Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Экспериментально-теоретическое обоснование подходов к стандартизации сырья и препаратов фармакопейных растений, содержащих флавоноиды

На правах рукописи

Куркина Анна Владимировна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПОДХОДОВ К СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ ФАРМАКОПЕЙНЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФЛАВОНОИДЫ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

10 ОКТ 2013

ои

Самара-2013

005534319

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждени; высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, доцент Авдеева Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

Киселёва Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» РАМН, лаборатория гигиенических исследований пищевых добавок, ведущий научный сотрудник

Онучак Людмила Артемовна - доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», кафедра физической химии и хроматографии, заведующая кафедрой

Пупыкина Кира Александровна - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «06» декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан «с^ » _2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В соответствии со Стратегией развития фармацевтической отрасли Российской Федерации до 2020 г., а также со Стратегией развития медицинской науки Российской Федерации на период до 2025 г. одним из главных приоритетов государственной политики является разработка новых конкурентоспособных импортозамещающих лекарственных препаратов, в том числе растительного происхождения.

Одним из перспективных источников фитопрепаратов считаются лекарственные растения (JIP), содержащие флавоноиды, которые в силу широкого распространения в растениях и большого структурного разнообразия в настоящее время находятся в центре внимания исследователей в области фармакогнозии во всей мировой фармацевтической науке (Бубенчикова В.Н., Дроздова И.Л., 2005; Доркина Е.Г. и др., 2013; Киселева T.JI. и др., 2008; Корулькин Д.Ю. и др., 2007; Макарова М.Н., Макаров В.Г., 2010; Самылина И.А. и др., 2003; 2010; Flavonoids: Chemistiy, Biochemistry, and Applications, 2006).

Этот интерес связан с тем обстоятельством, что флавоноиды, будучи эволюционно адекватными организму человека, обусловливают антиоксидантные, ангиопротекторные, гепатопротекторные, желчегонные, нейротропные и другие важнейшие фармакологические свойства. При этом следует отметить, что только за последние 10-15 лет число фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, увеличилось с 11 до 30 видов. Вместе с тем, созданию лекарственных препаратов на основе флавоноидных растений препятствует недостаточная степень изученности их химического состава, зависимостей в ряду «химическая структура — спектральные характеристики» и «компонентный состав — фармакологические свойства». Это приводит к отсутствию системного подхода в трактовке совокупной значимости действующих веществ в плане проявления фармакологических эффектов, а также научно обоснованных технологий получения и анализа лекарственных средств. Кроме того, в настоящее время остро стоит проблема объективной стандартизации сырья лекарственных растений и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, поскольку во многих случаях в методиках анализа отсутствует доказательная база или же не используются современные инструментальные возможности. Так, в большинстве фармакопейных статей на JIPC, содержащих флавоноиды, в разделе «Качественные реакции» в Государственной фармакопее СССР XI издания

используются лишь пробирочные реакции, а раздел «Количественное определение» отсутствует или не лишен недостатков.

В этой связи возникла необходимость обобщения и систематизации новых данных о химическом составе сырья, содержащего флавоноиды, из числа имеющих фармакопейный статус в Российской Федерации или за рубежом. Кроме того, очевидна целесообразность дальнейшего пересмотра существующих и разработки новых теоретически и экспериментально обоснованных подходов к стандартизации обсуждаемого круга объектов. Это особенно важно и актуально в связи с подготовкой к изданию Государственной Фармакопеи Российской Федерации XII издания, которая должна отражать лучшие отечественные разработки в области стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС), в частности, включать методики анализа, отвечающие параметрам валидации и использующие современные инструментальные возможности.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью диссертационного исследования является экспериментально-теоретическое обоснование новых подходов к стандартизации фармакопейных видов лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды, и лекарственных препаратов на их основе. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Обобщение и систематизация данных в области изучения фармакопейных растений, содержащих флавоноиды.

2. Анатомо-морфологическое исследование некоторых видов сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды (бессмертника песчаного цветки, пижмы обыкновенной цветки, репешка аптечного трава).

3. Сравнительное изучение химического состава лекарственных растений, содержащих флавоноиды.

4. Разработка принципов классификации флавоноидных фармакопейных растений с учетом совокупной значимости важнейших действующих веществ в лекарственном растительном сырье.

5. Изучение зависимостей спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов и компонентного состава лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

6. Разработка методологических подходов к стандартизации флавоноидосодержащего сырья и фитопрепаратов с использованием современных инструментальных методов и Государственных стандартных образцов (ГСО) веществ.

7. Обоснование объективных показателей качества лекарственного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды.

8. Разработка проектов нормативной документации на изучаемые виды сырья и на ГСО изосалипурпозида с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

9. Изучение зависимости «компонентный состав-фармакологическая активность» для фармакопейных видов ЛРС, содержащего флавоноиды, с целью создания антиоксидантных, нейротропных и диуретических лекарственных средств.

10. Обоснование целесообразности создания импортозамещающих лекарственных растительных препаратов на основе флавоноидов и рациональных путей использования соответствующих видов ЛРС.

Научная новизна. Впервые разработаны принципы классификации фармакопейных видов ЛРС, содержащего флавоноиды, позволяющие учитывать совокупную значимость действующих веществ с точки зрения проявления биологической и фармакологической активности, стандартизации, определения параметров качества и путей рационального использования.

В результате анатомо-морфологических исследований некоторых видов сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, выявлены новые диагностические признаки, позволяющие более объективно осуществлять идентификацию: для сырья бессмертника песчаного цветки - наличие в полостях прозенхимных клеток щетинок хохолка блестящих, по форме четырехугольных монокристаллов призматического вида, обладающих светоотражающей способностью, для сырья пижмы обыкновенной цветки - наличие мощного слоя склеренхимных волокон и проводящего пучка в центральной жилке листочков обертки, для сырья репешка аптечного трава - особенности лигнификации тканей стебля.

Впервые выделено и изучено 31 индивидуальное вещество: флавоноиды, фенилпропаноиды и фталиды. Среди них описаны два новых природных соединения, для которых установлено химическое строение: 61-гидрокси-21,41-диметоксихалкон (персикохалкон) и 21,61-дигидрокси-41,5|-диметоксихалкон (полигохалкон). Изучены зависимости спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов фармакопейных растении и компонентного состава лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

В результате проведенных исследований получены новые данные о флавоноидах как о самостоятельном классе биологически активных соединений, а также обоснованы пути использования изучаемых видов ЛРС с позиций выявления зависимости «компонентный состав-фармакологическая активность», что создает

перспективу расширения ассортимента отечественных эффективных и безопасных фитопрепаратов.

На основе результатов сравнительного изучения химического состава сырья и лекарственных препаратов фармакопейных растений научно обоснованы методологические подходы к стандартизации ЛРС, содержащего флаваноны, халконы, флавоны, флавонолы. Эти подходы заключаются в комплексном и обоснованном использовании методов ТСХ, ВЭЖХ, спектрофотометрии и использовании соответствующих ГСО (изосалипурпозид, пиностробин, цинарозид, гиперозид, рутин).

Обосновано использование в методиках качественного и количественного анализа сырья и препаратов, содержащих преимущественно флаваноны (перца водяного трава), халконы (бессмертника песчаного цветки), флавоны (пижмы обыкновенной цветки), флавонолы (горца почечуйного трава, боярышника кроваво-красного цветки и плоды, липы цветки, эрвы шерстистой трава, репешка аптечного трава), соответствующих ГСО изосалипурпозида (халкон), пиностробина (флаванон), цинарозида (флавон), гиперозида и рутина (флавонолы).

Экспериментально обоснованы показатели качества лекарственного растительного сырья и ГСО изосалипурпозида и включены в проекты фармакопейных статей «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Гинкго дву лопастного листья» и «Изосалипурпозид-стандартный образец».

В ходе исследований диуретической активности водных извлечений и образцов настоек из ЛРС выявлены препараты с быстрым развитием диуретического эффекта и короткой продолжительностью действия (настой и настойка эрвы), препараты с быстрым развитием эффекта и длительным действием (настой пижмы, настой и настойка бессмертника) и препараты с длительным латентным периодом и продолжительным действием (отвар толокнянки, настой репешка и рутин). Впервые обнаружена анксиолитическая активность для лекарственного препарата «Гинкго двулопастного настойка», при этом показана значимость всего флавоноидного комплекса листьев гинкго двулопастного для проявления наиболее полного спектра нейротропной активности.

Уточнен характер антиоксидантного действия для индивидуальных соединений, относящихся к разным классификационным группам флавоноидов, на ферментативные и неферментативные звенья антиоксидантной защиты.

Сформулирована концепция рационального использования сырья, содержащего флавоноиды, с точки зрения стандартизации, технологии получения лекарственных средств, фармакологических свойств.

На основе результатов фармакогностических, химических, технологических и фармакологических исследований сырья флавоноидосодержащих фармакопейных растений обоснована целесообразность создания антиоксидантных, диуретических, ноотропных, анксиолитических фитопрепаратов, в том числе импортозамещающих.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили создать методологическую базу для совершенствования стандартизации ЛРС, содержащего флавоноиды, а также расширить возможности целенаправленного поиска новых сырьевых источников для получения эффективных отечественных фитопрепаратов и лекарственных субстанций с антиоксидантной, диуретической, ноотропной и анксиолитической активностью.

Разработанные подходы к стандартизации, а также соответствующие методики анализа сырья и препаратов флавоноидных растений внедрены на таких фармацевтических предприятиях России как ОАО «Красногорсклексредства» (Московская обл.), ЗАО «ВИФИТЕХ» (г. Москва), ЗАО «Самаралектравы» (Самарская обл.), ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» (г. Самара).

Результаты диссертационных исследований используются в учебном процессе на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России.

Разработаны проекты нормативной документации «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Гинкго двулопастного листья», «Изосалипурпозид-стандартный образец», которые проходят экспертизу в Центре фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Успешное решение проблемы создания и стандартизации эффективных фитопрепаратов будет способствовать реализации Стратегии развития фармацевтической отрасли РФ до 2020 г., а также Стратегии лекарственного обеспечения населения РФ на период до 2025 г.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (№ государственной регистрации 01200202298) по темам «Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов» (№ 01200405620) и «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ 01200900658).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологического исследования некоторых видов сырья фармакопейных растений (бессмертника песчаного цветки, пижмы обыкновенной цветки, репешка аптечного трава), содержащих флавоноиды.

2. Результаты сравнительного изучения химического состава фармакопейных растений, содержащих флавоноиды (бессмертника песчаного цветки, пижмы обыкновенной цветки, гинкго листья, горца перечного трава, горца почечуйного трава, васильков цветки, репешка аптечного трава, боярышника цветки, боярышника плоды).

3. Принципы классификации флавоноидосодержащих фармакопейных растений на основе совокупной значимости важнейших действующих веществ в лекарственном растительном сырье.

4. Зависимости спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов и компонентного состава лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

5. Методологические подходы к стандартизации сырья, содержащего флавоноиды и фитопрепаратов с использованием современных инструментальных возможностей и ГСО.

6. Показатели качества, обоснованные для проектов фармакопейных статей на лекарственное растительное сырье «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Гинкго двулопастного листья» и «Изосалипурпозид-стандартный образец», с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

7. Экспериментально-теоретическое обоснование целесообразности создания новых импортозамещающих лекарственных растительных препаратов на основе флавоноидов с антиоксидантной, диуретической, нейротропной активностью.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (г. Томск, 2006); III и V Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007; 2012); XI, XII и XIV Всероссийских конгрессах и Всероссийских научно-практических конференциях «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006; 2007; 2008; 2009; 2011); XIII-XIX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (г. Москва, 2006; 2007; 2008; 2009; 2010; 2011; 2012); I Международном съезде фитотерапевтов (г. Москва, 2006); XV Всероссийской конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2010); научно-практической конференции «Фармация из века в век» (г. Санкт-Петербург, 2008); V Всероссийской научной

конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева «Современные проблемы химической науки и образования» (г. Чебоксары, 2012); 67-ой Межрегиональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2012); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012); IV Всероссийском научно-практическом семинаре (г. Волгоград, 2012); II Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (г. Москва, 2012), а также на международных конференциях по полифенолам: International Conference on Polyphenols (XXII - Helsinki, 2004; XXIII - Winnipeg, 2006; XXIV - Salamanca, 2008); на VI-VTO Международных Симпозиумах по фенольным соединениям (Москва, 2004, 2009, 2012); II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алматы, 2007); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (г. Москва, 2010); конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии природных соединении» (г. Ташкент, 2010); на 2-й Международной научной конференции по морфологии растений «Современная Фитоморфология» (г. Львов, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 70 научных работах, в том числе в 30 статьях - в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ. Имеются 2 патента РФ на изобретение и монография «Флавоноиды фармакопейных растений» (2012).

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения сырья «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Репешка аптечного трава», для которых выявлены основные диагностические признаки. Кроме того, автором выделено 31 природное соединение, при этом установлена их химическая структура с использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, различных химических превращений, тонкослойной хроматографии (ТСХ). Разработаны методики качественного и количественного анализа целого ряда фармакопейных растений и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, с применением методов ТСХ, УФ-спектроскопии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Автором разработаны проекты ФС «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Изосалипурпозид-стандартный образец», рекомендованные для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Диссертантом сформулированы принципы классификации флавоноидных фармакопейных растений с учетом совокупной значимости важнейших биологически активных соединений (БАС) в лекарственном растительном сырье. Изучены зависимости спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов и компонентного состава лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, а также данные зависимости «компонентный состав-фармакологическая активность». Разработаны методологические подходы к стандартизации флавоноидосодержащего сырья и фитопрепаратов с использованием современных инструментальных возможностей и ГСО, а также объективные показатели качества лекарственного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды. Автором научно обоснована целесообразность создания новых импортозамещающих лекарственных растительных препаратов на основе флавоноидов с разноплановым спектром фармакологической активности.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 485 страницах машинописного текста, содержит 55 таблиц, 167 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-7), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 475 источников, из которых 105 — на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту. Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, где систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств, применению в медицине, стандартизации сырья и препаратов на их основе. В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования. Глава 3 отражает результаты анатомо-морфологического исследования цветков бессмертника песчаного и цветков пижмы обыкновенной, а также репешка аптечного. Глава 4 содержит результаты сравнительного исследования компонентного состава сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды. В главе 5 обсуждаются зависимости спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов и компонентного состава сырья фармакопейных растений. Глава 6 посвящена проблеме стандартизации сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, и включает разработку подходов к стандартизации, методик качественного и количественного анализа и проектов фармакопейных статей на ЛРС. В главе 7 дается экспериментально-теоретическое обоснование целесообразности создания импортозамещающих антиоксидантных,

диуретических, ноотропных и анксиолитических лекарственных растительных препаратов на основе флавоноидов.

В Приложение вынесены акты внедрения, проекты ФС, патенты РФ на изобретение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили следующие виды ЛРС: цветки бессмертника песчаного (Heiichrysum arenarium (L.) Moench.), цветки пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.), трава эрвы шерстистой (Aerva Janata L.), листья мяты перечной (Mentha piperita L.), цветки ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), цветки василька синего (Centaurea cyanus L.), трава тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.), трава полыни эстрагон (Artemisia dracunculus L.), трава горца почечуйного (Polygonum persicaria L.), трава перца водяного (Polygonum hydropiper L.), листья гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.), траву репешка аптечного (Agrimonia eupatorio L.), плоды и цветки боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguínea Pall.), цветки липы сердцевидной (Tilia cordata Mill.), заготовленные в Самарской, Ульяновской, Пензенской областях и других регионах РФ в 2004-2013 гг., а также промышленные образцы (ЗАО «Красногорсклексредства», ООО ПКФ «Фитофарм» и др.). Были исследованы экстракционные препараты (настои, настойки), препараты «Фламин» и «Танацехол», ГСО, индивидуальные соединения, выделенные из ЛРС.

В работе использованы световые микроскопы следующих марок: цифровой микроскоп Motic DM111 (возможность увеличения данного прибора представлена четырьмя окулярами: 4x10; 10x10; 40x10; 100x10), цифровой стереоскопический микроскоп Motic DM-39C-N9GO-A (х20; х40). Микропрепараты готовили в соответствии с фармакопейной методикой ГФ СССР XI издания, а также с использованием модифицированных методик.

Исследование цветков бессмертника песчаного и препарата «Фламин» осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-5» (НПО «Научприбор», Россия) в изократическом режиме (стальная колонка 2 х 80 мм; КАХ 6-80-4, сорбент - «Диасорб С-16») в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали смесь «вода-ацетонитрил» в соотношениях 70:30 и 80:20 (об. %). Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длинах волн 254, 270, 290, 330 и 360 нм. Оценка межлабораторной воспроизводимости в отношении цветков бессмертника песчаного осуществлялась с использованием хроматографа «Стайер» (ООО «НПО Аквилон»), Исследование водно-спиртовых извлечений из цветков пижмы обыкновенной и листьев гинкго двулопастного осуществляли с

использованием хроматографа «Стайер» и колонки размером 4,6 х 250 мм (стационарная фаза - октадецил силан С-18). В качестве подвижной фазы использовали смеси «ацетонитрил-вода» в соотношении (40:60, 70:30).

Выделение веществ из исследуемого ЛРС осуществляли с помощью колоночной хроматографии (силикагель L 40/100 и L 100/160; полиамид марки «Woelm»). Контроль за разделением веществ осуществлялся с помощью метода тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ», а также «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-спирт в сочетаниях 9:1; 6:1; 2:1, хлороформ-метанол-вода (26:14:3), хлороформ-спирт этиловый-вода (26:16:3) и w-бутанол-вода-ледяная уксусная кислота (4:1:2).

Регистрацию УФ-спектров растворов веществ и водно-спиртовых извлечений проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

Установление строения выделенных веществ осуществляли с помощью УФ-спектроскопии, 'Н-ЯМР-спектроскопии и 13С-ЯМР-спектроскопии (спектрометр «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектрометрии (масс-спектрометр «Kratos MS-30»), различных химических превращений, ТСХ и непосредственным сравнением с достоверно известными образцами веществ.

Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (Р=95%) проводили с помощью программ StatSoft Statistica 6.0, Microsoft Excel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения (ГФ СССР XI издания, вып. 1, стр. 199).

2. Анатомо-морфологическое исследование некоторых видов лекарственных растений, содержащих флавоноиды

Необходимость совершенствования разделов «Внешние признаки» и «Микроскопия» нормативной документации (НД) на ЛРС вытекает из требований отраслевого стандарта (ОСТа 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств»), а также обусловлена тем, что в настоящее время готовится к изданию Государственная Фармакопея Российской Федерации XII издания (вып. 4). В связи с этим в работе были поставлены задачи по уточнению анатомо-морфологических признаков цветков бессмертника песчаного, цветков пижмы обыкновенной и травы репешка аптечного с использованием современной приборной базы, включая цифровую микроскопию.

2.1. Бессмертник песчаный

Определено, что анализируемое сырье представляет собой щитковидные соцветия (рис. 1), состоящие из 20-35 мелких корзинок, или части этих соцветий. Цветки корзинки, как правило, морфологически различимы и выделяются на срединные и краевые (рис. 2-4). В ходе исследований цветков бессмертника песчаного с использованием цифровой микроскопии уточнены и выявлены новые

Рис. Т. Соцветие бессмертника песчаного (х20)

Рис. 3. Краевой трубчатый цветок бессмертника песчаного (х40)

ШШШШ

диагностические признаки данного лекарственного растительного сырья (рис. 5 и 6), заключающиеся в наличии в полостях прозенхимных клеток щетинок хохолка блестящих, по форме четырехугольных монокристаллов призматического вида, обладающих светоотражающей способностью (рис. 6).

Результаты анатомо-морфологического исследования нашли отражение в разделе «Микроскопия» проекта фармакопейной статьи на сырье «Бессмертника песчаного цветки», рекомендованного для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Рис. 2. Срединный трубчатый цветок бессмертника песчаного (х40)

Рис. 4. Хохолок на верхушке завязи цветка бессмертника песчаного (х40)

Рис. 5. Пыльца на щетинках завязи Рис. 6. Кристаллы щетинок цветка

цветка бессмертника песчаного (хЮО) бессмертника песчаного (х400)

2.2. Пижма обыкновенная

Определено, что морфологически выраженной частью соцветия пижмы (рис.7) являются листочки на побегах (рис. 8), формирующих щитковидное соцветие.

На наш взгляд, листочки могут служить диагностическим признаком, причем в этом плане информативным является как морфологическое строение листовой пластины, так и ее анатомо-гистологические особенности.

Выявлены новые анатомо-морфологические особенности, ранее не описанные в литературе. Из перспективных диагностических признаков (рис. 9), выявленных впервые, для введения в новую редакцию раздела «Микроскопия» проекта ФС на цветки пижмы рекомендуются следующие характеристики:

1) Особенности строения фертильных частей трубчатого цветка пижмы, заключающиеся в характере эпидермальных клеток завязи и ее опушения, строения основания завязи (наличие кольца склерефицированных клеток), в особенностях строения рыльца пестика (его раздвоенность и особая неровная ворсинчатая поверхность), а также андроцея (пыльники с заостренной верхушкой, сросшиеся двухгнездными теками; наличие связника, образованного клетками с сильно утолщенными лигнифицированными стенками).

2) Гистологические особенности строения листочков обертки. На поперечном сечении листочков обертки диагностируется мощный слой склеренхимных волокон и проводящего пучка в центральной жилке, армированного мелкими склеренхимными клетками.

3) Гистологические особенности строения цветоложа: цветоложе выполнено основной паренхимой, при этом с периферии паренхима плотная, представлена

мелкими клетками. В сердцевине цветоложа клетки паренхимы крупные, с большим количеством межклетников.

4) Впервые в паренхиме цветоложа выявлены лизигенные вместилища, чередующиеся с проводящими элементами ксилемы. Содержимое вместилищ темно-коричневого цвета.

Рис. 7. Соцветие пижмы Рис. 8. Листочек соцветия пижмы

обыкновенной (х20) обыкновенной (на побегах) (х20)

Рис. 9. Анатомо-гистологические особенности цветка пижмы обыкновенной

Обозначения:

А - эпидермис трубки венчика близко к отгибу венчика (х400); Б, В - эпидермис трубки венчика близко к завязи (х400); Г - тычиночная нить (х400); Д - рыльце пестика (х400); Е - столбик пестика (х400); Ж - место срастания венчика с завязью (хЮО); 3 - место прикрепления соцветия к цветоложу (х400).

1 - стенки с порами; 2 - кристаллы; 3 - эпидермальные клетки трубки венчика близко к отгибу; 4 - эпидермальные клетки трубки венчика близко к завязи; 5 - железки; 6 - клетки с одревесневшими стенками; 7 - эпидермис столбика; 8 - пыльцевая трубка; 9 - клетки рыльца; 10 - сосудистый элемент; 11 - друзы в месте срастания завязи и венчика; 12 - клетки паренхимы столбика; 13 - клетка выполняющей паренхимы; 14 - сосуд; 15 - эпидермис семянки; 16 - трубка венчика; 17 - редуцированная чашечка; 18 — склереиды места прикрепления семянки; 19 - завязь.

Результаты морфолого-анатомических исследований предложены в новую редакцию раздела «Микроскопия» проекта фармакопейной статьи на сырье «Пижмы обыкновенной цветки», рекомендованного для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

С целью более надежной видовой идентификации проведены и анатомо-морфологические исследования в отношении сырья репешка аптечного.

3. Сравнительное изучение химического состава сырья некоторых видов

фармакопейных растений, содержащих флавоноиды С использованием экстракции 70 % спиртом этиловым, последующей очистки упаренных водно-спиртовых извлечений и разделения экстрактивных веществ с помощью колоночной хроматографии из цветков бессмертника песчаного, цветков пижмы обыкновенной, травы горца почечуйного травы перца водяного, плодов и цветков боярышника кроваво-красного, листьев гинкго двулопастного и травы репешка аптечного выделено 31 индивидуальное вещество: флавоноиды (1-27), фенилпропаноиды (28, 29) и фталиды (30, 31) (табл. 1).

3.1. Установление физико-химических констант и спектральных данных выделенных соединений В таблице 1 приведены важнейшие физико-химические и спектральные характеристики выделенных веществ (1-31).

Таблица 1

Физико-химические характеристики соединений, выделенных из некоторых видов

лекарственного растительного сырья

№ п/п Название, химическая формула Бругго-формула WEtOH), нм Растительный источник

1. Флавоноиды 1.1. Флаваноны

1. он о Онисилин с17н16о5 292, 326 (пл.) Перец водяной (трава)

2. с НзСК^^^О^Л^Ї ОН О Пиностробин С16Н14О4 290, 325 (пл.) Перец водяной (трава), горец почечуйный (трава)

3. но о Нарингенин С15Н12о5 227, 284 Бессмертник песчаный (цветки)

4. ас— о о Салипурпозид С21Н22О10 227,284 Бессмертник песчаный (цветки)

5. оуо Прунин С21Н22О10 227, 284 Бессмертник песчаный (цветки)

1.2. Халконы

6. ОСНз 2',61-Дигидрок-си-4',51-диметоксихалкоп (полигохалкон) С17Н1605 351 Перец водяной (трава), горец почечуйный (трава)

7. СН36 О б'-Гидрокси-г1^1-диметоксихалкон (персикохалкон) С17Н1604 341 Горец почечуйный (трава)

8. снзск^^он Г^З СИзО^^Т ОН О 21,61-Дигидроксн-31,41-диметоксихалкон С17Н1605 352 Перец водяной (трава)

9. Иїосалипурпозид С21Н22О10 372 Бессмертник песчаный (цветки)

1.3. Флавоны

10. Апигевин С15Н10О5 270, 335 Пижма обыкновенная (цветки)

11. /Ч/00"3 он о Акацетин С16Н1205 270, 328 Пижма обыкновенная (цветки)

12. Космоснин С21Н20О10 270, 334 Пижма обыкновенная (цветки)

13. ^^ОСНэ Тилианин С22Н22О10 270, 327 Пижма обыкновенная (цветки)

14. Витексин С21Н20О10 270, 332 Боярышник кроваво-красный (плоды, листья)

15. он о Лютеолин Сі5Н,0Об 256, 266 пл, 358 Пижма обыкновенная (цветки)

16. Цішарознд С21Н20О11 257,266 пл, 352 Пижма обыкновенная (цветки)

17. Гинкгетин С32Н220Ю 271,330 нм Гинкго двулопастный (листья)

1.4. Флавоноли

18. он о Кемпферол СцНюОб 267,359 Гинкго двулопастный (листья): кислотный гидролиз

19. он о Астрагаліні С21Н20О11 269,350 Горец почечуйный (трава)

20. ^і-^^Ґ^О - Ос -О^Ьа Никати флорин С27Н30О15 268,355 Гинкго двулопастный (листья):

21. Кверцетин С15Н10О7 257, 268 пл, 375 Репешок аптечный (трава), перец водяной (трава), кислотный гидролиз

22. он о Кверцитрин С2ІН20О12 257, 268 пл, 361 Горец почечуйный (трава), Репешок аптечный (трава),

23. ОН О Изокверцитрин С21Н20О12 257,268 пл, 363 Горец почечуйный (трава)

24. он о Гиперозид С21Н20О12 258,266 пл, 363 Боярышник кроваво-красный (цветки)

25. - Єіс -О-НИа Он О Рутин С27Н30О16 258,266 пл, 362 Гинкго двулопастный (листья)

26. ОСНз ОН О Изорамнетин СібН,207 256,269 пл., 370 Гинкго двулопастный (листья): кислотный гидролиз

27. І^^^^О - Є 1с -О-ГОіа ОН О Нарциссин СгвНзгОіб 257,268 пл., 367 Гинкго двулопастный (листья)

2. Фенилпропаноиды

28. Кофейная кислота С9Н804 217,242,328 Пижма обыкновенная (цветки)

29. он он ч/ хн Хлорогеновая кислота с16Ні8о, 217,243, 398 пл, 330 Пижма обыкновенная (цветки)

3. Фталиды

30. 5,7-Дигидроксифталид с8н6о4 217, 256, 291 Бессмертник песчаный (цветки)

31. снз<>ХгС он 0 5-Метокси-7-гидрокеифталид С9Н804 218,256, 292 Бессмертник песчаный (цветки)

3.2. Изучение химического строения выделенных соединений

В результате проведенных структурных исследований идентифицировано 31 индивидуальное природное соединение (табл. 1). В частности, установлено строение двух новых природных соединений - флавоноидов, выделенных из травы перца водяного и травы горца почечуйного - полигохалкона (6) и персикохалкона (7), которые имеют химическую структуру 2^,б'-дигидрокси-4',5'-диметоксихалкона (6) и 61 -гидрокси-21,41 -диметоксихалкона (7) соответственно.

Халконовая природа флавоноидов 6 и 7 следует из данных 'Н-ЯМР-спектров, в которых присутствуют два характерных дублета с КССВ 16 Гц в области 7,9 и 7,8 м.д., принадлежащих протонам Н-/? и Н-а. Наличие свободного гидроксила в молекуле флавоноида 6 при 2'-ОН подтверждается однопротонным синглетным сигналом при 14.30 м.д. В молекуле соединения 6 присутствуют две метоксильные группы, отнесенные к положениям С-41 и С-51, поскольку в ЯМР-спектре присутствуют два трехпротонных синглетных сигнала при 3,92 и 3,95 м.д., а также синглетный сигнал протона Н-31 при 6.08 м.д.

Как и в случае с флаванонами (1 и 2), соединения 6 и 7 имеют незамещенное боковое кольцо В, что подтверждается наличием в спектре 'Н-ЯМР мультиплета интенсивностью 5 протонов в области около 7,1-7,7 м.д.

В молекуле флавоноида 6 также обнаруживаются два трехпротонных синглетных сигнала (при 3,85 и 3,95 м.д.), принадлежащие двум метоксильным группам, однако они расположены при С-21 и С-41, что подтверждается наличием двух однопротонных дублетных сигналов при 5,98 и 6,16 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 2 Гц (рис. 10). В соответствии с данными 'Н-ЯМР-спектров находятся и результаты масс-спектрометрии: наличие в масс-спектре молекулярного пика иона (М+) с m/z 300 (100 %), а также пика иона с m/z 197 (28%), соответствующему фрагменту (А+Н)+ в случае флавоноида 6 (рис. 11) и молекулярного пика иона (М+) с m/z 284 (100 %), а также пика иона с m/z 181 (22%) в масс-спектре флавоноида 7.

Таким образом, полигохалкон (6) и полигохалкон (7) имеют строение 2',б'-дигидрокси-41,51 -диметоксихалкона и 61 -гидрокси-21,41 -диметоксихалкона соответственно и являются новыми природными соединениями.

Рис. 10. 'Н-ЯМР-спектр полигохалкона (6) в CDC13

Рис. 11. Масс-спектр полигохалкона (6)

Не меньший интерес представляет и другой халкон - изосалипурпозид (9), выделенный нами из цветков бессмертника песчаного. Для изосалипурпозида изучены физико-химические и спектральные характеристики, в том числе данные 'Н-ЯМР-спектров и масс-спектров, которые использованы для обоснования показателей качества данного флавоноида в рамках разработки проекта фармакопейной статьи «Изосалипурпозид-стандартный образец».

4. Сравнительное изучение зависимости спектральных характеристик от химической структуры важнейших флавоноидов фармакопейных растений В целях стандартизации ЛРС и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, наиболее часто применяется спектрофотометрия.

4.1. Характеристика электронных спектров важнейших флавоноидов фармакопейных растений Несмотря на то, что спектральные свойства флавоноидов достаточно хорошо изучены и успешно используются в анализе ЛРС и фитопрепаратов, проблема изучения данных аспектов по-прежнему актуальна. Это связано с тем, что появляются новые данные о химическом составе фармакопейных растений, расширяется ассортимент лекарственных растений, применяемых в медицине. Кроме того, до сих пор для многих видов ЛРС как в России, так и за рубежом вопросы стандартизации не решены в полной мере, особенно в плане количественного определения флавоноидов с использованием современных инструментальных возможностей.

В сырье фармакопейных растений наиболее распространенными группами флавоноидов являются флавоны, флавонолы, флаваноны, флаваноны, халконы, изофлавоны и антоцианы, которые представляют наибольший интерес в плане стандартизации ЛРС и фитопрепаратов. В сравнительном плане изучены спектральные характеристики флавоноидов, выделенных из исследуемых видов ЛРС, а также стандартных образцов веществ. Флавоны и флавонолы образуют единую сопряженную систему двойных связей, и в их УФ-спектрах присутствуют две интенсивные полосы поглощения. Длинноволновая полоса поглощения, обозначаемая обычно в литературе как полоса I, в области 320-380 нм связана главным образом с циннамоильной группировкой (кольцо В), а коротковолновая полоса (полоса II) при 250-270 нм обусловлена поглощением бензоильной группировки (кольцо А), например, в случае наиболее распространенных в растениях флавоноидных агликонов - апигенина (10), кемпферола (18) лютеолина (15) и кверцетина (21) (рис. 12-15). Введение электронодонорных ОН-групп в кольцо А или В приводит к повышению их электронной плотности и увеличивает длину волны и интенсивность соответствующих полос поглощения (рис. 13 и 15). Длинноволновая полоса поглощения флавонола кверцетина (21) имеет более высокую интенсивность и сдвинута в видимую область по сравнению с флавоном лютеолином (15) (максимумы поглощения при 374 нм и 353 нм соответственно). Аналогичный эффект наблюдается и в случае кемпферола (18), имеющего ОН-группу в положении С-3, по сравнению с апигенином (10) (рис. 12 и рис. 13).

Чаще всего для УФ-спектров флавонов характерны два максимума поглощения при ~ 260-270 нм (коротковолновый максимум) и при ~ 340-350 нм (длинноволновый максимум) (рис. 12-16). В УФ-спектрах флавонолов максимумы поглощения находятся, как правило, в области ~ 260 нм (коротковолновый максимум) и при ~ 360-380 нм (длинноволновый максимум), хотя, конечно, учитывая разнообразие структуры флавоноидов, эти значения могут сильно варьировать (рис. 12-16). Следовательно, значения максимумов поглощения в электронных спектрах флавоноидов и соотношение интенсивностей максимумов полос I и II имеют существенное значение в плане предварительной идентификации. Кроме того, весьма полезную информацию дает не только максимум поглощения, но и его характер. Так, в случае одновременного наличия заместителей в кольце В в З1-и 4'-положениях (рис. 14-16) наряду с максимумом наблюдается так называемое «плечо». Если в кольце В только один заместитель в 4'-положении (апигенин,

кемпферол), наблюдается один выраженный максимум (рис. 12, 13). Следовательно, наличие или отсутствие ОН-группы при С-3 или ее замещение (например, гликозилирование) в значительной мере влияет и на характер кривой поглощения, и на соотношение интенсивностей полос I и II. Например, в случае рутина (рис. 16, 18) максимум поглощения полос I находится при длине волны 362 нм, тогда как в случае его агликона (кверцетина) - при 374 нм (рис. 15).

Рис. 12. УФ-спектры растворов апигенина (10).

Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор добавлением алюминия хлорида.

Рис. 13. УФ-спектры растворов кемпферола (18).

Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 14. УФ-спектры растворов лютеолина (16).

Обозначения: 1 — исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 15. УФ-спектры растворов кверцетина (21).

Обозначения: 1 — исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 16. УФ-спектры растворов рутина (25).

Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 17. УФ-спектры растворов изосалипурпозида (9). Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида.

С целью отделения максимума поглощения анализируемой группы флавоноидов (флавоноида) от перекрывающих их полос поглощения других (сопутствующих) соединений используют вариант проведения дифференциальной спектрофотометрии. Для этого применяют ионизирующие и комплексообразуюгцие добавки (чаще всего - А1С13), при реакции с которыми образуются соединения с максимумом светопоглощения, как правило, находящимся в длинноволновой области спектра (батохромный сдвиг), за пределами «мешающих» соединений. Наиболее часто используют соединение флавоноловой природы - ГСО рутина, который в варианте проведения дифференциальной спектрофотометрии (рис. 18), имея исходный основной длинноволновый максимум 362 нм ± 1 нм, при реакции с А1С13 дает смещение на 50 нм (рис. 18). Такое же смещение также наблюдается у аналогичных по природе флавоноидов, содержащихся в ЛРС или в ФП, и анализируемых с использованием ГСО рутина. Несмотря на то, что из-за наличия системы сопряженных связей интенсивный максимум в халконах находится, как правило, в области 350-380 нм, например, в случае изосалипурпозида (рис. 17), в присутствии А1С13 также наблюдается сильный батохромный сдвиг (рис. 19). Это можно использовать целенаправленно для стандартизации.

В молекулах флаванонов или флаванонолов отсутствует одна сопряженная связь, поэтому в электронных спектрах наблюдается лишь один максимум поглощения в области 286-292 нм, причем, например, замещение 7-ОН группы в случае онисилина и пиностробина, а также наличие 4*-ОН (нарингенин), 3-ОН группы и З'^'-ОН ортодигидроксигруппировки, например, в ГСО дигидрокверцетина, практически не сказывается на спектральных характеристиках.

5. Стандартизация лекарственного сырья фармакопейных растений и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды

В настоящее время во многих фармакопейных статьях на ЛРС в разделах «Качественные реакции» Государственной фармакопее СССР XI издания используются лишь пробирочные реакции, а разделы «Количественное определение» отсутствуют или не лишены недостатков. В некоторых случаях подходы к химической стандартизации здесь достаточно противоречивы, а используемые методики анализа не всегда отвечают параметрам валидации.

Результаты изучения компонентного состава ЛРС, включая спектральные характеристики выделенных флавоноидов (1-27), фенилпропаноидов (28, 29) и фталидов (30, 31), использованы в качестве методологической основы для разработки новых подходов к стандартизации ЛРС с использованием ТСХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии.

5.1. Возможности использования ТСХ для идентификации ЛРС, содержащего флавоноиды

Метод ТСХ (что согласуется и с данными ВЭЖХ-анализа) позволил выявить, что доминирующим флавоноидом цветков бессмертника песчаного является изосалипурпозид (9) (рис. 20), цветков пижмы обыкновенной - тилианин (13), листьев гинкго двулопастного - гинкгетин (17), травы перца водяного -пиностробин (20) и полигохалкон (6), травы горца почечуйного - пиностробин, персикохалкон и изокверцитрин, цветков липы - изокверцитрин, цветков боярышника - гиперозид (24), плодов боярышника - витексин (14). Изосалипурпозид (9) обнаруживается в цветках бессмертника песчаного в виде пятна желтого цвета с величиной Т1Г около 0,5 (рис. 20). При этом обнаруживаются и другие флавоноиды, характерные для данного растения - салипурпозид (5-0-глюкозид нарингенина) и прунин (7-О-глюкозид нарингенина) в виде одного фиолетового пятна в УФ-свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме просматриваются также пятна кумаринов и коричных кислот, имеющих голубую флуоресценцию при длине волны 366 нм. Последующее проявление хроматограммы раствором диазобензолсульфокислоты позволяет еще более четко обнаружить доминирующее пятно изосалипурпозида на уровне пятна ГСО изосалипурпозида. С учетом отсутствия в РФ ГСО изосалипурпозида нами разработана схема выделения изосалипурпозида, а также проект ФС «Изосалипурпозид-стандартный образец»,

рекомендованный для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

О О

1 2 3 4 5 6

Рис. 20. Схема тонкослойной хроматограммы вешеств и водно-спиртового извлечения из цветков бессмертника песчаного

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение из сырья; 2 - ГСО изосалипурпозида; 3 - салипурпозид; 4 - прунин; 5 - нарингенин; 6 - хлорогеновая кислота.

Аналитические исследования выполнены и для других флавоноидосодержащих растений, что позволило включить разработанные методики ТСХ-анализа в сочетании со спектральными характеристиками и пробирочными реакциями в проекты ФС «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Гинкго двулопастного листья», а также рекомендованы в виде отдельных методик для соответствующих ФС на сырье других изучаемых видов.

5.2. Сравнительная характеристика электронных спектров водно-спиртовых извлечений некоторых фармакопейных растений, содержащих флавоноиды

В настоящее время актуальным является совершенствование методов стандартизации и их гармонизация в ряду: сырье - лекарственная субстанция -лекарственный препарат (Самылина И.А. и др., 1994; 2008).

Сравнительное изучение электронных спектров водно-спиртовых извлечений из ЛРС показало, что наряду с флавоноидами существенный вклад в кривую поглощения УФ-спектров вносят гидроксикоричные кислоты (фенилпропаноиды), представленные в основном кофейной, хлорогеновой кислотами и их производными.

Из данных, приведенных в таблицах 2 и 3, следует, что именно фенилпропаноиды во многом и обусловливают характер кривой поглощения «плечо» в области около 290 нм и максимум поглощения в области около 330 нм. Это имеет место как в случае эфиромасличных растений, например, у пижмы обыкновенной (табл. 2; рис. 21 и 22), так и у видов, где ведущей группой биологически активных соединений являются флавоноиды (бессмертник песчаный и др.) (табл. 2, рис. 23 и 24). В обоих вариантах использование дифференциальной спектрофотометрии приводит к получению кривой поглощения (табл. 2; рис. 22 и 24), спектральные характеристики которой определяются особенностями химического строения флавоноидов.

В дифференциальных электронных спектрах растворов водно-спиртовых извлечений из цветков пижмы обыкновенной обнаруживается максимум поглощения при длине волны 400 нм (табл. 2; рис. 22). Характер спектра в основном обусловлен веществами флавоновой природы (табл. 2), имеющими, как правило, в этих условиях максимум поглощения около 400 нм, свойственный ГСО цинарозида (табл. 3). Сопоставимые спектральные характеристики получены и для растворов водно-спиртовых извлечений из травы репешка аптечного, листьев мяты перечной и травы тысячелистника (табл. 3). Кривая поглощения УФ-спектра раствора извлечения из цветков ромашки аптечной, цветков липы сердцевидной, цветков и плодов боярышника и травы эрвы шерстистой, травы горца почечуйного в варианте дифференциальной спектрофотометрии в основном обусловлена флавонолами (табл. 3), имеющими, как правило, в этих условиях максимум поглощения около 407-412 нм (табл. 3), свойственный такому известному ГСО, как рутин (табл. 3; рис. 16, 18). Несмотря на то, что кривые поглощения исходных спектров электронных спектров водно-спиртовых извлечений из плодов и цветков боярышника кроваво-красного резко различаются (рис. 25 и 26). В условиях дифференциальной спектрофотометрии они имеют максимум поглощения (длина волны 412 нм), обусловленный гиперозидом и другими флавоноидами (рис. 27 и 28). В УФ-спектр раствора извлечения из цветков бессмертника песчаного значительный вклад вносят халконы, особенно в варианте дифференциальной спектрофотометрии (табл. 2, рис. 22).

Таблица 2

Сравнительная характеристика УФ-сиектров растворов водно-спиртовых извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды

№ п/п Значения максимумов поглощения, нм

Наименование объекта исследования (водно-спиртовое извлечение) Исходный раствор +А1С1з Дифференциальный спектр (длинноволновый максимум)

1. Цветки бессмертника песчаного 292пл, 331 281,334, 400 пл 418

2. Цветки пижмы обыкновенной 291пл, 332 291,332, 400пл 400

3. Цветки ромашки аптечной 293, 322 298, 323 411

4. Трава тысячелистника 291,331 281,334, 396пл 395

5. Трава эрвы шерстистой 268, 322, ЗбОпл 278, ЗЗОпл, 407 407

6. Трава репешка аптечного 267, 321, 278, 334пл, 397 403

7. Листья мяты перечной 288, 327 290, 333 389

8. Трава полыни эстрагон 292пл, 329 292пл, 330, 410пл 405

9. Цветки боярышника кроваво-красного 270,289, 327 280, 304пл, 328, 410пл 412

10. Плоды боярышника кроваво-красного 287, 340пл 287, 412пл, 412

11. Цветки липы 271,284 пл, 355пл 278, 344, 407 409

12. Листья гинкго двулопастного 276, 280, 305, 355 пл 276, 280 пл, 305, 400 403

13. Трава перца водяного 280 пл, 293,330 284, 309, 385 395

14. Трава горца почечуйного 270, 284 пл, 350 276, 398 409

15. Цветки василька синего 277, 327 пл, 538

Таблица З

Сравнительная характеристика УФ-спектров растворов

некоторых флавоноидов и фенилпропаноидов_

№ п/п Наименование вещества Значения максимумов поглощения, нм

Исходный раствор +А1С1з Дифференциальный спектр (длинноволновый максимум)

1. Рутин 257,267пл,362 274, 300,409 412

2. Гиперозид 257, 267пл, 362 274, 300, 409 412

3. Цинарозид 256, 267пл, 352 278, 298пл, 395 400

4. Изосалипурпозид 246пл, 370 252пл,408 418

5. Пиностробин 289,ЗЗОпл 309, 380 380

6. Дигидрокверцетин 290, ЗЗОпл 310, 380 380

7. «-Кумаровая кислота 295пл,309 295пл, 310 -

8. Кофейная кислота 290, 330 288, 334 -

9. Хлорогеновая кислота 290, 331 290, 333 -

Вклад в кривую поглощения электронного спектра данного извлечения подтверждается спектральными характеристиками ГСО изосалипурпозида, имеющего максимум поглощения в УФ-спектре при длине волны 418 нм (табл. 3; рис. 17 и 19). Следовательно, для стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды, целесообразно использование в случае флавонов, флавонолов и халконов соответственно ГСО цинарозида, ГСО рутина и ГСО изосалипурпозида. В этом контексте ключевым вопросом является углубленное исследование компонентного состава, в том числе флавоноидов, особенно в случае недостаточной степени изученности сырья лекарственных растений или противоречивости данных по химическому составу, к которым относятся бессмертник песчаный и пижма обыкновенная. В случае флаванонов и флаванонолов также возможно применение дифференциальной спектрофотометрии, так как эти вещества реагируют с АІСІз.

Обозначения: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор (дифференциальный спектр),

извлечения с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 27. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из цветков боярышника кроваво-красного (дифференциальный спектр)

\ Л

Рис. 23. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из цветков бессмертника песчаного

Обозначения: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 24. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из цветков бессмертника песчаного

(дифференциальный спектр).

Рис. 25. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из цветков боярышника

Обозначения: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида; 3 -раствор гиперозида с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 26. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из плодов боярышника

Обозначения: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида.

Рис. 28. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из плодов боярышника кроваво-красного (дифференциальный спектр)

Данное обстоятельство свидетельствует о возможности использования одного из основных флавоноидов данного сырья - ГСО пиностробина в целях стандартизации травы перца водяного.

5.5. Разработка методик количественного определения флавоноидов в сырье

и препаратах фармакопейных растений В сравнительном плане проведены аналитические исследования следующих видов ЛРС: цветки бессмертника песчаного, цветки пижмы обыкновенной, цветки и плоды боярышника кроваво-красного, трава эрвы шерстистой, трава горца почечуйного, трава перца водяного, листья гинкго двулопастного, трава репешка аптечного, цветки липы сердцевидной, цветки василька синего.

5.3.1. Разработка методик количественного определения содержания флавоноидов с использованием спектрофотометрии

На основе результатов сравнительного изучения электронных спектров водно-спиртовых извлечений и растворов флавоноидов обосновано использование стандартных образцов изосалипурпозида (халкон), рутина, гиперозида, изокверцитрина (флавонолы), цинарозида (флавон), пиностробина (флаванон), цианидин-З-О-глюкозида (антоцианы) (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительные параметры методик количественного определения _содержания суммы флавоноидов в ЛРС_

№ п/п Лекарственное растительное сырье Аналитическая длина волны, нм Используемый стандартный образец Содержание суммы флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье и соответствующий стандартный образец

1. Бессмертника песчаного цветки 418 Изосалипурпозид 2,90+0,03 - 3,50+0,04

2. Пижмы обыкновенной цветки 400 Цинарозид 1,58+0,02 - 1,98+0,03

3. Эрвы шерстистой трава 406 Рутин 0,51+0,01 - 1,05+0,02

4. Перца водяного трава 394 Пиностробин 2,47+0,03 - 4,44+0,05

5. Горца почечуйного трава 410 Изокверцитрин 2,70+0,03 - 3,55+0,03

6. Гшпсго двулопастного листья 412 Рутин 0,80+0,02 - 1,88+0,03

7. Липы сердцевидной цветки 410 Гиперозид 1,27+0,03 - 1,87+0,03

8. Боярышника цветки 412 Гиперозид 1,41+0,02- 1,84+0,03

9. Боярышника и плоды 412 Гиперозид 0,112+0,003- 0,183+0,003

10. Репешка аптечного трава 403 Цинарозид 1,22+0,03 - 1,40+0,03

11. Василька синего цветки 540 Цианидин-З-О-глюкозид 2,24+0,03 - 3,60+0,04

Разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов в изучаемых видах ЛРС отвечают параметрам валидации. Опыты с добавками стандартных образцов рутина, гиперозида, изокверцитрина, цинарозида, изосалипурпозида, пиностробина, цианидин-З-О-глюкозида к навескам соответствующего сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанных методик.

На основе результатов количественной оценки содержания суммы флавоноидов в изучаемых видах сырья обоснован нижний предел содержания суммы флавоноидов, рекомендованный для включения в раздел «Числовые показатели» соответствующих проектов ФС на ЛРС.

5.3.2. Перспективы использования ВЭЖХ для целей стандартизации некоторых видов сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды.

Одним из самых перспективных методов для целей стандартизации является ВЭЖХ, позволяющая одновременно решать вопросы определения подлинности ЛРС и фитопрепаратов, а также количественного определения содержания флавоноидов. Объектами исследования служили промышленные образцы ЛРС, а также собранные и высушенные на воздухе образцы сырья видов фармакопейных растений, содержащих флавоноиды: цветки бессмертника песчаного, цветки пижмы обыкновенной и листья гинкго двулопастного. В случае цветков бессмертника песчаного актуальность разработки методики количественного определения изосалипурпозида методом ВЭЖХ обусловлена тем, что данное сырье рекомендовано в качестве источника получения ГСО изосалипурпозида. В ходе разработки методики количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного, как отмечалось, изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также растворов изосалипурпозида (9), салипурпозида (4), 5,7-дигидроксифталида (30) и 5-метокси-7-гидроксифталида (31), выделенных из цветков бессмертника песчаного.

В основу разработанной методики количественного определения содержания изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного положены следующие оптимальные параметры: экстракция сырья 70 % спиртом этиловым в течение I часа в условиях кипения в соотношении 1:50.

Сравнение значений времени удерживания пиков веществ (пики 1-5) на ВЭЖХ-хроматограмме извлечения из цветков бессмертника песчаного (рис. 29) и времени удерживания пиков индивидуальных веществ, в частности, изосалипурпозида (рис. 30, табл. 5), позволило идентифицировать четыре соединения (4, 9, 30 и 31), среди которых доминирующим является изосалипурпозид (9).

1.1.1.1.1

5 А

2 4 'I / \ (

- 1 I 3 А \ /А А 1\т\ Ш ^ //ГШ ^ // \ Щ V \ \ \ I \1 \ \ 1 \\ и

^/Щ I I I V _

" - —

оэо 2.ООО 4.ООО 6 . ООО 8. ООО Ю.О

■с№1

т*1л шллш

т

Рис. 29. Схема ВЭЖХ-хроматограммы извлечения из цветков бессмертника песчаного

(номера пиков веществ соответствуют таковым в таблице 5)

ИсМД

О. ООО -.032

0.050 2.ООО 4.ООО 6.ООО 8.ООО ДО.ООО

Рис. 30. Схема ВЭЖХ-хроматограммы изосалипурпозида (9)

Таблица 5

Вещество № пика на хроматограмме Время удерживания ^¡О на хроматограмме извлечения, мин Время удерживания (1к) на хроматограмме вещества, мин

Изосалипурпозид (9) 5 7,198 7,399

Салипурпозид (4) 3 3,795 3,976

5,7-Дигидроксифталид (30) 2 2,919 3,221

5-Метокси-7-гидроксифталид (31) 4 4,832 5,285

Вещество неидентифицированное 1 2,215 -

С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов цветков бессмертника песчаного и определено, что содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного варьирует от 1,56 % до 1,78 %.

С учетом межлабораторной воспроизводимости метрологические характеристики разработанной методики ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,75 % (хроматограф «Милихром-5») и ±4,17 % (хроматограф «Стайер») (таблица 6).

Таблица 6

Метрологические характеристики методики количественного определения

изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного

/ X 5 Р, % АХ Е, %

Хроматограф «Милихром-5»

10 1,67 0,0356 95 2,23 ±0,08 ±4,75

Хроматограф «Стайер»

10 1,59 0,0297 95 2,23 ±0,07 ±4,17

В случае цветков пижмы обыкновенной актуальность использования метода ВЭЖХ обусловлена тем, что в качестве маркера может выступать доминирующий флавоноид тилианин (13). Результаты ВЭЖХ-анализ в предложенных условиях показали, что тилианин, имея время удерживания на хроматограммах около 5 мин, четко отделяется от других компонентов. Это позволяет рекомендовать данный метод для целей идентификации цветков пижмы обыкновенной, а также для количественной оценки содержания данного диагностического компонента.

Не меньший интерес представляет ВЭЖХ для анализа листьев гинкго двулопастного, так как позволяет обнаруживать одно из доминирующих, действующих и диагностически значимых компонентов - флавоноида гинкгетина (15). Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования гинкгетин (15) и изогинкгетин с величиной времени удерживания около 6 мин хорошо отделяется от других компонентов листьев гинкго двулопастного, что позволяет рекомендовать данный метод для целей идентификации листьев гинкго двулопастного, а также для стандартизации препаратов на основе сырья данного растения. Стоит заметить, что за рубежом

стандартизацию сырья данного растения осуществляют без учета наличия гинкгетина: методом ВЭЖХ обнаруживаются лишь продукты кислотного гидролизата - кемпферол, кверцетин и изорамнетин, что, на наш взгляд, является ошибочным подходом, поскольку данные флавоноидные агликоны широко встречаются в растениях и, следовательно, не обеспечивают достаточную специфичность методики.

6. Научное обоснование целесообразности создания новых лекарственных средств на основе сырья, содержащего флавоноиды Важнейшим направлением в области исследований флавоноидов является создание конкурентоспособных лекарственных препаратов, в том числе импортозамещающих. В этом отношении перспективным представляются не только растения, формально относящиеся к флавоноидам, но и целый ряд других видов, в случае которых флавоноиды представляют собой вторую группу БАС. 6.1. Классификация фармакопейных растений, содержащих флавоноиды

Поскольку флавоноиды играют не только роль действующих веществ, но и являются критерием качества сырья, а также выступают в качестве различных лекарственных субстанций, была разработана новая классификация фармакопейных растений, содержащих флавоноиды. Она позволяет учитывать всю совокупность БАС с точки зрения биологической активности, стандартизации и технологии получения лекарственных препаратов:

1. Фармакопейные растения, содержащие флавоноиды как ведущую группу биологически активных соединений растений.

2. Фармакопейные эфиромасличные растения, содержащие флавоноиды.

3. Фармакопейные растения, содержащие горечи и флавоноиды.

4. Фармакопейные растения, содержащие сапонины и флавоноиды.

5. Фармакопейные растения, содержащие витамины и флавоноиды.

6. Фармакопейные растения, содержащие простые фенолы и флавоноиды.

7. Фармакопейные растения, содержащие дубильные вещества и флавоноиды.

8. Фармакопейные алкалоидоносные растения, содержащие флавоноиды.

6.2. Перспективы создания лекарственных препаратов на основе флавоноидов Антиоксидантные, диуретические, ноотропные и анксиолитические свойства флавоноидов и полученных экстракционных препаратов, а также водных извлечений изучали на кафедре фармакологии им. заслуженного деятеля науки РФ, профессора A.A. Лебедева ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России.

Данная работа была проведена под руководством зав. кафедрой, профессора А.В.Дубищева.

6.2.1. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств Флавоноидов и

лекарственных препаратов на их основе

С точки зрения доказательной медицины среди флавоноидов к антиоксидантным лекарственным препаратам официально относится лишь диквертин (дигидрокверцетин), однако в этом отношении заслуживают внимания и другие флавоноиды, в частности, широко встречаемые в растениях кверцетин (21) и рутин (25). В качестве препаратов сравнения исследовали дигидрокверцетин (диквертин) и силибин. Оценку антиоксидантной активности препаратов осуществляли методом модельной интоксикации животных (белые лабораторные крысы обоего пола массой тела 200-260 г) четыреххлористым углеродом.

Определено, что на фоне токсического поражения печени четыреххлористым углеродом в наибольшей степени снижение уровня малонового диальдегида (МДА) наблюдается в случае препарата сравнения (дигидрокверцетин), хотя благоприятное воздействие отмечено и при использовании рутина, кверцетина и силибина. В ходе исследований выявлены некоторые отличия во влиянии исследуемых соединений на ферментативные звенья антиоксидантной защиты. Кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление лииидов в печени крыс в 1,3 раза и усиливает противоперекисную защиту за счет повышения активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза, 1,3 раза и 1,3 раза соответственно. Рутин в той же дозе оказывает антиоксидантное действие, проявляющееся в снижении содержания МДА в гомогенате в 1,3 раза, повышает активность каталазы в 1,2 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Особенности механизма антиоксидантного действия исследуемых флавоноидов можно объяснить тем, что дигидрокверцетин является флаванонолом, силибин - флаволигнаном, кверцетин - флавонолом, а рутин -флавоноловым гликозидом (З-О-рутинозид кверцетина).

Выявленные факторы с позиций зависимости «компонентный состав-фармакологическая активность» свидетельствуют о перспективности создания комбинированных антиоксидантных препаратов на основе кверцетина и рутина в сочетании с дигидрокверцетином и силибином.

6.2.2. Сравнительное исследование диуретической активности лекарственных форм из сырья, содержащего флавоноиды

Одной из актуальных задач медицины и фармации является поиск новых лекарственных препаратов, обладающих нефропротекторным действием. В этой связи проведено сравнительное с позиции зависимости «компонентный состав-фармакологическая активность» исследование диуретической активности водных извлечений из травы эрвы шерстистой, цветков пижмы обыкновенной, травы репешка аптечного, цветков бессмертника песчаного. При этом в качестве препаратов сравнения использовали отвар из листьев толокнянки обыкновенной и сухой экстракт травы зверобоя продырявленного. Поскольку рутин (25) является наиболее распространенным флавоноидом и, следовательно, компонентом, который потенциально может вносить свой вклад в спектр фармакологической активности суммарных препаратов, в сравнительном аспекте изучены особенности диуретической активности и для данного вещества.

Исследования были проведены на белых беспородных крысах обоего пола массой 200-250 г. Настои и настойки вводили животным в дозах 50 и 100 мг/кг за 4 ч и 24 ч эксперимента), сухой экстракт травы зверобоя продырявленного - в дозе 20 мг/кг за 24 ч опыта) и рутин - в дозе 10 мг/кг за 24 ч эксперимента. При этом исследовали почечную экскрецию натрия, калия и креатинина. Принимая во внимание то обстоятельство, что в исследуемых препаратах содержится рутин или близкие к нему по строению флавоноиды, нами сделано предположение, что рутин может обладать диуретическим действием или даже опосредовать его, поэтому исследовали и данный флавоноид. В ходе скрининга лекарственных форм из ЛРС был выявлен препарат с быстрым развитием диуретического эффекта и короткой продолжительностью действия (настой и настойка эрвы в дозе 50 мг/кг), препараты с быстрым развитием эффекта и длительным действием (настой цветков пижмы в дозе 50 мг/кг, настой и настойка бессмертника в дозе 50 мг/кг) и препараты с длительным латентным периодом и продолжительным действием (отвар толокнянки в дозе 100 мг/кг, настой репешка в дозе 50 мг/кг, сухой экстракт зверобоя в дозе 20 мг/кг и рутин в дозе 10 мг/кг). Для настоя эрвы были также установлены антидиуретические дозы - 50 и 100 мг/кг в 24-х часовом эксперименте.

6.2.3. Исследование нейротропных свойств препаратов на основе листьев гинкго двулопастного

В настоящее время в медицинской практике широко применяются ноотропные средства («Танакан», «Билобил», «Мемоплант» и др.), получаемые из

листьев гинкго двулопастного, однако практически все они являются зарубежными дорогостоящими препаратами. В этой связи проведены исследования по широкому спектру нейротропной активности, включая ноотропные и анксиолитические свойства в отношении образцов настоек (1:5) на 40 % и 70 % спирте этиловом, полученные из листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Краснодарском крае и Московской области. В качестве препарата сравнения использовали «Танакан» (на основе сухого стандартизированного экстракта гинкго двулопастного ЕОЬ 761). Действие препаратов в дозе 100 мг/кг исследовали на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-250 г. Контрольные животные получали воду очищенную с добавлением спирта этилового в эквивалентной массе 100 мг/кг и концентрации (40% и 70%) для тестируемых настоек и «Танакана». Оценку нейротропного действия проводили с использованием теста воспроизведения условного рефлекса активного избегания (УРАИ), теста «открытое поле» (ОП) и теста «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ).

Результаты по изучению ноотропной активности указывают на способность препаратов гинкго двулопастного оказывать оптимизирующее влияние на когнитивные процессы, ускорять образование условных связей и обеспечивать сохранение выработанного навыка на достаточно долгое (несколько суток) время. Впервые выявлена анксиолитическая активность препаратов гинкго из отечественного сырья, причем наибольшую эффективность показала настойка гинкго на 70% спирте этиловом, тогда как «Танакан» (препарат сравнения) оказался неэффективным в данной методике. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при создании импортозамещающих ноотропных препаратов следует идти не по пути воспроизводства технологии получения зарубежных препаратов на основе листьев гинкго двулопастного, а с использованием способа, позволяющего оптимизировать извлечение действующих веществ, в том числе флавоноидов сырья данного растения. В этом отношении заслуживает внимания тот факт, что флавоноид гинкгетин, выделенный нами из листьев гинкго двулопастного, также обладает выраженной ноотропной активностью.

Таким образом, лекарственные растения, содержащие флавоноиды, являются перспективным источником таких важных фармакологических групп, как антиоксиданты, диуретики, ноотропы и анксиолитики.

ВЫВОДЫ

1. В результате фармакогностических, химических, аналитических и фармакологических исследований впервые разработаны принципы классификации лекарственного сырья фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, позволяющие учитывать совокупную значимость всех основных групп БАС с точки зрения проявления фармакологической активности, химической стандартизации, определения параметров качества и путей рационального использования.

2. В результате анатомо-морфологического исследования некоторых видов сырья фармакопейных растений (бессмертника песчаного цветки, пижмы обыкновенной цветки, травы репешка), содержащих флавоноиды, выявлены новые диагностические признаки, позволяющие более объективно осуществлять идентификацию данных видов сырья.

3. Из лекарственного растительного сырья «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Горца почечуйного трава», «Перца водяного трава», «Боярышника кроваво-красного цветки и плоды», «Репешка аптечного трава» впервые выделено и изучено 31 индивидуальное вещество, относящееся к флавоноидам, фенилпропаноидам и фталидам, среди которых два флавоноида (персикохалкон и полигохалкон) являются новыми природными соединениями.

4. С использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также различных химических превращений изучено строение 31 индивидуального вещества: онисилин (5-гидрокси-6,7-диметоксифлаванон), пиностробин (5-гидрокси-7-метоксифлаванон), салипурпозид (5-0-р-Б-глюкопиранозид нарингенина), прунин (7-О-р-Б-глюкопиранозид нарингенина), персикохалкон (б'-гидрокси-2',4'-днметоксихалкон), полигохалкон (г'.б'-дигидрокси-*1^1-диметоксихалкон), г^б'дигидрокси-З'^'-диметоксихалкон, изосалипурпозид (6-О-р-Б-глюкопиранозид 4,21,41,61-тетрагидроксихалкона), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), космосиин (7-О-р-О-глюкопиранозид апигенина), витексин (8-С-Р-Б-глюкопираноизид апигенина), акацетин (5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавон), тилианин (7-О-р-Б-глюкопиранозид акацетина), гинкгетин (7,4'-диметиламентофлавон), лютеолин (5,7,3'^'-тетрагидроксифлавон), цинарозид (7-о-р-Б -глюкопиранозид лютеолина), кемпферол (3,5,7,4 -тетрагидроксифлавон), астрагалин (З-О-Р-Б-глюкопиранозид кемпферола), никотифлорин (З-О-рутинозид кемпферола), кверцетин (3,5,7,3'^'-пентагидроксифлавон), изокверцитрин (З-О-Р-Б-глюкопиранозид кверцетина), кверцитрин (З-О-а-Ь-

рамнопиранозид кверцетина), гиперозид (З-О-Р-Б-галактопиранозид кверцетина), рутин (З-О-рутинозид кверцетина), изорамнетин (ЗДУД'-тетрагидрокси-З1-метоксифлавон), нарциссин (З-О-рутинозид изорамнетина), хлорогеновая кислота, кофейная кислота, 5,7-дигидроксифталид, 5-метокси-7-гидроксифталид.

5. Изучены зависимости спектральных характеристик от химической структуры флавоноидов фармакопейных растений и компонентного состава лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, заключающиеся в корреляции характера и максимумов кривой поглощения электронных спектров со строением флаванонов, халконов, флавонов и флавонолов.

6. На основе результатов сравнительного изучения химического состава сырья и лекарственных препаратов фармакопейных растений, содержащих флавоноиды, теоретически и экспериментально научно обоснованы методологические подходы к стандартизации ЛРС, содержащего флаваноны, халконы, флавоны, флавонолы, заключающиеся в комплексном и адекватном использовании аналитических методов - ТСХ, ВЭЖХ, спектрофотометрии с использованием соответствующих Государственных стандартных образцов веществ (изосалипурпозид, пиностробин, цинарозид, гиперозид, рутин).

7. Предложены новые подходы к стандартизации ряда официнальных видов ЛРС, содержащих флавоноиды, и обосновано использование в разработанных методиках качественного и количественного анализа сырья и препаратов, содержащих преимущественно флаваноны (перца водяного трава), халконы (бессмертника песчаного цветки), флавоны (пижмы обыкновенной цветки), флавонолы (горца почечуйного трава, боярышника кроваво-красного цветки и плоды, липы цветки, эрвы шерстистой трава, репешка аптечного трава) Государственных стандартных образцов изосалипурпозида (халкон), пиностробина (флаванон), цинарозида (флавон), гиперозида и рутина (флавонол).

8. Изучены зависимости «химический состав-фармакологическая активность» для ЛРС, содержащего флавоноиды, с целью создания лекарственных препаратов с антиоксидантным, нейропротекторным и диуретическим спектрами действия.

9. В ходе исследований диуретической активности водных извлечений из ЛРС выявлен препарат с быстрым развитием диуретического эффекта и короткой продолжительностью действия (настой эрвы и настойка эрвы), препараты с быстрым развитием эффекта и длительным действием (настой пижмы, настой и настойка бессмертника) и препараты с длительным латентным

периодом и продолжительным действием (отвар толокнянки, настой репешка, сухой экстракт зверобоя и рутин).

10. В результате сравнительного исследования ноотропной и анксиолитической активности лекарственных препаратов — образцов настоек, полученных на 40 % и 70 % спирте этиловом из листьев гинкго двулопастного, а также препарата сравнения «Танакан», определено, что лекарственный препарат «Гинкго двулопастного настойка» (1:5) на 70 % спирте этиловом проявляет более выраженные ноотропные и анксиолитические свойства по сравнению с фармакологическими эффектами исследуемых аналогов, в том числе препарата сравнения «Танакан». Впервые выявлена анксиолитическая активность для препаратов гинкго из отечественного сырья, причем наибольшую эффективность, как и в случае ноотропного эффекта, показала настойка гинкго на 70% спирте этиловом.

11. Экспериментально обоснованы показатели качества лекарственного растительного сырья и ГСО изосалипурпозида, использованные при разработке проектов фармакопейных статей «Бессмертника песчаного цветки», «Пижмы обыкновенной цветки», «Гинкго двулопастного листья» и «Изосалипурпозид-стандартный образец», для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

12. С учетом результатов фармакогностических, химических, технологических и фармакологических исследований была обоснована целесообразность создания на основе исследуемых флавоноидосодержащих видов лекарственного растительного сырья антиоксидантных, диуретических, ноотропных, анксиолитических лекарственных средств, в том числе импортозамещающих препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кулагин, O.JI. Антиоксидантная активность некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды / O.JI. Кулагин, В.А. Куркин, Н.С. Додонов, A.A. Царева, Е.В. Авдеева, A.B. Куркина и др. // Фармация. - 2007. - Т. 55, № 2. - С. 30-32.

2. Куркина, A.B. Фитохимическое исследование сырья и препаратов бессмертника песчаного / A.B. Куркина // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - Самара. - 2007. - Т. 2. - С. 177-182.

3. Куркин, В.А. Антиоксидантная активность некоторых тонизирующих и гепатопротекторных фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / В.А. Куркин, O.JI. Кулагин, Н.С. Додонов, A.A. Царева, Е.В. Авдеева, A.B. Куркина и др. // Растительные ресурсы. - 2008. - Т. 44, вып. 1. - С. 122-129.

4. Куркина, A.B. Новые подходы к стандартизации сырья бессмертника песчаного — Heiichrysum arenarium (L.) Moench. / A.B. Куркина // Традиционная медицина. — 2010. -№ 1 (20).-С. 45-49.

5. Куркина, A.B. Методика определения суммы флавоноидов в цветках пижмы / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова// Фармация.-2010. -Т. 58, № 3. - С. 21-24.

6. Куркина, A.B. Актуальные аспекты стандартизации сырья и препаратов пижмы обыкновенной / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова // Медицинский альманах. - 2010. - № 2 (И).-С. 322-326.

7. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного растительного сырья / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, O.E. Правдивцева,

B.Б. Браславский, A.B. Куркина и др. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2010. -Т.12, № 1(3). - С. 737-740.

8. Куркина, A.B. Актуальные аспекты стандартизации эфиромасличного лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды // Традиционная медицина. - 2010. — №3(22).-С. 176-179.

9. Куркина, A.B., Микроскопическое исследование цветков бессмертника песчаного / A.B. Куркина, Л.В. Тарасенко, В.М. Рыжов // Медицинский альманах. — 2010. - № 4 (13). —

C.70-72.

10. Куркина, A.B. Новые подходы к стандартизации сырья эрвы шерстистой / A.B. Куркина, A.A. Осипова//Химия растительного сырья. - 2010. — № 2. - С. 117-121.

11. Куркина, A.B. Актуальные аспекты стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды / A.B. Куркина // Бюллетень сибирской медицины (Bulletin of Siberian medicine). -2011. -№ 5. - С. 150-153.

12. Куркина, A.B. Содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного / A.B. Куркина, В.М. Рыжов, Е.В. Авдеева// Фармация. — 2011. - Т. 59, № 1. - С. 12-14.

13. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих лекарственных растительных препаратов / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, A.B. Дубщцев, О.Л. Кулагин, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Традиционная медицина. -2011. - № 5 (28). -С.230-232.

14. Куркина, A.B. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на основе флавоноидов / A.B. Куркина // Традиционная медицина. -2011. -№ 5 (28). - С. 232-239.

15. Куркина, A.B. Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве репешка аптечного / A.B. Куркина // Химико-фармацевтический журнал. — 2011. - Т. 45, №1.-С.31-34.

16. Куркина, A.B. Исследование компонентного состава цветков Heiichrysum arenarium (L.) Moench. / A.B. Куркина//Химия растительного сырья. —2011. -№ 2. — С. 113-116.

17. Куркина, A.B. Исследование флавоноидного состава цветков пижмы обыкновенной (!Tanacetum vulgare L.) / А.В. Куркина // Химня растительного сырья. - 2011. — Часть II. -№4.-С. 209-212.

18. Куркина, A.B. Флавоноиды цветков Tanacetum vulgare / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова, Е.Д. Даева, В.И. Каденцев // Химия природных соединений. - 2011. - № 2. - С. 256257.

19. Куркина, A.B. Перспективы использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного / A.B. Куркина, В.М. Рыжов, Е.В. Авдеева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13. - № 1 (8). -С. 2015-2020.

20. Куркина, A.B. Репешок аптечный - перспективный сырьевой растительный источник гепатопротекгоров / A.B. Куркина, К.А. Васякина // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2012. - Т. 14, № 1 (9). — С. 2184-2186.

21. Куркина, A.B. Современная стандартизация как методологическая основа рационального использования ресурсов лекарственных растений, содержащих флавоноиды / A.B. Куркина // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2012. - Т. 14, № 1 (9). - С. 2253-2256.

22. Куркина, A.B. Актуальные вопросы химической стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды / A.B. Куркина // Фармация. - 2012. - Т. 60, № 7. -С. 44-48.

23. Куркина, A.B. Гинкго двулопастный - перспективный источник импортозамещающих ноотропных лекарственных препаратов / A.B. Куркина, Д.В. Корчагина, A.B. Дубшцев и др. //Традиционная медицина. -2012.-№ 5,- С. 261-265.

24. Куркина A.B., Определение содержания изосалипурпозида в сырье и препаратах бессмертника песчаного/ A.B. Куркина, В.М. Рыжов, Е.В. Авдеева // Химико-фармацевтический журнал. -2012. - Т. 46, К» 3, - С. 28-33.

25. Куркина, A.B. Подходы к стандартизации сырья, содержащего флавоноиды / A.B. Куркина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2013. - № 5. -С.38.

26. Куркина, A.B. Актуальные аспекты морфолого-анатомического анализа лекарственного растительного сырья пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) / A.B. Куркина, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко, А.И. Хусаинова // Фундаментальные исследования. -2013 -№ 8 (6). - С. 1420-1425.

27. Куркина, A.B. Состав и содержание флавоноидов в листьях Ginkgo biloba (Ginkgoaceae), культивируемого в различных регионах России / A.B. Куркина, Н.В. Загоскина, Т.К. Рязанова // Растительные ресурсы. - 2013. - Т. 46, вып. 3. - С. 410-415.

28. Kurkina, A.V. Flavonoids from Tanacetum vulgare flowers / A.V. Kurkina, A.I. Khusainova, E.D. Daeva, V.l. Kadentsev//Chemistry of Natural Compounds. -2011 - Vol 47 No 2 -P. 284.

29. Kurkina, A.V. A method for assay of total flavonoids on common agrimony herb / A.V. Kurkina //Pharmaceutical Chemistry Journal.-2011,- Vol. 45, No. 1. -P. 43-46.

30. Kurkina, A.V. Assay of isosalipurposide in raw material and drugs from dwarf everlast (.Heiichrysum arenarium) / A.V. Kurkina, V.M. Ryzhov, E.V. Avdeeva // Pharmaceutical Chemistry Journal. -2012. - Vol. 46, No. 3. -P. 171-176.

31.Куркин, B.A. Флавоноиды как стандартные вещества растений / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, В.Н. Ежков, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям. -Москва, 2004.-С.101.

32. Кадацкая, Д.В. Экспериментальная оценка влияния фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, на центральную нервную систему / Д.В. Кадацкая, A.B. Дубшцев, В.А. Куркин, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: материалы 59-й Межрегиональной конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2004. - С. 277-278.

33. Куркин, В.А. Современные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Е.В. Авдеева O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Материалы II Всероссийского съезда фармацевтических работников. - Сочи, 2005. - С. 95-96.

34. Куркина, A.B. Флавоноиды как перспективный источник экопротекторов / A.B. Куркина // Проблемы выживания человека в техногенной среде современных городов: труды XI Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека». - Самара 2006 - С 159160.

35. Куркина, A.B. Современные принципы разработки новых лекарственных препаратов в фармации / A.B. Куркина // Материалы I Международного съезда фитотерапевтов -Москва, 2006. - С. 152-154.

36. Куркина, A.B. Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного / A.B. Куркина // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы 1П Всероссийской конференции Книга 2 -Барнаул, 2007. - С. 250-253.

37. Куркина, A.B. Современные аспекты стандартизации цветков бессмертника песчаного / A.B. Куркина // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: материалы II Международной научной конференции. - Алматы, Казахстан 2007 - С 212.

38. Куркин, В.А. Подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // XV Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. — Москва, 2008. — С. 545-546.

39. Куркина, A.B. Новые подходы к стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного / A.B. Куркина // Химия и технология растительных веществ: тезисы докладов V Всероссийской научной конференции. - Уфа, 2008. - С. 183.

40. Куркина, A.B. Фармакогностическое изучение цветков бессмертника песчаного / A.B. Куркина // Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы VII Международного симпозиума по фенольным соединениям.-Москва, 2009. -С. 138-139.

41. Куркина A.B. Микроскопическое исследование сырья бессмертника песчаного / A.B. Куркина, Л.В. Тарасенко, В.М. Рыжов / Материалы научных трудов I съезда натуротерапевтов России. — Москва, 2009. - С. 136-138.

42. Куркин, В.А. Лекарственные растения как источник импортозамещающих, гепатопротекторных, антиоксидангных, иммуномодулирующих и нейротропных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Новые и нетрадиционные растения и перспектива их использования: материалы VIII Международного симпозиума. —Москва, 2009. - С. 360-363.

43. Куркин, В.А. Актуальные аспекты использования государственных стандартных образцов в фармацевтическом анализе лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // XVII Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. -Москва, 2010. - С. 658-659.

44. Куркин, В.А., Флавоноиды и фенилпропаноиды - перспективные антиоксиданты лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. II Биоантиоксидант: тезисы докладов VIII Международной конференции. - Москва, 2010.-С. 241-243.

45. Куркин, В.А., Авдеева Е.В., Браславский В.Б., Правдивцева O.E., Куркина A.B. и др. Флавоноиды и фенилпропаноиды как биологически активные соединения лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Актуальные проблемы химии природных соединении: сборник тезисов I конференции. - Ташкент, 2010. - С. 8.

46. Куркина, A.B. Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов пижмы обыкновенной / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова // 65-ая Межрегиональная конференция по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»: сборник научных трудов. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. -С. 333-341.

47. Куркин, В.А. Перспективы создания и внедрения импортозамещающих лекарственных растительных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. — Москва, 2011, — С. 507.

48. Куркина, A.B. Актуальные аспекты стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды / A.B. Куркина // Материалы Межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета Сибирского государственного медицинского университета. - Томск, 2011. -С.86-90.

49. Куркина, A.B. Новые подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды. 1. Пижма обыкновенная / A.B. Куркина // 65-ая Межрегиональная конференция по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»: сборник научных трудов.-Пятигорск, 2011. - Вып. 66.-С. 134-137.

50. Куркина, A.B. Новые подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды. 2. Бессмертник песчаный / A.B. Куркина // Современная

фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты: материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета. - Самара, 2011. — С. 130-132.

51. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих нейротропных, иммуномодулирующих, антиоксидантных и гепатопротекторных препаратов / В.А. Куркин, A.B. Дубищев, O.JI. Кулагин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина и др. // Материалы научных трудов II съезда натуротерапевтов России. Научно-практическая конференция «Средства и методы традиционной медицины в России». -Москва, 2011. - С. 23-24.

52. Куркина, A.B. Флавоноиды как критерий качества лекарственного растительного сырья / A.B. Куркина, К.А. Васякина, А.И. Хусаинова // Современные проблемы химической науки и образования: материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева. - Чебоксары 2012 -Т.2. - С.153-154.

53. Куркина, A.B. Перспективные направления в области стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / A.B. Куркина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов 67-ой межрегиональной конференции по фармации и фармакологии. -Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 60-62.

54. Куркина, A.B. Анатомо-морфологическое исследование цветков пижмы обыкновенной / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова // Материалы Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых. Харьков, 2012.-Т. 1.-С. 124.

55. Авдеева, Е.В. Лекарственные растения, содержащие флавоноиды, как сырьевые источники гепатопротекторов / Е.В. Авдеева, A.B. Куркина, В.М. Рыжов // XIX Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов — Москва, 2012. - С. 347.

56; Куркина, A.B. Совершенствование химической стандартизации фармакопейных растений, содержащих флавоноиды / A.B. Куркина // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы V Всероссийской конференции с международным участием. - Барнаул, 2012. - С. 307-308.

57. Куркина, A.B., Корчагина Д.В., Дубищев A.B., Куркин В.А. Сравнительная оценка ноотропного действия препаратов пшкго двулопастного / A.B. Куркина, Д.В. Корчагина, A.B. Дубищев, В.А. Куркин // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, 2012. - Т. 1. - С. 95.

58. Куркина, A.B. Флавоноиды как критерий качества лекарственного сырья и препаратов фармакопейных растеши! / A.B. Куркина // Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты: материалы докладов VIII Международного симпозиума. - Москва 2012. - С. 571-577.

59. Куркина, A.B. Совершенствование методов стандартизации цветков пижмы обыкновенной / A.B. Куркина, А.И. Хусаинова // Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. -Волгоград, 2012. - С. 81-82.

60. Зайцева, E.H. Анализ действия водных извлечений на основе сырья толокнянки, эрвы, пижмы, репешка и бессмертника на экскреторную функцию почек / E.H. Зайцева, A.B. Куркина // Проблемы разработки новых лекарственных средств: сборник тезисов первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Москва 2013 -С.ЗО.

61. Куркина, A.B. Изучение анксиолитической активности гинкго двулопастного / A.B. Куркина, Д.В. Корчагина, О.Н. Кочнева, Д.О. Гусев // Проблемы разработки новых лекарственных средств: сборник тезисов первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Москва. 2013.-С. 55.

62. Куркина, А.В. Флавоноиды фармакопейных растений: Монография / А.В. Куркина. -Самара: ООО «Офорт», ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, 2012.-290 с.

63. Куркина, А.В. Анатомо-морфологическая диагностика цветков пижмы обыкновенной / А.В. Куркина //Modem Phytomorphology. - 2013. - Vol. 4.-P. 245-248.

64. Kurkin, V.A. Phytochemical and pharmacological investigation of some medicinal plants containing flavonoids / V.A. Kurkin, A.V. Dubishev, O.L. Kulagin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, AV. Kurkina et al.// Polyphenols Communications 2006;

XXIII International Conference on Polyphenols, Winnipeg, Manitoba-Canada. - 2006. - P. 513.

65. Kurkina, A.V. Problems of standardization of flowers and pharmaceuticals of Helichrysum arenaruim (L.) Moench. / A.V. Kurkina // 50 years anniversary S. Yunusov Institute of the Chemistry of Plant Substance; 7th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds, Tashkent-Uzbekistan, 2007.-P. 392.

66. Kurkin,V.A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids and phenylpropanoids / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina et al. // Polyphenols Communications 2008;

XXIV International Conference on Polyphenols, Salamanca-Spain, 2008. - P. 185-186.

67. Kurkin, V.A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing flavonoids / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina et al. // Polyphenols Communications 2010; XXV International Conference on Polyphenols, Montpellier-Franee. - 2010. - P. 548-549.

68. Kurkin, V.A. The flavonoids as the criteria of the identity and quality of the medicinal plants and phytopharmaceuticals / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, A.V. Kurkina et al. // World Congress 2013 «Drug Discovery & Therapy» (3-6 June 2013, Boston, MA, USA): Abstracts. -2013.-P. 170.

69. Куркин, В.А. Средство для лечения заболеваний пародонта и способ его получения / В .А. Куркин, Е.М. Бурова, В.Н. Ежков, А.В. Куркина, Е.В. Авдеева // Патент РФ № 2147223. - А 61 К 7/26, 35/78. - Бюл. изобр. № 10 от 10.04.2000 г.

70. Куркин, В .А. Способ получения средства «Боярышника настойка» / В.А. Куркин, А.В. Куркина //Патент РФ №2435604,- А61 К 36/734. - Бюл. изобр. № 34 от 10.12.2011 г.

Сдано в набор 04.09.2013. Подписано в печать 04.09.2013. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Объем 2,6 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 1447. Самарский государственный медицинский университет 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89. Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П Тел.: 8-(846)-372-00-56; 8-(846)-372-00-57.