Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск новых средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функционального изучения семейств эндогенных пептидов

I На правах рукописи

[

ЕМЕЛЬЯНОВА Татьяна Георгиевна

Поиск новых средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функционального изучения семейств эндогенных

пептидов

14.00.25. - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

обязательней

бесплатный

экземпЩ!!

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории структурной организации биологических систем (рук. - лауреат Государственной премии, доктор химических наук, профессор А .В. Шишков) ИХФ РАН (директор - академик РАН А.А. Берлин).

Научные консультанты:

академик РАН,

доктор химических наук, профессор Н.Ф. Мясоедов

лауреат Государственной премии,

доктор медицинских наук, профессор Т.А. Воронина

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор ИД. Ашмарии

доктор биологических наук, профессор ТЛ. Гарибова

доктор биологических наук В.М. Ковальзон

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится 19 октября 2005 года, в............часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан...................................2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед. наук

Б.А. Вальдман.

¿¿g 7

-/-S6J3 з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время гипотермия находит все большее применение в клинических условиях. Гипотермию используют в нейрохирургии: для снижения внутричерепного давления при некоторых видах травм и пшоксических-ишемических инсультах, при операциях на магистральных сосудах мозга, церебральных аневризмах, врожденных пороках артерио-венозных сосудов, злокачественной опухоли основания черепа (Hachimi-Idrissi, Huyghens, 2004; Mohammad, et al., 2004; Smrcka, et al., 2005) и в кардиологии: при операциях на открытом сердце (Hearse, 1980; В amer, 1980), при внезапной остановке сердца (Friberg, et al., 2004), ишемических инфарктах (Mohammad, et al., 2004). Возрастающий интерес к патофизиологии апоптоза и другим процессам гибели клеток, а также к механизмам, лежащим в основе защитных эффектов гипотермии, привел к расширению диапазона клинического применения гипотермии (Brüx, et al., 2005). Во многих зарубежных медицинских центрах гипотермия стала частью стандартной терапии. Данные Европейского и Австралийского Испытательных Центров продемонстрировали снижение смертности и тяжести неврологических нарушений после применения гипотермии. В 2003 году International Liaison Committee on esuscitation (ILCOR) включил терапевтическую умеренную гипотермию (32-34° С) в протокол необходимых реанимационных мероприятий при внезапной остановке сердца (Popp, et al., 2005).

Традиционные способы принудительного охлаждения с применением физических методов понижения температуры тела и известная медикаментозная гипотермия весьма отрицательно влияют не только на больной, но и на здоровый организм. При охлаждении гомойотермов происходит активация компенсаторных защитных механизмов терморегуляции, преодолеть которые крайне трудно. Основные исследования по разработке фармакологических гипотермических средств были направлены на создание соединений, препятствующих развитию специфических компенсаторных терморегуляторных реакций и подавляющих сократительный и несократительный термогенез. В качестве попытки создания комплексного средства для подавления термогенеза можно привести нейроплегический коктейль (промедол, морфин, аминазин, атропин, димедрол, гексоний и т.д.) (Тимофеев, 1983), который, ЬЩк^Щ^ШШ1 ОД • пределы экспериментального изучения. | !

В природе примером регулируемой гипотермии является гибернация -физиологическое состояние, при котором происходит минимизация уровня физиологических функций организма, позволяющая в течение многих месяцев переживать неблагоприятные условия внешней среды. Искусственное получение гипобиоза по аналогии с естественным, имеет вековую историю (Бахметьев, 1902). Многие ведущие научные центры, как за рубежом, так и в нашей стране, проводят исследования по изучению естественного и созданию искусственного пшобиоза. В основе процессов гипобиоза лежит регулируемое обратимое снижение температуры тела, связанное не только с угнетением термогенеза, но и с изменением центрального уровня регуляции (смещением "set point"). На протяжении последних 15 лет в ИБОХ РАН под руководством академика В.Т. Иванова проводятся исследования по выделению и идентификации новых биологически активных соединений пептидной природы из мозга шбернирующих животных (Зиганшин и др. 1994).

В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма. Большинство природных пептидных соединений обладает полифункциональным действием, что затрудняет создание на их основе лекарственных препаратов с избирательной активностью. Поэтому изучение и создание на основе структурно-функциональных взаимосвязей новых пептидных соединений, вызывающих регулируемое изменение температуры тела, является актуальной проблемой современной фармакологии. Исследование структурно-функциональных взаимоотношений позволяет не только определить пептидную последовательность, обладающую заданными свойствами, но на основе направленной модификации усилить или ослабить эти свойства.

Изыскание новых терморегуляторно-активных пептидных соединений и создание на их основе пептидов-терморегуляторов (в частности пептидов, вызывающих мягкую обратимую гипотермию) является актуальным и имеет большое значение для решения широкого круга задач клинической медицины.

Работа поддержана грантами РФФИ №00-04-48272 , №03-04-48404 и офи_а №04-04-08009.

Целью настоящего исследования явилась разработка средств фармакологической регуляции процессов температурного гомеостаза на основе исследований структурно-функциональных взаимоотношений в рядах эндогенных пептидов (дерморфинов, Ьеи-энкефалинов, DSIP, бомбезинов и новых соединений,

выделенных из мозга гибернирующих животных), оказывающих влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, и создание на этой основе базы данных новых веществ - пептидов-терморегуляторов.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных исследований в ряду эндогенного опиоидного пептида дерморфина (ДМ).

2. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения закономерностей зависимости между структурой и терморегуляторной активностью эндогенного опиоидного пептида Leu-энкефалина (Leu-ЭНК), его фрагментов и аналогов.

3. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных отношений в ряду эндогенного пептида DSIP.

4. Изучение гипотермической активности теоретически предсказанных фрагментов деградации эндогенного пептида бомбезина и его модифицированного фрагмента - литорина.

5. Изучение новых пептидов, выделенных из мозга гибернирующих животных, в качестве средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза.

6. Разработка новой концепции фармакологической регуляции температурного гомеостаза.

Научная новизна. Выявлен новый класс пептидных соединений и создана база данных - пептидов-терморегуляторов.

Разработан новый оригинальный комплексный методологический подход для выявления и изучения веществ, вызывающих изменения в системе терморегуляции не только на уровне изменения температуры тела и развития компенсаторных реакций, но и на уровне температурной чувствительности и центральной регуляции температурного гомеостаза in vivo.

Разработана новая концепция фармакологической пептидной регуляции температурного гомеостаза, основанная на изменении центрального уровня регуляции, относительно которого развиваются защитные компенсаторные реакции. Предложенная концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза позволяет существенно снизить активность защитных компенсаторных реакций, вызывающих негативные последствия при клиническом применении гипотермии.

Впервые установлено, что дерморфин, вызывает обратимую температуро-зависимую гипотермию и двухфазную вазомоторную реакцию (вазодилятацш сменяется вазоконстрикцией). Гипотермия и реакция вазоконстрикции опосредуете} через налоксон-чувствительные, а реакция вазодилятацш - через налоксон нечувствительные рецепторы.

На основе структурно-функциональных исследований пептидов семействг дерморфина впервые показано, что разные фрагменты молекулы дерморфит ответственны за разные виды физиологической активности. Гипотермичесю» действием обладает только N-концевой тетрапептид. Реакцию вазодилятацш вызывает N-концевой гексапептид. Для проявления двухфазной сосудистой реакш» необходима целая молекула дерморфина. Модификация в молекуле дерморфинг аминокислотных остатков в первом, во втором, третьем, четвертом и шестое положениях показала, что возможна замена DAla2 на DArg2, Phe3 на Trp3, Gly4 не DAla4, Pro6 на Hyp6, dHPro6 и DdHPro6. Модификация N-концевого тетрапептидг (замена DAla2 на DArg2) позволила увеличить длительность гипотермическогс эффекта более чем в 2 раза. Удлинение молекулы ДМ с N-копца на одш-аминокислотный остаток позволило разделить пшотермическую активность, а также реакцию вазодилятации и реакцию вазоконстрикции. Добавление Arg к молекуле с N-конца в 2 раза увеличило налоксон-нечувствительную реакцию вазодилятации, г 4Amino-Pro - в 3 раза налоксон-чувствительную реакцию вазоконстрикции.

Впервые показано, что бомбезин вызывает гипотермию при интраназальном введении. N-концевые дипептиды - фрагменты-метаболиты деградации литорина и бомбезина, обладают самостоятельной гипотермической активностью. Установлено, что аналог N-концевого трипептида Glp-Gln-Glu(yOMe)-OH превышает гипотермический эффект бомбезина.

Впервые установлено, что пептиды (неокиоторфин (НКТ) и киоторфин (KT)), выделенные из фракций мозга зимоспящих животных, оказывают влияние не температуру тела и вазомоторные реакции. НКТ вызывает гипертермию только е условиях термонейтральной среды. KT - С-концевой фрагмент НКТ, снижав! температуру тела только в холодной среде. Пептид RZ-13 вызывает температуро-зависимые изменения температуры тела и реакцию расширения периферических сосудов.

Научно-практическое значение. Выявлен новый класс пептидных соединений - пептидов-терморегуляторов.

Разработан новый комплексный методологический подход для изучения фармакологической регуляции температурного гомеостаза in vivo, на основе которого проведено изучение структурно-функциональных взаимоотношений фрагментов и аналогов дерморфина, Ьеи-энкефалина, бомбезина, литорина, некиоторфина и киоторфияа и выявлен новый класс соединений, вызывающих регулируемую обратимую легкую гипотермию. Определены и отобраны новые, выделенные из мозга гибернирующих животных, пептиды-терморегуляторы. Выявлены пептиды, вызывающие смещение уровня центральной температурной регуляции, относительно которого включаются защитные компенсаторные механизмы.

Установлен ряд новых оригинальных веществ, для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. Эти соединения являются перспективными для дальнейшей разработки их в качестве лекарственных препаратов: - [Нур6]-ДМ, [сИРго^-ДМ, [ОаНРго6]-ДМ и RZ-13 (пептид из мозга гибернирующих животных) вызывают регулируемую гипотермию за счет изменения уровня центральной регуляции; [ОА1а4]-ДМ вызывает гипотермию за счет снижения порога периферической температурной чувствительности; Arg-ДМ обладает сосудорасширяющим действием; 4Атшо-Рго-ДМ - сосудосуживающим.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзной конференции "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" (Горький, 1990); Всесоюзной конференции "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды" (Новосибирск. 1990); The I-st Int. Biophisics congress and biotechnology at GAP (Dicle, Turkey, 1991), Всесоюзном Симпозиуме "Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии"(Москва, 1991); Всесоюзной Конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза"(Сыктывкар, 1991); The 8-th FRG-USSR Symposium on chemistry of peptides and proteins (Aahen, 1991); Всесоюзной Конференции "Сенсорная информация" (Ленинград, 1992); П Международной Конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992); Международном симпозиуме "Структура и функция регуляторных полипептидов", (Москва, 1992); Международной конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности"(Беларусь, Минск, 1999); The 5-th ECNP Regional

Meeting (St.-Peterburg, 2000); Международной научной конференции "Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника" (Минск, 2001) Всероссийском симпозиуме "Механизмы терморегуляции и биоэнергетики взаимодействие функциональных систем" (Иваново, 2002); III Съезд* биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Tenth German-Russian Pcptidi Symposium (Turingia, 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидо! (Москва, 2003, Ст-Петербург, 2005).

Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав результате! исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащей 513 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 381 страниц! машинописного текста, содержит 28 таблиц и 85 рисунков.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 печатных работ Зарегистрирован патент РФ №2134121 от 10.08.99, приоритет от 02.07.97.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Эксперименты проводились на самцах нелинейных белых крыс массой 180-250 г. Всегс было испытано 96 пептидов и проведено 10965 экспериментов (по 10-14 животных в группе) Животные использовались однократно.

Измерение и регистрация температур производилась на специальной устаповке созданной в лаборатории структурной организации биосистем Института химическо{ физики РАН. Крыс в индивидуальных пластиковых пеналах помещали в термокамеру с заданным температурным режимом. Одновременно в камере находилось 10 животных 5, и; которых являлись контрольными. С помощью медно-константановых TepMonaj осуществляли непрерывную регистрацию температур: воздуха в камере (Тк), в прямо? кишке (на глубине 6 см) (Тт) и кожи хвоста (Тхв), являющегося специфическим органоь теплообмена у крыс (Hart, 1971). Пептиды вводили после предварительной 60 минутно{ адаптации животных к условиям эксперимента (когда Тт и Тхв для каждого животногс практически не изменялась на протяжении, по крайней мере, 30 мин).

Эксперименты проводились в условиях стационарного и нестационарной температурного воздействия.

Стационарное температурное воздействие.

Терморегуляторные эффекты пептидов изучали в трех температурных режима? (Gordon, 1990):

- в холодной среде (Тк = 4-6° С), когда постоянство температуры тела обеспечивается за счет усиления специфических механизмов теплопродукции и снижения процессов теплоотдачи;

- в комфортной среде (Тк = 27-28° С - для крыс), в которой регуляция температуры тела осуществляется за счет изменения тонуса периферических сосудов;

- в жаркой среде (Тк = 31-32° С), когда постоянство температуры тела обеспечивается за счет усиления специфических механизмов теплоотдачи.

Некоторые пептиды испытывали при комнатной температуре (Тк = 20-21° С), поскольку эта температура окружающей среды является характерной при проведении других физиологических экспериментов.

Нестационарное температурное воздействие.

В условиях нестационарного температурного воздействия для предотвращения перегрева организма и стабилизации температуры тела у животных развивается компенсаторная рефлекторная реакция расширения периферических сосудов. Для предотвращения прямого теплового воздействия на датчик, расположенный на хвосте крыс, их размещали в камере таким образом, чтобы хвост оказывался за пределами камеры при исходной температуре окружающей среды.

Использовали два типа динамических температурных воздействий на организм;

1) медленный нагрев - постепенное повышение температуры воздуха в камере со скоростью 0.2 град/мин. В этих условиях повышение температуры оказывает постоянно возрастающее воздействие не только на поверхностные слои кожи, но и на глубоко расположенные ткани;

2) быстрый нагрев - градиентное повышение температуры окружающей среды со скоростью 10 град/сек. В этих условиях моделировался запуск предупреждающей системы или, так называемой "контрольной системы" (feed forward system) (Слоним, 1986), компенсаторная реакция развивалась на температурный градиент.

Пептиды вводили в виде водного раствора внутрибрюшинно (в/б) в объеме 1 мл/кг веса, интраназально (i.n.) и интравентршсулярно (i.c.v.). I.n. и i.c.v. введение осуществляли при помощи микрошприца ("Hamilton", США). Объем вводимого раствора составлял 20 мкл/кг -по 2 капли (5 мкл каждая) в обе ноздри поочередно, а при i.c.v.- 10 ц.1 на крысу. Контрольным животным вводили эквивалентное количество дистиллированной воды. После окончания экспериментов при i.c.v. инъекциях животные декапетировались и проводились гистологические исследования срезов мозга для определения точности локализации канюли.

Пептиды синтезировали в Институте молекулярной генетики РАН (рук. акад. Н.Ф. Мясоедов), ЗАО "Центр "Пептос" (рук. к.х.н. ВИ.Дейпш), в лаборатории синтеза пептидов (рук. к.х.н. Ж.Д. Беспалова) Российского кардиологического научно-

производственного комплекса, в лаборатории биоорганической химии (рук. д.б.н. В.П. Голубович) Института биоорганической химии НАНБ, Беларусь, в лаборатории синтеза пептидов (рук. акад. В.Т. Иванов) Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Измерения температуры тела (АТт) и температуры кожи хвоста (ДТхв), рассчитывали по формуле: ДТ = Т, - Тяга, где Т, - величина Тт или Тхв, зафиксированная в 1-й момент времени; ТИСх - исходная температура тела или кожи хвоста - среднее арифметическое из трех показателей, зафиксированных за 30, 20 и 10 мин до инъекции. Результаты экспериментов статистически обрабатывали, используя непараметрический критерий и-Вилкоксона-Манна-Уитни в статистических пакетах программ Статистика 6.0. и Т-ТЕБТ в статистических пакетах Мв Ехе1.

Определение уровня потребления кислорода.

Уровень потребления О2 регистрировали с помощью прибора КА-1 (Лазаренко, Диверт, 1983).

Метод поведенческой терморегуляции "термопреферендум".

Установка для определения предпочтительной температуры ("термопреферендум") для теплокровных была создана в лаборатории структурной организации биосистем Института химической физики РАН. Установка состояла из длинного цилиндра, температура одного конца равнялась 40° С, другого - до 10° С. Крысу помещали в цилиндр и регистрировали температуру, при которой она останавливалась.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

I. ПОИСК СРЕДСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ В РЯДУ ЭНДОГЕННОГО ОПИОИДНОГО ПЕПТИДА ДЕРМОРФИНА.

Эндогенные опиоидные пептиды обладают выраженной способностью оказывать влияние на механизмы терморегуляции. ДМ является селективным лигандом ц-опиоидных рецепторов (СЙа$5пот, е\ ей., 1984)

В 1981 году итальянские ученые выделили из кожи южно-американских лягушек рода РИйотесЬиа новый биологически активный гептапептид (Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-Тут-Рго-8ег-Ш2) - дерморфин (ДМ) (МоШесиссЫ, ег а1, 1981, Вгоссагёо, е? а/., 1981). Общим в первичной структуре всех природных дерморфинов является наличие К-концевого трипептида Туг-ВА1а-РЬе (Егератег, 1992).

ДМ обладает широким спектром физиологической активности - оказывает влияние на сердечно-сосудистую, дыхательную, выделительную, мышечную и

терморегуляторную системы (Broccardo, 1987; Melchiorri, Negri, 1996; Emel'yanova, et ah, 1996).

В данной серии проводили исследования зависимости терморегуляторной активности (температуры тела и вазомоторных реакций) от изменения структуры молекулы ДМ с целью поиска веществ, которые в последствии можно использовать для фармакологической регуляции температурного гомеостаза.

Основные полученные результаты представлены в таблице 1 (стр. 19). Изучаемые виды терморегуляторной активности ДМ приняты за 100% (вазомоторная реакция при Тк = 27-28° С представлена двумя колонками: первая - реакция вазодилятации, вторая - реакция вазоконстрикции), активность остальных фрагментов и аналогов определялась относительно активности ДМ. Прочерк означает отсутствие эффекта. Аналогично и в других таблицах. 1.1. ВЛИЯНИЕ ДЕРМОРФИНА НА СИСТЕМУ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ.

В первой серии экспериментов изучали дозо-зависимость действия ДМ. Пептид вводили в/б в диапазоне доз от 5 до 0.0005 мг/кг.

В холодной среде и при комнатной температуре ДМ вызывал куполообразное дозо-зависимое снижение Тт. Максимальное снижение Тт наблюдалось при введении ДМ в дозе 0.5 мг/кг (ДТт = -1.61 ± 0.23° С - в холоде и ДТт = -1.27 ± 0.13° С - в комнатной температуре). ДМ в дозе 5 и 0.5 мг/кг увеличивал Тхв в холоде, а при комнатной температуре в дозе 0.5 и 0.05 мг/кг уменьшал Тхв (рис. 1).

В термонейтральной среде ДМ в дозе 5 мг/кг вызывал гипертермию, а в дозах 0.5-0.05 мг/кг - дозо-зависимую гипотермию. При введении ДМ в дозах 5 и 0.5 мг/кг наблюдалось двухфазное изменение Тхв (вазодилятация сменялась вазоконстрикцией). При уменьшении дозы до 0.05 мг/кг наблюдалась только первая фаза сосудистой реакции (рис. 1).

В жаркой среде ДМ (5-0.05 мг/кг) вызывал гипертермию, причем при введении пептида в дозе 5 мг/кг развивалась реакция вазоконстрикции (рис. 1).

Таким образом, ДМ нарушает механизмы терморегуляции и Тт становится зависимой от температуры окружающей среды. Изменениям Тт после введения ДМ не всегда сопутствуют вазомоторные реакции, совпадающие с ожидаемыми.

Время после инъекции (мин) ♦ * * * « * ♦

Тк=4-воС —ТК»20-21оС Тк«27-28оС Т«»31-32оС

Рис. I. Влияние дерморфина, вводимого в/б в дозе 0.5 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк = 4-6° С), комнатной (Тк=20-2Г С), комфортной (Тк=27-28° С) и жаркой (Тк=31-32° С) средах. Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

Механизм терморегуляториой активности дерморфина.

Поскольку дерморфин является специфическими лигандом ц-опиатных рецепторов (О1а§пот, а1., 1984), то терморегуляторные эффекты пептида изучались на фоне налоксона - блокатора опиатных рецепторов. Налоксон вводили в дозе 1 мг/кг в/б за 15 минут до введения пептида.

Введение N1. крысам, независимо от температуры среды, в которой они находились, вызывало медленное снижение Тт и Тхв (рис. 2, 3, 4). Предварительное введение №. устраняло вызываемую ДМ гипотермию в холодной (рис. 2), комнатной и термонейтральной средах. Однако Ж не предотвращал реакцию вазодилягации в термонейтральной среде (рис. 3). В жаркой среде ГО. уменьшал развитие гипертермия, вызываемой ДМ в дозе 5 мг/кг и полностью предотвращал в дозе 0.5 мг/кг (рис. 4). Реакция вазоконстрикции, вызываемая ДМ в дозе 5 мг/кг, на фоне № усиливалась.

Рис. 2. Влияние ДМ (в/б, 0.5 мг/кг), вводимого на фоне предварительно введенного налоксона (в/б, 1 мг/кг), на динамику температуры тела крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6° С). Отличия достоверны от контроля (*), от ДМ (&) и отМЬ (#) при Р<0.05.

Результаты исследований показали, что ДМ вызывал дозо- и температуро-зависимые, обращаемые № изменения Тт. Максимальные терморегуляторные

Рис. 3. Влияние ДМ вводимого (в/б, 0.5 мг/кг), на фоне предварительно введенного налоксона (в/б, 1 мг/кг), на динамику температуру кожи хвоста крыс, находящихся в комфортной среде (Тк = 27-28° С). Отличия достоверны от контроля (*), от ДМ (&) и от (#) при Р<0.05.

~контроль ■ ■ ДМ (Бмг/кг)

—А—ДМ (0,5 мг/кг) х N1

ш М1-+ДМ (6 мг/кг) • Ы1.+ДМ (0,5 мг/кг)

Рис. 4. Влияние ДМ, вводимого в/б, на фоне предварительно введенного налоксона (в/б, 1 мг/кг), на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в жаркой среде (Тк = 31-32° С). Отличия от контроля (*), от ДМ (&) и от (#) достоверны при Р <0.05.

реакции проявлялись в дозе 0.5 мг/кг (в/б). Изменения Тт сопровождались изменениями периферического кровотока, которые не устранялись предварительным введением N11. В комнатной температуре ДМ вызывал только реакцию вазоконстрикции, а в термонейтральной среде - двухфазную вазомоторную реакцию (реакция вазодилятации сменялась реакцией вазоконстрикции). В жаркой среде ДМ вызывал реакцию вазоконстрикции.

Терморегуляторная активность дерморфииа при интраназальном введении.

Известно, что ДМ при ¡.п. введении в дозе 0.05 и 0.005 мг/кг вызывает анальгезию (Емельянова и др., 1996). Однако изменений в системе терморегуляции при таком же способе введения ДМ в этих же дозах не наблюдалось ни в одном из температурных режимов.

Влияние дерморфииа на уровень метаболизма.

Введение ДМ крысам, находящимся при Тк = 20-21° С и Тк = 4-6° С приводило к снижению уровня потребления кислорода по сравнению с контрольными животными. Следовательно, ДМ вызывает снижение уровня метаболизма, что соответственно приводит к развитию гипотермии.

1.2. ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В МОЛЕКУЛЕ ДЕРМОРФИИА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ.

Укорочение молекулы ДМ с С-конца.

Укорочение ДМ с С-конца приводило к снижению активности. Минимальным фрагментом, обладающим гипотермическим эффектом, являлся ДМм. Минимальным фрагментом, вызывающим реакцию вазодилятации в комфортной среде был ДМ^.

Трипептид Рго-Иу-Рго способствует стабилизации молекул пептидов (Ашмарин и др., 2002). Удлинение с С-конца этим трипептидом ДМЬЗ и ДМ1.5 не повлияло на изменение активности фрагментов ДМ.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции А.

Роль второго аминокислотного остатка.

Присутствие БА1а между двумя ароматическими кольцами обуславливает специфику проявления биологической активности ДМ (Егератег, 1992).

Замена ОА1а2 на ВА^2 снизила активность ДМ во всех температурных режимах. Вазомоторная активность [ВАг^-ДМ наблюдалась только в холоде.

Замена ВА1а2 на Иу2 или ВОгп2 приводила к полной потере активностей ДМ.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции В.

Роль третьего аминокислотного остатка.

Наличие ароматического кольца в третьем положении необходимо для связывания ДМ с опиатным рецептором (Salvadori, et al., 1986; Marastoni, et al., 1989).

Замена Phe3 на Тгр3 приводила к уменьшению гипотермической активности ДМ. В условиях холодной среды вазомоторная реакция [Тгр3]-ДМ была такой же, как у ДМ. В условиях комфортной среды частично сохранялась только реакция вазоконстрикции (38%). В условиях жаркой среды наблюдалось сужение периферических сосудов.

Гипотермическая активность ([Тгр3]-ДМ].5) и ([Тгр3]-ДМ] 4) практически не отличалась от активности подобных фрагментов ДМ. В условиях термонейтральной среды в отличие от ДМ1.5, [Тгр3]-ДМ1.5 вызывал сужение периферических сосудов, а [Тгр3]-ДМ].4 в отличие от ДМ^ вызывал двухфазную вазомоторную реакцию.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции С.

Роль четвертого аминокислотного остатка.

В литературе высказывается предположение о важной роли четвертого аминокислотного остатка в молекуле ДМ, обеспечивающего стабилизацию ß-складки, необходимой для взаимодействия с ц-опиатными рецепторами (Pattabiraman, et al., 1986). Показано, что замена Gly4 на DAla4 увеличивает продолжительность анальгетической активности (Емельянова и др., 1996).

Замена Gly4 на DAla4 привела к частичной потере гипотермической и вазомоторной активностей ДМ.

При замене Туг1 на Тгр1 у [ОЛ1а4]-ДМ частично сохранилась активность ДМ.

Укорочение молекулы [БАк^-ДМ с N-конца только на один аминокислотный остаток привело к полному исчезновению эффектов ДМ.

Аналог С-концевого тетрапептида [Туг4]-ДМ4.7 не проявлял активности.

Одновременная замена DAla2 на DArg2 и Gly4 на DAla4 привела к снижению, а DAla2 на DOrn2 и Gly4 на DAla4 - к полному исчезновению активности.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции D.

Терморегуляторная активность аналогов ДМ, удлиненных с N-конца.

У данной группы аналогов ДМ с N-конца были добавлены Arg, присутствующий в природном предшественнике ДМ (Richter, et al., 1987), а также Kre, Met, Pro и 4Amino-Pro.

Результаты проведенных исследований показали, что природный фрагмент предшественника ДМ - Arg-ДМ обладал температуро-зависимой терморегуляторной активностью. Гипотермический эффект пептида значительно уступал, а вазомоторная активность превосходила таковую у ДМ. В термонейтральной среде сосудорасширяющий эффект Arg-ДМ был в 2 раза больше, чем у ДМ, а сосудосуживающий не изменялся. Замена Arg на другие аминокислотные остатки перераспределила терморегуляторные и вазомоторные эффекты предшественника. Аналоги Pro-ДМ, 4Апнпо-Рго-ДМ, А^-[ОА1а4]-ДМ обладали меньшим, a Arg-[DArg^-flM - большим, гипотермическими эффектами, чем Arg-ДМ. Аналоги Met-ДМ и Kre-ДМ вообще не проявляли терморегуляторной активности. В комфортной среде двухфазным вазомоторным действием кроме Arg-ДМ обладал Рго-ДМ. Сосудорасширяющее действие оказывали Arg-[DArg2]-/iM и Arg-[DAla4]-/(M, а сосудосуживающее - 4Атто-Рго-ДМ.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции Е.

Предварительное введение NL во всех температурных режимах предотвращало гипотермический эффект тех аналогов Arg-ДМ, которые им обладали. В условиях термонейтральной среды NL не оказывал влияния на реакцию расширения периферических сосудов, вызванную Arg-ДМ, Pro-ДМ, Arg-[DAla4]-flM и Arg-[Е)Аг£?]-ДМ, и уменьшал реакцию вазоконстрикции, вызванную Arg-ДМ, Pro-ДМ и 4Атшо-Рго-ДМ.

Роль аминокислотных остатков в последовательности N-концевого тетрапептида.

Как было показано выше, минимальным фрагментом, обладающим гипотсрмической активностью, являлся ДМм.

Замена DAla2 на DArg2 привела к усилению и удлинению гипотермического эффекта ДМ1.4. В термонейтральной среде наблюдалось двухфазное изменение Тт.

Замена Gly4 на DAla4 привела к снижению, а замена DAla2 на DOrn2 - к полному исчезновению гипотермического эффекта ДМм-

После одновременной замены DAla2 на DArg2 и Gly4 на DAla4 снижение Тт наблюдалось только в холодной среде.

Добавление Arg с N-конца к [DArg2]^MM или к [DArg2, DAla4]-ДМ в 4 раза увеличивало ¡лубину гипотермического эффекта ДМм в холодной среде. В

термонейтральной среде наблюдалось двухфазное изменение Тт. Добавление Arg с N-конца к [DOrn2, ОА1а4]-ДМм привело к снижению гипотермического эффекта.

Полученные результаты представлены в таблице 1, секции F.

Роль шестого аминокислотного остатка.

Pro занимает важное положение в молекуле ДМ. С одной стороны, его присутствие повышает устойчивость пептида к воздействию С-концевых пептидаз (карбоксипептидаз), что продлевает его существование в организме (Malfroy, et al., 1982). С другой стороны, обеспечивает определенную ориентацию колец Туг и Phe в пространстве (Pattabiraman, et al., 1986).

[Нур6]-ДМ в холодной, термонейтральной и жаркой средах вызывал гипотермию, глубина которой зависела от температуры окружающей. В холодной среде наблюдалось сужение сосудов, в термонейтральной - расширение, а в жаркой -двухфазное изменение сосудистого тонуса.

[БРго6]-ДМ обладал гипотермическим эффектом только в холодной среде.

[<ЩРго6]-ДМ и |Т>(1НРго6]-ДМ вызывали гипотермию в холоде и термонейтральной среде. В термонейтральной среде реакция вазодилятации у [(ШРго61-ДМ (в 2 раза) и у [Б<1НРго6]-ДМ была больше, чем у ДМ, а реакция вазоконстрикции меньше (у [<1НРго6]-ДМ - 50%, а у [DdHPro^-flM - 90%).

Одновременная замена Gly4 на Sar4 и Pro6 на dHPro6 привела к снижению гипотермической активности ДМ, а одновременная замена Gly4 на DAla4 и Pro6 на DPro6 - к полной ее потере. Полученные результаты представлены в табл. 1, секции G.

Таким образом, на основании структурно-функциональных исследований ДМ можно заключить, что разные фрагменты молекулы ДМ отвечают за разные виды терморегуляторной активности и что направленная модификация молекулы ДМ позволяет разделить гипотермическую, сосудорасширяющую и сосудосуживающую активности.

Сродство [DPro'j-ДМ и ¡dHPro6¡-ДМ к ft-и 8- опиоидным рецепторам.

Совместно с М. Broccardo, в тестах на препаратах MVD и GPI показано, что [DPro6]-ДМ и [dHPro6]-ДМ имеют большее сродство к ц-, чем к 5-рецепторам.

Терморегуляторная активность гибридов дерморфина и бомбезина.

Ни один из 4 аналогов ДМ (Trp-DAla-Val-DAla-His-Pro-Ser-NH2; Trp-DAla-Val-DAla-His-Leu-Met-NH2; Trp-DAla-Val-DAla-His-NH2; Trp-DAla-Val-Gly-Tyr-Leu-Pro-NH2) с гомологичными С-концевыми аминокислотными остатками Бб

Таблиц» 1. Терморегуляторная активность дерморфииа, его фрагментов и аналогов.

№ Дерморфины Температура теп, % прн Т.ГО- Температур* «м* хвоста, % прв Т.ГС).

1 2 3 4 5 С 7 4-6 27-28 31-32 4-4 27-28 31-12

А I Tyr DAIa Phe Gly Tyr Рю Ser NH, 100 100 100 100 100 100

2 Tyr DAta Phe aiy Tyr Pro NH, 61 65 - i 51 - -

3 Tyr DAIa Phe Gly 1\r NH, 58 39 - - -

4 Tyr DAIa Phe Gly NHi 22 20 - - -

5 Tyr DAIa Phe NH, - - - - - -

6 »K DAh Phe Pro Pro NH, - - - - - -

7 Tyr DAIa Phe Gly ту Pro Gly Pro NH, 44 - - - - -

В 8 Tyr Git Phe Gly Tyr Pro Ser NH, - -

9 Tyr DArt Phe Gly Tyr Pro Ser NH, 34 16 10 20 - - -

10 ТУ DOrn Phe Gly lyr Pro Ser NH, - - - - -

С 11 Туг DAIa f*p Gly Tyr Pro Ser NH, 48 21 4. III - 38 X

12 Ту DAIa Trp Gly Tyr NH, 54(1.) 19 - - 40 -

13 Туг DAIa Trf Gfy NH, 20 - - 34 20 -

D 14 Туг DAIa Phe алы Tyr Pro Ser NH, 70 23 - 54 94 -

15 DAIa Phe DAIa Tyr Pro Ser NH, - - - - - -

1« Phe DAIa Tyr Pro Ser NH, - - - - -

17 DAIa ту Pro Ser NH, - - - - -

18 Tyr Tyr Pro Ser NH, - - - - -

19 Тгр DAIa Phe DAIa Tyr Pro Ser NH, 14 - - 32 - - -

20 Туг DArt Phe DAIa Tyr Pro Ser NH, 42 - 36 - -

21 Туг DOnl Phe DAIa ту Pro Ser NH, - - - - - -

Е 22 Art Туг DAIa Phe Gly Tyr Pro Ser NH, 80 94 - 201 89 -

23 Art Туг DAIa Phe DAIa Tyr Pro Ser NH, 62 51 - 139 - -

24 An Туг DArt Phe Gly Ту Pro Ser NH, *KL> 42 - 60 - -

25 Pro Туг DAIa Phe Gly ту Pro Ser NH, 64 79 - 40 40 -

26 tAmPro Туг DAIa Phe Gly ту Pro Ser NH, 58 31 - - 300

27 Mel Туг DAIa Phe GJy Туг Pro Ser NH, 16 17 - - -

21 Kre Туг DAIa Phe Gly ту Pro Ser NH, - - - - -

F 29 ту DArt Phe Gly NH, 41(L) 30it - - - -

30 Туг DOn Phe Gly NH, - - - - - -

31 Туг DAIa Phe DAIa NH, 16 10 - - -

32 Туг DAn Phe DAIa NH, 25 - - - -

33 An, Туг DAIa Phe Gly NH, 26 - - - - -

34 Are Туг DAIa Phe DAh NH, 24 10 - - J

35 Arg Туг DArt Phe Gly NH, 83 40i-T - - - -

36 Art Туг DArt Phe DAIa NH, 9(КЬ) 37it - - - -

37 Ant Туг DOrn Phe ВАШ NH, 9 - - - -

G 3S Туг DAIa Phe Gly Tyr Hyp Ser NH, 105 65 X X « - tl"

39 Туг DAIa Phe Gly Tyr DPro Ser NH, 70 - - - 28 32 1

40 Туг DAIa Phe DAIa •У DPro Ser NH, - - - - -

41 Туг DAIa Phe Gly ТУ Afro Ser NH, 97 IIS X I 20t 50 X

42 Туг DAIa Phe Sar Туг APr* Ser NH, 5S - - - -

43 Туг DAIa Phe Gly ТУ DA Pro Ser NH, 11« w X - 120 90 -

(выделены жирным шрифтом) не обладал терморегуляторной активностью ни в одном из температурных режимов.

II. ПОИСК СРЕДСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ И ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЭНДОГЕННОГО ОПИОИДНОГО ПЕПТИДА LEÜ-ЭНКЕФАЛИНА, ЕГО ФРАГМЕНТОВ И АНАЛОГОВ.

Эндогенный опиоидный пептид Leu-ЭНК является лигандом 5-оииоидных рецепторов (Lazarus, et al., 1990).

В экспериментах использовали пептиды, синтезированные в лаборатории синтеза пептидов (рук. к.х.н. Ж.Д. Беспалова) Российского кардиологического научно-произвоственного комплекса. Пептиды вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг.

Полученные результаты и список пептидов представлены в таблице 2. Терморегуляторная активность Leu-ЭНК принята за 100%, активность остальных фрагментов и аналогов определялась относительно активности Leu-ЭНК.

Только в условиях холодной среды Leu-ЭНК вызывал снижение Тт. Вазомоторным действием Leu-ЭНК не обладал.

Укорочение Leu-ЭНК на один аминокислотный остаток с С-конца, как и замена Туг1 на Тгр1 не изменяло его гипотермической активности. Таблица 2. Терморегуляторная активность Leu-ЭНК, его фрагментов и аналоев.

№ Формула пептида Температура тела (%) при ТкГС Температура хвоста (%) при Тк

1 2 3 4 5 6 28 32 6 28 32

1 Туг Gly Gly Phe Leu NHf 100 - - - - -

2 Туг Gly Gly Phe Leu OH - - - - -

3 Туг Gly Gly Phe NHj 92 - - - -

4 Тгр Gly Gly Phe NHj 62 - - - - -

5 Туг DAla Gly Phe Leu nh2 80 4. - - 4 -

6 Тут DAia Gly Phe Leu Are nh2 - - - - -

В условиях холодной и термонейтральной среды [ОА1а |-Ьеи-ЭНК вызывал снижение Тт, в термонейтральной среде - вызывал реакцию вазоконстрикции.

Аналоги Ееи-ЭНК-ОН и [ВА1а2,Аг§6]-Ьеи-ЭНК не проявляли активности ни в одном из температурных режимов.

Таким образом, можно заключить, что ни Ееи-ЭНК ни один из его фрагментов или аналогов не вызывали температуро-зависимой гипотермии и поэтому не

представляют интереса для разработки их в качестве регуляторов температурного гомеостаза.

III. ПОИСК СРЕДСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ В РЯДУ ЭНДОГЕННОГО ПЕПТИДА DSIP.

Используя ресурсы банка пептидных соединений EROP-Moscow (http//erop.inbi.ras.ru), созданного сотрудником Института биохимии им. А.С.Баха РАН A.A. Замятиным (Zamyatnin, 1991), было установлено (Kovalzon, 1999) структурное сходство нонапептида DSIP (Trp-Ala-Gly-Gly-Asn-Ala-Ser-Gly-Glu) и декапептидного аналога дерморфина (Tyr-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-Gly-Glu-Ala), образующегося после ферментативного расщепления продерморфина, экспрессированного в культуре ткани млекопитающих in vitro (Seethaler, et al., 1993).

В экспериментах использовали пептиды, синтезированные в лаборатории синтеза пептидов (рук. акад. В.Т. Иванов) ИБОХ РАН.

Пептиды вводили в/б в дозе 1 и 0.5 мг/кг крысам, находящимся в холодной среде. Список пептидов и основные результаты представлены в таблице 3.

Результаты экспериментов показали, что DSIP обладал сосудорасширяющим действием и не оказывал влияние на Тт. При укорочении пептида на три аминокислотных остатка с С-конца и замене Ala2 на DAla2 у его фрагмента вазомоторная активность исчезала, а пшотермическая появлялась.

При замене Тгр1 на Туг1 вазомоторная активность DSIP исчезала. Одновременная замена Тгр1 на Туг1 и одновременной замене Ala2 на Pro2, наоборот, приводила к появлению гипотермической и вазомоторной активностей.

Замена Ala во втором положении в молекуле DSIP на другие аминокислотные остатки оказывала влияние на изменение его активности. Так [DVal2]-DSIP вызывал сужение периферических сосудов и одновременно снижал Тт. [MeAla2]-DSIP и [DTyr^-DSIP снижали Тт и не оказывали влияния на тонус периферических сосудов. [DLeu2]-DSIP и [DAla2, Pro6]-DSIP вообще не обладали терморегуляторной активностью.

Добавление к N-концу DSIP дипептида Gly-Pro приводило к повышению Тт.

При введении крысам ID-6 наблюдались подобные изменения Тт и Тхв, как и при инъекции [DAla2, Tyr6]-DSIP.

Гипотермическая активность изученных аналогов значительно уступала таковой у аналогов ДМ, поэтому дальнейшее их изучение в качестве потенциального средства фармакологической регуляции температурного гомеостаза представляется малоперспективным.

Таблица 3. Терморегуляторная активность ББГР, его фрагментов и аналогов.

№ Формула пептида Тк-4-6"С

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tt Тхв

1 Trp Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu - t

2 Trp Ala Gly Gly Asp Ala - -

3 Tip DAla Gly Gly Asp Ala i -

4 Туг Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu - -

5 Туг Pro Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu t

6 Trp DVal Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu i i

7 Trp DTyr Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu ir -

8 Trp DLeu Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu - -

9 Trp MeAla Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu i i

10 Trp DAla Gly Gly Asp Tyr Ser Gly Glu i -

11 Trp DAla Gly Gly Asp Pro Ser Gly Glu - -

12 Gly Pro Trp Ala Gly Gly AsP Ala Ser Gly Glu t -

13 ID6 i -

IV. ИЗУЧЕНИЕ ГИПОТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТЕОРЕТИЧЕСКИ ПРЕДСКАЗАННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЕГРАДАЦИИ ЭНДОГЕННОГО ПЕПТИДА БОМБЕЗИНА И ЕГО МОДИФИЦИРОВАННОГО ФРАГМЕНТА -ЛИТОРИНА.

Тетрадекапептид бомбезин (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) (Бб) и его С-концевой аналог литорин (L) (Glp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2) были выделены из кожи лягушки (Anastasi, et al., 1975). Бб, обладающий сильным гипотермическим действием, вызывает дозо- и температуро-зависимое снижение Тт только при внутримозговом способе введения (Rivier, Brown, 1978; Clark, Lipton, 1983).

IV.l. ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ БОМБЕЗИНА.

Одним из недостатков Бб и L является отсутствие их активности при периферическом введении, что делает невозможным их практическое применение. В данной серии исследований проведено сравнение терморегуляторной активности Бб при внутрижелудочковом (i.c.v.) и периферическом (i.n.) способах введения. Использовали бомбезин фирмы "Serva".

Бомбезин вводили ¿.п. в дозе 0.5, 0.1 и 0.05 мг/кг и ¡.с.у. в дозе 0.05 и 0.005

мг/кг.

Терморегуляториая активность бомбезина при в 1.с.у. введении.

В условиях холодной среды ¡.с/у. введение Бб вызывало дозо-зависимую гипотермию (рис. 5). В комнатной и термонейтральной средах Бб также вызывал дозо-зависимую гипотермию, которой предшествовала дозо-зависимая реакция вазодилятации (рис. 6). В условиях жаркой среды при ¡.с.у. введении Бб был не активен.

Рис. 5. Влияние бомбезина, вводимого 1.с.у. на динамику температуры тела крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6° С). Отличия 01 контроля достоверны: * - Р<0.05.

Терморегуляториая активность бомбезина при ¡.п. введении.

В условиях холодной среды Бб ьп вызывал дозо-зависимую гипотермию (рис. 7), без изменений в динамике Тхв.

1У.2. ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ДЕГРАДАЦИИ ЛИТОРИНА И ТЕРМОРЕГУЛЯТОРИАЯ АКТИВНОСТЬ ЕГО ФРАГМЕНТОВ.

Полифункциональность эндогенных пептидов становится лимитирующим фактором их применения. Для получения низкомолекулярных пептидных биорегуляторов, обладающих высокой биологической активностью, селективным действием и более простой структурой, а также ферментативно более устойчивых,

чем природные, было проведено целенаправленное изыскание пептидных соединений среди фрагментов деградации исходных пептидов. Возможно, что сами фрагменты, как и их предшественники, могут оказывать влияние на те же физиологические процессы.

►—контроль

-Бб (О.ООбмг/кг)

-Бб (0.05 мг/кг)

Время после инъекции (мин)

20 40 60 80 100 120 140 160

►— контроль

-Бб (0.005м г/кг)

-Бб (0.05мг/кг)

Рис. 6. Влияние бомбезина, вводимого ¡.с.у. на динамику температуры тела (а) и температуру кожи хвоста (б) крыс, находящихся при комнатной температуре (Тк = 20-21° С). Отличия от контроля достоверны: * - Р<0.05.

Прогнозирование таких фрагментов производилось на основе разработанной в ИБОХ НАНБ г. Минск (Беларусь) методики теоретического моделирования процесса деградации пептидов под действием ферментов крови.

Рис. 7. Влияние бомбезина, вводимого ¡.п., на динамику температуры тела крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6° С). Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

В качестве основного соединения для исследования терморегуляторной активности был выбран Ь.

Проведенное теоретическое исследование деградации литорина (ИБОХ НАНБ, Беларусь) позволило выявить 48 способов его возможного расщепления. Все полученные фрагменты были разделены на 4 группы: N -концевые, С-концевые, фрагменты серединного участка и отдельные аминокислоты.

Терморегуляторная активность литорина и его фрагментов.

В данной серии экспериментов использовали литорин, фрагменты и модифицированные фрагменты, синтезированные в лаборатории биоорганической химии (рук. д.б.н. В .П. Голубович) ИБОХ НАНБ, г. Минск, Беларусь (Галюк и др., 1999;Галюкидр., 1988).

Всего было исследовано 13 пептидов. Литорин и его фрагменты вводили 1.п. в дозе 0.1 мг/кг. Изучалась дозо-зависимость эффектов активных фрагментов.

Активность пептидов сравнивалась с активностью Бб. Полученные результаты и формулы пептидов представлены в таблице 4.

Терморегуляторная активность литорина и его №концевых и серединного фрагментов в условиях холодной среды.

Литорин не проявлял ни температурной, ни вазомоторной активности.

М-концевые фрагменты литорина: Ь^-ОН и Ь4.6-ОМе вызывали увеличение Тт. Фрагмент Ь^-ОМе повышал Тхв. Метиловый эфир М-концевого трипептида (Ъ^-ОМе) был не активен. Метиловый эфир аналога К-концевого трипептида - [А^3]-!^-ОМе, не вызывал изменений Тт, однако снижал Тхв.

Модифицированный К-концевой трипептид Г01и3(тОМе)]-Ь|.3-ОН вызывал более глубокую гипотермию, чем Бб (110%).

После введения Ы-концевого дипептида (Ь^-ОН) развивалась длительная гипотермия. Метиловый эфир этого дипептида не вызывал изменения динамики Тт.

Терморегуляторная активность Ь^-ОН в условиях комфортной и жаркой температурах окружающей среды.

•При введении Ь^-ОН в термонейтральной среде изменений в динамике Тт не наблюдалось (рис. 8а), однако Тхв достоверно повышалась и оставалась высокой на протяжении более 3 часов (рис. 86). В жаркой среде Тт повышалась незначительно, при этом Тхв не изменялась (рис. 8).

Таким образом, Ь^-ОН вызывает температуро-зависимое изменение Тт.

Концентрационная зависимость активности Ь^-ОН.

Ь].2-ОН вводили ¡.п. в дозах 5,1,0.5,0.05,0.005 и 0.0005 мг/кг веса животного.

Наибольшая гипотермическая активность наблюдалась при введении пептида в дозе 1,0.5 и 0.05 мг/кг, причем в этом диапазоне доз снижение Тт не зависело от дозы пептида (рис. 9). Более слабая, но достоверная гипотермия наблюдалась при введении дипептида в дозе 0.005 мг/кг. При введении Ь^г-ОН в дозе 5 и 0.0005 мг/кг динамика изменения Тт экспериментальных групп животных достоверно не отличалась от Тт контрольной группы (рис. 9а). Наибольшее снижение Тхв вызывала доза 0.5 мг/кг, а наименьшее 5 и 0.0005 мг/кг (рис. 96).

Таким образом, при ¡.п. введении 1.|_2-ОН наблюдалось дозо-зависимое куполообразное снижение Тт и Тхв.

-Тк-4-воС

-Тк=27-28оС

-Тк«31-32оС

Время после инъекции(мин)

5 х

-1,5 J

-Тк-4-воС Тк=27-28оС Тк»31-32оС

Время после инъекции (мин)

Рис. 8. Влияние Ь^г-ОН вводимого интраназально в дозе 0.05 мг/кг на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк 4-6° С), термонейтральной (Тк=27-28° С) и жаркой (Тк=31-32° С) средах. Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

— ♦■ - контроль —■—5 мг/кг

-4-1 МГ/КГ

—х—0.8 мг/кг —*—0.06 мг/кг —•— 0.005 мг/кг —в—0.0005 мг/кг

Время после инъекции(мин)

Время после инъекции (мин)

Рис. 9. Влияние Ь_2-ОН, вводимого интраназально на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6° С). Отличия контроля достоверны: * - Р <0.05.

Время после инъекции (мин)

Рис. 10. Влияние [Glu3]Li-3(yOMe)-OH HCl, вводимых интраназально в дозе 0.1 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк = 4-6° С), комфортной (Тк=27-28° С) и жаркой (Тк=31-32° С) средах. Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

Таблица 4. Терморегуляторная активность бомбезина, литорина и его фрагментов.

Л» Формулы пептидов Тк=4—6°С

Тт % Тхв %

1 2 5 4 5 6 7 # 9 /в и 12 13 14

1 рй!и Оп Агк Ьеи Ляп С1п Тф Л1а Уа1 в1у Н18 Ьеи Ме» N»2 >1 100 -

1 2 3 4 5 6 7 И 9

2 рО!и С1п Тф А1а Уа1 а!у № РЬе Ме( Ш2 - -

1Ч-концевые фрагменты

3 р01и Оп ОН 4 85

4 р01и С1п ОМе - 4-

5 р01и Оп Тф ОМе - -

6 рС1и Оп Л(* ОМе - 4-

7 рй1и С1п Юи (ТОМе) ОН на по -

8 рвШ С1п Тф А1а Уа1 С1у №з ОН Т -

Срединный фрагмент

9 А1а Уа1 в1у ОМе 1" 1-

С-концевые фрагменты

10 Тф А1а Уа] &у Шз РЬе Ме1 ЫН2 - -

И А 1а Уа! С1у РЬе Ме1 ЫН2 - -

12 № РЬе Ме4 ЫН2 - -

13 А1а РЬе МЫ т2 - Г

И РЬе ММ ЫН2 - 4

Терморегуляторная активность [GIu3](YOMe)-L1.3-OH в условиях комфортной и жаркой температур окружающей среды.

При введении [Glu3](yOMe)-Li.3-OH в термонейтральной и жаркой средах изменений в динамике Тт не наблюдалось. В условиях термонейтральной и жаркой сред пептид вызывал продолжительное (по крайне мере на протяжении 3 часов) сужение периферических сосудов (рис. 10).

Терморегуляторная активность С-концевых фрагментов литорина.

С-концевые фрагменты литорина - Г-3.9, L4.9, L7.9, а также аналог фрагмента литорина - [Ala7]-L7_9 не вызывали изменений Тт. Вазомоторной активностью обладали фрагмент L8.9 (вызывал снижение Тхв) и аналог фрагмента [Ala7]-L7.9 (вызывал повышение Тхв).

V. ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОЗГА ГИБЕРНИРУЮЩИХ ЖИВОТНЫХ, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО

ГОМЕОСТАЗА.

В ИБОХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в лаборатории синтеза пептидов (рук. акад. В.Т. Иванов) из мозга гибернирующего якутского суслика Citellus undulatus и холодоадаптированной якутской лошади Yakutian horse были выделены, идентифицированы, а затем синтезированы новые вещества пептидной природы. Терморегуляторную активность изучали у 16 пептидов.

Полученные результаты и формулы пептидов представлены в табл. 5.

Терморегуляторная активность неокиоторфина.

НКТ и его аналог [DSer^-HKT вводили в/б (0.5 мг/кг) и i.n. (0.15 мг/кг).

Только в условиях термонейтральной среды НКТ, независимо от способа введения, вызывал повышение Тт, которое сопровождалось компенсаторным повышением Тхв (рис. 11).

Замена Ser2 на его стереоизомер не привела к изменению терморегуляторной активности НКТ.

Терморегуляторная активность кноторфнна.

КТ - С-концевой фрагмент НКТ, и его аналог [DArg2]-KT вводили в/б (0.5 мг/кг) и i.n (0.05 мг/кг).

а

б

Рис 11. Влияние НКТ, вводимого внутрибрюшипно в дозе 0.5 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк=4-6° С), термонейтральной (Тк = 27-28° С) и жаркой средах (Тк = 31-32° С). Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

Только в условиях холодной среды КТ независимо от способа введения, вызывал понижение Тт крыс (рис. 12). Замена А^2 на его стереоизомер БА^2 не привела к изменению активности КТ.

а

0,2 п

—Тк-4-воС —Тк=27-28оС -*-Тк=31-32оС

б

1,в т

-0.6

-»-Тк"4-6оС -*-Тк«27-28оС -*-Тк=31-32оС

Рис. 12. Влияние КТ, вводимого внутрибрюшинно в дозе 0.5 мг/кг, на динамику температуры тела (а) и температуры кожи хвоста (б) крыс, находящихся в холодной (Тк=4-6"С), термонейтральной (Тк « 27-28° С) и жаркой средах (Тк = 31-32° С). Отличия от контроля достоверны: * - Р <0.05.

И)С НАЦИМН, ,

библиотека СПстсрСург 1 О» МО а»

Терморегуляторная активность новых пептидов, выделенных из мозга CUelius

undulatus.

RZ-5 (НКТМ) и RZ-2 ([Gln']-HKTM) (0.5 мг/кг, в/б) не обладали терморегуляторной активностью ни в одном из температурных режимов.

Ala-Leu-Trp-TFA (0.05 мг/кг, i.n.) не обладал гипотермической активностью, но вызывал повышение Гхв, тогда как его фрагмент - Ala-Leu-TFA (0.05 мг/кг, i.n.) не проявлял никакой активности.

Asp-Tyr-TFA (0.5 мг/кг, в/б) не вызывал изменений динамики Тт крыс, независимо от температуры окружающей среды, в которой они находились. В термонейтральной среде пептид повышал Тхв.

RZ-3 (0.5 мг/кг, в/б) только в термонейтральной среде снижал Тт, которому предшествовало повышение Тхв.

RZ-6 (0.5 мг/кг, в/б) во всех температурных режимах вызывал сужение периферических сосудов, а в холодной среде способствовал снижению Тт.

RZ-8 (0.5 мг/кг, в/б) вызывал снижение Тт в холодной среде и реакцию расширения сосудов в термонейтральной.

RZ-10 (0.5 мг/кг, в/б) не оказывал влияния на Тт ни в одном из температурных режимов. В холодной среде Тхв экспериментальных животных была достоверно выше, чем у контрольных крыс. В термонейтральной среде пептид вызывал сужение периферических сосудов, а в жаркой среде - расширение.

Ни в одном из температурных режимов RZ-11(0.5 мг/кг, в/б) не вызывал изменений Тт и Тхв.

RZ-12 (0.5 мг/кг, в/б) только в термонейтральной среде вызывал двухфазный вазомоторный эффект и снижение Тт.

Терморегуляторная активность новых пептидов, выделенных из мозга Yakutian

horse.

В условиях действия холода при введении RZ-13 (0.5 мг/кг, в/б) наблюдалась гипотермия длительностью более 120 минут, без изменения динамики Тхв. В термонейтральной среде пептид не оказывал влияния на Тт, однако Тхв достоверно повышалась. В жаркой среде после введения пептида через 50 минут повышалась Тт, а через 90 минут - Тхв.

Таким образом, RZ-13 вызывал температуро-зависимое изменение Тт и реакцию расширения периферических сосудов в термонейтральной среде.

Таблица 5. Терморегуляторная активность пептидов, выделенных из мозга зимоспящих животных

№ Пептиды Температура тела, % при T.CQ - Температура кожи хвоста, % приТ,СС) =

] 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4-6 27-28 31-32 4-6 27-28 31-32

I Тф Ser Lys Tyr Arg - t - - T - -

2 Тф DSer Lys Tyr Arg - t - - t - -

3 Tyr Arg 4 - - t - - -

4 Tyr DArg 4 - - t - - -

5 Tkr Ser Lys ту - - - - - -

6 Gl. Ser Lys Tyr - - - - - -

7 Ala Leu Trp - - - t - -

8 Ala Leu - - - - - -

9 Asp Tyr - - - 4 t - -

10 Glu Tyr Asp His - 4 - t - -

11 Met Gly Arg Gly Thr 4 - t 4 - 4 4

12 Ala Val His Leu Arg Asn Asp Phe Thr Phe 4 _ _ t .

Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys

13 Tyr Tyr Ser Ser Gly - - - t - 4 t

14 Lys Lys Leu - - - - - -

15 Tyr Gin Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn _ 4 _ t 4

Ala Leu Ala His Lys Tyr His

16 Phe Leu Gly Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr 4 - t t 4 t

Phe Pro His Phe Aap Leu

Изучение терморегуляторной активности пептидов, выделенных из мозга гибернирующих животных, показало, что:

- температуро-зависимое изменение Тт вызывали только два пептида RZ-6 и RZ-13.

- смешанным вазомоторным действием обладали Asp-Tyr-TFA, RZ-10.

- сосудосуживающим действием во всех режимах обладал RZ-6.

- двухфазным вазомоторным действием в термонейтральной среде - RZ-12.

- сосудорасширяющим действием в термонейтральной среде - НКТ, Ala-Leu-Trp-TFA, RZ-3, RZ-8, RZ-13.

VI. НОВАЯ КОНЦЕПЦИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА.

Новая концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза заключается в разработке новых соединений на основе эндогенных пептидов, вызывающих не угнетение компенсаторных реакций терморегуляции, а изменение температурной чувствительности или смещение центрального уровня температурного контроля (set point), относительного которого они наступают при высокой или низкой температуре тела.

Отобранные пептиды изучали в условиях нестационарного температурного воздействия, позволяющего определить изменение центральной и периферической температурной чувствительности. Для определения выбора предпочтительной температуры окружающей среды (уровня (set point)) использовали метод поведенческой терморегуляции "термопреферендум".

VI.1. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА РАЗВИТИЕ КОМПЕНСАТОРНЫХ СОСУДИСТЫХ РЕАКЦИЙ В УСЛОВИЯХ НЕСТАЦИОНАРНОГО ТЕМПЕРАТУРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ.

Влияние ДМ и его аналогов [DAla4¡-ДМ, [Нур6]-ДМ, [йНРго6]-ДМ и [DdHPro'j-ДМ на развитие реакции вазодилятацииу крыс в условиях медленного повышения

температуры в камере.

При возрастании температуры окружающей среды (0.2 град/мин), наблюдалось повышение Тт до порогового значения, после чего развивалась реакция расширения периферических сосудов (табл. 6).

ДМ и его аналоги [Нур6]-ДМ, [<1НРго6]-ДМ и [В<1НРго6]-ДМ тормозили развитие компенсаторной сосудистой реакции за счет снижения порога центральной

(Тт была выше, чем в контроле) и периферической (Тхв была больше, чем в контроле) температурной чувствительности. Предварительное введение N1. не влияло на задержку возникновения компенсаторной реакции, вызыванную ДМ.

[ПА1а4]-ДМ, также тормозил развитие сосудистой реакции, но только за счет снижения порога периферической температурной чувствительности (только Тхв была выше, чем в контроле).

Таким образом, механизмы, обуславливающие задержку развития рефлекторной компенсаторной реакции на перегрев организма, для ДМ и его пролиновых аналогов - [Нурб]-ДМ, [<1НРго6]-ДМ и [ШНРго6]-ДМ отличаются от механизмов [БА1а4]-ДМ.

Влияние ДМ и его аналогов [ОА1а4]-ДМ, [Нур6]-ДМ, [¡¡НРго6]-ДМ и (Т)йНРто6}-ДМ на развитие реакции вазодилятации у крыс в условиях быстрого (градиентного) повышения температуры в камере.

Введение ДМ и его аналогов [Нур^-ДМ, [(ШРго^-ДМ и [Б(ШРго6]-ДМ и рЭА1а4]-ДМ приводило к задержке возникновения компенсаторной реакции, причем ДМ и его аналоги [Нур6]-ДМ, [с!НРго6]-ДМ и [0<111Ргоб]-ДМ, в отличие от [БА1а4]-ДМ< вызывали снижение центральной температурной чувствительности. Эффект действия ДМ на фоне предварительного введения КЬ не претерпевал изменений.

Следовательно, задержка развития компенсаторной реакции у ДМ, [Нур6]-ДМ, [<ШРго6]-ДМ, рМНРго6]-ДМ обусловлена другим механизмом, чем у [ВА1а4]-ДМ.

Кроме того, изменение температурной чувствительности, вызванное ДМ, не связано с его налоксон-чувствительной опиатной активностью.

Терморегуляторная активность 1 и фрагментов его деградации.

Пептиды вводили ¡.п. Т. - в дозе 0.3 мг/кг., Ь^-ОН, [01и3](у0Ме)-1-1.з-0Н - 0.1 мг/кг. и 1-1-7 - 0-2 мг/кг.

При введении Ь наблюдалось удлиннение времени возникновения компенсаторной реакции на перегрев за счет изменения периферической температурной чувствительности. Фрагменты его деградации (Ьц-ОН, [01и3](у0Ме)-1-1.3-ОН и Ь ,.7-ОН) активности не проявляли.

Таким образом, исследование К-концевых фрагментов литорина показало, что эти фрагменты не оказывают влияния на изменение температурной чувствительности.

Терморегуляторная активность НКТ и Ш-13.

В условиях медленного нагрева температуры в камере НКТ вызывал увеличение Тт, но не оказывал влияния на время возникновения компенсаторной сосудистой реакции и не вызывал изменения периферической температурной чувствительности (табл. 6).

В условиях быстрого нагрева температуры в камере НКТ только при в/б введении увеличивал время возникновения компенсаторной реакции на перегрев и снижал порог центральной температурной чувствительности.

М-13 вызывал изменения как центральной, так и периферической температурной чувствительности (табл. 6).

Таблица 6. Влияние пептидов, вводимых в/б (0.5 мг/кг) на развитие компенсаторной сосудистой реакции у крыс в условиях медленного (0.2 град/мин) повышения

температуры в камере.

Число Исходные Компенсаторная реакция

Пептиды живот значения (°С)

-ных Тк Гт Тк ДТк Тт ДТт лп

(°С) (°С) (°С) ГС) со (°С) (мин)

контроль п=17 23±0.8 37.3±0.2 30.Ы.8 6.9±1.6 37.Ш2 0л±02 68.0±11.2

ДМ п=17 23±0.6 37.3±0.4 32.1±1.4* 9.1±2Л" 38.1=0.4' 0.7±0.4' 91.6±10.7"

!ЧЬ+ДМ п-17 23±0.б 37.5±0.5 33.1±2.2" 10.1±2.6* 38.1±0.5* 0.6±0.6" 95.6±12.9*

[|ШРго61-ДМ п=14 23±0.б 37.4±0.3 32.8±1.2* 9.842.2* 38.2*0.4* 0.8±0.5* 91.б±11.7*

ЮсШРгоЧ-ДМ п=13 23±0.б 37.3±0.5 зз.з±2.2* 10.3±2.4* 37.9±0.$" 0.6±0.4' 95.6±11.9*

|Нур'1-ДМ п=15 23±0.6 37.3±0.4 33.4±1.4* 10.4±2.3* 38.0±0.4" в.7±0.4" 91.8±11.7"

ЮА]а4]-ДМ п=15 23±0.б 37 5зЛ.1 36.4±1.6" 13.4±1.6* 37.9±0.2 0.4±0.2 89.2±9.б"

НКТ п=15 23±0.5 37±0.2 31.8±2.1 7.8±2.1 37.7±0.5 0.7±0.4 58.8±17.8

1*2-13 п=15 23±0.5 37.3±0 1 33.4±1.6" 10.4±1.б" 38.0±0.4" 0.7±0.4* 88.0±9.8*

Примечание: Звездочкой (*) выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля по Т-тесту при Р<0.05.

У1.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИЮ В ТЕСТЕ "ТЕРМОПРЕФЕРЕНДУМ".

Пептиды вводили в/б в дозе 0.5 мг/кг. Полученные результаты представлены в табл. 7.

При помещении крыс в камеру контрольные животные выбирали отсек с Тк = 26.5±0.5° С.

После введения ДМ или его аналогов - [Нур6]-ДМ, [<ШРго6]-ДМ и [ШНРго6]-ДМ крысы предпочитали отсек с более прохладной температурой, чем контрольные. Наиболее холодное место предпочитали животные получавшие [Б<1НРго6]-ДМ.

После инъекции |рА1а4]-ДМ крысы останавливались при той же температуре, что и контрольные.

После введения НКТ животные перемещались в более теплый, а после введения КТ или RZ-13 предпочитали находиться в более прохладном отсеке.

Таким образом, после введения ДМ или его аналогов - [Нур6]-ДМ, [dHPro6]-ДМ, [DdHPro6], а также КТ и нового пептида, выделенного из мозга зимоспящих, -RZ-13 животные предпочитают более прохладную температуру (т.е. пептиды смещают "set point" в более низкий температурный диапазон, в результате чего тормозится развитие защитных компенсаторных реакций) и, тем самым, способствуют снижению Тт. Инъекция НКТ, наоборот, смещает "set point" в более высокий температурный диапазон, в результате чего организм интенсивно нагревается.

Таблица 7. Влияние пептидов на поведенческую терморегуляцию

в тесте "термопреферендум"

Пептиды Количество Предпочтительная

животных Тк С)

контроль 11=12 26.7±0.7

ДМ 11=10 23.3*0.6'

МНРлЛ-ДМ п-14 24.0*0.6'

[DdHPro'l-ДМ п=13 22.8±0.9*

ШувЧ-ДМ п—10 23.0±0Л"

fDAla'1-ДМ п=10 26.8±0.6

НКТ п=11 29.0±0.5"

КТ п=10 230±0.5*

RZ-13 п—11 24.0±0.5"

Примечание: Звездочкой (*) выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля по Т-тесту при Р<0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка средств фармакологической регуляции процессов температурного гомеостаза у теплокровных организмов является сложной, но весьма перспективной для клинического применения. Сложность заключается в том, что регуляция температурного гомеостаза осуществляется на основе комплексной обработки информации, поступающей с периферических и внутренних структур организма, с последующим развитием ответных компенсаторных реакций, направленных на сохранение температуры тела. В экстремальных условиях в ответные реакции вовлечены органы многих физиологических систем, и часто наносится ущерб их прямым функциям. В основу предложенной концепции фармакологической

регуляции температурного гомеостаза положена идея смещения уровня внутреннего эталонного порога ("установочной точки"), что позволяет затормозить, а не подавить, проявление компенсаторных реакций и, тем самым, устранить развитие нежелательных последствий. Для выявления веществ, обладающих способностью влиять на "set point" были выбраны эндогенные пептидные вещества, присутствующие в мозге шбернирующих животных. К пептидам, индуцирующим и поддерживающим состояние гибернации, относятся опиоиды (Jansky, 1990), DSIP, (Kramarova et.al., 1983), бомбезин (Muchalinski et.al., 1983) и др. Получение новых биологически активных соединений на основе природных веществ пептидной природы и вызывающих регулируемое снижение температуры тела - главная задача проведенных исследований. Решение поставленной задачи проводилось на основе изучения структурно-функциональных отношений пептидных соединений, обладающих гипотермической активностью, и является частью фундаментальной проблемы физиологии и медицины - изучения зависимости биологической функции от структуры макромолекул природных биологически активных соединений с целью создания на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

Используемый в работе методологический подход оценки влияния веществ на терморегуляторньте функции достаточно уникален. Разработанный метод непрерывной термометрии в стационарных и нестационарных условиях, дает возможность оценивать зависимость характера терморегуляторных эффектов пептидов от исходного функционального состояния системы терморегуляции, в значительной степени обусловленного температурой окружающей среды.

На основании полученных результатов выявлен новый класс пептидных соединений и создана база данных - пептидов-терморегуляторов.

С помощью направленных изменений в структуре молекулы дерморфина впервые удалось установить, что разные фрагменты молекулы ДМ ответственны за разные физиологические функции, что позволило получить пептиды с заданными свойствами. Впервые было показано, что влияние ДМ и его аналогов температуру тела и вазомоторные реакции опосредуется через разные типы рецепторов. Получены новые пептиды, вызывающие регулируемую липотермию за счет изменения уровня "set point'XtHyp'j-flM, [ёНРго^-ДМ и [DdHPro6]), которые можно рекомендовать в качестве веществ для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. Кроме того, выявлены пептиды, у которых наблюдалось перераспределение

физиологических функций: вазодилятация (ДМ^, Агё-рА1а4]-ДМ) или вазоконстрикция (4АттоРго-ДМ) доминировали над птотермической активностью; гипотермия доминировала над вазомоторными реакциями (Arg-[DArg2J-flM, Arg-[ОАгё2]-ДМы, [Тф3]-ДМ,.5).

С помощью математического предсказания фрагментов деградации пептидов на примере молекулы литорина удалось показать, что N-концевой дипептид (pGlu-Gln-OH) при периферическом введении вызывает снижение температуры тела, сопоставимое с действием бомбезина, а модифицированный N-концевой трипептид ([Glus](yOMe)-Li.3-OH) даже превосходит его по силе.

Изучение новых пептидов, полученных из фракций зимоспящих животных, показало, что ни один из тестируемых пептидов не смог воспроизвести снижение температуры тела до такого уровня, какое наблюдается у гибернирующих животных в природе. Однако, наличие в пептиде фрагмента (как в случае НКТ фрагмента КТ), который проявляет свою собственную активность, причем противоположно направленную ("ингибитор" КТ и "стимулятор" НКТ) являются хорошим примером такого типа структурно и функционально связанных между собой отношений, обеспечивающих циклический характер изменения температуры тела. Кроме того, обнаружено, что НКТ и КТ сдвигают "set point" в противоположные стороны. По такому принципу могут работать и другие природные биорегуляторы. Особого внимания заслуживает новый пептид RZ-13, вызывающий температуро-зависимое изменение температуры тела и вызывающий смещение "set point".

Новая концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза и исследования структурно-функциональных взаимоотношений эндогенных пептидов и веществ, полученных из мозга гибернирующих животных, позволили выявить новые пептидные соединения, перестраивающие уровнь внутреннего эталонного порога ("установочной точки") и тормозящие ответные компенсаторные реакции.

ВЫВОДЫ

1. На основе исследований структурно-функциональных отношений среди эндогенных пептидов: дерморфина, Leu-энквфалина, неокиоторфина, киоторфина, бомбезина, литорина и их фрагментов и аналогов (всего 96 пептидов) выявлен новый класс соединений, вызывающих обратимую регулируемую гипотермию. Определены новые, выделенные из мозга гибернирующих животных пептиды-терморегуляторы. Создана база данных пептидов-терморегуляторов.

2. Дерморфин вызывает течпературо-зависимую гипотермию и двухфазную вазомоторную реакцию. Его гипотермический эффект и реакция вазоконстрикции опосредуются налоксон-чувствительяыми рецепторами, тогда как реакция расширения периферических сосудов - налоксон-нечувствительными рецепторами.

3. Разные фрагменты молекулы дерморфина ответственны за разные виды физиологической активности: для проявления гипотермического эффекта достаточно наличие N-концевого тетрапептида, для реакции вазодилятации - N-концевого гексапептида, для реакции вазоконстрикции - целой молекулы.

4. Модификация в молекуле дерморфина аминокислотных остатков в первом, во втором, третьем, четвертом и шестом положениях показала, что замена DAla2 на DArg2, Phe3 на Trp3, Gly4 на DAla4, Pro6 на Hyp6, dHPro6 и DdHPro6 сохраняет гипотермическую активность. Модификация N-концевого тетрапептида (замена DAla2 на DArg2) увеличивает длительность гипотермического эффекта более чем в два раза. Удлинение молекулы дерморфина с N-конца на один аминокислотный остаток приводит к усилению и перераспределению вазомоторной активности. Добавление Arg увеличивает налоксон-нечувствительную реакцию вазодилятации, а 4Amino-Pro - налоксон-чувствительную реакцию вазоконстрикции.

5. Дерморфин и его аналоги, вызывающие температуро-зависимую гипотермию -[Нур6]-ДМ, [<ШРго6]-ДМ и [DdHPro6], снижают не только порог центральной и периферической температурной чувствительности, но и смещают уровень "set point" в сторону холодных температур, тогда как [ОА1а4]-ДМ изменяет только чувствительность периферической рецепции.

6. Бомбезин является сильным гипотермиком, проявляющим активность при интраназальном введении. N-концевые фрагменты его деградации играют самостоятельную роль в проявлении терморегуляторного действия. Выявлен новый

аналог фрагмента бомбезина Glp-Gln-Glu(yOMe)-OH, гипотермический эффект которого превышает эффект самого бомбезина.

7. Новые пептиды, полученные из фракций мозга гибернирующих животных, вызывают снижение температуры тела. Установлено, что новый пептид RZ-13 вызывает температуро-зависимые изменения температуры тела и сдвигает "set point" в сторону холодной среды. Неокиоторфин и фрагмент его деградации - киоторфин вызывают разнонаправленные изменения температуры тела. Неокиоторфин -повышение температуры тела и смещение "set point" в сторону жаркой среды, а киоторфин - наоборот.

8. Выявленные новые пептидные соединения могут быть рекомендованы для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. В качестве веществ, вызывающих легкую, обратимую гипотермию: [Нур6]-ДМ, [с!НРго6]-ДМ, [DdHPro6]-ДМ и RZ-13. В процессе исследований получены новые соединения, которые могут быть рекомендованы: Arg-ДМ - как сосудорасширяющее средство и 4Ашшо-Рго-ДМ -как сосудосуживающее средство, a Glp-Gln-Glu(yOMe)-OH - как средство для быстрого снижение температуры тела.

9. Разработана новая концепция фармакологической пептидной рефляции температурного гомеостаза, основанная на изменении центрального уровня регуляции, относительно которого развиваются защитные компенсаторные реакции, в результате чего не происходит активации комплекса компенсаторных реакций, вызывающих негативные последствия при клиническом применении гипотермии.

10. Разработан новый оригинальный комплексный методологический подход для выявления и изучения веществ, вызывающих изменения в системе терморегуляции не только на уровне изменения температуры тела и развития компенсаторных реакций, но и на уровне температурной чувствительности и центральной регуляции температурного гомеостаза in vivo.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние киоторфина и неокиоторфина на терморегуляцию крыс. // III Всесоюзн. Симп.,

1990, Сб. "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов", Горький, ноябрь, с. 54, (соавт.: Усенко А.Б., Ушаков В.В., Кононова Л.В., Михалева И.И.).

2. Зависимость действия пептидов на температурный гомеостаз // III Всесоюзн. Симп., 1990,

Сб. "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов", Горький, с. 55.

3. Влияние дерморфина на терморегуляцию крыс при различных температурах внешней

среды. // Ш Всесоюзн. Сими.., 1990, Сб. "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов", Горький, ноябрь, с. 57-58, (соавт.: Усенко А.Б., Ушаков В.В., Каменский А.А., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

4. Роль функционального состояния системы терморегуляции в действии пептидов на

температурный гомеостаз. // Всесоюзн. Конф., 1990, Сб. "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды", Новосибирск, с.38.

5. Thermoregulatory peptides: correlation between structure and function. // The I-st Int. Biophisics

congress and biotechnology at GAP, 1991, Dicle University, Turkey, May, p. 119, (соавт.: Usenko A.B., Shishkov A.V., Gedrovich A.V., EfimovA.V., DeiginV.I., YarovaE.P., Michaleva LI., Bespalova G.D.).

6. Зависимость терморегуляторных и поведенческих эффектов дерморфина от температуры

окружающей среды. // Всес. Симп., 1991, Сб. "Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии", Москва, с. 73-75, (соавт.: Усенко А.Б., Каменский А.А., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

7. Влияние дерморфина на спонтанное поведение белых крыс в различных температурных

условиях. // Всесоюзн. Конф., 1991, Сб. "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза", Сыктывкар, с. 63, (соавт.: Усенко АБ., Каменский А.А., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

8. Изменение чувствительности температурного анализатора под действием дерморфина. //

Всесоюзн. Конф., 1992, Сб. "Сенсорная информация", Ленинград, с. 32, (соавт.: Усенко А.Б., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

9. О возможности применения пептидов в искусственной гипотермии. // II Межд. Конф.,

1992, Сб. "Успехи современной криобиологии", Харьков, с. 63, (соавт.: Усенко А.Б., Ушаков В.В., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

10. The peptides from the brain of hibernating ground squirrels and their biological effects. // Abstracts of the 8-th FRG-USSR Symposium on chemistry of peptides and proteins. 1991, Aahen, p. 27, (соавт.: Mikhaleva I.I., Svieryaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Kokoz Y.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., Ignatiev D.A., Sukhova G.S., Ivanov V.T.).

11. Effect of dermorphin on termoregulation in rats at selected ambient temperatures.// Biomedical science, 1991, v.2, № 6, p. 601-606, (соавт.: UsenkoA.B., DeiginV.I., YarovaE.P., Kamensky A.A.).

12. Bioactive peptides from the brain of hibernating ground squirrels and their possible participation in hibernation mechanisms. // Intern. Symp., "Structure and function of regulatory polypeptides", Moskow, 1992, № 1, p.90, (соавт.: Ziganshin R.H., Svieryaev V.I.,

Vaskovsky B.V., Mikhaleva I.I., IvanovV.T., KokozY.M., Alekseev A.E., Ignatiev D.A., Kruman I.M., Sukhova G.S.).

13. Влияние киоторфина и неокиоторфина на терморегушщию крыс при различных температурах внешней среды. // Сб. "Эколого-физиологоческие характеристики гипометаболических состояний", Пущино, 1992, т. П, с. 132-137, (соавт.: Усенко А.Б., Ушаков В.В., Кононова Л.В., Михалева И.И.).

14. The peptides from the brain of hibernating ground squirrels and their biological effects. // Chemistry of Peptides and Proteins, ed. by V. Ivanov and W. Voelter, DWI Reports, 1993, v.5/6, Part A, 112A, p. 299-308, (соавторы: Mikhaleva I.I., Svieryaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Ignatiev D.A., KokozYu.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., Kruman I.M., Sukhova G.S., Ivanov V.T.).

15. Биологически активные пептиды, выделенные из мозга зимоспящих сусликов. // Ж. Биоорг. химии, 1994, т. 20, № 8-9, с. 899-918, (соавт.: Зиганшин Р.Х., СвиряевВ.И., Васьковский Б.В., Михалева И.И., Иванов В.Т., КокозЮ.М., Алексеев А.Е., Корыстова А.Ф., Сухова Г.С., Усенко А.Б.).

16. Влияние дерморфина на развитие компенсаторных терморегуляторных сосудистых реакций в условиях перегрева // БЭБиМ, 1994, т.118, № 8, с. 151-153, (соавт.: Усенко А.Б., Дейгин В.И., Ярова Е.П.).

17. Biological active peptides isolated from bran of hibernating ground squarel and cold adapted Yakutian horse. // In: Peptides: Chemistry, Structure and Biology. Ed. Provin T.P., Kaumaya and R.S. Hodjes, Mayflower, Scientific Ltd. 1996, p. 244-245, (соавт.: Ziganshin R.H., Mikhaleva 11., IvanovV.T., KokozYu.M., Alekseev A.E., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Akhremenko A.K.).

18 Физиологические эффекты дерморфина и его аналога [ОАЫ^-дерморфина. // ДАН, 1996, т, 346, № 2, с. 272-273, (соавт.: Батурина Е.Ю., Воскресенская О.Г., Каменский А.А., Дейгин В .И., Ярова Е.П., Усенко А.Б.).

19 Effect of dermorphin on termoregulation in rats at selected ambient temperatures// Peptides, 1996, v. 17, № 2, p. 241-245, (соавт.: UsenkoA.B., DeiginV.I., YarovaE.P., Kamensky A.A.).

20. Biological active peptides isolated from brain of hibernating ground squarel and cold adapted Yakutian horse. // In: Adaptation to the cold: Tenth Int. Hybernation Symp. Ed. By Geiser F., Hulbert A., Nicol S.C. University of New England Pres., Armidale, 1996, P. 373-378, (соавт.: Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Y.M.,, Korystova A.F., Mavlyutova D.A.).

21. Effect of [Hyp6]-dermorphin on spontaneous behaviour and thermoregulation in rats. // The Journal of the European College of Neurophychopharmacology, 1999, September, v. 9, Supp. 5,

p. S374, (соавт.: Bonartsev A.P., UranovaM.G., UsenkoA.B., Kamensky A.A., Andreeva LA., Alfeeva L.Yu.).

22. Гептапептид, обладающий анальгетической активностью, сочетающийся с терморегуляторной и/или с сосудодвигательной активностью и/или с влиянием на поведенческую реакцию испытуемого и способ изменения физиологической активности дерморфина. // Патент на изобретение №2134121 от 10.08.99, приоритет от 02.07.97, (соавт.: Незавибатько В.Н., Усенко А.Б., Андреева Л.А.).

23. Влияние дерморфина, его фрагментов и аналогов на систему терморегуляции. // Междунар. Конф. "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности", 1999, Беларусь, Минск, с. 126, (соавт.: Усенко А.Б., Горячева Н.Н., Гузеватых Л.С., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

24. Тсрморегуляторное действие пироглугамил-глутамина. // Сб. "Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза", Гродно, 2000, с. 106-109, (соавт.: Галюк Е.Н., Егорова С.В., Голубович В.П.).

25. Effect of [DPro^-dermorphin on spontaneous behavior and thermoregulation in rats. // The Journal of European College of Neuropsychopharmacology of the 5-th ECNP Regional Meeting, Abstracts, St.-Peterburg, 2000, v. 10, suppl. 2, p.S88, (соавт.: UranovaM.G., UsenkoA.B., Bonartsev A.P., Kamensky A.A., Andreeva L. A., Alfeeva L.Yu., Myasoedov N.F.).

26. Влияние дерморфина и его аналогов на свободное поведение белых крыс. //ДАН, 2000, т.370, № 5, с.704-707, (соавт.: Усенко А.Б., УрановаМ.Г„ Каменский А.А., Алфеева А.Ю., Андреева ЛА., Мясоедов Н.Ф.).

27. Влияние опиоидных пептидов дерморфина и [dHPro6]-дерморфина на поведение крыс в тесте "открытое поле. // Тез. Докл. II Российского конгресса по патофизиологии с международным участием "Патофизиолошя органов и систем. Типовые патологические процессы", 2000, с. 39-40, (соавторы: УрановаМ.Г., Усенко А.Б., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф.).

28. Изучение анальгетической активности аналогов эндогенного пептида дерморфина. // Межд. Науч. Конф. "Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника", Минск, 2001, с. 36, (соавт.: Гузеватых Л.С., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Усенко А.Б., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф.).

29. Comparison of effects of novel dermorphin analogues and dermorphin on in vitro and in vivo gastrointestinal tests in rats. // J. Pharmacol. Res., 2001, v. 43, suppl. A, p.l 13, (соавт,: BroccardoM., ImprotaG., UsenkoA.B., UranovaM.G., Andreeva L.A., Alfeeva L.Yu., Myasoedov N.F.).

30. Дерморфины - природные опиоиды с упикальной первичной структурой, определяющей специфику их биологической активности. // Известия АН, сер. биол., 2002, № 2, с. 192-204, (соавт.: Усенко А.Б., Мясоедов Н.Ф.).

31. Влияние аналогов дерморфина на терморегуляцию крыс в различных температурных режимах. // Известия АН, сер. биол., 2002, № 3, с. 348-354, (соавт.: Усенко А.Б., Бонарцев А.П., Каменский А.А., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

32. Влияние структурных изменений Pro6 в молекуле дерморфина на анальгетическую активность. // Известия АН, сер. биол., 2002, № 4, с. 472-476, (соавт.: Гузеватых Л.Г., Усенко А.Б., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф.).

33. Структурно-конформационные особенности дерморфинов и их роль в регуляции температурного гомеостаза. // Тез. Докл. Всерос. симп. "Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем", Иваново, 2002, с. 22, (соавт.: Усенко А.Б., Гузеватых Л.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

34. Дерморфины - природные опиоидные пептиды. Связь структуры с функцией. // Тез.науч. докл. III Съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 538, (соавт.: Усенко А.Б., Гузеватых Л.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

35. Влияние дерморфина и его аналогов на поведение животных в условиях воздействия стресса разной интенсивности. // Тез. Науч. Докл. III Съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 561, (соавт.: Усенко А.Б., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

36. Natural opioids - dermorphins and casomorphines, having neurotropic activity. Structure-fmctional analysis. // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology,

2002, v. 12, Suppl. 3, p. S429, (соавт.: Malinovskaya I.V., Usenko A.B., Chulichkov A.I.., Dubynin V.A., Andreeva L.A., Alfeeva L.Yu., Myasoedov N.F.).

37. In vitro and in vivo opioid activity of [DPro6]-dermorphin, a novel analogue to dermorphin. // Peptides, 2003, 24, p. 419-428, (соавт.: BroccardoM., Usenko A.B., UranovaM.G., Guzevatykh L.S., Kamensky A.A., Andreeva L.A., Alfeeva,L.Yu., Myasoedov N.F., Gianini E., Improta G.).

38. Structure-activity relationships of Dermorphines. // Tenth German-Russian Peptide Symposium,

2003, Turingia, p. 23, (соавт.: Usenko A.B., Guzevatykh L.S., Andreeva L.A., Alfeeva L.Yu., Myasoedov N.F.).

39. Структурно-функциональные исследования дерморфинов. // Тез. Докл. Российского симп. по химии и биологии пептидов; 2003, Москва, с.10, (соавт.: Усенко А.Б., Гузеватых Л.С., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф.).

40. Физиологические эффекты дерморфинов со стереохимической модификацией остатка Pro6. П Тез. Стенд. Сообщ. Российского симп. по химии и биологии пептидов,

2003,Москва, с. 99, (соавт.: Усенхо А.Б., Уранова М.Г., Алфеева Л.Ю., Андреева JI.A., Мясоедов Н.Ф.).

41. Влияние иммунизации к дерморфину на спонтанное поведение белых крыс. // Тез. Стенд. Сообщ. Российского симп. по химии и биологии пептидов, 2003, Москва, с.34, (соавт.: Малиновская И.В.; Валуйских Д.В.; Усенко А.Б.; Горячева H.H.).

42. Роль шестой аминокислоты молекулы дерморфина в проявлении анальгетической активности пептида. // Тез. Стенд. Сообщ. Российского симп. по химии и биологии пептидов, 2003, Москва, с. 66, (соавт.: Гузеватых Л.С., Валуйских Д.В., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф.).

43. Влияние [DAla4]-дерморфина, его фрагментов и аналогов на функциональное состояние системы терморегуляции крыс, находящихся при разной температуре окружающей среды. // Известия АН, сер. биол., 2004, № 4, с.481-487.

44. Влияние пептидомиметиков нейротензина на систему терморегуляции крыс. // Известия АН, сер. биол., 2004, № 4, с. 488-492, (соавт.: Гузеватых Л.С., Зайцева Н.И.,Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А.).

45. Терморегуляторная активность фрагментов дерморфина. // Известия АН, сер. биол., 2004, № 5, с. 570-576, (соавт.: Горячева H.H., Гузеватых Л.С., Андреева Л. А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

46. Изучение терморегуляторной активности фрагмента природного предшественника дерморфина - Arg-дерморфина и его аналогов. // Известия АН, сер. биол., 2005, № 1, с. 1-8, (соавт.: Гузеватых Л.С., Горячева H.H., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.).

47. Анальгетическая активность дерморфина и его пролиновых аналогов. // Экспер. и клин, фармакол., 2005, №2, с. 25-30, (соавт.: Гузеватых Л.С., Валуйских Д.В., Воронина Т.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Середенин С.Б., Мясоедов Н.Ф.).

48. Сравнительное изучение физической зависимости пролинового аналога дерморфина и морфина. // Экспер. и клин, фармакол., 2005, №4, с. 120-125,(соавт.: Гузеватых Л.С., Валуйских Д.В., Воронина Т.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Мясоедов Н.Ф.)

49. Влияние стереохимической модификации Pro6 в молекуле дерморфина на изменение сосудодвигательной активности. // Тез. Докл. II Российского симп. по химии и биологии пептидов, Санкт-Петербург, 2005, с.39, (соавт.: Гузеватых Л.С., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Воронина Т.А.).

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 08.08.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. ЗДТираж 150 экз. Заказ 464. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Р15 18 в

РНБ Русский фонд

2006-4 11693

Актуальность темы. В последнее время гипотермия находит все большее применение в клинических условиях. Гипотермию используют в нейрохирургии: для снижения внутричерепного давления при некоторых видах травм и гипоксических-ишемических инсультах, при операциях на магистральных сосудах мозга, церебральных аневризмах, врожденных пороках артерио-венозных сосудов, злокачественной опухоли основания черепа (Hachimi-Idrissi, Huyghens, 2004; Mohammad, et al., 2004; Smrcka, et al., 2005) и в кардиологии: при операциях на открытом сердце (Hearse, 1980; Barner, 1980), при внезапной остановке сердца (Friberg, et al., 2004), ишемических инфарктах (Mohammad, et al., 2004). Возрастающий интерес к патофизиологии апоптоза и другим процессам гибели клеток, а также к механизмам, лежащим в основе защитных эффектов гипотермии, привел к расширению диапазона клинического применения гипотермии (Brux, et al., 2005). Во многих зарубежных медицинских центрах гипотермия стала частью стандартной терапии. Данные Европейского и Австралийского Испытательных Центров продемонстрировали снижение смертности и тяжести неврологических нарушений после применения гипотермии. В 2003 году International Liaison Committee on esuscitation (ILCOR) включил терапевтическую умеренную гипотермию (32-34° С) в протокол необходимых реанимационных мероприятий при внезапной остановке сердца (Рорр, et al., 2005).

Традиционные способы принудительного охлаждения с применением физических методов понижения температуры тела и известная медикаментозная гипотермия весьма отрицательно влияют не только на больной, но и на здоровый организм. При охлаждении гомойотермов происходит активация компенсаторных защитных механизмов терморегуляции, преодолеть которые крайне трудно. Основные исследования по разработке фармакологических гипотермических средств были направлены на создание соединений, препятствующих развитию специфических компенсаторных терморегуляторных реакций и подавляющих сократительный и несократительный термогенез. В качестве попытки создания комплексного средства для подавления термогенеза можно привести нейроплегический коктейль (промедол, морфин, аминазин, атропин, димедрол, гексоний и т.д.) (Тимофеев, 1983), который, однако, не вышел за пределы экспериментального изучения.

В природе примером регулируемой гипотермии является гибернация -физиологическое состояние, при котором происходит минимизация уровня физиологических функций организма, позволяющая в течение многих месяцев переживать неблагоприятные условия внешней среды. Искусственное получение гипобиоза по аналогии с естественным, имеет вековую историю (Бахметьев, 1902). Многие ведущие научные центры, как за рубежом, так и в нашей стране, проводят исследования по изучению естественного и созданию искусственного гипобиоза. В основе процессов гипобиоза лежит регулируемое обратимое снижение температуры тела, связанное не только с угнетением термогенеза, но и с изменением центрального уровня регуляции (смещением "set point"). На протяжении последних 15 лет в ИБОХ РАН под руководством академика В.Т. Иванова проводятся исследования по выделению и идентификации новых биологически активных соединений пептидной природы из мозга гибернирующих животных (Зиганшин, и др. 1994).

В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма. Большинство природных пептидных соединений обладает полифункциональным действием, что затрудняет создание на их основе лекарственных препаратов с избирательной активностью. Поэтому изучение и создание на основе структурно-функциональных взаимосвязей новых пептидных соединений, вызывающих регулируемое изменение температуры тела, является актуальной проблемой современной фармакологии. Исследование структурно-функциональных взаимоотношений позволяет не только определить пептидную последовательность, обладающую заданными свойствами, но на основе направленной модификации усилить или ослабить эти свойства.

Изыскание новых терморегуляторно-активных пептидных соединений и создание на их основе пептидов-терморегуляторов (в частности пептидов, вызывающих мягкую обратимую гипотермию) является актуальным и имеет большое значение для решения широкого круга задач клинической медицины.

Работа поддержана грантами РФФИ №00-04-48272 , №03-04-48404 и офиа №04-04-08009.

Целью настоящего исследования явилась разработка средств фармакологической регуляции процессов температурного гомеостаза на основе исследований структурно-функциональных взаимоотношений в рядах эндогенных пептидов (дерморфинов, Ьеи-энкефалинов, DSIP, бомбезинов и новых соединений, выделенных из мозга гибернирующих животных), оказывающих влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, и создание на этой основе базы данных новых веществ - пептидов-терморегуляторов.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных исследований в ряду эндогенного опиоидного пептида дерморфина (ДМ).

2. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе изучения закономерностей зависимости между структурой и терморегуляторной активностью эндогенного опиоидного пептида Ьеи-энкефалина (Leu-ЭНК), его фрагментов и аналогов.

3. Поиск средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза на основе структурно-функциональных отношений в ряду эндогенного пептида DSIP.

4. Изучение гипотермической активности теоретически предсказанных фрагментов деградации эндогенного пептида бомбезина и его модифицированного фрагмента - литорина.

5. Изучение новых пептидов, выделенных из мозга гибернирующих животных, в качестве средств фармакологической регуляции температурного гомеостаза.

6. Разработка новой концепции фармакологической регуляции температурного гомеостаза.

Научная новизна. Выявлен новый класс пептидных соединений и создана база данных - пептидов-терморегуляторов.

Разработан новый оригинальный комплексный методологический подход для выявления и изучения веществ, вызывающих изменения в системе терморегуляции не только на уровне изменения температуры тела и развития компенсаторных реакций, но и на уровне температурной чувствительности и центральной регуляции температурного гомеостаза in vivo.

Разработана новая концепция фармакологической пептидной регуляции температурного гомеостаза, основанная на изменении центрального уровня регуляции, относительно которого развиваются защитные компенсаторные реакции. Предложенная концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза позволяет существенно снизить активность защитных компенсаторных реакций, вызывающих негативные последствия при клиническом применении гипотермии.

Впервые установлено, что дерморфин, вызывает обратимую температуро-зависимую гипотермию и двухфазную вазомоторную реакцию (вазодилятация сменяется вазоконстрикцией). Гипотермия и реакция вазоконстрикции опосредуется через налоксон-чувствительные, а реакция вазодилятации - через налоксон-нечувствительные рецепторы.

На основе структурно-функциональных исследований пептидов семейства дерморфина впервые показано, что разные фрагменты молекулы дерморфина ответственны за разные виды физиологической активности. Гипотермическим действием обладает только N-концевой тетрапептид. Реакцию вазодилятации вызывает N-концевой гексапептид. Для проявления двухфазной сосудистой реакции необходима целая молекула дерморфина. Модификация в молекуле дерморфина аминокислотных остатков в первом, во втором, третьем, четвертом и шестом положениях показала, что возможна замена DAla2 на DArg2, Phe3 на Тгр3, Gly4 на DAla4, Pro6 на Hyp6, dHPro6 и DdHPro6. Модификация N-концевого тетрапептида (замена DAla2 на DArg2) позволила увеличить длительность гипотермического эффекта более чем в 2 раза. Удлинение молекулы ДМ с N-конца на один аминокислотный остаток позволило разделить гипотермическую активность, а также реакцию вазодилятации и реакцию вазоконстрикции. Добавление Arg к молекуле с N-конца в 2 раза увеличило налоксон-нечувствительную реакцию вазодилятации, a 4Amino-Pro - в 3 раза налоксон-чувствительную реакцию вазоконстрикции.

Впервые показано, что бомбезин вызывает гипотермию при интраназальном введении. N-концевые дипептиды - фрагменты-метаболиты деградации литорина и бомбезина, обладают самостоятельной гипотермической активностью. Установлено, что аналог N-концевого трипептида Glp-GIn-GIu(yOMe)-OH превышает гипотермический эффект бомбезина.

Впервые установлено, что пептиды (неокиоторфин (НКТ) и киоторфин (КТ)), выделенные из фракций мозга зимоспящих животных, оказывают влияние на температуру тела и вазомоторные реакции. НКТ вызывает гипертермию только в условиях термонейтральной среды. КТ - С-концевой фрагмент НКТ, снижает температуру тела только в холодной среде. Пептид RZ-13 вызывает температуро-зависимые изменения температуры тела и реакцию расширения периферических сосудов.

Научно-практическое значение. Выявлен новый класс пептидных соединений - пептидов-терморегуляторов.

Разработан новый комплексный методологический подход для изучения фармакологической регуляции температурного гомеостаза in vivo, на основе которого проведено изучение структурно-функциональных взаимоотношений фрагментов и аналогов дерморфина, Ьеи-энкефалина, бомбезина, литорина, некиоторфина и киоторфина и выявлен новый класс соединений, вызывающих регулируемую обратимую легкую гипотермию. Определены и отобраны новые, выделенные из мозга гибернирующих животных, пептиды-терморегуляторы. Выявлены пептиды, вызывающие смещение уровня центральной температурной регуляции, относительно которого включаются защитные компенсаторные механизмы.

Установлен ряд новых оригинальных веществ, для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. Эти соединения являются перспективными для дальнейшей разработки их в качестве лекарственных препаратов: - [Нур6]-ДМ, [ёНРго6]-ДМ, [DdHPro6]-,fl[M и RZ-13 (пептид из мозга гибернирующих животных) вызывают регулируемую гипотермию за счет изменения уровня центральной регуляции; [БА1а4]-ДМ вызывает гипотермию за счет снижения порога периферической температурной чувствительности; Arg-ДМ обладает сосудорасширяющим действием; 4Атто-Рго-ДМ - сосудосуживающим.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзной конференции "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" и

Горький, 1990); Всесоюзной конференции "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды" (Новосибирск. 1990); The I-st Int. Biophisics congress and biotechnology at GAP (Dicle, Turkey, 1991), Всесоюзном Симпозиуме "Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии"(Москва, 1991); Всесоюзной Конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза"(Сыктывкар, 1991); The 8-th FRG-USSR Symposium on chemistry of peptides and proteins (Aahen,

1991); Всесоюзной Конференции "Сенсорная информация" (Ленинград, 1992); II Международной Конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков,

1992); Международном симпозиуме "Структура и функция регуляторных полипептидов", (Москва, 1992); . Международной конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности"(Беларусь, Минск, 1999); The 5-th ECNP Regional Meeting (St.-Peterburg, 2000); Международной научной конференции "Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника" (Минск, 2001); Всероссийском симпозиуме "Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем" (Иваново, 2002); III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Tenth German-Russian Peptide Symposium (Turingia, 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003, Ст-Петербург, 2005).

Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 513 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 381 страница машинописного текста, содержит 28 таблиц и 85 рисунков. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 печатных работ. Зарегистрирован патент РФ №2134121 от 10.08.99, приоритет от 02.07.97.

ВЫВОДЫ

1. На основе исследований структурно-функциональных отношений среди эндогенных пептидов: дерморфина, Ьеи-энкефалина, неокиоторфина, киоторфина, бомбезина, литорина и их фрагментов и аналогов (всего 96 пептидов) выявлен новый класс соединений, вызывающих обратимую регулируемую гипотермию. Определены новые, выделенные из мозга гибернирующих животных пептиды-терморегуляторы. Создана база данных пептидов-терморегуляторов.

2. Дерморфин вызывает температуро-зависимую гипотермию и двухфазную вазомоторную реакцию. Его гипотермический эффект и реакция вазоконстрикции опосредуются налоксон-чувствительными рецепторами, тогда как реакция расширения периферических сосудов - налоксон-нечувствительными рецепторами.

3. Разные фрагменты молекулы дерморфина ответственны за разные виды физиологической активности: для проявления гипотермического эффекта достаточно наличие N-концевого тетрапептида, для реакции вазодилятации - N-концевого гексапептида, для реакции вазоконстрикции - целой молекулы.

4. Модификация в молекуле дерморфина аминокислотных остатков в первом, во втором, третьем, четвертом и шестом положениях показала, что замена DAla2 на

DArg2, Phe3 на Trp3, Gly4 на DAla4, Pro6 на Hyp6, dHPro6 и DdHPro6 сохраняет гипотермическую активность. Модификация N-концевого тетрапептида (замена 2 2

DAla на DArg ) увеличивает длительность гипотермического эффекта более чем в два раза. Удлинение молекулы дерморфина с N-конца на один аминокислотный остаток приводит к усилению и перераспределению вазомоторной активности. Добавление Arg увеличивает налоксон-нечувствительную реакцию вазодилятации, a 4Amino-Pro - налоксон-чувствительную реакцию вазоконстрикции.

5. Дерморфин и его аналоги, вызывающие температуро-зависимую гипотермию - [Нур6]-ДМ, ^НРго6]-ДМ и [DdHPro6], снижают не только порог центральной и периферической температурной чувствительности, но и смещают уровень "set point" в сторону холодных температур, тогда как [ОА1а4]-ДМ изменяет только чувствительность периферической рецепции.

6. Бомбезин является сильным гипотермиком, проявляющим активность при интраназальном введении. N-концевые фрагменты его деградации играют самостоятельную роль в проявлении терморегуляторного действия. Выявлен новый аналог фрагмента бомбезина Glp-Gln-Glu(yOMe)-OH, гипотермический эффект которого превышает эффект самого бомбезина.

7. Новые пептиды, полученные из фракций мозга гибернирующих животных, вызывают снижение температуры тела. Установлено, что новый пептид RZ-13 вызывает температуро-зависимые изменения температуры тела и сдвигает "set point" в сторону холодной среды. Неокиоторфин и фрагмент его деградации -киоторфин вызывают разнонаправленные изменения температуры тела. Неокиоторфин - повышение температуры тела и смещение "set point" в сторону жаркой среды, а киоторфин - наоборот.

8. Выявленные новые пептидные соединения могут быть рекомендованы для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. В качестве веществ, вызывающих легкую, обратимую гипотермию: [Hyp6]-ДМ, [ёНРго6]-ДМ, [Бс1НРго6]-ДМ и RZ-13. В процессе исследований получены новые соединения, которые могут быть рекомендованы: Arg-ДМ - как сосудорасширяющее средство и 4Атто-Рго-ДМ - как сосудосуживающее средство, a Glp-Gln-Glu(yOMe)-OH - как средство для быстрого снижение температуры тела.

9. Разработана новая концепция фармакологической пептидной регуляции температурного гомеостаза, основанная на изменении центрального уровня регуляции, относительно которого развиваются защитные компенсаторные реакции, в результате чего не происходит активации комплекса компенсаторных реакций, вызывающих негативные последствия при клиническом применении гипотермии.

10. Разработан новый оригинальный комплексный методологический подход для выявления и изучения веществ, вызывающих изменения в системе терморегуляции не только на уровне изменения температуры тела и развития компенсаторных реакций, но и на уровне температурной чувствительности и центральной регуляции температурного гомеостаза in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка средств фармакологической регуляции процессов температурного гомеостаза у теплокровных организмов является сложной, но весьма перспективной для клинического применения. Сложность заключается в том, что регуляция температурного гомеостаза осуществляется на основе комплексной обработки информации, поступающей с периферических и внутренних структур организма, с последующим развитием ответных компенсаторных реакций, направленных на сохранение температуры тела. В экстремальных условиях в ответные реакции вовлечены органы многих физиологических систем, и часто наносится ущерб их прямым функциям. В основу предложенной концепции фармакологической регуляции температурного гомеостаза положена идея смещения уровня внутреннего эталонного порога ("установочной точки"), что позволяет затормозить, а не подавить, проявление компенсаторных реакций и, тем самым, устранить развитие нежелательных последствий. Для выявления веществ, обладающих способностью влиять на "set point" были выбраны эндогенные пептидные вещества, присутствующие в мозге гибернирующих животных. К пептидам, индуцирующим и поддерживающим состояние гибернации, относятся опиоиды (Jansky, 1990), DSIP, (Kramarova et.al., 1983), бомбезин (Muchalinski et.al., 1983) и др. Получение новых биологически активных соединений на основе природных веществ пептидной природы и вызывающих регулируемое снижение температуры тела - главная задача проведенных исследований. Решение поставленной задачи проводилось на основе изучения структурно-функциональных отношений пептидных соединений, обладающих гипотермической активностью, и является частью фундаментальной проблемы физиологии и медицины - изучения зависимости биологической функции от структуры макромолекул природных биологически активных соединений с целью создания на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

Используемый в работе методологический подход оценки влияния веществ на терморегуляторные функции достаточно уникален. Разработанный метод непрерывной термометрии в стационарных и нестационарных условиях, дает возможность оценивать зависимость характера терморегуляторных эффектов пептидов от исходного функционального состояния системы терморегуляции, в значительной степени обусловленного температурой окружающей среды.

На основании полученных результатов выявлен новый класс пептидных соединений и создана база данных - пептидов-терморегуляторов.

С помощью направленных изменений в структуре молекулы дерморфина впервые удалось установить, что разные фрагменты молекулы ДМ ответственны за разные физиологические функции, что позволило получить пептиды с заданными свойствами. Впервые было показано, что влияние ДМ и его аналогов температуру тела и вазомоторные реакции опосредуется через разные типы рецепторов.

Получены новые пептиды, вызывающие регулируемую гипотермию за счет изменения уровня "set ротГ([Нур6]-ДМ, [ёНРго6]-ДМ и [DdHPro6]), которые можно рекомендовать в качестве веществ для фармакологической регуляции температурного гомеостаза. Кроме того, выявлены пептиды, у которых наблюдалось перераспределение физиологических функций: вазодилятация (ДМ1.6, или вазоконстрикция (4АгшпоРго-ДМ) доминировали над гипотермической активностью; гипотермия доминировала над вазомоторными реакциями (Arg-[DArg2]-,HM, Arg-[DArg2]-^M, [Тгр3]-ДМм).

С помощью математического предсказания фрагментов деградации пептидов на примере молекулы литорина удалось показать, что N-концевой дипептид (pGlu-Gln-OH) при периферическом введении вызывает снижение температуры тела, сопоставимое с действием бомбезина, а модифицированный N-концевой трипептид ([Glu ](yOMe)-Li.3-OH) даже превосходит его по силе.

Изучение новых пептидов, полученных из фракций зимоспящих животных, показало, что ни один из тестируемых пептидов не смог воспроизвести снижение температуры тела до такого уровня, какое наблюдается у гибернирующих животных в природе. Однако, наличие в пептиде фрагмента (как в случае НКТ фрагмента КТ), который проявляет свою собственную активность, причем противоположно направленную ("ингибитор" КТ и "стимулятор" НКТ) являются хорошим примером такого типа структурно и функционально связанных между собой отношений, обеспечивающих циклический характер изменения температуры тела. Кроме того, обнаружено, что НКТ и КТ сдвигают "set point" в противоположные стороны. По такому принципу могут работать и другие природные биорегуляторы. Особого внимания заслуживает новый пептид RZ-13, вызывающий температуро-зависимое изменение температуры тела и вызывающий смещение "set point".

Новая концепция фармакологической регуляции температурного гомеостаза и исследования структурно-функциональных взаимоотношений эндогенных пептидов и веществ, полученных из мозга гибернирующих животных, позволили выявить новые пептидные соединения, перестраивающие уровнь внутреннего эталонного порога ("установочной точки") и тормозящие ответные компенсаторные реакции.