Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Развитие различных форм иммунного ответа и его фармакологическая коррекция при физических нагрузках

ЛШНКСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОЛ1ЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи ЛАСКОВА Инна Леонидовна

РАЗВИТИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ИММУННОГО ОТВЕТА И ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ПРИ ФИЗИЧЕСКИХ

НАГРУЗКАХ

14. 00. 36— аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-1995

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете н Россьйсксм государстгеннсм медкш.нском университете

Научные консультанты:

—доктор медицинских наук, профессор Б. С. УТЕШЕВ —доктор медицинских наук, профессор А. И. КОНОПЛЯ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

—доктор биологических наук, профессор В. А. АЛЕШКИН -доктор биологических наук И. Н. ГОЛОВИСТИКОВ доктор медицинских наук, профессор А. В. СЕРГЕЕВ

Ведущее учреждение:

в специализированном совете д Ш1. 11. ио при российском государственно медицинском университете во адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета

—Институт иммунологии Л1инздравме щрома РФ

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук, доцент

Т. Е. КУЗНЕЦОВА

Л4Ю70СОООЭ.29 без объявл. 42В11'3)-9о

О Ласкова И. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛЕОТН

Актуальность темы. Рефляция метаболических прсцесссЕ и Физиологических Функции в покое, при стрессе и в ус.-срнях патологии осуществляется нервной, эндокринной и иммунной система/и. Между ятими системами существуют многочисленные двусторонние связи за счет выделяемых клетками медиатооов и напичия на клетках рецепторов для медиатороз лругих систем /В.В.Абрамов. 1991; А.А.Михайлова, 1992: Н.Ю.Громнхинн и пр., 1993/. Исменение баланса Функций тр°х регулирующих систем при стрессе приводит к возникновению состояния неустойчивого го-меостааа.

Причинами нарушения иммунологических реакций органипма при стрессе являются сложные гуморальные перестройки, включающие изменение биосинтеза, выделения и продолжительности циркуляции нейромедиаторов, гормонов и медиаторов иммунной системы. При различных формах стресса увеличивается интенсивность свободнорадикгшьных процессов, ■ ускоряется перекисное окисление липилов'клеточных мембрач, повышается их проницаемость, наблюдается выход Б сосудистое русло и образование в нем различии* соединений (протеаз. антипротеолитических белков, липонротеидов низкой и очень низкой плотности, гликоза-мпногликанои и протеоглкканов!. обладающих иммуносупрессорны-ми свойствами /Л-.Г,Прокопенко, Т. А.Чаши, 1988: Р.СЬк^ап , 1980; Ь. СигиеБ е.а. 1980: М. Ака^иКа е. а., 1993/. Роль седого из этих соединений в рагнитиц иммуносупрессии. а тагае их взаимосвязь на уровне синтеза, секреции и реализации иммуно-

- О -

модулирующего остаются практически неизученными.

Естественным и древнейшим стрессорным агентом является физическая нагрузка. Она обусловлена вемной гравитацией и по-отсму действует на живые организмы на всем протяжении их филогенетического и онтогенетического развития. Интенсивная фи-аическая нагрузка в настоящее Еремя рассматривается как идеальная модель дли изучения резервных возможностей здорового организма, так как выполнение физических нагрузок высокой интенсивности обусловливает включение или значительное усиление реализации всех механизмов 1В том числе и иммунологических) адалтаини организма к изменяющимся условиям существования /Р.С.Суздашшцкий и др., 1990/.

Множественность регистрируемых нарушений -во всех звеььях ' иммунной системы, а также выраженные нарушения нейроэндокрин-ной регуляции и глубокие метаболические сдвиги, сопровождающееся дисбалансом иммунорегуляторных функшй, обусловливают необходимость иммунокоррекции при интенсивных фйэических натру йках. При вторичных иммунодефиците«, возникающих после интенсивных физических нагрузок, предпочтительной является экс' траиммуниая коррекция, направленная на иаменение химического состава среди без прямого действия на быстропролифюрирующие иммунокомпетелтные клетки.

Цель исследования: выяснение метаболических механизмов иммуносупре^сии, а также эффективности иммуномодулируюшего действия стабилизаторов клеточных мембран и энергизаторов клеток при физических нагрузках..

Задачи исследования:

1/ изучение-развития гуморального иммунного ответа и ги-иерчуьствительности вамедденного типа при физических нагруа-

ках, выполняемых в различных режимах;

2/ выяснение роли сывороточных субстанций, эритроцитов и цитокинов в развитии иммуносупрессии при физических нагрузках;

3/ изучение иммуномодулирующей активности стабилизаторов' клеточных мембран и знергизирующих препаратов при физических нагрузках;

4/ выяснение иммуномодулирукщей эффективности экстракорпорально модифицированных эритроцитов при физических нагрузках;

5/ выяснение роли эритроцитов и цитокинов в реализации иммуномодулирующего действия стабилизаторов клеточных мембран и знергизирующих препаратов;

6/ изучение зависимости между иммунологической реактивность» и физической работоспособностью при физических нагрузках и применении иммуномодулирующих препаратов;

7/ сравнительная оценка эффективности применения 1»муко-модулируюпзк соединений, модифицированных ими эритроцитов и выделяющихся под их влиянием цитокинов в качестве средств повышения иммунологической реактивности и физической работоспо- » собности при физических нагрузках. ' .

Новые положения, выносимые на защиту:

V снижение иммунологической реактивности организма в от-ноаенин Т-зависимых и Т-невавискмых антигенов при интенсивных физических нагрузках в значительной степени обусловлено легкими эритроцитами и выделяющимися под их влиянием цитокинами • спленоцитов; *

2/ стабилизаторы . клеточных мембран и эяергизнрувщие препараты являются иммуномодуляторами при физических нагрузках; эффект этих соединений в определенной степени обусловлен ог-

раничением или полным прекращением поступления в сосудистое русло иммуносупрессирующих субстанций, повышением резистентности легких эритроцитов к действию этих субстанций или индукцией иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов;

3/ стабилизаторы клеточных мембран и энергизаторы клеток повышают физическую работоспособность организма в покое и ' после интенсивных физических нагрузок; актопротекторный эффект некоторых из этих соединений связан с их иммуномодулиру-ющим действием;

4/ тяжелые эритроциты, интра- и экстракорпорально модифицированные эссенциале, индуцируют выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки факторов, усиливающих развитие различных форм иммунного ответа и повышающих физическую работоспособность при физических нагрузках.

Практическая значимость работы:

Экспериментально обоснована перспективность применения эссенциале, модифицированных им эритроцитов, тЬкоферола ацетата, лидокаина, рибоксина и милдроната в сочетании с глюкозой и бенфотиамином в качестве средств иммунокоррекции при 'интенсивных физических нагрузках; обоснована перспективность применения эссенциале и модифицированных им эритроцитов для повышения физической работоспособности. Предложен способ повышения физической работоспособности.

эритроцитов и медиаторов иммунного ответа, выделяемых клетками лимфатических узлов и селезенки в развитии иммуносупрессии

1ы и углублены существующие представления о роли

и реализации иммуномодулирующего действия стабилизаторов клеточных мембран и знергизирующих препаратов. • Обоснована перспективность дальнейшего изучения взаи-

- б -

мосвязи между выделением и функцией медиаторов имотнного ответа. выделяемых клетками лимфатических узлов и селезенки при состояниях напряжения и применении метаболических иммуномоду-ляторов, влияния полиненасшенных фосфолипидов и других ли-потропных соединений на Физико-химические свойства мембраны эритроцитов при состояниях напряжения, клеточных и молекулярных механизмов индуцирующего влияния модифицированных химическими агентами эритроцитов на выделение клетками лимфоидных органов медиаторов иммунного ответа.

Апробация работы. Основние положения диссертации обсукде-кы на научных конференциях Курского медицинского института /1990, 1991/, презентации Курского отделения РАЕН /1992/, Курского городского общества по спортивной медицине /1991/, Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" /Ростов-на-Дону, 1989/, Всесоюзной конференции молодых ученых по экспериментальной и прикладной иммунологии /Москва, 1989/, 1 Всесоюзном съезде иммунологов /Дагомыс, 1989/, Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" /Москва, 1991/, 1 съезде иммунологов России /Новосибирск, 1992/. Международном -конгрессе по иммунореабилитации /Даго- • мыс, 1994/. ■ •

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 18 научных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из "Введения", 2 глав обзора литературы, 9 глаз собственных исследований, "Заключения". "Выводов", "Списка литературы", включающего 390 источников /237 на русском и 153 на иностранных языках/. Работа изложена на 227 страницах машинописи, содержит 92 таблицы и 4 схемы.

- ? -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты выполнены на крысах Вистар. Физическую нагрузку создавали плаванием при температуре воды 30±2°С. Животные плавали однократно или многократно по 4 ч с грузом, составляющим 3-4 X массы тела (нагрузка высокой интенсивности) или без груза (нагрузка умеренной интенсивности).В крови крыс определяли активность фосфокреатинкиназы, концентрацию глюко-вы и лактата /В.В.Меньшиков, 1S87/, общую нротеолитическую активность /К.Н.Веремеенко и др., 1978/, активность альфа- 1-антипротеаз и альфа-2-макроглобулина /В.Ф.Нартикова, Т.С.Пасхина, 1979/, показатели кислотно-щелочного равновесия, содержание гидроперекисей липидов в сыворотке /В.Б.Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983/, малонового д«альдегида в эритроцитах и интенсивность перекисного гемолиза эритроцитов /В.И..Ее-нисович, Л.И.Идельсон, 1973/. В мембранах эритроцитбв определяли содержание фосфолипидов и холестерина /A.A. Покровский, 1269/.

'Животных иммунизировали эритроцитами барана ОБ) или бактериальным липололисахаридом (ЛПС). Оба антигена вводили внутрибршинно однократно, ЭБ в дозе 10е клеток на 1 кг массы тела, ЛПС - 50 мкг на 1 кг.Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали по количеству антитело- и роаеткооб-разующих клеток (АОК и РОК) в селеаенке. Число АОК к ЭБ определяли методом прямого,а АОК к ЛПС - непрямого локального гемолиза /К.Мальберг,Э.Зигль,1987/, количество иммунных РОК ус- .

танавливали по X.3av3D /1987 Л Для оценки выраженности гипер-чувстЕИтельности замедленного типа сенсибилизирующую дозу ОБ ilO8 на 1 кг массы тела) вводили внутрибргаинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу (10б на 1 кг массы). О выраженности реакции судили по разнице массы и количества кариоцитов регионарных и контрлатеральных лимфатических узлов череп 24 ч после введения разрешающей дозы.

Исследовали и*адуномодулируюйие свойства сыворотки крови и ее хроматограФических Фракций. ' Сыворотку фракционировали на сефапексе G-EOO. Молекулярную массу белков фракций определяли по обьему выхода белков с известной молекулярной массой /А.И.Конопля и др., 1085/. Получали .3 фракции - Фракция I содержала белки с ММ, превышающей '200 КД, фракция 11 '- преиму-31ественно белки с ММ 1-50-160 кД, и фракция Ш - белки с ММ 60-70 кД и меньше, фракцию III после предварительного концентрирования повторно подвергали»фракционированию на сефа-дексе G-75. Выделяли 3 фракции - Фракция I содержала белки с ММ, превышающей 75 кД, фракция 2 - преимущественно белки с КМ 50- 60 кД, и фракция 3 - преимущественно белки с ММ 10-15 кД. йммуномодулируюцую активность сыворотки и ее фракций определяли путем внутрибрющинного введения их по 1 мг на 1 кг массы тела животным, иммунизированным ЭВ или ЛПС. Сыворотки крыс истощали кроличьими антисыворотками, содержащими антитела к альфа-l-антипротеазам, альфа-2-макроглобулину и С1-ингибитору.

Эритроциты крови крыс, ■ выполнявших физическую нагрувку, фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина /Т.В. Кобозев й др., 1978/. Выделяли 3 фракции: легкие эритроциты (меньше 1,079 г/см3), промежуточные клетки (1,091-1,105' г/см3) и тяжелые эритроциты (более 1,117 г/см3). Эритроциты

- У -

экстракорпорально обрабатывали сывороткой крови или ее фракциями. С этой целью 108 клеток инкубировали в течение 1 ч в 1 мл сыворотки или фракции, содержавшей 200 мкг белка. Иммуно-модулирующую активность эритроцитов или их фракций определяли путем внутрибрюшинного введения 10° клеток на 1 кг массы тела.

Клетки селезенки и лимфатических узлов фракционировали по способности прилипать к стеклу /П.Д.Дерфлинг, З.Вихнер, 1987/. В некоторых опытах фракционирование проводили при различных температурах /С.В.Родионов и др, 1985/. Выделяли клетки, прилипающие при температуре 4, 10, 22, 28, 32 и 3?°С. Прилипающие и неприлипающие клетки инкубировали в среде 199 в течение 4-6 ч при температуре 3?°С. Сулернатангы прилипающих и неприлипающих клеток селезенки (СПКС и СНКС) фракционировали на сефадексе G-150, при этом получали 3 фракции.- фракция 1 содержала белки с ММ, превышающей 150 кД, фракция 11 - преимущественно белки с ММ 50-60 кД и фракция 111-- преимущественно белки с ММ 10-15 кД. Супернатанты клеток лимфатических . узлов фракционировали на сефадексе 6-50, выделяли 3 фракции -"фракция 1 с ММ, превышающей 50 кД, фракция II - преимущественно белки с ММ 20-30 кДи фракция 111 - преимущественно белки с Ш 10 кД и меньше. Концентрацию бедка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Брэдфорду. Иммуномоду-лирующую активность супернатантов и их фракций определяли путем внутрибрюшинного введения их в обьеме, содержащем 2 или 5 иг на 1 кг массы тела животных, иммунизированиях ЭБ шш'ЛПС. К белкам спланоцитов плававших крыс получали кроличью антисы-юротку /А.И.Конопля и Л.Г.Прокопенко, 1988/. Антисыворотку ксяользовали'для истощения сыворотки, а также супернатантов

клеток селезенки и лимфатических уэлоз плаЕаэгаих крыс. Исследовали влияние антисыворотки на развитие иммунного ответа у плававших и неплававтих крыс. Часть антисыворотки перед, экспериментом истощали белками инкубатов селезенки плававши* и неплававших крыс.

Исследовали иммуномодулирующуя активность препаратов, оказывавших влияние на состояние клеточных мембран и улучшающих энергообеспечение клеток животных,, выполнявших интенсивную физическую нагрузку. Животным вводили эссенциале, токоферола ацетат, лидокаин, пираиетам, рибоксин, милдронат, бечфо-тиамин я глюкозу. Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д.Машковского "Лекарственные средства" и аннотациям к использованию препаратов. Выбор разовых доз основывался на экспериментальных данных, приведенных в литературе о влиянии препаратов на состояние мембран клеток. Схемы введения препаратов определялись задачами эксперимента.

■ Результаты экспериментов подвергали статистической обработке. Вычисляли средние арифметические и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величия оценивали ■ с помощью критериев Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Развитие иммуносупрессии при однократных физических нагрузках.

Плавание' в течение 30 мин или 1 ч с грузом вызывает нерезко выраженное, но статистически существенное увеличение ' активности фосфокреаткикиназы, 2- или 4-часовое плавание при-

- и -

ьодит к значительному увеличению активности этого фермента в крови. Плавание и течение 30 мин или 1 ч вызывает увеличение концентрации глюкозы в крови, у крыс, плававших в течение 2 или 4 ч, концентрация глюкозы находится на уровне нижней границы нормы или становится несколько ниже ее. Через 2 и 4 ч после начала плавания в крови крыс увеличивается концентрация лактата. Через 30 мин после начала плавания протеолитическая активность крови была существенно повышена, через 1 ч она воввращалась к исходному уровню, а через 2 и 4 ч была ниже последнего. Активность альфа-1-антииротеаэ и альфа-2-макроглобулина после 30-минутного плавания не отличалась от нормы, а в последующие сроки была существенно повышена.

Плавание в течение 30 мин стимулирует развитие ГИО, но.не влияет на выраженность ГЗТ, индуцированных ЭБ. После плавания в течение 1 ч интенсивность ГИО не отличалась от -исходного уровня, 'а выреденность ГЗТ была существенно ниже уровня контроля. Плавание в течение 2 или 4 ч угнетало развитие ГИО и ГЗТ. Сыворотка крови крыс, плававших в течение 30 мин, облада-. ет иммуностимулирующей активностью. После 4-часового плавания "•сыворотка крови приобретает выраженные иммуносупрессируюшие свойства. При последовательной хроматографии сыворотки крови' на сефадексе 6-200, а ее фракции III на сефадексе В-75 стиму-лирукщий фактор выделяется»в составе фракции, основную массу которой составляют белки с ММ 10-15 кД, а супрессирукщий фактор - в составе фракции, содержащей белки с ММ более 200 кД и фракции, основная масса белков которой имеет ММ 50-60 кД.

Введение интактным животным эритроцитов крыс, плававших 30 мин или 1 ч,.стимулирует развитие у них ГИО и ГЗТ, индуцированные ЭБ.'Эритроциты крыс, плававших 2 или 4 ч супрессиру-

- IS -

ют развитие ГКО и ГЭТ. Иммуностимуд/фугщий эффект е«энвайт тяжелые (более 1,11? г/см3) эритроциты, иммунесупресскруш>?ми свойствами обладает легкие (менее 1,079 г/смэ) клетки.

Супернатачти прилипающих к стеклу клеток селезенки крыс, плакавших 30 мин или 1 ч, обладают иммуносткмулиоуггстей активностью, после плавания в течение 2'или 4 ч супернатантм приобретают шлг/носупрессируюаие свойства. При хроматографии су-пернатанта спленоцнтов на сефадексе G-150 иммуносупрессирую-едя активность обнаружена в составе фракции, основную массу белков которой составляют белки с Ш 50-60 кД. После плавания в течение 1, 2 или 4 ч в супернатантах прилипакаих к стеклу клеток лимфатических узлов обнаружен фактор, супрессйруюздй развитие иммунного ответа на ЭВ при аллогенном переносе. Хроматография супернатзнтоз на сефадексе G-50 позволила выявить супрессирующую активность s составе фракции, основную мадсу белков которой составляли белки с Ш 20-30 кД. Рееультаты этих исследований дают основание считать, что ранпяя реакция на физическую нагрузку высокой интенсивности характеризуется накоплением в крови тмуност»о*улируюа?их субстанция, появление яммуностимулирущих свойств у тяжелых эритроцитов, наделение» хелперного фактора, прилипающими к стеклу клетками сеяевенки и супрессирующего иитокина клетлчми лимфатических углов. Более поздней реакцией на физическую нагрузку является накопление в крови кммукосупрессирующих субстанций, появление вимунасуп-рессируюша свойств у легких, эритроцитов, выделение супресси-руюэдх медиаторов прилипаицкми к стеклу сплероцятакн.

Иммуносулрессирутоая активность сывороток крови, полученных через 2 ч после начала плавания, исчезала после истощения их кроличьей сывороткой, содержащей антитела к ал>Фа-2-мак-

роглобулину, и ослабевала после истощения сывороткой, содержащей антитела к альфа-1-антипротеаэам. Это позволяет считать, что через 2 ч после начала физической нагрузки иммуно-супрессирующая активность сыворотки крови обусловлена повышением содержания в ней альфа-2-макроглобулина и альфа-1-антип-ротеаз. Сыворотка крови, полученная после 2-часового плавания, не индуцирует появления иммуномодулирующих свойств у эритроцитов интактных крыс. Через 4 ч после начала плавания сыворотка крови приобретает свойство индуцировать появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов интактных животных. После истощения 4-часовой сыворотки антисыворотками к альфа-1-антипротеазам и альфа-2-макроглобулину ее иммуно-супрессирующая активность снижалась, но не исчезала полностью, а свойство индуцировать появление иммуносупрессирую-щей активности у эритроцитов сохранялось. Это свидетельствует о том, что после 4-часовой нагрузки иммуносупрессируюшая активность 'сыворотки определяется как аитипротеолитическими белками, так и другими соединениями, индуцирующими появление ' • у легких эритроцитов свойства супрессироьать развитие иммун-''«ого ответа на ЭБ. Легкие эритроциты крыс, плававших в течение 4ч, а также эритроциты интактных животных, обработанных1 сывороткой плававших животных, индуцируют выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки иммуносупрессирующего фактора. Следовательно, звенья триады сывороточные субстанции, легкие эритроциты, цитокины спленоцитов являются взаимосвязанными.

Б поддержании иммунного гомеостаза при действии на- организм стресс- индуцируших агентов важную роль играет соотношение антигенн'еспецифической и антигенспецифической форм "суи-

рессии /А.Бастик и др.. 1983/. Исследована выраженность иммунного ответа на Т-зависимый и Т-независимый антигены-у иммунизированных (10е клеток) и гипериммунизированных (5х108 клеток) ЭБ животных, выполнявших Физическую нагрузку (плавание с грузом 3-4 X массы тела). После 2-часового плавания выраженность иммунного ответа на ЭБ V гипериммунизированных крыс была сушестгенно ниже, чем у иммунизированных. Выраженность иммунного ответа на ЛПС у иммунизированных и гипериммунизированных крыс была одинаковой и не отличалась от контроля. Эти результаты дают основание считать, что после 2-часо-всй нагрузки наблюдалось угнетение иммунного ответа на ЭБ, которое у гипериммунизированных животных было более выражен-нш, чем у иммунизированных после 4-часового плавания. Угнетение иммунного ответа на ЛИС у иммунизированных и гипериммунизированных крыс было одинаковым. Это свидетельствует о том, что наряду с антигенспецифическсй развивается ангигеннеспеци-фическая супрессия, обусловленная вызываемыми нагрузкой ней-рогормональннми и метаболическими сдвигами.

Исследование иммуномодулирующей активности супернатантов прилипающих и неприлипающих к стеклу клеток селезенки (СПКС "и. СПКС) иммунизированных и гипериммунизированных крыс, плававших в течение 2 или 4 ч, показало, что аятигенспецифический фактор выделяют неприлипающие, а антигеннеспецифический -прилипающие к стеклу.клетки селезенки. Изучено влияние СНКС гипериммунизированных крыс, . плававших 2 ч (содержащего анти-генспецифический супрессируюпшй фактор), и СПКС иммунизированных крыс, плававших 4 ч (содержащего антигеннеспецифический супрессируюдий фактор) на, развитие иммунного ответа у ■ крыс, плававших 1ч, и на иммуномодулирутацие свойства супер-

натантоб спленоцитов этих животных. Установлено, что анти-генспецифический супрессирующий фактор не влияет на выделение антигеннеспеиифического фактора, а последний усиливает выделение антигенспецифического фактора спленоцитами плававших крыс.

2. Развитие иммуносупрессии при многократных физических нагрузках.

В производственных условиях, при занятиях физической культурой и спортом, а также в Сыту наиболее частым является выполнение физических нагрузок по 3-6 ч в день в течение нескольких дней подряд. Учитывая это. било изучено развитие иммуносупрессии при 5- и 30-кратном плавании по 4 ч с интервалом 20 ч (5-кратное плавание с грузом 3-4 X массы тола. ЭО-кратное плавание без груза). Выраженность угнетения ГИО и ГЗТ при 5- и 30-кратной нагрузке была примерно одинаковой. Сыворотка крови животных обеих групп обладала супрессирующей активностью, которая не исчезала после истощения сыворотками, содержадам антитела к апьфа-1-антипротеазам, альфа-2-макрог-добулину и *С1-ингибитору. Иммуносупрессирующей активностью у * 5-кратно плававших крыс обладала фракция, содержащая белки с. Ш, превышающей 200 кД и фракция, основную массу которой сос-' тавляли белки с ММ 60-70 кД и ниже. У 30-кратно плававших крыс сулрессирующими свойствами обладала кроме того фракция, в состав которой входили белки с ММ 10-15 кД и меньше.

. Эритроциты многократно плававших крыс при аллогенном переносе супрессируюг развитие иммунного ответа на ЭБ. Эритроциты интактных крыс приобретают иммуносупрессирующие свойства после инкубации, с высокомолекулярными фракциями сыворотки крЬви многократно плававших крыс. Исследование иммуномодули-

рутсших свойств супернатанта сплеконитов 5-кратно плававших животных показало, что супрессирующей активностью обладает фракция, содержащая белки с ММ 50-60 кД. У 30-кратно плавав-иих крыс иммунссупрессирушая активность выявлена во фракциях, основную массу которых составляли белки с Ш 50-60 кЛ И 10-15 кД.

Для решения вопроса о происхождении низкомолекулярного ¡'ммуносупрессируюяего фактора использовали кроличью сыворотку, содержавшую антитела против нммуносудрессирующего фактора суперпатанта прилипающих клеток селезенки плававших крыс. Ан-тксыворотка инактивировала фракции сыворотки многократно пла-ваг.ких крыс, содержащие белки с Ш 50-60 и 10-15 кЛ, но не влияла на активность фракции, в'состав которой входили белки с ММ, превышавшей 200 кД. На основании проведенных экспериментов' можно сделать следующие заключения:

1/ иммуносунрессирущие факторы, выявляющиеся в составе Фракций супернатантов прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих белки с ММ 50-60 кД и 10-15 кД, близки ло антигенным свойствам; не исключено, что фактор, ассоциированный с низкомалекулярными бейками супернатанта, является субьединицей фактора, выделяющегося с белками, имеющими более высокую ММ;

2/ иммуносупрессирующие факторы сыворотки крови, выделяющиеся в составе фракций, основная масса которых представлена белками с ММ 50-60 кД и 10-15 кД, представляют собой проникающие в сосудистое русло медиаторы иммунного ответа, образующиеся прилипающими к стеклу клетками селезенки;

3/ иммуносупрессирующая активность высокомолекулярной • фракции сыворотки крови многократно плававсих крыс обусловле-

на субстанциями, отличающимися по антигенным свойствам от в'

аналогичных по функциональной активности факторов спленоци-тов; вероятно, эти субстанции являются соединениями, проникающими в сосудистое русло из клеток интенсивно функционирующих органов.

Данные об иммуномодулируювдх факторах сыворотки крови и супернатантов клеток лимфоидных органов суммированы в таблице 1.

3. Иммуномодулирующее действие- зссенциале при физических нагрузках.

Угнетение функций иммунной системы является одной из причин возникновения инфекционных заболеваний, воспалительных и "дистрофических заболеваний миокарда, легких, поджелудочной железы, почек, суставов и сосудов после интенсивных физических нагрузок /А.Г.Дембо, 1984; В.А.Левандо, 1986/. Ведущую роль в механизме угнетения функций иммунной системы при физических нагрузках играет нарушение структурной целостности мембран иммунекомпетентных клеток и их клеточного окружения. Учитывая это, большой интерес представляет изучение иммуномо-дулирующего действия соединений, обладающих выраженными мемб-раностабилиэнрующнми свойствами. К числу таких соединений от-' носятся полиненасыщенные фосфолипиды /А.Д.Гордиенко, 1992; W.K.Linger е.а., 1992/.

Крисам родили зссенциале, 90 X активных соединений которого составляют полиненасыщенные фосфолипиды сои. Исследовано влияние зссенциале на1 развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ, у крыс, находящихся в состоянии покоя и выполняющих физическую нагрузку., а также роль эритроцитов и медиаторов иммунного ответа,' выделяемых клетками селезенки в реализации иыму-

ТАБЛИЦА 1.

Иммуномодулирующие факторы сывооотки крови и суперкатацтов меток лимФоидных органов крыс, выполнявших физическую нагруаку

Биологический объект

Функциональная характеристика

Ш, кД

Время появления

Антигенное сходство с факторами спленоиитов

Сыворотка•крови

Супернатант прилипающих клеток лимфатических узлов

Супернатант прилипающих клеток селезенки

Стимулирующий фактор

Супресс ирующий фактор

Супрессирующий фактор

Супрессирующий фактор

Супрессирующий фактор

Супрессирующий фактор ,

Супрессирующий фактор

10-15 Через 30 мин.после начала нагрузки

> 200 Через 1 час после начала нагрузки

50-60 Через 2 часа после начала нагрузки

10-15 После многократной нагрузки

20-30 Через 1 час после начала нагрузки

50-60 Через 2 часа после начала нагрузки

10-15 После многократней нагрузки

Не выявляли Не выявлено

Выявлено антигенное сходство

Выявлено антигенное сходство

Выявлено антигенное сходство

выявлено антигенное сходство двух спле-ноцитарных факторов

ноиодулпрующего действия эссенциале. Физическую нагрузку создавали 5- и 30-кратным плаванием. Эссенциале вводили внутривенно 5-кратно с интервалом 24 ч, разовая доза препарата в пересчете на фосфолипиды равнялась 2 или 10 мг на 1 кг массы тела. Установлено, что введение эссенциале неплававшим животным стимулировало развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ. Тяжелые эритроциты неплаьавших крыс, получавших иньекции эссенциале, обладают иммуностимулирующими свойствами, при инкубации со спленоцита-ми интактных крыс они индуцировали выделение иммуностимулиру-. ющего фактора прилипающими к стеклу клетками селезенки. Су-пернатант этих клеток при введении аллогенным животным стиму-лирокал развитие ГИО и ГЗТ' на ЗБ, иммунологически активной была фракция, содержащая белки с ММ 10-15 кД. Эти результаты свидетельствуют о ьыраженном иммуностимулирующем действии эссенциале, опосредованном тяжелыми эритроцитам»;.

Изучено также влияние эссенциале на раавитие различных форм иммунного ответа при физических нагрузках. Физические нагрузки приводят к повышению активности фосфокреатинкиназы и • содержания "ацилгидроперекисей в крови, содержания малонового *диадьдегида в эритроцитах и степени их перекисного гемолиза. Введение эссенциале плававшим- крысам дозозависимо снижает ак-' тивность фосфокреатинкиназы и содержание ацилгидроиерекисей в крови, а также содержание малонового диальдегида в эритроцитах и степень их перекисного гемолиза. Это позволяет сделать вцвод о стабилизирующем влиянии эссенциале на мембраны миоци-тов и эритроцитов при физической нагрузке. Инъекции 5-кратно плававшим крысам 20 мг препарата усиливает, а 100 мг - нормализует развитиеЛ'ИО. на ЗВ. Аналогично изменялась выраженность кадуцироьанной ЗБ ГЗТ. Введение 20 мг эссенциале ЗО-'кратно

- 20 - . . плававшим животным не оказывало влияния на развитие обеих форм иммунного ответа, а инъекции 100 мг препарата усиливало развитие ГИО и ГОТ на ЭБ.

Сыворотка крови 5-кратно плававших крыс, получавших эс-сенциале, была иммунологически неактивной. Легкие эритроциты таких животных не обладали иммунссупрессорными свойствами, а тяжелые эритроциты вызывали иммуностимулирующий эффект при аллогенном переносе. После 5-кратного плавания не происходит существенного изменения содержания фосфолипидов и холестерина а мембранах различных по плотности эритроцитов. Введение плававшим крысам эссенциале не влияло на соотношение этих соединений в мембранах легких и промежуточных по плотности эритроцитов, но существенно снижало его в мембране тяжелых клеток за счет повышения содержания в них фосфолипидов. Супернатант прилипающих спленоцитов плававших и получавших эссенциале крыс не содержал иммуносупрессирующего фактора, но при аллогенном переносе стимулировал развитие иммунного ответа на ЭВ. Иммунологически активной была фракция супернатанта, содержащая белки с ММ 10-15 кД. Таким образом, внутривенное введение эссенциале плававшим- животным блокирует иммуносупрессорные эффекты, вызываемые физической нагрузкой и вместе с тем индуцирует возникновение иммуностимулирующих эффектов, аналогичных тем, которые имеют место в организме, не выполнявшем физической нагрузки. Иная картина.наблюдается при введении эссенциале 30-кратно плававшим-крысам. В этом случае высокомолекулярная фракция сыворотки и .легкая фракция эритроцитов' при аллогенном переносе вызывали слабо выраженное угнетение ГИО на ЭБ, а остальные фракции сыворотки и эритроцитов иммуномо-дулиругсаими свойствами не обладали. Фракции И и III суперна-

танта прилипающих к стеклу клеток селезенки 30-кратно плавав-тих крыс, получавших эссенциале, при аллогенном переносе слабо супрессировали развитие ГИО, остальные фракции прилипающих и неприлипаицих. клеток не влияли на развитие ГИО, индуцированного 5Б. Это позволяет считать, что некоторое усиление иммунного ответа, наблюдающееся при иньекции эссенциале 30-кратно плававшим животным, обусловлено стабилизацией клеточных мембран и ослаблением сывороточно-зритроцитарно-спле-ноцитарного звена механизма развития, иммуносупрессии. Вместе с тем после многократного плавания тяжелые эритроциты становятся резистентными к действию эссенциале. Введение этого препарата не индуцирует появления у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств.

В связи с актуальностью поиска иммуномодулирующих препаратов, активных при поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт, изучено влияние эссенциале на развитие иммунного ответа при внутрижелудочном введении. ГТрепарат вводили 5-кратно внутрижелудочно через зонд непосредственно перед • сеансами Плавания. Разовая доза препарата равнялась 100 мг ' или 500 мг на 1 кг массы тела. Бнутрижелудочное введение эссенциале не оказывало влияния на активность фосфокреатинкина-вы плававших крыс, но снижало величину показателей, характеризующих выраженность перекисного окисления липидов. Введение эссенциале кратно плававшим крысам в дозе 100 мг усиливало, а. в дозе' 500 мг нормализовало развитие ГИО на ЗБ. При 30-кратном плавании введение эссенциале в дозе 100 мг не вли-яло#на развитие ГИО, а в дозе 500 мг несколько усиливало выраженность ГИО.-Бнутрижелудочное введение препарата не оказывало влияние на развитие ГЗТ. При внутрижелудочном введении

препарат не влиял на иммуксмодулиругагу» активность Фракций супернатантов прилипающих к стеклу клеток селезенки плававших крыс. Таким образом, иммуностимулирующий .■эффект эссенциале, при внутрилелудочном введении выражен слабее, чем при внутривенных иньекииях. и не опосредуется снвороточно-эритроиитар-но-спленоцитарной триадой.

4. Иммуномодулирующее действие дритроцитсв, экстракорпорально модифицированных эссенциале (ЭМЭ).

Традиционные способы использования лекарственных препаратов, основанные на непосредственном введении их в организм, имеют ряд серьезных недостатков, большой интерес представляет экстракорпоральный принцип применения лекарственных средств /И.С.Гущин. В.П.Лесков, 1967/. При внутривенном' введении эссенциале в крови животных появляются эритроциты, обладающие иммуностимулирующими свойствами. В связи с этим возникло предположение о возможности индуцирования таких свойств у эритроцитов путем прямого действия на них зссенциале вне организма. Проведенные для проверки этого предположения эксперименты показали, что экстракорпоральная обработка эссенциале эритроцитов интактных- крыс индуцирует появление у них иммуностимулирующих свойств. Тяжелая фракция эритроцитов, модифицированных эссенциале (ЭМЭ), при аялогенном переносе стимулирует развитие иммунного ответа на Т-зависимые антигены. Легкие и промежуточные по плотности. ЭМЭ были иммунологически не активными. При инкубации со взвесью прилипающих клеток селезенки интактных крыс ЭМЭ индуцируют или усиливают выделение хелперных факторов. Иммуностимулирующей активностью обладает фракция супернатаята, содержащая, белки с ММ 10-15 кД.

Исследовано также влияние ЭМЭ на развитие иммунного отве-

та при интенсивных физических нагрузках. Установлено, что введение тяжелой фракции ЭМЭ интактннх или 5-кратко плававших крыс 5-кратно плававшим животным усиливало развитие у них ГШ на ЭБ. Супернатант прилипающих клеток плававших и получавших иньекции ЭМЗ крыс содержал иммуносупрессирующий и иммуностимулирующий фактор. Первый обнаруживается во фракции II (белки о ММ 50-60 кЦ), второй - фракции III (белки с ММ 10-15 кД). В связи с этим возник вопрос: выделятся ли разные по функциональной активности факторы одной • субпопуляцией прилипающих клеток, или они являются продуктами разных субпопуляций. Для решения этого вопроса клетки селезенки фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре сре- / ды. Оказалось, что иммуносупрессирующий фактор выделяется \ клетками, прилипающими к стеклу при 4°С и 10°С, а иммуности-/ мулирующий фактор - клетками, прилипающими при 32°С-и 3?°С. |

Изучено влияние выявленных факторов на эффект, вызываемый-, другим фактором. Проведено два варианта экспериментов: в пер- ^ вом плававшим крысам вводили фракцию супернатанта, содержащую • иммуностимулирующий фактор, во втором крысам, иолучавшим инъ-* .екции оМЭ, вводили фракцию, содержащую иммуносупрессирующий , фактор. Введение стимулирующего' фактора усиливало развитие' иммунного ответа на ЭБ у плававших крыс, в то же время суп-рессирующий фкктйр не ослабляет иммуностимулирующего действия иньекций SAß. На основании этих данных можно было предположить, что стимулирующий фактор ослабляет, или полностью нейтрализует действие супрессирующего . фактора, а последний не оказывает влияния на действие стимулирующего фактора. . Для проверки этого .предположения животным вводили фракцию супре-натанта, содержащую супрессирующий фактор, затем их имыунизи-

ровали ЭБ и вводили фракцию, содержащую стимулирующий фактор. При такой постановке опыта выраженность иммунного ответа на ЭБ не отличалась'от контроля. В случае же введения фракции, содержащей стимулирующий фактор, а затем ЭБ и фракции, в состав которой/входил супрессирующий фактор, имело место усиление иммунного ответа на ЭБ. Эти данные свидетельствуют об однонаправленном антагонизме иммуномодулирующих факторов, выделяемых клетками селезенки при физических нагрузках* и введении ЭМЭ.

Некоторые монокины обладают свойством повышать концентрацию в крови белков острой фазы и в частности антипротеолити-ческих белков /О.А.Кетлинский и др., 1992/. Изучено влияние фракций супернатантов, содержащих супрессирующий и стимулирующий факторы, на содержание в крови альфа-1 -антипротеаэ и альфа-2-макроглобулина и влияние последних на свойства эритроцитов. Установлено, что после иньекции фракции, в состав которой входит супрессирующий фактор, не наблюдается существенного изменения концентрации антипротеолитических белков в крови плававших и неплававших крыс. Введение фракции, содержащей стимулирующий фактор, приводило к повышению концентрации альфа-1-антипротеаэ и альфа-2-макроглобулина в крови обеих групп животных. Альфа-1-антипротеазы и альфа-2-макроглобулин обладают иммуносупрессорными свойствами /Л.Г.Прокопенко, Г.А.Чалый, 1988/. Учитывая это, была изучена иммуномодулирую-тя активность сыворотки крови крыс, получавших иньекции фракций оупернзтаитов, содержащие иммуносупсессирующий и иммуностимулирующий факторы (СКИСУФ и СКИСТФ). СКИСУФ при алло-гекном лереносе' не. оказывала влияния на развитие ГИО, индуцированного ЭБ, а СКИСТФ обладала иммуносупрессирующими

- 2й -

свойствами.

Обработка эритроцитов интактных крыс СКИСУФ или СКИСТФ не приводила к появлению у них иммуномодулируюших свойств. После обработки эссенциале эритроциты, предварительно инкубированные с СКИСУФ, приобретали иммуностимулирующие свойства; у эритроцитов, ннкубпрованнык с СКИСТФ, эссенциале не индуцировал появления иммуномодулирующих свойств. Это свидетельствует о наличии в СКИСТФ фактора, повивающего резистентность эритроцитов к действию эссенциале. Учитывая тот Факт, что введение животным фракции суперната.,та, содержащей иммуностимулирующий Фактор, приводит к повышению концентрации в крови альфа- 1-антипротеаз и альфа-2-макроглобулина, возникло предположение, что появление резистентности у эритроцитов обусловлено связыванием с их мембраной ангипротеолитических белков СКИСТФ.

Истощение СКИСТФ сывороткой, содержащей антитела к альфа- 1-антипротеазам, не влияло на ее свойство индуцировать по-

0

явление у эритроцитов резистентности к эссенциале. Вместе с тем СКИСТФ теряла это свойство после истощения сывороткой, содержащей антитела к альфа-2-макроГлобулину. Результаты этих экспериментов показывают, что резистентность эритроцитов к действию эссенциале обусловлена связыванием с их мембраной адьФл-2-макроглобулина. Повышение концентрации этого белка под влиянием иммуностимулирующего фактора спленйцитов, выделение которого индуцируется эссенциале, снижает чувствительность эритроцитов к действию эссенциале. ограничивает выраженность иммуностимулирующего эффекта, вызываемого этим препаратом и таким путем обеспечивает сохранение иммунного гоме-остала.

- Е6 -

5. Сравнительная оценка имиуномодулируш^го действия эс-сенииале, ЭМЭ и иммуностимулирующего фактора спленоцитов.

Проведено сравнительное исследование влияния эссенциале, Ж и фракции, содержащей иммуностимулирующий фактор МОЙ),

на относительную организованность иммунного ответа у непла-

»

вавшнх' жиьотных /Г.Г.Автандклов, 1978/. Показано, что во всех трех случаях имеет место существенное снижение относительной организованности, однако при введении эссенциале это снижение более выражено. У плававших крыс относительная организованность иммунного .ответа на ЗБ была значительно ниже, ч.м у неплававших. Введение эссенциале, &МЭ или •1СИФ плававшим крысам усиливало выраженность ГИО и ГЗТ на ЭБ, но при этом снижало относительную организованность иммунного ответа. Выраженность усиления иммунного ответа была одинаковой, а относительная организованность при введении эссенциале снижалась в меньшей степени, чем при введении ЭМЭ или ФСИФ.

Изучено влияние эссенциале, ЭМЭ и ФСИФ на устойчивость иммунной системы в отношении неспецифических раздражителей -охлаждения и голодания. Установлено, что охлаждение и голодание при выбранных параметрах не влияют на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ, у крыс, которым иммуномодуляторы не вводили. В то же время охлаждение угнетало развитие иммунного ответа у крыс, получавших эссенциале, но не влияло на этот процесс в случае введения ЭМЭ или ФСИФ. У плававших крыс охлаждение и голодание в равной степени снижали интенсивность развития иммунного ответа на ЭБ. После введения плававшим крысам эссенциале охлаждение и голодание не влияли на развитие иммунного ответа, ' а при введении ЭМЭ или >1СИФ угнетали этот процесс.

Проведено сравнительное изучение влияния эссенциале, ЭМЭ и 4СИФ на развитие Т-независимого иммунного ответа.у плававших и неплававших крыс. Установлено, что у крыс, находившихся в покое, иммуномодуляторы не влияют на развитие иммунного ответа, индуцированного ЛПС. У плававших крыс эссенциале повышает выраженность иммунного ответа на ЛПС, а ЭМЭ и 4СИФ не влияют на этот процесс.

Различия иммуномкл^лирующего действия эссенциале, ЭМЭ и 4СИФ в покое и при физических нагрузках объясняются особент ностями их метаболических эффектов. У наплававших животных действие эссенциале и ЭМЭ обусловлено индукцией выделения иммуностимулирующего фактора прилипающими к стеклу клетками селезенки. При физической нагрузке усиление иммунного ответа под влиянием эссенциале обусловлено как выделением иммуностимулирующего фактора, так и блокированием секреции иммуносуп-рессирующего фактора. Иньекцин ЭМЭ приводят к выделению, иммуностимулирующего фактора, но не влияют на секрецию иммуносуп-рессирующего медиатора, об этом свидетельствует одинаковая эффективность ЭМЭ и <1СИФ в покое и при физической нагрузке.

Проведено сравнительное изучение иммуностимулирующей активности эссенциале, ЭМЭ и ФСЙФ при инфицировании стафилококком плававших и неплававших крыс.- Введение иммуномодулятсров инфицированным животным, находящимся в покое, в одинаковой степени стимулировало у них развитие иммунного ответа на ЭБ. Иньекиии эссенциале и ЭМЭ плававшим инфицированным крысам слабо усиливали развитие' иммунного ответа на ЭБ, а ФСИФ обладал более выраженным иммуномодулирующим действием. Такое различие действия эссенциале, ЭМЭ и «ЮИФ при инфицировании в сочетании с нагрузкой можно обьяснить их угнетающим влиянием на

функции моноцитов/макрофагов, реагирующих на эссенциале и ЭМЭ выделением иммуностимулирующего фактора.

6. йммуномодулирующее действие токоФерола ацетата, лидо-каина и пирацетама при физических нагрузках.

Большой интерес представляет изучение иммуномодулирующего действия соединений, обладающих свойством стабилизировать мембраны клеток за счет влияния на обменные процессы. К числу таких соединений относятся токоферола ацетат, /А.БепсИсЬ, 1950; И.И.Степуро, 1952/, лидокаин /В.И.Шарапов и др.. 1990; С.Кшпис1а,Н.М1зга,1991/ и пирацетам /Л.А.Громов и др., 15-3/.

Исследовано влияние токоферола ацетата (20 мг/кг), лидо-каина (10 . мг/кг) и пирацетама (20 мг/кг) на развитие Т-за-висимого и Т-независимого иммунного ответа у плававших и неп-лававших крыс. Пятикратное введение всех препаратов снижало показатели -перекиского окисления липидов клеточных мембран. Наиболее эффективным в этом отношении был токоферола ацетат. Кроме того, токоферола ацетат и лидокаин снижали активность фосфокреатинкинаэы в плазме крови плававших крыс.

Установлено, что у неплававших крыс токоферола ацетат стимулировал развитие иммунного отьета на &Б и ЛП0. Остальные препараты таким действием не обладали. При 5-кратной Физической нагрузке токоферола ацетат и лидокаин нормализовали "Г-зависимый и усиливали Т-независимый иммунный ответ. Пирацетам усиливал ответ на 5Б, но не влиял на реакцию, индуцированную ЛПС. Исследование иммуномодулирующей активности фракций сыворотки плававших животных показало, что токоферола ацетат ц лидокаин снижают активность высокомолекулярной фракции и отменяют активность низкомолекулярных фракций, а пирацетам не влияет на активность Фракций сыворотки крови. Легкие

эритроциты плававших крыс, получавших токоферола ацетат или лидокаин о отличие от животных, которым препараты.не вводили, не обладают иммуносупрессорными свойствами. Иммунологически неактивными были также промежуточная по плотности и тяжелая Фракции эритроцитов этих животных. Введение пирацетама не приводило к ослаблению иммуносупрессирующих свойств легкой фракции эритроцитов и не влияло на свойства других фракций эритроцитов плававших крыс. Таким образом, влияние токоферола ацетата и лидокаина на иммунологическую реактивность плававших животных в определенной степ>. .ж связано с их влиянием на свойства легкой Фракции эритроцитов, а эффект пирацетама не опосредован его влиянием на свойства эритроцитов.

Эритроциты плававших и неплававших крыс, получавших токоферола ацетат или лидокаин, после обработки сывороткой крови плававших крыс, которым пги препараты не вводили, не'приобретали иммуносупрессируюцих свойств. Вероятно, при иньекциях токоферола ацетата или лидокаина плававшим крысам 'имеет место стабилизирующее влияние .препаратов нд цитоплазматические мембраны клеток интенсивно работающих'органов (снижение суп-рессирующей активности сыворотки крови) и на мембраны эритроцитов (резистентность эритроцитов к действию сывороточных субстанций).

Исследование влияния препаратов на содержание холестерина и фосфолшшдов в мембране эритроцитов показало, что при инь-екииях плававшим животным токоферола ацетата или лидокаина происходило снижение -соотношения холестерин/фосфолипиды г мембранах всех Фракций эритроцитов, обусловленное уменьшением содержания в них холестерина. Пираиетам не оказывал существенного влияния на содержание холестерина и фосфолипидов в

мембранах эритроцитов,. наблюдающееся при введении животным стабилизаторов клеточных мембран. Результаты этих наблюдений позволяют считать, что изменение свойств эритроцитов, наблюдающееся при введении жиеотным стабилизаторов клеточных мембран, в определенной степени обусловлено влиянием последних на соотношение количества холестерина и фосфолипидов в мембранах клеток.

Оупернатанты прилипающих и неприлипаюших к стеклу клеток селезенки плаваьших крыс, получавших токоферола ацетат или лидокаин, а также супернатант неприлипамцих клеток селезенки крыс, получавших пирацетам, не обладают иммуномодулирующей активностью. Супернатант прилипающих клеток селезенки крыс, получавших пирацетам,. при аллогенном переносе вызывал супрес-сирующий эффект. Супернатанты неприлипаюших к стеклу клеток лимфатических узлов при введении всех трех препаратов были иммунологически неактивными. Супрессируюшая активность супер-натантов прилипающих клеток лимфатических уилов плававших крыс после иньекции токоферола ацетата или лидокаина сохранялась, но была ниже, чем в случае введения пирацетама или у плававших животных, которым препараты не ььодили. Эти данные позволяют считать, что выделение иммуносупрессирушего Фактора прилипающими спленоцитами обусловлено въаимочейс.твием их с модифицированными эритроцитами и что последние не являются единственным индуктором ьылеления супрессирующего Фактора клетками лимфатических уалов.

Сопоставление иммуномодулирушего эффекта изученных соединений-с их структурой показало, что иммуномодулирующая активность снижается по мере убывания липотрогшых свойств соединений (таблица 2ь Полиненасыщенные фосфолипиды зссенциане

Т«блина 2.

Блияни? стабилизаторов глеточных м~уорам на иммуномодулирующие сЕойстга и химический состав мембраны эритроцитов

Название, формула

Эссенциале

Иммуномодулируюашй эффект при физической нагрузке

Стимуляция Т-зависимого и 7-независимого иммунного ответа

Влияние на свойства эритроцитов

Индукция иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов

Влияние на химический состав мембраны эритроцитов

Повышение содержания фосфолилидов в мембране тяжелых эритроцитов

Токоферола ацетат Стимуляция Т-зависимого Индукция реэистент- Снижение содержании и Т-независимого иммун- ности у легких эркт- холестерина в мемора-ного ответа роцитов к действию не легких эритроцитов

супрессируюших соединений ^

Лидокаин

Стимуляция Т-зависимого и Т-независимого иммунного ответа

Индукция резистентности у легких эритроцитов к действию супоессирующих соединений *

Снижение содержания холестерина в мембране легких эритроцитов

Пирацетам

Слабо выраженная стимуляция Т-зависимого иммунного ответа

Не выявлено

Не выявлено

- ô2 -

индуцируют появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов, но не повышают резистентность легких эритроцитов к действию сывороточных субстанций, индуцирующих появление у них иммуносупрессирутих свойств. Вероятно, строго упорядоченная структура легких (молодых) эритроцитов не включает в свой состав крупные молекулы фоофолипидоь окружающей клетку среды. Вместе с тем билипидный слой тяжелых (старых) эритроцитов, дезорганизованный продолжительным действием на него различных агентов, включает в свой состав фосфолипиды внешней среды, особенно при повышении их концентрации, ¡маранной введением эссенциале. Относительно небольшие ino сравнению с фосфолипидами) молекулы' токоферола ацетата и лидокаипа, а также наличие в них .циклических структур с сопряженными связями, вероятно, позволяют им внедряться в строго упорядоченную структуру легких эритроцитов. Не исключено, что токоферола ацетат и лидокаин могут вытеснять холестерин иъ Оилипидно-го слоя мембраны легких эритроцитов и занимать ь нем его место. Следствием этого является увеличение соотношения фюсфоли-пиды/холестерия в мембране эритроцитов. Можно предположить, что такое увеличение приводит к иимен^шпи резистентности эритроцитов в отношении сыворотчных субстанций.

7. Иммуноыодулирующее действие энергиаируюших препаратов при физических нагрузках.

Иммунный ответ является энергозаьисимим процессом, об этом свидетельствует значительное увеличение образования лак-тата в лимфоцитах после.активации их митогенами /T.Wang е.а.

1980/, а также необходимость еысокого парциального давления кислорода в капиллярах селезенки ¡4 лимфатических . узлов для дифференцирования В-лимФоцитов з плазматические клетки и синтеза в последних иммуноглобулинов /Ф.Вернет, 1971/. Следствием де<1жиита кислорода и глюкозы в капиллярах органов брюшной полости при интенсивных физических нагрузках является снижение-функциональной активности иммуноцитов селезенки, а также увеличение проницаемости мембран клеток различных органов и выход из них в сосудистое русло соединений, обладающих имму-иосупрезсируюиими свойствами. Учитывая это. было изучено влияние рибоксина ('40 мг/кг i. милдропата (20 мг/кг') и сочетаний этих препаратов с глюкозой (ICO мг/кг) и бенфотиачином (10 мг/кг) на развитие иммунного ответа при физических нагрузках. Рибоксин и миларонат вводили 5-кратно, глюкозу и бенфотиамин - 30-кратно с интервалом Г 4 ч.

Эксперименты проведены на крысах, плававших 5-крауно по 4 ч с грузом (нагрузка высокой интенсивности) и 30-кратно по 4 ч без груза (нагрузка умеренной интенсивности). Введение ри: боксина 5-кратно плававшим крысам усиливаю развитие ГЛ0 и не; влияло на развитие ГЗТ. При 30-кратном плавании рибоксин оказался неэффективным. Миляронат был неэффективным как при 5-кратной, так и при 30-кратной-физической нагрузке.

. Многократное выполнение физической нагрузки приводит к истощению углеводных резервов организма, поэтому было изучено влияние поступления дополнительного количества глюкозы на развитие ГКО и ГЗТ. Установлено, что введение глюкозы 30-кратно плававшим крысам не влияло на ГИО и ГЗТ, индуцированные ЗБ. Физическая нагрузка приводит к возникновению абсолютной или относительной недостаточности тиамина в организме.

- о4 -

Введение бенфотиамина усиливало развитие ГШ, но не влияло на выраженность ГЗТ у неплакавших животных. При 30-кратном плавании препарат не оказывал влияния на развитие обеих форм иммунного ответа. Сочетание глюкозы с бенфотиамином усиливало выраженность ГИО, но не влияло на развитие ГЗТ. Аналогичный эффект'вызывало сочетание глюкозы и рибоксина, а также бенфо-тиамина и рибоксина. При введении 30-кратно плававшим крысам Есех трех препаратов наблюдалось более выраженное усиление ГИО и некоторое повышение ГЗТ. Введение милдроната и рибоксина оказывало слайовыракеннсе влияние на развитие ГИО и . ^Т у 30-кратно плававших крыс. Сочетанное применение глюкозы, бен-фотиамина и милдроната нормализовало развитие ГИО и усиливало выраженность ГЗТ при 30-кратных нагрузках.

Изучены свойства сыворотки крови, эритроцитов и суперна-тантов 30-кратно плававпих крыс, получавших энергизирующие препараты. Сыворотка крови животных, получавших рибоксин, глюкозу и бенфотиамин при аллогенном переносе вызывала имму-нооупрессирующик эффект, а эритроциты и супернатант прилипающих спленоцитов не обладали иммуномодулирующими свойствами. Сыворотка крови, эритроциты и супернатант прилипающих клеток селезенки 30-кратно плававших крыс, получавших милдронат, глюкозу и бенфотиамин, супрессировали раьвитие иммунного ответа у интактных животных. Инъекции эритроцитов или суперна-тантов прилипающих спленоцитов 30-кратно плававших крыс, не получавших никаких препаратов, плававшим животным, которым вводили рибоксин, глюкозу и бенфотиамин, супрессировали развитие иммунного.ответа на ЭБ, а иньекции таких эритроцитов или супернатанта -плававшим животным, получавшим милдронат, глюкозу и бенфотиамин, не влияли на иммунный ответ, индуциро-

~ -

ванный ЗЕ.

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что нммуномодулируклций э4хЬект рибоксина в сочетании с глюкозой и Сенфотиамином обусловлен повышением резистентности эритроцитов к действию Факторов сыворотки крови, индуцирующих появление у них иммуносупрессируюших свойств. В этом отношении действие сочетанчого применения указанных соединений аналогично действии, вызываемому введением токоферола ацетата или лидскаина. милдроната в сочетании с глюкозой и

б<»Ыхлиамином связан, по-видимому, со снижением чувствительности иммунопитог. к действию медиаторов спленоцитов, супрес-сирующих развитие иммунного ответа.

А. Лктопротекторное действие стабилизаторов клеточных мембран и энерги^ируютих. препаратов в состоянии покоя и при физических нагрузкал,

В ситуациях. требующих выполнения физической нагрузки высокой интенсивности, как правило, возникает необходимость повышения Физической работоспособности организма. Учитывая это, изучено влияние стабилизаторов клеточных мембран и энергизи-рующих препаратов на Физическую работоспособность животных, находившихся в покое и выполнявших субмаксимальную нагрузку (время плавания с грузом, составлявшим 8 % массы тела) и максимальной (число крыс, плававших с грузом 20 % массы тела в течение 1 мин ) интенсивности. Установлено, что введение эс-сенциале повышало способность крыс выполнять нагрузку субмаксимальной и максимальной интенсивности. Инъекции токоферола ацетата и лидоканна "повышали способность 5-кратно плававших животных выполнять субмаксимальную нагрузку, но не влияли на возможность выполнения ими максимальной нагрузки. Повышение

физической работоспособности под влиянием эссенциале, вероятно,' обусловлено его мембраностабилизирующим действием, а также появлением под его влиянием иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. Слабо выраженный актопротекторный эффект токоферола ацетата и лидокаина связан, по-видимому, только с их стабилизирующим влиянием на мембраны клеток.

Изучено влияние эритроцитов, экстракорпорально обработанных эссенциале, на физическую работоспособность. Оказалось, что введение тяжелых ЭМЭ повышает способность плававших и неплававших крыс.выполнять работу субмаксимальной и максимальной интенсивности. Исследовано также влияние фракций спленоиитов плававших и получавших иньекции ЭМЭ крыс на работоспособность плававших и неплававших животных. Установлено, что фракция, содержавшая супрессирующий фактор, не влияет на способность животных обеих групп выполнять физическую нагрузка. Фракция, в состав которой входил стимулирующий фактор, повышала способность плававших и неплававших животных выполнять высокую и максимальную мышечную работу. Эти результаты обосновывают целесообразность применения эссенциале и ЭМЭ в качестве актопротекторов, а также изучение актопротекторной активности других иммуномодуляторов.

С целью повышения физической работоспособности используют энергизирующие препараты - активаторы и метаболиты энерго-поставляющих реакций /Ю.Г.Бобков и др., 1984/. В связи с этим было исследовано влияние рибоксина и милдроната в сочетании с глюкозой и бенфотиамином на способность крыс выполнять работу субмаксимальной и максимальной интенсивности. Установлено, что физическая работоспособность 30-кратно плававших без груза крыс существенно не отличалась от работоспособности

неплававиих животных. Введение рибоксина несколько увеличивало способность крыс выполнять работу субмаксимальной (но не максимальной) интенсивности, поступление дополнительных количеств глюкозы или бенфотиамина че влияло на работоспособность , а введение милдроната угнетало ее. После введения плававшим животным глюкозы и бенфотиамина рибоксин существенно повышал способность крыс выполнять работу субмаксимальной интенсивности, а милдронат не оказывал влияния на работоспособность .

Введение рибоксина в сочетанг с глюкозой и бенфотиамином приводит к повышению физической работоспособности, вероятно, за счет улучшения аэробного окисления глюкогы б миопитах. Милдронат без углеводной и витаминной нагрузок угнетает физическую работоспособность. Это может быть связано с ограничением использования неэстерифииированных карбоновых кислот ми-оштами как энергетического материала. Введение глюкозы и бенфотиамина ограничивает мобилизацию трйглицеролОв жировых депо и вместе с тем улучшает энергоснабжение миоцитов за счет усиления анаэробного гликолиза. Такое действие углеводной и. витаминной нагрузок нейтрализует угнетающее'влияние милдрона-та на физическую работоспособность плававших животных/

Результаты проведенных экспериментов позволили'

- установить роль эритроцитов и медиаторов иммунного ответа. выделяемых клетками селезенки и лимфатических уалов В развитии иммуносупрессии при физических нагрузках;

- выяснить роль эритроцитов и монокинов в реализации им-муномодулируюшего действия эссенциале, токоферола ацетата,, лидокална, пирацетама и рибоксина при физических нагрузках;

- предложить эссенциале, экстракорпорально модифицированные им эритроциты, токоферола ацетат, лидокаин, рибоксин и милдронатв сочетании с глюкозой и бенфотиамином в качестве эффективных средств иммунокоррекпии при физических нагрузках;

- предложить эссенциале и модифицированные им эритроциты . в качестве эффективного средства повышения физической работоспособности.

В и В О Д Ы

1. Интенсивная физическая нагрузка приводит к развитию вторичного иммунодефицита, характерными признаками которого является накопление в крови иммуносупрессирующих соединений, появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов, и выделение клетками селезенки медиаторов, супрессирующих развитие иммунного ответа на Т-зависимые и Т-независимые антигены. Звенья этой триады взаимообусловлены - сывороточные соединения модифицируют эритроциты, а последние индуцируют выделение медиаторов клетками селезенки.

?.. Иммуносупрессируюшле соединения, накапливающиеся в крови после интенсивных физических нагрузок, обнаруживаются во фракциях сыворотки, содержащих белки с молекулярной массой более 200 кД, 50-60 кД и 10-15 кД. Иммуносупрессирующая активность высокомолекулярной фракции сыворотки обусловлена увеличением содержания в ней антипротеолитических белков и соединении невыясненной природы. Активность низкомолекудярных фракций сыворотки связана с наличием в них субстанций, анти-генно родственных. меДиаторам иммунного ответа, выделяющихся кл е 'С к"- .ч и се л е з е н ки.

- 59 -

Эритроциты животных, выполнявших интенсивную физи-ческут нагрузку, облапают иммуносупрессирующими свойствами. Эти свойства характерны для эритроцитов, плотность которых не превышает 1.079 г/см3. Появление иммуносупрессируюших свойств V '(ритроиитов обусловлено действием на мембрану сывороточных соединений. Модифицированные сывороточными субстанциями эритроциты индуцируют выделение прилипакчшми к стеклу клетками селезенки ант игеннесг>е пифических иммуносупрессируюших медиаторов .

4. Иммуносупрессирующие фактсуы. выделяющиеся под влиянием эритроцитов плававших крыс прилипающими к стеклу клетками селеуенки выявляются в составе фракций их супернатантов, со-держсшшх белки с молекулярной массой 50-60 кД и 10-15 кД. Эти Факторы по антигенным свойствам близки к аналогичным по молекулярной массе и функциональной активности субстанциям сыворотки крови плававших крыс. Вместе с тем они отличаются • по антигенной специфичности от иммуносупрессируюших соединений, обнаруживаемых в составе высокомолекулярной фракции сыворотки крови.

5. Парэнтеральное введение эссенциале усиливает ; азвитие иммунного ответа на ЭБ у крыс, .находящихся в состоянии покоя и реакцию на ЭБ и ЛПС V животных, выполнявших интенсивную физическую нагрузку. Иньекции эссенциале плававшим й неплавав-шим крысам индуцирует появление иммуностимулирующих свойств у эритроцитов, плотность которых превышает 1,117 г/см3. Такие эритроциты индуцируют выделение иммуностимулирующего фактора прилипающими к стеклу клетками селезенки. Фактор обнаруживается в составе, фракции супернатанта. содержащей белки с молекулярной массой 10-15 кД.

6. Экстракорпорально модифицированные эссенциале тяжелые эритроциты обладают иммуностимулирующими свойствами. Они индуцируют выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки фактора, стимулирующего развитие иммунного ответа на ЭБ. Фактор обнаруживается в составе фракции супернатанта, содержащей белки с молекулярной массой 10-15 кД. Эритроциты, модифицированные эссенциале, и выделяющиеся под их влиянием иммуностимулирующие факторы как иммуномодуляторы более эффективны, чем эссенциале в состояниях покоя, но менее эффективны при интенсивных физических нагрузках. При резко выраженном иммунодефиците иммуностимулирующий фактор более эффективен, чем эссенциале и модифицированные им эритроциты.

7. Супернатант прилипающих к стеклу клеток селезенки, получавших модифицированные эссенциале эритроциты, содержит фактор, повышающий содержание в крови антииротеолитических белков. Альфа-1-антипротеагы и альфа-2-макроглобулин не индуцируют появления иммуномодулирующих свойств у эритроцитов. Под влиянием альфа-2-макроглобулина эритроциты приобретают резистентность к действию эссенциале, Это ограничивает появление в крови эритроцитов, обладающих иммуностимулирующими свойствами, у животных, получавших иньекции эссенциале.

8. Эритроциты, модифицированные эссенциале, индуцируют выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки фактора, повышающего физическую работоспособность животных, находящихся в покое и выполнявших интенсивную физическую нагрузку. Фактор, повышающий физическую работоспособность, обнаруживается в составе хроматсграфической фракции, содержащей белки с молекулярной массой Ю-15 кД. В составе фракции супернатанта прилипающих к стеклу клеток селезенки плававших крыс не обна-

рулен Фактор, обладающий свойством влиять на физическую рабо-тоепссооность.

9. Введение токоферола ацетата крысам, находившимся в состоянии покоя, стимулирует развитие иммунного ответа на Т-зависимый и Т-независимый антигены, лидокаин и пирацетам не влияют на реакцию, индуцированную этими антигенами. При интенсивной Физической нагрузке токоферола ацетат и лидокаин нормализуют Т-зависимый и усиливают развитие Т-независимого иммунного ответа, пирацетам усиливает Т-зависимый и не влияет па 1'-независимый иммунный ответ.

10. Токоферола ацетат и лидокаин снижают иммуносупресси-рующую активность высокомолекулярной фракций сыворотки крови плававших крыс,, повышают резистентность легких эритроцитов к действию супрессирующих субстанций сыворотки крови, блокируют выделение иммуносупрессирующих факторов клетками селезенки. Пирацетам не оказывает влияния на супрессирующую активнось сыворотки крови, эритроцитов и супернатантов прилипающих к стеклу клеток селезенки крыс, выполнявших интенсивную физическую нагрузку.

11. Рибоксин при физических нагрузках вызывает нерезко выраженный иммуностимулирующий •• и актопротекторный эффекты, глюкоза и бенфотиамин усиливают'это действие рибоксина. Милд-ронаг не влияет на развитие иммунного ответа и угнетает физическую работоспособность плававших животных. В сочетании с гдакогой и бенфотиамином милдронат нормализует иммунологи-ческуя' реактивность и не влияет на физическую работоспособность плаьаг.ашх крыс.

10. : »гспергментально обоснована возможность двух путей •• ' : . тг.Ч'-:кон коррекции иммунологической реактивности орга-

низма при интенсивных физических нагрузках, Один из них базируется на применении стабилизаторов клеточных мембран, в основе другого лежит использование препаратов, улучшающих энергообеспечение клеток. Общим для обеих групп является участие эритроцитов в реализации их иммуномодулирующего действия.

О И И С О К работ, опубликованных по теме диссертации

1. И.Л.Ласкова. Роль гуморальных факторов крови и селезенки в угнетении иммунологической реактивности при интенсивных физических нагрузках // Интерлейклны и другие медиаторы в клинической иммунологии. Республиканский сборник научных работ. -Москва. -1989. -С. 215-219

2. И.Л.Ласкова, Н.Я.Прокопенко. Иммуностимулирующий эффект антител к белкам спленоцитов при двигательном стрессе //' Стресс и иммунитет. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет /психонейроиммунология/". -Ленинград. -1989. -С.12?

3. Н.Н.Кедровская, И.Л.Ласкова. Роль гуморальных Факторов сыворотки крови в развитии вторичного иммунодефицита при интенсивных Физических нагрузках // Первый Всесоюзный иммунологический сьевд. Тезисы докладов. -Москва. - 1989. - Т.11. -С.217

4. И.Л.Ласкова. Развитие индуцируемой стафилококком гиперчувствительности замедленного тина и антигеннеспецифи-ческой -иммуносупрессии в состоядии покоя и при физической нагрузке различной интенсивности // Журнал микробиологии,

- 43 -

эпидемиологии и иммунобиологии. -19э6.- - N 3. -С. 68-73

•г1. Лчсгова И. Л. Метаболическая иммуносупрессия-при физических нагрузках // Тезисы докладов. 1 съезд иммунологов России. • Новосибирск. -1992. -С. 269-270

6. Прокопенко Н.Я., Ласкова И.Л. Метаболическая коррекция иммунного ответа при Физических нагрузках // Тееисы докладов. 1 сьозл иммунологов России. -Новосибирск. -1992. -С. 384

7. Л.Г.Прокопенко. И.Л.Ласкова. Медиаторы иммунного ответа и Фи.чическая работоспособность // Тезисы докладов. 1 сьеед иммунологов России. -Новосибирск. - 1992. -С. 384.-385

6. И.Л.Ласкова.Б.С.Утешов.Иммуномодулируюдее действие ри-бикснна при Физической нагруаке /7 Экспериментальная и клиническая Фармакология. -1992. Т.55. - N 5. -С. 48-51

9. И.Л.Ласкова. Б.О.Утевев. Иммуномодулирукнцее действие гетерополисахаридов, выделенных из соцветий ромашки // Анти-биотжи и химиотерапия. -1992. Т. 37. - N 6. -С. 15-18.

10. И.Л.Ласкова, Л.Е.Силливая, Л.Г.Прокопенко. Развитие различных Форм пммунооупрессии после физической нагрузки и т»пло1иго воздействия // Патологическая физиология и экспери- , ментальная терапия. -1092. - N 5-6. -С. 48-51

11. Б.С.Утешев, И.Л.Ласкова'. Эссенциале как индуктор ин-муномодулирукжих свойств у эритроцитов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1993. - Т. 56. - N 3. -С. 39-42

12. И.Л.Ласкова. Л.Е.Сишшвая. О взаимосвязи иммунологической реактивности и Физической работоспособности организма // ''помологический журнал т. И.М.Сеченова. - 1993. -Т. 79. -¡1 2, -Г. 75-82

1Д. Л.Р.Прокопенко, Г.А.Чалый, А.И.Конопля, В.Д.Затоло-■■¡ш. ¡'..Л. !:лсксм. Протеагы и иммунитет (монография). Курск,

см. на обороте след. страницы

его о.

l-U l.l-.Laikova. Imraunomodulating Effect of Cell Membrane ¿Ы-Ч] i:;ens in strain // Abstracts of 1st the International Congress on Imunorehabii i tation. - 1994 - Namber 1,- Supplement.- p. ГОГ

15. Л.Г.Прокопенко, Л.А.Северьянова. К.Л.Ласкова. Нейро-имм'унологические механизмы регуляции Физиологических йушщий при стрессе и г условиях патологии /7 Медико-социальные и экологические проблемы Курского региона. - Курск. 1994,- с.

16. И.Л.Ласкова. Взаимосвязь медиаторов клеток селезенки и лимфатических узлов при физической нагрузке // Патологическая Физиология и экспериментальная терапия.- 1994.- N 2..- С.

Г/. И.Л.Ласкова. Л.Е.Сипливая. Способ выявления иммуностимулирующих свойств эритроцитов // Положительно» решение ГоатомизоОротений от У.01.92 по заявке N 4912192/14

Ш. И.Л.Ласкова. Л.Е.Сипливая. Способ стимуляции Физической работоспособности О' Положительное решение Госкомизобре,-тении от 16.03.9Г по заявке N 4926866/14