Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу

На правах рукописи

Орлова Марианна Олеговна

ПОЛИГЕННЫЙ КОНТРОЛЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЫШЕЙ К ТУБЕРКУЛЕЗУ.

14.00.36. - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.С. Апт

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А. Ярилин доктор медицинских наук, профессор A.M. Мороз

Ведущая организация:

Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗРФ

Защита состоится "_" октября 2004г. в 11 ч. на заседании Диссертационного

совета Д001.007.01 в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан"_"_2004г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения заболевание туберкулезом остается существенной причиной смертности, и количество новых случаев заболевания насчитывает миллионы ежегодно. Росту числа случаев инфицирования Mycobacterium tuberculosis способствует появление новых лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий и распространение иммунодефицитных заболеваний (Leinhardt, 2001; WHO report 2002). При этом, хотя общая инфицированность достигает одной трети всего населения Земного шара, лишь у небольшой части развивается клинический туберкулез. Чувствительность к туберкулезной инфекции определяется многими факторами, в том числе и генетическими (Comstock, 1978; Stead et al., 1990; McLeod et al., 1995). Генетические и иммунологические механизмы, лежащие в основе резистентности и чувствительности организма-хозяина к туберкулезу, во много не ясны. Один из прямых путей к пониманию этих механизмов - это картирование и последующее клонирование генов, определяющих уровень чувствительности к инфекции. Второй путь - определение уровня экспрессии генов в клетках, органах и тканях у чувствительных и резистентных особей, а также оценка изменений в уровне экспрессии генов, вызванных самой инфекцией Изучение генетических закономерностей контроля инфекции непосредственно у человека очень осложняется гетерогенностью популяции и сильным воздействием факторов внешней среды. Поэтому широко используются модели на животных и клеточных культурах in vitro, позволяющие упростить систему и уменьшить влияние факторов окружающей среды и клеточного многообразия.

Использование инбредных линий мышей для обнаружения генов, участвующих в контроле чувствительности к микобактериям, позволило картировать и клонировать ген Nramp 1, контролирующий экспериментальную BCG-инфекцию (Vidal et al., 1995; Skamene et al., 1998), а также картировать локусы sst-1 (Kramnik et al., 2000) и локусы Tlr-1, 2, 3, 4 (Mitsos et al., 2000, 2003). В лаборатории иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН была исследована чувствительность к летальной туберкулезной инфекции мышей более 30 линий и среди них была обнаружена сверхчувствительная к туберкулезу линия I/St (Nikonenko et al., 1985,

веса у зараженных животных с локусами tbs1-D3Mit215, tbs2-D9Mit89 и D17Mit175, расположенными в 3, 9 и 17 хромосомах, соответственно (Lavebratt et al., 1999, Sanchez et al, 2003). До настоящего времени оставалось неизвестным, участвуют ли эти три локуса в контроле эффекторных функций макрофагов, во многом определяющих уровень резистентности и чувствительности к микобактериям (Оггпе et a/., 1993, Kaufmann, 2000) и участвуют ли эти локусы в контроле клеточной инфильтрации легких при туберкулезнсй инфекции. Этот вопрос стал одним из основных в нашей работе.

Кроме того, применение технологии недавно созданных «больших» олигонуклеотидных микрочипов ДНК создает широкие возможности для исследования генно-экспрессионных профилей макрофагов, участвующих в локальном иммунном ответе на туберкулезную инфекцию (Ragno et al., 2001; Spira et al., 2003). Сравнительный анализ противоинфекционного иммунитета и генной экспрессии в популяции клеток-эффекторов у организмов с различной генетически-детерминированной чувствительностью к возбудителю заболевания формируют одно из перспективных направлений в инфекционной иммуногенетике. Принимая во внимание то, что макрофаги легких являются основными клетками, ответственными за непосредственное уничтожение и элиминацию туберкулезных бактерий из организма, представлялось особенно актуальным провести иммуногенетический анализ именно этих клеток.

Цель исследования.

Целью настоящего исследования стало изучение иммунного ответа и экспрессии генов в макрофагах легких мышей, различающихся по генетическим характеристикам, для установления связи между генотипом и фенотипическими проявлениями туберкулезной патологии.

Задачи исследования.

1. Определить индивидуальные генотипы по микросателлитным маркерам 3, 9 и 17 хромосом у животных и после заражения сопоставить инфильтрацию легких Т-клетками CD4\ CD8+, макрофагами и нейтрофилами с присутствием конкретных генотипов во всех трех локусах.

2. Определить антимикобактериальную активность легочных макрофагов, индивидуально выделенных от инфицированных животных F2 и провести корреляционный анализ с генотипами трех локусов.

3. Оценить способность мышей F2 контролировать размножение микобактерий в органах в зависимости от генотипа.

4. Сравнить патоморфологию легких при туберкулезной инфекции у мышей родительских линий I/St и A/Sn и их гибридов F2, несущих разное сочетание аллелей генов, влияющих на резистентность.

5. Оценить межлинейные и постинфекционные различия по экспрессии генов в легочных макрофагах мышей линий I/St и A/Sn методом РНК-гибридизации на микрочипах ДНК.

Научная новизна.

• Впервые была рассмотрена зависимость инфильтрации легких клетками различных типов от аллелей локусов 3, 9 и 17 хромосом. Установлено, что мощная инфильтрация полиморфоядерными лейкоцитами легких мышей зависит от сочетания рецессивного аллеля / в локусе tb$1 (D3MH215) и доминантного аллеля / в локусе D17MH175, унаследованных от чувствительных мышей I/St.

• Установлено, что антимикобактериальная активность макрофагов мышей F2 зависит от генотипа локуса tbsl; преимущество имеют животные F2 гетерозиготные по данному локусу.

• Показано, что интегральная картина патологического процесса и размножение микобактерий в легких мышей F2 контролируется полигенно, но прямая связь с генотипами локусов tbsl, tbs2и D17MH175 не прослеживается.

• Впервые исследованы межлинейные различия и изменения генной экспрессии в легочных макрофагах чувствительной и резистентной линий мышей. Показано, что в макрофагах чувствительной линии I/St по сравнению с макрофагами мышей A/Sn достоверно сильнее экспрессируются 35 генов и слабее 18 генов (из 12000 исследованных). При инфицировании макрофагов in vitro межлинейные различия в генной экспрессии увеличиваются, но инфекция регулирует экспрессию генов слабее, чем собственно генотип хозяина.

• Впервые продемонстрировано, что легочные макрофаги экспрессируют провоспалительный цитокин IL-11. При этом экспрессия гена IL-11 в 15 раз выше в макрофагах чувствительных мышей I/St. В сочетании с 3-кратной разницей по экспрессии гена IL-6 это может быть причиной неблагоприятного развития патологического процесса при инфекции.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные позволили определить, какие именно-механизмы антимикобактериального ответа, зависят от генотипов ранее установленных локусов. Кроме того, анализ результатов генной экспрессии в легочных макрофагах позволил выявить новые, ранее не исследованные гены, влияющие на развитие туберкулезной патологии.

Изучение работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяет выделить иммунологические реакции и контролирующие их гены, которые в совокупности определяют высокую индивидуальную чувствительность и неблагоприятное течение туберкулезной инфекции. Высокая гомология геномов мыши и человека позволяет рассчитывать, что наши исследования могут лечь в основу поиска генов, участвующих в контроле развития туберкулезного процесса у человека. В дальнейшем такие данные могут лечь в основу выявления групп высокого генетического риска заболевания туберкулезом.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 1°" Российско-Германском Симпозиуме по туберкулезу (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции Annual Meeting, of HHMU International Research Scholars, Таллинн, Эстония 2004.

Диссертация - была апробирована на совместном заседании лабораторно-экспериментального и иммунологического отделов ГУ Центральный НИИ туберкулеза РАМН 18 мая 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (5 глав), материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (2 главы), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 16 отечественных и 228 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные. Исследования выполнены на мышах инбредных-линий 1/StSnEgYCit (I/St) и A/JSnYCit (A/Sn), поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ

РАМН путем инбридинга по общепринятым правилам (Бландова и др. 1983). Гибриды F2(A/Sn х I/St) получены в этом же питомнике. Всего в работе было использовано 350 мышей. В экспериментах с мышами F2 использовались животные обоего пола, весом 21 - 25 г., в возрасте 2-4 месяцев. Для экспериментов по оценке генной экспрессии в легочных макрофагах мышей линий A/Sn и I/St использовали самок в возрасте 2-6 месяцев.

Микобактерии. В работе использовали вирулентный штамм М. tuberculosis H37Rv, полученный из института Пастера (Paris). Наработанную культуру аликвотировали и хранили при -80°С до использования. Перед заражением суспензию трижды отмывали центрифугированием (ЭОООд 15 мин, 4°С) и ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе.

Высеваемость микобактерии из органов зараженных животных. Органы инфицированных животных гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе, делали серию 10-и кратных разведений каждой суспензии и наносили на пластиковые чашки Петри с агаром Дюбо по 100 мкл суспензии каждого разведения. Чашки инкубировали при 370С 18 дней, подсчитывали колонии и пересчитывали количество микобактерии на орган.

Гистологическая оценка патологии легких у мышей F?. Легкие, полученные от инфицированных M.tuberculosis H37Rv мышей, фиксировали 1% раствором ПАФ на фосфатном буфере. Полученные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты были сфотографированы на цифровой фотоаппарат Coolpix 990 (Nikon, Japan) и затем обработаны с помощью программного обеспечения для анализа изображений LabWorks 4.0 (UVP Ltd., UK).

Получение легочных макрофагов. Суспензию интерстициальных легочных клеток получали по методу (Holt et a!., 1985) в нашей модификации (Lyadova et al., 1998) перевариванием легкого в RPM11640, содержащей HEPES, FCS, коллагеназу, ДНК-азу и антибиотики. Клетки инкубировали на пластиковых чашках и освобождали от неприлипших клеток. Прикрепившиеся макрофаги переводили из монослоя в суспензию, инкубируя в растворе Версена.

Проточная цитофлуорометрия. 500 тыс. клеток на пробу осаждали и обрабатывали aHTH-CD16/CD32 антителами для предотвращения неспецифического связывания. Через 5 минут в суспензии добавляли моноклональные антитела, меченые флуоресцентной меткой (из расчета 1 мкг/106 .клеток) и инкубировали клетки 30 минут при 4°С. Были использованы двойные окраски моноклональными

антителами Pharmingen и Caltag, меченные FITC и РЕ Анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur, BD, USA Анализировали не менее 104 клеток каждого образца, данные обрабатывали с помощью программы CellQuest™ Pro, 4 0 2 (BD, USA)

Взаимодействие макрофагов с микобактериями проводили в плоскодонных 96-луночных культуральных планшетах в СО г-инкубаторе в среде без антибиотиков Легочные макрофаги (60*1 О3 клеток/100 мкл/лунку) инкубировали в планшете 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляли суспензию М tuberculosis H37Rv (Pasteur) Оценка антимикобактериальной активности макрофагов производится по избирательному включению микобактериями [3Н]-урацила (Majorov et al, 2003)

Для анализа экспрессии генов взаимодействие макрофагов с микобактериями проводили в культуральных чашках Петри или 6-луночных плейтах в СО г-инкубаторе в среде RPMI-1640 содержащей 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамином 2%FCS без антибиотиков Суспензию легочных макрофагов переносили в чашку (по 8 5x106 клеток/10 мл) или в лунку плейта (по 1 5x106 клеток/3 мл) и инкубировали 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляли суспензию М tuberculosis H37Rv в соотношении 5 1 В качестве контроля использовались инкубированные, но не зараженные макрофаги Зараженные и контрольные макрофаги культивировали 24 часа до экстракции РНК

Для выделения тотальной РНК из макрофагов и фибробластов легкого использовали набор RNeasy MimKit (QIAGEN, Germany), следуя методике производителя Полученные пробы РНК хранили при -80°С

Анализ генной экспрессии макрофагов с использованием микрочипов ДНК Affymetnx. Были использованы микрочипы ДНК Genechip® U74Av2 для мышиного генома (Affymetnx Santa Clara. USA, Fodor et al, 1991, Lockhart et al, 1996) В Геномном Центре г Монреаль, Канада, были проведены гибридизация проб РНК, полученных из зараженных и контрольных макрофагов самок линий I/St и A/Sn Флуоресценция связавшейся РНК рассчитывалась при помощи Gene Chip Reader, cincuTrio мОЛу*ч6ппо1л Даппо(Л 5dij~ ПрОббДсп с Пимищью itpOipdMMbi "vnuuAíldy

Suite 5 0 (Affymetnx)

Анализ ОТ-ПЦР. Для подтверждения данных, полученных при анализе РНК гибридизацией проб на микрочипах ДНК были использованы методы ПЦР с использованием обратной транскрипции (ОТ) Для получения комплементарных ДНК

использовали Superscript™ II RNase H* Reverse Transcriptase (Invitrogen, Canada) no методике производителя. Полученную кДНК использовали для дальнейшего ПЦР-анализа. Анализ экспрессии генов 1L-6, IL-11, MMP8, ММР9, ММР10, TIMP-1 проводили параллельно с конститутативно экспрессирующимся геном GAPDH в качестве контроля. Продукты ПЦР анализировали, используя электрофорез в 1,5% агарозном геле. Результаты анализировали либо с помощью системы UVP™ Biolmaging System (Ultra Violet Products Ltd., United Kingdom), либо с применением программного обеспечения Rotor-Gene 3000™, Corbett Research, Australia.

Генотипирование мышей F? с помощью ПЦР. Геномную ДНК мышей F2 выделяли с использованием Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA), следуя методике производителя. Аллельные варианты микросателлитных последовательностей D3Mit215, D9Mit89 и D17Mit175, расположенных соответственно на 3, 9 и 17 хромосомах определялись методом ПЦР. Полученные ПЦР-продукты анализировали в 8% ПААГ (22,3:1).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Данные по генной экспрессии были обработаны с помощью программы SAM (Significance Analysis of Microarrays, Tusher et a/, 2000). Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли непарный критерий Стьюдента (t-тест), критерий Манн-Уитни (U-тест) и Крускаль-Уоллис тест. Полученные данные обсчитывали с помощью программы (nStat (USA). Статистически достоверными считали различия с р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучение влияния генотипов мышей F2 на различные фенотипические проявления туберкулезной инфекции.

1.1. Патология легочной ткани.

По степени развития туберкулезного процесса в легочной ткани среди мышей F2 были выделены 5 групп (Рис.1 А). Степень патологии оценивали по проценту легочной ткани, замещенной воспалительным инфильтратом, гранулемами, периваскулярными и перибронхиальными скоплениями лейкоцитов.

А

X

2 50%

х 60% X

е 50%

•л- 47,4% «

5 40%

0%

-j- 13,8%

-Х- 34,3%

12 3 4 5

п=7 п=5 п=5 п=4 п=3

d3mi215 I h a hh I I hhhlh II hah hhhh Ihl 09ш89 I hi ha ah I h I I h I h aa h I a hh ha a d17m17s hhh I It I h< а а Ь I h I a I h a hill lah

1 2 3 4 S

Рисунок 1. Распределение степени легочной патологии, вызванной туберкулезным процессом у мышей F2, по пяти группам (А) и зависимость степени патологии от генотипа (Б).

Характер распределения фенотипов ясно указывает на то, что структурные и функциональные изменения, происходящие в легком при туберкулезной инфекции, находятся под полигенным контролем. Однако на данной выборке мышей F2 нам не удалось показать корреляцию данного сложного фенотипа с определенным < генотипом по аллелям локусов D3Mit215, D9Mit89и D17Mit175(Рис. 1 Б).

1.2. Высеваемость микобактерий из органов инфицированных животных.

Гибридов F2(A/Sn х I/St) заражали внутритрахеально в дозе 103 КОЕ/мышь М. tuberculosis H37Rv и через четыре недели производили забор легких для высева микобактерий. Данные, представленные на рисунке 2, соответствуют непрерывному спектру в экспрессии фенотипа (разброс: от 3,6 х 106 до 2,4 х 109 КОЕ/легкое). Полигенный характер контроля данного фенотипа очевиден, однако прямой зависимости от генотипов локусов, расположенных на 3, 9 и 17 хромосомах, показать не удалось.

s

10.0

а 9.0 о

ш о

£ 8.0

Ш о

7.0

6.0

локус генотип

А Б В г

в в в в

8 8 8 8

о о о о о — о о

1 л о о о о о о о о о -О. •Д. 1

S о 8 О 8 в о о

Q 8 8 о О й

1 $ о о 8 8 § 8 о 8 о о

О » о о

о о о о

п=31

D3MU215 Ш а/а i/a п=10 п=6 п=15

D9MU89 i/i а/а i/a п=5 п=12 п=14

D17MU175

I/< а/а i/a п=7 п=7 п=17

Рисунок 2. Разброс данных по высеваемости микобактерий из легких гибридов F2 без учета генотипов (А), и в зависимости от аллелей локусов й3МИ215 (Б), 09Ш89(В) и 017МП175(Г).

1.3. Инфильтрация легких фагоцитами.

На модели l/St-A/Sn было показано, что у мышей чувствительной линии I/St (носитель аллелей /) на ранних сроках туберкулезной инфекции происходит активное накопление полиморфоядерных клеток (в основном нейтрофилов), которое коррелирует с неблагоприятным течением туберкулеза. Нейтрофилы - первые фагоциты, приходящие в очаг инфекции и пытающиеся ограничить распространение патогена за счет высвобождения активных соединений кислорода и протеолитических ферментов из гранул. Дегрануляция нейтрофилов направлена на уничтожение инфицирующего агента, однако ее побочным эффектом часто является разрушение окружающих клеток и серьезное повреждение ткани. Вследствие этого необходимо наличие жесткой регуляции притока нейтрофилов в инфицированную ткань для снижения возможных негативных последствий. Методом проточной цитофлуориметрии суспензии клеток легкого мышей F2 были проанализированы на содержание клеток Ly6G+ (нейтрофилов). При изучении влияния генотипов рассматриваемых локусов на накопление нейтрофилов в легком мышей F2 (Рис. 3). наблюдается большой разброс данных по этому фенотипу, который колеблется от 1% до 80%.

Оказалось, что выраженная инфильтрация клетками Ly6G* характерна для особей F2, несущих гомозиготный аллель i/i в локусе D3Mit215 (Рис. 5Б): среднее содержание нейтрофилов в инфильтрате составляет 23,5%, что заметно больше среднего числа Ly6G* клеток у мышей, несущих другие аллели (а/а - 3%, i/a - 5% от всех клеток легкого). При рассмотрении зависимости инфильтрации нейтрофилами от генотипа локуса D17Mit175, оказалось, что заметно больше нейтрофилов присутствует у мышей, несущих аллели ¿7 и i/a (в среднем 13,7% и 14%), тогда как среднее содержание нейтрофилов у мышей D17Mit17!?" составляет 3% (Рис. ЗВ).

80%

| 60% 9

5

Ô 40% и»

20%

0% локус генотип

О о о О

8 о о о о о о

О о о О 30,7%

О 23,5%— о о о

13,7%— — 14% 4-4%

н R § -£-з% в

п=34

D3MIt21S D17MU175 3MIt215&D17Mitl75

i/i i/a a/a i/i i/a a/a i/i&i/~ другой

n=12 n=15 n=7 n=9 n=16 n=9 n=9 n=25

Рисунок 3. Распределение накопления Ьу6С+ клеток в легких зараженных мышей F2 без учета генотипов локуса (А), и зависимость накопления нейтрофилов от аллелей локусов ОЗМН215 и 017МП175 (Б и В). Г. Сравнение степени инфильтрации нейтрофилами легочной ткани между мышами, несущими генотип О3МИ21, 017МП175 и всеми остальными мышами.

Эти данные позволяют предположить, что фенотип повышенной инфильтрации ткани легкого клетками Ly6G* связан с аллелем / в данных локусах. Наследование у мышей F2 происходит по рецессивному типу (i/i) для локуса D3Mit215, и по доминантному типу (i/i и i/a) для локуса D17Mit175. Это подтвердилось при сравнении данных по накоплению нейтрофилов в легких двух групп мышей. В одну были отнесены особи, несущие сочетание аллелей ОЗМЯ21^и D17MÍÍ17&1 или 017Ш17!^, в другую - всех остальные мыши. Почти 8-кратная разница в процентном содержании нейтрофилов между группами оказалась достоверной (р<0,05, Рис. ЗГ).

Протективные свойства макрофагов при туберкулезной инфекции хорошо известны, в связи с чем представляло интерес изучить вопрос о влиянии рассматриваемых локусов на развитие макрофагального воспаления. Результаты, характеризующие влияние генотипов локусов 3 и 9 хромосом на накопление -макрофагов в легком зараженных мышей представлены на рисунке 4. Нам удалось показать, что усиленная макрофагальная инфильтрация имеет место у мышей F2. несущих гетерозиготные аллели в локусах D3MH215 и 09Ш89 ((Рис. 4А., Б). Еще более нагляден результат сравнения группы мышей F2, характеризующейся наличием сочетания гетерозиготных аллелей i/a в локусах tbsl и tbs2, с мышами, несущими остальные генотипы по данным локусам (Рис. 4В). Этот результат особенно важен, если учесть, что гетерозиготы по этим двум локусам более резистентны к туберкулезной патологии по таким фенотипам как степень кахексии и средняя продолжительность жизни (Sanchez et al., 2003)

80%

60%

•

5 40%

ь

? •

ь. 20%

0%

оо оо оо

о о О

о о -О- 25°/( о о —27% 34%_ о 8

Л. 18%£. 17%В 0 о g -о- ° 4-18% Q -гг12*Т 1 8 О О j-17%

локус D3MH2J5 генотип i/< а/а i/а

п=11 п=7 п=16

D9MU89

i/t а/а i/а п=5 п-14 п=15 п=8

DiMit215&D9Mit89

i/а другой п=26

Рисунок 4. Влияние генотипов локусов О3М№15 и 09М1189 на степень инфильтрации легочной ткани мышей Р2 макрофагами, независимое (А и Б) и сочетанное (В).

1.4. Инфильтрация легких Т-клетками.

Инфильтрация легочной ткани различными клетками является характерной чертой туберкулезной патологии. Для исследования возможного влияния различных генотипов локусов, расположенных на 3, 9 и 17 хромосомах, на качественное и количественное разнообразие клеток воспаления, мы оценили локальный иммунный ответ в легких зараженных гибридов Р2.

Для оценки степени инфильтрации ткани легкого клетками воспаления при туберкулезном процессе у 40 гибридов F2 получали суспензии клеток легкого и окрашивали моноклональными антителами специфичными к поверхностным маркерам Т-лимфоцитов (CD4 и CD8), макрофагов ^4/80) и нейтрофилов (Ly-6G). Влияния генотипа по аллелям локусов 03МИ215, йЯМИБЯ и й17МИ175 на накопление Т-клеток в легком представлено на рисунках 5 и 6.

Рисунок 5. Содержание клеток CD4* в легких зараженных мышей F2 без учета данных генотипирования (А), и в зависимости от аллелей локусов й3МИ215 (Б), й9МП89 (В) и 017МП175 (Г).

Рисунок 6. Содержание клеток CD8* в легких зараженных мышей F2 без учета данных генотипирования (А), и в зависимости от аллелей локусов й3МИ215 (Б), й9МП89 (В) и й17МП175 (Г).

При внутритрахеальном заражении мышей F2 число клеток CD4* превышает число CD8*. Наблюдается широкая вариабельность в накоплении клеток CD4* (от 1% до 33%) и CD8* клеток (от 1% до 13%).

При рассмотрении распределения CD4- и СD8-положительных Т-клеток в зависимости от аллелей й3МИ215 (Рис. 5, 6Б), видна тенденция к увеличенному накоплению этих клеток при наличии у мышей Р2 гомозиготного аплеля 1Ьв1, унаследованного от резистентной родительской линии (23% и 9% от всей клеточной популяции легкого, соответственно). Аллели остальных двух локусов слабо влияют на инфильтрацию легких Т-клетками (Рис. 5,6 В, Г).

Из полученных результатов видно, что накопление Т-клеток в легких при туберкулезной инфекции также имеет полигенный характер. Тот факт, что степень Т-клеточной инфильтрации у носителей генотипа не достигла достоверных

различий с мышами других генотипов, возможно, объясняется недостаточностью объема выборки, а также влиянием других локусов, не изученных в данной работе.

1.5. Влияние генотипов локусов Лв1 -й3МП215,№в2-й9М№9и й17М'Л175 на функциональную активность легочных макрофагов мышей F2.

Анализ активности макрофагов был продолжен изучением антимикобактериальной активности интерстициальных макрофагов легкого гибридов F2 в зависимости от их генотипов по трем изучаемым локусам, которую оценивали по уровню включения внутриклеточными микобактериями [3Н]-урацила. Результаты приведены на рисунке 7.

Рисунок 7. Уровень подавления роста микобактерий легочными макрофагами мышей F2 в зависимости от аллелей локуса D3Mit215. Сравнение антимикобактериальной активности группы легочных макрофагов с гомозиготным аллелем (i/i или а/а) в локусе D3Mit215 с группой макрофагов, несущих гетерозиготу i/a по данному локусу (р<0,05).

Достоверно меньшая способность подавлять рост микобактерий показана для легочных макрофагов, несущих гомозиготный аллель i/i или а/а в локусе tbs1 (хромосома 3). В среднем уровень подавления составил 46% у гомозигот и 67% у гетерозигот (р<0,05). Таким образом, гетерозиготность по аллелю локуса tbs1 действительно обеспечивает повышенную способность макрофагов подавлять рост микобактерий

2. Экспрессия генов в тканевых легочных макрофагах при заражении М. tuberculosis H37Rv in vitro: сравнительный анализ чувствительной и резистентной линий мышей.

Технология микрочипов ДНК, получившая широкое распространение за последние годы, позволяет следить за изменениями в экспрессии десятков тысяч генов одновременно, что дает возможность изучать глобальные изменения, происходящие в клетках и тканях, в ответ на различные воздействия.

В данной работе мы впервые рассмотрели изменение генной экспрессии, происходящей в макрофагах, выделенных из легочной ткани оппозитных по чувствительности к туберкулезной инфекции мышей ли ний I/St и A/Sn.

2.1. Анализ изменения генной экспрессии в тканевых легочных макрофагах мышей I/St и A/Sn после заражения in vitro Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Легочные макрофаги одними из первых вступают в контакт с попавшими в легкие микобактериями. Для изучения возможного влияния М. tuberculosis на генно-экспрессионный профиль этих клеток мы сравнили уровни экспрессии генов в интактных и зараженных легочных макрофагах. Для этого были приготовлены биотинилированные пробы кРНК из тотальной РНК, выделенной из легочных макрофагов мышей I/St и A/Sn, которые перед этим инкубировались в течение 24 часов в отсутствие микобактерий (контрольные), либо в присутствие М. tuberculosis H37Rv в соотношении микобактерия: макрофаг 5:1 (зараженные). Пробы кРНК затем гибридизовали с четырьмя индивидуальными микрочипами ДНК для мышиного генома U74Av2, позволяющими анализировать экспрессию 12000 генов и экспрессируемых последовательностей. Всего было проведено три повтора опыта.

Результаты сравнительного анализа экспрессии генов макрофагов обеих линий до и после инфекции представлены в таблице 1. Вывод о том, что данный ген,

достоверно изменяет экспрессию в результате инфекции, должен удовлетворять нескольким условиям. Во-первых, уровень экспрессии (интенсивность свечения на микрочипе) должен превышать 200; во-вторых, изменение экспрессии после инфекции должно быть не менее чем 2-кратным. Как видно, в нашей модели происходит изменение экспрессии лишь единичных генов, что облегчает анализ и постановку дальнейших экспериментов. Тем не менее, эти гены относятся к самым разным классам и кодируют белки воспаления, факторы иммунного ответа, белки нормального клеточного цикла и пролиферации, а также белки внеклеточного матрикса, участвующие во взаимодействии с другими клетками. Интересно, что инфекция в нашей модели вызывала не более чем трехкратное изменение в уровне экспрессии (Таблица 1).

2.2. Межлинейные отличия в генной экспрессии контрольных и инфицированных легочных макрофагов I/St и A/Sn.

Установление межлинейных, отличий в экспрессии генов в интактных и зараженных макрофагах позволяет сравнить относительное влияние инфекции и собственно генетических различий на уровень иммунного ответа, давая возможность подойти к. вопросу о причинно-следственных связях между биохимическими реакциями, наблюдаемыми при инфекции.

В таблице 2 представлены результаты анализа данных по экспрессии генов в интактных и зараженных макрофагах I/St и A/Sn.

Важно отметить, что различия по экспрессии генов между макрофагами двух линий мышей намного сильнее, чем между интактными и зараженными макрофагами в пределах одной линии. Большинство генов, более активно экспрессирующихся в макрофагах чувствительных мышей I/St, кодируют белки воспаления и перестройки внеклеточного матрикса, что убедительно объясняет более сильную степень воспаления в легких этих мышей.

Таблица 1. Список генов, изменивших экспрессию в легочных макрофагах I/St и A/Sn в ответ на инфекцию М. tuberculosis H37Rv.

Символ гена Ai/Ac* Ii/Ic* Название гена/белка

Воспаление, цитокины, хемокины и иммунпый ответ

IL-11 1,7 2,1 IL-11

Я-17 1,6 2,0 IL-17

lanl 1,6 2.0 Immune associated nucleotide 1

Ifi204 -1,9 -2,0 Interferon activated gene 204

Isg20 -1,2 -2,2 Interferon-stimulated protein

Внеклеточный матрнкс

MMP10 2,4 1,9

MMP9 1,5 2,3

Ereg 1,5 2,0

TIMP-1 1,2 2,0

Matrix metallopreteinase 10 Matrix metallopreteinase 9 Epiregulin (Epidermal growth factor) Tissue inhibitor of metalloproteinases-l

Клеточный цикл и пролиферация

Ctgf Sljh3 Slfti4

2,1 2,8 Connective tissue growth factor -1,7 -2,0 Schlafen 3 -1,5 -2,1 Schlafen 4

Клеточная мембрана Cdh5 2,5 1,4

Sftpc 2,0 -1,1

Cadherin 5

Surfactant associated protein С

Модификация белков Siatl 1.1

-2,0 Sialyltransferse 1

В таблице приводятся средние значения, полученные при анале результатов трех экспериментов.

Значимыми считались изменения > 2 и < -2 раз, отмечены жирным шрифтом

* Разница в экспресии генов в макрофагах мышей одной линии после инфицирования

Гены с коэффициентом >2 экспрессируются активнее в зараженных

макрофагах, а <-2 - слабее.

1с- контрольные макрофаги I/St

Ai - инфицированные макрофаги A/Sn

Таблица 2. Различия в экспрессии генов между легочными макрофагами « I/St и A/Sn до и после заражения М. tuberculosis H37Rv

Символ гена Ic/Ac" Ii/Aî** Название гена/белка

Воспаление, цитокины, хемокины и иммунный ответ

IL-11 14,5 15,2 IL-U

Схс113 10,6 5,4 Chemokine (C-X-C motiO ligand 13

Схс114 5,3 6a Chemokine (C-X-C motif) ligand 14 (MIP-2y)

Ifl205 3,6 4,7 Interferon activated gene 205

CctS 2,5 1,6 Chemokine (C-C motif) receptor 5

Csfî 2,3 1,5 Colony stimulation factor (GM)

IL-6 га 2,0 IL-6

IL12rb 2,0 2,0 IL-12 receptor beta

Celli 2,0 2,0 Chemokine (C-C motif) ligand 1

Tnfrsß 1,1 2,1 TNF receptor superfamily member 9

IL-17 -2,0 -1,6 IL-17

CxcllO -2,1 -2,1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (IP-10)

TNF -2,6 -1,7 TNF

Isg20 -1,5 -2,8- Interferon-stimulated protein

IL7r -3,2 -2,9 IL-7 receptor

Ianl -3,8 -3,4 Immune associated nucleotide 1

¡sgl 5 47 -7a Interferon-stimulated protein

Внеклеточный матрикс

ММР10 Ereg Lurn ADAM8 TIMP-1

ММР8

2,9 2 a Matrix metallopreteinase 10

2,0 2,9 Epiregulin (Epidermal growth factor)

2,4 2,3 Lumican

2 a 2,3 A disentegrin and metalloproteinase domain 8

u 2 a Tissue inhibitor of metalloproteinases-l

-2,9 -2,8 Matrix metallopreteinase 8

Клеточный цикл и пролиферация

Gas5 6,5 7,2 Growth arrest specific

Система комплемента Clqa Clqb Clqg Pfc

C2

3,0 1,9 Complement component Iq

2,6 1,9 Complement component lq

2,8 2,3 Complement component lq

2,6 1,7 Properdin factor complement

-3,0 -2,7 Complement component 2

Таблица 2. (Продолжение)

Символ гена Ic/Ac** Ii/Ai** Название гена/белка Белки острой фазы

Fsl 63 7,6 Follistatin

Scrum ameloid 3

SAA3 2,7 2,8

Передача сигнала

Eat2 4,9 33

2fp97 -2,6 -1,5

Белки стресса

du 3,0 1,6

Cldn4 2,8 2,7

Hspala 2,2 1,5

CldnS 1,1 -2,1

Модификация белков

Ctse 8,6 4,9

Siatl 3,1 1,6

EWS/FLU activated transcript 2 Zink finger protein 97

Clusterin Claudin 4 Heat shock protein

Claudin 5

Cathepsin E Sialyltransferse 1

Ctsk

-1,8

-2,1 Cathepsin К

Клеточная мембрана

Tool H2-T24 Sftpc

Marco H2-T23 H2-D1 Mag

3,9 43 Tumor-associated antigen 1

2,4 3.2 Histocompatibility 2T region

1,0 Surfactant associated protein C

-23 -23 Macrophage receptor with collagenous structure

-2,6 -3,2 Histocompatibility 2T region

-3,5 -3,8 Histocompatibility 2D region

-за -43 Myel in-associated glycoprotein

Транспорт

Cp Apoe Lcn2 HFE

Hebp-1 Tap2

за 2,1 Ceruloplasmin

2,6 2,1 Apolipoprotein

2,2 2,2 Lipocalin 2

2,0 1,3 Hereditary hemochromatosis protein

-23 -2,0 Heme binding protein-1

-6.1 -4,6 Transporter 2 ATP-binding cassette

2.3. Подтверждение результатов анализа экспрессии генов с помощью различных методов ОТ-ПЦР.

Анализ высокоплотностных олигонуклеотидных микрочипов является очень чувствительным и аккуратным методом, однако особо значимые результаты гибридизаций на микрочипах принято подтверждать другими методами Мы воспользовались различными методами ОТ-ПЦР

В качестве внутреннего контроля были использованы гены глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) и гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы (HPRT) со строго конститутивной экспрессией Как показано на рисунке 8, при одинаковой экспрессии гена GAPDH во всех пробах все шесть проанализированных генов продемонстрировали межлинейные и постинфекционные изменения в экспрессии, в полном соответствии с данными по гибридизации на микрочипах (Таблица 1 и 2)

Рисунок 8 Межлинейные различия в экспрессии различных генов в интактных и зараженных in vitro макрофагах I/St и A/Sn через 24 часа после начала культивирования В качестве внутреннего контроля была использована мРНК гена GAPDH На рисунке представлены фотографии продуктов ПЦР в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием Ас - интактные макрофаги A/Sn, h -инфицированные макрофаги I/St

Для получения более точных результатов был использован метод количественный ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), позволяющий исследовать динамику накопления высокоспецифичных продуктов ПЦР.

Конечные результаты, полученные нами с использованием методов TaqMan® и SYBR Green®, и их соответствие с результатами микрочипов представлены в таблице 3. Как видно, использование количественных методов ОТ-ПЦР является хорошим способом подтверждения результатов, полученных с применением технологии ДНК микрочипов

2.4. Продукция IL-11 тканевыми легочными макрофагами.

Из представленных выше результатов видно, что самые большие межлинейные различия в уровне экспрессии характерны для IL-11 (Таблица 2), который в 15 раз более активно экспрессируется в макрофагах мышей I/St. Кроме того, его экспрессия увеличивается при инкубации легочных макрофагов с Mycobacterium tuberculosis (Таблица 1). Этот цитокин относится к числу регуляторных, но его функции во многом не ясны Более того, разные авторы относят его к про- (Doucet et al., 1998) и противовоспалительным (Trepicchio et a/, 1996,1999; Opal et al., 1999)

Нас особенно заинтересовали данные об экспрессии IL-11 в легочных макрофагах, так как ранее продуцентами данного цитокина считались легочные фибробласты, эпителиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры дыхательных путей (Einarsson et а/., 1996; Elias et al, 1994а, b, 1997; Zhu ef a/, 2001). Для проверки данных полученных с помощью микрочипов ДНК мы сравнили уровни экспрессии IL-11 в легочных макрофагах и фибробластах, используя метод ОТ-ПЦР. На рисунке 9 представлены фотографии агарозных гелей с продуктами ПЦР, полученными в последовательных циклах реакции амплификации участков генов IL-11 и HPRT. Экспрессия IL-11 в легочных макрофагах (Рис.9А) заметно выше, чем в легочных фибробластах (Рис.9Б). Кроме того, в отличие от макрофагов, в фибробластах не проявляется межлинейные различия в экспрессии.

Таблица 3. Сравнение данных по изменению экспрессии генов в интактных и зараженных макрофагах, полученных методами ОТ-ПЦР (TaqMan и SYBR Green) и с помощью микрочипов ДНК.

TaqMan

SYBR Green

микрочипы

* - Измепение в экспресии генов в макрофагах одной линии мышей после инфекции **- Межлинейные различия в экспресии генов в интактных и зараженных макрофагах. В таблице приведены средние значения, полученные в четырех повторах TaqMan-анализа, двух повторах SYBR Gieen-анализа и трех гибридизаций с микрочипами Aflymetrix. Ai - инфицированные макрофаги A/Sn Ic - контрольные макрофаги I/St

Рисунок 9. А. Существенные межлинейные отличия в продукции мРНК для IL-11 легочными макрофагами (I - I/St, A-A/Sn). Б. Низкая экспрессия IL-11 легочными фибробластами, при отсутствии межлинейных различий (I - I/St, A - A/Sn). K+ -положительный контроль.

Возможно, степень патологии в легких при туберкулезной инфекции у мышей (Рис 1) также зависит от уровня экспрессии IL-11 в легочной ткани. Ранее было показано (Nikonenko et а/., 2000; Eruslanov et a/., 2004a), что при заражении мышей М. tuberculosis уровень патологических изменений в легких чувствительных линии I/St заметно больше, чем у резистентных мышей A/Sn. Эти данные могут объясняться усиленной продукцией IL-11 и IL-6 легочными макрофагами мышей I/St.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена зависимость степени инфильтрации легких нейтрофилами при туберкулезе у мышей от аллельного состава локусов fbs1-D3Mit215 (Хромосома 3) и D17Mit175 (Хромосома 17), участвующих в контроле тяжести течения заболевания.

2. Установлено, что антимикобактериальная активность макрофагов мышей зависит от генотипа локуса tbs1-D3Mit215, при этом преимущество имеют животные, гетерозиготные по данному локусу.

3. Показано, что многие параметры патологического процесса и инфильтрации легких клетками иммунной системы при туберкулезе находятся под полигенным контролем, но зависят от пока не локализованных генов.

4. При заражении in vitro легочных макрофагов мышей I/St увеличивается экспрессия всего семи и

уменьшается всего пяти генов {Slf 3, 4, ifi204, Siati, lsg20), у мышей A/Sn усиливается экспрессия всего четырех генов (Sftpc, Cdh5, МтрЮ, Ctgf).

5. Показано, что легочные макрофаги мышей чувствительной линии I/St более активно экспрессируют 35 генов и менее активно - 18 при сравнении с макрофагами резистентной линии A/Sn. В число этих генов преимущественно входят гены цитокинов, хемокинов, белков иммунного ответа и внеклеточного матрикса.

6. Впервые установлено, что цитокин IL-11 экспрессируется в легочных макрофагах. Межлинейные различия в продукции мРНК данного гена достигают 15-кратного уровня. В сочетании с 3-кратными различиями в экспрессии IL-6, относящегося к тому же семейству цитокинов воспаления, это может объяснить существенные различия между мышами двух линий по чувствительности и тяжести легочной патологии.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Orb/a M.O., Majorov K.B., Mschenko V.V., Eruslancv ЕВ., Lyedo/a IV. Tissue and cell pathology in the lungs of mice genetically susceptible and resistant to tubercuCus challenge. Sixth John Humphrey Advanced Summer Rogramme and Lecture Series n Immunology Rushchino, Russia, September2002, p.92-93.

2. Radaeva T.V., Nikonenko B.V., Lyado/a I.V. Eruslanov EB., Majoov K.B., Kondratieva Т.К., Orlova M.O., Apt A.S. Multigenic control of Micobacterium tuberculosis infection in mice and fenotypes expressed jn lung and extra-pulmonary macrophages. Annual meeting of HHMI Intemation Research Scholar, Australia, June 2002. e. 78

3. Majorov K.B., Lyadova I.V., Kondratieva Т.К., Eruslanov E.B., Rubakova E.I., Orlova M.O., Mischenko V.V., Apt A.S. Different innate ability of I/St and A/Sn mice to combat virulent Mycobacterium tuberculosis: phenotypes expressed in lung and extrapulmonary macrophages. Inf. Immun. 2003,71, p. 697-707

4. Orlova M.O., Schurr E., Lyadova I.V., Majorov K.B., Eruslanov E.B., Apt A.S. Gene expression in the lungs following ТВ challenge: comparative analysis in susceptible and resistant mouse strains. First Russian-German Symposium on Tuberculosis, St Petersburg, June 2003, p. 476-477.

5. Апт А.С., Радаева Т.В, Никоненко Б.В., Лядова И.В., Ерусланов Е.Б., Орлова М.О., Майоров К.Б., Кондратьева Т.К. Генетический контроль восприимчивости к туберкулезу и его иммунологические аспекты. Первый Российско-Германский Симпозиум по туберкулезу. Санкт-Петербург, июнь 2003, стр. 466.

6. Радаева Т.В., Орлова М.О., Ерусланов Е.Б., Лядова И.В., Никоненко Б.В., Майоров К.Б., Кондратьева Т.К., Апт А.С. Полигенный контроль восприимчивости' к туберкулезу у мышей: сравнительный анализ ответа и экспрессии генов в легких. Российско-Германский симпозиум «Биотехнология туберкулеза», ноябрь 2003, Москва. с. Z&&-ZB9

7. Eruslanov E.B., Majorov K.B., Orlova M.O., Mischenko V.V., Kondratieva Т.К., Apt A.S. and Lyadova I.V. Lung sell responses to M. tuberculosis in genetically susceptible and resistant mice following intratracheal challenge. Clin. Exp. Immunol 2004,135, p. 19-28.

8. Radaeva T.V., Orlova M.O., Schurr E., Eruslanov E.B., Lyadova I.V., Majorov K.B., Kondratieva Т.К., Apt A.S. Immunogenetic and gene expression analysis of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Annual meeting of HHMI Internation Research Scholar, Estonia, June 2004. с ©6

ООП МГУ. Заказ 82-100-04

4 1.1. Актуальность проблемы.

Заболевание туберкулезом остается одной из основных причин смертности, и количество новых случаев заболевания насчитывает миллионы ежегодно. По данным Всемирной Организации Здравоохранения за последние годы отмечается рост числа случаев инфицирования Mycobacterium tuberculosis, которому способствует появление новых лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий и распространение иммунодефицитных заболеваний (Leinhardt, 2001; WHO report 2002). Хотя инфицированность мировой популяции достигает одной трети всего населения Земного шара, лишь у небольшой части развивается клинический туберкулез. Такое разнообразие в чувствительности определяется многими факторами, в том числе и генетическими (Comstock, 1978; Stead et al., 1990; McLeod ^ et al., 1995). До настоящего времени остаются во многом невыясненными генетические и иммунологические механизмы, лежащие в основе резистентности и чувствительности организма-хозяина к туберкулезу. Поэтому весьма многообещающими подходами являются выявление, картирование и последующее клонирование генов, определяющих уровень чувствительности к инфекции, а также определение уровня экспрессии генов в клетках, органах и тканях (например, в макрофагах легкого при туберкулезной инфекции). Изучение генетических закономерностей контроля инфекции очень осложняется гетерогенностью популяции человека. Поэтому широко используются модели на животных и клеточных культурах in vitro, позволяющие упростить систему и уменьшить влияние факторов окружающей среды и клеточного многообразия.

Использование инбредных линий мышей для обнаружения генов, участвующих в контроле чувствительности к микобактериям, позволило картировать и клонировать ген Nrampl (Vidal et al., 1995; Skamene et al., 1998), картировать ген sst-I (Kramnik et al., 2000), а также локусы Tlr-1, 2, 3, 4 контролирующие резистентность к туберкулезу при заражении мышей вирулентным штаммом M.tuberculosis H37Rv (Mitsos et al., 2000, 2003). В лаборатории иммуногенетики ЦНИИ Туберкулеза РАМН была исследована чувствительность к летальной туберкулезной инфекции мышей более 30 линий. Среди них были обнаружены сверхчувствительная к туберкулезу линия I/St, чувствительные линии B10.SM, С57В1/6 и ряд резистентных линий - A/Sn, СВА, AKR (Nikonenko et al., 1985, 2000). Недавно на мышах линии I/St было показано сцепление скорости гибели и потери веса у зараженных животных с локусами tbsl-D3Mit215, tbs2-D9Mit89 и D17Mitl 75, расположенными в 3, 9 и 17 хромосомах, соответственно (Lavebratt et al., 1999, ц, Sanchez et al., 2003). Предполагается, что данные локусы являются одними из основных генетических факторов, определяющих течение туберкулезной инфекции в нашей модели (Nikonenko et al., 2000).

Хотя иммуногенетика экспериментального туберкулеза исследована сравнительно подробно (McLeod et al., 1995, Авербах М.М. и соавт., 1985), генетический контроль эффекторных функций макрофагов, от которых во многом зависит проявление фенотипов резистентности и чувствительности, остается мало изученным, хотя ведущая роль этих клеток в защите от туберкулеза хорошо известна (Orme et al., 1993, Kaufmann, 2000).Применение технологии олигонуклеотидных микрочипов ДНК создает широкие возможности для исследования генно-экспрессионных профилей макрофагов, участвующих в локальном иммунном ответе на туберкулезную инфекцию (Ragno et al., 2001; Spira et al., 2003).

Сравнительный анализ противоинфекционного иммунитета и генной экспрессии специфических клеток у организмов с различной генетически-детерминированной чувствительностью к возбудителю заболевания являются одним из перспективных направлений в иммунологии инфекций, поскольку позволяет выявить физиологически значимые механизмы противоинфекционной резистентности. Принимая во внимание то, что макрофаги легких являются основными клетками, ответственными за непосредственное уничтожение и элиминацию туберкулезных бактерий из организма, представлялось актуальным провести иммунологический анализ системы мононуклеарных фагоцитов легкого у мышей с разной устойчивостью к экспериментальному туберкулезу.

1.2. Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение иммунного ответа и экспрессии генов в макрофагах легких у мышей, отличающихся по генетическим характеристикам, для установления связи между генотипом и фенотипическими проявлениями туберкулезной патологии.

1.3. Задачи исследования

1. Определить индивидуальные генотипы по микросателлитным маркерам 3, 9 и 17 хромосом у животных F2 (A/Sn х I/St). В дальнейших исследованиях сопоставить параметры туберкулезного ответа с присутствием конкретных генотипов во всех трех локусах.

2. Определить антимикобактериальную активность и устойчивость к цитопатогенному действию микобактерий легочных макрофагов, индивидуально выделенных от инфицированных животных F2.

3. Оценить способность мышей F2 контролировать размножение микобактерий в органах в зависимости от генотипа.

4* 4. Оценить клеточный состав инфильтратов легкого у зараженных мышей F2 по экспрессии клеточных маркеров (макрофаги - F4/80, нейтрофилы- Ly-6G, Т клетки - CD4, CD8).

5. Сравнить патоморфологию легких при туберкулезной инфекции у мышей родительских линий I/St и A/Sn и их гибридов F2, несущих разное сочетание аллелей генов, влияющих на резистентность.

6. Оценить межлинейные и постинфекционные различия по экспрессии генов в легочных макрофагах мышей линий I/St и A/Sn методом РНК-гибридизации на микрочипах ДНК.

1.4. Научная новизна gt ■ Впервые была рассмотрена зависимость инфильтрации легких клетками различных типов от аллелей локусов 3, 9 и 17 хромосом. Установлено, что мощная инфильтрация полиморфоядерными лейкоцитами легких мышей зависит от сочетания рецессивного аллеля / в локусе tbsl (.D3MU215) и доминантного аллеля i в локусе D17MU175, унаследованных от чувствительных мышей I/St.

Установлено, что антимикобактериальная активность макрофагов мышей F2 зависит от генотипа локуса tbsl; преимущество имеют животные F2 с гетерозиготным аллелем по данному локусу.

Показано, что интегральная картина патологического процесса и размножение микобактерий в легких мышей F2 контролируется полигенно,

-Г но прямая связь с генотипами локусов tbsl, tbs2 и D17MU175 не прослеживается.

Впервые исследованы межлинейные различия и изменения генной экспрессии в легочных макрофагах чувствительной и резистентной линий мышей. Показано, что макрофаги чувствительной линии I/St функционально более активны по 35 генам и менее активны по 18 (из 12000 исследованных генов) при сравнении с клетками резистентной линии A/Sn. При инфицировании макрофагов in vitro межлинейные различия по генной экспрессии увеличиваются, но инфекция регулирует экспрессию генов слабее, чем собственно генотип хозяина.

Впервые продемонстрировано, что легочные макрофаги экспрессируют провоспалительный цитокин IL-11. При этом экспрессия гена IL-11 в 15 раз выше в макрофагах чувствительных мышей I/St. В сочетании с 3-кратной разницей в экспрессии IL-6 это может быть причиной неблагоприятного развития патологии при инфекции.

1.5. Практическая значимость

Полученные в работе данные позволили определить, какие именно механизмы противотуберкулезного ответа, зависят от генотипов ранее установленных локусов. Кроме того, анализ результатов генной экспрессии в легочных макрофагах позволил выявить новые, ранее не исследованные гены, влияющие на развитие туберкулезной патологии.

Изучение работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяет выделить иммунологические реакции и контролирующие их гены, которые в совокупности определяют высокую индивидуальную чувствительность и неблагоприятное течение туберкулезной инфекции. Высокая гомология геномов мыши и человека позволяет рассчитывать, 'Ф что наши исследования могут лечь в основу поиска генов, участвующих в контроле туберкулеза у человека. В дальнейшем такие данные могут лечь в основу выявления групп высокого риска заболеваемости туберкулезом. Ь

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Введение

По итогам статистических исследований, проведенных Всемирной Организацией Здравоохранения за последнее десятилетие, стало очевидно, что распространение инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis, продолжает неуклонно наращивать темпы (Dye et al, 1999). Каждый год регистрируется более 8 миллионов новых случаев и приблизительно 2 миллиона смертей от туберкулеза. Однако лишь у немногих людей, из числа первично инфицированных микобактериями - а это около 2 миллиардов или 1/3 населения планеты - развивается активный туберкулез. Существует много факторов, определяющих характер развития болезни: вирулентность микобактерий (Young & Duncan, 1995), внешние факторы (природные и социальные; Bloom, 1994; Rom & Garay, 1996; the WHO report 2002) и внутренние факторы (генетика хозяина, сопутствующий иммунодефицит, Lienhardt,

2001). За последние годы было проведено множество исследований по выявлению генетических факторов в восприимчивости к туберкулезу у людей, влияющих на чувствительность к возбудителю и скорость развития болезни (Casanova & Abel,

2002). Данные, указывающие на важность генетической составляющей при развитии заболевания, подтверждаются результатами многочисленных исследований по влиянию пола на восприимчивость к инфекции (Hinman et al., 1976, Rieder et al., 1991), принадлежности к различным расовым и этническим группам (Stead et al., 1990, Lander & Schork, 1994, Pospelov et al, 1996), типу наследования восприимчивости и резистентности к туберкулезу в семьях с множественными случаями заболевания (Stead et al., 1992; Casanova & Abel, 2002). С момента открытия микобактерий Кохом исследователи в основном интересовались жизнедеятельностью патогена и физиологическими, биохимическими, иммунологическими аспектами ответа организма-хозяина, уделяя недостаточно внимания его генетическим характеристикам. Сейчас уже очевидно, что влияние генетических факторов макроорганизма на чувствительность к инфекции, патогенез и механизмы патологического процесса крайне важно и разнообразно (Апт А.С., 2001). Убедительным подтверждением того, что гены хозяина имеют сильное влияние на развитие микобактериальной инфекции, являются результаты исследований, проведенных на изолированных популяциях, не имеющих до этого контакта с данной инфекцией (Motulsky, 1960, Sousa et al., 1997). Данные о 173 детях из 249, выживших после случайного заражения большой дозой живых вирулентных M.tuberculosis в 1926 году в городе Любеке, также демонстрируют генетическую неоднородность популяции в отношении к туберкулезу (Dubos & Dubos, 1952). И, наконец, работы, демонстрирующие повышенную конкордантность возникновения клинически выраженного туберкулеза у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными (Kallmann & Reisner, 1942; Simonds, 1963; Comstock, 1978) являются прямым доказательством влияния генетических факторов на восприимчивость.

Необычайный темп развития технологий за последние 20 лет позволил сильно продвинуть генетические исследования в области картирования, идентификации и клонирования генов резистентности хозяина. Появилась возможность находить и сравнивать высококонсервативные гены, принимающие участие в контроле защиты от инфекций среди таких разных таксономических групп как растения, насекомые и позвоночные (Staskawicz et al., 2001, Poipre et al., 2000, Lee et al., 2001). Тем не менее, генетический контроль иммунитета к инфекционным агентам остается недостаточно изученным из-за сложной природы многоступенчатых взаимодействий хозяина и патогена, который и определяет дальнейшее развитие инфекции.

Генетические исследования в очень разнородной человеческой популяции сильно затруднены, так как большинство генетических вариаций, лежащих в основе различий в чувствительности/резистентности к патогенным инфекциям, контролируются группой генов и следуют сложной схеме наследования (Lander & Schork, 1994). Поиск отдельных генов, контролирующих развитие инфекции, в настоящее время может быть проведен (в принципе) путем сканирования всего генома человека, изучения характера сцепления в больших семьях, анализа распределения аллелей у инфицированных и здоровых детей одних родителей, или путем анализа ассоциации группы аллелей с повышенной заболеваемостью в этнически однородных популяциях (Lander & Schork, 1994, Pospelov et al, 1996). Такие подходы могут предоставить свидетельства о сцеплении маркерных генов (чаще - это микросателлитные полиморфные последовательности) с участком хромосомы, предположительно отвечающим за чувствительность к инфекции. Последующее точное генетическое и физическое картирование необходимо для сужения хромосомного интервала, способствующее идентификации гена путем позиционного клонирования или выбора гена-кандидата. Однако основным лимитирующим фактором при таком изучении генома является недостаток многодетных семей с четким расщеплением по чувствительности к инфекции. На практике высокий уровень гетерозиготности в популяциях человека и невозможность собрать достаточное количество данных в семейном анализе, не позволяют провести многоуровневый генетический анализ (Jing et al., 1993). Это заставило исследователей обратиться к моделированию инфекционного процесса на животных.

Безусловно, моделируя микобактериальную инфекцию на мышах, исследователи сталкиваются с некоторыми ограничениями (Casanova & Abel, 2002,

2004). Например, те виды микобактерий, которыми обычно инфицируют мышей в экспериментах (М tuberculosis, М. bovis BCG, М. avium), не являются природными мышиными патогенами, в отличие от М. microti. К тому же, часто используемые пути заражения (такие как внутривенное, внутритрахеальное введение бактерий мышам), значительно отличается от естественного, воздушно-капельного пути инфицирования. Кроме того, не все виды микобактерий могут быть культивированы и исследованы в лабораторных условиях. Так М. leprae размножается исключительно в клетках человека и броненосца, поэтому все генетические исследования чувствительности к данному патогену могут быть проведены только с помощью семейного анализа (Mira et al, 2003, 2004). Лабораторные мыши формируют ограниченную группу инбредных линий, которые, чаще всего, менее резистентны, чем аутбредные дикие мыши. Человеческая популяция, наоборот, многочисленна и разнообразна, для нее большинство микобактериальных инфекций являются естественными, а вакцинация авирулентным штаммом М. bovis BCG выступает в роли «экспериментального» контроля.

Тем не менее, наиболее успешные исследования по генетике резистентности к микобактериям были проведены именно на мышах, поэтому в данном обзоре будут рассмотрены различные генетические подходы, использующиеся на мышиной модели, которые дали обширные знания в области иммунологического контроля над инфекциями.

2.2. Инбредные и искусственно генетически измененные мыши

Лабораторные мыши являются одними из самых распространенных экспериментальных модельных систем, используемых при изучении генетического контроля инфекционных заболеваний человека (Lengeling et al., 2001, Nikonenko &

Hanrahan, 2002, Kramnik & Boyartchuk, 2002, Boyartchuk & Dietrich, 2002, Gros & Schurr, 2002, Rogner & Avner, 2003, Lam-Yuk-Tseung & Gros, 2003). Для изучения полигенных комплексов, влияющих на проявление фенотипа чувствительности/резистентности к инфекционным заболеваниям, в настоящий момент широко используются различные конгенные, рекомбинантные инбредные (Dietrich et al, 1995), рекомбинантные конгенные линии мышей (Fortin et al., 2001, 2002), а также инбредные мыши, полученные на основе пойманных в природе дикий особей (Sebastiani et al., 1998,2000)

Еще в ЗОх годах ХХ-го века работы на мышах показали, что можно разделить инбредные линии в зависимости от их чувствительности или резистентности к различным патогенам. Вскоре было продемонстрировано не только то, что феномен чувствительности и резистентности может иметь генетическую основу, но и то, что наследование отличий по резистентности среди инбредных линий является полигенным (Griineberg, 1952, Lynch et al., 1965). С тех пор популярность мыши в качестве модельного вида для исследования инфекционных заболеваний человека только росла. В настоящий момент доступны многочисленные (>1500) инбредные линии. Часто используются генетические манипуляции, как например создание трансгенных животных и животных с «нокаут»-мутациями. Доступность химического и сайтового мутагенеза сделала мышей привлекательной экспериментальной моделью для нахождения локусов, отвечающих за резистентность хозяина. Существенный прорыв в технологии генетического картирования за последние годы значительно продвинул возможность клонировать и характеризовать гены устойчивости хозяина (Wells & Brown, 2000, Hirschhorn et al., 2000, Lindblad-Toh et al., 2000). Высокая гомология геномов мыши и человека (85%) позволяет использовать данные, полученные при генетических исследованиях инфицированных мышей, для выявления хромосомных участков и генов-кандидитов человека, вовлеченных в проявление чувствительного фенотипа к инфекциям (SkameneE. et al., 1998).

Стратегия «межвидовой генетики» обеспечивает два важных преимущества по сравнению с обнаружением генов у людей. Во-первых, использование мышей в качестве модели позволяет исследователю делать информативные скрещивания в прямой направленной форме, тогда как непосредственный анализ характера сцепления у людей возможен исключительно в обратном, ретроспективном варианте. Во-вторых, возможность выбора правильных экспериментальных условий (соответствующая вирулентность патогена, доза и путь инфицирования, выбор исследуемого фенотипа) позволяют поэтапно изучить процесс развития инфекции и обнаружить индивидуальные гены, которые вносят вклад в сложный фенотип патологического процесса (Skamene Е. et al., 1998; Nikonenko & Hanrahan, 2002). Такой путь по выявлению единичных генов практически невозможен при исследовании людей из-за одновременного взаимодействия многих генов и влияния гетерозиготности по многим локусах.

На данный момент существует несколько подходов к изучению человеческих инфекционных заболеваний на мышах. Наиболее подробно рассмотрены самые распространенные из них:

5. ВЫВОДЫ

1. Выявлена зависимость степени инфильтрации легких нейтрофилами при туберкулезе у мышей от аллельного состава локусов tbsl-D3Mit215 (Хромосома 3) и D17MU175 Щ

Хромосома 17), участвующих в контроле тяжести течения заболевания.

2. Установлено, что антимикобактериальная активность макрофагов мышей зависит от генотипа локуса tbsl-D3Mit215, при этом преимущество имеют животные, гетерозиготные по данному локусу.

3. Показано, что многие параметры патологического процесса и инфильтрации легких клетками иммунной системы при туберкулезе находятся под полигенным контролем, но зависят от пока не локализованных генов.

4. При заражении in vitro легочных макрофагов мышей I/St увеличивается экспрессия всего семи (.IL-11, /1-77, Мтр9, Timp-1, Ctgf, Ianl и Ereg) и уменьшается всего пяти генов (Slf 3, 4, Ifi204, Siatl, Isg20), у мышей A/Sn усиливается экспрессия всего четырех генов (Sftpc, Cdh5, MmplO, Ctgf).

5. Показано, что легочные макрофаги мышей чувствительной линии I/St более активно экспрессируют 35 генов и менее активно - 18 при сравнении с макрофагами резистентной линии A/Sn. В число этих генов преимущественно входят гены цитокинов, хемокинов, белков иммунного ответа и внеклеточного матрикса.

6. Впервые установлено, что цитокин IL-11 экспрессируется в легочных макрофагах. Межлинейные различия в продукции мРНК данного гена достигают 15-кратного уровня. В сочетании с 3-кратными различиями в экспрессии IL-6, относящегося к тому же семейству цитокинов воспаления, это может объяснить существенные различия между мышами двух линий по чувствительности и тяжести легочной патологии.

4.2.5. Заключение

Развитие туберкулезной инфекции зависит от сложной цепи взаимодействий, включающей изменения в экспрессии микобактериальных генов и генов хозяина. Мы использовали технологию микрочипов ДНК, чтобы изучить влияние инфекции М. tuberculosis H37Rv непосредственно на тканевые легочные макрофаги мышей с различной чувствительностью к туберкулезной инфекции.

В проведенных ранее работах было продемонстрировано наличие пика изменений генной экспрессии через шесть часов после заражения макрофагов микобактериями in vitro. Этот пик спадал к 12 часам после заражения (Ragno et al., 2001). Гены, экспрессия которых увеличилась на столь раннем этапе инфекции, в основном относятся к функциональным группам цитокинов/хемокинов и рецепторных/адгезионных молекул. Аналогичным образом было исследованно изменение транскрипции макрофагальных генов на поздних сроках инфекции. Через 48 часов инкубации альвеолярных макрофагов с микобактериями наблюдалось подавление экспрессии генов раннего апоптоза и повышение генов конечной фазы апоптоза (Spira et al., 2003). Гены, увеличение экспрессии которых мы наблюдаем при 24 часовом заражения in vitro тканевых легочных макрофагов, относятся к группе ферментов внеклеточного матрикса, которые участвуют в проникновении макрофагов в очаг воспаления. Кроме того, эти продукты могут вызывать массивное разрушение легочной ткани и тем самым способствовать диссеминации инфекции.

Важно подчеркнуть, что постинфекционные изменения в экспрессионном профиле тканевых легочных макрофагов вызажен слабее, чем межлинейные различия в экспрессии многих генов. Можно ожидать, что именно среди генов с межлинейными различиями в уровне экспрессии находятся те гены, продукты которых контролируют первичный макрофагальный ответ на микобактериальную инфекцию и, в конечном счете, определяют общую чувствительность мышей линий I/St и A/Sn к заражению (Nikonenko et al., 2000; Majorov et al., 2003; Eruslanov et al., 2004a). Мы предполагаем, что к их числу можно отнести ген IL-11, кодирующий плейотропный цитокин, подавляющий при нормальном уровне экспрессии транскрипцию провоспалительных цитокинов, но при увеличенной продукции вызывающий избыточное образование матриксных металлопротеиназ. Это приводит к повреждению ткани легкого и распространению микобактерий. Повышенная продукция данного цитокина макрофагами мышей I/St может в какой-то мере объяснить природу восприимчивости этих мышей к туберкулезу и тяжесть легочной (Nikonenko et al., 2000; Eruslanov et al., 2004a).

Таким образом, технология олигонуклеотидных микрочипов ДНК позволяет не только выявлять гены, изменяющие свою экспрессию в результате того или иного воздействия, но и прогнозировать развития событий в ответ на различные факторы, основываясь на общем генно-экспрессионном профиле клеток.