Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Показатели иммунной и нейроэндокринной системыпри иммуномодулирующих воздействиях

На правах рукописи

Соловьева Марина Сергеевна

Показатели иммунной и нейроэндокринной системы при иммуномодулирующих воздействиях

14.00.36 - аллергология, иммунология

fjuf iefa^eu^ см au /ЛО

а / /А/ dut,

^jp /у . АВТОРЕФЕРАТ /

диссертации на^о и екание ученой степени к а н д^гата; Д i ! twKcKVi х наук

/О, Д

J/ 3** Ж / ^ V ' ' 1

гу , / '^-iiSilSi^^

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Туманян

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.С. Бляхер доктор биологических наук, профессор А.А. Михайлова Ведущее учреждение: Институт иммунологии МЗ РФ

заседании диссертационного совета К 001.07.01. в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Защита состоится «-^Г..» 1999 г. в

,ч. на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

раы.ъгб-.ь ъ®

РХН. / о

Актуальность проблемы. -

Деятельность человека привела к большим изменениям окружающей среды и к появлению новых факторов, которые оказывают неблагоприятное влияние на физиологические адаптационные возможности организма, а также на иммунную систему человека и животных. В сложившейся ситуации возможно быстрое истощение компенсаторных, адаптационных возможностей организма, что приводит к росту заболеваемости, тяжелому и длительному течению инфекционных болезней. В этой связи актуальной проблемой при профилактике и лечении инфекционных заболеваний является поиск препаратов стимулирующих неспецифическую естественную резистентность организма. Особое значение эта проблема приобретает в связи с изменением профиля инфекционной патологии, возникновением инфекционных заболеваний, возбудителями которых стали микроорганизмы, ранее считавшиеся апатогенными.

При поиске новых и оценке механизмов действия существующих иммуномодуляторов (ИМ) нередко ограничиваются изучением их влияния на Т- и В-системы иммунитета. При таком подходе за рамками исследования остаются возможные иммуномодулирующие эффекты препаратов, опосредованные через систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ) (Фрейдлин, 1988).

Активация макрофагов различными биологически" активными веществами сопровождается связыванием последних с рецепторами цитоплазматической мембраны, действуя на метаболическую активность клетки путем изменения концентрации и каталитической активности ферментов (Лесникова, 1987). Тестирование функционального состояния макрофагов наиболее надежно осуществляется по изменению обменных процессов в них, поскольку известно, что метаболизм и функция макрофагов тесно взаимосвязаны (Ледванова, 1989).

В связи с этим определенный интерес представляет комплексное исследование экзоферментов, локализующихся в цитоплазматической мембране макрофагов в частности 5'-нуклеотидазы (5'-н) и №,К- аденозинтрифосфатазы.

5'-нуклеотидаза-это один из основных ферментов пуринового обмена. Интерес иммунологов к изучению 5'-нуклеотидазы обусловлен тем, что дефицит этого фермента приводит к развитию тяжелых - иммунодефицитных состояний (Дмитриенко, 1991).

В лаборатории естественного иммунитета НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи разработан способ первичного отбора иммуномодуляторов, основанный на изменении уровня активности экто5'-нуклеотидазы макрофагов перитонеалыюго экссудата (МПЭ) (Кирилличева, Туманян, 1987; Кирилличева, Соловьева, 1993). Возможность использования данного метаболического показателя для оценки иммуномодулирующего действия препаратов базируется на обнаруженной зависимости между характером иммуномодулирующего эффекта и направленностью изменения энзимологического показателя.

В настоящее время установлено, что макрофаги играют важную роль не только в кооперативных взаимодействиях между иммунокомпетентными Т- и В-лимфоцитами, но и являются активными участниками формирования межсистемных взаимодействий, в частности, служат связующим звеном между иммунной, нервной и эндокринной системами (Громыхина, 1993). Однако особенности участия макрофагов во взаимодействиях иммунной и нейроэндокринной системы изучены. недостаточно, особенно при иммуномодулирующих воздействиях. В этой связи особую актуальность приобретают комплексные исследования показателей иммунной и нейроэндокринной системы.

Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной (н-э) систем подразумевает динамичность этого процесса. Функциональное состояние иммунной системы во многом зависит от структуры ее временной организации. При этом циркадная программа иммунной системы - это составная часть общей циркадной программы организма, и, следовательно, она испытывает на себе синхронизирующее влияние регулирующей системы организационного уровня -нейроэндокринной (Дедов, 1992; Абрамов, 1996). В литературе практически нет сведений о связи суточных биоритмов нейроэндокринных и иммунологических параметров при иммуномодулирующих воздействиях. Исследование закономерностей синхронизации биоритмов иммунной и нейроэндокринной

систем может явиться ключом к пониманию многих деталей нейрогормонального контроля иммунного гомеостаза как в стабильных условиях, так и при различных иммуномодулирующих воздействиях. Все это определило цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования: Поиск путей разработки способов оценки иммуномодулирующих воздействии на основе комплексного изучения показателен иммунной и нейроэпдокринпон систем.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимосвязь уровня активности 5'-н в МПЭ с состоянием естественной резистентности организма к бактериальным инфекциям, бактериальным токсинам при действии ИМ различной природы и происхождения.

2. Изучить взаимосвязь уровня активности 5'-н в МПЭ с уровнем активности показателей нейро-эндокринной системы-кортикостерона, дофамина, адреналина, норадреналина в крови, активностью лигандов опиоидных рецепторов 8- типа и ц- типа в плазме крови после введения различных иммуномодулирующих препаратов и стрессорных воздействий.

3. Использовать биоритмологический подход к изучению влияния иммуномодуляторов на:

- активность 5'-н, АТФ-азы в МПЭ

- пролиферативную активность лимфоцитов селезенки и костного мозга

- уровень суммарного интерферона в сыворотке крови

- чувствительность к бактериальным инфекциям, токсическому воздействию.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые, при иммуномодулирующих воздействиях, установлена зависимость между уровнем активности 5'-н в МПЭ и естественной резистентностью линейных мышей к различным патологическим воздействиям: 1) бактериальным инфекциям - Kl.pneum.,S.sonnei, S.thyphi murium.,

Б1арЬ.аигеи8 \Vood-46., 2) токсическим воздействиям^ чумного микроба, гг-стафилококкового токсина.

Впервые при - иммуномодулирующих воздействиях установлены корреляционные связи между уровнем активности 5'-н в МПЭ и показателями нейроэндокринной системы: кортикостерона, показателями катехоламинового обмена (адреналин, норадреналин, дофамин), активностью лигандов опиоидных рецепторов 5- типа и ц-типа.

Проведение биоритмологических исследований показало, что влияние ИМ на уровень активности различных показателей иммунной системы (5'-нуклеотидаза, АТФ-аза, интерферон, пролиферативная активность лимфоцитов), включая такие интегральные, как чувствительность к токсинам, зависит от времени введения препарата.

Учет времени введения препарата особенно важен при проведении сравнительных экспериментов по изучению иммуномодулирующего действия препаратов. Установлено, что результаты сравнительного изучения разных сторон иммуномодулирующего эффекта в значительной степени зависят от времени проведения эксперимента в течение суток.

Впервые при изучении иммуномодулирующих воздействий использовался интегративный подход в изучении биоритмов, заключающийся в изучении биоритмов как системы взаимодействующих элементов. Данный подход позволил установить коррелятивные связи между активностью 5'-н в МПЭ и: спонтанной пролиферативной активностью лимфоцитов селезенки и костного мозга, уровнем интерферона в сыворотке крови

Впервые проведено изучение иммуномодулирующего эффекта в условиях измененного светового режима. В работе было установлено, что варьирование светового режима приводило к изменению направленности иммуномодулирующего эффекта. Данное наблюдение имеет большое практическое значение. При использовании иммуномодуляторов в практическом здравоохранении, во избежании проявления парадоксального эффекта, следует с особой осторожностью назначать их людям, страдающим расстройствами нейро-эндокринной системы, а также переезжающим из одного часового пояса в другой или работающим в условиях полярной ночи или дня.

Комплексный анализ показателей иммунной и н-э системы позволил разработать метод оценки иммуномодулирующего эффекта. По результатам • . исследования иммуномодулирующих свойств препарата глауцина-гидрохлорида данным методом ттолучен патент № 2032403.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Симпозиуме с международным участием «Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии» (Томск . 1992 г.) и I съезде иммунологов России (Новосибирск 1992 г.).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрироваиа 2 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 195 наименований отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы.

2.1. Животные. В экспериментах использовали мышей-самцов линий С57В1/6,Ва1Ь/С,СВА и мышей-гибридов F1(CBA * С57В1/6), весом 16-18 г в возрасте 3 месяца, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая».

2.2. Препараты. В работе были использованы иммуномодуляторы различной химической структуры и происхождения, действующие на различные звенья .иммунитета.

Сальмозан- - полисахарид О-соматического антигена из . S.typhi abdominalis; получен в лаборатории естественного иммунитета НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством профессора М.А. Туманян (использовали в дозах 10 и 1 ООмкг/мышь).

МОП-35 (коммерческий препарат «Дина») - препарат металлоргани-ческой природы. Изготовлен АО «Динафарм». Использовали в дозах 10~4 и 1 Омкг/мышь).

РР-(фоспренил) препарат растительного происхождения (относится к классу" терпеноидов). Получен на фирме «МикроПлюс» (использовали в "рекомендованной дозе 4 мкг/мышь).

Стафилококковый энтеротокснн А (СЭ)-токсин белковой природы. Изготовлен в Уфимском НИИВС (использовали в дозе 1 мкг/мышь)

Амикснн-низкомолекулярный синтетический индуктор интерферона ИФН ароматического ряда, относящийся к классу флуоренов. Изготовлен Дальхимфарм ЗАО «ЛЭНС» (использовали в рекомендованной дозе 4мкг/мышь).

Т-актнвин-фармакопейный препарат(использовали в дозе 1мкг/мышь).

Глауцин-гндрохлорид-фармакопейный, нестероидный противокашле-вый препарат (использовали в дозах 250 и 1600мкг/мышь).

Даларгнн-синтетический аналог лей-энкефалина. Является фармакопейным препаратом(использовали в дозах 10"8 и 10'2 мкг/мышь).

2.3. Приготовление клеточных суспензий. Приготовление клеточных суспензий проводили согласно общепринятым методикам. Источником лимфоидных клеток служил костный мозг и селезенка. Макрофаги получали из взвеси клеток перитонеального экссудата мышей.

2.4. Заражение животных Для определения антиинфекционного действия иммуномодуляторов, линейных мышей заражали различными бактериальными инфекциями.

Культура золотистого стафилококка штамм Wood-46 вводилась в дозах, вызывающих гибель животных от 20% до 80%: подкожно в дозах от 3,3 * 106 до 6,6*106 млн.кл, внутрибрюшинно - 1,6* 106и 2,4*106мпн.кл.

Kl.pneum К-2 - культуру вводили в переднюю камеру глазав дозах от1 до 106 млн.кл., S.typhi murium, Sh.sonnei- внутрибрюшинно в дозах от 12,5 до 200 мклн.кл и от 6 до 100 млн кл соответственно. Наблюдение за гибелью животных проводилось в течение 14 дней. Вычисляли ЛД50 и индекс резистентности (ИР).

Антитоксическое действие иммуномодуляторов исследовалось после внутрибрюшинного введения линейным мышам фракции 2(F2) чумного микроба и стафилококкового а -токсина.

Фракция 2 (F 2) чумного микроба - токсин получен в лаборатории биохимии ВНИПЧИ «Микроб».

а-стафилококковый токсин - получен в отделении стафилококкового анатоксина производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Токсины вводились в заранее оттитрованных дозах. Об эффективности исследуемых препаратов судили по разнице между процентом погибших животных в опытной и контрольной группе.

2.5. Метод определения активности 5'-пуклеотндазы. Исследование 5'-нуклеотидазной активности в макрофагах . перитонеального экссудата (МПЭ) мышей проводили по методу Dixon и Purdom с некоторыми модификациями внесенными М.А Туманян и соавторами (Туманян М.А., Кирилличева Г.Б., 1988).

Уровень активности 5'-н в МПЭ оценивался по разности между уровнем активности в опытной и контрольной группах и выражался в абсолютных единицах (мкг фосфора) или в % относительно контроля (контроль принимался за 100%)

Все иммуномодулирующие препараты, представленные в данной работе были исследованы по 5'-нуклеотидазному тесту. Дозы препаратов были отобраны после параллейного изучения доза-эффекта препаратов в 5'-нуклеотидазном тесте и в тесте инфекционного заражения или при введении токсинов.

2.6. Реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Изучение влияния иммуномодулирующих препаратов на пролиферативные процессы в нормальной и стимулированной митогенами культурах клеток селезенки и костного мозга проводили проводили согласно общепринятой методике (Фримель,1987) и микрометодом, разработанным в лаборатории клеточного иммунитета НИИЭМ им Гамалеи РАМН (Методические рекомендации, 1983).

2.7. Метод определение катсхоламннов (адреналин, норадренали, дофамин). Определение катехоламинов проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматография (ВЭЖХ) с электрохимической детекцией согласно общепринятой методике (P. Kissenger, 1978).

Уровень активности показателей катехоламинового обмена оценивалась по разнице между уровнем активности в опытной и контрольной группе и выражался в % относительно контроля. Контроль принимался за 100%.

2.8. Метод определения кортикостерона. Кортикостерон определяли радиоиммунологическим методом (Гончаров Н.П., 1986). Кортизол определяли методом флюорисцентного иммунного анализа (Дельфия) на основе конкурентного взаимодействия между молекулой кортизола иммобилизованного на твердой фазе и меченным европием кортизолом (Езко1а I., Н1асЫо й а1.- 1985).

Активность кортикостерона оценивалась по разнице между уровнем активности в опытной и контрольной группах и выражалась в % относительно контроля(контроль принимался за 100%).

2.9. Стрессорное воздействие. Моделирование Аэ^вЬоск - стресса проводилось сотрудниками ВНИЦ психического здоровья. При моделировании й^Ьоск -стресса использовали камеры производства НТК «Диагностика». Ток на дно камеры подавали по схеме: [(1,5 мА * 5 с, перерыв 5 с)* 25 раз, 30 секунд перерыв]*3 раза - общая продолжительность воздействия - 13 мин.

Иммобилизационный стресс - стрессирование животных осуществляли путем обездвиживания в специальном станке. Время обездвиживания варьировало от 10 до 60 минут.

2.10. Метод определения активности лигандов опнондных рецепторов.

Активность лигандов опиоидных рецепторов проводилась методом радиорецепторного анализа (РРА). (Пшеничкин С.Ф. 1990, Щурин М.Р., Пшеничкин С.Ф., 1992).

В качестве меченных лигандов использовали лиганд ОР р.- типа 3Н-В-Ала2 - МеФен4-Гли(ол)- энкефалин( 'Н- ЯХ 783006 или 3Н -ДАГО) -40 Ки/ммоль и лиганд ОР 5 -типа 0-Ала2-В-Лей5-энкефалин (3Н-ДАДЛЭ)- 40 Ки/ммоль (АтегеЬат, Великобритания).

Уровень активность лигандов опиоидных рецепторов оценивалась по разнице между уровнем активности в опытной и контрольной группе и выражался в % (контроль принимался за 100%).

2.11. Метод определения уровня активности суммарного интерферона в сыворотке кровн. Уровень активности суммарного интерферона определяли в сыворотке крови (Носик и др., 1984, Ершов, 1996), оценивали по разнице между уровнем активности в опытной и контрольной группах и выражали в условных ед. За единицу интерферона принимали величину, обратную конечному

разведению интерферона, при котором наблюдается защита 50% клеток от 100 ЦПД50 тест-вируса.. -

2.12. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «81а1дгарЫсз»

Результаты исследования.

Уровень активности 5'-нуклеотидазы в МПЭ и интегральные показатели оценки действия иммуномодуляторов.

При оценке влияния того или иного агента на показатели НР и иммунитета общепринятым является использование интегральных тестов, позволяющих изучить действие фактора на систему в целом (Петров, 1997).

В настоящем исследовании, при оценке иммуномодулирующего действия препаратов, проводилось параллейное определение активности 5-н в МПЭ и чувствительности мышей инбредных линий к заражению возбудителями различных инфекций, токсическому воздействию. На рис. 1 представлены результаты определения уровня активности 5'-н в МПЭ и чувствительности мышей Р1 к стафилококковой инфекции через 5мин после в/в введения МОП-35. Препарат вводился в дозах 106 и Юмкг. Дозы препарата были отобраны после изучения доза-эффекта МОП-35 в 5-нуклеотидазном тесте. Согласно 5'-н теста препараты, повышающие активность 5'-н в МПЭ относительно контроля обладают иммуносупрессорным действием, а препараты снижающие активность фермента - иммуностимулирующим действием. Поэтому в данном опыте и во всех последующих, при изучении иммуномодулирующего эффекта, нас интересовали изменения направленности уровня изучаемого показателя относительно контроля. Контроль принимался за «0» уровень и относительно контроля представлялись все опытные данные.

Контролем служили мыши, которым вводился физиологический раствор.

еЗ

И о С

с?

и

5

о В

Рис 1 Уровень активности 5-и в МПЭ и чувствительность мышей Р1 (п=10) к стафилококковой инфекции после в/в введения препарата МОП-35 в дозах 10-6 и 10 мкг

Д

60

40 + 20 0 -20 -40 -60 -80

10(-6)

*р<0,05

□ 5-н

Ш "/»гибели

К-уровень контроля, принятый за «0», Д -О-Контр (в %)

Из рисунка видно, что введение МОП-35 в дозе 1С6 мкг приводило к повышению активности 5'-н в МПЭ, что сопровождалось повышением чувствительности мышей к стафилококковой инфекции, введение ИМ в дозе Юмкг, наоборот, приводило к снижению активности фермента относительно контроля и чувствительности к инфекции.

Эти данные. являются иллюстрацией общей закономерности взаимосвязи между уровнем активности 5'-н в МПЭ и чувствительностью линейных мышей к различным патологическим воздействиям. При оценке иммуномодулирующего эффекта препаратов различной природы и происхождения установлена зависимость между уровнем активности 5'-н в МПЭ и чувствительностью к бактериальным инфекциям (В^оппеи, Б.ЛурЫ.тип., К1.рпеит., 81.аигеиз \Vood-46), действию бактериальных токсинов (Р2 чумного микроба, а-стафилококковый токсин). Показано, что мыши имеющие в момент заражения бактериальными инфекциями или токсинами низкий по сравнению с контролем уровень активности 5'-н в МПЭ были более устойчивы к действию инфекции, токсинов и, наоборот, мыши, имеющие в момент заражения высокий уровень активности 5'-н в МПЭ - менее устойчивы к действию инфекции, токсинов.

Таким образом, при изучении иммуномодулирующей активности препаратов- различной природы и происхождения, было показано, что изменение уровня активности 5'-н в МПЭ является одним из универсальных проявлений иммуномодулирующего эффекта. Полученные экспериментальные данные о прямой зависимости между уровнем активности 5'-н в МПЭ и чувствительностью мышей к бактериальным инфекциям и действию бактериальных токсинов различной этиологии и патогенеза позволяют предположить, что уровень активности 5'-н в МПЭ является фактором неспецифической резистентности организма.

Изучение активности 5'-нуклеотндазы в МПЭ и показателен ненроэндокршшой системы организма при иммуномодулирующих воздействиях.

Важную роль в регуляции неспецифической резистентности организма играет нейроэндокринная система (Панин, 1983, ОоЬЬб, 1996). Поэтому на следующем этапе нашего исследования мы сочли необходимым изучить взаимосвязь между уровнем активности 5'-н в МПЭ и показателями 3-х основных звеньев нейроэндокринной модуляции иммунологических процессов:, глюкокортикоидного, катехоламинового и эндорфинного после введения различных ИМ и стрессорного воздействия.

Для того, чтобы конкретизировать взаимосвязь между показателями н-э и иммунной системы при иммуномодулирующих воздействиях была произведена оценка направленности изменений изучаемых показателей у мышей СВА и С57В1/6-ЛИНИЙ мышей с генетически детерминироваными четкими различиями в- активности показателей иммунной и н-э систем. -

Результаты проведенного исследования позволили установить коррелятивные связи между активностью 5'-н в МПЭ и уровнем эндогенного кортикостерона после п/к введения различных иммуномодуляторов - сальмозан, СЭ. (рис. 2).

£ а

>Л

¡2 и

Рис 2 Динамика изменения активности 5м1 в МПЭ н кортнкостерона в крови после п/к введения сальмозана(С) в дозе ЮОмкг и стафилококкового эитеротоксииа(СЭ) в дозе 1мкг мышам линий СВА и С57В1/6.

Л

- 500

время,прошед. после введен.

препаратов (в часах) *р<0,05

—■—5-н

■■<•• ■ кортизол

К-уровень контроля,принятый за «0», А -О-Контр (в %),

Ы-коэфф.корреляции.

Из рисунка видно, что у мышей СВА при введении сальмозана и СЭ корелляционная связь между исследуемыми показателями носила прямой, а у С57В1/6-обратный характер.

Корреляционная зависимость между уровнем активности 5'-н в МПЭ и кортикостероном у мышей этих линий установлена также при введении Т-активина, стрессировании животных футшок-стрессом.

Работами последних лет доказано несомненное участие в реализации иммуномодулирующих воздействий опиоидных пептидов (Зозуля, 1990, Кост, 1994). На рисЗ представлены результаты изучения иммуномодули-рующей активности сальмозана по изменению уровня активности 5'-н и активности лигандов опиоидных рецепторов 6 -типа и ц -типа. В ходе исследования установлена корреляционная связь между уровнем активности 5'-н в МПЭ и активностью лигандов опиоидных рецепторов. У мышей СВА корреляционная связь между исследуемыми показателями носила прямой, а у С57В1/6 обратный характер.

Рис 3. Динамика тменешщ уровня активности 5-и в МГВ и лигавдов 0ПИ01ЩИЫХ рецепторов1?-типа и^-тапа после п/к введения сальмозага в дозе ЮОмкг мышам СБА п С57Ш/6.

СБА

С57В1/6

Д £ -типа ф ул -типа

уЛ^-тип

■ТИГ)5

Я 0,93 Я 0,72

11-0,91

11-0,92

*р< 0,05

время,прошедшее после введения прспарата(в часах)

—— 5-н| - —--ОР1

К-уровень контроля,принятый за «0», А -О-Контр (в %),

Я-коэффициент корреляции.

В ходе проведенных исследований впервые выявлены зависимости между активностью 5'-н МПЭ и уровнем дофамина, адреналина и норадреналина при стрессорном воздействии.

Коэффициент корреляции между уровнем активности 5'-н в МПЭ и различных показателей н-э системы варьировал от 0,7 до 0,98.

Таким образом, при изучении иммуномодуляторов различной природы и происхождения установлена взаимосвязь между уровнем активности 5'-н в МПЭ и различных н-э показателей. Обнаруженная взаимосвязь позволяет сделать предположение, что действие ИМ носит сложный опосредованный характер и объясняется тем, что изменение активности этого фермента отражает изменение н-э статуса организма. Это согласуется с литературными данными о том, что продукт 5'-н реакции аденозин является регулятором уровня цАМФ, который в свою очередь является внутриклеточным посредником действия гормонов на метаболизм клеток (Корнева, 1993).

Изменение активности различных показателей иммунной системы после введении иммуномодуляторов в разное время суток.

Предположение о том, что уровень активности 5'-н в МПЭ отражает изменение н-э статуса организма при введении ИМ, подтверждается также в результатах другой серии экспериментов. Было проведено изучение влияния ИМ на уровень активности 5'-н в МПЭ, уровень активности АТФ-азы в МПЭ, уровень суммарного интерферона крови, пролиферативная активность лимфоцитов) при различных состояниях, сопровождающихся изменением н-э статуса организма. Использовали физиологическую и патологическую модель измененного состояния н-э статуса организма. В качестве патологической модели применяли измененный световой режим. В качестве физиологической модели - определение активности изучаемых показателей в разное время суток. Такой биоритмологический подход имеет и самостоятельное значение для изучения зависимости иммуномодулирующего эффекта от времени введения. Данный подход позволяет определить наиболее подходящее состояние во временной организации биологической системы для получения нужного эффекта от применения препарата (Комаров, 1989).

На рис 4 представлены результаты изучения иммуномодулирующей активности препарата МОП-35 по изменению уровня активности 5'-н в МПЭ мышей линий СВА через 5 мин после в/в введения МОП-35 в 6,12 и 18 часов.

Рис 4. Уровень активности 5-н в МПЭ мышей СВА через 5 мин после в/в введения МОП-35 в дозе Юмкг в разное время суток

тпп Ч_

200 -150 ■ 100 ■

и

Я

12

18

К

-100

•р<0,05

время введения МОП-35

К-уровень контроля, принятый за "0", Л -О-Контр (в %)

Иммуномодулятор вводился в дозе Юмкг. Как видно из рис, введение МОП-35 в разное время приводило- к различному иммуномодулирующему эффекту. В б часов препарат снижал активность 5'-н в МПЭ, в 12 не изменял активность фермента, а при введении ИМ в 18 часов-активность 5'-н значительно превышала уровень контрольных значений.

Особенностью представленных ниже экспериментов по изучению зависимости иммуномодулирующего эффекта от времени воздействия являлось одномоментное, комплексное исследование различных иммунологических показателей в динамике. Были проведены исследования по изучению динамики активности 5'-н, АТФ-азы в МПЭ, суммарного интерферона в сыворотке крови, пролиферативной активности лимфоцитов.

Рис 5. Динамика уровня активности 5-и в МПЭ и спонтанной лролиферации(СП) лимфоцитов в костном мозге после п/к введения амиксина в

400

300

а 200

Л ? 100

е & V « 0

щ -100

-200

-300

дозе 50 мкг

время.прошсдшес после введения

а м нкснпа (в часах) *р<0,05

К-уровень контроля.принятый за «0», Д -О-Контр

На рис. 5 представлены результаты изменения активности 5'-н в МПЭ и спонтанной пролиферации лимфоцитов в костном мозге после подкожного введения амиксина в утреннее и вечернее время. Эксперимент проводился на мышах линии Ва1Ь/С. Амиксин вводили подкожно в дозе 50 мкг в утреннее

(6 ч.) и вечернее время (18 ч.). Через 3, 12, и 24 ч после введения препарата, определяли активность изучаемых показателей.

Как видно из рисунка, динамика изменения уровня активности 5'-н в МПЭ после утреннего введения амиксина существенно отличается от динамики активности фермента после вечернего введения препарата.

Направленность изменения активности спонтанной пролиферации лимфоцитов в костном мозге являлась зеркальным отражением линии, характеризующей изменение уровня активности 5'-н в МПЭ. Подобные закономерности наблюдались как после утреннего так и после вечернего введения амиксина.

В результате проведенного эксперимента выявлена корреляционная зависимость между спонтанной пролиферацией лимфоцитов в костном мозге и уровнем активности 5'-н в МПЭ. Корреляционная связь между исследуемыми показателями прослеживалась как после утреннего, так и после вечернего введения амиксина. Коэффициент корреляции между исследуемыми показателями утром (-0,95), вечером - (-0,9).

Таким образом, при изучении иммуномодулирующего действия препарата амиксина на уровень активности 5'-н в МПЭ и спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов в костном мозге у мышей Ва1Ь/С выявлена зависимость ИМ эффекта от времени введения препарата. Митогениндуцированная пролиферация лимфоцитов также зависела от времени введения амиксина.

На рис. 6 представлена динамика изменения активности 5'-н, АТФ-азы в МПЭ и интерферона в сыворотке крови после подкожного введения сальмозана в 12 и 24 часа. -Сальмозан вводили-в дозе 100 мкг мышам Ва1Ь/С. Активность исследуемых показателей определялась через 6, 12, 18, 24 часа после введения иммуномодулятора.

Анализ результатов, представленных на рисунке показал, что динамика изменения активности исследуемых показателей зависит от времени введения иммуномодулятора. Результаты исследования активности всех изучаемых показателей 5'-н, АТФ-азы, интерферона) в экспериментальных группах.

различающихся временем введения ИМ, не сопоставимы и отличаются друг от друга. Зависимость между активностью исследуемых показателей и временем введения прослеживается во все сроки исследования.

Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем активности 5'-н в МПЭ и суммарного интерферона в сыворотке крови. Корреляционная связь прослеживалась во всех экспериментальных группах, различающихся временем введения препаратов. Коэффициент корреляции

между уровнем активности 5'-н в МПЭ и интерферона в крови при введении сальмозана в 12 часов-(-0,8), при введении в 24 часа-(-0,78).

Таким образом, проведение экспериментов по изучению влияния ИМ на активность различных показателей иммунной системы показало, что иммуномодулирующий эффект зависит от время введения ИМ в течение суток. Применение ИМ в разное время суток приводит к иммуномодулирующему эффекту разной степени выраженности и направленности: от повышения до снижения уровня активности изучаемых показателей относительно контроля. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при исследовании иммуномодулируюшей активности препарата в разное время суток можно получить совершенно различные сведения об активности препарата. Это касается не только различий в количественной оценке иммуномодулируюшей активности препарата, что проявляется в различной степени повышения или снижения изучаемого показателя относительно контрольного уровня, но и различной направленности иммуномодулирующего эффекта (от иммуносупрес-сии до иммуностимуляции).

Чувствительность мышей к бактериальным токсинам так же зависела от времени введения ИМ. На рис 7 представлены результаты влияния сальмозана .на чувствительность мышей Ва1Ь/С к стафилококковому а-токсину через 1 сутки после п/к введения ИМ в 12, 18, 24 и 6 часов утра. Как видно из рис, при введении С в 12 и 24 часа наблюдалось снижение чувствительности мышей к токсину относительно контроля, при введении С в 18 и б ч., наоборот, повышение чувствительности мышей Ва1Ь/С к стафилококковому а-токсину. Иными словами, одним из факторов, влияющих на чувствительность мышей Ва1Ь/С к стафилококовому токсину является время введения иммуномодулятора.

60

40

с

5 20

V©

С 0

-20

-40

Рнс 7. Влияние сальмозана на чувствительность мышей Ва1Ь/С(п = 12) к стафнлококковому -токсину через сутки после п/к введения в дозе ЮОмкг в разное д время суток

24

время введения (в часах)

К-уровень контроля, принятый за «О» Д - О-Контр (в %)

Аналогичная зависимость наблюдалась при изучении влияния препарата РР на чувствительность мышей Ва1Ь/С к чумному токсину.

Таким образом, зависимость иммуномодулирующего эффекта от времени введения установлена при изучении активности различных показателей иммунной системы . (5'-н, АТФ-аза, интерферон, пролиферативная активность лимфоцитов), в том числе включая такие интегральные, как чувствительность к токсическому воздействию, на мышах различных линий при использовании иммуномодуляторов различной природы и происхождения.

Биоритмологический подход к изучению иммуномодулирующего эффекта включает не только изучение зависимости ИМ эффекта от времени применения препарата, но и изучение влияния внешнесредовых факторов, к которым относится световой режим (Комаров, 1989).

Исследования проводились на модели 14-суточного содержания одной группы мышей в условиях круглосуточного освещения другой в условиях круглосуточного затемнения.

На рис. 8 представлены результаты влияния МОП-35 на чувствительность мышей С57В1/6 к стафилококковой инфекции в условиях измененного светового режима. ИМ вводился до помещения мышей в условия измененного светового режима.

20

Рис. 8 Влияние МОП-35 на чувствительность

мышей С57В1/6 (п=12) к стафилококковой инфекции в условиях измененного светового Д режима

- О §

1 -20 * -40 Н -60

□м

□ М+свег

□ М+ночь

К-уровень контроля,принятый за «0» Л -О-Контр (в%)

Как видно из рисунка, измененный световой режим меняет степень выраженности и направленность иммуномодулирующего эффекта. Действие МОП-35 в условиях измененного светового режима приводило к снижению чувствительности мышей к стафилококковой инфекции, в то время как в условиях естественного освещения МОП-35 повышал чувствительность мышей С57В1/6 к стафилококковой инфекции относительно контроля. Результаты изучения иммуномодулирующего эффекта в условиях измененного светового режима являются также доказательством зависимости ИМ эффекта от состояния н-э системы.

Изучение ИМ эффекта в условиях измененного светового режима имеет большое практическое значение. При использовании иммуномодуляторов в практическом здравоохранении, следует с особой осторожностью назначать их людям, переезжающим из одного часового пояса в другой,или работающим в условиях полярной ночи или дня.

Таким образом, в результате проведенного исследования была установлена зависимость иммуномодулирующего эффекта от состояния нейро-эндокринного статуса организма. Изменение состояния нейро-эндокринного статуса организма (изучение ИМ эффекта в разнос время суток, варьирование светового режима) приводило к изменению выраженности и направленности иммуномодулирующего эффекта.

В результате исследования установлены корреляционные взаимосвязи между уровнем активности 5'-н в МПЭ с уровнем показателей и-э системы с одной стороны, и с различными иммунологическими показателями с другой стороны. Это позволяет предположить, что аденозиновая система макрофагов и в частности фермент 5'-н, имеет важное значение в реализации двусторонних связей между иммунной и нейроэндокринной системами. Данное положение достаточно полно вписывается в современные представления о структуре и функции 5'-нуклеотидазы, ее роли в регуляции внеклеточного и внутриклеточного уровня аденозина (Дмитриенко, 1991). Последний, как известно, является одним из основных регуляторов важнейших физиологических процессов, в том числе иммунологических (Елисеев, 1991).

ВЫВОДЫ

1. Изменение уровня активности 5'-н в МПЭ является одним из универсальных проявлений иммуномодулирующего эффекта.

2. При иммуномодулирующих воздействиях выявлена прямая зависимость между уровнем активности 5'-нуклеотидазы в МПЭ и чувствительностью мышей к заражению Kl.pneum., S.sonnei, Staph.aureus Wood-46, S.thyphi muri, действию бактериальных токсинов- чумного микроба, u-стафплококкового токсина.

3. В условиях иммуномодулирующего воздействия выявлены корреляционные связи и между активностью 5'-и в МПЭ и показателей нейроэндокринной системы:уровнем активности кортикостерона крови, активностью лигандов опиоидных рецепторов 5 - типа и ц -типа, уровнем активности дофамина, адреналина, норадреналина в крови

4. Выявлены межлинейные различия в характере корреляционной связи между активностью 5'-н в МПЭ и показателями нейроэндокринной системы (кортикостерон, активность лигандов опиоидных рецепторов, показатели катехоламинового обмена).

5. Установлено, что влияние иммуномодуляторов на уровень активности 5'-н. АТФ-азы в МПЭ, интерферона, пролиферативной активности лимфоцитов селезенки и костного мозга, чувствительность к бактериальным инфекциям и токсинам зависит от времени введения ИМ в течение суток.

6. Варьирование светового режима приводило к изменению выраженности и направленности ИМ эффекта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кирилличева Г.Б., Батурина И.Г., Митькин В.В., Соловьева М. С., СухихГ.Т. Особенности влияния Т-активина на активность 5'-нуклеотидазы макрофагов и уровень кортизола крови в зависимости от времени суток// Бюлл.экспер.биолог. и медицины,- 1993.- Т. 115.- № 5.- С. 519-521.

2. Кирилличева Г.Б., Гончаров H.H., Батурина И.Г. и др. Влияние измененного светового режима на характер иммуномодулирующего эффекта металлорганического соединения МОП-35. // Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии: Тезисы докладов,- Томск.- 1992,- Т.1. - С. 58-60.

3. Кирилличева Г.Б., Гончаров Н.П., Батурина И.Г., Митькин В.В., Соловьева М.С., Крилин В.В., Сухих Г.Т. Фагоцитирующие клетки и нейроэндокринное звено регуляции иммунитета при иммуномодулирующих воздействиях. // Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии: Тезисы докладов. -Томск. -1992. -Т. 1. -С. 55-58.

4. Кирилличева Г.Б., ЕзепчукЮ.В., Соловьева М.С. и др. Иммуномодулн-рующие свойства стафилококкового энтеротоксина А. // 2-я Всесоюзная конференция «Бактериальные'токсины»: Тезисы докладов. -Юрмала. -1989.- С. 52.

5. Кирилличева Г.Б., Пронин A.B., Гончаров H.H., Соловьева М.С. и dpi. Взаимосвязь активности 5 '-нуклеотидазы макрофагов с показателями иммунной и нейроэндокринной систем. // Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. -1992. -С. 210-211

6. Кирилличева Г.Б., Соловьева М.С., Батурина И.Г., Туманян М.А. Способ первичного отбора иммуномодуляторов по уровню активности 5'-нуклеотидазы макрофагов перитонеалыюго экссудата. // Бюллет.экспер.биолог. и медицины.-1993. -Т. 115. -№ 6. -С. 642-646. 2.3.

7. Кирилличева Г.Б., Соловьева М.С. и др. Ферменты пуринового метаболизма макрофагов как показатель естественной резистентности организма. // 17-й Съезд Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова: Тезисы докладов. -Алма-Ата. -1989. -

С. 57.