Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск антагонистов пуриновых рецепторов тромбоцитов среди конденсированных производных бензимидазола и изучение их фармакологических свойств

На правах рукописи 0'

□03053512

СТУКОВИНА АННА ЮРЬЕВНА

ПОИСК АНТАГОНИСТОВ ПУРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ТРОМБОЦИТОВ СРЕДИ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК-2007

003053512

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: Член-корреспондент РАМН, заслуженный

деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Батурин Владимир Александрович

кандидат фармацевтических наук, доцент Кулешова Светлана Анатольевна

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 13 февраля 2007 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357533, г.Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан « ]Ь » Лк8о.р£ 2007 г-Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор ^ V Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения регуляции функциональной активности тромбоцитов, ведущие к увеличению тромбогенного потенциала крови, могут быть причиной тромбоэмболии сосудов головного мозга, легких, почек (Духанин A.C., Губаева Ф.Р., 1998; Суслина З.А., Танашян М.М., 2003; Deepak L., Topol В.& Е., 2003). Показано участие тромбоцитарного звена в патогенезе заболеваний, сопровождающихся диссеминированным внутрисосудистым свёртыванием крови, а также атеросклероза (Панченко Е.П., 2005; Rauch U. et al., 2001), ишемической болезни сердца (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1996; Лупанов В.П., 2005; Steimle А.Е., Lange R.A., Hillis L.D., 2004), диабетической ангиопатии (Балаболкин М.И., 2000; Вае S.H. et al., 2003; Matsuno H. et al, 2004). Несмотря на достаточно большой арсенал антитромботических средств, лекарственным препаратом первого выбора по-прежнему остаётся кислота ацетилсалициловая (Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В., 1996; Остроумова О.Д., 2003; Stein P.D. et al., 2004), однако выраженные побочные явления (геморрагические осложнения, ульцерогенное действие), развитие резистентности и способность лекарственного препарата блокировать только циклооксигеназный путь тромбообразования существенно ограничивают ее применение (Скворцова В.И., Стаховская JI.B., 2004). В связи с этим фармакологическое изучение новых высокоэффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов являются актуальными для современной медицины.

В настоящее время накоплен обширный фактический материал, свидетельствующий о том, что Р2-пуринорецепторы могут представлять собой мишень для фармакологического воздействия (Зиганшин А.У., Зиганшина JI.E., Бернсток Дж., 2002; Burstock G., Wood J.N., 1996; Ziganshina L.E. et al., 1996; Collo G. et al., 1997; Bodin P., Burnstock G., 1998; Inoue K., 1998; Dunn P.M., 2000; Mulryan К. et al., 2000; Bogousslavsky J., 2001) и создания лекарственных средств принципиально нового механизма действия (Spedding M., Williams M., 1996). Многообразие подтипов Р2-рецепторов делает возможным разработку

органо- или тканеспецифичных препаратов, направленно моделирующих те или иные функции (Зиганшин А.У., Зиганшина Л.Е., Бернсток Дж., 2002). На мембране тромбоцитов имеются три подтипа пуринорецепторов: Р2ХЬ P2Y) и P2Y|2 (Khakh B.S. et al., 2001). P2Y!-рецепторы играют ключевую роль в тромбообразовании и представляют возможную мишень для создания лекарственных препаратов, препятствующих реализации данного процесса на стадии обратимой агрегации тромбоцитов (Kunapuli S.P. et al., 2003). При блокаде Р2Уп-рецепторов тромбоцитов не происходит связывание АДФ с рецепторами и активируемое гликопротеиновым комплексом IIb/Ша взаимодействие тромбоцитов, являющееся заключительным этапом агрегации при воздействии любого активатора (Paul B.Z. et al., 1999; Kunapuli S.P. et al., 2003).

Химический класс производных бензимидазола считается перспективным для разработки эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов (Riviere М., 1997; Saczewski F., 1998; Chackalamannil S. et al., 2003). В исследованиях, проведенных в Волгоградском государственном медицинском университете, установлена способность ряда производных бензимидазола блокировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Турчаева А.Ф., 1995; Дудченко Г.П., Спасов А.А., Анисимова В.А., 1995). Учитывая данный факт, а также сходство химического строения с пуриновыми лигандами, представляется интересным поиск веществ, избирательно блокирующих пуриновые рецепторы тромбоцитов, в частности, P2Y, и Р2У,2-подтипы, среди конденсированных производных бензимидазола.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом НИР Волгоградского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.20.02 15606). Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета университета (протокол №1 от 14.01.2004 г.).

Цель исследования. Целью настоящего исследования является поиск антагонистов Р2У-рецепторов тромбоцитов среди конденсированных

производных бензимидазола и изучение фармакологических свойств наиболее активных соединений.

Задачи исследования.

1. Проведение поиска веществ, демонстрирующих антагонистическую активность к тромбоцитарным Р2Угпуриновым рецепторам.

2. Анализ зависимости между структурой и функциональной активностью исследованных соединений по отношению к Р2У, - подтипу пуриновых рецепторов тромбоцитов.

3. Изучение влияния наиболее активных соединений на Р2Х| и Р2У,2 подтипы рецепторов тромбоцитов.

4. Исследование влияния наиболее эффективных соединений на показатели сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза у интактных животных.

5. Изучение антитромботических свойств наиболее активных соединений на моделях артериального тромбоза (индуцированного хлоридом железа (III), электрическим током)

6. Выявление антитромботических свойств соединений на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза.

Научпая новизна. Впервые проведено исследование способности ряда новых веществ, конденсированных производных бензимидазола, блокировать различные подтипы Р2-рецепторов тромбоцитов. Проведен анализ зависимости между химической структурой веществ и выраженностью антагонистических свойств по отношению к Р2У) - рецепторам мембраны тромбоцитов. Установлено, что наибольшими Р2У| - антагонистическими свойствами среди исследованных соединений обладают Мрморфолиноэтилзамещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола, при этом уменьшение полярности заместителя во втором положении гетероциклического ядра способствует повышению Р2Ур блокирующей активности. Полученные результаты исследований могут явиться основой для проведения целенаправленного поиска новых субстанций со свойствами лигандов пуриновых рецепторов. Впервые получены данные о

влиянии соединений РУ-722 и РУ-286 на изменение функциональной активности тромбоцитов при действии агонистов пуриновых рецепторов: АДФ и 2-метилтио-АТФ, на сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз. Показано, что соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют антитромботические свойства на моделях тромбоза различного генеза.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска антиагрегантных веществ, блокирующих Р2У-рецепторы тромбоцитов, среди конденсированных бензимидазольных систем. Результаты выявленных закономерностей между Р2У-антагонистической активностью производных бензимидазола и их химической структурой могут служить основой для направленного поиска веществ, обладающих данным видом фармакологической активности.

Выявленные эффекты соединений РУ-722 и РУ-286, превосходящие по величине активности тиклопидин, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований данных веществ с целью создания на их основе новых лекарственных препаратов, обладающих антиагрегантными свойствами.

Реализация результатов исследования. По результатам исследований разработаны информационное письмо «Зависимость между P2Yr антагонистической активностью и химической структурой кондесированных производных бензимидазола», внедренное в план работы НИИ ФОХ при ГОУ ВПО «Ростовский государственный университет» (акт внедрения от 10.09.2006), информационное письмо «Антиагрегантные и антитромботические свойства новых соединений - производных имидазо[1,2-а] бензимидазола РУ-722 и РУ-286, блокирующих Р2У-рецепторы тромбоцитов», внедренное в план работы НИИ Фармакологии ВолГМУ и Волгоградского научного центра РАМН и ABO (акты внедрения от 05.09.2006). Материалы информационного письма «Антиагрегантные и антитромботические свойства новых производных имидазо[1,2-а] бензимидазола, блокирующих Р2У-рецепторы тромбоцитов» внедрены в план работы кафедр фармакологии Кубанского государственного

медицинского университета (акт внедрения от 08.09.2006), Саратовского государственного медицинского университета (акт внедрения от 07.11.2006), а также кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (акт внедрения от 06.09.2006).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Игморфолинозтилзамещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола перспективная группа химических соединений для поиска новых высокоэффективных Р2У, - антагонистов.

2. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженную антипуринергическую активность, блокируя изменения функциональной активности тромбоцитов, вызванные агонистами Р2У-пуринорецепторов.

3. Соединения РУ-722 и РУ-286 ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ и коллагеном, при этом не влияя на коагулографические показатели.

4. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют антитромботические свойства е условиях целостного организма на тромбоцит-зависимых моделях артериального тромбоза (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), электрическим током), а также при внутривенном введении адреналина и коллагена.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 61 - 64-й итоговых научных конференциях студентов и молодых учёных ВолГМУ, Волгоград, 2003-2006 гг.; УШ-Х1 Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, Волгоград, 2003-2006 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 30 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), экспериментальной части (главы Ш-У), обсуждения

g

результатов (глава VI), выводов и списка литературы, включающего 202 источника, в том числе 152 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы

Объектами исследования являлись соединения, синтезированные в НИИ физической и органической химии Ростовского государственного университета1: Ng-замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола (26 соединений), Ni-замещенные имидазо[1,2-а] бензимидазола (12 соединений), Ni-замещенные бензимидазолина (6 соединений), ^-замещенные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (3 соединения), Ni-замещенные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (3 соединения), ^-замещенные триазоло[ 1,5-а]бензимидазола (2 соединения). В качестве препаратов сравнения использовались антагонисты Р2-рецепторов Basilen blue («Sigma», США), PPADS («Sigma», США), а также лекарственные препараты, блокирующие тромбоцитарные P2Y|2 - рецепторы -тиклопидин (Тиклид, "Sanofi-syntelabo", Франция) и клопидогрель («Sanofi-syntelabo», Франция).2

В качестве индукторов активации и агрегации тромбоцитов использовали динатриевую соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Реанал», Венгрия), неселективный агонист Р2У-рецепторов 2-метилтио-АТФ («Sigma», США), адреналина гидрохлорид ("Sigma", США), коллаген ("Sigma", США). При изготовлении буфера применяли натриевую соль этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА) («ICN», США), натрия хлорид (х.ч.), трис-(оксиметил)-аминометана гидрохлорид (х.ч) и кальция хлорид (ч.д.а) производства «Мосреактив» (Россия). Определение показателей коагулограммы крови проводилось с использованием стандартных наборов реактивов производства "Технология - стандарт" (Россия). Индуктором

' Выражаем искреннюю благодарность к.х.н., ведущему научному сотруднику В.А. Анисимовой и к.х.н, старшему научному сотруднику Т.А Кузьменко за за синтез и предоставление субстанции веществ.

2 Выражаем признательность фирме «Sanofi-syntelabo» (Франция) за любезно предоставленную субстанцию вещества клопидогрель.

тромбообразования при изучении антитромботической активности соединений являлся хлорид железа (III) (ч.) производства «Мосреактив» (Россия).

Экспериментальное исследование антипуринергической, антиагрегантной активности и влияния соединений на показатели коагулограммы выполнено на образцах плазмы 8 кроликов породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг и 120 нелинейных белых крысах обоего пола массой 270-320 г. Антитромботическая активность изучалась на 90 нелинейных белых крысах-самцах массой 330440 г. Для определения LD50 и моделирования генерализованного тромбоза использовались 120 белых неимбредных мышей-самцов, массой 20-26 г. Животные содержались в условиях вивария ВолГМУ на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96).

Методы исследования

Изучение функциональной активности тромбоцитов in vitro. Скрининг соединений, обладающих P2Yi - антагонистической активностью, изучение влияния на Р2-рецепторы тромбоцитов других подтипов, подтверждение P2Yi -антагонистической активности проводились с использованием метода малоуглового светорассеяния (Сакаев М.Р., Миндукшев И.В., 2001), позволяющим оценить все стадии трансформации тромбоцитов. Эксперименты проводились на лазерном анализаторе малоуглового светорассеяния «Лайт-скан» («Люмекс ЛТД», Россия) в солевой среде (140 мМ NaCl; ЮмМ трис-НС1 буфера; 1 мМ СаС12 или 5 мМ ЭДТА (pH 7,8)), с разбавлением плазмы, обогащенной тромбоцитами (концентрация тромбоцитов не превышала 107 клеток/мл). Активация тромбоцитов в присутствии 1 мМ СаС12 отражает эффективность действия исследуемых соединений на Р2Х,- и Р2Угрецепторы, а в безкальциевой среде (5мМ ЭДТА) - на P2Yi-рецепторы. Эффективность действия на пуриновые Р2У|2-рецепторы тромбоцитов оценивается по

ингибированию агрегации. В качестве индукторов использовались АДФ и селективный агонист Р2У-рецепторов 2-метилтио-АТФ. В качестве веществ сравнения использовались Reactive blue 2 (Basilen blue), PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновая кислота), а также лекарственные препараты тиклопидин и клопидогрель.

Антиагрегантная активность in vitro наиболее активных соединений по отношению к агрегации, индуцированной 5 мкМ АДФ, подтверждалась методом Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. (1989) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA) "Биола" (Россия)

Исследование сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза ex vivo. Исследуемые соединения, тиклопидин и клопидогрель вводились перорально в дозе, эквимоляльной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до забора крови под эфирным наркозом. Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (Россия) по методу Bom G. (1962) в модификации Габбасова ЗА. (1989). В качестве индукторов агрегации использовали АДФ (5 мкМ), адреналин (10 мкМ), коллаген (50 мг/кг). Хронометрически, на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) были определены показатели коагул ограмм ы: тромбиновое, протромбиновое, активированное парциальное тромбопластиновое время и содержание фибриногена (Баркаган З.С., Момот А.П., 1999).

Изучение антитромботических свойств соединений. Исследуемые соединения, тиклопидин и клопидогрель вводились перорально в дозе, эквимоляльной 6 мг/кг тиклопидина, за 2 часа до моделирования тромбоза. Воспроизведение моделей артериальных тромбозов проводилось под нембутаповым (35 мг/кг) наркозом с регистрацией уровня кровотока с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К» («СП Минимакс», С.-Петербург, Россия).3

3 Выражаем благодарность заведующему кафедрой фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета профессору, д м н. И.Н Тюренкову

Антитромботическая активность соединений на модели артериального тромбоза, индуцированного поверхностной аппликацией 50%раствора хлорида железа (III) (Kurz K.D., 1990) оценивалась по времени, необходимом для достижения 50%-ного уровня кровотока, времени до полной окклюзии сонной артерии, а также по средней объемной и средней линейной скорости кровотока.

Эффективность соединений на модели артериального тромбоза, индуцированного постоянным электрическим током (12В, 50 мА) (Guglielmi G. et al., 1991) оценивалась по времени до полной окклюзии каротидной артерии.

Генерализованный тромбоз (Giovanni Di Minno, Melvin J. Silver, 1983) вызывался введением смеси растворов коллагена и адреналина (0,5 мг/кг и 0,06 мг/кг соответственно) в хвостовую вену мышей. Критериями эффективности исследуемых соединений являлись количество выживших животных по сравнению с контрольной группой и наличие тромбов в сосудах легких.

Определение острой токсичности и расчет условного терапевтического индекса Острая токсичность соединений изучена на мышах при внутрибрюшинном введении. LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.

Результаты исследований подвергнуты статистической обработке с использованием парного критерия Стьюдента, точного критерия Фишера, критерия Манна-Уитни и ANOVA (Newman-Keuls test) в статистических программах «Statistika 6.0» и программного обеспечения Microsoft Excell 2000.

Результаты экспериментов и их обсуждение

В результате проведенного скрининга среди замещенных производных бензимидазола выявлено, что наиболее активной группой соединений, обладающих выраженными P2Yi-блокирующими свойствами, оказались Nr замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола (все соединения активны, 5 из 12 соединений проявили высокие антипуринергические свойства) (рисунок 1). Менее перспективна группа производных ^замещенных имидазо[1,2-а] бензимидазола (2 из 26 исследованных веществ высоко активны, 5 соединений - умеренно активны) и Ni-замещенные бензимидазолина (все соединения

проявляют Р2У|- антагонизм, 1 из 6 соединений высоко активно). Сравнивая N9- и М]-замещенные имидазо[ 1,2-а]бензимидазола, имеющие одинаковые заместители во втором положении конденсированного гетерецикла, можно отметить значительное увеличение активности при перемещении заместителя от 9 к 1 атому азота, эффект в значительной степени определяется типом заместителя у второго углеродного атома: уменьшение полярности радикала способствует повышению Р2У]-антагонистической активности соединений.

Рисунок ] - Частота встречаемости соединений, проявляющих высокую Р2Уг антагонистическую активность среди исследованных групп производных бензимидазола.

Примечание: заштрихованные области диаграммы отражают процентное соотношение количества соединений с активностью выше 20% по отношению ко всему количеству соединений в скриниге.

Для проявления данного вида биологической активности в ряду три циклических гетеро систем имеет значение строение заместителей у ключевого атома азота: характерной особенностью ям лете л более выраженная активность у морфолинэтил замещенных соединений по сравнению с их аналогами, имеющими диэтиламиноэтильный или пиперидипоэтильный заместитель. N9- и -замещенные 2,3- дигидроимидазо[ 1,2-а]бензимидазола и ^-замещенные триазоло] 1,5-а] бензимидазола оказались низкоактивными или

/ М^-гамещснные бевшмиэпша

N4-1 ям ещеиные Т]шан>ло|1,5-а] оетпнмпдтпла

0/2

неактивными соединениями. Выявленные закономерности могут явиться основой для направленного синтеза антагонистов Р2Угпуриновых рецепторов.

По результатам скрининга были выбраны соединения РУ-286, РУ-355, РУ-575, РУ-576, РУ-603, РУ-722, РУ-1185, РУ-1204, P2Y,-антагонистические свойства которых превышали эффект Basilen blue, обладающего неселективным антагонизмом по отношению к Р2У-рецепторам (V. Ravelic, J. Burnstok, 1998).

Несмотря на то, что к настоящему времени более 20 соединений описаны как Р2-антагонисты, ни одно из них не обладает достаточной селективностью к подтипам Р2-пуринорецепторов (Зиганшин А.У. и др., 2004). Для наиболее активных соединений проводилось изучение их влияния на Р2Х| - и P2Yn -пуринорецепторы (табл. 1).

Для оценки влияния на тромбоцитарные Р2Х|-рецепторы проводилась их активация в присутствии 1 мМ СаС12. Все соединения в концентрации Ю^М подавляли АДФ-индуцированную активацию тромбоцитов в кальциевой среде, однако эффект изученных веществ был значительно меньше, чем у PPADS (неселективного Р2Х-антагониста). Активация тромбоцитов в безкальциевой среде опосредуется только пуриновыми Р2У!-рецепторами, а в кальциевой среде Р2Х|- и частично Р2Yt-рецепторами, сравнивая полученные результаты влияния соединений для кальциевой и безкальциевой сред, можно предположить долевое участие взаимодействия изученных соединений с Р2Хг рецепторами тромбоцитов для активации в кальциевой среде. Оказалось, что соединения РУ-286, РУ-576 и РУ-1204 подавляют активацию тромбоцитов в кальциевой среде преимущественно за счет влияния на пуринобые P2Yr рецепторы, тогда как эффект соединений РУ-355, РУ-575, РУ-603, РУ-722 и РУ-1185 реализуется путем антагонистического влияния как на Р2Хр рецепторы, так и на Р2Угрецепторы.

Начальное повышение внутриклеточной концентрации кальция, вызывающее активацию тромбоцитов через стимуляцию Р2Х)- и P2Yi-рецепторов, недостаточно для развития агрегации. Для появления псевдоподий и образования агрегатов необходимо угнетение синтеза цАМФ (Siess W., 1989).

Таблица 1 - Влияние наиболее активных производных бензимидазола (10'6М) и веществ сравнения на АДФ-индуцированное изменение функциональной активности тромбоцитов в средах с различным содержанием кальция

Соединение Подавление активации (Л%, М±т) » » , *** Д%

в кальциевой среде* в безкальциевой среде"

РУ-286 -32,41±2,80? -29,43±2,62§ -2,98

РУ-1204 -9,30+0,76* -22,20±2,148 0

РУ-355 -56,92±4,57§ -37,62±2,885 -19,30

РУ-722 -50,61±4,838 -22,05±2,09? -28,56

РУ-603 -37,43±3,32§ -22,60±2,18§ -14,83

РУ-575 -41,22+3,66* -23,91±2,28s -17,31

РУ-576 -36,72±3,715 -27,32±2,665 -9,40

РУ-1185 -42,36±4,03* -21,60±1,885 -20,76

Basilen blue -25,02±2,38§ -21,5012,08* -3,52

PPADS -71,83+5,99' -30,0012,74* -41,83

5 - данные достоверны по отношению к контролю, t-критерий Стьюдента (р<0,05)

*-АДФ-индуцированная активация'тромбоцитов в кальциевой среде отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым P2Xi-и P2Y)-рецепторам тромбоцитов

**- АДФ индуцированная активация тромбоцитов в безкальциевой среде отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым P2Y!-рецепторам тромбоцитов

***-является разницей между эффектами соединений по влиянию на активацию тромбоцитов в кальциевой и безкальциевой средах, отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым Р2ХГ рецепторам

Следовательно, степень выраженности агрегации, индуцируемой АДФ, будет отражать связывание этого пурина с Р2У|2-рецептором, угнетающим через G,-белок аденилатциклазу. При регистрации агрегации методом малоуглового светорассеяния наибольшее антиагрегантное действие проявили соединения РУ-722, РУ-286 и РУ-1185 (рис. 2), выбранные нами для дальнейшего изучения. Подавление агрегации носило дозозависимый характер в диапазоне

концентраций 10"6- 10" М. Р2 У ^локирующая активность соединений РУ-722, РУ-286 и РУ-1185 подтверждалась угнетением активации тромбоцитов, индуцированной 2-метшгшо-АТФ, селективным аго ни с.том пури новых Р2У-рецепторов (табл. 2). Тиклопидин и клопидогрель б данной экспериментальной серии продемонстрировали низкую активность, что объясняется отсутствием в их механизме действия влияния На Р2У,-пури норе цеп торы тромбоцитов (НесЫег В.е! а!., 1998).

Рисунок 2 - Влияние наиболее активных производных бензимидазола (1 О^М) и PPADS на АДФ-индуцирован ну ю агрегацию тромбоци'1-ов (антагонистические свойства по отношению к Р2 Y {^рецепторам тромбоцитов) (Д%. М±ш).

LD;o (мыши, внугрибркщшнно) соединений РУ-722, РУ-286 и РУ-1185 составляет ) 30,0, 282,8 и 660,0 мг/кг соответственно.

Необходимым этапом исследования явилось изучение активности соединений в условиях "ex vivo" с различными индукторами (табл. 3). Для исследования антиагрегантного эффекта P2Y|?- антагонистов обязательно изучение т влияния на АДФ- и коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроме того, дт всех антиагрегаятов целесообразно использовать е качестве индуктора адреналин. Наиболее выражено уменьшало АДФ-индуцированную агрегацию соединение РУ-722, активность которого превышала таковую у тиююпндина и была сопоставима с клогшдогрелем.

Таблица 2 - Влияние соединений РУ-286, РУ-722, РУ-1185, клопидогреля и тиклопидина на активацию тромбоцитов индуцированную селективным Р2У-агонистом 2-метил-тио-АТФ (М±ш)

Соединение Концентрация log С, M Подавление активации тромбоцитов в безкальциевой среде, Д%

РУ-286 -4 -56,10±4,62*

-5 -30,42±3,14*

РУ-722 -4 -70,81±6,45*

-5 -33,33±2,91*

РУ-1185 -4 -43,57±16,78

-5 -33,88±6,56*

Тиклопидин -4 -13,32±1,28

-5 -1,22±1,59

Клопидогрель -4 0,0+2,38

-5 -7,51±3,21

*- данные достоверны по отношению к контролю, t-критерий Стьюдента (р<0,05)

Таблица 3 - Влияние соединений РУ-286, РУ-722, тиклопидина и клопидогреля на агрегацию тромбоцитов при использовании различных индукторов, Д% по отношению к контролю

Соединения Индукторы агрегации тромбоцитов

АДФ, 5мкМ Коллаген, 50мг/мл Адреналин, 10 мкМ

СА НСА СА НСА СА НСА

РУ-722 -85,03*" -89,69*# -97,5'" -99,0** -19,32 -35,99

РУ-286 -69,02'" -74,93*" -86,3'" -87,9*" -40,67*# -46,52**

Тиклопидин -37,12* -44,89* -94,9' -96,2" -5,41 +10,28

Клопидогрель -96,62*" -96,99* -92,2' -94,2" -42,25** -22,68

- данные достоверны по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни (р<0,05); " - данные достоверны по отношению к группе крыс, получавших тиклопидин, критерий Манна-Уитни (р<0,05).

Обозначения: СА - степень агрегации, НСА - начальная скорость агрегации -Несколько слабее проявлялся антиагрегантный эффект у соединения РУ-286, занимающего промежуточное место между препаратами сравнения тиклопидином и клопидогрелем. У соединения РУ-1185 вопреки полученным в

условиях in vitro результатам при пероральном введении отсутствовала способность подавлять АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, дальнейшее изучение его антиагрегантной активности не проводилось.

Соединения РУ-286 и РУ-722, тиклопидин и клопидогрель эффективно подавляли коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, снижая степень агрегации на -86%-98%, а скорость агрегации на 88-99% по сравнению с контролем. Агрегация, индуцированная коллагеном, опосредуется через АДФ-зависимое конформационное изменение гликопротеинового комплекса ПЬ/Ша (Dorsam R.T., Kunapuli S.P., 2004), поэтому P2Y|2 - антагонисты тиклопидин и клопидогрель блокируют коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Monsalud M. et al., 2004). Проходящий доклинические испытания P2Yr антагонист MRS 2179 блокирует агрегацию тромбоцитов, вызываемую низкими дозами коллагена, в больших концентрациях коллаген вызывает прохождение обратимой агрегации (Baurand A., Gachet С., 2003). Соединения РУ-722 и РУ-286 практически полностью ингибируют коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов при высокой дозе индуктора, что свидетельствует о P2Yi2- антагонистической активности.

Соединение РУ-286 достоверно уменьшает как степень, так и скорость адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Соединение РУ-722 понижает начальную скорость, клопидогрель - степень агрегации, индуцированной адреналином. Сравнительно низкая эффективность изученных веществ и препаратов сравнения в данном тесте согласуется с литературными данными (Monsalud M. et al., 2004) и объясняется другим рецепторным механизмом опосредования тромбоцитарного ответа на действие адреналина: в данном случае угнетение аденилатциклазы и последующая агрегация тромбоцитов связана с модуляцией мембран при взаимодействии адреналина с агд-адренорецепторами и изменением её проницаемости к ионам кальция (Самаль А.Б. и соавт, 1990; Lenox R.H. et al., 1985).

При исследовании веществ, оказывающих антитромботические свойства, обязательны тесты, дающие интегральное представление об изменениях

коагуляционного потенциала крови: тромбиновое время, протромбиновое время Квика, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень фибриногена (Баркаган З.С.,Момот А.П., 1999). При однократном введении соединений РУ-722, РУ-286, тиклопидина и клопидогреля не было получено статистически -значимых изменений показателей коагулограммы, что свидетельствует об отсутствии прямого антикоагулянтного эффекта в исследуемых дозах, как для исследуемых соединений, так и для препаратов сравнения спустя 2 часа после перорального введения.

Для изучения антитромботических свойств соединений с антиагрегантной активностью в условиях целостного организма целесообразно использовать модели артериального тромбоза, сопровождающиеся повреждением эндотелия сосудов. Наиболее распространенными являются модели артериального тромбоза, индуцированного поверхностной аппликацией раствора хлорида железа (III), а также электрическим током (Angelillo-Scherгer А., 2004).

На модели артериального тромбоза, индуцированного раствором хлорида железа соединения РУ-722, РУ-286, тиклопидин и клопидогрель увеличивали время до полной окклюзии сонной артерии (рисунок 3). По времени уменьшения кровотока до 50%-ного уровня соединение РУ-722 превосходит тиклопидин в 3,1 раза. Для соединения РУ-286 и клопидогреля этот показатель за 2,5 часа (длительность нембуталового наркоза) зарегистрировать не удается. Данные результаты свидетельствуют о высокой эффективности соединений РУ-722 и РУ-286, по антитромботической активности превышающих тиклопидин.

Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженные антитромботические свойства на модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током (табл. 4), превосходя по эффективности тиклопидин в 1,9 и 2,4 раза, соответственно.

На модели генерализованного тромбоза соединения РУ-722, РУ-286, тиклопидин и клопидогрель повышали выживаемость животных, при этом эффект соединений РУ-722 и РУ-286 превышал таковой у тиклопидина в 1,9 и

Рисунок 3 - Влияние соединений РУ-722, РУ-286, тиклопидина и клопидогреля на изменение средней объемной скорости кровотока в сонной артерии интактных крыс после нанесения аппликации хлорида железа (III)

Таблица 4 - Влияние соединений РУ-722 и РУ-286, тиклопидина и клопидогреля на время окклюзии сонной артерии интактных крыс на модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током (М±ш)

Соединение Время полного тромбоза, мин.

контроль 17,71±0,84

РУ-286 55,33±2,03**##

РУ-722 43,33±2,73"##

тиклопидин 23,33±2,03*

клопидогрель 74,00±Ю,54*#

* - данные достоверны по отношению к контролю, и-критерий Манна-Уитни (р<0,05); ** - данные достоверны по отношению к контролю, и-критерий Манна-Уитни (р<0,01); # - данные достоверны по отношению к группе крыс, получавших тиклопидин, и-критерий Манна-Уитни (р<0,05); ## - данные достоверны по отношению к группе крыс, получавших тиклопидин, и-критерий Манна-Уитни (р<0,01)

Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина (6 мг/кг)

2,3 раза, что свидетельствует о наличии выраженных антитромботических свойств у указанных соединений.

Таким образом, в результате исследования гетероциклических производных бегоимидазола, установлено, что среди изученных соединений наиболее перспективным для расширенного скрининга является класс соединений, обладающих наибольшей активностью Р2Урблокирующей активностью - Ni-морфолинозтилзамещенные- имидазо[1,2-а]бензимидазола, имеющие неполярный радикал во втором положении. Проявление P2Yr антагонистических свойств в ряду трициклических производных зависит от заместителей у ключевого атома азота, обладающих циклическим строением и содержащих атом кислорода. Кроме того, предпочтительно наличие во втором положении бензимидазольного кольца неполярного радикала.

Для дальнейшего изучения были выбраны соединения РУ-722, РУ-286 и РУ-1185, имеющие морфолиноэтильный радикал у ключевого атома азота и относящиеся соответственно к Ni-замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазола и Ид-замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазола и Ni-замещенным бензимидазолина, проявляющие антагонистические свойства по отношению к P2Yi- и P2Yi2- подтипам тромбоцитарных пуриновых рецепторов. Соединения РУ-722 и РУ-1185 проявляют также Р2Хгантагонистическую активность. В условиях in vitro данные вещества эффективно блокируют изменения функциональной активности тромбоцитов, индуцированные как АДФ, так и селективным агонистом пуриновых Р2У-рецепторов 2-метилтио-АТФ.

При изучении ex vivo соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженные антиагрегантные свойства, превосходя по влиянию на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов препарат сравнения тиклопидин, но уступая по выраженности эффекта клопидогрелю. Соединение РУ-1185 не влияет на тромбоцитарную агрегацию под действием АДФ при пероральном введении и не перспективно для дальнейшего изучения. Соединения РУ-722 и РУ-286 практически полностью подавляют коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, при этом их эффективность сопоставима с тиклопидином и клопидогрелем. Соединение РУ-286 подавляет адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов. При однократном введении

соединения РУ-722 и РУ-286 не оказывают влияния на коагулографические показатели.

В условиях целостного организма на экспериментальных моделях артериального тромбоза и генерализованного тромбоза соединения РУ-722 и РУ-286 демонстрируют выраженные антитромботические свойства, превосходя при этом тиклопидин, но уступают клопидогрелю.

Сопоставление полученных результатов, теоретических предпосылок и литературных данных позволяет считать целесообразным дальнейшее изучение различных типов производных бензимидазола в качестве лигандов пуриновых рецепторов, в частности P2Yr и Р2У]2-антагонистов.

Антипуринергическая активность соединений РУ-722 и РУ-286, стабильное проявление антиагрегантной и антитромботической активности на различных моделях "in vitro", "ex vivo" и "in vivo" позволяют предположить, что соединения РУ-722 и РУ-286 могут явиться основой для создания лекарственных препаратов принципиально нового механизма действия, проявляющего антиагрегантные свойства.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные N9- и Ni-замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола и Ni-замещенные 2-аминобензимидазола проявляют свойства антагонистов пуриновых Р2У|-рецепторов.

2. Наибольшей P2Yi-блокирующей активностью обладают Ni-морфолиноалкилзамещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола, содержащие у второго углеродного атома фенильный радикал.

3. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют антагонистические свойства по отношению к P2Yr и Р2У12-подтипам тромбоцитарных пуриновых рецепторов. Соединение РУ-722 проявляет Р2Хгблокирующую активность.

4. Соединения РУ-722 и РУ-286 при пероральном введении проявляют выраженные антиагрегантные свойства, по влиянию на АДФ-индуцированную агрегацию превосходят тиклопидин в 2 и 1,7 раза соответственно, но уступают клопидогрелю. Соединения РУ-722 и РУ-286 ингибируют коллаген-

индуцированную агрегацию тромбоцитов, при этом их эффект сопоставим с препаратами сравнения. Соединение РУ-286 достоверно понижает адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов. При однократном введении соединения РУ-722 и РУ-286 не оказывают влияния на коагулографические показатели.

5. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженные антитромботические свойства в условиях in vivo на моделях артериальных тромбозов (индуцированного хлоридом железа (III), электрическим током). По уровню активности соединения РУ-722 и РУ-286 превосходят препарат сравнения тиклопидин, но уступают по выраженности эффекта клопидогрелю.

6. Вещества РУ-722 и РУ-286 увеличивают выживаемость животных на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза, при этом их антитромботическая активность превышает таковую у тиклопидина в 1,9 и 2,3 раза, но уступает клопидогрелю на 34,4% и 20%, соответственно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Изучение возможности использования модели АДФ-зависимой активации тромбоцитов для поиска антагонистов пуриновых Р2Угрецепторов// Материалы 61-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2003. - С. 139-140. (соавт. Черников М.В.).

2. Поиск антагонистов пуриновых Р2Угрецепторов в ряду конденсированных производных бензимидазола на модели АДФ-зависимой активации тромбоцитов // Тез. докл. VIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград, 2003. -С. 40-41. (соавт. Черников М.В., Гречко О.Ю.).

3. Изучение агрегации тромбоцитов, обусловленной активацией пуриновых Р2Уддф-рецепторов // Материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2004. -С. 107.

4. Поиск антагонистов Р2Угрецепторов среди производных бензимидазола // Сборник тезисов международной конференции молодых учёных Одесского

государственного медицинского университета "Вчеш майбутнього". - 2004. -С.40-41.

5. Изучение механизма антиагрегантного действия производных бензимидазола // Тез. докл. IX Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград, 2004. -С. 67-68 (соавт. Гречко О.Ю., Черников М.В.).

6. Изучение влияния конденсированных производных бензимидазола на активацию и агрегацию тромбоцитов, вызванную 2-метилтио-АТФ // Материалы 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2005. -С. 104-105. (соавт. Мишура Д.И., Вдовенко О.Ю.).

7. Фармакологическая регуляция функций пуриновых рецепторов // Материалы 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - Москва, 2006. - С.69 (рус.), С.138 (англ.). (соавт. Спасов A.A., Черников М.В., Анисимова В.А.)

8. Изучение антитромботических свойств новых производных бензимидазола на модели генерализованного тромбоза у мышей // Тез. докл. X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград,

2005. -С. 42-43.

9. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазоло-[1,2а]бензимидазола // Хим.-фарм. журнал. -

2006. - Т.40, №10. - С.124-132. (соавт. Анисимова В.А., Спасов A.A., Косолапов В.А., Черников М.В., Ельцова JI.B., Ларионов Н.П., Либинзон P.E., Ватолкина O.E.)

10. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на агрегацию тромбоцитов, вызванную различными индукторами // Материалы 64-й открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2006. -С. 140.

СТУКОШША АННА ЮРЬЕВНА

ПОИСК АНТАГОНИСТОВ ПУРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ТРОМБОЦИТОВ СРЕДИ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 8.01.2007 г. Бумага офсетная 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,0 Тираж 120 экз. Заказ № 4.

Волгоградский государственный медицинский университет 400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1. Отпечатано в ВолгГАСУ

В настоящее время накоплен обширный фактический материал, свидетельствующий о том, что Р2-пурннорецегггоры могуг представлять собой мишень для фармакологического воздействия (Знганшин А,У., Знганшина Л.Е , Бернсток Дж., 2002; Burstock G., Wood J.N,, 1996; Ziganshina L.E, et a!,, 1996; Collo G, et al,, 1997; Bodin P., Burnstock G., 1998; Inoue K-, 1998; Dunn P.M., 2QOO; Mulryan K. et al., 2000; Bogoussla%'sky 2001) и создания лекарственных средств принципиально нового механизма действия (Mast S.G., (992; Williams М.,1993; Speckling М., Williams М., 1996)~ Большое многообразие подтипов Р2рецепторов делает возможным разработку органо- или ткансслеинфкчньгх препаратов, направленно моделирующих те илн иные функции (Знганшнн А.У., Зи Ганшина JI.E., Бернсгок Дж, 2002). АДФ, являясь важнейшим физиологическим метаболитом, обеспечивающим первичный гемостаз, индуцирует агрегацию тромбоцитов под воздействием любых индукторов (Dorsam R.T., Kunapuli S.P., 2004), В настоящий момент установлено,, что на мембране тромбоцитов имеются три полтипа пуринорсиепторов: Р2Х|, P2Y, н P2Y,2 (Khakh B.S. et al., 2001; Kunapuli S.P, el a!., 2003). P2Y,-рецепторы выполняют ключевую роль в тромбообразованни и могут представлять собой возможную мишень для создания лекарственных препаратов, препятствующих реализации данного процесса на стадии обратимой агрегации тромбоцитов, для терапии ряда заболеваний, сопровождающихся увеличением тромбогеиного потенциала крови (Kunapuli S.P. et al, 2003). При блокаде пуриновых P2Yir рецепторов тромбоцитов не происходит связывание АДФ с рецепторами и предупреждается активируемое комплексом GP ПЬ/Ша взаимодействие тромбоцитов между собой, являющееся заключительным этапом агрегации при воздействии любого активатора (Paul B.Z., Jin J. et al., 1999; Kunapuli S.P. et al, 2003),

Химический класс производных бешнмндазола считается перспективным для разработки гемореологнческнх препаратов - эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов (Rusu G-, Danila G., Nechifor M„ 1993; Rehse К., Brikhofcr G., 1995; Lagorce J.F. et al., 1995; Riviere M, 1997; Saezewski F el al, 1998; Chackalamannil S, et al. 2003; Subramanian R. el al., 2003). В исследованиях, проведенных в Волгоградском государственном медицинском университете, была установлена антиагрегантная активность ряда гетероциклических производных бензимидазола по отношению к АДФ-индуцнрованной агрегации тромбоцитов (Ковалев С.Г., Турчаева А.Ф,, 1992; Турчаева А,Ф.Ч 1995; Дудченко Г.П., Спасов А,А,( Аниснмова В,А,( 1995), Учитывая данный факт, а также сходство химического строения с пуриновыми лигандамн, представляется интересным поиск веществ, избирательно блокирующих п урн новые рецепторы тромбоцитов, в частности, P2Y, и Р2Уц-подтнпы, среди данного класса соединений.

Связь задач исследований с проблемами фирмлисвтнчсски! наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом НИР Волгоградского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.20.02 15606). Тема работы утверждена на заседании Ученого Совета университета (протокол №1 от 14.01,2004 г.).

Цель исследования. Целью настоящего исследования является поиск антагонистов Р2У-рецспторов тромбоцитов среди конденсированных производных бентмидазола и изучение фармакологических свойств наиболее активных соединений.

Задачи исследования.

1. Проведение поиска веществ, демонстрирующих антагонистическую активность ктромбоиитарным Р2У,-пурнновым рецепторам.

2, Анализ зависимости между структурой и функциональной активностью исследованных соединений по отношению к Р2У| - подтипу пуриновых рецепторов тромбоцитов.

3, Изучение влияния наиболее активных соединений на P2Xt н Р2Уц подтипы рецепторов тромбоцитов.

4, Исследование влияния наиболее эффективных соединений на показатели сосуднсто-тромбонитарного и коагуляцнонного гемостаза у ннтактных животных.

5. Изучение антитромботическях свойств наиболее активных соединений на моделях артериального тромбоза (индуцированного хлоридом железа (III), электрическим током)

6. Выявление антнтромботнческих свойств соединений на модели генерализованного адреналнн-коллагеиового тромбоза.

Научная новншя. Впервые было проведено исследование способности ряда новых веществ, конденсированных производных бензнмндазола, блокировать различные подтипы пурнновых рецепторов мембраны тромбоцитов. Проведен аншп зависимости между химической структурой веществ и выраженностью антагонистических свойств по отношению к P2Y(-подтипу пурнновых рецепторов мембраны тромбоцитов. Установлено, что наибольшими P2Y| - антагонистическими свойствами среди исследованных соединений обладают Ni-замещенные имндазо( 1,2-а]бензммндаюла, содержащие морфолнноэтнльиый радикал в Ni-положсннн, при этом уменьшение полярности заместителя во втором положении гетероциклического ядра способствует повышению P2Yблокирующей активности. Полученные результаты исследований могут явиться основой для проведения целенапра&^енного поиска новых субстанций со свойствами лнгандов пурнновых рецепторов

Впервые в ходе работы получены данные о влиянии соединений РУ-722 и РУ-286 на изменение функциональной активности тромбоцитов при действии агоннстов пуриновых рецепторов: АДФ и 2-метилтио-АТФ. Изучено влияние данных веществ на сосуднсто-тромбоцнтарный и коагуляцнонный гемостаз. Похазано, что соединения РУ-722 н РУ-286 проявляют антитромботнческие свойства на моделях тромбоза различного генеза.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска внтнагрегантных веществ, блокирующих Р2У-реиопторы тромбоцитов, среди конденсированных бензимндазольных систем. Результаты выявленных закономерностей между Р2У-аитагоиистической активностью производных бензнмндазола н их химической структурой могут служить основой для направленно ГО поиска веществ, обладающих данным видом фармакологической активности. Выявленные эффекты соединений РУ-722 и РУ-286, превосходящие но величине активности тиклопчднн, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических н токсикологических исследований данных веществ с целью создания на их основе новых лекарственных препаратов, обладающих антиагрегантными свойствами.

Реализаций результатов исследования. По результатам исследований разработаны информационное письмо «Зависимость между P2Yj-антагоннстической активностью и химической структурой кондесированных производных бензнмидазола», внедренное в план работы НИИ ФОХ при ГОУ ВПО «Ростовский государственный университет» (акт внедрения от 10,09.2006). информационное письмо «Антиагрегантные и антнтромботнческнс свойства новых соединений - производных имидаэо[1г2-а]бензимидазола РУ-722 и РУ-286, блокирующих Р2У-рецепторы тромбоцитов», внедренное в план работы НИИ Фармакологии ВолГМУ и Волгоградского научного центра РАМН и АВО (акты внедрения от 05,09,2006), Материалы информационного письма «Антиагрегантные и антнтромботические свойства новых производных имида-зо| 1,2-aJ бензимндазола, блокирующих Р2У*рецепторы тромбоцитов» внедрены в план работы кафедр фармакологии Кубанского государственного медицинского университета (акт внедрения от 08.09.2006), Саратовского государственного медицинского университета (акт внедрения от 07,11.2006), а также кафедры фармакологии и биофармзшш ФУ В Волгоградского государственного медицинского университета (акт внедрения от 06,09.2006). Основные положения, выносимые на защиту.

1. Nj- морфолнноэтнлзамещеиные нмндазо[]»2-а]бенэнмидазола перспективная группа химических соединений для поиска ноных высокоэффективных P2Y, - антагонистов.

2. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженную антииурннергическую активность, блокируя изменения функциональной активности тромбоцитов» вызванные агониетамн Р2У-пурннорсцепторов.

3. Соединения РУ-722 и РУ-286 ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ и коллагеном, при этом не влияя на коагулографические показатели.

4. Соединения РУ~722 и РУ-286 проявляют антнтромботнческие свойства в условиях целостного организма на тромбоцит-зависимых моделях артериального тромбоза (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (HI), электрическим током), а также при внутривенном введении адреналина и коллагена.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались н обсуждались на 6] - 64-й итоговых научных конференциях студентов и молодых уч£ных ВолГМУ, Волгоград, 2003-2006 гг.; VIII-XI Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, Волгоград, 20032006 гг.

Публикации. По теме днссергации опубликовано J0 работ.

Объёч н структура диссертации, Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 30 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), экспериментальной части (главы iu-V), обсуждения результатов (глава VI), выводов и списка литературы, включающего 202 источника, в том числе 152 иностранных.

ВЫВОДЫ

I - Исследованные N9- н N,-замешенные нмнлазо[1,2-а]бензиммдазола и N гзамещенные 2-аминобензимндазояа проявляют свойства антагонистов пуриновых P2Y|-рецепторов.

2. Наибольшей Р2Y i-б локирующей активностью обладают N | -морфол иноалкилзамешенные имндазо[ 1,2-а]беиэимндазола, содержащие у второго углеродного атома фенильный радикал.

3. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют антагонистические свойства по отношению к P2Y|- и Р2У|г-подгипам тромбоцнтарных пуриновых рецепторов. Соединение РУ-722 проявляет Р2Х|-блокирующую активность.

4. Соединения РУ-722 и РУ-286 при пероральном введении проявляют выраженные антнагрегантные свойства, по влиянию на АДФ-индуцнрованную агрегацию превосходят тиклопндин в 2 и 1,7 раза соответственно, но уступают клопндогрелю. Соединения РУ-722 и РУ-286 ингибнруют коллаген-индуинрованную агрегацию тромбоцитов, при этом их эффект сопоставим с препаратами сравнения. Соединение РУ-286 достоверно понижает здрсналин-нндуцированную агрегацию тромбоцитов. При однократном введении соединения РУ-722 и РУ-286 не оказывают влияния на кекпулофафнческне показатели,

5. Соединения РУ-722 и РУ-286 проявляют выраженные антитромботическне свойства в условиях in vjvo на моделях артериальных тромбозов (индуцированного хлоридом железа (III)t электрическим током). По уровню активности соединения РУ-722 и РУ-286 превосходят препарат сравнения тиклопндин, но уступают по выражен кост и эффекта клопндогрелю.

6. Вещества РУ-722 и РУ-286 увеличивают выживаемость животных на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза, при этом их антктромботнческая активность превышает таковую тиклопндниа в 1,9 н 2,3 раза, но уступает клопндогрелю на 34.4% 20%, соответственно.

5,4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате ряда проведенных исследований, вое производящих процесс тромбообразования при повреждении стенки артерий факторами различного генеза (электрический ток, поверхностная аппликация раствора хлорида железа (Ш)), а также при сдвиге динамического равновесия систем, обеспечивающих нормальный гемостаз, в сторону повышения активности тромбообразуюшей системы, установлена высокая антитромботическая активность соединений РУ - 722 и РУ-286 при их однократном пероральном введении интактным крысам за 2 часа до моделирования тромбозов.

На модели тромбоза сонной артерии, индуцированного обработкой сосуда 50% раствором хлорида железа (III), интервал времени от момента начала действия повреждающего агента до полной окклюзии сосуда на фоне действия исследуемых соединений превышает 150 минут, что более чем в б раз превышает время полного артериального тромбоза в контрольной группе н больше, чем в 3,6 раза — по сравнению с экспериментальной группой, получивших тиклопидии. Но времени регистрации уменьшения исходного кровотока до 50% исследуемые соединения превосходят тнклопндин, для соединения РУ-286 и клопидогреля этот параметр не удастся зафиксировать в течение 2,5 часов допплерографинеской регистрации. По значениям средней объемной скорости соединение РУ-722 достоверно не отличается от клопидогреля на протяжении 40 минут от наложения аппликации хлорида железа (III), для соединения РУ-286 отличия данного параметра статистически незначнмы по сравнению с клопндогрелем в течение всего времени регистрации.

В результате изучения антитромботических свойств соединений РУ-722, РУ-286 н препаратов сравнения тнклопндина н клопидогреля на модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, установлено, что прн их предварительном введении интакгным крысам перорально в дозе, эквимоляльной дозе тнклопнднна 6 мг/кг, увеличивается время сохранения кровотока в сонной артерии у интактных крыс. По выраженности ангитромботнческнх свойств соединения РУ-722 и РУ-286 превосходят тнклопидин в 2,4 и 3tl раза, соответственно,

На фоне действия исследуемых соединений РУ-722 и РУ-286 уменьшается смертность белых мышей прн системном коллаген-адреналиновом тромбозе, вызванным совместным введением больших доз индукторов в хвостовую вену животных, При этом отмечается уменьшение выраженности двигательных нарушений н уменьшение плошадн массивного тромбоза легких но сравнению с контрольной группой. По своему влиянию на выживаемость мышей соединение РУ-286 превосходит тнклопидин а 2,3 раза (р<0,01).

Проявление выраженных антнтромботнческих свойств у соединений РУ-722 и РУ-286 на всех моделях экспериментальных тромбозов различного генеза позволяет предположить, что в основе их механизма действия лежит угнетение агрегации тромбоцитов, так как именно тромбоциты играют ключевую роль в инициации тромбоза. Подобное предположение согласуется с данными, полученными при изучении влияния соединений РУ-722 и РУ-286 на функциональную активность тромбоцитов в условиях in vitro, а также прн исследовании действия веществ на сосуднето-тромбоцнтарный и коагуляцнонный гемостаз в условиях ex vivo,