Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Тонкое генетическое картирование локуса МНС, контролирующего уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей при инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis

На правах рукописи

Коротецкая Мария Валерьевна

Тонкое генетическое картирование локуса МНС, контролирующего уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей при инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

2 0 НОЯ 2014

Москва 2014 г.

005555569

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук Логунова Надежда Николаевна Официальные оппоненты:

Филатов Александр Васильевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Нестеренко Людмила Николаевна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ « НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи » Минздрава России

Ведущая организация: ФБУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского" Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « 12 » декабря 2014 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ « НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи » Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, дом 18.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте института www.gamaleya.org

Автореферат разослан «11» ноября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор П/^^Е.В.Русакова

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Многочисленные исследования последних лет ясно показали, что уровень восприимчивости к инфекции и тяжесть течения заболевания во многом определяются генетическими особенностями хозяина и что контроль взаимодействия «паразит-хозяин» при туберкулезе носит полигенный характер (Schurr Е. et al. 2008; Апт А.С. и сооавт. 2008; Apt A.S. 2011). При этом, до сих пор немногое известно о конкретных генах, предопределяющих восприимчивость к туберкулезу (ТБ) и о физиологических (иммунологических) фенотипах, которые они контролируют.

Генетический контроль ТБ со стороны хозяина во всем мире изучается лишь несколькими группами исследователей, поэтому наши представления о генетике восприимчивости и тяжести течения туберкулеза, как и других комплексных хронических заболеваний, очень скудны. Каждое новое сочетание родительских линий мышей (Mitsos L.M. et al. 2000; Sanchez F. et al. 2003; Yan B.S. et al. 2006), каждая новая обследованная популяция людей (Sahiratmadja Е. et al. 2007; Lee H.W. et al. 2005; Tso H.W. et al. 2005; Bellamy R. et al. 1999; Liu W. et al. 2004) приносит сведения о ранее неизвестных механизмах контроля и генах-участниках. Лишь в самое последнее время было впрямую показано, насколько важным в прогностическом аспекте может оказаться сочетание генетического картирования с исследованием регуляции иммунного ответа при хронических воспалительных состояниях (Lee J.C. et al. 2013) , и это в полной мере относится к генетическому контролю тяжести течения ТБ. Идентификация новых локусов и генов позволит получить новые знания о механизмах регуляции процессов, задействованных в контроле ТБ инфекции.

Цель работы - точное картирование (сужение) генетической области в комплексе Н2, несущей ген(ы), ответственный(е) за тяжесть течения туберкулезной инфекции (локус tbs-3 = tuberculosis sensitivity-3), и поиск регуляторных механизмов работы иммунной системы у мышей с генетически детерминированными различиями по чувствительности к туберкулезу.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

• Получить новые линии мышей на генетической основе резистентных к ТБ мышей C57BL/6, у которых различные участки локуса tbs-3 замещены за счет рекомбинации на соответствующие участки чувствительных к ТБ мышей линии I/St.

• Подобрать микросателлитные полиморфные ДНК-маркеры для тонкого картирования внутри всего генетического интервала исследуемой области.

• Определить точные границы рекомбинантных участков, перенесенных от чувствительной линии I/St на генетическую основу резистентной линии C57BL/6, в сочетании с определением у конгенных линий основного интегрального фенотипа -срока выживания после заражения.

• Сравнить мышей новых конгенных линий по способности контролировать размножение микобактерий в легких.

• Определить динамику кахексии у мышей конгенных линий в сравнении с родительскими линиями I/St и С57В1/6 после заражения.

• Сравнить особенности патоморфологических изменений в легких у новых конгенных линий мышей по сравнению с родительскими линиями.

• Определить количество и тип наследования гена-кандидата в локусе tbs-3, участвующем в контроле ТБ.

• Провести позиционное клонирование генов в этом локусе для определения генов-кандидатов, отличающих чувствительную и резистентную линии.

Научная новизна

• Область íbs-З локуса, содержащая ген, участвующий в контроле ТБ, сужена до участка длиной 98 588 п.о., в котором расположено всего 5 структурных генов.

• Установлено, что аллель гена-кандидата локуса tbs-З, который несет родительская линия В6 (tbs-3b), детерминирующий более благоприятное развитие инфекции, имеет доминантный тип наследования.

• Установлено, что аллельные варианты идентифицированного локуса tbs-3 детерминируют все главные фенотипические характеристики течения ТБ: среднее время выживания, степень развития кахексии, уровень размножения микобактерий в легких и тяжесть легочной патологии.

• Выявлено, что «аллель резистентности» локуса tbs-3 - tbs-3b, в ответ на заражение Mycobacterium tuberculosis запускает экспрессию значительно большего числа генов по сравнению с «аллелем чувствительности» tbs-31.

• Аллельные варианты всех пяти генов локуса tbs-З, которые несет генетически чувствительная к ТБ линия I/St, впервые клонированы, определена их нуклеотидная последовательность и установлены полиморфные отличия от хорошо изученной линии C57BL/6, относительно резистентной к ТБ

Практическая значимость работы

Данные об участке МНС, который отвечает за тяжесть течения инфекции в модели на мышах и знания о типе его наследования являются хорошей основой для исследования роли гомологичного участка у человека. Контроль чувствительности и резистентности к микобактериям у человека и мыши зависит, по крайней мере частично, от гомологичных генов (Liu J. et al 1995), поэтому наши данные позволят продвинуться к решению вопроса о генетическом прогнозировании тяжести течения ТБ и развития разных форм заболевания в клинике.

Сходство между мышью и человеком на уровне генетического контроля чувствительности и резистентности к туберкулезу позволяет думать и о сходстве механизмов противотуберкулезной защиты. Исследования работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяют выделить те иммунологические реакции, которые определяют высокую индивидуальную чувствительность к туберкулезной инфекции, что потенциально важно для установления групп высокого риска заболеваемости туберкулезом, а также для генетического мониторинга эффективности лечения и вакцинации.

Вид и формы внедрения в практику

Материалы диссертационного исследования используются в курсе лекций «Иммуногенетика» для студентов кафедры иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Наша работа позволила сузить генетическую область на 17 хромосоме, участвующую в контроле туберкулезной инфекции у мышей, до участка в 98 588 пар оснований, содержащего всего пять кодирующих генов.

• Были выявлены мутации в 5 генах, отличающие генетически восприимчивых к туберкулезу мышей от более резистентных.

• Полученные нами новые рекомбинантные линии мышей и характеристика их фенотипов служат основой для получения новых данных о механизмах генетического контроля над развитием инфекции, вызванной вирулентным штаммом М. tuberculosis.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на: Российском национальном конгрессе «Человек и лекарства» 2013 г.; XIX-ой межгородской научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии -2013"; 38th FEBS Congress, St. Petersburg, 2013.

Исследования поддерживались грантом РФФИ № 12-04-00173-9. Апробация диссертации состоялась 28 апреля 2014 г. на заседании отдела иммунологии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН.

Публикации

По результатам исследования в рецензируемых изданиях опубликовано 3 научных статьи, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 5 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих глав: «Введения», «Обзора литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список сокращений» и «Список литературы» (3 отечественных и 198 зарубежных источников). Работа изложена на 85 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 21 рисунком.

Собственные исследования Материалы и методы исследований

Животные и выведение рекомбинантных кошенных линий мышей. В работе были использованы мыши линий C57BL/6YCit (В6) и I/StYCit (I/St) в возрасте 1.5-2 месяца на начало всех типов экспериментов. Линии поддерживались братско-сестринскими скрещиваниями в питомнике Центрального НИИ туберкулеза РАМН в обычных условиях, с доступом к корму и воде ad libitum.

Выделение ДНК. Для генотипирования мышей использовали ДНК из кончиков хвостов мышей (2-3 мм.). ДНК выделяли с помощью Wizard Genomic DNA Purification кит (Promega, USA) согласно инструкции производителя.

Генетическое шинирование Генотипирование мышей проводили методом ПЦР с использованием маркеров Mit для полиморфных микросателлитных областей геномной ДНК, позволяющих по длине продукта ПЦР выявить аллельпые различия (Коротецкая М.В. и соавт. 2013).

Заражение и параметры инфекции. Животных заражали М. tuberculosis штаммом H37Rv Pasteur в дозе 400-600 КОЕ на мышь в аэрозольной камере (Glas-Col, США), как описано ранее (Radaeva T.V. et al 2008). Зараженных животных взвешивали раз в две недели и определяли % потери веса по следующей формуле:

W(TN)-W(TO) % потери веса --;у(го)-Х 10°*

где W(TN) - среднее значение веса мышей на данном этапе заражения, W(T0) - среднее значение веса мышей на момент заражения. Гибель животных после заражения регистрировали ежедневно.

Подсчет колоний микобактерий (CFU). На разных сроках после заражения животных забивали и в стерильных условиях выделяли легкие. Органы гомогенизировали в стерильном растворе PBS и делали серию 10-кратных разведений каждой суспензии. На пластиковые чашки Петри с агаром Дюбо наносили по 50 мкл суспензии каждого разведения. Чашки герметично закрывали, инкубировали при 37°С, и колонии

подсчитывали визуально через 21 день после высева. Затем пересчитывали количество колоний микобактерий на целый орган.

Приготовление суспензии легких и проточная цитофлуориметрия. Клеточные суспензии легких мышей готовили индивидуально путем переваривания легких в смеси ферментов: 200 ед/мл коллагеназы и 50 ед/мл Днказы-I (Sigma, St-Louis, МО, USA), и полученную клеточную суспензию окрашивали и анализировали на цитофлуориметре FACSCalibur как описано ранее (Lyadova I.V. et al 2000).

Продукция цитокинов. Цитокины определяли иммуноферментным методом в гомогенате легких зараженных животных методом ELISA с использованием коммерческих наборов OptEIA mouse TNF-a Set, OptEIA mouse IL-5 Set и OptEIA mouse IL-6 Set (PharMingen-BD, CA, USA), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя, а также INF-y ELISA Set Biolegend.

Гистологические исследования. Легкие мышей замораживали при -60°С в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания), после чего получали срезы, фиксировали их в метаноле и окрашивали гематоксилином-эозином. Иммуногистохимическую окраску по маркеру CD 19 проводили согласно протоколу (Kondratieva E.V. et al 2010).

Постановка пролиферативного теста. Мышей иммунизировали подкожно в подушечки задних лап ультразвуковой дезинтеграт М. tuberculosis H37Rv - 10 мкг на мышь в неполном адъюванте Фрейнда (Sigma, США). Через 21 день после иммунизации из подколенных лимфоузлов выделяли смесь клеток. Все культуры ставили в триплетах и культивировали в течение 72 часов в СОг-инкубаторе при 37°С, последние 18 часов в присутствии 0,5 цС! [Н3]-тимидина. Включение [Н3]-тимидина определяли на сцинтилляционном ß-счетчике Wallac (Turku, Finland) . Индекс стимуляции вычисляли по следующей формуле:

срт в присуствии антигена

Индекс стимуляции =-

срт в отсуствие антигена

Выделение РНК и получение кДнк. Выделение РНК из селезенок и легких проводили при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Комплементарную цепь ДНК синтезировали на РНК-матрице с использованием олиго^Т) праймера (Fermentas) с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, USA).

Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени мы использовали систему количественной идентификации ПЦР-продукта по связыванию с интеркалирующим красителем SYBR Green I. В качестве «housekeeping» гена использовали a-актин. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали готовую реакционную смесь (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, Fermentas. Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 Real Time System (Bio-Rad).

Клонирование генов-кандидатов. Исследуемый ген амплифицировали с синтезированной кДНК с использованием высокоточной полимеразы Advantage GC Genomic LA Polymerase (Clontech, USA). Клонирование генов проводили с использованием PCR-Script™ Amp Cloning Kit (Stratagene, USA) и вектора pAL-TA (Евроген) согласно прилагаемым рекомендациям, ампициллином, Для верификации последовательности гена проверяли последовательность 3-5 клонов. Определение последовательностей клонов проводили в компании Евроген (Москва).

Определение экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов Illumina. Тотальную экспрессию генов определяли в легочной ткани мышей В6 и конгеиной линии B6.I-9.5.7 в норме, а также на 21 день после аэрозольного заражения. Для этого были индивидуально выделены и очищены РНК из легких мышей (3 мыши на группу). Анализ экспрессии проводился в университете Чикаго, США, на микрочипах Illumina MouseWG-6 v2.0

Expression BeadChip Kit с последующей первичной статистической обработкой в программе Illumina Genome Studio ™ Data Analysis. Статистически достоверные данные в дальнейшем обрабатывали с помощью программы DAVID

(httn://david.abcc.ncifcrf.gov/gene2gene.ispV

Статистическая обработка результатов. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism 4,0 (GraphPad Software, Inc.) и Биостат. Данные представлены как M ± SEM. Статистически достоверными считали данные с Р < 0.05.

Результаты исследования Выведение новыхрекомбинантиых линий мышеи, кошенных по МНС

Ранее в нашей лаборатории был картирован в 17 хромосоме мыши генетический локус, участвующий в контроле восприимчивости к туберкулезу - tbs-3 (Sanchez F. et al 2003). Для того, чтобы сузить генетический интервал и приступить к поиску генов-кандидатов были выведены конгенные рекомбинантные линии, у которых на резистентную основу C57BL/6 от чувствительной инбредной линии I/St были перенесены различные области локуса tbs-3 . Был исследован геномный участок на 17 хромосоме между позициями 8,63 м.п.о и 65,34 м.п.о.

Для перевода на резистентную основу C57BL/6 все новые полученные рекомбинантные линии прошли по крайней мере 10 возвратных скрещиваний, после чего проводили братско-сестринские скрещивания для получения гомозиготных конгенных линий, несущих на основе В6 участок генома I/St в исследуемой области. Все полученные нами линии мышей были проверены на чувствительность к туберкулезной инфекции, для чего их заражали в аэрозольной камере -500 КОЕ вирулентного штамма M.titberculosis H37Rv. По срокам выживания новые конгенные линии разбились на две группы: в первой группе (B6.I-219, B6.I-20.15, B6.I-411, B6.I-107, B6.I-20.3) среднее время выживания составило 230-240 дней и не отличалось от родительской линии В6 (242 ± 14 дней). Вторая группа линий (B6.I-9.5.7, B6.I-9.5A, B6.I-21, B6.I-364.1, В6.1-398.16) была более чувствительна к ТБ и имела среднее время выживания 130-150 дней (Рис.1). В эту группу вошли линии, у которых область переноса включала геномный интервхч 17-й хромосомы от 33,168 до 36,21 м.п.о. Нужно отметить, что вновь полученные чувствительные линии выживали достоверно дольше, чем родительская чувствительная родительская линия I/St (СВВ 88+/- 6 дней, см. Рис.1). Этот факт вполне согласуется с полигенным наследованием уровня восприимчивости к туберкулезной инфекции (Lavebratt С. et al 1999): поскольку локус 17-й хромосомы определяет лишь часть фенотипа, конгенные по нему линии меньше отличаются от мышей В6, чем мыши I/St.

О 100 200 300 400

Дни поел* заражения

Рис.1. Кривые выживания новых конгенных линий мышей после аэрозольного заражения Мгм6е/-ск/о^/5 Н37Яу (400-600 КОЕ/мышь). Заражали самцов одного возраста, каждая

группа содержала не менее 10 животных. На рисунке обобщены данные нескольких независимых экспериментов.

С помощью рекомбинантных конгенных линий был исследован сегмент хромосомы от 8,63 до 65,34 м.п.о., и область поиска удалось сократить до интервала 33,168-36,21 м.п.о. Тем не менее, установленный нами участок генома оставался слишком большим для позиционного клонирования генов, поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на сужение генетического интервала за счет более тонкого картирования и получения следующего набора линий с рекомбинациями внутри выявленной области.

Исследование роли полиморфизма TNF-a в течении инфекции

Среди генов исследуемой нами области ген tnfa (геномная позиция 17:35,199 -35,202 м.п.о.) может рассматриваться как один из приоритетных генов-кандидатов. Во-первых, многочисленные исследования подтвердили важность этого провоспалительного цитокина при ТБ (Flynn J.L. 2004; Clay Н. et al 2008; Dambuza I. et al 2011). Во-вторых, несмотря на общий эволюционный консерватизм гена tnfa, связанный, вероятно, с высокой важностью выполняемых этим цитокином функций, именно мыши I/St отличаются от всех других несколькими мутациями в гене tnfa (Kahler A.K. et al 2005). Это потенциально могло бы привести к серьезным изменениям в иммунном ответе при ТБ.

Для исследования были отобраны конгенные линии мышей, которые отличаются по чувствительности к ТБ и несут области генома от мышей I/St с границами между 34,333 м.п.о. и 36,21 м.п.о. (Табл.1). Аллельные варианты TNF-a определяли методом RFLP продуктов ПЦР: аллели tnfa у мышей В6 и I/St отличаются заменой Arg8His (G>A), что приводит к появлению сайта для рестрикционной нуклеазы DralH. Результаты исследования показаны в Табл. 1 и на Рис. 2._

TMFa

Таблица № 1. Типирование конгенных линий мышей по аплельному варианту гена ?и/а. В последнем столбце приведены фенотипы: Ч-чувствителыюсть, Р — резистентность. А Б

—CG7BL/6 -*-l/St

—B8J-20.16 —•-Вв.М11 -в- B6J-9.3

Дни после заражения

Дни пасла заражения

Рис.2. Полиморфизм TNFa не влияет на течение ТБ у конгенных мышей. А- кривые выживания и Б- развитие кахексии у мышей исходных линий В6 и I/St и новых рекомбинантных конгенных линий.

Оказалось, что две резистентные линии, B6.I-20.15 и B6.I-411, имеют разные аллели, соответственно, tnfrf и tnfah, а линии B6.I-9.3 и B6.I-9.5A обе чувствительнее к инфекции, чем исходная линия В6, хотя первая несет аллель tnj" линии В6, а вторая приобрела в результате рекомбинации аллель tnfd от чувствительной линии I/St (Табл.1, Рис.2). Таким образом, основная роль в определении уровня восприимчивости и тяжести течения ТБ принадлежит не аллелыюму варианту гена tnfa, а искомый ген-кандидат лежит проксимальнее tnfa.

Топкое генетическое картирование участка МНС, содержащего ген-кандидат

Все рекомбинантные линии мышей, несущие генетический интервал между маркерами 33,168 м.п.о. и 35,199 м.п.о. от родительской линии I/St оказались чувствительными к инфекции. Однако геномная область в 2 м.п.о. слишком велика для позиционного клонирования генов, поэтому была проделана работа по сужению этой области.

Оказалось, что конгенные линии B6.I-9.3.19.8 и B6.I-9.3, имеющие чувствительный фенотип, не экспрессируют на поверхности антиген-презентирующих клеток молекулу Н2-Е, т. е. несут ген Ш-Еа гаплотипа Н2Ь. Таким образом, граница исследуемого интервала начинается проксимальнее гена Еа, с маркера D17Mit22.

Сузить интервал со стороны центромеры позволило выведение новой рекомбинантной линии B6.I-249.1.16, которая показала резистентный фенотип. Мы смогли подобрать маркеры два маркера SNP (SNP1, SNP2) различающие родительские аллели. В результате левая граница искомого локуса оказалась между SNP1 и SNP2 (33 910 276 - 33 939 973 п.о.).

Таким образом, тонкое генетическое картирование позволило сузить границы искомого интервала до менее, чем 0,5 м.п.о (33, 910 - 34, 34 м.п.о.). Чувствительная конгенная линия B6.I-9.5.7 унаследовала наименьший участок генома от родительской линии I/St (33,168 - 36,21), поэтому представляла наибольший интерес для более подробного анализа.

Гепотипические и фенотипические характеристики новой линии B6.I-9.5.7 После заражения вирулентным штаммом H37Rv конгенная линия B6.I-9.5.7 показала промежуточное СВВ по сравнению с родительскими линиями: В6 = 242 ± 14 дней; I/St = 88 ± 6 дней; B6.I-9.5.7 =136 ±10 дней (Рис.3А). Гибели животных предшествовало развитие кахексии, характерной для туберкулезной инфекции (Рис.ЗБ).

Рнс.З. Линия В6.1-9.5.7 имеет промежуточное время выживания (А) и скорость потери веса (Б) после заражения. Приведены суммарные данные трех независимых опытов.

КОЕ в легких

Недель после заражения

Рис.4. Динамика роста микобактерий в легких зараженных мышей. После стандартного заражения определяли количество КОЕ/легкое. На каждую точку брали 3 мыши. Показаны данные двух независимых экспериментов.

Сходным образом изменяется и количество микобактерий в легких мышей: быстрее всех теряют контроль над размножением микобактерий мыши I/St, линия B6.I-9.5.7 имеет промежуточный фенотип, а лучше других контролируют рост микобактерий мыши В6 (Рис. 4).

Изложенным выше результатам соответствуют данные по гистологической оценке легочной патологии на разные сроки инфекции. Изменения в легочной ткани у мышей В6 к 6 неделе после заражения значительно слабее, чем у мышей I/St. У линии I/St наблюдаются большие участки диффузной инфильтрации, а у линии В6 участки инфильтрации меньше, с мелкими макрофагальными гранулемами. Раннее образование гранулем считается защитным механизмом, т. к. позволяет оградить здоровую ткань легкого от диссеминации инфекции из очага поражения, поэтому наличие хорошо организованных гранулем является подтверждением более резистентного фенотипа. У конгенной линии B6.I-9.5.7 в легких имеются средние и мелкие участки инфильтрации, в которых также выявляются хорошо сформированные гранулемы с макрофагальным центром. Общую патологию легочной ткани у линии B6.I-9.5.7 можно оценить как промежуточную между родительскими линиями.

К 17 неделе развития инфекции мыши I/St уже погибают, а у конгенной линии B6.I-9.5.7 значительно ухудшается состояние легочной ткани. Почти отсутствуют участки здоровой ткани, происходит массивная клеточная инфильтрация, развиваются отек и сливная пневмония. Патология на данном этапе напоминает патологию линии I/St на более ранних сроках после заражения. В тоже время у линии В6 есть как хорошо организованные гранулемы, так и здоровая легочная ткань.

Исследование клеточного состава легких при инфекции

Гистологические исследования показали, что при туберкулезной инфекции происходит инфильтрация легкого различными типами лейкоцитов. Для более точной оценки клеточного состава легких был проведен цитофлуориметрический анализ различных популяций лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов в динамике. Для чувствительных к инфекции мышей I/St был характерен более быстрый приток нейтрофилов, начиная с первой недели инфекции. Напротив, у более резистентных мышей В6 и B6.I.9.5.7, начиная с 3-й недели после заражения, в легких возрастало количество макрофагов, тогда как у мышей I/St их содержание остается достоверно ниже. Следует отметить, что линия B6.I-9.5.7 по клеточному составу легких оказалась ближе к родительской линии В6. Мы не нашли существенной разницы в популяциях Т-клеток CD4+ и CD8+, а также В-клеток. Даже кривая накопления активированных Т-клеток CD4+ у конгенной линии оказалась сходной с родительской линией В6.

Линия мышей В6 несет доминантный аллель, определяющий резистентность к

инфекции

При первичном анализе наследования восприимчивости к ТБ на мышах родительских линий было установлено, что у гибридов F1 между чувствительной и резистентной линией доминирует резистентность (Eruslanov Е.В. et al 2005).

Для того, чтобы прояснить этот вопрос, были получены гибриды F1 между родительской линией В6 и линией B6.I-9.5.7, проведено их заражение и оценен уровень восприимчивости к инфекции. Срок выживания линии B6.I-9.5.7 достоверно отличался от родительской линии В6 и гибридов F1, в тоже время не было найдено статистически достоверных отличий между линией В6 и гибридами первого поколения F1. Эти результаты были подтверждены при анализе гибридов F2. Гибриды F2 [(В6 х B6.I-9.5.7)F1 х (В6 х B6.I-9.5.7)F1] были типированы по аллелям исследуемой области и оценили уровень восприимчивости к инфекции при стандартном аэрозольном заражении. Сроки выживания после заражения носителей гомозиготного аллеля j/j был достоверно ниже, чем гомозигот Ь/Ь и гетерозигот b/j, в то же время среднее время выживаемости у гомозигот b/b и гетерозигот b/j статистически не отличалось. Таким образом, аллель Ъ является доминантным по отношению к аллелю j.

Анализ экспрессии генов в нормальной и зараженной легочной ткани линий

Одним из подходов к поиску генов-кандидатов является исследование экспрессии генов с помощью ДНК-чипов. В нашем случае геном мышей линии В6.1-9.5.7 отличается от родительской линии В6 лишь небольшой областью на 17 хромосоме. Мы не знаем, с какой функцией (или дефектом) гена-кандидата связана чувствительность линии B6.I-9.5.7 и связан ли фенотип с уровнем экспрессии искомого гена. Кроме того, аллельные различия могут не влиять на экспрессию самого гена, но приводить к изменению экспрессии генов вовлеченных в сигнальные пути «ниже» действия самого гена. В последнем случае может меняться экспрессия генов, находящихся в любых участках генома. Также мы не знаем, функционирует ли искомый ген в норме или его экспрессия связана с взаимодействием хозяина с возбудителем. В попытке ответить на эти вопросы мы выделили РНК из нормальной легочной ткани и на 21 день после заражения мышей линий В6.1-9.5.7 и В6 (по 3 индивидуальных образца) и провели анализ экспрессии всех генов мышиного генома (около 45200 транскриптов) на платформе Illumina. Работа проводилась совместно с коллегами из Университета Чикаго, США.

В результате при сравнении образцов из нормальной легочной ткани мышей В6 и B6.I-9.5.7 были выявлены отличия в экспрессии всего 31 гена, причем 28 из них локализованы в той самой области 17-й хромосомы, которая была перенесена от родительской линии I/St.

Выявленные различия в экспрессии генов 17-й хромосомы могут быть связаны как с реальными биологическими различиями в работе генов, так и с артефактами, вызванными полиморфизмом ДНК в исследуемой области. Поскольку зонды в системе Illumina основаны на праймерах комплементарных к З'-UTR генов линии В6, отличия даже в один нуклеотид приведут к изменению сигнала.

Особенно сильные различия в экспрессии были обнаружены для генов Wdr46 и Ringl, экспрессия которых (по данным Illumina) была на 2-3 порядка ниже у линии B6.I-9.5.7 по сравнению с В6. Такие различия давали основания предположить, что у мышей B6.I-9.5.7 эти гены вообще не экспрессируются. Для проверки этого предположения мы исследовали экспрессию этих генов методом ПЦР в реальном времени, для чего были синтезированы праймеры на кодирующие области генов. К нашему удивлению, полученные этим точным методом результаты не выявили никакой разницы по экспрессии в легких генов Wdr46 и Ringl в линиях B6.I-9.5.7 и В6. Этот результат говорит о том, что полиморфизм в некодирующих областях генов чрезвычайно сильно влияет на

результаты оценки экспрессии методами ДНК-чипов в тех случаях, когда исследуются генетически полиморфные области.

Так как мы столкнулись со сложностью интерпретации данных по экспрессии генов в нормальной легочной ткани в связи с полиморфизмом в области поиска, мы попытались проанализировать возможные различия в экспрессии генов по сигнальным путям, активированным после заражения у мышей В6.1-9.5.7 и В6. В этом случае были найдены достоверные различия в экспрессии более, чем 5000 генов. Схематично распределение этих генов показано на рис.5.

Количество Эштреспш шгсрш ттгдешпасъ после

таражстш тольго у B>HTCHHOil ЛШПП1 FÏ6.I 9J.7.

Количество генов, тпресспя которых нлчешплеь после заражения у обе!« .llffillft: юнгеяноП RS.I 9-5.7 п ролительсыпП ретстстттиоГт лнншт Вб.

Количество генов, лкспрсссня вторых тпмеияетс* то лько у ретстетпной ролщельскоП

ЛНШП! Вб.

Рис. 5. Количественная оценка генов, изменивших экспрессию в легочной ткани после заражения.

Из рисунка 10 видно, что у резистентной линии Вб количество генов, изменивших экспрессию на ранней фазе инфекции (21 день после заражения), значительно выше, чем у конгенной линии B6.I-9.5.7. По-видимому, резистентность основана на вовлечение во взаимодействие с возбудителем большего количества метаболических путей и их регуляторов. Более высокая чувствительность мышей B6.I-9.5.7 может быть связана с каким-то дефектом гена-кандидата, не позволяющего задействовать больше защитных механизмов, поэтому было интересно распределить гены с измененной экспрессией на функциональные группы. Мы использовали для этого программу DAVID, которая выявила несколько функциональных групп (Табл. 2). Результаты показывают, что меняется, в основном, экспрессия генов, ответственных за иммунный ответ, деление клеток и регуляцию клеточного цикла. Самый высокий показатель Р, а следовательно и наиболее достоверные различия, соответствует кластеру генов, задействованных в иммунном ответе. Этот результат косвенно подтверждает, что «включение» генов иммунной системы у мышей Вб после заражения проходит более активно, чем у мышей

Название функционального кластера Количество генов Р

Иммунный ответ 74 2.9Е-31

Врожденный иммунный ответ 36 2.4Е-15

Процессинг антигенов и презентация 20 1.5Е-11

Хемокиновая активность 12 5.9Е-9

Адаптивный иммунный ответ 16 3.9Е-8

Связывание углеводов 28 5.0Е-7

Белки межклеточного пространства 85 4.3Е-6

Митоз 22 2.5Е-5

ТАР комплекс 4 9.5Е-4

Микротрубочки 17 9.2Е-4

Таблица № 2. Кластеризация генов в метаболические пути с помощью программы DAVID, разработанной для обработки данных, полученных с разных видов чипов. Значения в данной системе анализа являются достоверными до значения Р= 0,001 (Huang B.W. et al 2009). Самое высокое значение Р у функционального кластера «иммунный ответ».

Конечно, скорее всего, выбранный нами срок (21 день после инфицирования) отражает далеко не все различия в активации генов важных для борьбы с туберкулезной инфекцией, и на других сроках после заражения отличия были бы либо более яркими, либо отражали изменения соотношений экспрессии генов в других функциональных кластерах.

Сужение области генома, несущей ген(ы) -кандидат(ы)

Сегмент 17-й хромосомы 33,93-34,34 полиморфен и содержит большое количество генов, имеющих отношение, как к развитию адаптивного иммунного ответа, так и презентации антигенов. Помимо основных и вспомогательных генов МНС класса II, продукты которых участвуют в процессинге, загрузке и презентации антигенных пептидов (.Н2-АЫ, H2-Aa,H2-DMbl. H2-DMb2, H2-DMa, H2-Ob, H2-Oa, Н2-ЕЫ, H2-K1. Tapb, Tapi, Tap2, Psmb8, Psmb9), в этой области расположен ген-регулятор апоптоза (Daxx), внутриклеточного транспорта везикул (Vps52), гипоксии (AngptU) и некоторые другие. Кроме того, в этой области локализованы гены важных транскрипционных факторов Rxrb и Ztb22, а также гены с неизвестной на сегодняшний день функцией. Исходя из наших знаний о патогенезе и развитии иммунного ответа при ТБ, многие из них могут рассматриваться как потенциальные гены-кандидаты.

Для сужения интервала был продолжен поиск новых рекомбинаций внутри области. Мышей двух выведенных ранее линий - В6.1-9.5.7 и В6Д-249.1.15 скрещивали с родительской линией В6, получали гибридов F2 и вели поиск новых рекомбинаций внутри исследуемой области. В результате было получено несколько независимых рекомбинантных линий: B6.I-249.1.15.46, Вб.1-249.1.15.100 и B6.I-9.5.7.101. Первые две линии позволили лишь подтвердить определенные ранее границы локуса: конгенная линия B6.I-249.1.15.46 (СВВ = 150 ± 11 дней) также чувствительна, как и линия B6.I-9.5.7 (СВВ = 136 ± 10 дней), а линия B6.I-9.5.7.101 (СВВ = 259 ± 16 дней) не отличается по резистентности от родительской линии В6 (СВВ = 242 ± 14 дней).

Сравнение параметров течения ТБ у мышеи линий В6.1-249.1.15.100 и родительских

линий

Проверка фенотипа новой рекомбинантной линии В6.1-249.1.15.100 показала, что ее СВВ = 149 ±21 день, т. е. линия имеет чувствительный фенотип (Рис. 6).

Рис.6. Кривые выживаемости рекомбинантной конгенной линии мышей после аэрозольного заражения в стандартных условиях. Суммированы результаты 2-х независимых экспериментов.

Кроме оценки СВВ, мы проанализировали размножение микобактерий в легких, и по данному фенотипическому признаку конгенная линия B6.I-249.1.15.100 показала, что контролирует размножение микобактерий на уровне чувствительной родительской линии I/St (Рис. 7).

S- 25-<

° 20-X

Ш 15-О * 10-

2 I/St

3249.1.15.100

28 70

Дни после заражения

Рис.7. Количество микобактерий в легких новых конгенной и родительских линий после аэрозольного заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv.

Как было показано в многочисленных работах нашей лаборатории (Yeremeev V.V. et al 2000; Eruslanov E.B. et al 2004,2005; Kondratieva E. et al 2010), течение инфекции у мышей I/St всегда сопровождается сильной воспалительной реакцией в легких. Для того, чтобы охарактеризовать воспаление, мы определили количество ключевых цитокинов воспаления, IL-6 и TNF-a, в гомогенате легких заражённых мышей (Рис. 8). У резистентной родительской линии Вб самая низкая концентрация TNF-a и IL-6, тогда как у мышей I/St и чувствительной конгенной линии мышей В6.1-249.1.15.100 количество этих цитокинов в легких было достоверно выше.

г 200 х

Ч

I

J list

3B6.I-249.1.15.100

Рис.8. Иммуноферментный анализ TNF-a и IL-6 в гомогенате легких мышей на 60-й день после аэрозольного заражения. В каждой группе исследовали индивидуально по 3 мыши.

В то же время на этих же сроках мы не выявили разницы в концентрации IL-5 и INF-y ни между конгенной линией, ни родительскими линиями (данные не приводятся).

Таким образом, полученные данные подтверждают, что конгенная рекомбинантная линия В6.1-249.1.15.100 имеют промежуточный фенотип и по некоторым параметрам ближе к чувствительной родительской линии I/St.

Учитывая роль молекул МНС класса II в формировании адаптивного иммунного ответа Т-клеток CD4*, нас в первую очередь интересовал вопрос, не являются ли эти молекулы в каком-то смысле дефектными, что возможно выражается в дефекте самой презентации. Следствием этого могло бы быть изменение уровня ответа Т-клеток на антигены микобактерий. Для проверки этого предположения мы исследовали уровень ответа Т-клеток на смесь антигенов М. tuberculosis (ультразвуковой дезинтеграт) в полученных линиях мышей. Мышей иммунизировали подкожно в подушечки лап соникатом H37R.V в неполном адъюванте Фрейнд и через 21 день определяли уровень Т-клеточной пролиферации. Показатели пролиферации оказались похожими у мышей всех линий (Рис. 9).

В6 1/Б1

В6.1-249.1 15.100

Рис. 9. Ответ клеток из подколенного лимфоузла иммунизированных мышей разных линий на 10 мкг/мл сониката Н37Яу.

Таким образом, область, содержащая ген(ы)-кандидат(ы) сократилась до участка в 98 588 п.о согласно базе данных ЕпветЫ и ограничена слева маркером 017Мк 21, а справа - геном Н2-Еа (Таб № 3, Рис. 10).

Маркеры 175 147 16 0сг4 62 Осг5 82 вЫР1 5ЫР2 28 103 21 22 Еа 13 ТЫРа 47

Геномная позиция(мпо) 31.184 33.19 33.60 33.60 33.737 33.81 33.910 33.939 34.0 34.184 34.24 34.33 34.34 35.07 35.199 36.21

Линии мышей

1/51 У

В6 Ь

В6.1-9.3.19.8 У У Ь

В6.1-9.5.7 Ь У У Ь

В6.1-249.1.15 Ь У У Ь

В6.1-249.1.15.46 Ь У У Ь

В6.1-249.1.15.100 Ь У У Ь

В6.1-9.5.7.101 ь У У Ь

Таблица № 3. Новые рекомбинантные линии , позволяющие уменьшить область поиска гена-кандидата

А В

Ген/маркер Геномная позиция (п.о.)

017Ми21 17 34,243,234-34,243,371

Н2-ОЬ 17 34,238,903-34,245,907

бш20506 17 34,249,057-34,250,264

Н2-АЫ 17 34,263,209-34,269,418

Н2-Аа 17 34,282,744-34,287,827

6т20513 17 34,293,073-34,305,720

Н2-ЕЫ Н2-ЕЬ2 17 34,305,883-34,316,199

17 34,325,665-34,340,229

017М1122 17 34,333,549-34.333,707

Н2-Еа 17 34,341,959-34,344,645

Рис. 10. Область генома, содержащая ген-кандидат. (А) - карта области согласно базе данных ЕпБетЫ. Границы прямоугольника очерчивают точный размер интересующего нас участка 17-й хромосомы. (Б) - все аннотированные гены этого интервала с их позициями

Позиционное клонирование в области 17:34,243371 - 34,341959

Найденная нами область в 98588 п. о. содержит всего 5 генов, кодирующих белки, что позволила нам клонировать и определить последовательность этих генов у линии

мышей I/St. Поскольку последовательность генома линии I/St не известна, в базах данных отсутствовали сведения об исследуемом нами аллельном полиморфизме. Поэтому нами были подобраны праймеры на основании данных о последовательности изучаемых генов у линии В6. Белковые последовательности клонированных генов I/St в сравнении с В6 приведены на Таб.4.

Гены Аминокислотные замены

ш-оь S154N, V174I, L193H, E265K.S266L

Н2-АЫ D29N, М39К, G40S, E41A.Y53L, T55S, Y57N, V64F, V65M, Y67F, H74F, A85V, S90K, Р92-, Е93-, I94Y, R97Q, Т98К, Е101А, L102V, W224R, H249Y

Ш-Аа T34S, F51H, IS8W, А79Т, Q88K, V92T.V93G, V99I, S106F, А156Т, F165L, Y170H

Н2-ЕЫ V2M, W33R, C38S, К39Т, L53F, E55D, L61R, N64Y, L65V, F74Y, N87Y, F94I, Q97D, К98А, E101S, V105Y, Е214К

Н2-ЕЬ2 L22V, R179G, М191Т, P206L

Таблица № 4. Сравнение белковой последовательности у родительских линий В6 и I/St. Нуклеотидные последовательности генов Н2-ОБ, Н2-АЫ, Н2-Аа, Н2-ЕЫ и Н2-ЕЬ2 были транслированы в белковые последовательности. Последовательности для линии В6 были взяты из базы данных Ensembl.

Как показано на Таб.4, во всех пяти генах были найдены аминокислотные замены, причем не только в вариабельных, но и в консервативных участках молекул. Мы не нашли стоп-кодонов и нонсенс-мутаций, которые могли бы привести к нарушению синтеза белка, поэтому идентификация гена, определяющего чувствительность к ТБ, потребует дополнительных исследований.

Выводы

1. Полученная панель рекомбинантных конгенных линий мышей от резистентной к туберкулезу C57BL/6 (Н2Ь) и чувствительной I/St (H2J) родительских линий позволила определить точные границы генетического локуса tbs-З, контролирующего тяжесть течения туберкулезной инфекции (17 хромосома: 34,243371 - 34,341959 п.о.). Размер участка генома, несущего искомый ген, был сужен с 57 м. п. о. до 98 588 пар.

2. Впервые для гаплотипа H2J были клонированы все пять известных для этой области генов, кодирующих белки (Н2-ОЬ,Н2-АЫ, Н2-Аа, Н2-ЕЫ, Н2-ЕЬ2). Все они оказались высоко полиморфными и несли множество аминокислотных различий между гаплотипами Н2Ь и Н2^

3. Показано, что аллель локуса tbs-З линии I/St имеет рецессивный тип наследования.

4. Аллельные варианты tbs-З определяют разницу по всем основным параметрам течения инфекции: среднее время выживания, степень развития кахексии, уровень размножения микобактерий в легких, уровень воспаления и тяжесть легочной патологии.

5. После заражения в легочной ткани более восприимчивых к инфекции мышей, несущих аллель tbs1, обнаруживается достоверно больше провоспалительных цитокинов ИЛ-б и TNF-а по сравнению с носителями аллеля tbsb , что согласуется с более высоким уровнем воспаления и образования гранулем в легочной ткани.

6. Повышенная чувствительность к туберкулезу мышей, несущих аллель tbs1, не связана с явными нарушениями презентации антигенов микобактерий Т-лимфоцитам CD4+ в контексте молекул Н2 Класса II.

Список работ опубликованных по теме диссертационной работы.

1. Коротецкая М. В., Капина М. А., Авербах М. М., Евстифеев В. В., Апт А. С., Логунова Н. Н. Локализация локуса, участвующего в контроле туберкулезной инфекции, в проксимальной части комплекса Н2 мыши. Молекулярная Биология 2011, т. 45, № 1,с. 58-65.

2. Коротецкая М. В., Авербах М. М., Апт А. С, Логунова Н. Н. Локус комлекса Н2, участвующий в контроле туберкулёзной инфекции, локализуемый в области генов класса II. Туберкулез и болезни легких, 2013, № 10,с. 51-56.

3. Коротецкая М.В., Майоров К.Б., Апт А.С., Логунова Н.Н. Количественная генетика контроля туберкулезной инфекции: фенотипы и иммунный ответ у мышей новых конгенных линий. Юбилейный сборник статей 50 лет отделу иммунологии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, 2013, с.111-117.

4. Логунова Н.Н., Капина М.А., Кондратьева Е.В., Коротецкая М.В., Апт А.С. Новые линии мышей конгенные по главному комплексу гистосовместимости (Н2) отличаются по чувствительности к микобактериям. Медицинская Иммунология, 2009, т.11,№4-5, с.323.

5. Коротецкая М.В., Логунова Н.Н., Апт А.С. Тонкое генетическое картирование локусов, контролирующих уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей к Mycobacterium tuberculosis.// Тезисы на Первой Всероссийской научной конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» на базе Научного Центра сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Москва, 2012.

6. Коротецкая М.В., Логунова Н.Н., Апт А.С. Тонкое генетическое картирование локусов, контролирующих уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей к Mycobacterium tuberculosis.// Тезисы доклада на «XIX-ой межгородской научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии -2013" . г.Санкт-Петербург, 2013, с.64-65.

7. Коротецкая М.В., Логунова Н.Н., Апт А.С. Тонкое генетическое картирование локусов, контролирующих уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей к Mycobacterium

tuberculosis.II Тезисы доклада на XX национальном медицинском конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, 2013, с.359.

8. Korotetskaya M.V., Logunova N.N., Apt A.S. Fine-scale mapping of a genetic locus responsible for the level of susceptibility and immune responses to Mycobacterium tuberculosis in the mouse model. //38th FEBS Congress, St. Petersburg, 2013.

Подписано в печать 24.10.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 80 Экз. Заказ № 4790-10-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39