Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск и разработка фитопрепаратов, содержащих тритерпеноиды и флавоноиды

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И АРОМАТИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ

Колхир Владимир Карлович

ПОИСК И РАЗРАБОТКА ФИТОПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ТРИТЕРПЕНОИДЫ И ФЛАВОНОИДЫ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Купавна - 2002

2 7 аПР ¡СИ?

На правах рукописи

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор Митрохин Н.М.

- доктор медицинских наук, профессор член-корр. РАМН Шашков В.<

- доктор медицинских наук, профессор Булаев В.М.

Ведущая организация:

- Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическг академия

Защита состоится «14» мая 2002 г. в 103° часов на заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при Всероссийском научно центре по безопасности биологически активных веществ по адресу: п. Стара Купавна Московской обл., ул. Кирова, д.23

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотек Всероссийского научного центра по безопасности биологически активны веществ

Диссертация в виде научного доклада разослана « 12 » апреля 2002 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема создания новых эффективных лекарственных средств растительного происхождения продолжает оставаться одной из актуальнейших в фармакологии.

Оптимизация тестирования на первом этапе скрининга биологически активных веществ (БАВ) чрезвычайно привлекательна для организаций, занимающихся целенаправленным поиском и разработкой препаратов. При этом ставится задача сократить время поиска, материальные и физические затраты на исследование, получить максимально достоверные данные о потенциальных возможностях изучаемого фитообъекта как БАВ и предложить направления его дальнейшего изучения с целью разработки эффективного лекарственного средства с заданной фармакологической активностью. В связи с этим предлагаются разные системы скрининга, например многоуровневая автоматизированная система (Баренбойм Г.М., Маленков А.Г., 1986; Johnson, 1987). Наиболее привлекательны и перспективны, на наш взгляд, системы первичного поиска БАВ с использованием тестов in vitro, как наиболее быстрые и экономичные. Так, система, основанная на взаимодействии изучаемых веществ с мембранными рецепторами (Blackbom et al., 1988; Prous et al, 1994), дополненная «рецепгорной технологией» (Корольченко Л.В., 1999), позволила выявить сотни потенциальных препаратов и разработать десятки новых оригинальных лекарственных средств. Однако эта система предназначена, преимущественно, для поиска индивидуальных химических соединений, продуктов химического синтеза, когда можно установить конкретную связь - вещество-рецептор, определить константу связывания, константу вытеснения эталонного лиганда.

Скрининг биологически активных веществ растительного происхождения имеет особенности, обусловленные сложностью состава извлечений из растений, в которых могут одновременно содержаться БАВ различной химической структуры и разной биологической активности. В этом случае установить связь вещество-рецептор-мишень очень сложно или вообще не возможно. Для выявления биологической активности извлечений из растений, в особенности для выявления заданной (искомой) активности, целесообразны специфические тесты in vitro с использованием биотест-систем (тест-обьектов), соответ-ств\кшшч определенным пилам фармакологического действия. Мы предлагаем програм-м\ первичною биохимическою скрининга БАВ, где в качестве специфических тест-oni.cKioi! исно.1М)М1ся ферменты, ill рающие ключевую роль в комплексе реакций, участ-1!>Ю1Ш[\ в обеспечении соогветствующих физиологических процессов. Выявление основной направленности действия изучаемого объекта на этапе первичного биохимического

скрининга in vitro при использовании адекватных ферментных тестов, позволяет повы эффективность, усовершенствовать и унифицировать программу поиска и оценки фа кологической активности новых БАВ природного происхождения.

Предлагаемая программа скрининга может быть применена, прежде всего, для г ка и дальнейшей разработки новых оригинальных препаратов среди фитообъектов держащих соединения флавоноидной и тритерпеновой природы. Это обусловлено, п де всего, их широким спектром потенциальных фармакологических свойств и, как пр ло, относительной безвредностью для организма. Так, показано, что'флавоноиды o6j ют антиоксидантными, капилляропротекторными, желчегонными, гепатозащитными диопротекторными, противовоспалительными, антимикробными и другими видами маколошческих свойств (Барабой В.А., 1976; Вичк анова С.А., 1980; Барнаулов ( 1999; Амосова Е.Н. и др., 2000; Сыров В.Н. и др., 2001; Pathak et al., 1991, Formica, R son, 1995; Priollet, Boisseau, 2000; O'Brien et al., 2000). Являясь малотоксичными соед ниями, флавоноиды и препараты на их основе проявляют высокую эффективность в i нии достаточно тяжелых заболеваний. Показан ингибирующий эффект флавоноидов генина и кверцетина на рост меланомы и образование метастазов (Caltagirone et al., 21 с успехом применяются при лечении нарушений мозгового кровообращения (бол Альцгемера и др.) препарат «Танакан» и другие препараты, содержащие флавонощ экстракт из листьев Гинкго Билоба (Суслина З.А. и др., 2000; Милопольская И.М., 2 Le Bars et al, 1997). Такая широта и выраженность фармакологических свойств биоф! ноидов обусловлены, прежде всего, их блокирующим влиянием на ключевые звенья вития различных патологических процессов, в том числе на ускорение процесса сво но-радикального окисления липидов мембран и нарушение целостности сосуди стенки капилляров (Cholbi et al., 1990; Pathak et al., 1991). Поскольку по своей пр де флавоноиды являются естественными антиокислителями, представляется целесооС ным поиск и разработка новых антиоксидантных средств на основе флавоноидсоде] щих фитообъектов.

Не меньшим, чем флавоноидные препараты, диапазоном фармакологича свойств обладают растительные тритерпеновые гликозиды и препараты на их основе силенко Ю.К. и др., 1993; Платонов В.Г. и др., 1995; Уварова Н.И. и др., 2000; Ильи Т.Н. и др., 2001; Shibata, 1985; Facino et al., 1995, Uchendu, Leek, 1999; Kim et al., li Наиболее востребованы их нейротропные свойства (препараты женьшеня, аралии), в тонические, ангиолротекторные и противовосполительные свойства (препараты каш

конского, солодки гладкой). В последние годы, в связи с увеличением общей стрессс *

ности жизни человека, обусловленной различными неблагоприятными условиями о

жающей действительности, возрос интерес к препаратам седативного или транквилизирующего действия как средствам, оказывающим благоприятное воздействие при неврозах и астеноневротических состояниях. Чрезвычайно высока потребность в малотоксичных и не вызывающих зависимость транквилизаторах для лечения больных с алкогольным или наркотическим пристрастием. Принимая во внимание, что нейротропные свойства три-терпеноидов часто сочетаются с их положительным влиянием на функционирование других органов и систем в организме, в частности на сердечно-сосудистую и гемокоагуляци-онную (Колхир В.К. и др., 1989, 1995, 2000; Майнсков A.B. и др., 1999), они, как правило, не оказывают токсического действия, представляется актуальным поиск и разработка се-дативных (транквилизирующих) средств в ряду тритерпенсодержащих фитообъектов.

Возможности комбинированного использования положительных качеств представителей классов флавоноидов и тритерпеноидов позволяют разработать лекарственные средства для лечения заболеваний со сложной и не всегда установленной этиологией. В первую очередь это касается такого заболевания как простатит. Хронический простатит является одним из наиболее частых заболеваний у мужчин. Возникновение воспалительных заболеваний репродуктивного тракта обусловлено инфицированием половых путей патогенньми и условно-патогенными микроорганизмами, нарушением гемодинамики предстательной железы, состоянием иммунологического статуса и другими, не всегда четко определяемыми, причинами (Ващенко В.В. и др., 1998; Титова Т.М. и др., 1998; Сегал A.C. и др., 2000; Мазо Е.Б., 2001). Недостаточная эффективность лечения больных хроническим простатитом и значительная частота осложнений (аллергические реакции, токсическое воздействие фармакологических препаратов на сперматогенез и др.) делает необходимым разработку новых эффективных препаратов для лечения этого заболевания. Включение лекарственных средств растительного происхоящения в комплексную терапию при различных клинических формах хронического простатита и реабилитационные мероприятия для таких больных является одним из перспективных направлений в решении данной задачи (Михеев H.A. и др, 1989; Виноградов В.М. и др., 1996; Кукес В.Г. и др., 1999).

Указанные причины определяют актуальность проблемы в целом.

Работа выполнена как часть плановых научных исследований, проводимых во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений.

Цель исследования. Разработка научно-методических основ первичного биохимического скрининга и прогнозов механизмов действия in vitro БАВ растительного происхождения с использованием в качестве тест-объектов ключевых ферментов, и создание ори-

гинальных фитопрепаратов, на основе флавоноидов и тритерпеноидов, нейротроп антиоксидантного, гепатопротекторного и простатотропного действия для лечения за ваний центральной нервной, дыхательной, сердечно-сосудистой, гепатобилиарной и 1 половой систем.

Задачи исследования.

1. Поиск и отбор приемлемых, в качестве молекулярных биотест-систем, фермен разработка блоков ферментативных тестов in vitro, соответствующих определе] видам фармакологической активности.

2. Отработка методологических подходов и принципов биохимического тестиров для выявления веществ, обладающих адаптогенными, антиоксидантньши, ант> робными, антитоксическими свойствами.

3. Поиск биологически активных веществ с целью обнаружения перспективных i объектов для разработки фитопрепаратов.

4. Выявление доминирующей направленности фармакологического действия не рых тритерпен- и флавоноидсодержащих БАВ растительного происхождени; использования в качестве основы фитопрепаратов, таких как «Диквертин», бектан», «Простанорм», «Патримин».

5. Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследо! флавоноидного препарата «Диквертин» как антиоксидантного и капилляропр торного средства, обладающего гастро- и гепатопротекторными, гиполипиде! скими и диуретическими свойствами.

6. Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследо* комплексного флавоноидсодержащего препарата «Сибектан» как желчегонш гепатозащитного средства, обладающего гастропротективными, антиоксидант) и диуретическими свойствами.

7. Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследо! комплексного тритерпен- и флавоноидсодержащего препарата «Простанорм; простатотропного средства, обладающего противовоспалительными, капил. протекторными, анальгетическими, диуретическми, антимикробными и андр ными свойствами.

8. Фармакологическое, токсикологическое изучение и клинические исследования терпеноидного препарата «Патримин» как седативного средства, обладающег тигипертензивными, антикоагулянгными, антиагрегащюнными и пшотриглш демическими свойствами.

9. Разработка нормативно-технической документации на фитопрепараты «Диквер-тин», «Сибектан», «Простанорм», «Патримин».

Научная новизна. Впервые разработаны и предложены научно-методологические основы первичного биохимического скрининга in vitro, с прогнозом механизма действия, веществ растительного происхождения с использованием в качестве тест-объектов ключевых и лимитирующих ферментов, что позволило изменить схему скрининга и разработки препаратов в целом, исключив этап первичного фармакологического поиска.

Дано теоретическое и практическое обоснование использования в качестве тест-объектов ключевых или лимитирующих ферментов биохимических реакций для первичного поиска биологически активных фитообъектов, перспективных с точки зрения разработки оригинальных фитопрепаратов. Установлено, что каждый из сформированных блоков ферментативных тестов соответствует определенному виду фармакологической активности. Первичный биохимический скрининг с использованием ферментных тест-систем позволяет изменить схему скрининга и разработки препаратов в целом, исключив этап первичного фармакологического поиска.

В рамках разработанной Программы биохимического скрининга предложены способы выявления веществ, обладающих адаптогенными, антиоксидантными, антитоксическими, антимикробными свойствами.

Используя предложенные тест-системы, выявлена направленность фармакологического действия некоторых тритерпен- и флавоновдсодержащих фитообъектов, что позволило целенаправленно разрабатывать фитопрепараты с заданными фармакологическими свойствами. Показан широкий диапазон потенциальных фармакологических свойств фла-воноидов и тритерпеноидов, определяющий перспективность их дальнейшего биохимического и фармакологического изучения.

Впервые проведены доклинические исследования специфической и общефармакологической активности и безопасности тритерпен- и флавоноидсодержащих фитопрепаратов - «Патримина», «Диквертина», «Сибектана» и «Простанорма», в основном, подтвердившие в экспериментах на животных фармакологические свойства, прогнозируемые при первичном биохимическом тестировании.

Показано, что патримин оказывает выраженный седативный эффект, повышая активность тормозных процессов в коре головного мозга и ослабляя восходящую активацию из подкорковых областей. Седативная активность препарата сочетается с его антиги-пертензивными, антикоагуляционными, антиагрегационными и гиполипидемическими свойствами. Антиагрегационная (дезагрегационная) активность патримина существенно

превосходит эффект ацетилсалициловой кислоты. Установлен высокий уровень безо ности препарата.

Экспериментально установлены специфические капилляропротекторные и антис дантные свойства диквертина, которые обусловлены как прямым антирадикальным ствием препарата, так и влиянием его на ферменты антиоксидантной защиты и моною назной системы цитохрома Р450. Дополнительные положительные свойства преп; обеспечиваются его гастро- и гепатопротекторной, гиполипидемической и диуретиче активностью, низким уровнем токсичности.

В экспериментах на животных показана высокая гепатозащитная и желчегонна тивность комплексного препарата сибектана на различных моделях поражения гена! лиарной системы. Эффект препарата во многом обусловлен присутствием в его комг ции фармакологически активных компонентов - силимара и танацехола, определяй: антиоксидантные, антирадикальные, мембраностабилизирукмцие и антитоксические ( ства сибектана, дополненные противовоспалительными, гастропротективными и диу[ ческими свойствами экстрактов из зверобоя и листа березы.

В модельных экспериментах изучена простатотропная активность простанорма 1 казаны его выраженные противовоспалительныые, капилляропротекторные, аналыст ские, диуретические, антимикробные свойства, сочетающиеся с гастро- гепатопроте! ной, иммуностимулирующей и антигипоксантной активностью, низким уровнем токси сти.

Полученные в экспериментах результаты послужили основой для проведения кл ческих исследований фитопрепаратов, где были доказаны их специфические свойст безопасность..

Практическая значимость.

Разработанная Программа первичного биохимического скрининга БАВ растител го происхождения позволила провести поиск среди более чем 200 природных соедине и выявить 20 фитообъектов, перспективных для разработки препаратов общеукрепляк го, адаптогенного, иммуномодулирующего, ноотропного, антитоксического и др. де вия. Установлены направления расширенного фармакологического изучения тритерпе флавоноидсодержащих фитообъектов.

Предложенные ферментные биотест-системы, эффективны не только в каче экспресс-тестов для первичного скрининга биологически активных веществ, но и м быть использованы в качестве методов, позволяющих выявить сходство и различия м«

близкими по фармакологическим свойствам препаратами, а также для изучения биохимических механизмов фармакологического действия веществ.

По результатам доклинического изучения и клинических исследований препаратов «Диквертин», «Сибектан», «Простанорм» и «Патримин» оформлена нормативно-техническая документация и получено разрешение Министерства здравоохранения РФ на их медицинское применение и промышленный выпуск:

- Патримина. в лекарственной форме таблетки по 0,1 г для приема внутрь, как седа-тивного средства для профилактики и лечения заболеваний ЦНС (неврозы и невро-зоподобные состояния, сопровождающиеся повышенной возбудимостью и нарушением сна, энцефачолатии) и при комплексном лечении гипертонической болезни 1-Й степени с тромботическими и атеросклеротическими осложнениями. (Приказ МЗ РФ № от 24.02.1994г)

- Диквертина. в лекарственной форме таблетки по 0,02 г для приема внутрь, как ан-тиоксидантного и капилляропротекторного средства при бронхо-легочных заболеваниях, а также при ишемической болезни сердца и наджелудочковых нарушениях ритма сердца в составе комплексной терапии (Приказ МЗ РФ №302 от 29.07.96).

- Сибектана. в лекарственной форме таблетки по 0,1 г для приема внутрь, в качестве гепатопротекторного и желчегонного средства при хроническом персисти-рующем гепатите, хроническом холецистите и гипомоторной дискенезии желчного пузыря. Сибектан применяют также в комплексной терапии цирроза печени и жировой дистрофии печени алкогольного генеза (МЗ РФ № 51 от 18.02.97).

- Простанорма. в жидкой лекарственной форме и в виде таблеток по 0,2 г для приема внутрь как простатотропное, противовоспалительное и нормализующее диурез средство для лечения и профилактики обострений хронического неспецифического простатита (Р.У. 99/280/12; Р.У. № 000842/02-2001).

Подготовлены (совместно с Кукесом В.Г., Будаевым В.М. и др.) и опубликованы в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2000) «Методические указания по доклиническому изучению новых препаратов, разработанных из природного сырья».

Опюнные положения, выносимые на защиту:

11рч1р.1\пи Гшохпмичсского скрининга веществ природного происхождения ¡п \ иго. (ле и качеемве и-сг-объекгов используются ключевые ферменты, позволяет бысфо, в режиме экспресс-тестирования, провести первичный поиск и отбор фармакологически активных фитообъектов, перспективных с точки зрения разра-

ботки оригинальных фитопрепаратов, в частности, на основе тритерпеноид< флавоноидов.

При разработке новых фитопрепаратов установлено, что:

- тритерпеноидный препарат «Патримин» оказывает седативное действие, соче' щееся с ангигипертензивньми, ангикоагулянтными, антиагрегационными и ги риглицеридемическими свойствами.

- флавоноидный препарат «Диквертин» (дигидрокверцетин) обладает ангиопро торной и антиоксидантной активностью (превосходящей активность кверцев сочетающейся с противовоспалительными, гепатопротекгивными, гиполипид! ческими и диуретическими свойствами.

- флавоноидсодержащий комплексный препарат «Сибектан» оказывает гепато; текторное, желчегонное, антиоксидантное и усиливающее процессы регенерг действие.

- тритерпен- и флавоноидсодержащий комплексный препарат «Простанорм» обл ет фармакологическими свойствами, характеризующими его как простатотрог средство, из которых главными являются противовоспалительные, капилляр« текторные, анальгетические, диуретические, антимикробные и андрогенные.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации я жены и обсуждены на Конференции «Исследования по изысканию лекарственных сре, природного происхождения» (Ленинград, 1981), V и VI Всесоюзных съездах фармак гов (Ереван, 1982; Ташкент, 1988), Национальной конференции по лекарственным ра ниям (София, 1982), Всесоюзной научной конференции «Результаты и перспективы и ных исследований в области создания лекарственных средств из растительного сы] (Москва, 1985), V Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Таллин, 1987 III-VIII Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1 1996-2001), Ш Международном симпозиуме «Экология человека: проблемы и coctoj лечебно-профилактического питания» (Москва, 1994), Научной конференции, посвяг ной 50-шо НИИ фармации «Решение актуальных задач фармации на современном эт; (Москва,1994), 2-ом Научном конгрессе «Традиционная медицина - теоретические и п тические аспекты» (Чебоксары, 1996), 1-ой Международной конференции «Научнь практические аспекты совершенствования качества продуктов детского и геродиетиче го питания» (Москва, 1997), Международном симпозиуме «Биоантиоксидант» (Тюм 1997), Конференции «Проблемы противолучевой защиты» (Москва, 1998), XIXth Inte tional Conference on Polyphenols (Lille (France), 1998), I, II, IV и V Международных С

дах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С-Петербург-Выборг, С.-Петербург-Валаам, В.Новгород, С.-Петербург-Петергоф, 1997, 1998, 2000, 2001), Научно-практической конференции «Биологически-активные добавки к питанию и лекарственные препараты на натуральной основе в профессиональном лечении и реабилитации» (Москва, 2000), Юбилейной конференции, посвященной 70-ти летию ВИЛАР (Москва, 2000), X Международном Симпозиуме «Эколо-го-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2001), 1-ой Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001), Международном Конгрессе «Здравница-2001» «Актуальные проблемы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Москва, 2001), на специализированной секции Ученого совета ВИЛАР (Москва, 2002).

Публикации.

Материалы диссертационной работы изложены в 114 научных трудах, в том числе в 17 патентах и авторских свидетельствах, 11 публикациях в общероссийских медико-фармацевтических журналах, рекомендованных ВАК РФ, 8 публикациях в иностранных журналах, 38 публикациях в других журналах и сборниках научных работ, 40 материалах Всероссийских, зарубежных и международных конгрессов, симпозиумов и конференций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ*»

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты изучения

В биохимических и фармакологических исследованиях использовали вещества растительного происхождения, полученные и охарактеризованные, как правило, в химико-технологическом подразделении ВИЛАР. Дигидрокверцетин (препарат «Диквертин») -охарактеризован на кафедре органической химии ММА им. И.М.Сеченова (зав. кафедрой - профессор Н.А.Тюкавкина).

Основные фитообъекты:

1. ПАТРИМИН - очищенный сухой экстракт, содержащий сумму тритерпеновых гликозидов, полученный из корней патринии средней (Patrinia intermedia Roem et Schult., сем. валериановых). Основными компонентами препарата и лекарственного вещества являются гликозиды олеаноловой кислоты - патринозиды В, С и D, среди которых патрино-зид D - доминирующий (Рис. 1). Хорошо растворим в воде.

амноза-ксилоза-

глюкоза

глркоза глюкоза

Рис. 1. Патринозид Б : 2. ДИКВЕРТИН (Дигидрокверцетин) - 3,3',4',5,7-пентагидроксифлававон (Рис

получают из стружки древесины лиственницы даурской (Ьапх ¿аЪипса Т.) и лиственн

сибирской (Ьалх эШтса Ь.). Плохо растворим в воде.

ЭН

НО О

Рис. 2. Дигидрокверцетин

Я=0-галактоза, К1=Я2=ОН -гиперозид

Я1=ОН- апигенин К.=К]=112=ОН - кверцетин К=К2=Н, Л1=0-глюкоза - ликвиритин

Силибин (3,5,7-тригидрокси-2-[1 -оксимеп СН20Н 3-(3-метокси-4-оксифенил)-1,4-бензодиок£ 6-ил]-4-хроманон)

СНз

Рис. 3. Основные флавониды сибектана и простанорма

н

=0 он

диглюкоронид N

Рис. 4. Глицирризиновая кислота

3. СИБЕКТАН - комплексный препарат, содержащий танацехол (действующие фла-воноиды - апигенин, лютеолин, акацетин), экстракт жома плодов расторопши (действующие флавоноиды - флаволигнаны группы силимарина - силибин, силидианин, силикри-стин), экстракт травы зверобоя (действующие флавоноиды - гиперозид, рутин) и экстракт листьев березы (Рис. 3). Плохо растворим в воде.

4. ПРОСТАНОРМ - комплексный препарат, получают из смеси лекарственного растительного сырья - корня солодки (действующие вещества - тритерпеноиды - калиевая и кальциевая соли глицирризиновой кислоты, и флавоноиды - ликвиритин, ликуразид и др., Рис. 3-4), травы зверобоя, травы золотарника, корневищ с корнями эхинацеи пурпурной -в виде водно-спиртового извлечения или сухого экстракта. Простанорм сухой хорошо растворим в воде.

В фармакологических экспериментах использованы различные виды лабораторных животных:

• Белые беспородные мыши обоего пола, массой 17-22 г

• Белые беспородные крысы обоего пола, массой 150-250 г

• Морские свинки обоего пола, массой 220-300 г

• Кролики породы «Шиншилла» обоего пола, массой 2-4 кг

• Беспородные собаки обоего пола, массой 2,5-7 кг

Лекарственные вещества и/или их лекарственные формы изучали в условиях in vitro и при различных путях введения животным: внутрижелудочно, внутрибрюшинно, внутривенно и подкожно в виде растворов в воде, изотоническом растворе хлористого натрия или в виде взвеси в 1,5% крахмальном клейстере. Простанорм жидкий перед исследованием деалкоголизировали. Контрольные животные получали в адекватном количестве и при

Лабораторные животные

Пути введения изучаемых веществ

том же пути введения растворитель. Каждая группа опытных, контрольных или инт ных животных формировалась не менее, чем из 10-ти особей.

Основные биохимические тесты in vitro

В биохимических экспериментах использовали реактивы квалификации «хч» от ственного производства. Ферменты глутагионредуктаза, супероксиддисмутаза («Сиг США), каталаза («BDH», Англия), а также глутатион окисленный, НАДФН («См США) - высокоочищенные препараты.

Скорость ферментативных реакций измеряли спектрофотометрически на спектрс тометре MPF-2 фирмы «Шимадзу» (Япония). Моноксигеназную активность mrroxf Р450 определяли с использованием субстрата I типа - амидопирана (реакция деметилирования диметиланилина (Nash, 1953)) и субстрата И типа - анилина (реакци гидроксилирования (Канаева И.П. и др.)). В качестве источника цитохрома Р450 испол вали микросомальную фракцию печени крыс, полученную дифференциальным центр} гированием (Карузина И.И. и др., 1979). Содержание цитохрома Р450 в микросомах р стрировали спектрофотометрически (Арчаков А.И., 1975). Белок определяли по ме: Lowry и соавт. (1951). Скорость глутатионредуктазной и каталазной реакций опреде; по Beutter(1986).

Основные фармакологические тесты, использованные при разработке фитопрепаратов 1. Методы оценки нейро-психотропных свойств

а) седатшных (или стимулирующих):

• Оценка влияния на спонтанную двигательную активность мышей по стандартной тодике, с использованием актометра фирмы «UGO Basile» (Италия) с автоматичес регистрацией.

• Оценка влияния на координацию движений мышей и крыс по стандартной метода] использованием установки «Вращающийся стержень» фирмы «UGO Basile» (Ита.11

• Оценка влияния на сон у мышей по стандартной методике, с использованием енот: ных анализаторов хлоралгидрата («корковое» снотворное, 300 мг/кг, п./к) и барби натрия («стволовое» снотворное, 120 мг/кг, п/к).

• Оценка влияния на латентный период условно-рефлекторной реакции у мышей ак ного избегания электро-болевого раздражения (Аничков C.B., 1962), с использов; ем челночной камеры фирмы «OTE Биомедика».

• Оценка влияния на биоэлектрическую активность коры головного мозга кролике использованием электроэнцефалографа «Нейрограф-9» фирмы «OTE Биомедика».

б) протиеосудорожиых:

• Оценка влияния на судороги, вызванные судорожными анализаторами каразолом (160 мг/кг, л/к) и стрихнином (1,2 мг/кг, п/к).

в) стресспротективных:

• Оценка влияния на реакцию крыс при неожиданно возникшей угрожающей ситуации и нахождение эффективного способа избавления от нее в «Тесте экстралоляционного избавления Хендерсона» (в модификации Бондаренко Н.А., 1990).

г) антидепрессантных:

• Оценка влияния на поведение крыс в безвыходной ситуации в тесте Порсолта (Porsoit et al., 1979), создаваемой при помещении животных в бак с водой, откуда они не могут выбраться.

д) антигипоксантных;

• Оценка влияния на выживаемость мышей в стандартном тесте гипоксической гипоксии с гиперкапнией.

2. Методы, оценки антипшертензивных свойств

• Модель реноваскулярной гипертензии у крыс (Коган А.Х., 1961). Повышенное артериальное давление (АД) воспроизводили путем наложения специальной металлической спирали на почечную артерию левой почки крыс и измеряли прибором фирмы «UGO Basile» (Италия).

• Модель нейрогенной гипертензии у крыс (Sos et al., 1973). Стойкое повышение АД нейрогенного характера развивалось у животных при использовании специальной диеты в течение 2-х недель и последующего светового, звукового и электроболевого раздражения в камере фирмы «UGO Basile» (Италия).

• Модель ДОКА-солевой гипертензии у крыс. Повышенное АД у животных развивалось на фоне внутримышечного введения дезоксикортикостерона ацетата в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней.

3. Методы оценки геиокоагуляцнонных свойств:

• Определение параметров, позволяющих оценить общую свертываемость и 3 основные фазы свертывания крови - время рекальцификации плазмы, толерантность плазмы крови к i Опарину, прогромбиновое время, тромбиновое время, концентрация фибрино-mu » lujiMc кропи (Калуда В.П. и др., 1980), а также показатели тромбоэластограм-мы. с исио iMOHJJiucM прибора «ГКГМ4-02» (Россия).

• Модель фибршюлтиса (Ефимов B.C. и др., 1973). Фибринолитическую активность плазмы крови кроликов оценивали по ее способности растворять фибрин-агаровые пластинки, активированные стрептоюшазой.

• Модель венозного тромбоза у крыс (Калишевская Т.М. и др., 1971). Позволяет оце способность веществ лизировать свежеобразованный венозный тромб в условиях ; тения функции вегетативной нервной системы.

• Модель АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (Born, 1962) с использова! прибора «Агрегометр».

4. Методы оценки гиполипидемических свойств.

• Определение содержания холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке к нормолипидемических крыс (Adrian, 1983).

• Модель углеводной гиперлипидемии у крыс (Рихтер Ф., Силтнер В., 1986). Повьн ное содержание липидов в крови животных воспроизводится в условиях 7-ми дне: углеводной диеты.

• Модель гиперлипидемии у крыс-самцов (Базазьян Г.Г., 1982). Повышенное соде ние липидов в крови животных воспроизводится в условиях 52-х дневной диеты бытком экзогенного холестерина.

5. Методы оценки противовоспалительных свойств

• Модель острого экссудативного воспаления у мышей и крыс, вызываемого введе) под апоневроз задних лап флогогенных агентов - формалина, декстрана, каолина, там и на, серотонина (Тринус, 1974).

• Модель экспериментального перитонита у крыс, вызываемого внутрибрюшинным дением 0,2% раствора азотнокислого серебра (Либерман С.С., 1972).

• Модель «ватной гранулемы» у мышей (Мейер и др., 1953). Позволяет охаракте{ вать влияние веществ на процесс образования фиброзно-грануляционной ткани.

6. Методы оценки капнлляропротекторных свойств

• Модель повышения сосудистой проницаемости кожи у мышей и крыс (Ойвин 1 Монахова К.Н., 1953). Оценивается по времени выхода трипновой сини в очаг вс ления, вызванный нанесением ксилола.

• Модель нарушения микроциркуляции в сосудах кожи морских свинок-альбин (Свингле и др., 1971) с использованием ультрафиолетового облучения.

7. Методы оценки анальгетическнх свойств

• Модель определения порога болевой чувствительности у мышей по методике «гор пластинка» (Woolfe, МаС Donald, 1944) с использованием стандартной устан фирмы «UGO Basile» (Италия).

• Модель определения порога болевой чувствительности у мышей по методике «yi но-кислые корчи» (Cashin et al., 1977)

• Модель определения порога болевой чувствительности у крыс по методике «давление острия на лапу» с использованием стандартной установки фирмы «UGO Basile» (Италия).

8. Методы оценки гастропротективных (противоязвенных) и желчегонных свойств

• Модель этаноловых язв у крыс (Robert et al., 1983).

• Модель язв с перевязкой привратника по Шею у крыс (Shay et al., 1954).

• Модель индометациновых язв у Kpbic(Bhargava et al., 1954).

• Модель кофеино-мышьяковистых язв у крыс (Мещерская К.А., 1954)

• Модель, позволяющая оценить интенсивность желчеотделения в острых опытах у крыс (Скакун Н.П., 1967).

9. Методы оценки антитоксических, гепатопротисторных и аитиоксидантных свойств

• Модель гепатита, вызываемого 4-х дневным внугрижелудочным введением тетрациклина (Скакун Н.П., Высоцкий И.В., 1982).

• Модель гепатита, вызываемого однократным или 5-ти дневным подкожным введением масляного раствора четыреххлористого углерода (Левшин В.И., 1972).

• Модель гексеналового сна у крыс (Remmer. 1959).

• Оценка обезвреживающе-выделительной функции печени крыс при нагрузке бензойно-кислым натрием (Савина М.Я., 1963).

• Модель, позволяющая оценить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате печени крыс по содержанию малонового диальдегида (МДА) при индукции ПОЛ ионами двухвалентного железа в присутствии НАДФН (in vitro), СС14 или тетрациклином (модели гепатита).

9. Методы оценки андрогенных свойств

• Модель гонадэктомии у инфантильных крыс-самцов на фоне введения тестостерона-пропионата (Кабак Я.М., 1968).

10. Методы оценки диуретических свойств

• Модель усиления диуреза у крыс на фоне водной нагрузки (Берхин Е.Б., 1972)

11. Методы оценки антимикробных свойств

• Исследования проводили методом серийных разведений препаратов в жидких питательных средах, в качестве тест-микроорганизмов использованы 56 штамов, выделенных от больных и полученных из Института хирургии им. А.В.Вишневского и НИИ урологии РАМН, г. Москва

12. Методы оценкн иммуностимулирующих свойств

• Модель стимуляции фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов сонизированным зимозаном (Владимиров, 1989)

Изучение безопасности фитопрепаратов проводили в отделе медицины ВИЛ; соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению вых фармакологических веществ, 2000).

Клинические исследования проводили:

патримина - на кафедре нервных болезней и нейрохирургии №1 и в клинике нерв болезней ММА им. И.М.Сеченова, в НИИ неврологии АМН РФ, в Центральной поли; нике МЗ РФ;

диквертина - в НИИ традиционных методов лечения, на кафедре военно-пол( (военно-морской) терапии военно-медицинского факультета при Российской медицине академии последипломного образования;

сибектана - на кафедре пропедевтики внутренних болезней и в госпитальной т певтической клинике ММА им. И.М.Сеченова;

простанорма - в НИИ урологии МЗ РФ, в урологическом отделении на базе М! №47, в урологическом отделении МГКБ №60, на кафедре урологии и оперативной нес логии РГМУ им. Н.И.Пирогова.

Статистическую обработку данных проводили с использованием параметричес (t-критерия Стьюдента) и непараметрических методов (Гублер Е.В., 1978; Гланц С., 19'

РАЗРАБОТКА ПРОГРАММЫ БИОХИМИЧЕСКОГО СКРИНИНГА IN VITR(

Скрининг биологически активных веществ (БАВ) растительного происхожде имеет особенности, обусловленные сложностью состава извлечений из растений, в ki рых могут одновременно содержаться БАВ различной химической структуры и раз биологической активности. В связи с этим для повышения эффективности и экономи1 сти скрининга рационально применять в качестве первого этапа биохимическое тест! вание in vitro. Первичный биохимический скрининг при использовании адекватных те( позволяет не только выявить биологическую активность, но и прогнозировать направ. ность фармакологического действия изучаемых объектов. Разработанная нами програ первичного биохимического скрининга in vitro (Быков В.А., Минеева М.Ф., Кол В.К.,1995-2000) базируется на фундаментальных представлениях фармакологии и би< мин, прежде всего - на известных представлениях о существовании специфических <| макофоров, то есть определенных специфических структур в составе фармакологичс

активных соединений, комплиментарных соответствующим биохимическим мишеням и определяющих направленность фармакологической активности или принадлежность к определенной фармакологической группе. Программа основывается также на представлениях о специфическом избирательном взаимодействии фармакофоров с эндогенными мишенями, в качестве которых могут выступать, по нашим представлениям, не только рецепторы, но и лимитирующие ферменты, играющие ключевую роль в биохимических процессах, обеспечивающих соответствующие физиологические функции. В соответствии с этими представлениями, в нашей программе первичного биохимического скрининга в качестве тест-объектов используются ключевые ферменты, имеющие сложную, в том числе - аллостерическую, регуляцию нейротрансмиттерами, гормонами, другими эндогенными факторами.

Лимитирующие и ключевые ферменты быстро реагируют на изменение внутренней среды изменением своей активности, что влечет за собой изменение скорости ансамбля биохимических реакций и приводит к изменениям в скорости соответствующих физиологических процессов.

Предложенная программа биохимического тестирования состоит из блоков тестов, каждый из которых коррелирует с определенным видом фармакологической активности. Для направленного поиска или выявления целевой биологической активности используют соответствующий тест или блок тестов, коррелирующих с искомым видом фармакологического действия.

Для характеристики спектра биологического действия изучаемого объекта, который может быть индивидуальным веществом или объектом сложного состава, применяют набор ферментативных тестов, позволяющих, в совокупности, охарактеризовать все известные виды фармакологического действия. Программа включает в себя как оригинальные ферментные тесты, так и немногочисленные известные ферментативные тесты in vitro, модифицированные в соответствии с задачами ВИЛАР (работа проводилась совместно с сотрудниками группы скрининга БАВ Дубинской В.А. и Стрелковой Л.Б. под рук. профессора Минеевой М.Ф.). В частности, запатентованы тесты (способы) выявления веществ с адаптогенной, антибактериальной и противовирусной, антиоксидантной активностью. Эти тесты основаны на использовании ферментов антиоксидантной защиты: глута-тионредуктазы, каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы (Табл.1.): • Глутатионредуктаза катализирует восстановление дисульфида глутатиона в глутати-он-тиол (восстановленный глутатион), используя в качестве кофактора никотинами-дадениндинуклеотид фосфат (НАДФН). Глутатионредуктаза играет решающую роль в поддержании высокого внутриклеточного соотношения глутатиона восстановленного

и окисленного (с константой равновесия 5><106М), играющего регуляторную ро; контрольных механизмах процессов жизнедеятельности. Глутатионредуктазная pi ция является лимитирующим звеном восстановительного внутриклеточного пг тионового цикла, играющего исключительно важную роль в защите внутриклеточ] мембранных структур, белков, нуклеиновых кислот, липидов от оксидативното сц са. Продукт глутатионредуктазной реакции - восстановленный глутатион, участву< обеспечении защиты от пероксидации тиоловых ферментов, занимающих ключе позиции в обмене веществ (тиоловыми являются ферменты тканевого дыхания, i колиза, биосинтеза нейромедиаторов). Кроме того глутатион восстановленный, Я1 ясь субстратом глутатионпероксидазы, играет специфическую роль в восстановле] перекиси водорода и дегидроаскорбиновой кислоты.

• Супероксидцисмутаза является ключевым ферментом антиоксидантной защиты, тализирует дисмутацюо супероксидного радикала Ог в Н2О2. По эффективно устранения супероксидного анион-радикала супероксиддисмутазная реакция эф<] тивнее неферментативных тканевых антиоксидантов.

• Каталаза разрушает перекись водорода. Активность каталазы связана с активное супероксиддисмутазы.

• Глутатионпероксидаза разрушает органические перекиси, прежде всего - перек липидов.

Исходя из современных представлений о функциях ферментов антиоксидантной щиты, вышеперечисленные ферменты использовали как тест-объекты для разработю их основе новых оригинальных биохимических тестов in vitro для направленного вь ления БАВ с адаптогенной, антиоксидантной, антимикробной активностью.

В процессе разработки тестов определяли in vitro влияние веществ с извест: фармакологической активностью (взятых в качестве эталонных), на ферменты, избран] нами в качестве потенциальных тест-объектов. Полученные результаты сопоставлял результатами проводимых нами фармакологических экспериментов при системном вв( нии изучаемых веществ. На исследовании находились различные фитообьекты, прей щественно жидкие и сухие экстракты или индивидуальные химические соединен!« лекарственного растительного сырья. Большинство исследуемых фитообъектов отне лись к веществам тритерпеноидной (препараты женьшеня, элеутерококка, аралии, каи на, солодки и др.) или флавоноидной (флакозид, хелепин, препараты из шалфея, зверо( копеечника и др.) природы, как наиболее биологически активных и перспективных 061 тов с точки зрения разработки фитопрепаратов. Среди более чем 200 изучавшихся с ектов, включая взятые в качестве эталонов известные, хорошо изученные, разрешеинь

применению, лекарственные средства растительного и синтетического происхождения, были найдены активаторы и ингибиторы глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глу-татионпероксидазы, каталазы.

Так, непосредственным угнетающим действием на ферменты антиоксидантной защиты in vitro обладали все изучавшиеся антимикробные и противовирусные средства, которые в разной степени снижали скорость глутатионредуктазной, супероксиддисмутаз-ной, каталазной и глутатионпероксидазной реакций при добавлении их в пробу, содержавшую фермент, субстрат, косубстрат - то есть полную систему для протекания ферментативной реакции. С другой стороны, все исследованные вещества, обладающие анти-оксидантными свойствами, активировали указанные ферменты, а для всех веществ, проявляющих адаптогенную активность, характерным являлось активация глутатионредуктазы и угнетение каталазы. При этом установлено, что для выявления заявленных видов биологической активности достаточно установить характер влияния изучаемого объекта на глутатионредуктазу и каталазу (Табл. 1). Надо подчеркнуть, что наблюдалось полное соответствие (корреляция) между характером непосредственного влияния на фермент вещества, изучавшегося в условиях in vitro, и результатами фармакологического тестирования на животных. Количество веществ в выборке для установления такой корреляции было не меньше 30 объектов. Для каждого объекта были проведены исследования по изучению зависимости его ингибирующего или активирующего эффекта на ферменты от концентрации в пробе, и установлены максимально эффективные концентрации. Концентрации веществ, как правило, рассчитывались или в молярных величинах, в случае индивидуального химического соединения, или в мкг/мл пробы в пересчете на сухое вещество, в случае, когда изучавшийся объект представлял собой извлечение из растения.

На рисунках 5-7 приведены в качестве примера результаты экспериментов по изучению влияния на глутатионредуктазу и каталазу in vitro известных антимикробных - эв-калимина (10 мкг/мл), сангвиритрина (10 мкг/мл), пенициллина а-кИм), доксициклина РТО^М), противовирусных - гипорамина (10 мкг/мл), флакозида (10 мкг/мл), оксолина (Ю^М), средств разного химического состава; известных средств адаптогенной направленности - сухих экстрактов женьшеня (10 мкг/мл), элеугероккока (10 мкг/мл), левзеи (10 мкг/мл), эхинацеи (10 мкг/мл), а также бемитила (Ю^М); известных антиоксидантов -собственно глутатиона (10'8М), аскорбиновой кислоты(10"8М), а также сухих экстрактов из змееголовника и копеечника (10 мкг/мл). Активность веществ представлена в их наиболее эффективных концентрациях. Видно, что препараты адаптогенной направленности in vitro активируют глутатионредуктазу и угнетают каталазу. Препараты антимикробного и противовирусного действия угнетают активность этих ферментов. Антиоксиданты акти-

вируют и глутатионредуктазу, и каталазу. При этом антиоксидантная активность экст] тов из змееголовника и копеечника была установлена в процессе биохимического ci нинга.

Таблица 1.

БИОХИМИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ ФИТООБЪЕКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

№ ТЕСТ-ФЕРМЕНТ Активация j ВЫЯВЛЯЕМОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТООБЪЕКТА

Угнетение |

1. Глутатионредуктаза t АДАПТОГЕННОЕ (Заявка №2001115328/14)

Каталаза X

2. Глутатионредуктаза т АНТИОКСИДАНТНОЕ (Заявка №2001115330/14)

Каталаза

3. Глутатионредуктаза i АНТИМИКРОБНОЕ, ПРОТИВОВИРУСНОЕ (Заявка №2001115329/14)

Каталаза

Супероксиддисмутаза

4. Система цитохрома Р450 т ГЕПАТОПРОТЕКТИВНОЕ

5. НАДФН-оксидаза и ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ (Попова Н.Б., 2000)

Рис. 5. Влияние антимикробных (доксициклин, бензилпенциллин, сангиритрин, эвкалимин) и противовирусных (оксолин, гипорамин, флакозд) препаратов на скорость глутатионредуктазной и каталазной реакций in vitro*

D Глутатионредуктаза □ Каталаза

# ^

<г / / '

* - здесь и далее на рисунках приведены данные, отличающиеся от контроля с уровн вероятности не менее 0,05

На базе Научно-исследовательского центра биомедицинских технологий (Н БМТ) ВИЛАР проведено также систематическое изучение влияния БАВ разной фармг логической направленности на моноксигеназную активность цитохрома Р450. Устано! но, что активация моноксигеназной активности цитохрома Р450 in vitro коррелирует с

патозащитным (гепатопротекторным) действием веществ, подтвержденным на экспериментальных моделях гепатита.

Рис. 6. Влияние адаптогенов на скорость глутатионредуктазной, каталазной реакций in vitro

Рис. 7. Влияние антиоксидантов на скорость глутатионредуктазной, каталазной и супероксиддисмутазной реакции

Эффективность разработанной нами программы первичного биохимического скрининга можно показать на примере поиска БАВ с адаптогенной активностью среди пептидных фракций омелы белой (пептид-1) и пшеницы (пептид-2). На рисунке 8 представлены результаты тестирования in vitro пептида-1 и пептида-2 с помощью ферментов глу-татионредуктазы, каталазы, цитохрома Р450- Видно, что оба пептида in vitro активируют глутатионредуктазу, угнетают каталазу, повышают монооксигеназную активность цитохрома Р450, особенно по субстрату анилину. Эти результаты позволили предположить на-

личие у пептидов адаптогенной активности, сочетающейся с гепатопротекторным де! вне.

Фармакологические исследования подтвердили прогноз наличия адаптотеш свойств у пептидов. Показано, что пептид-1 и пептид-2 повышают физическую ра(х способность и выносливость мышей (Рис. 9, тест плавания с грузом 5% от массы те ускоряют выработку условного рефлекса активного избегания (УРАИ) у крыс, поло тельао влияют на экстраполяционное поведение животных, повышают устойчивость к поксии (Рис. 9, на модели гипоксии с гиперкапнией) и психоэмоциональному стра При экспериментальном гепатите, вызванном многократным введением четыреххлорш го углерода, пептиды оказывали защитное действие на печень (Рис. 8). Таким образ прогноз основной направленности фармакологической активности пептида-1 и пептид сделанный на основании тестирования in vitro с помощью ферментных биотест-сиа полностью подтвержден.

Рис. 8. Влияние растительных пептидов на скорость глутатионредуктазной, каталазной реакций in vitro и гидроксилирования в моноксигеназной системе(МОС) цитохрома P4S0 in vitro и in vivo (модель гепатита)

350'

Контроль Бемитил Женьшень Пептид-1 Пептид-2

Как было отмечено выше, предлагаемая программа скрининга может быть с успе применена для поиска и дальнейшей разработки новых оригинальных препаратов cj фитообъектов, содержащих соединения флавоноидной и тритерпеновой природы.

Предложенные биотест-системы были апробированы при разработке таких три пен- и флавоноидсодержащих препаратов как «Диквертин», «Простанорм», «Патримиг! «Сибектан». При этом необходимо подчеркнуть, что ферментные тест-системы, разр тайные на базе использованных нами принципов, эффективны не только в качестве

пресс-тестов для первичного скрининга БАВ, но и в качестве экспресс-тестов, позволяющих выявить сходство и различия между близкими по фармакологическим свойствам препаратами, а также для изучения биохимических механизмов фармакологического действия веществ.

Рис. 9. Влияние растительных пептидов на физическую работоспособность и выносливость и выживаемость мышей при

□ Плавание-1-й день

□ Плавание-2-й день Ш Гипоксия }4р.

120 100

Эффект, % 8060 40 20 0

гипоксии с гиперкапииеи

Кнтроль Бемитил Женьшень Пептид-1 Пептид-2

Как видно из рисунка 10, простанорм (жидкая лекарственная форма, 20 мкл/мл) in vitro влиял и на активность ферментов антиоксидантной защиты, и на монооксигеназную активность цитохрома Р450.

Простанорм существенно угнетал скорость глутатионредуктазной и каталазной реакций in vitro. Причем его угнетающее действие возрастало при увеличении концентрации препарата в пробе. Данный эффект свидетельствовал о возможности проявления про-станормом антимикробной активности. И действительно, наличие антимикробной активности у препарата доказано микробиологическими методами (см. след. раздел). Таким образом, в этом случае была подтверждена высокая специфичность биотест-системы на основе ферментов глутатионредуктазы и каталазы для выявления антимикробных свойств веществ и точность прогноза фармакологической активности по специфическому ферментному тесту. Простанорм in vitro активировал монооксигеназную активность цитохрома Р450 (Рис. 10), что указывало на его возможную гепатопротекторную активность. Этот вывод также совпал с результатами фармакологического изучения простанорма: при системном введении животным с экспериментальным гепатитом он улучшал состояние печени, о чем свидетельствовало, в частности, снижение активности аминотрансфераз в сыворотке крови крыс. При этом монооксигеназная активность цитохрома Р450 в печени повышалась. Эффект был особенно заметен при расчете ферментативной активности на

моль цитохрома, что свидетельствовало о непосредственном активирующем влиянии п станорма на ферментативную монооксигеназную активность цитохрома Pjso-

Диквертин (дигидрокверцетин), в экспериментах in vitro с применением биот( систем на основе ферментов антиоксидантной защиты, проявил себя как истинный тиоксидант, существенно повышая скорость глутатионредуктазной и каталазной реаки Кроме того, диквертин оказывал положительное влияние на монооксигеназную акт ность цитохрома Р450 in vitro (Рис. 10). Эти результаты полностью подтверждены при з периментальном фармакологическом изучении его антиоксидантных и гспатозащшт свойств с использованием соответствующих моделей на животных (см. след. раздел).

Сибектан, проявивший выраженную гепатозащитную и антиоксидантную акт ность в экспериментах на животных, в условиях in vitro повышал монооксигеназную тивность цитохрома Р450 в отношении гидроксилирования анилина также как и скоро глутатионредуктазной и каталазной реакций (Рис. 10). Положительное влияние сибект на функционирование моноксигеназной системы цитохрома Р450 сопоставимо с аналог ной активностью одного из ведущих компонентов препарата - силимара.

Рис. 10. Влияние патримина (10 мкг/мл), диквертина (10 мкг/мл),

сибектана (10 мкг/мл) и простанорма (20 мкл/мл) на скорость глутатионредуктазной, каталазной, аншшнгидроксилазной (МОС-АГ) и деметилазной (МОС-ДМ) реакций in vitro

У патримина, также как и простанорма, в процессе биохимических исследованш vitro выявлены новые направления его возможного фармакологического действия, именно - антимикробные и, особенно, гепатозащитные, свойства (Рис. 10). В случае п тверждения данной активности в условиях экспериментальных моделей, возможно bhs

ние соответствующих изменений в инструкцию по применению препарата с целью расширения показаний для его применения.

На базе НИЦ БМТ ВИЛАР была также разработана и в настоящее время патентуется (Попова Н.Б. и др., 2000) НДФН-оксидазная биотест-система, позволяющая выявлять им-муномодуляторы in vitro по их активирующему влиянию на НАДФН-оксидазу гомогената спокойных лейкоцитов. С использованием данного теста установлено, что простанорм (30 мкг/мл) и патримин в низкой концентрации - 1 мкг/мл, вызывают заметную активацию НАДФН-оксидазы, свидетельствующую о потенциальных иммуностимулирующих свойствах препаратов. Активирующее действие простанорма и патримина превосходило активность препарата сравнения - эстифана, известного иммуностимулятора. На основаии результатов тестирования in vitro, с целью расширения показаний для применения простанорма и патримина как иммуномодуляторов, целесообразно проведение углубленного изучения искомой активности в экспериментах на животных.

Соответствие прогноза биологической активности простанорма, сибектана, диквер-тина и патримина, сделанного по результатам их биохимического тестирования in vitro, с данными экспериментального изучения in vivo, представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Соответствие прогноза биологической активности фитообъектов по результатам первичного биохимического скрининга с использованием ферментных тест-систем с фармакологической активностью по результатам экспериментов на животных_

Вещество Ключевой фермент Активность фермента Прогноз активно ста фитообъекта Установленная фармакологическая активность

ПРОСТАНОРМ Глутатионредуктаза Уменьшение Антимикробная Активен в отношении стафилококка и стрептококка

Каталаза Уменьшение

Монооксигеназная система цитохрома Р450 Увеличение Антитоксическая Антитоксическая, гепатозащитная (модели гепатита)

НАДФН-оксидаза Увеличение Иммуностимулирующая Стимулирует фагоцитоз

ДИКВЕРТИН Глутатионредуктаза Увеличение Антиоксидант-ная Антиоксидантная (в модельных экспериментах)

Каталаза Увеличение

Монооксигеназная система цитохрома Р.™ Увеличение Антитоксическая "епатопротекторная (модели гепатита

СИБЕКТАН Глутатионредуктаза Увеличение Ангиоксидант-ная Антиоксидантная (в модельных экспериментах)

Каталаза Увеличение

Монооксигеназная система цитохрома Р450 Увеличение Антитоксическая Гепатопротектор-ная (модели гепатита

Таким образом, прогнозирование направленности фармакологического действия этапе первичного биохимического скрининга дает возможность изменить схему скрин; га в целом. А именно, вместо дорогостоящего, материально- и трудозатратного эт; первичного фармакологического скрининга, ввести первичное биохимическое экспре тестирование, с использованием ферментных биотест-снстем, по результатам котор можно проводить направленное фармакологическое изучение фитообъектов (Схема 1.). СХЕМА 1.

ПОИСК И РАЗРАБОТКА ФИТОПРЕПАРАТОВ

РЕШЕНИЕ О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ РАЗРАБОТКИ ФИТОПРЕПАРАТА (с учетом сырьевой базы и технологичности получения) ОТРИЦАТЕЛЬНО! РЕШЕНИЕ (РЕЗЕРВ)

1 ПОЛОЖИТЕЛЬНОЕ РЕШЕНИЕ

ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ [в соответствии с «Методическими указаниями по доклиническому изуче-IHIIO новых препаратов, разработанных нз природного сырья», 2000)

_I_

ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ФИТОПРЕПАРАТА С ЦЕЛЬЮ ПЕРЕДАЧИ В НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКСПЕРТИЗЫ И ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ МЗ РФ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ РАЗРЕШЕНИЯ НА ПРОВЕДЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ _ИЛИ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ_

РАЗРАБОТКА ФИТОПРЕПАРАТОВ

Разработка флавоноидного препарата антиоксидантного действия -«Диквертина» (аигнярокверцетин)

Как показали результаты биохимического тестирования перспективным в плане разработки нового антиоксидантного средства оказался флавоноид дигидрокверцетин (ДКВ), получаемый из древесины лиственницы сибирской и Даурской и являющийся по химической структуре близкородственным соединением кверцетину (КВ, Антонова Г.Ф., Тю-кавкинаН.А., 1983). Ранее в отдельных экспериментах было показано, что ДКВ обладает антиоксидантной и противовоспалительной активностью (Ильюченок Т.Ю. и др., 1975; Тюкавкина H.A. и др., 1993; Теселкин Ю.О. и др., 1994; Robak at el., 1986). Возможная широта терапевтического действия, стабильность сырьевой базы для получения ДКВ послужили основой для проведения настоящей экспериментальной работы по сравнительному изучению фармакологичнеских свойств ДКВ и КВ с целью разработки препарата на основе ДКВ, обладающего капилляропротекторной и антиоксидантной активностью.

Антиоксидантные и гепатопротекторные свойства. Специфическая антиоксидантная активность ДКВ в сравнении с известным антиоксидантом КВ показана в модельных экспериментах in vitro с использованием гомогената печени крыс при концентрациях вещества 100, 500 и 1000 мкг/г печени, и в условиях токсического поражения печени тетрациклином при внутрижелудочном введении ДКВ крысам в дозах 30 и 100 мг/кг. Гепато-защитный эффект препарата также изучали на модели острого ССи-гепатита у крыс.

Как показал эксперимент, инкубация гомогената печени крыс в системе, содержащей ионы Fe и НАДФН, приводил к усилению свободно-радикальной реакции, что, в свою очередь, стимулирует образование молекул МДА. ДКВ подавлял индуцированное ПОЛ, что проявлялось в уменьшении количества МДА на 38-61 % по сравнению с контролем (Рис. 11). Антиоксидантный эффект препарата возрастал с увеличением его концентрации в гомогенате. Известный антиоксидант КВ также дозо-зависимо подавлял процессы ПОЛ в печени крыс, однако его эффект при концентрации 100 мкг/г был выражен слабее (на 10 %), чем у ДКВ.

Модели поражения печени сильными прооксидантами и гепатогрогшыми ядами -тетрациклином и ССЦ, позволяют оценить антиоксидантные и гепатопротекторные свойства препаратов. При тетрациклиновом гепатите в гомогенатах печени крыс уровень МДА в 3,4 раза превосходил аналогичный уровень в печени здоровых крыс (Табл. 11). Под влиянием ДКВ (100 мг/кг) уровень МДА снижался на 37 %, а под влиянием КВ - на

22 %, по сравнению с не лечеными животными. Важным моментом в проявлении п паратом гепатопротекторных свойств является устранение гиперферментемии, обусл ленной цитолизом гепатоцитов. В условиях острого тстрациклшювото гепатита ДК обеих изучавшихся дозах задерживал скорость нарастания лкшпиосш трансамина! н i лочной фосфатазы в пределах 15,6-24.4 %% по сравнению с кошртсм ( lao.i. 11) Акт ность ДКВ была сопоставима с эффектом КВ. 4-х разовое введение ССЬ приводил! многократному росту активности цитолитических ферментов по сравнению с исходи уровнем на протяжении всего срока эксперимента (Табл. 12). Так на 14-й день исследо ния активность АЛТ превосходила исходную в 6,4 раза. В тоже время у животных ош ных групп, получавших ДКВ в дозе 30 мг/кг, скорость нарастания активности фермен' была в 1,5-2,5 раза (АЛТ), в 1,1-2,0 раза (ACT) и в 1,5-1,6 (у-ГГТ) раз ниже чем в контро Менее выражено антитоксический эффект ДКВ проявлялся в дозе 100 мг/кг, а также изменению в процессе эксперимента уровня активности ЩФ (Табл. 12).

Рисунок 11. Влияние ДКВ и KB на ПОЛ в гомогенате печени крыс

Таблица 11.

Влияние ДКВ на активность некоторых сывороточных ферментов и содержание МДА в печени крыс с тетрациклиновым гепатитом

Вариант опыта АЛТ, МЕ/л (%к контролю) ACT, МЕ/л (% к контролю) ЩФ, мкмоль/л % к контролю) МДА,мкмоль/г белка (% к контролю)

Контроль 215±4 198+22 772+21 334+35

ДКВ, 30 мг/кг 173±б(-19) 151+17(-24) 652±12**(-15) -

ДКВ, 100 мг/кг 180+3 158+15 584+8**(-24) 212+17* (-36)

KB, 30 мг/кг 162+4 135+13 569+9**(-26) 263+17 (-21)

Интактная - - - 78+6** (-76)

Примечание: АЛТ - аланинаминотрансфераза, ACT - аспартатаминотрансфераза, ЩС щелочная фосфотаза, МДА - малоновый диальдегид. * или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Для средства, являющегося потенциальным антиоксидантом, кроме активности в отношении процессов ПОЛ, важно было изучить его влияние на процессы воспаления, сосудистую проницаемость, оценить гастропротективные, гиполипидемические и диуретические свойства.

Противовоспалительные свойства. Противовоспалительное действие ДКВ изучали при его внутрижелудочном введении в дозах 100 и 300 мг/кг на моделях острого воспалительного отека задней конечности у мышей, и на модели перитонита у крыс. Установлено, что ДКВ проявляет заметную противовоспалительную активность, сопоставимую с активностью КВ, что выражалось в уменьшении в 4,3 и 3,2 раза количества воспалительного экссудата в брюшной полости у крыс и в 1,1-1,4 раза формалинового и гистамино-вого отеков конечностей у мышей по сравнению с контролем (Табл.13).

Таблица 12.

Влияние ДКВ на активность сывороточных трансаминаз у крыс с ССЦ -гепатитом

Вариант опыта ДНИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходный уровень| 7 | 14 | 21

Аланинаминотрансфераза, МЕ/л

Контроль 49+2 241+11 313+6 200±7

ДКВ, 30 мг/кг 57+6 169+3** 172±12** 85±10*

ДКВ, 100 мг/кг 44+3 197±б* 171+5** 126±4**

Аспартатаминотрансфераза, МЕ/л

Контроль 110+10 255+8 262±4 249±14

ДКВ, 30 мг/кг 111+6 225+9 162+10** 123+8**

ДКВ, 100 мг/кг 98+6 106±7** 136±8** 126+11**

Гамма-глутамилт] )ансфераза, МЕ/л

Контроль 4,6+0,9 25,1+4,6 20,1+1,3 14,4+2,1

ДКВ, 30 мг/кг 5,2±0,6 16,8±2,2 12,6+0,7** 9,3±0,6

ДКВ, 100 мг/кг 4,9+0,5 21,9+2,1 15,8+0,9** 7,2+0,4*

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01 Таблица 13. Влияние ДКВ и КВ на проницаемость капилляров кожи и воспалительный отек конечно стей у мышей и экспериментальный перитонит у крыс

Вариант опыта Время выхода трипановой сини, сек (% к контролю) Формалиновый отек, мг (% к контролю) Гистаминовый отек, мг (% к контролю) Перитонеальный экссудат, мл (% к контролю)

Контроль 106,2+2,4 71,5±2,3 42,1 ±0,4 1,7+0,31

ДКВ, 100 мг/кг 162,5+1,1** (+53) 59,7±0,7**(-17) 37,8+0,8**(-10) -

КВ, 100 мг/кг 122,5+2,7** (+15) 59,0±1,2**(-17) - -

ДКВ, 300 мг/кг 173,5±9,4** (+63) 57,0±1,2**(-20) 35,5+1,8 (-16) 0,4±0,04** (-76)

КВ, 300 мг/кг )24,0+3,1** (+24) 50,9+!,9**(-29) 36,8+4,5 (-13) 0,5+0,09** (-71)

** - достоверность отличий от контроля при р<0,01

Ангиопротекторные свойства. Капилляропротекторное действие ДКВ изучено при его внутрижелудочном введении в дозах 50,100 и 300 мг/кг на модели повышения сосудистой проницаемости кожи у мышей. Экспериментальные исследования показали, что ДКВ обладает выраженным капилляропротекторным действием, превосходящим аналогичную активность КВ в 3,4 (100 мг/кг) и 4,9 (300 мг/кг) раза (Табл. 13).

Гастропротективные свойства. Ангиопротекторные свойства ДКВ, вероятно, onj деляли и его гастропротективное действие. Внутрижелудочное введение препарата ж вотным в дозах 10-50-300 мг/кг до или на фоне действия различных ульцерогенных аге тов (перевязка пилоруса, этанол, кофеиново-мышьяковистая смесь) оказывало дозозаь симое защитное действие на слизистую желудка крыс. Это выражалось в снижении Ю-25%% числа "больных" крыс, уменьшении на 15-50%% частоты образования и п.г щади язвенных дефектов, а также индекса Паулса.

Гиполипидемические свойства. Влияние ДКВ на некоторые показатели липидно обмена изучали на модели гиперлипидемии у крыс-самцов, находившихся на атероген» диете (Базазьян Г.Г., 1982) в течение 52 дней. Опытным животным одновременно с диет внутрижелудочно вводили ДКВ (250 мг/кг). В качестве препарата сравнения использова полиспонин (ПС, 250 мг/кг) - известное гиполипидемическое средство. В конце экспер мента определяли содержание общего холестерина, ß-липопротеидов и триглицеридо! сыворотке крови, проводили морфологическое изучение ультраструктуры кардиоми цитов папиллярных мышц сердца животных. Было показано, что атерогенная диета избытком экзогенного холестерина вызывала у контрольных крыс четкую гиперхолеи ринемию (Табл. 14). У животных, леченых ДКВ, наблюдалось существенное снижен по сравнению с контролем (на 30-40%) концентрации в сыворотке крови ß липопротеидов и триглицеридов. Эффект ДКВ был сопоставим с активностью ПС. И тересные данные получены при морфологическом изучении ультраструктуры карди миоцитов папиллярных мышц сердца крыс. У животных, находящихся на диете, уст новлены определенные изменения ультраструктурной организации сократительного апг рата кардиомиоцитов, что выражалось в локальном лизисе миофиламентов в отдельш саркомерах. Введение ДКВ и ПС крысам на фоне атерогенкой диеты сопровождало снижением объемной плотности соединительной ткани (для ДКВ - на 60 %) и соответс вующим увеличением объемной плотности мышечной ткани в папиллярных мышц сердца по сравнению с контрольными животными (Табл. 14).

Полученные данные дают основание полагать, что ДКВ может играть определенна протекторную роль в отношении развития кардиосклероза на фоне гиперхолестеринеми

Таблица 14.

Влияние ДКВ(250 мг/кг) и полиспонина(250 мг/кг) на некоторые показатели гиперлипи-_демии и объемной плотности мышечной и соединительной тканей у крыс_

Вариант опыта Показатели липидного обмена Объемная плотность тканей сердца, у.е.

Солестерин, мг% Р-липопротеиды, мг% Триглицериды, ммоль/л Соединительная ткань Мышечная ткань

Интактная 32,0+4,5 25,4±13,6 1,16±0,32 - -

Контроль 56,1+4,2 59,3+32,3 1,36±0,35 10,4+0,9 89,6+0,9

ДКВ 66,9+10,9 40,9±33,3 0,79+0,27 4,0+0,3** 96,0±0,4*

Полиспонин 64,5+13,9 39,3+22,2 0,89+0,46 9,0+0,3 91,0+0,4

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Диуретические свойства. Диуретическое действие ДКВ изучали при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозах 20 и 100 мг/кг. ДКВ заметно усиливал стимулированный водной нагрузкой диурез у крыс, причем эффект возрастал с увеличением дозы препарата: при дозе ДКВ 100 мг/кг суммарный (за 4 часа) диурез увеличился на 31 % (р<0,05) по сравнению с контролем.

Таким образом, в результате проведенной экспериментальной работы выявлены ка-пилляропротекторные и антиоксидантные свойства ДКВ (превосходящие в ряде случаев эффект KB) и сочетающиеся с противовоспалительным, гастро- и гепатопротектор-ным, гиполипидемическим, диуретическим действием. Как известно, в основе ангио-протекторного действия, а также многих других известных фармако-терапевтических эффектов биофлавоноидов (в том числе гепатопротекторных, антитоксических, противовоспалительных), лежит их способность прямо или косвенно влиять на биомембраны, что, в свою очередь, связано с ингибированием свободнорадикальных процессов в биомембранах (Николаев С.М., 1983). Исходя из результатов исследований in vitro антиоксидант-ных свойств ДКВ, а также с учетом данных литературы (Теселкин Ю.О. и др., 1994, 1998; Fulcuzawa,1981), можно предположить, что он обладает прямой антирадикальной активностью, преимущественно взаимодействуя с липидными радикалами. Вместе с тем, на ор-ганизменном уровне, не исключена реакция ДКВ (также как и KB) как с пероксильными радикалами (Теселкин Ю.О. и др., 1998, 1999), так и с супероксидными анионами Rolak, Griglewsky, 1988). Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ДКВ, в частности, тормозит тетрациклин- и СС14-индуцированную липидную пероксидацию микросом печени, приводящую к интенсивному выходу из поврежденных печеночных клеток трансаминаз. С учетом результатов биохимического скрининга можно предположить, что ДКВ, также как и KB, предупреждая накопление продуктов ПОЛ, способен индуцировать ферменты монооксигеназной системы печени, в частности, цитохром Р-450 (Теселкин Ю.О. и др., 1999; Лукьянчук В.Д. и др, 1993).

Высокая антирадикальная активность ДКВ также установлена в модельных экспе) ментах по изучения радиопротекторных свойств ДКВ на молекулярном уровне - по ci собности защищать от повреждения биополимеры ДНК и белок при гамма облученш водных растворах (Кондакова Н.В. и др. 1997-2000). Исследования, проведенные совме но с НИЦ БМТ «ВИЛАР» (рук. исследований - д.б.н. Кондакова Н.В.), показали, что Д1 обладает способностью защищать молекулы ДНК и белка (трипсин) от радиационной , градации и инактивации ОН-радикалами (один из продуктов радиолиза воды). По эфф< тивности защиты ДКВ не уступает известному радиопротектору антоциану. Эти резуль ты свидетельствовали о принципиальной возможности вмешательства ДКВ в первичн физико-химические процессы формирования лучевого повреждения биоструктур в ор: низме. Результаты экспериментов в условиях опытов in vitro нашли свое подтвержден» модельных экспериментах на животных. Показано, что в условиях общего у-облучен ДКВ при внутрижелудочном введении за 24 ч и 1 ч до облучения в дозе 100 мг/кг и вн; рибрюшинном введении за 15- 20 мин до облучения в дозе 24 мг/кг повышал выжив; мость мышей в 1,5 - 2,5 раза по сравнению с контролем (Кондакова Н.В. и др., 1998). 1 же показано, что ДКВ тормозит развитие свободно-радикального окисления липидое плазме крови и печени мышей, подвергшихся общему у-облучен шо (Теселкин Ю.О. и д 1999).

Исследование безопасности ДКВ. Исследования показали, что ДКВ по параметр острой токсичности для мышей и крыс при однократном внутрибрюшинном введен может быть отнесен к малотокснчным веществам (LD50 для мышей - 680±65 и 635+50, д крыс - 566+15 и 600±18 мг/кг), а при внутрижелудочном введении - к практически иетс сичным. В хронических экспериментах на крысах (100-кратное превышение терапевта1 ской дозы) и на собаках (готовая лекарственная форма - таблетки по 0,02 г; пятикратн превышение терапевтической дозы) в течение 6-ти месяцев не выявлено существенн] отклонений со стороны основных органов и систем организма. Это подтверждалось и t томорфологическими исследованиями внутренних органов животных. При изучении ci цифических видов токсичности у животных не обнаружено аллергических реакций введение ДКВ. Он не обладал мутагенным, эмбриотоксическим и местнораздражающ; действием, не влиял на репродуктивную функцию крыс.

Клинические исследования. На основании результатов доклинического изучен Фармакологический государственный комитет МЗ РФ разрешил клинические исследо] ния лекарственной формы ДКВ (под названием «Диквертин») - таблеток по 0,02 г, как г тиоксидантного и капилляропротекторного средства. Результаты клинических исследо] нийдиквертина, проведенные у 200 больных в 2-х специализированных лечебных учре

дениях г.Москвы, подтвердили, в основном, данные экспериментальных исследований. В условиях стационара у больных в возрасте от 19 до 68 лет при пневмонии в остром периоде заболевания, хроническом обструктивном бронхите с нарушением вентиляционной функции 1-П степени, бронхиальной астме (инфекционио-зависимая форма в стадии обострения), ишемической болезни сердца (ИБС) с клиническими проявлениями нестабильной стенокардии диквертин (2-3 таблетки 4 раза в сутки) проявил себя как сильный анти-оксидант и ангиопротектор. Так, усиление процессов ПОЛ при воспалительных заболеваниях бронхолегочной системы инициируется активными формами кислорода и сопровождается, в частности, увеличением малонового диальдегида (МДА), диеновых коньюгатов (ДК), перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) и уменьшением эндогенного антиокси-данга альфа-токоферола (о-ТФ). У больных, получавших диквертин, к 10-14 дням лечения наблюдалось достоверное снижение уровня МДА, ДК и ПГЭ (на 25, 19 и 13%% соответственно) и увеличение уровня а-ТФ (на 21%) по сравнению с контрольной группой больных. В группе сравнения, получавших антиокислительный комплекс (АОК: а-ТФ по 0,1 г внутрь + натрия тиосульфат 10% по 10 мл в/в), характер изменения показателей ПОЛ был подобен тому, что наблюдалось в опытной группе (Рис. 12).

%0Т 180 здоровых

140 120

Рисунок 12. Влияние диквертинана показатели ПОЛ у больных на 10-14 дни лечения пневмонии

200-г

Показатели

На основании результатов представленных исследований приказом МЗ РФ №302 от 29.07.96 разрешен промышленный выпуск препарата «Диквертин», таблетки по 0,02 г для приема внутрь как антиоксидантного и капилляропротекторного средства при бронхо-легочных заболеваниях, а также при ишемической болезни сердца и наджелудочковых нарушениях ритма сердца в составе комплексной терапии.

Разработка комплексного флавоиондсодержашсю препарата гепатопротекторного и желчегонного действия - «Сибектана»

Известно, что в настоящее время в России, как и в большинстве развитых стран. 15-20% взрослого населения страдает острой и хронической naioini ней печени В результате многолетних исследований, проводимых в ВИЛЛ Го. стлан ряд прсплраюв па основе растительного сырья для лечения заболеваний же.^дочно-кншечного тракта. (Глызин В.И. и др., 1995; Вичканова С.А. и др., 1996). Композиция сибсктана составлена так, чтобы оказывать оптимальное защитное воздействие при патологии гепато-билиарной системы. Растения, экстракты которых образуют формулу препарата, известны и пользуются популярностью в отечественной и зарубежной традиционной и официнальной медицине. Так, на основе цветков пижмы в институте создан и разрешен к медицинскому применению препарат желчегонного действия «Танацехол» - компонент сибектана; из жома плодов расторопши разрешен к медицинскому применению в качестве гепатозащитного средства препарат «Силимар» (аналог «Карсила») - компонент сибектана; препараты из травы зверобоя применяют внутрь как вяжущие, антимикробные, антидепрессантные средства; лист березы известен диуретическими, противовоспалительными и другими свойствами (Скляревский, Л.Я., Губанов И.А., 1989; Вичканова С. А. и др. 1996). Основную фармакологическую нагрузку в данном препарате несут, безусловно, флавоноидсодержащие компоненты - танацехол и силимар (Ба-гинская А.И. и др., 2000; Колхир В.К. и др. 2001). С учетом результатов биохимического тестирования представлялось целесообразньм провести исследования сибектана как желчегонного и гепатопротекторного средства.

Желчегонные свойства. Положительное влияние сибектана на внешнесекреторнук функцию печени доказано в острых опытах на крысах-самцах, с использованием модел1 канюлирования общего желчного протока. Желчь собирали в течение 3-х часов пост однократного интрадуоденального введения препарата в дозах 100 и 300 мг/кг. Препа ратом сравнения служил фламин (300 мг/кг) - известное желчегонное средство. В про цессе экспериментов определяли как общее количество выделенной желчи, так и ei компонентов - желчных кислот, холестерина и билирубина.

Установлено, что введение сибектана в дозе 100 мг/кг приводило к достоверном; увеличению на 31 и 25 %% желчеотделения у крыс к 1-му и 2-му часам эксперимента ш сравнению с исходным уровнем (Табл. 15). При этом наблюдалось количественное из менение компонентов желчи. Так, если у интактных животных в течение периода на блюдения компонентный состав желчи постепенно уменьшался по сравнению с исход ньм уровнем, то у опытных крыс в 1-й и 2-й часы после введения сибектанаа увеличе

ние содержания желчных кислот, холестерина и билирубина в желчи по отношению к исходному уровню составило 73 и 58%, 24 и 33%, 48 и 30%, соответственно показателю (Табл. 15). Холато-холестериновый коэффициент в 1,7 раза превышал аналогичный показатель интактных животных. Желчегонный эффект сибектана (100 мг/кг) сопоставим с активностью фламина (100 мг/кг), однако последний оказывал менее выраженное влияние на компонентный состав желчи. Увеличение дозы препарата до 300 мг/кг не приводило к усилению желчеотделения.

Гепатопротекторные. антиоксидантные и антитоксические свойства. Влияние сибектана на функции печени изучали с использованием моделей поражения печени крыс четыреххлористым углеродом и тетрациклином и различных схем экспериментов. Так, в 1-й серии опытов препарат вводили внутрижелудочно крысам в дозах 50 и 200 мг/кг в течение 3-х дней до однократного подкожного введения ССЦ (0,4 мл/100 г). Животных забивали через 48 часов и отбирали сыворотку крови на биохимический анализ, активность АЛТ, АСТ, концентрацию общего холестерина и триглицеридов. Показано, что сибектан (50 мг/кг) достоверно уменьшал на 38 и 28 %% активность АЛТ и АСТ и на 53 и 58 %% - концентрацию общего холестерина и триглицеридов в сывортке крови крыс по сравнению с контролем. Во 2-й серии экспериментов, проведенных по аналогичной схеме у мышей с дополнительным внутрибрюшинным введением гексенапа (65 мг/кг) через три часа после СС1< (т.н. «гексеналовая проба»), показано, что сибектан (50 и 100 мг/кг) укорачивал на 40 и 35 %%, соответственно дозе, длительность сна по сравнению с контролем, что свидетельствовало об антитоксическом эффекте сибектана.

В 3-ей серии опытов экспериментальный гепатит у крыс вызывали путем 3-х кратного (через день) подкожного введения ССЦ. Сибектан вводили внутрижелудочно в дозах 30-50-100-200 мг/кг в течение 7-ми дней до и 21 дня после начала введения ССЦ. О защитном действии препарата судили по изменению показателей, характеризующих состояние детоксицирующей, синтетико-выделительной, желчевыделительной, антиокси-дантной функции печени крыс по сравнению с контролем и активностью препарата сравнения - карсила, известного гепатопротектора. Так, на 15-й день эксперимента введение сибектана (30 и 100 мг/кг) приводило к достоверному укорачиванию длительности «гексенатового» сна на 36,8 и 31,5 %% по сравнению с контролем (Табл. 16). При этом, у группы опытных животных, подвергшихся натрузке бензойно-кислым натрием (200 мг/кг, внутрь), наблюдалось дозо-зависимое (сопоставимое с карсилом) увеличение выведения с мочой данного агента - на 37,8 и 42,8 %%, по сравнению с контролем. В этот же период времени наблюдали усиление интенсивности желчеотделения у опытных животных. Таким образом, показано, что сибектан увеличивает антитоксическую и

обезвреживающе-выделительную функции печени крыс на фоне повреждающего действия ССЦ.

Таблица 15

Влияние сибектана на интенсивность желчеотделения и выделение желчных ки-_слот, холестерина и билирубина с желчью крыс_

Вариант опыта Исходный фон После введения препарата

Через 1 час | Через 2 часа | Через 3 часа

Интенсивность желчеотделения, мл/час/100 г массы тела

Сибектан, 100 мг/кг 0,16+0,01 0,21+0,01* 0,2±0,02 0,15+0,01

Сибектан, 300 мг/кг 0,17+0,01 0,22+0,01* 0,21+0,02 0,17+0,04

Фламин, 150 мг/кг 0,15±0,01 0,21±0,02* 0,2±0,01 0,16+0,01

Желчные кислоты, мг/кг

Интактные крысы 8,4+0,62 9,42+0,73 7,81+0,51 7,72±0,47

Сибектан, 100 мг/кг 12,3+1,4 21,2+2,4* 19,4+3,2 18,7±1,6*

Фламин, 150 мг/кг 9,12+0,72 14,85±2,12 13,82+2,02 10,2211,82

Холестерин, мг/кг

Интактные крысы 0,58±0,04 0,44+0,05 0,53+0,06 0,5210,06

Сибектан, 100 мг/кг 0,54±0,07 0,67+0,02 0,72+0,14 0,6310,03

Фламин, 150 мг/кг 0,49±0,08 0,53±0,05 0,58+0,07 0,63+0,04

Билирубин, мг/кг

Интактные крысы 0,22±0,02 0,25±0,01 0,23+0,02 0,2+0,01

Сибектан, 100 мг/кг 0,27±0,02 0,4+0,02* 0,35+0,04 0,29+0,04

Фламин, 150 мг/кг 0,24±0,04 0,3210,04 0,29+0,03 0,21+0,01

* - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05

Таблица 16.

Влияние сибектана на длительность гексеналового сна и выведение бензойно-кислого н; __трия у крыс с ССЦ -гепатитом_

Вариант опыта Длительность сна, мин (% к контролю) Выведение бензойно-кислого натрия, % (% к контролю)

Интактные крысы 22,7+0,5 58,615,2

Контроль 59,1+6,7 34,4614,8

Сибектан, 30 мг/кг 37,414,8* (-36,8) 47,512,4* (+37,8)

Сибектан, 100 мг/кг 40,5±3,3* (-31,5) 49,2+3,11* (+42,8)

Интактные крысы 29,914,2 58,6+5,2

Контроль 135,4114,4 33,212,7

КарсилДОО мг/кг 95,0111,5* (-29,2) 45,415,2* (+36,7)

* или * * - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Активность аминотрансфераз и ЩФ в сыворотке крови опытных и контрольных

крыс определяли на 7-й, 14-й и 21-й дни эксперимента. На фоне цитолиза печеночных клеток, вызванного введением ССЦ, резко возрастает активность данных ферментов е крови контрольных животных (Табл. 17). На фоне введения сибектана наблюдалось заметное (сопоставимое с активностью карсила) торможение увеличения активности AJIT и ACT на 7-й и 14-й дни эксперимента. Так, активность AJIT у крыс, получавших сибек-тан в дозах 30 и 50 мг/кг, составляла 57 и 50%% (р<0,05) от контроля. В меньшей степени отмечено влияние препарата на активность ЩФ. Также показано, что на 7-й день экс-

перимента сибектан (30 и 100 мг/кг) достоверно на 12 и 63%% снижал повышенное содержание МДА (индикатор усиления ПОЛ) в печени опытных крыс по сравнению с контролем (Табл. 17). Это свидетельствует об антиоксидантной активности препарата.

В 4-й серии экспериментов гепатит вызывали путем 4-х кратного (через день) внутрижелудочного введения тетрациклина (0,5 г/кг) крысам. Как и в случае с CCI4-гепатитом, данная модель приводит к цитолитическому поражению печени. Препарат животным вводили внутрижелудочно в дозах 30 и 100 мг/кг в течение 5-и дней до и на фоне 4-х дней введения тетрациклина. Через 48 часов после последнего введения животных забивали и определяли активность АЛГ и ACT в сыворотке крови. Установлено, что, как и в предыдущей серии экспериментов, лечебно-профилактическое применение сибектана приводило к значительному замедлению нарастания (на 30-53%%, р<0,05) активности АЛТ и ACT по сравнению с контролем.

Таблица 17.

Влияние сибектана на активность сывороточных аминотрансфераз и содержание МДА в _печени крыс с ССЦ -гепатитом_

Вариант опыта ДНИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходные 7 14 21 _

Аланинаминотрансфераза, МЕ/л (% к контролю)

Контроль 52±3 217+19 170+29 61+7

Сибектан, 30 мг/кг 53+3 - 97+9* (-43) 5214

Сибектан, 50 мг/кг 47+4 85+3** (-61) 78+6* (-50) 4412

Сибектан, 100 мг/кг 42±5 168+11* (-23) 127113 (-25) 62+3

Сибектан, 200 мг/кг 5115 139+14** (-36) 111+7 (-35) 7415

Карсил, 100 мг/кг 50+4 99+12* (-54) 102±6 (-40) 49+4

Аспартатаминотрансфе) заза, МЕ/л (% к контролю)

Контроль 113±9 308+19 264+12 142+7

Сибектан, 30 мг/кг 117±6 - 184+7** (-30) 12116

Сибектан, 50 мг/кг 124±3 156+22* (-49) 14719* (-44) 11815* (-17)

Сибектан, 100 мг/кг 128+6 231+2* (-25) 220+14* (-17) 150+5

Зибектан, 200 мг/кг 114+7 202+20* (-34) 215+8* (-19) 164+4

Содержание МДА в печени крыс, мкмоль/г белка (% к контролю)

Интактные крысы 78,2±5,7 80,5+7,6 65,214,6

Контроль 278,0±17,9 107,7+16,7 75,0121,1

Сибектан, 30 мг/кг 244,8+12,2* (-12) 98,7115,4 (-8) 62,8118,6

Сибектан,100 мг/кг 103,8+31,4**(-63 98,1+28,8 (-9) 85,9128,2

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Диуретические свойства. Диуретическое действие сибектана установлено при его однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 30 мг/кг. Сибектан заметно усиливал стимулированный водной нагрузкой диурез у крыс (Рис. 13). Суммарный (за 5 часа) диурез увеличился в 2,5 раза (р<0,01) по сравнению с контролем.

Таблица 18.

Влияние сибектана на этаноловые язвы желудка у крыс

Вариант опыта Крысы с язвами, % Степень изъязвления Индекс Паулса Терап. эффект Площадь язв Индекс Паулса Терап. эффект

Контроль 100 7,0+2,4 100% 7,0 — 61,8±2,1 100% 61,8 —

Сибектан, 50 4,9±1,8 2,45 2,1 25,0±1,9** 12,5 4,8

200 мг/кг -30,0% -59,5%

** - достоверность отличий от контроля при р<0,01

Гастропротективные свойства. Внутрижелудочное введение препарата крысам ] дозе 200 мг/кг на модели этанолового повреждения слизистой желудка оказывало дос товерное защитное действие на слизистую желудка. Это выражалось в снижении к 50% числа "больных" крыс, уменьшении на 30-60%% частоты образования и площад1 язвенных дефектов, снижении в 3-5 раз индекса Паулса (Табл. 18).

Рис. 13. Влияние сибектана на диурез у крыс

120 100

Диурез, % к 80 водной нагрузке ¿д.

40200

1 час 2 час 3 час 4 час 5 час Периоды наблюдения

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что сибек тан защищает печеночные клетки от повреждающего действия гепатотропных ядов улучшает желчевьщелительную функцию печени, одновременно увеличивая выделен» с желчью холатов, холестерина и билирубина; улучшает обезвреживающую и выдели тельную функции печени; усиливает процессы регенерации в поврежедниой слизисто{ желудка; тормозит процессы ПОЛ, а также стимулирует мочевыделительную функцик почек. Сибектан по влиянию на функциональную активность печени в эксперимент! превышает активность зарубежного препарата «Карсил».

Безусловно, одним из ведущих компонентов в проявлении сибектаном вышепе речисленных свойств является стабилизирующее влияние флавоноидных компоненто! препарата на биологические мембраны в сочетании с антиоксидантными свойствам! (Барабой В.А., 1976, Багинская А.И. и др. 1988, 1994, 2000). Антирадикальная актив ность сибектана и его флавоноидных компонентов - силимара и танацехола (Багиискш А.И. и др., 2000) сочетается с радиопротекгорньши свойствами препарата. Сибектан ш

□ Контроль □ Сибектан-30

молекулярном уровне защищает от радиационной деградации при у-облучении в водных растворах биополимеры ДНК и белка (Кондакова Н.В. и др., 1998, 1999).

Исследование безопасности сибектана. Исследования показали, что сибектан по параметрам острой токсичности для мышей и крыс при однократном внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях может быть отнесен к практически нетоксичным веществам. В подострых экспериментах на крысах (5-ЮО-кратное превышение терапевтической дозы) не выявлено изменений морфологических и биохимических показателей крови, функционального состояния сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, печени и почек. Низкая токсичность сибектана подтверждена в хронических экспериментах на собаках (готовая лекарственная форма - таблетки по 0,1 г; двух- и двадцатикратное превышение терапевтической дозы) в течение 4-х месяцев не выявлено существенных отклонений со стороны основных органов и систем организма. Это подтверждалось и патоморфологическими исследованиями внутренних органов животных.

Клинические исследования. На основании результатов доклинического изучения Фармакологический государственный комитет МЗ РФ разрешил клинические исследования лекарственной формы сибектана - таблетки по 0,1 г, как гепатозащитного и желчегонного средства. Результаты клинических исследований сибектана, проведенные у 120 больных в 2-х специализированных гастроэнтерологических лечебных учреждениях г.Москвы подтвердили гепатозащитные свойства препарата, установленные в эксперименте. В условиях стационара у больных в возрасте от 15 до 79 лет при диффузных поражения печени (хронический персистирующий гепатит, хронический персистирующий гепатит с жировой дистрофией печени, хронический персистирующий гепатит с признаками начавшегося перехода в цирроз печени, гепатиты алкогольной или медикаментозной этиологии), заболеваниях желчного пузыря (хронический холецистит, дискинезия желчевыводящих путей по гипомоторному типу), заболеваниях желудка (хронический гастрит, хронический гастродуоденит, язвенная болезнь двенадцатиперсной кишки, функциональное расстройство желудка) сибектан (2 таблетки 4 раза в сутки) проявил себя сильньм гепатопротектором и нормализующим функции желчного пузыря и желчевыводящих путей средством. Как гепатопротектор сибектан не уступал активности препарата сравнения - карсилу.

Приказом МЗ РФ № 51 от 18.02.97 (Р.У. 97/51/12) сибектан (таблетки по 0,1 г) разрешен к применению в медицинской практике у взрослых в качестве гепатопротектор-ного и желчегонного средства при хроническом перснстирующем гепатите, хроническом холецистите и гипомоторной дискинезии желчного пузыря. Сибектан применяют

также в комплексной терапии цирроза печени и жировой дистрофии печени алкогольн го генеза.

Разработка комплексного тритерпен- и флавоноидсодержащего препарата простатотропного действия - «Простанорма»

В состав простанорма входят экстракты из растений, обладающие как собствет простатотропной активностью, так и улучшающие микроциркуляторные процессы предстательной железе, усиливающие (нормализующие) мочеотделение, оказывакшц противовоспалительное, капилляропротекторное и антимикробное действие. Специф] ческую фармакологическую активность простанорма обуславливает, прежде всего, npi сутствие в его составе тритерпеновых и флавоноидных гликозидов из солодки. Так, у тановлено, что отвар из очищенных корней солодки обладает выраженной гонадотро) ной, андрогенной и диуретической активностью, по степени выраженности превосх( дящей активность «Цернилтона» - известного антипростатитного средства, и препар; из солодки рекомендуется использовать для профилактики и лечения простатита fП тент N 2058152 от 10.11.94). Кроме того, показано, что тритерпеноиды из солодки обл; дают антиаллергическими, антитоксическими, гипохолестеринемическими, антирад! кальными, а флавоноиды, кроме того, еще и противомикробными и антиоксидантньш свойствами (Вичканова С.А., 1981; Бондарев A.M. и др., 1995; Takagi, 1969; Segal, 1971 Kenzo et al., 1989, Ju et al., 1990). Экстракт травы золотарника входит в состав препар: тов «Инконтурин», «Простафортон», «Антипростин», «Простамед», «Цефасабаль (Германия), применяемых при простатитах, аденоме простаты, ночном недержани мочи, цистите (Lutomski et al., 1987). Диуретический, противовоспалительный и «кал нерастворяющий» эффекты золотарника присущи флавоноидам из золотарника (Батк B.C. и др., 1988). Активность флавоноидсодержащего растения зверобоя описана в npi дыдущем разделе. Препараты эхинацеи пурпурной, в частности, препарат «Эстифаг (сухой экстракт травы эхинацеи), применяются как иммуностимулирующие средстн (Сакович Г.С., Колхир В.К., 2001). Они также проявляют андрогенную и улучшающу потенцию активность.

При биохимическом тестировании показано, что простанорм в ферментных тес системах оказывал прямое влияние на активность ферментов антиоксидантной активш ста, НАДФН-оксидазы, моноксигеназую активность цитохрома Р45о, что характеризов; ло его как потенциального антимикробного, иммуностимулирующего, и детоксицирук щего средства. На основании вышеизложенного бьии проведены необходимые иссл! дования с целью разработки препарата для лечения хронического простатита.

Простанорм изучали в виде двух препаратов - простанорма жидкого (ПЖ) и лро-стаиорма сухого (ПС) в условиях одних и тех же экспериментальных моделей. Специфической активностью для простанорма как препарата для лечения простатита должна являться его противовоспалительная, капилляропротекторная, анальгетическая, диуретическая, антимикробная и андрогенная активность.

Противовоспалительные свойства. Противовоспалительное действие простанорма изучали при его однократном внутрижелудочном введении в дозах 0,2-0,6 мл/мышь, 0,52 мл/крысу (ПЖ) или 20-100 мг/кг (ПС) на моделях острого воспалительного отека задней конечности у мышей, и на модели перитонита у крыс. Установлено, что простанорм и в жидком и сухом виде проявляет выраженную противовоспалительную активность, что выражалось в достоверном уменьшении на 15-50 %% количества воспалительного экссудата в брюшной полости у крыс и выраженности формалинового и гис-таминового отеков конечностей у мышей по сравнению с контролем (Табл. 19). Зависимость эффекта от дозы более четко проявлялась в случае ПС.

Ангиопротекторные свойства. Капилляропротекторное действие простанорма изучали при его однократном внутрижелудочном введении в дозах 0,2-0,6 мл/мышь (ПЖ) и 20-100 мг/кг (ПС) на модели повышенной сосудистой проницаемости кожи у мышей. Экспериментальные исследования показали, что простанорм обладает выраженным капилляропротекторным действием, достоверно увеличивая время выхода три-пановой сини в очаг воспаления на 32-50%% по сравнению с контролем (Табл. 19).

Таблица 19.

Влияние простанорма на воспалительный отек конечностей у мышей, эксперименталь-

Вариант опыта Формалиновый отек, мг {% к контролю) Гистаминовый отек, мг (% к кон-гролю) Перитояеальный экссудат, мл (% к контролю) Время выхода трипановой сини, :ек (% к контролю)

Контроль 60,6±3,15 37,3±2,96 1,93+0,29 68,3±5,9

ПЖ, 0,2мл/мышь 60,6+2,75 29,6+1,76 (-21) - 91,6+5,4*(+34)

ПЖ, 0,4мл/мышь 49,0+3,97 (-19) 26,8+2,95 (-25) - 90,8±2,4*(+32)

ПЖ, 0,6мл/мышь 46,4+3,95*(-24) 27,3+2,36*(-27) - 100,0±5,0**(+4б)

ПЖ, 0,5мл/крысу - - 1,64+0,29 (-15) -

ПЖ, 1,0мл/крысу - - 1,54+0,19 (-20) -

ПЖ, 2,0мл/крыс} - - 0,97+0,24*(-50) -

Контроль 71,0±4,5 61,0±1,75 1,75+0,16 75,0±2,23

ПС, 20 мг/кг 58,3+3,33 (-18) 51,5±1,8*(-16) 1,33±0,22 (-24) 99,6+1,05**(+33)

ПС, 50 мг/кг 54,2+2,38*(-24) 46,6+2,47* *(-24) - 103,3+2,78**(+38)

ПС, 100 мг/кг 49,1±2,39*(-31) 33,3±2,47**(-45) 1,08+0,19* (-38) 112,1+5,23**(+50)

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Анальгетические свойства. Анальгетический эффект простанорма изучали путем

определения порога болевой чувствительности (ПБЧ) по методике «горячая пластинка»,

на моделях «уксуснокислых корчей» у мышей и «давления на лапу» у крыс. Механи: развития болевого синдрома при термическом воздействии включает в себя эмоци нальную реакцию на боль (в этой модели боли ведущую роль играют центральные м ханизмы); при раздражении брюшной полости кислотой на первый план выступают г моральные механизмы болевой чувствительности, а в случае давления на лапу - раздр жение периферических болевых рецепторов. Показано, что в условиях «горяч! пластинки» однократное внутрижелудочное введение простанорма в дозах 20-50-11 мг/кг (ПС) и 0,2-0,6 мл/мышь (ПЖ) увеличивало ПБЧ на 12-70%% на протяжении во трех часов эксперимента по сравнению с исходным уровнем (Табл. 20). В случае П обезболивающий эффект возрастал с увеличением дозы. ПС в дозах 50 и 100 мг/: достоверно на 18 и 25%% уменьшал количество корчей у мышей, а в дозах 20 и 1( мг/кг также достоверно повышал на 39 и 44%% отношение ПБЧ через 60 минут пос; введения препарата (ПБЧео) к ПБЧ исходному (ПБЧИСХ) по сравнению с контролем (Таб 20). Результаты изучения анальгетических свойств простанорма с использованием тр< экспериментальных моделей свидетельствуют, что заметную активность препар; проявляет как в условиях моделей, сопровождающихся острым воспалительны процессом - модели «горячая пластинка» и уксусно-кислые «корчи» (согласуется результатами изучения его противовоспалительных свойств), так и при воздействии ] периферические болевые рецепторы. Полученные данные свидетельствуют в поль: определенной универсальности анальгетического воздействия простанорма на организ!

Таблица 20.

Влияние простанорма на порог болевой чувствительности (ПБЧ) на моделях «го-

рячая пластинка» и «уксусные корчи» у мышей, «давление на лапу» у крыс

Вариант «Горячая пластинка» «Корчи» «Лапа»

опьгга ПБЧ, %, (исходно -100%) после введения .... Количество ПБЧ6о/ПБЧ„сх

30 мин 60 мин 120 мин 180 мин % %

Контроль 116+7 116+6 117±8 11118 10013 10017

ПС, 20 мг/кг 15816** 161+7** 152±8* 15019* 88+5 13916*

ПС, 50 мг/кг 14617* 150±8* 150±8* 143110 8214* -

ПС, 100 мг/кг 14517* 149+8* 153±7* 149+10* 7515** 14417**

Контроль 94±7 106+8 88±5 9315 - -

ПЖ, 0,2мл/м 11317 121±7 119±6* 12416* - -

ПЖ, 0,6мл/м 153+8** 169±7** 17117** 161+6** - -

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Диуретические свойства. Диуретическое действие простанорма изучали при одн> кратном внутрижелудочном введении крысам в дозах 50 и 100 мг/кг (ПС) и 1 мл/100 массы крысы (ПЖ). Простанорм достоверно усиливал стимулированный водной н грузкой диурез у крыс. В случае ПС эффект возрастал с дозой препарата: суммарный (:

5-ть часов) диурез увеличивался с 43 % (50 мг/кг) до 76 % (100 мг/кг) по сравнению с контролем (Табл. 21).

Таблица 21

Показатель Контроль ПЖ, 1 мл/100г ПС, 50 мг/кг ПС, 100 мг/кг

Диурез, мл/100 г, % от контроля 2,95+0,27 5,4+0,32** +83,1 4,22+0,16* +43,1 5,2±0,17** +76,3

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Гонадотропные и андрогенные свойства. Целью изучения влияния простанорма на

половую гормональную активность крыс было выявить тропность препарата к половым органм. Гонадотропную активность простанорма изучали при его внутрижелудочном введении в течение 10 дней в дозе 100 мг/кг (ПС) и 10 мл/кг (ПЖ) инфантильным крысам-самцам (возраст 21-23 дня). На 11 день животных забивали, извлекали половые железы, мышцу levator arti, гипофиз и определяли их массу. Введение простанорма приводило к достоверному увеличению массы семенных пузырьков на 25 и 28%% и массы вентральной простаты на 30 и 34%% по сравнению с контролем (Табл. 22). Полученные данные свидетельствуют о гонадотропном действии простанорма. Небольшое увеличение мышцы levator ani в экспериментах с ПЖ предполагает наличие у препарата некоторых анаболических свойств.

Андрогеннзто активность простанорма изучали на гонадэктомированных инфантильных крысах-самцах. Препарат вводили внутрижелудочно в дозах 100 мг/кг (ПЖ) и 10 мл/кг (ПС) в течение 7 дней, начиная со следующего дня после гонадэктомии, на фоне введения тестостерона-пропионата. Установлено, что в условиях данной модели после введения простанорма в дозе 100 мг/кг масса семенных пузырьков достоверно увеличилась на 42% (ПС) и 60% (ПЖ) по сравнению с контролем (Табл. 22). Полученные данные свидетельствуют об андрогенной активности препарата.

Таблица 22.

Влияние простанорма на массу половых желез и органов инфантильных

и гонадэктомированных крыс

Вариант опыта Масса органа, прирост в % к контролю

Семенные пузырьки Вентральная простата Семенники Гипофиз Мышца levator ami

Инфантильные крысы

ПЖ, 10 мл/кг +28* +34* +14 +12 +20*

ПС, 100 мг/кг +25* +31* +3 +2 +8

Гонадэктомированные крысы

ПЖ, 10 мл/кг +60** +20 +19*

ПС, 100 мг/кг +42** +11 1 - +7

* или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Антимикробные свойства. Подробно изучены антимикробные свойства простанорма сухого. В результате исследований влияния простанорма на клинические штаммы,

выделенные от больных, в числе которых было 46 штаммов бактерий, обладающих в сокой степенью резистентности к широко применяемым в настоящее время антибиот кам, и 5 штаммов дрожжеподобных грибов рода CANDIDA показано, что грамполож тельные бактерии рода STAPHYLOCOCCUS и STREPTOCOCCUS (ENTEROCOCCL были чувствительны к препарату. При этом его ингибирующий эффект в отношен] антибиотикорезистентных бактерий был не ниже, чем в отношении антибиотикочувс вительных штаммов бактерий. Наиболее высокая активность простанорма проявила« отношении разных видов стафилококка (St.aureus, St.epidermidis, St.saprophyticus) стрептококка (Str. fecalis, род iENTEROCOCCUS), играющих важную роль в этиолоп инфекционно-воспалительных неспецифических заболеваний предстательной железы мочевыводящих путей. При этом установлен весьма важный факт, что простанорм : подавляет рост грамотрицательных бактерий рода ESCHERICHIA, что может иметь п ложительное значение при клиническом применении препарат.

Гастропротективные и гепатопротективные свойства. Известно, что тритерпен вые и флавоноидные гликозиды из корней солодки проявляют противоязвенную акти ность, также как и флавоноиды из травы зверобоя (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 198 Машковский М.Д., 2000). Поэтому изучение гастропротекторных свойств простанор! было проводили достаточно подробно, с использованием моделей экспериментальм язв желудка у крыс различного генеза: острые - этаноловые, индометациновые и В] званные перевязкой привратника (по Шею), хронические - кофеиново-мышьяковисть Критериями оценки гепатопротекторного действия препарата служили изменения а тивности печеночных ферментов монооксигеназной системы цитохрома P4J0 на моде: повреждения печени крыс кофеиново-мышьяковистой смесью.

Внутрижелудочное введение препарата животным в дозах 10 мл/кг (ПЖ) или 11 мг/кг (ПС) до или на фоне действия ульцерогенных) оказывало защитное действие i слизистую желудка крыс (Табл 23). Наиболее отчетливый гастрозащитный эффект пр парата проявлялся на моделях этаноловых язв и язв по Шею. Это выражалось в сниж нии на 70 и 57 %% числа "больных" крыс, уменьшении на 76-97 %% частоты образов ния и площади язвенных дефектов, а также снижении более чем в 10 раз индекса Паул по сравнению с контролем.

При изучении гепатопротективного действия ПЖ установлено, что активное микросомальных ферментов гидроксилирования и деметилирования, рассчитанная ] молярную концентрацию цитохрома Р450, У леченных животных возрастает на 31 и • %%, соотвественно, по сравнению с контролем (Табл. 24). Положительное влияние пр станорма на микросомальную монооксигеназную систему печени крыс свидетельству

о детоксицирующем и защитном (гепатопротекторном) действии препарата на печень.

Полученные результаты согласуются с данными биохимического тестирования in vitro.

Таблица 23.

Влияние простанорма на экспериментальные язвы желудка у крыс__

Вариант опыта Крысы с ввами, % Степень гзъязвления,% Индекс Паулса Герапев эффект Площадь язв, % Индекс Паулса Терапев. эффект

Индометациновые язвы

Контроль 100 100+13 14,5 - 100+17 34,8 -

ПЖ, 1 Омл/кг 100 43+10** 6,2 2,3 12+5* 4,0 8,7

Этаноловые язвы

Контроль 100 100±8 2,9 - 100+4 34,1 -

ПЖ, 1 Омл/кг 28,8 24+14** 0,3 14,5 15±6** 1,4 24,4

Язвы, вызванные перевязкой привратника

Контроль 100 100±27 19,2 - 100+25 14,4 -

ПЖ, 1 Омл/кг 42,8 7+15* 0,6 3,2 3+10* 0,2 72,0

Кофеиново-мышьяковистые язвы

Контроль 100 100+27 7,4 - 100+21 22,7 -

ПЖ, 1 Омл/кг 88,9 55+21 3,6 2,0 56±17 11,4 2,0

ПС, ЮОмг/кг 28,3 58+16 1,1 6,0 6+15* 0,3 76,0

' или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Таблица 24.

Влияние простанорма (10 мл/кг) на микросомальную монооксигеназную систему

Вариант опыта Содержание цитохрома Р450 Скорость реакции

нмоль на мл нмоль на мг белка Гидроксилирования анилина N-деметилирования диметилаланина

нмоль/мин на мг белка нмоль/мин на мг Р450 нмоль/мин на мг белка нмоль/мин на мг Р450

Контроль 16,2510,02 0,6510,02 0,810,02 1,2310,03 1,3910,06 2,1410,08

Опыт 15,3+0,44 0,5+0,01** 0,5910,02** 1,61+0,01** 1,1210,03* 3,06+0,01**

Опыт/контроль, % 94 77 74 131 81 143

или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

Иммуностимулирующие свойства. Одним из компонентов простанорма является экстракт эхинацеи пурпурной, препараты из которой самостоятельно используются в широкой медицинской практике как иммуностимуляторы, в частности препарат «Эсти-фан» (Сакович Г.С., Колхир В.К., 2000). Поэтому представляло интерес провести сравнительное изучение иммунотропных свойств обоих препаратов. На базе НИЦ БМТ ВИ-ЛАР была проведена оценка влияния простанорма на фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) человека, в сравнении с эффектом эстифана, в условиях опытов in vitro по усилению люминол-зависимой хемилюминисценции стимулированной опсонизированным зимозаном. Исследование показало, что предварительное инкубирование ПЯЛ с простанормом или эстифаном (0,3 мг/мл) приводит к усилению ответа на зимозан. Это явление носит название предстимуляции

ответа на зимозан. Это явление носит название предстимуляции или прайминга. Инде предстимуляции, рассчитанный исходя из экспериментальных данных, бьи максимал для простанорма- 166%. По данному показателю простанорм превосходил эстифан. 1 ким образом, полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии просз норма на фагоцитоз, и по этому параметру препарат может быть охарактеризован к иммуностимулятор.

Нейротропные свойства. Присутствие в составе простанорма флавоноидных фра ций из зверобоя (известны его антидепрессантные свойства - Горьков В.А. и др., 2000^ сочетании с тритерпеноидами солодки может способствовать проявлению препарате нейротропной активности. Показано, что простанорм (20 и 100 мг/кг, внутрь) проявл стресс-протективную и антидепрессантную активность, оказывая положительное вли ние на поведение крыс в «Тесте экстраполяционного избавления по Хендерсону» «Тесте поведенческого отчаяния по Порсолту». В условиях модели гипоксической г поксии с гиперкапнией препарат достоверно повышал (до 30%) устойчивость крыс к г поксии, оказьюая антигипоксический эффект.

Таким образом, простанорм обладает комплексом фармакологических свойсз характеризующих его как простатотропное средство, из которых главными являютс противовоспалительные, капилляропротекторные, анальгетические, диуретические, а тимикробные и андрогенные. Наличие такого спектра фармакологической активности препарата позволяло надеяться на его благоприятное лечебное воздействие как при хр ническом неспецифическом абактериальном простатите, так и при простатите, осло: ненном грамположительными антибиотикорезистентными бактериями. Установленнг нейротропные и иммуностимулирующие свойства препарата могут усиливать в целс лечебный эффект при простатите. Выраженные гастропротективные свойства прост норма служат ему дополнительной положительной характеристикой.

Исследование безопасности простанорма. По параметрам острой токсичности пр парат следует отнести к VI классу относительно безвредных препаратов. В хроничесы экспериментах на крысах (10-100-кратное превышение терапевтической дозы) и месячных экспериментах на собаках, получавших ПЖ как лекарственную форму в пят кратной терапевтической дозе , и ПС, в лекарственной форме таблетки по 0,2 г, не выя лено изменений морфологических и биохимических показателей крови, функциональн го состояния сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, печени и почек. Э' подтверждалось и патоморфологическими исследованиями внутренних органов живо ных. Препарат не обладал местнораздражающими, аллергизирующими, иммунотоксич

скими, эмбриотоксическими свойствами, не влиял на репродуктивные функции подопытных животных.

Клинические исследования. На основании результатов доклинического изучения простанорма Фармакологический государственный комитет МЗ РФ разрешил клинические исследования препарата в жидкой лекарственной форме и в виде таблеток по 0,2 г для приема внутрь у больных хроническим неспецифическим простатитом абактериаль-ной и бактериальной природы. Результаты клинических исследований простанорма, проведенные у 278 больных в 4-х специализированных лечебных учреждениях г.Москвы подтвердили безопасность и лечебные свойства препарата, установленные в эксперименте. Эффективность простанорма как в жидкой лекарственной форме (по 0,5 ч.л. 3 раза/день), так и в виде таблеток (по 1-2 таблетки 3 раза/день) при монотерапии хронического неспецифического простатита выявлена у большинства пациентов и составляла 84-95%%, в отличие от контрольной группы больных, получавших традиционную терапию (Табл. 25). На фоне приема препарата у больных улучшалось самочувствие, нормализовалось мочеиспускание, уменьшались и исчезали боль и воспалительные отеки. Простанорм оказывал лечебный эффект как в активной фазе заболевания, так и в состоянии ремисии.

Таблица 25.

Эффективность простанорма (ПЖ) в сравнении с традиционными методами лечения

Учреждение Раза болезни Показатель Простанорм1) Контроль')

НИИ урологии, Активная Суммарный балл 1Р88 Индекс качества жизни Урофлоуграмма Объем простаты -3,8 + 0,04** -0,95 + 0,08 0,92 + 0,12 -5,79 + 0,21* -1,22 + 0,1 -0,86 + 0,09 0,93 + 0,15 -3,32 ± 0,24

Кафедра урологии ММСИ, МГКБ№50 Активная Суммарный балл 1Р5Э Урофлоуграмма -3,73 + 0,38** 2,03 ±0,34** -1,38 + 0,39 0,46 + 0,17

Ремиссия Суммарный балл ГРЭЭ Урофлоуграмма -3,27 + 0,32** 0,27+0,57 -1,38 + 0,39 0,46 ±0,17

Урологическое отд. МГКБ №60 Ремисия Суммарный балл ¡РБЭ Мочеиспускание,мл/сек -10,6+1,15** 1,0 ±0,06** -0,8 ± 0,29 0,18+0,43

Примечание: ) разность показателей до и после лечения * или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01

На основании результатов проведенных исследований препарат «Простанорм» разрешен для применения в жидкой лекарственной форме (Р.у. 99/280/12) и в виде таблеток по 0,2 г для приема внутрь у взрослых (Р.У. № 000842/02-2001) как простатотропное, противовоспалительное и нормализующее диурез средство для лечения и профилактики обострений хронического неспецифического простатита.

Разработка трнтерпенондиого препарата седативного действия -«Патрнмина»

То, что тритерпеиовые гликозиды из патринии средней («валерианы каменной») < словливают различную биологическую активность галеновых форм растения, из кото главная - седативная, известно давно (Иванова В.М., 1963, Матвеева A.B., 1966). Cpai тельные исследования галеновых форм патринии и валерианы свидетельствовали о, крайней мере, двукратном превосходстве первых препаратов над вторыми по выражм сти седативного (транквилизирующего) эффекта (Турова А.Д., 1967; Замотаев И.П., Г Соколов С.Я., 1984). Были изучены гипотензивные свойства препаратов из патриш патринозида D (Соколов С.Я., 1984). Ранее мы также показали, что патринозид D обла, противосвертывающими и антиагрегационными свойствами. При разработке npenaj «патримин» были учтены результаты ранее проведенных исследований. Прежде всего обходимо было доказать специфическую, нейротропную активность препарата, в соч нии с положительными эффектами на функции сердечно-сосудистой и гемокоагулящ ной систем.

Нейротропные свойства. С целью доказательства седативных (транквилизирующих) свойств патримина использовали модели, позволяющие оценить влияние препарата на спонтанную двигательную активность (СДА), координацию движений, эффекты снотворных и судорожных анализаторов у мышей, условно-рефлекторную реакцию избегания (УРАИ) у крыс, на биоэлектрическую активность коры головного мозга кроликов. Препарат изучали при внутрижелудочном и внутривенном пути введения в дозах 20,50 и 100 мг/кг.

Исследования показали, что однократное внутрижелудочное введение препарата зывало снижение (на 22-32%%) СДА животных, угнетение координации движения и, ответственно, уменьшение времени удерживания мышей на вращающемся стержне на 35%% по сравнению с контролем (Табл. 3). Патримин слабо влиял на латентный пер сна, вызванного хлоралгидратом и барбитал-натрием, однако достоверно увеличивал г должительность сна - на 26-27 %% и 51-56%%, соответственно анализатору, по cpai нию с контролем (Табл.4). Препарат проявлял заметную противосудорожную активно! что выражалось в достоверном увеличении латентного периода судорог, вызванных кс золом и стрихнином, и увеличении продолжительности жизни мьвшей в судорогах (на 46%%) по сравнению с контролем (Табл.4). Через 90 минут после однократного внут желудочного введения препарата в условиях модели УРАИ наблюдали увеличение на 19%% латентного периода реакции избегания у мышей по сравнению с исходным ур

нем, что также является подтверждением седативной направленности в действии патри-мина.

Влияние препарата на биоэлектрическую активность мозга кроликов изучали при его однократном внутривенном введении. При этом оценивали поведение животных, а также основную и вызванную ритмическими и одиночными световыми раздражениями электрическую активность коры головного мозга. После введения патримина наблюдали трансформацию ЭЭГ в сторону медленной активности по сравнению с исходным уровнем. При спектральном анализе отмечено увеличение общей спектральной мощности одновременно с возрастанием соотношения его низко-высокочастотных составляющих, преимущественно за счет роста показателей медленной активности. Это свидетельствует о способности препарата увеличивать соотношение тормозно-возбудительных процессов и подтверждает наличие у него седативных свойств.

На основании полученных данных препарат можно охарактеризовать, как седатив-ный, относящийся к веществам синхронизирующего типа, повышающих активность тормозных процессов в коре головного мозга и ослабляющих восходящую активацию из подкорковых областей.

Антигипертензивные свойства. Известно, что седативные средства широко применяются для лечения гипертонической болезни и симптоматических гипертензий. Нами изучены антигипертензивные свойства патримина с использованием трех моделей гипер-тензии у крыс: реноваскулярной, Дока-солевой и неврогенной. Артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокрашений (ЧСС) регистрировали на фоне воспроизведения той или иной модели гипертензии на протяжении 14-ти дней введения препарата в дозах 20-100 мг/кг и через 7 дней после окончания введения. Анализ полученных результатов свидетельствует, что патримин на 7-й и 14-й дни, а также через 7 дней после окончания экспериментов, достоверно снижал исходно повышенное АД на 5,5-20,7%% (Табл.5). Одновременно со снижением АД наблюдалось урежение ЧСС у опытных крыс. Кроме того, на модели Дока-солевой гипертензии наблюдали заметное увеличение диуреза (на 63-65%%, р<0,05) у крыс, леченных патримином, по сравнению с контролем, при этом препарат не задерживал выведение ионов натрия и не вызывал вымывания ионов калия из организма.

Антикоагулянтные свойства. Тритерпеновые гликозиды - один из немногих классов растительных соединений, представители которого обладают заметными антикоагулянт-ными, тромболитическими, фибринолитическими и антиагрегационными свойства (Майн-сков A.B. и др., 1999). Наличие антикоагулянтной активности у седативного средства

весьма привлекательно для его использования у лиц среднего и пожилого возраста с вышенным риском развития тромбоза вен различной этиологии.

Таблица 3.

Влияние патримина на спонтанную двигательную активность

Вариант опыта Спонтанная двигательная активность, через.....мин после введения, у.е. Длительность удерживани на стержне, через....мин пс еле введения, сек

30 60 90 30 60 90

Контроль 8581124 733+129 573+126 8,2106 11,210,9 11,8+1,

Опыт, 20 мг/кг 8141123 5611114 367185 6,910,5 7,310,6* 10,4+0,

Контроль 1341+133 1243+229 669+175 7,610,7 7,010,5 7,0+0,6

Опыт, 50 мг/кг 9871113 7731123 461+105 6,1+0,6 4,9+0,4* 5,010,4

Контроль 1337+78 1068+98 598+101 11,5+0,6 13,910.7 15,1+0,

Опыт, 100 мг/кг 1064+62* 765171* 375164 7,6+0,4* 9,0+0,6* 10,0+0,

* - достоверность отличий от контроля при р<0,05 Таблица 4. Влияние патримина на эффекты снотворных и судорожных анализаторов у мышей

Вариант Параметры сна, мин (% к контролю) Параметры судорог, сек (% к контролю)

опыта Латентный Длительность Латентный Длительность

период сна период судорог

Хюралгидратный сон Коразоловые судороги

Контроль 6,3+0,4 171125 6017,5 496121

Опыт, 20 мг/кг 4,810,3* (-23,8) 217+22 (+26,8) 88+7,0* (+46,7) 628+44* (+26,

Контроль 5,0+0,4 180+11 - -

Опыт, 50 мг/кг 4,6+0,4 (-8,1) 227+14* (+26,1) - -

Контроль 5,6+0,3 17913 6018,6 496121

Опыт, 100 мг/кг 4,9+0,4 (-12,5) 19115 (+6,4) 9519,7* (+58,3) 723141* (+45,

Барбитал натриевый сон Стрихниновые судороги

Контроль 45,614,2 136112 7719,8 504149

Опыт, 20 мг/кг 46,815,2 (+2,6) 21318**(+56,0) 9519,8 (+23,4) 643157 (+27,6

Контроль 45,6+4,2 136+12 - -

Опыт, 50 мг/кг 44,7+4,8 (-2,0) 206+7**(+45,8) - -

Контроль 42,3+4,7 9513 7719,3 455139

Опыт, 100 мг/кг 40,2+5,0 (-5,2) 14519**(+53,1) 5617,0 (-27,3) 532153 (+16,9

• или ** - достоверность отличий от контроля при р<0,05 или р<0,01 Нами подробно изучено влияние патримина на систему гемостаза. Антикоагуляш

активность препарата установлена в экспериментах in vitro и in vivo. Патримин в кон]

трациях 0,01-2,5 мг/мл крови кроликов по большинству изучавшихся показателей вызь

достоверное замедление в 1,2-2,1 раза свертывания крови по сравнению с исход!

уровнем (Табл. 6). При однократном внутривенном введении препарат в дозе 10 м

снижал свертывающий потенциал крови кроликов максимально (на20-80%%) чере;

мин после введения (Табл. 7). При многократном (14-ти дневном) внутрижелудочном

дении патримина в дозе 20 мг/кг кроликам наблюдали снижение свертывающего потенциала животных на протяжении всего эксперимента, наиболее заметное к концу исследования - основные параметры гемокоагуляции изменяются в сторону гипокоагуляции в 1,52,5 раза по сравнению с контролем (Табл. 8).

Таблица 5.

Влияние патримина на течение реноваскулярной, неврогенной и _Дока-солевой гипертензии у крыс_

Вариант опыта Артериальное давление, мм.рт.ст. (% к исходному уровню)

Исходное Через 7 дней лечения Через 14 дней лечения 7 день после лечения

Реноваскулярная гипертензия

Контроль 153+5,0 153±4,8 (0) 150+3,9 (-1,9) 151±4,0(-1,3)

Опыт, 20 мг/кг 150±3,5 135+4,3* (-10) 135±4,0* (-10) 132±3,8* (-12)

Опыт, 100 мг/кг 152+3,8 139+3,0* (-8,6) 129+2,5* (-15,2) 136+3,7* (-10,5)

Неврогенная гипертензия

Контроль 159+4,4 153+4,6 (-3,7) 153+4,6 (-3,7) 155+6,4 (-2,5)

Опыт, 20 мг/кг 166±4,9 145+5,7* (-12,6) 142±4,2* (-14,4) 145+3,7* (-12,6)

Опыт, 50 мг/кг 165±4,4 131+7,8* (-20,6) 136±5,4* (-17,6) 145±2,0* (-12,1)

Дока-солевая гипертензия

Контроль 158+2,4 150+3,2 (-5,1) 160+4,0 (+1,3) 153+4,1 (-3,1)

Опыт, 20 мг/кг 156+2,6 138+3,1* (-11,5) 134+5,3* (-14,1) 136+3,6* (-12,8)

Опыт, 50 мг/кг 159+3,5 134+2,5* (-15,7) 135+5,1* (-15,1) 143+2,8* (-10,1)

Опыт, 100 мг/кг 150+2,7 140+3,5 (-9,3) 141 ±3,7 (-6,0) 135±2,3* (-10,0)

* - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05

Антиагрегационные свойства патримина установлены в экспериментах in vitro в

сравнении с аналогичной активностью ацетилсалициловой кислоты (извествный антиагре-гант). Препарат в концентрациях 0,1-1,0 мг/мл плазмы крови ингибировал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов, что проявлялось в снижении степени агрегации на 27-60%% и сокращении времен агрегации и дезагрегации по сравнению с контролем (Табл. 9). Антиагрегационная активность патримина по характеру влияния на степень агрегации не уступала активности ацетилсалициловой кислоты, а по выраженности воздействия на процесс дезагрегации - существенно превосходила. Также в опытах in vitro с использованием модели лизиса фибрик-агаровой пластинки, активированной стрептокиназой, показана фибринолитическая активность препарата при его концентрациях 1-10 мг/мл крови - площадь лизиса возрастала на 12-31%% (р<0,05) по сравнению с контролем.

Тромболитическая активность патримина установлена с использованием модели экспериментального тромбоза вен у крыс. При внутривенном введении препарата в дозе 10 мг/кг наблюдалось рассасывание или реканализация экспериментальных тромбов у крыс в 73% случаев, в контроле - в 30%. Гистологическое изучение тромбированных участков вен опытных и контрольных животных показало, что под влиянием патримина

уменьшались размеры тромбов, их плотность, содержание в них нитей фибрина, увели валось число свободнолежащих эритроцитов.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что патрш оказывает «мягкое» антикоатулянтное и фибринолитическое действие, сочетающеес выраженной антиагрегационной и тромболитической активностью. Результаты экспе ментов in vitro, подтвержденные опытами in vivo, свидетельствуют о способности пр< рата оказывать прямое (гепариноподобное) влияние на факторы свертывания крови, с жая их активность. Механизм непрямого противосвертывающего эффекта патрим возможно реализуется через его влияние гипоталямус-гипофиз-надпочечниковую сист регуляции процесса гемокоагуляции, В пользу этого свидетельствует ранее установ! ный нами факт подавления в модельных экспериментах гиперкоагуляционной активно гормона коры надпочечников - гидрокортизона, тритерпеновым гликозидом из патри! - патринозидом D (Колхир В.К., 1984). Существенным моментом в характере влия патримина на систему гемостаза является его антиагрегационный эффект, превосходяи активность АС. Известно, что АС блокирует превращение арахидоновой кислоты в тр боксан А2 (индуктор агрегации) в тромбоцитах, но одновременно подавляет вырабо простациклина (ингибитор агрегации) в сосудистой стенке. Поэтому в условиях клин: бывает довольно сложно подобрать оптимальную дозу препарата при использовании ei качестве антиагреганта. Патримин, с учетом его выраженных дезагрегационных свой| имеет явные преимущества перед АС как антиагрегант.

Таблица 6.

Влияние патримина на некоторые параметры гемокоагуляции в условиях in vitro

Концентрация, мг/мл Различия с контролем по параметрам гемокоагуляции

Тр, сек ТПГ, сек Та, сек ТРОМБОЭЛАСТОГРАФИЯ

R, сек К, сек Ма, мм

0,01 +38,1114,1* +154+36** +0,3310,16 +24+55 +16,8112,6 i-1,811,8

0,1 +92,0+21,2* +219146** +0,6310,31 +45118* +33,6110,8* -4,1+1.9

0,5 +46,6±13,7* +107121** +1,05+0,22** +54113** +47,4115,0* •8,212,2*

1,0 +65,3+21,5* +154136** +1,3810.3** +76121** +74,4122,0* ■12,012,7*

2,5 +59,5+24,1 +202135** +1,74+0,27** +116+26** +93,0112,8** •27,5+5,0*

Примечание: Тр - время рекальцификации плазмы, ТПГ - толерантность плазмы к гепа ну, Та - тромбиновое время, Я - время реакции, К - время образования сгустка, Ма - м симальная амплитуда тромбоэластограммы;

• или ** - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05 или р<0,01 Гиполипидемические свойства. Гиполипидемическая активность патримина пок;

зана в экспериментах на нормо- и гиперлипидемических крысах при многократном вв!

дении препарата внутрь в дозах 20-200 мг/кг. 9-тидневное введение патримина норме

липидемическим животным вызывало дозозависимое снижение концентрации холесп

рина (ХС) и триглицеридов (ТГ) на 12-38%% по сравнению с контролем (Табл. 10).

условиях модели углеводной гиперлипидемии препарат также достоверно и дозозави-симо снижал концентрацию ХС (max на 35%) и ТГ (шах на 42%) в сыворотке крови крыс. Таким образом, установлено, что патримин оказывает гиполипидемическое действие с более выраженным гипотриглицеридемическим эффектом.

Таблица 7.

Влияние патримина на некоторые параметры гемокоагуляции при внутривенном введе-__нии кроликам в дозе 10 мг/кг_

Время после введения, мин Различия с исходным уровнем по параметрам гемокоагуляции

Тр, сек ТПГ, сек Та, сек ТРОМБОЭЛАСТОГРАФИЯ

R, сек К, сек Ma, мм

5 +19,0+5,1** +146±17** +0,7410,15** +292196* +150154* •21,015,1**

15 +21,5±6,9** +222130** +0,9510,19** +199168* +121+31** -12,614,5*

30 +23,0±5,1** +214+46** +1,1910,32** +278188* +105+33* ■4,613,6

60 +17,3±6,6* +190150* f+0, 9110,18** +193180 +52127 И ,312,7

120 +39,5±3,8** +72120* +0,5910,38 +137146* +29130 •4,0110,1

240 +30,0±8,9** +195148* +0,2110,13 +218185* +51+8** -6,313,7

Сокращения: см.таблицу

* или ** - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05 или р<0,01

Таблица 8.

Влияние патримина и ацетилсалициловой кислоты (АС) на АДФ-индуцированнуто __агрегацию тромбоцитов кроликов_

Концен- Препарат Различия с контролем по параметрам агрегатограммы

трация Степень Время Угол агре- Угол Время де- Индекс

мг/мл, агрега- агрегации гации, град. дезагре- загрегации, дезагре-

ции, % сек гации, град сек гации

0,1 Патримин ■27112 -45112* +2,812,7 -8,2+2,6* ■121118** +1314*

АС •7111 ■14114 +0,612,6 -1,0+1,7 ■35119 -112

0,5 Патримин ■3919** -72+21* +10,8+1,9** -10,1+2,8** -185+28** +18+3**

АС ■40113* ■37+15 +7,412,3 -3,8+2,9 ■72117** +217

1,0 Патримин ■60112** ■91120** +16,812,8** -12,214,5* 1-280+45** +1912**

АС к>7112** ■59+19* +30,713,7** •4,0+8,9 -150120** ■816

* - или ** - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05 или р<0,01 Общефармакологическое действие. Принимая во внимания потенциально широкий

диапазон фармакологических свойств, присущих классу тритерпеновых гликозидов, проведено также изучение общефармакологических свойств патримина, включающее в себя исследование его противовоспалительных, жаропонижающих, гастропротективных, желчегонных, бронхолитических, противокашлевых, спазмолитических и гипогликеми-ческих свойств. На моделях острого экссудативного воспаления у мышей, вызванного флогогенными агентами - формалином, декстраном и каолином, патримин, в дозах 10100 мг/кг проявлял небольшую противовоспалительную активность, подавляя развитие отеков на 22-33%% по сравнению с контролем. На модели «ватной гранулемы» у мышей патримин в дозе 10 мг/кг на 14,6% (р<0,05) тормозил процесс образования фиброз-но-грануляционной ткани на фоне хронического пролиферативного воспаления.

Таблица 9.

Влияние патримина на некоторые параметры гемокоагуляции при многократном (14_дневном) внутрижелудочном введении кроликам в дозе 20 мг/кг_

Дни Группы Параметры гемокоагуляции

иссле- живот- Тр, ТПГ, Ра, Ф, ТРОМБОЭЛАСТОГРАФИЯ

ювания ных сек сек сек мг% Я, сек К, сек Ма, мм

Цо вве- К 104+11 182+14 17,2+1,3 252±26 309+63 101 ±9 64±4

дения О 108+14 176±13 17,2+1,0 274±26 313±64 89±7 67±3

1 К 97±6 157+11 17,1+0,6 317+89 257±29 72+10 65+3

О 128+8* 212+11* 19,9±0,5* 249±32 314+31 105±9* 55+9

4 К 91+9 151+9 18,1+0,5 326+43 280±49 96+26 72+3

О 108±6 201±13* 19,6±0,7 232±34 410+35* 138+13 54±6

7 К 99±4 135±11 17,1 ±0,4 332±27 316±27 85±15 64+2

О 138+9* 234±21* 19,1+0.3* 312+29 411±38 124+17 63±3

14 К 87±4 143+8 17,6±0,8 286±41 193±14 77±17 70+5

О 125+9 Е22±15* 19,5+0,4 254±24 514±57** 189+28* 60±7

Примечание:К - контроль, О - опыт, Ра - протромбиновый индекс, Ф - концентра фибриногена в крови. Другие сокращения - см.таблицу * или ** - достоверность отличий от исходного уровня при р<0,05 или р<0,01

Таблица 10.

Влияние патримина на концентрацию холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ)

в крови нормолипидемических крыс и крыс с углеводной _гиперлипидемией Г М(М-(6/Уп)г + М+(5/Уп)01_

Вариант опыта Нормолипидемия Гиперлипидемия

X, ммоль/л ТГ, ммоль/л X, ммоль/л ТГ, ммоль/л

Интактные - - 0,99(0,43+1,57)* 0,65(0,46+1,19)

Контроль 1,27(0,99-=-1,59) 0,91(0,8+1,03) 2,32(1,82+2,67) 1,02(0,69+1,59)

Опыт, 20 мг/кг 1,19(0,87+1,41) 0,84(0,71+1,0) 2,09(1,54+2,93) 0,74(0,56+1,14)

Опыт, 100мг/кг 1,12(0,82+1,42) 0,64(0,52+0,81)* 1,67(1,23+2,11)* 0,60(0,45+0,75)

Опыт, 200мг/кг 0,98(0,81+1,14) 0,56(0,5+0,63)* 1,52(1,18+1,86)* 0,59(0,43+0,75)

* - достоверность отличий от контроля при р<0,05

Изучение влияния патримина на процессы репарации слизистой желудка провед с использованием моделей язв желудка у крыс, характеризующихся различным меха* мом повреждающего действия: кофеиново-мышьяковистые, индометациновые, вызва/и перевязкой привратника (преимущественно, нерогенные). В результате проведен! исследований установлено, что только в условиях нейрогенной модели препарат оказы достоверное гастропротективное действие: после однократного внутрижелудочного 1 дения патримина в дозах 10-100 мг/кг на фоне воспроизведенной патологии наблюдал дозозависимое уменьшение числа язвенных дефектов (на 36-87%%) и степени изъяз! ния слизистой желудка (на 57-97%%) по сравнению с контролем. При этом не отмеч существенного влияния препарата на секрецию и рН желудочного сока. Положителы эффект патримина именно на модели язв нейрогенного происхождения согласуется с к ротропными свойствами препарата. Кроме того, в острых опытах на крысах патрш

при интрадуоденальном введении в дозе 50 мг/ кг на 20-25%% увеличивал интенсивность желчеотделения по сравнению с контролем.

С использованием теста толерантности к глюкозе установлено, что патримин при однократном внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг на 18% повышает толерантность интактных кроликов к глюкозе. При многократном применении в той же дозе в условиях модели аллоксанового диабета он достоверно снижает на 23% уровень гипергликемии, увеличивая при этом содержание гликогена в печени на 30%. Таким образом, показано, что патримин положительно влияет на углеводный обмен, что важно при дальнейшем применении препарата по основному показанию у больных, страдающих сахарным диабетом. Другие исследования, проведенные в условиях соответствующих модельных экспериментов, не выявили у патримина анальгетических, жаропонижающих и спазмолитических свойств.

Исследование безопасности патримина. Исследования показали, что патримин по параметрам острой токсичности для мышей и крыс при однократном внутрибрюшинном введении может быть отнесен к малотоксичным веществам (ТО^о для мышей - 298±35 и 338132, для крыс - 308123 и 313121 мг/кг), а при внутрижелудочном введении - к относительно безвредным (Сидоров К.К., 1973). При введении патримина в желудок в максимально возможной дозе летального эффекта получить не удалось. В условиях подострого и хронического экспериментов, когда патримин вводили крысам внутрижелудочно в течение 1 месяца в дозах 50-2000 мг/кг или 6-ти месяцев в дозах 10-500 мг/кг (в 20-100 раз превышение терапевтической дозы), соответственно, не вызывало патологических изменений в организмах животных. При этом во всех опытных группах отмечали достоверное замедление процессов свертывания крови и снижение уровня холестерина, а также некоторое угнетение ЦНС, что согласуется с установленными фармакологическими эффектами препарата. При изучении специфических видов токсичности у животных не было обнаружено аллергических реакций на введение патримина. Он не обладал мутагенным, эм-бриотоксическим и местнораздражающим действием. Препарат несколько угнетал гуморальное звено иммунитета, но не оказывал действия на активность сенсибилизированных Т-лимфоцитов. При 6-ти месячном исследовании на собаках безопасности терапевтической дозы препарата в виде готовой лекарственной формы (таблетки по 0,1 г) не установлено каких-либо нарушений в деятельности органов и систем организма животных, что подтверждалось соответствующими патоморфологическими исследованиями. Лишь дозы в 10 раз превышающие терапевтические вызывали у отдельных животных некоторые изменения показателей функции печени.

Клинические исследования. На основании резул ьтатов доклинического изуч( патримина Фармакологический государственный комитет МЗ РФ разрешил клиниче! исследования препарата как седативного средства, обладающего антигипертензивной полипидемической, антикоагулянтной и антиагрегационной активностью при заболев; ях ЦНС, сопровождающихся повышенной возбудимостью, гипертензией, гиперкоаг цией и гиперлипидемией. Результаты клинических исследований патримина (в виде леток по 0,1 г), проведенные у 198 больных в 4-х специализированных клин: г.Москвы, подтвердили, в основном, данные экспериментальных исследований. У б ных с сосудистой патологией головного мозга (дисциркуляторные энцефалопатии, г мические инсульты и др.), невротическими состояниями, обусловленными, преимуш венно, органическими заболеваниями нервной системы, сердечно-сосудистой патоло1 (гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца и др.) патримин (0,2-0,3 г/су 2-3 недели) оказывал выраженное седативное действие в -80% случаев, значительно : восходя по активности официнальные препараты из валерианы лекарственной. При : отмечали нормализацию повышенного артериального давления, умеренное антико лянтное и антиагрегационное действие, отчетливый дезагрегационный эффект.

Итогом разработки тритерпенсодержащего препарата из корней патринии средю патримина, явился приказ МЗ РФ от 24.02.1994г (регистрационный № 94/34/4), ра шающий промышленный выпуск препарата «Патримин», таблетки по 0,1 г для при внутрь, как седативного средства для профилактики и лечения заболеваний ЦНС (невр и неврозоподобные состояния, сопровождающиеся повышенной возбудимостью и н шением сна, энцефалопатии) и при комплексном лечении гипертонической болезни степени с тромботическими и атеросклеротическими осложнениями.

59

ВЫВОДЫ

1. Предложенный научно-методический подход первичного биохимического скрининга in vitro биологически активных веществ растительного происхождения, основанный на использовании в качестве биотест-систем, ключевых ферментов, соответствующий определенным видам фармакологической активности, позволяет осуществлять в короткие сроки и с высокой степенью достоверности первичный поиск биологически активных фитообьектов и разработку новых оригинальных фитопрепаратов.

2. Выявлены БАВ растительного происхождения, обладающие адаптогенными, анти-оксидантными, антимикробными, антитоксическими свойствами, перспективные для разработки фитопрепаратов, относящихся к классу практически не токсичных веществ, и не обладающих местнораздражающими, аллергизирующими, иммуно-токсическими, эмбриотоксическими, мутагенными свойствами.

3. С помощью биотест-систем установлены доминирующие направления фармакологического действия некоторых веществ, ставших основой тритерпен- и флавоноид-содержащих фитопрепаратов «Диквертина», «Сибектана», «Простанорма» и «Патримина».

4. Разработан оригинальный фитопрепарат «Диквертин» (дигидрокверцетин), оказывающий антиоксидантное, ангиопротекторное, противовоспалительное, гепатопро-тективное, гиполипидемическое и диуретическое действие. Установлена фармако-терапевтическая доза - 0,02 г в лекарственной форме таблетки для приема внутрь, с целью медицинского применения препарата в качестве антиоксидантного и ка-пилляропротекторного средства при ишемической болезни сердца и наджелудоч-ковых нарушениях ритма сердца в составе комплексной терапии, а также при бронхо-легочных заболеваниях,

5. Разработан оригинальный фитопрепарат «Сибектан», обладающий гепатопротек-торными, желчегонными, антиоксидантными и усиливающими процессы регенерации свойствами. Установлена фармакотерапевтическая доза - 0,1 г в лекарственной форме таблетки для приема внутрь, с целью медицинского применения препарата в качестве гепатопротекторного и желчегонного лекарственного средства при хроническом персистирующем гепатите, хроническом холецистите и гипомоторной дискинезии желчного пузыря, а также в комплексной терапии цирроза и жировой дистрофии печени алкогольного генеза.

6. Разработан оригинальный фитопрепарат «Простанорм», обладающий комплексом фармакологических свойств, характеризующих его как простатотропное средство,

из которых главными являются противовоспалительные, капилляропротектор! анальгетические, диуретические, антимикробные и андрогенные свойства. У новлена фармакотерапевтическая доза - 0,5 мл и 0,1 г в лекарственных формах твор и таблетки для приема внутрь, с целью медицинского применения препа; в качестве противовоспалительного и нормализующего диурез средства для л ния и профилактики обострений хронического неспецифического простатита.

7. Разработан оригинальный фитопрепарат «Патримин», оказывающий седатив антигипертензивное, антикоагулянтное, антиагрегационное и гипотриглицер: мическое действие. Установлена фармакотерапевтическая доза - 0,1 г в лека венной форме таблетки для приема внутрь, с целью медицинского применс препарата в качестве седативного средства для профилактики и лечения забол ний ЦНС (неврозы и неврозоподобные состояния, сопровождающиеся повышен возбудимостью и нарушением сна, энцефалопатии) и при комплексном лече гипертонической болезни 1-Й степени с тромботическими и атеросклеротическ осложнениями.

8. По результатам проведенных научных исследований, доклинического и клин: ского изучения разработаны фитопрепараты «Диквертин», «Сибектан», «Про норм», «Патримин», нормативно-техническая документация и получены при» Министерства здравоохранения России, разрешающие медицинское применен! промышленный выпуск препаратов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Фармакологическая и клиническая характеристика новых лечебных препарато из растений. // Тез. докл. конф. «Исследования по изысканию лекарственны средств природного происхождения» - Ленинград, 1981. (В соавт. С.Я.Соколовым, Л. Ф. Беловой и др.).

2. Влияние некоторых препаратов, содержащих тритерпеновые гликозиды, н свертывание крови. // Хим.-фарм. ж. 1982.-К 5,- С.532-537. (В соавт. С.Я.Соколовым).

3. Антикоагулянтные свойства тритерпеновых гликозидов из качима двуцветног и каштана конского. // Тез. докл. X конф. молодых ученых, М., 1982 с. 48 (В сс авт. с С.Я.Соколовым).

4. Исследование влияния некоторых тритерпеновых гликозидов на свертывающу1 систему крови. //Тез. докл. V Всес. съезда фармакол., Ереван, 1982,- С. 148.

5. К общей фармакологии тритерпеновых гликозидов из растений. // Тез.докл. Нац. конф. по лек. растениям, София, 1982,- С.79. (В соавт. с С.Я.Соколовым, А.И.Багинской).

6. Влияние некоторых тритерпеновых гликозидов на систему свертывания крови. // Сб.трудов ВИЛР «Состояние и персп. иссл. биол. акт. веществ из растений и создание на их основе новых лек. препаратов».-Москва,- 1983.-С.124-129. (В соавт. с С.Я.Соколовым, Г. С. Сакович).

7. Исследование влияния некоторых тритерпеновых гликозидов на свертывающую систему крови. // Автореф.канд.дис., М., 1983.

8. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов из качима двуцветного и каштана конского на систему свертывания крови. //Труды VI Конф. молодых ученых ВИЛР, М.1983,- С.68-74, библиогр. 11 назв. / Деп.в ВИНИТИ 1985, N381-85 ДЕП. (В соавт. с С.Я.Соколовым).

9. К фармакологии моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты из солодки гладкой. // Тез.докл.на Всесоюз.науч.конф. «Результаты и перспективы науч. иссл. в области создания лек. средств из раст. сырья», Москва, 1985 - С. 125-126. (В соавт. с С.Я.Соколовым, Л. Ф. Беловой и др.).

10. Методические подходы к поиску противосклеротической активности веществ растительного происхождения. // Труды VII Конф. молод, уч., 1985. /Деп.в ВИНИТИ ДЕП N 3339-1386, 1986. (В соавт. С Е.Г.Гаврищук, Г.С.Сакович, С.Я.Соколовым).

И. Изучение желчегонных и гепатопротекторных свойств датискана и карсила. // Тез.док. V Всес. симп. по фенольным соед., секция медицинских и прикладных проблем, Таллин, 1987,- С. 34-35. (В соавт. с Т.И.Городнюк, С.Я.Соколовым).

12. "Бромистоводородная соль элимоклавина, обладающая нейролепьтическими свойствами, антисеротониновой активностью, влиянием на сердечнососудистую систему и систему свертывания крови". // Авторское свидетельство №1274267, 1987 (В соавт. с С.Я.Соколовым и др.).

13. Способ получения средства, обладающего антикоагуляционной активностью. // Авторское свидетельство №4397349 от 23.03.88 (В соавт. с С.Я.Соколовым, А.А.Савиной и др.)

14. Средство для лечения хронического алкоголизма «Сафинор».// Авторское свидетельство №4097464 от 22.09.88г. (В соавт. с С.Я.Соколовым, Л.Ф.Беловой и др.).

15. Сравнительное фармакологическое изучение новых фитопрепаратов танацехола и датискана. // Тез.док. VI Всес. Съезда фармакологов «Фармакология и научно-

технический прогресс», Ташкент, 1988.- С.30-31. (В соавт. с А. И. Багинской, " И. Городнюк и др.).

16. Фармакологические свойства нового противовирусного препарата алпизарина. Фармакол. и токсикол., М., «Медицина», N4, 1988.- С. 93-96. (В соавт. с С. i Соколовым, Л.Ф. Беловой и др.).

17. Comparative study of the effects of triterpenoids from Patrinia intermedia, Gipsophi' bycolor and Aesculus hippocastanum on blood coagulation, fibrinolytic activity in ral bits and experimental venous trombosis in rats. // Medicines of Plant Origin in Model Therapy, Intern. Symp., Praha, 1989. p.66 (В соавт. с С.Я.Соколовы» Г.С.Сакович).

18. The new activity of monoammonium salt of glycyrrhetic acid (glycyram) from th roots of Glycyrrhisa glabra // Medicines of Plant Origin in Modern Therapy, Inten Symp., Praha, 1989, p.67 (В соавт. с С.Я.Соколовым, П.П.Омельницких Л.Ф.Беловой).

19. Экспериментальная фармакокинетика алпизарина. // Фармация, 1992, №6.- С.5" 59. (В соавт. с С.В.Геодакян, И.В.Воскобойниковой и др.).

20. Фармакокинетика ликвиритина в эксперименте. // Фармация,1992,№2, С.51-5 (В соавт с И.В.Воскобойниковой, Ю.А.Колесник и др.).

21. Анализ мангиферина в плазме крови и моче крыс методом ВЭЖХ. // Фармг ция,1993,№1.- С.70-72 (В соавт. с С.В.Геодакян, И.В.Воскобойниковой и др.).

22. Experimental pharmacokinetics of biologically active plant phenolitic compaundsl Pharmacokinetics of Mangifirin in the rats. // Phytotherapy Research, 1992, vol.6. p.332-334. (В соавт. с С.В.Геодакян, И.В.Воскобойниковой и др.).

23. Композиция, обладающая нейрогормональной активностью. // Патент № 80100( от 09.10.1992. (В соавт. с С.Я.Соколовым, П.П.Омельницким и др.).

24. Экспериментальное обоснование возможности применения растительны тритерпеновых гликозидов для коррекции нарушений в системе гемостаза. , Тез. докл. I Рос. Нац. Конгр. «Человек и лекарство», М, 1992.- С.205. (В соавт. С.Я.Соколовым, Г.С.Сакович).

25. Experimental pharmacokinetics of biologically active plant phenolitic compaund:

II.Pharmacokinetics of Likviritin in the rats. // Phytotherapy Research, 1993, vol.7 p.84-86. (В соавт с И.В.Воскобойниковой, Н.А.Тюкавкиной и др.)

26. Experimental pharmacokinetics of biologically active plant phenolic compaund:

III.Pharmacokinetics of Dihydroquercetin in the rats. // Phytotherapy Rí

8еагсЬ,1993,уо1.7. , р.208-210.(В соавт с И.В.Воскобойниковой, Н.А.Тюкавкиной и др.).

27. Биологическое действие кондитерских изделий с добавкой дигидрокверцетина. // Матер. Ш Межд. симпоз. «Экология человека: пробл. и состояние леч.-проф. питания», Москва, 1994, - С.197-199. (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной, И.А.Руленко и др.).

28. Силимар - новый отечественный препарат гепатопротекторнго действия. // Тез. докл. науч.конф. поев. 50-ию НИИ фармации. «Решение актуал. задач фармации на совр.этапе.», Москва, 1994.- С.276-277. (В соавт. с А.И.Багинской и др.).

29. Дигидрокверцетин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство. // Матер. 1-го Межд. науч. конгресса «Трад. мед. и питание», Москва, 1994.-С.164. (В соавт. с А.И.Багинской, С.Я.Соколовым и др.).

30. Антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и антигис-таминное средство. // Патент №2014841 Бюл.№12, 30.06.94. (В соавт. с С.Я.Соколовьм, Н.А.Тюкавкиной и др.).

31. Стандартизация нового фитопрепарата «Диквертин». // НИИ фармации, на-уч.труды,т.ХХХ1У, Соврем, аспекты изучения лекарственных растений, 1995,-С.77-81. (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной, А.П.Арзамасцевым и др.).

32. Растительные антикоагулянты. // Там же., С.236. (В соавт. с Г.С.Сакович, В.А.Зюзиным).

33. Основные разработки лекарственных растительных препаратов, их клиническая эффективность и место в современной медицине. // Там же, С.233. (В соавт. с В.И.Глызиным, С.А.Вичкановой, Т.А. Сокольской).

34. Разработка лекарственных препаратов на основе комплексного использования плодов расторопши пятнистой. // Там же, с.229.(В соавт. с А.И.Багинской, В.И Глызиным и др.).

35. Программа скрининга биологически активных веществ растительного происхождения. //Там же, с.281. (В соавт. с М.Ф.Минеевой, В.А.Быковым).

36. Дигидрокверцетин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство. // Хим.-фарм.ж., 1995, №9.- С.61-64. (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной, А.И.Багинской и др.).

37. Фенилпропаноиды - перспективные биологически активные вещества лекарственных растений // Хим.-фарм.ж., 1995, №4.-С.47-50.

38. Фармакологические свойства нового комплексного растительного препара' беллацехол. // Тез. Докл. III Рос. Нац. Конгр. «Человек и лекарство», М, 199( С.8. (В соавт. с А.И.Багинской, М.Ф.Минеевой).

39. Новые флавоноидсодержащие препараты, эффективные при заболеванш гепатобилиарной системы. // Тез.докл.2-го Науч. конгр. «Традиц. медицина теор. и прак. аспекты», Чебоксары, 1996.- С.69. (В соавт. с С.А.Вичканово

A.И.Багинской и др.).

40. Antioxidant Activity of a Dihydroquercetin, Isolated from Larix gmelinii(Rupr). Phytotherapy research, 1996, vol.10., P.478-482. (В соавт. Н.А.Тюкавкино

B.А.Быковым, А.И.Багинской и др.).

41. Антиоксидантные ферменты - возможные мишени антимикробных противовирусных средств. // Тез. докл. IV Рос. Нац. Конгресса, «Человек и лек. 1997. - С.43. (В соавт. с В.А.Дубинской, М.Ф.Минеевой и др.).

42. Антиоксидантное и капилляропротекторное средство диквертин для леченг бронхолегочной паталогии и ишемической болезни сердца. // Там же, с.63. ( соавт. с С.А.Вичкановой, Н.А.Тюкавкиной и др.).

43. Фармакологические свойства антитромботического сбора «Касмин». // Там ж с.165. (В соавт. с А.Ф.Майнсковым, Т.Е. Лесковой и др.).

44. Разработка перспективного направления по созданию парафармацевтическо продукции с дигидрокверцетином. // Труды 1-й Межд. Конф. «Науч. и практ. а< пекты соверш. качества прод. детск. и геродиет. питания», Москва, 1997

C.207-213. (В соавт. с И.А.Радаевой, С.П. Шулькине и др.).

45. Новое антиоксидантное средство «Диквертин». // Практическая фитотерапи 1997, №1,- С.12-17 ( В соавт. с Н.А.Тюкавкиной, В.А.Быковым).

46. Новое антиоксидантное средство «Диквертин»: Клинические исследования. Межд. симпозиум «Биоантиоксидант», Тюмень, 1997.- С.91-93. (В соавт. Н.А.Тюкавкиной, В.А.Быковым и др.).

47. Антирадикальная активность флавоноидов и других природных соединений i модельных системах разной сложности. // Там же, с.231-233. (В соавт. Н.В.Кондаковой, В.В.Сахаровой и др.).

48. Антирадикальные свойства фитосоединений семейства флавоноидов и трите] пеноидов. // Сборник «Биомедицинские технологии», Москва, 1997,вып.7, с. 6< 71. (В соавт. с Н.В.Кондаковой, В.В.Сахаровой и др.).

49. Средство для комплексной терапии заболеваний «Диквертин», получени стандартизация, фармакологические свойства и клинические исследования. //1 -

Межд. Съезд «Акт. проблемы созд. новых лек. препаратов природ, происх.», Выборг, 1997, С.67-71 (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной,И.А.Руленко и др.).

50. Лечебно-профилактическое средство «Простанорм» для лечения простатитов, 5ретритов и др. воспалительных заболеваний мочеполовой сферы. // Патент №2098119 Бюлл. №34 от 10.12.97. (В соавт с В.А Стихиным, Т.Е. Трумпе и др.).

51. Средство для комплексной терапии заболеваний "Диквертин" и способ его получения". // Патент №2088256 от 27.08.97.- Бюл.Х°24. (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной и др.).

52. "Способ комплексной терапии заболеваний". // Патент №2090205 от 20.09.97. -Бюлл. №26. (В соавт. с В.А.Быковым, Н.А.Тюкавкиной).

53. Способ комплексной переработки плодов расторопши. // Патент №2032414 Бюлл. №35,20.12.97. (В соавт. с В.А.Быковым, В.И.Глызиным и др.).

54. Противолучевые свойства БАВ растительного происхождения, изученные на модельных системах. // Материалы конф. «Проблемы противолучевой защиты», 1998.- с.50-51. (В соавт. с Н.В.Кондаковой, В.В.Сахаровой и др.).

55. Радиопротекторная активность дигидрокверцетина в экспериментах in vitro и in vivo. // Сб. «Биомедицинские технологии», 1998, в.№10, С.66-70 (В соавт. с Н.В.Кондаковой, В.В.Сахаровой и др.).

56. Константы скоростей реакции флавоноидов и родственных соединений природного происхождения с радикалами ОН при радиолизе в водном растворе. // Химия Высоких Энергий, 1998, т.32, №2.- С106-111. (В соавт. с Н.В.Кондаковой, В.В.Сахаровой и др.).

57. Food supplement diquertinrinvestigation of bioavailability. // XlXth International Conference on Polyphnols, Lille (France)l-4 September 1998, p. 65-66. (В соавт. с Н.А.Тюкавкиной, И.А.Селивановой, Ю.А.Колесник).

58. Use of a New Antioxidant Diquertin as an Adjuvant in the Therapy of Patients with Acute Pneumonia // Fitoterapia Research, 1998, v.12 p.606-608. (В соавт. с В.А. Быковым, Ю.О. Теселкиным и др.).

59. Antioxidant activity of diquertin as basis of its pharmacological effects. // XlXth International Conference on Polyphenols, Lille(France)l-4 September 1998, p. 23-34. (В соавт. с Ю.О. Теселкиным, И.В. Бабенковой и др.).

60. Influence of Dihydroquercetin on the Lipid Peroxidation of Mice During Postradiation Period. // Fitoterapia Research, 1998, v.12, p. 517-519. (В соавт. с Ю.О. Теселкиным, И.В. Бабенковой и др.).

61. Простанорм - новый комплексный растительный препарат для лечения прост титов. //2-й межд. Съезд «Акт. проблемы созд. новых лек. препаратов прирс происх.».- С-Петербург, Валаам. -1998.- с.57-59. (В соавт. с Т.А.Сокольской, Т. Трумпе и др.).

62. Фармакологическое изучение нового антитромботического сбора «Касмин». Там же, с.55-56. (В соавт. с А.В. Майнсковым, Г.С. Сакович и др.).

63. Гепатопротекторное действие диквертина при экспериментаьном отравлен! СС14. // Тез. докл. V Рос. Нац. Конгресса, «Человек и лек.».-М., 1998.- С.413.1 соавт. с О.Ю.,Теселкиным, И.В. Бабенковой и др.).

64. Новый отечественный препарат «Диквертин»: изучение биодоступности. // Т* же, С.405. (В соавт. с И.А.Селивановой, Н.А.Тюкавкиной, Ю.А.Колесник ).

65. Простанорм - новое средство для лечения простатитов. // Там же, С.374. (В с авт. с Т.Е.Трумпе, Н.Г. Глазовой и др.).

66. Изучение гемолитической активности сбора «Касмин» и его компонентов. // Г меопатия и фитотерапия, С-Петербург, 1998, №2, С. 15-20. (В соавт. А.В.Майнсковым, ТЛКиселевой, Т.Е.Лесковой).

67. Изучение возможности использования семян каштана конского обыкновенного качестве компонента сбора «Касмин». // Гомеопатия и фитотерапия,- I Петербург, 1998, №2, С. 33-37. (В соавт. с А.В.Майнсковым, ТЛ.Киселевой др.).

68. Сбор «Касмин» для профилактики и лечения тромбозов. // Патент №21040: Бюлл. №4, 10.02.98. (В соавт. с В.А.Быковым, Г.И.Юшмахиным и др.).

69. Некоторые фармакологические свойства нового фитопрепарата, рекомендова ного для лечения хронического простатита. // VI Росс. нац. конгресс «Человек лекарство», М., 1999.- С.39. (В соавт. с А.И.Багинской, М.Ф.Минеевой).

70. Фармакологическое изучение линимента, содержащего экстракты лекарстве ных растений. // Там же, С.466 (В соавт. с Г.С.,Сакович, Т.Е. Лесковой и др.).

71. Использование нового антиоксидантного средства диквертина при лечеш больных острой пневмонией. // Вопросы биолог, медиц. и фармацевт, хими 1999, №1, С.36-40. (В соавт. с Ю.О.Теселкиным, И.В.Бабенковой и др.).

72. Антиоксидантное действие дигидрокверцитина при общем 7-облучении. // В просы биолог, медиц. и фармацевт, химии, 1999, №2, С.45-48. ( В соавт. с Ю. ( Теселкиным, И. В. Бабенковой и др.).

73. Антиоксидантное действие дигидрокверцитина при тетрахлорметановом гепатите у крыс. // Вопросы биолог, медиц. и фармацевт, химии, 1999, №3, С.44-47. ( В соавт. с Ю. О. Теселкиным, И. В. Бабенковой и др.).

74. Лекарственные средства растительного происхождения в терапии хронической венозной недостаточности. // Серия «Гомеопатия и фитотерапия практ.врачу и провизору», Москва, 1999, 37 С. (В соавт. с А.В.Майнсковым, Т.Л.Киселевой и др.).

75. Монооксигеназная система цитохрома Р450, как тест-система для скрининга биологически активных веществ in vitro. // Сб. «Биомедицинские технологии», М.-1999, .№11 .-С.50-55 (В соавт. с В.А.Быковым, М.Ф.Минеевой и др.).

76. Тестирование БАВ, обладающих антирадикальной активностью, на модельных биотест-системах. // Сб. «Биомедицинские технологии», М.- 1999, .№11, с.66-72. (В соавт. с В.А.Быковым, Н.В.Кондаковой и др.).

77. Сбор лекарственных растений, обладающий седативным действием.// Патент № 99120997,от 20.12.1999. (В соавт. с В.И.Глызиным, Н.В.Косенко и др.).

78. Сбор лекарственных растений, обладающий гиполипидемическим действием.// Патент № 99120998, от 17.12.1999. (В соавт. с В.И.Глызиным, Н.В.Косенко и др.).

79. Ранозаживляющее средство.// Патент №2143260, от 27.12.1999 (В соавт. с В.А.Быковым, С.А.Вичкановой и др.).

80. Иммуностимулирующее средство эстифан и способ его получения.// Патент № 2137490 Бюлл. №26,20.09.99. (В соавт с Г.С.Сакович. В.А.Стихиным и др.).

81. Сибектан - новый оригинальный отечественный фитопрепарат для лечения заболеваний гепатобилиарной системы.// Гастробюллетель, Санкт-Петербург, 2000, №1-2, С. 43. (В соавт. с Т.Е.Трумпе).

82. Биологически активная добавка Виларин - новая оригинальная разработка ВИЛАРа.// Труды ВИЛАР «Химия, техн., мед.», Москва, 2000, с. 219-227. (В соавт. С Т.А.Сокольской, С.А.Вичкановой и др.).

83. Некоторые аспекты доклинического изучения лекарственных средств природного происхождения. // Там же, С. 186-191. (В соавт. с С.А.Вичкановой, Н.М.Крутиковой и др.).

84. Эффективность разработки лекарственных средств из растительного сырья. // Там же, С.177-185. (В соавт. с В.А.Быковым, С.А.Вичкановой и др.).

85. Новая схема скрининга биологически активных веществ с использованием би химических ферментативных тестов in vitro. // Там же, С.5-9. (В соавт. В.А.Быковым, М.Ф.Минеевой).

86. Стресс-протективные мнемотропные пептиды из растений // Там же, С.192-1! (В соавт. С В.А.Быковым, М.Ф.Минеевой, Е.П.Наймытенко)

87. Фармакологические свойства касмина - нового отечественного антитромботич ского сбора. // Там же, С.273-281. (В соавт. с A.B. Майнсковым, Г.С. Сакович др.).

88. Лекарственные средства на основе расторопши пятнистой. // Там же, С.282-29 (В соавт. с А.И.Багинской, А.А.Шкаренковым и др.).

89. Изучение влияния танацехола на некоторые параметры функционального с стояния гепатобилиарной системы крыс. // Там же, с.310-315. (В соавт.

A.И.Багинской, Т.И. Городнюк).

90. Флакозид - эффективное растительное средство для лечения гепатитов вируснс и невирусной этиологии, а также вирусных поражений кожи. // Там же, С.31 323. (В соавт. с С.А.Вичкановой, А.И.Багинской и др.).

91. Разработка эстифана, препарата иммуностимулирующего действия из эхинащ пурпурной. // Там же, С. 358-368. (В соавт. с Г.С.Сакович, Е.Ю.Енютиной и др.'

92. Методические указания по доклиническому изучению новых препарато разрабатываемых из природного сырья. // Руководство по экспер. (докл.) изу новых фармаколог, в-в. Москва, 2000,- С. 346-348. (В соавт. с В.Г.Куке

B.М.Булаевым и др.).

93. Современные аспекты доклинического изучения лекарственных средств npi родного происхождения. // 4-й межд. Съезд «Акт. проблемы созд. новых ле препаратов природ, происх.». Великий Новгород, 2000.- С.30-35. (В соавт.

C.А.Вичкановой, Н.М.Крутиковой и др.).

94. Простанорм - новое натуральное лекарственное средство для лечения простат] та. // Научно-практ. Конф. «Биологически-актив. добавки к питанию и лек. пр параты на натуральной основе в проф. лечении и реабилитации».- Москв 2000.- С.44-46. (В соавт. с С.А.Вичкановой, Н.М.Крутиковой и др.).

95. Простанорм в терапии хронического простатита. // Андрология и генитальн; хирургия. 2000, №2, С.34-35. (В соавт. с А.С.Сегал, Г.Г.Ахтаевым).

96. Dihydroquercetin as a Means of Antioxidative Defence in Rats with Tetrachlor methane Hepatitis. // Phytotherapy Research, 2000, p. 14. (В соавт. Ю.О.Теселкиным, И. В. Бабенковой и др.).

97. Клиническое изучение простанорма - нового лекарственного средства для лечения простатита. // Тез. Докл. VII Рос. Нац. Конгр."Человек и лекарство", М.,

2000, с.279-280. (В соавт. с С.А.Вичкановой, Н.М.Крутиковой и др.).

98. Молекулярные биотест-системы для скрининга, контроля качества и оценки безопасности фармацевтических препаратов. // VIII Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство», М., 200I.-C.591. (В соавт. с М.Ф.Минеевой, В.А.Быковым).

99. Экспериментальное изучение простанорма сухого. // Тез. Докл. VIII Рос. Нац. Конгр. "Человек и лекарство", М., 2001.- С.578. (В соавт. с И.В.Воскобойниковой, Т.Е.Трумпе и др.).

100. Глутатионредуктаза - мишень действия адаптогенов. // Мат. X Межд. Симп. «Эколого-физиол. пробл. адаптации», Москва, 2001.- С.97-98. (В соавт. с

B.А.Быковым, М.Ф.Минеевой и др.).

101. Методологические подходы к доклиническому изучению и стандартизации растительных препаратов тонизирующего действия. // 5-й межд. Съезд «Актуальные проблемы созд. новых лек. препаратов природ, происхождения». -Петергоф,

2001.- С. 12-17. (В соавт. с В.М.Булаевым, Е.Е. Лесиовской и др.).

102. Создание отечественных лекарственных средств растительного происхождения. // Ведомости НЦЭГКЛС МЗ РФ, 2001, №1, С.54-57. (В соавт. с В.А.Быковым,

C.А.Вичкановой, Т.А.Сокольской).

103. Подходы к тестированию биологически активных веществ на антирадикальную активность с использованием комплекса биотест-систем in vitro. // Там же, с.82-89. (В соавт. с В.А.Быковым, Н.В.Кондаковой и др.).

104. Генофонд растений ВИЛАР - основа создания эффективных лекарственных средств. // Сб. науч. Трудов ВИЛАР «Ген. Ресурсы лекарств, и аромат, растений», 2001,- С.358 (В соавт. с С.А.Вичкановой, Т.А.Сокольской).

105. Разработки ВИЛАР по созданию современных отечественных лекарственных препаратов на основе эхинацеи пурпурной и сырьевой базы для их производства. // Ведомости НЦЭГКЛС МЗ РФ, 2001, №2.- С.54-57. (В соавт. с Г.С.Сакович).

106. Экспериментальное изучение новых отечественных лекарственных средств на основе расторопши пятнистой. // Ведомости НЦЭГКЛС МЗ РФ, 2001, №3, С.39-43. (В соавт. с А.И.Багинской, А.А.Шкаренковым и др.).

107. Клиническое изучение простанорма при хроническом неспецифическом простатите. //1-я Межд. Конф. «Клинические исслед. лек. средств»,- Москва, 2001.- С.140. (В соавт. с С.А.Вичкановой, Н.М.Крутиковой и др.).

108. Простанорм - новое эффективное лекарственное средство для лечения и проф лактики простатита. // Мат. Межд. Конгр. «Здравница-2001» «Акт.проблек восстан. медицины, курорт, и физиотерапии».- Москва, 2001,- С.91-92. (В coai с Т.Е.Трумпе, И.В.Воскобойниковой).

109. Опыт применения препарата "Простанорм" при реабилитации раненных и л страдавших с сопутствующим простатитом. // В сб. «Ранения и закрытые повр ждения органов мочеполовой системы».- Москва, 2001,- С.ЗО. (В соавт. с Л. Шаплыгиным, Н.Ф. Сергиенко и др.).

110. Фармакологическая активность и применение в медицинской практике настое экстрактов и эликсиров. // В книге «Настойки, экстракты, эликсиры и их ста дартизация»,- С/Петербург, 2001. - С.10-46. (В соавт. с А.Е.Александрово

A.П.Арзамасцевым, Е.Е.Лесиовской и др.).

111. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in \ tro. // Заявка №2001115330/14. Положительное рещение от 06.06.01. (В соавт.

B.А.Быковым, В.А.Дубинской и др.).

112. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro. Заявка №2001115328/14. Положительное рещение от 06.06.01. (В соавт. В.А.Быковым, М.Ф.Минеевой и др.).

113. Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовиру ными свойствами, in vitro. // Заявка №2001115329/14. Положительное рещеш от 06.06.01. (В соавт. с В.А.Быковым, М.Ф.Минеевой и др.).

114. Тест-система для определения кинетических параметров ферментативных pea ций.// Заявка №2001128967/20. Положительное рещение от 30.10.01. (В соавт. В.А.Быковым, Ю.И.Денисов-Никольским и др.).

- Автор выражает благодарность за содействие в проведении данной работы сотрудникам отдела медицины и Центра биомедицинских технологий ВИЛАР, учреждени-ий, проводивших клинические исследования препаратов (кафедра нервных болезней и нейрохирургии №1, клиника нервных болезней ММА им. И.М.Сеченова, НИИ неврологии АМН РФ, Центральная поликлиника МЗ РФ, НИИ традиционных методов лечения, кафедра военно-полевой (военно-морской) терапии военно-медицинского факультета при РМА последипломного образования, кафедра пропедевтики внутренних болезней, госпитальная терапевтическая клиника ММА им. И.М.Сеченова, НИИ урологии МЗ РФ, урологическое отделение МГКБ №47, урологическое отделение МГКБ №60, кафедра урологии и оперативной нефрологии РГМУ им. Н.И.Пирогова).

Печатио-множительиос чптпвоаствп миг

Новая Басманная VI.. л.6 Зак. /25 тир. /У/7 экз. 2002 г.