистентность к н.bovis (все) и И.tuberculosis H37Bv имеет раздельный генетический контроль, к все - ген Bog, к H37Bv - тъс-х, хотя незначительное влияние ген Bog на рост H37Bv оказывает.
Мыши l/3t (ген тьс-10) помимо повышенной восприимчивости к заражению вирулентными н.tuberculosis H37Bv, характеризуются крайне низкими показателями противотуберкулезного иммунитета /Мороз A.M., 1984/. Мы исследопали способность мшзой I/3t, ищу-
шзнрованных соникатом H37Hv, отвечать на микобактериальные антигены. Оказалось, что Т-клетки мышей отвечают на антигены мико-бактерий, а их клетки селезенки способны к антигенной презентации (рис. 2). То есть мы не выявили какого-либо глубокого дефекта иммунитета против антигенов H37Hv, как это имеет место при заражении живыми H.tuberculosie H37BV. По-видамому, при заражении вирулентными микобактергоши дефект естественной резистентности мышей i/st столь значителен, что потенциально вполне нормальный иммунитет оказывается полностью несостоятельным.
Всё это указывает на то, что гены Bog и тъо-l неидентичны, что также подтверждается комплементацией генов тъс-1° и Bog8 (табл. 5) .в тесте выживаемости зараженных мышей, отсутствием сцепления гена ТЬо-Х с маркером f«y хромосомы I мыши.
Таблица 5
Комплементация генов Beg и тъо-1
Мыши ГЬс-I Beg Среднее время выживаемости (дни) - а
I/St с г? 19,5 £ 1,2
Вб г в 26,3 2 »2»
ВАЬВ/о г а 31,2 t 2,0Д
(BAlB/o х I/St)?I г/а в/г? 64,2 t 4,4 — ^.p<ro,oai
(Вб х I/St)*I г/в в/г? 72,3 £ 3,3 -Л P< O.OCtt
П. Противотуберкулезная резистентность гибридов и.
При заражении туберкулезом гибриды 1Хх (акв х l/st),(cBA х I/St)?I, (СВА х Вб)*1, (Вб х ВАЪВ/с)iI, (BIO.WB X BBSDBT)?I, (C3H/H«j х I/st) оказались значительно резистентнее, чем мыши любой из родительских линий (табл. 6). Здесь, по-видимому, имеет
S
о • а
I-
Рис. 2. Пролиферативная активность in vitro глоток мытой I/St, имцунизированшя соилкатом H37Rv. Ответ на: jjjjjj сонякят ir37Hv
а - рро о контр°ль
Таблица 6
Выживаемость мышей ряда линий гибридов И, зараженных K.tuY>ercx0.oeie И37нт
Мыши
Число Время выживаемости
животных (дни) £ ®
I/St 15
AKS 7
(AKB % I/3t)FI 9
CBA. 24
(CBi. X I/St)ll 8
C57BL/6 II
(B6 x CBA)JI 8
BAXB/o 18
(B6 x BAI<B/o)FI 12
BBSUHT 8
(bbsu»x x i/st)fi 7
BIO.WB 6
(BIO.WB x BBSDWl)ri 8
(BIO.WB x BXO.BB)n 6
A/Sa 10
BIO 12
(A/So * Bio)PI 9
C3H/H«j 8
(CJH/tleJ X I/St)?I II
21.3 t 40,8 t
124,8 t
37.4 t
83.5 -
25.0 -
66.3 t
31.4 t
84.5 t
38,7 t
30.2 t 27,5 t
59.3 t
33.4 t
44.1 t
27.2 t 70,2 t 26,2 t 82,0 t
0,6
8,2^
5,5<-* 2Д\ 4,I<^ 2,2 ^ 6Д . 3,2 1,6 3,2 2,8
3.1
2.2 2,1 4,8 .2,0 4,8
p< o.oar
p<o,ooi
p< o.oar p<-o.oar
•p<" 0,02
Н.Д,
p<o,oocn
>p< 0,001
н.д. - различия статистически недостоверны.
место явление сверхдоминирования или гетерозиза, при этом аллели дикого типа доминируют над аллелем сверхчувствительности мышей X/St» не позволяя проявиться дефекту противотуберкулезной защиты. Исключение составляют мыши (ввзимт * l/st)ïl. Эти гибриды имеют промежуточную резистентность по отношениг к родительским линиям. Этот факт нельзя объяснить, исходя из полигенного наследован ия восприимчивости к туберкулезу, поскольку мыши линии I/S сверхчувствительны не из-за "бедного" набора генов, обеспечивающих резистентность, а вследствие наличия лишь "дефектного" эпи-статического аллеля в гомозиготном состоянии. Об этом молено судить, исходя из высокой, а не промежуточной резистентности гибридов (АКН X i/st)Fi и (СВА X i/st)?i, (озн/Uej х i/st) (см. таблицу 6). Можно предположить, что неполное доминирование линии BRSUNf над дефектом протюзогуберкулезной резистентности мышей I/St связано с идентичностью гаплотипов н-2 мышей i/st и Basrai, однако,, как можно видеть в таблице, для сверхдоминирования гетерозигот гетерозиготность по н-2 менее важна, чем гетеро-зиготность по генам основы (вю.га * внзиит)?1 (н-2^/н-гЪ, и, наоборот, гетерозиготность по н-2 на гомозиготной основе -(bio.STB * вю.ва) (н-г^/н-г*) не обеспечивает сверхдоминирования. Так или иначе, закономерностью является повышенная резистентность гетерозигот, мыши se (bhsunt * i/st)?l составляют исключение: по-видимому, мыли вазиит не способны полность комплементировать дефект гена îbc-X мышей I/st, хотя сами являются весьма резистентной линией.
Особое внимание обращают на себя гибриды (akh х l/st)?l, эти мыши обладают чрезвычайно высокой резистентностью даже по сравнению с резистентных® линиями сва, акй и даже другими гибридами 91. По-видимому, эти мыш характеризуются высокой гете-
розиготностью и удачным набором и сочетанием аллелей, полученных от родительских линий. Это позволяет использовать мышей (акн х
l/st)n, наряду с .другими высокорезистентными гибридами в качестве модели для изучения основ повышенной резистентности к туберкулезу. Следует отметить, что мы не выявили второй линии наряду с i/st, несущей аллель Tbc-i", так как все чувствительные линии оказались комплементарными с i/st, и их гибриды обладали высокой резистентностью.'
При сравнительном исследовании резистентности (выживаемость мышей и высеваекость микобактерий из селезенки зараженных мышей) и иммунитета (ГЭГ на туберкулин, пролиферация лимфоцитов i» vitro на IFD, ФГА) оказалось, что гибрида (лев % i/st)pi характеризуются наибольшими значениями всех показателей резистентности и иммунитета, превосходя в этом мышей i/3t, ata и гибридов (bio.wb х вю.вв)?1, идентичных с ниш по генотипун-2 (в-г^н-г16), что угазывает на более важную роль не-н-2 генов в создании высокой резистентности к туберкулезу. У мышей (Л£В х i/st)/x, тимэк-томирбванных за 5 месяцев до заражения, все показатели иммунитета имели крайне низкие значения (ГЗТ - 0,16 мм, низкий уровень пролиферации лимфоцитов практически с отсутствием их стимуляции), однако их выживаемость не снизилась до уровня 1/3t, а оказалась на уровне мышей акн (около 50 дней) и высеваемость микобактерий из селезенки была также на уровне дкв. Это указывает на то, что высокая резистентность мышей (дкв х l/зt)и складывается из высокой естественной резистентности и выраженных реакций Т-клеточного иммунитета. Прч этом высокая естественная резистентность сама по себе обеспечивает достаточно высокий уровень сопротивляемости к туберкулезу.
И. Иммуногейетичг.с&п аналиь Факторов противотуберкулезной резистентности. сегрегирующихся в паре линий вб - вах-в/с
Мыши вб и вахв/о при заражеьли и.ЪиЪегси1оа1в н37в*- показали сравнительно невысокую резистентность, гибриды же п между этими линиями высокорезистентны (табл. 6). Учитывая этот факт, а также продемонстрированный ранее сложный характер наследования противотуберкулезной резистентности, од сочли целесообразным провести сегрегационный анализ наследственных факторов, проявляющихся в паре мышей вб и вахв/о. Были приготовлены и заражены а.гиЪагси1оо1в нз7ну потомки возвратного скрещивания ЗС1, * вб и ух х вахв/с. Результаты индивидуальной вышваетости этих мышей представлены в табл. 7. Мы видим, что в обоих типах скрещивания потомки ВС1 разбились на несколько групп с весьма широким диапазоном выживаемости, начиная с 18-21 дая и кончая 116-129.
Таблица 7
Выживаемость потомков скрещиваний 3 ваьв/о
и я 5 вб, зараженных туберкуклезом
Мша День гибели
(ВЖЬВ/о х В6)?1 18 19 20 20 56 66 73 121 122
X ВАЬВ/о 24 25 26 27 79 84 122 129
29 29 31
(ВАХВ/о х В6)р1 21 21 25-" 40 42 43 58 58 1СТ .
X Вб 28 30 30 45 47 47 66 69 109
30 33 33 47 48 48 69 69 116
74 75
При скрещивании У1 х вдхв/с выделяются три группы, которые можно обозначить как чувствительная, резистентная и высокорезистентная; мши последней группы имеют уровень выживаемости, превы-
шающий не только выживаемость родительских линий, но и внсокоре-зистентных гибридов 11. Потомки ВС! (*1х вб) также разбились на группы от чувствительной до высокорезистентной, однако группирование их имеет несколько более сложный характер и их группирование в таблице носит несколько условный характер. Так или иначе, потомки двух типов возвратного скрещивания разбиваются на высокочувствительных, резистентных и васокорезистентных мышей, что соответствует двухгенному контролю восприимчивости.
Для более тщательного исследования этого явления была использована панель рекоыбинантных инбредных линий (Б1-лшшй) серии схв. Напомним* что семь линий этой серии были выведены в результате инбридинга (более 20 поколений) потомков от скрещивания мышей линий вб и ваьв/с (сокращенно в и с соответственно) /Ва1-1ау I)., 1971/. Каадая из семи М-линий не имеет новых генетических локусов по отношению ". исходным линиям вб и ваьв/с, геном каждой из этих линий представлен комбинацией генов (в гомозиготном, естественно, состоянии) вб и вах-в/с, и каждая линия имеет свою комбинация этих генов. Тем самым эта панель представляет собой весьма удойный инструмент для исследования генетики мышей вб и ВАЬВ/с.
В табл. 8 представлены показатели выживаемости мышей Ш-ли-ний охв, зараженных млиЬвгси1оа1а нз/а*. Пять из семи М-лшшй имеют резистентность, сходную с резистентностью мышей вб и ваьв/о, выживаемость находится в пределах 25-32 дня и две линии - схвб а схв1 - резистентные, достоверно отличаясь от этих пяти линий и от вб и ыхл/с. Изс выживаемость 45,3 и 51,0 дня.
Результаты, полученные о Вб , вахв/о, И потомками В& 71 х вб и п х ваьв/с и с Ш-дшшши, мы объясняем с помощью следующего пшотетического предположения. Восприимчивость какой
Тайяя» 3
Выживаемость мышей ЕЛ-диний серия СХВ, зараженных туберкулезом
Линия шяай Число мышей Зремя выживаемости - ®
С57В1,/6 1Г 28.2 11.6
ВАХВ/о 17 32 Д 1,7
(Вб х ВАЬВ/с) 9 «3.4 р < 0,001
сш 5 25,0 1 0.7—
СХВЕ 10 32.1 t 3,3
схво схвн схвх 6 8 7 45,3 27.2 51.0 р.^о.осп; р< 0.001
схвд 9 27.9
> н.д.
схж II 26.3 1 2,9--"
в ах в/о и вб контролируется двумя неаллельныш генами (обозначим их условно А и В), каждый с двумя аллелями - доминантными аг и вг (обусловливают резистентность) с доза-зависимой стенотипической экспрессией и рецессивными эпистатлческими А° и в® (обусловливают чувствительность). В этом случае генотип мышей вдьв/о запишем агагвавв, вб - а8а8вгвг. Мыши обеих линий весьма восприимчивы к туберкулезу, что объясняется подавлением аллелей "резистентности" анастатическими аллелями "чувствительности". Сверхвысокая резистентность гибридов ?! обеспечивается функционированием обоих "резистентных" аллелей и гетерозисом. Высокую резистентность мышей схб& и схв1 следует объяснить благоприятным сочетанием аллелей генов А и в - агагвгвг( но полное отсутствие гетерозиготности не позволяет этим мшам достичь уровня резистентности гибридов рх. А в предыдущем разделе ш убедились, что ге-
терозиготность гибридов, как правило, обеспечивает повышенную резистентность к туберкулезу. Среди мышей возвратного скрещивания следует ожидать разнообразные варианты генотипов: как родительские а?агв?вР, а?а9в?в?, так и другие - от чувствительных типа агавв"вв и ававвгв", до резистентных агл"вгв8 и высоко-i-эзистентных агагвгв°.
Для проверки предложенной гипотезы были проведены дополнительные скрещивания.
Суть проверки заключается в следующем. Если мыли Ш-линий cxbi и схвз имеют генотип агагвгвг то при скрещивании с 16 и ваьв/о гибриды будут иметь генотип ага"вгвг и агагвгвв, т.е. в обоих скрещиваниях потомки должны быть высокооезистентны.
Мыши других Ш-линий при скрещивании с родительскими линиями лолжны давать с каждой линией восприимчивых потомков, если РИ-линия имеет генотип ааА.ввввв, если же один из генов в Ж-линии п;здставлен/доминантным аллелем, то одна из линий (В6 или BALB/o) должна комплементировать эпистатические аллели и соответствующие потомки будут резистентны, потомки же от скрещивания с другими линиями,- нет. Результаты подобных скрещиваний с последующим заражением потомков представлены в табл. 9.
Представленные в таблице результаты не противоречат высказанной гипотезе, а примененный подход проверки гипотезы позволяет, кроме того, определить принадлежность (от вб или balb/o) каждого из двух постулируемых генов противотуберкулезной резистентности, сегрегирующихся в паре инбредаых линий вб и balb/o.
В работе были изучены особенности реагирования в ГЗГ на туберкулин мышей Вб, balb/o и производных от них после заражения U.tuberculosis H37Rv я иммунизации u.bovie (BCD). В табл.10 приведены показатели этих реакций у мышей вб, вахв/о и Ш-линий.
Таблица 9
Выживаемость гибридов Я от скрещивания Иллиний с шааш ваьв/о и Вб, посла заражения МЛиЪ«гси1оя1э Н37йу
Тип Дни гибели Предполагаемый
скрещивания мышей (дни) генотип исследу-5 а емой РИ-ллнии
Происхождение аллелей
-в—
СХВ1 х ВАХВ/о СХВХ х Вб
СХЫ X ВАХВ/о СХВ^ х Вб
СХВВ х ВАХВ/с СХВВ х Вб
67.2 £ 6,8 64,6 £ 4,4
26.3 * 3,3
44.2 £ 4,4
24.3 £ 3,2 22,2 £ 3,2
АГАГВГВГ
АгАгВаВ°
6*85
А А В В
О
в
В
<31
Таблица 10
Показатели гиперчувствлтеданостя замедленного типа у мняей, производных вб и ваьв/е после заражения м.*иЪвгви1оа1а Н37ВТ и иммунизации й.ъочгАа (ВСО>
_Показатели ГЗТ (ш)_
Мыши После заражения После вакцинации вс8
Число мышеЦ гзг £» Число мышей Г5Т £»
ВАХВ/о 14 0.23 £ 0,02 10 0,32 £ 0,04
Вб II 0,20 £ 0,03 6 0,29 £ 0,03
И 10 0,33 £ о.оз — не исследоа.
СХЕЭ 8 0,18 £ 0,01 II 0,30 £ 0.,05
схвз 7 0,18 £ 0,03 7 0,31 £ 0,05
схво 8 0,28 £ 0,04. 6 0,41 £ 0,03
схвн 6 0,15 £-0,02 0,26 £ 0,03 .
СХВ1 9 0,25 £ О'.СЗ 8 0,24 £ 0,03
схы 8 0,22 £ 0,02 7 0,16 £ о.оз
СХВК 9 0,15 £ 0,01 7 0,23 £ 0,02
5 - Значение туберкулиновых проб определяли через 18 дней
после заражения; ш - Значение туберкулиновых проб определяли через 5 недель после иммунизации.
Из датах, приведенных в табл. 10, можно сделать ряд выводов. Во-первых, значения реакции ГЗГ у мшей, иммунизированных всо, в целом выше, чем у мышей, зараженных вирулентными микобактериями. Это объясняется тем, что введение *.ьот!в (все) не приводит к развитию болезни, а лишь индуцирует формирование иммунитета, в то время как вирулентные микобактерии, помимо индукции ответа, приводят к развитию туберкулезного процесса с летальным исходом, по мере'приближения которого нарастает супрессия иммунного ответа наряду с подавлением и других функций защиты организма. Во-вторых, здесь, как и при оценке противотуберкулезной резистентности по другим параметрам, проявляется принцип доминирования гетероаигот - гибрида 'X имеют более высокие показатели ГЗГ, чем родительские линии (исследовала при заражении). В-третьих, ш видим, что распределение Ш-линий по уровню ГЗГ при заражении не идентично распределению при вакцинации вса. Если при заражения наибольшие показатели ГЗГ наблюдаются у мышей охво -0,28 и 6X81 - 0,25, то у вакцинированных все наибольшие показатели имеют охво - 0,41 и схвв - 0,31, в то время как схвх имеет показатели 0,24, что ниже показателей мышей схвв - 0,31 и ОХВН - 0,26.
1У. Генетический контроль и Фенотгатическая экспрессии протективяого эФйекта вакцинации ВС о.
Утвердительный ответ на вопрос о существовании "отдельного", в чистом алде генетического контроля протекции вса мог бы дать факт существования, по крайней мере, двух линий мышей, имеющих одинаковый уровень резистентности при первичном заражении туберкулезом, но резко различающихся по уровню резистентности посла шкцинациу. все.
Для исследования этого вопроса мы заражали вирулентными
M.tuberculoale H37Hv мышей рада лзший, каждая из которых была представлена двумя группами: I - вакцинированные подкожным введением 500 мкг/мышь м.bovis (всо) за пять недель до заражения и 2 - неиммунные мыши. В табл. II представлены с^ДНие значения сроков выживаемости этих мышей, а такжа.индекс протекции и процент увеличения продолжительности жизни. Индекс протекции определяли как отношение срока жизни вакцинированных мышей .. сроку жизни невакцинированных вса'мышей. Мы видим, что для большинства линий картина похожая: вакцинация вса существенно пролонгирует выживаемость поело заражения нирулентныг штаммом,микобактерий. Так, мыши вю и вalb/o имеют исходно невнеофта (и почти одинаковую) резистентность, и вакцинация всо оказывает на этих мышей практически одинаковое протективное действие. .
Похожая картина складывается и в отношении резистентных линий ахв и сба отличие лишь в том, что у исходно более резистентных мышей относительные значения протекции несколько ниже, хотя абсолютные значения выживаемости после вакцинации у этих мышей выше.
Мыши сзн/fteJ отличаются от мышей сзц/Sn наследуемым дефектом иммунного ответа на липополисахарид (ген ¿ре4 ), и из таблицы II можно.видеть, что этр мутация снизила первичную резистентность шлей к туберкулезу, однако протективным действием на мышей сзн/fcej все обладает в неменьшей степени, чем на C3H/Sn.
Особого же внимания заслуживают мши линии сък/я. Мыши этой линии характеризуются практически отсутствием эффекта вакцинации всо. Эти мыши - носители мутации х!4 (сцепленный с Х-хромосомой иммунодефицит), имеют первичную резистентность (порядка 29 дней) несколько ниже, чем сва (36,0), но вше, чем мши чувствительной группы (bio, вахв/с). Однако, в результате вакцинации все,
Таблица II
Продолжительность жизни вакцинированных все и невакци-нированных мышей, зараженных М.ЪЛегси1ов1в Н37а» и % пролонгирования выживаемости в результате вакцинации
Линия мышей Число к шей Среднее время*, выживаемости - ш Индекс протекции % увеличения продолжительности жизни
ИНТ- вак. интакт-ные вакцинированные
ВАЬВ/с 15 13 23,6ti,i 57,7*5.1 2,4 145
BIO . 23 25 23,2^-1,0 57,8*1,2 2,5 149
ВЮ.ЯВ '8; 8 22 ,Cfcl ,5 53,9*10,8 2,5 145
BIO.BB I; 14 23,2^1,5 53,5*6,8 2,3 131
C3H/Sa 13 9 28,3^2,5 52,1*2,8 1,8 85
СЗН/На 35 25 21,6*0,5 44,2*4,1 2,0 105 .
AER 13 16 38 ,CÉ-2 ,б 68,7*5,0 1.8 80
СВА 25 18 36,0^1,9 70,CÉ3,I_ 1,9 94
8 27,5*1,6 33,9^2,2 1,2 23
СВАД** [ » 12 30,3^2,2 37,1*2,3 1,2 30
1
V6 13 27,8*1,9 33,1*1,2 1.2 19
Ь 12 29.CÍ4.7 33,8¿4,I ' 1,2 . 17
I/St 12 14 19,2*1,3 28,8*1,1 1.5 50
* - Результаты получены на основании 2-3 экспериментов; ** - Приведены раздельно результаты 4-х экспериментов.
их резистентность едва "дотягивает" до невакцинированннг' сва, увеличение продолжительности жизни в среднем составляет-- 20$. Таким образом, представленные здесь результаты говорят- а' том, что мыши с одинаковой исходной резистентностью к туберкулезу могут имоть различную резистентность после вакцинации bcg;'„ мыши резистентных л5ший характеризуются нормальным протективннм действием все, числовое выражение которого несколько ниже, чем у*чувствительных мышей (однако не всех), обнаружена линия мышей сва/н, характеризующаяся резко сниженной способностью развивать протек-тивный противотуберкулезный иммунитет в результате вакцинации-всо.
Мыши сва А не отвечали на вакцинацию все также и увеличением реакции ГЗТ на туберкулин (0,16 мм у зараженных и 0,19 мм -у зараженных после вакцинации BCG).
Как уже было сказано, мыши сва/н имеют характерное отличие как от мышей линии сва, так и других линий: в Х-хромосоме этих ЛИНИЙ локализована мутация xid (- X linked immunodeficiency), приводящая к дефекту B-клеточного иммунитета, в частности, у мышей сва/я отсутствует популяция B-лимфоцитов с маркером ХуЬ-5+, кроме того, для этой мутации характерен и ряд других проявлений. Мы исследовали сцепление дефекта вакцинации всс у .лышей сва/й с X-хромосомой. Для этого использовали гибриды pi (сва/н х сва).
В результате такого скрещивания самки гетерозиготны по гену xia и имеют нормальный фенотип, а самцы - гемизиготны и тлеют дефектный фенотип. Следовательно, если дефект вакцинации bog у мшей сва/н определяется геном xid, то среди гибридов (сва х сва)pi он должен проявиться у самцов и не проявиться у самок.
Из рис. 3 можно сделать заключение, что дефект вакцинации мшей сваД сцеплен с Х-хромосомой и, по-видимому, обусловлен
Р^О.02
CBA/N
СВА
СВА/Н СВА
¿ ' % (cba/h х cbajf1
Рис. 3. Выживаемость вакцинированных все и невакцинирован-ных мышей в зависимости от гена xid. [Алией вакцинировали ц/к в со (500 мкг/мышь), через 5 недель заражали в/в к.tuberculosis
H37Bv. _ мыщи ваццллировалние всс перед заражением
- невакцинированные мыши
геном xid« самки (свА/to х cba)íi, вакцинированные все, близки по выживаемости к мышам сва, а самцы - к сва/к. Различия между выживаемостью самок и самцов - достоверны.
При исследовании пролиферативной активности in vitro клеток лимфатических узлов мышей, вакцинированных все, оказалось, что клетки СВА/Й пролиферирузот значительно менее активно, чем клетки сва как в присутствии рро и Конfi так и спонтанно.
Таким образом, ген xid', не оказывая выраженного влияния на резистентность мышей к первично^ заражению туберкулезом, обусловливает практически полное отсутствие лротективного эффекта вакцинации все, что указывает на возможность избирательного контроля протективного действия всо на противотуберкулезный иммунитет.
ВЫВОДЫ
1. Совокупность результатов, полученных в работе, позволяет сформулировать концепцию о полигонном контроле противотуберкулезного имгфгкитета и резистентности как при экспериментальном туберкулезе, так и вакцинации все.
2. Обнаружен широкий спектр генетически детермшированного уровня резистентности лг'кий мышей и гибридов И к экспериментальному туберкулезу: от сверхвосприимчивости мышей i/st до сверхрезистентности гибридов (акв х l/st)7l. Высокая резистентность последних складывается из высокой выраженности факторов естественной резистентности и приобретенного иммунитета.
3. Сравнительный анализ выживаемости животных и выраженности ГЗТ in vivo на туберкулин всех исследованных лшш" ншей позволяет сделать заключение, что эти показатели жестко не коррелируют между собой.
4. Ген Beg незначительно влияет на естественную резистент- • ность мышей при заражении M.tuberculosis H37ttv, в то время как мыши i/st, несущие ген тьо-i0, характеризуются в 15-30 раз более высокой высеваемостыо M.tuberculoeie H37Bv из селезенки зараженных мышей, чем все другие линии. По результатам анализа вы- , •/ севаемости шкобактерий из органов и комплементации "дефекта"
гена ibo-i" при скрещивании с мышами, несущими ген Beg", следует, что гены Beg и tbc-I неидентичны. .
5. Выживаемость мышей, зараженных M.tubereuloeie H37Bv и их уровень гиперчувствительности замедленного типа на туберкулин
не находятся под контролем гена Bog. Эффект вакцинации ВС& так- . же не зависит от гена Beg.
6. Клетки лимфатических узлов мышей генотипа Bcgr, имцуни- ; зированных соникатом H37Bv в неполном адъыванте врейнда, характеризуются более высокой, чем клетки мышей Bog8, . пролифератив-ной активностьюi» vitro как спонтанной, так и индуцированной шкобактериальными антигенами ( Ш), соникат Н37К*).
7. Т-клетки мшей (C.D2 - Bogr х BALB/c)?l (Begr/Bcge), иммунизированных соникатом или живыми ».tuberculosis H37Rv, проли-ферируют in vitro сильнее в присутствии антигенпредставляпцих . клеток Bogr чем Bog", удаление прилипащих -к пластику клеток из суспензии антигенпредставлявдих' клеток отменяет эти различия.
8. Для генетического контроля противотуберкулезной резистентности характерны такие явления, как гетерозис (высокий уро- : вень резистентности гибридов я по сравнению с родительскими линиями) и эшстатическое взаимодействие генов (l/st, Вб - влъв/о).
9. Ген *г>с-1 не сцеплен с генетическими маркерами: /* (хромосома I), а (хромосома 2),.Ъ (4), сир (оба 7), 4 (9), в (14), н-2 (17), X (20).
. 10. Мутация lpsa (мыши СЗЧ/Й«') привела к снижению противотуберкулезной резистентности при заражении м.tuberculosis H37Hv. Эта мутация не препятствует формированию протективного иммунитета при вакцинации всо.
11. Постулируется существование генетического контроля эффективности противотуберкулезной вакцинации всо, отдельного от контроля восприимчивости к первичному заражению M.tuberculoeia Н37&Г.
12. Мыши сва/К характеризуются несколько сниженной резистентностью к первичному заражению м.tubérculoais H37Hv, по сравнению с мышами сва.; предварительная вакцинация все практически не повышает (в отличие от всех других исследованных линий мышей) их выживаемости при заражении туберкулезом и уровня реакции ГЗГ на туберкулин. Клетки лимфатических узлов мышей сва/н, вакцинированных всо, характеризуются сниженной (то сравнению с сва) пролиферативной активностью ia vitro - как спонтанной, гак и в присутствии микобактериальных антигенов.
Отсутствие эффективности вакцинации всо у мышей сва/н сцеплено с Х-хромосомой (ген xid ).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Мороз Д.М., Апт А.С., Никоненко Б.В. Генетический контроль сопротивляемости к, туберкулезу у мышей //В сб.: Труды 2-й конференции по иммунологии туберкулеза.- Мос^за, 1983,- С. 19-22.
2. Мороз А.М., Апт А.С., Никоненко Б.В. Ищуногенетические механизмы резистентности к туберкулезу у мышей // Пробл. туберкулеза.- 1983,- К 9.- С.49-52.
3. Авербах М.М., Мороз А.М., Апт А.С., Никоненко Б.В. Имг.у-ногенетика инфекционных заболеваний // М.: Медицина.- I985.-253 с.
4. Nllconeoko B.V., Apt A.S., Йогов A.B., Averbakh K.M. Genetic analysis of Susceptibility of »ice to H37Bv tuberoulosis infection» sensitivity versus relative resistance // Progr. Leur. Biol.- 1985.- V.3.- 291-299.
5. Никоненко Б.В., Апт A.C., Мороз А.М., Авербах М.М. Гене-'.лческие аспекта экспериментального туберкулеза у мышей // Генетика.-1986,-№ 5.-С.851-854.
6. Никоненко Б .В., Апт A.C., Межлумова М.Б., Мороз А.М. Линия мышей, конгенная с A/Sn по гену чувствительности к туберкулезу //В кн.: Актуальные вопросы теоретич. и прикл. инфекционной иммунологии. Мех-мы цротивоинфекц. иммунитетаМосква.-1987.-С.54.
7. Buschman В., Apt A.S., Hilconenko B.V., Moroc A.M., Aver-balcb Ü.M., Skamene B. Genetic aspects of innate resistance and acquired immunity to mycobacterial in Inbred mice // Springer Sea* min. Tmmunopatbol.- 1988.- V.XO.- Я 4.- 7.319-336.
8. Hikonenko B.V., Apt A.S., Meshlumova K.B., Koros A.M. Development of a new congenic murine Strain A-I-Tbo- Iе // XYI tb . Intern. Congress Qenetlcs.- Toronto.- 1988.- F.825>
9. Хоменко А.Г., Авербах UM., Литвинов ВЛ., Маленко А.Ф., Мостовой Ю.М., Мороз А.М., Никоненко Б JB., Поспелов Л.Е., Чукано-ва Ь.П. Проблемы наследственности при болезни легких // М.: Медицина.- 1990.- 240 с.
10. Мороз A.M., Апт A.C., Никоненко Б.В., Межлумова М.Б. Им-муногенетические маркеры чувствительности к туберкулезу / Симп. Тенетические маркепы в актропогенетике и медицине",- Хмельницкий.- 1988.- С.282.
11. Мороз A.M., Апт A.C., Никоненко Б.В., Межлумова М.Б., Майоров К.Б., Крамник И.Б. Генетический контроль противотуберку-
лезного иммунитета у мышей // 1-й Всесоюзный иммунологический съезд.- Москва, 1989.- T.I.- С.78.
12. Никоненко Б.В. He-H-2 гепы в контроле специфического иммунитета и резистентности при экспериментальном туберкулеза у мышей // В сб.:Труды ЦНИИТ "Проблемы наследственности при туберк. и др. легочной и инфекц. патологии.- Т.54.-Москва, 1990.-
С.162-168.
13. Методические рекомендации МЗ СССР "Практические рекомендации по проведению иммунологических исследований при туберкулезе и других заболеваниях легких".- М.,. 1984.
14. Коллективная монография. Руководство по инфекционной иммунологии.- М.: Медицина, 1332 (в печати).
15. Hikonenlco В.V., Hezhlumova M.B., Apt A.S., Markov A.H., Horoi A.M., Averbakh И.М. Imaunogenetica of high resistance to tuberculosis in nice // .. Int. Congr. of imaunologisis in West Berlin, 1990.- P.74.
16. Никоненко Б.В., Апт A.C., Меялумова М.Б., Мороз A.M. // Гены Beg и Tbc-Ijвзаимосвязь // Генетика.-1990.- й 12.-
С.2254-2257.
17. Никоненко Б.В., Меялумова М.Б., Мороз A.M. Генетическая регуляция ответа хозяина на введение Mycobacterium bovis (всо) и Mycobacterium tuberculosis H37Bv // Бюл. ЭКСП. биол.- 1990.-№11.- С.526-528.