Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Планирование и проведение статистического анализа в медико-биологических экспериментах

На правах рукописи

ПУХЛЯНКО Марина Евгеньевна

ПЛАНИРОВАНИЕ И ПРОВЕДЕНИЕ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ

(14.00.16 - Патологическая физиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1997

Г--

СП

о~

Г."

сг> см

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии и кафедре математических и компьютерных методов в медицине медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Фролов В. А., кандидат физико-математических наук, доцент Шустов А. С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Вальцева И. А., кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Проценко В. Д.

Ведущая организация — НИИ общей патологии н патологической физиологии РАМН.

Защита диссертации состоится «_»_199 г.

в_ час. на заседании диссертационного совета

Д 053.22.01 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан «_»_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор ДРОЗДОВА Г. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

В настоящее время все больше внимания уделяется статистический обрабвтке данных медико-биологических экспериментом, цель которых состоит н выявлении плиянии внешних факторов на биологические объекты, механизм которых неизвестен.

Прогрессирующее обогащение медицины данными точных паук (физики, химии) ставит перед врачами задачу овладения на новом, боле«.> высоком уровне методами прикладной математики, и особенности математической статистики (Бессмертный B.C., 1967J.

Применяя методы статистики, медик-исследователь не исегда в полной мере осознает их значения в медицинском эксперименте. Статистика иногда представляется ему в виде набора правил и формул, освобождающих исследователя от трудностей и сомнений при решении какой-либо сложной медицинской проблемы (Орлов А.И., 1987).

Роль математической статистики в медицине далеко не ограничивает/ расчетами по определенным формулам при обработке материалои исследования. Наиболее существе!,^ую и важную для медицины сторону математической статистики составляет логики статистического анализа, критическое отношение к эмпирическим данным, порядок и система научной аргументации при выборе необходимого статистического метода (Весемертный БС.,1У67).

Понимание идей математической статистики углубляет содержание общепринятых медицинских понятии, предъявляет повышенные требования к организации и проиедекию зкеггеримгииш, мстил нет псслсдшм имя использовать суждения и оценки, основанные па объективны*, статистических критериях Оксмнрнаи организация здравоохранения, 1!Ш).

Важность темы диссертации обуславливается тем, что недоучет того факта, что медико-биологический эксперимент яилястся статистическим приводит к ряду негативных последствий: I

1. некорректное определенно генеральной совокупности исследуемых объектов;

2. получение недостоверных результатов из-за недостаточных объемов выборки;

3. несоответствие или отсутствие статистически обоснованного клана эксперимента с поставленными задачами, и как следствие * невозможность их корректного решения;

4. неумение осуществить полномасштабный статистический анализ

»

полученных данных;

5. получение неверных выводов, основанных на статистически незначимых .результатах проверки тех или иных гипотез, которые не всегда Четко сформулированы,

Статистические методы и'пользуются в различных областях биологии и медицины. В частности, они применяются для оценки эффективности методов лечения и применения лекарственных препаратов, диагностики заболеваний, при прогнозирование развития той или иной болсанн у конкретного больного или патологического процесса для группы больных. Знакомство с статистическими методами необходимо также для понимания и критической оценки сообщений в медицинских и биологических журналах.

ЦЕЛЬ И ЗДДАЧИ РАБОТЫ.

Целью, настоящего исследования является разработка подхода к планированию и статистической обработке результатов медико-биологических исследований, предназначенных для изучения влияния внешних факторов па биологические объекты, механизмы которых неизвестны.

В связи с этим в данной работе рассмотрены следующие задачи:

1. Выявление особенностей экспериментов, цель которых состоит в изучении воздействия внешних факторов (с неизвестным механизмом) на биологические объекты.

2. Применение методов снижения размерности многомерных массивов данных.

3. Установление статистической значимости влияния внешних факторов на исследуемые биологические объекты.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Разработан систематический подход к применению статистического анализа данных, получаемых п ходе медико-биологических экспериментов, предназначенных для выявления воздействия внешних факторов с неизвестными механизмами на функционирование биологических систем и организмов.

Использование разработанной методики показало, что влияние внешних факторов на организм приводит к тому, что исследуемые величины, характеризующие жизнедеятельность организма, в процессе адаптации образуют различные группы взаимосвязанных параметров, наиболее точно отражающих функционирование систем организма.

НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

Разработанный в диссертации метод может быть использован для решения Медико-биологических задач "ониторинга организма с целью выявления влияния на него внешних воздействий.

Полученные результаты представляют практический интерес, поскольку дают возможность статистически достоверно установить наличие воздействий факторов среды на биологические системы и организмы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Осиошинс результаты диссертационной работы доложены на:

- третьей международной конференции "Математика. Компьютер. Образование", (г.Дубна, 29 яннаря - 3 февраля 1996 г.)

иторой межвузовской конференции "Актуальные проблемы экологии", (г. Москва, 27-28 мая 1996 г.)

- четвертой международной конференции "Математика. Компьютер. Образование", (г. Пущино, 29 января - 3 февраля 1997 г.)

ПУБЛИКАЦИИ.

Основные результаты, изложенные в диссертации, опубликованы в 5 научных работах, список которых приводится в конце автореферата.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы. Общий объем работы составляет страниц, включая

рисунков, таблиц; библиография насчитывает наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы, излагаются цели и задачи диссертации и дается краткое описание содержания каждой главы.

Первая глава является обзорной. В ней дается анализ основных работ, касающихся роли и применения статистических методов в медико-биологических исследованиях. Приводятся наиболее типичные ошибки, возникающие при неправильном выборе и использовании методов статистического анализа. Обсуждается необходимость статистического планирования медико-биологических исследований.

Во второй главе приводится описание материалов и методов латофнзиологических исследований, а также статистических методов,

используемых в диссертации. В работе использован ¡жспериментальныН материал, полученный сотрудниками кафедры патологической физиологии медицинского факультета РУДН,

Эксперименты проводились на самца*, кроликов породы "шиншилла", массо" 2.5 - 3.5 кг. Всего в работе былр использовано 480 кроликов.

Методика проведения хропобиалогического эксперимента.

Исследования проводились во все сезоны года и были ориентированы по срокам астрономического календаря на дни весеннего и осеннего равноденствий, летнего и зимнего солнцестояний (21-23 марта, 21-23 сентября, 21-23.июня, 21-23 декабря). Эксперимент начинался па 30 минут до контрольного времени и заканчивался через 30 минут после него. С 0 часов и в течение 72 часов (3 суток) с интервалом н 3 часа производились замеры и забор материала для исследований всех изучаемых показателей. В группе для каждой временной точки было пять животных.

Методы оценки артериального давления и сократительной функции сердца.

В условиях острого вкспернмснта у животных под местной анестезией 1%-м раствором новокаина, в левой общей сонной артерии электроманометрическн оценивала' величина систол1 еского (АДмакс -дальнейшее обозначение АРМАХ) и диастолнчгского (АДмин - дальнейшее обозначение . PMIN) артериального давления. ЗатеМ. у животных под легким гексеналовым наркозом а третьем межреберье слева рассекалась грудная клетка, левый и правый желудочки сердца кашолировали^ь и на ленте полиграфов (Alvar, "Ñlingograf-82") ре. .стрнровалось пиковое систолическое давление в полостях нового (ВДрЛЖ - внутрижелудочконое давление реальное - дальнейшее обозначение VPREALLV) и правого (ВДрПЖ - дальнейшее обозначение VPREAI.RV) желудочкоь сердца. Затем вызывалась пятисекундиая окклюзия восходящей аорты (дли левого желудочка) и легочной-артерии (для правого желудочка) и фнкси|юиал(*;ь пиковое систолическое (максимальное) внутрижелудочковое давление в

условиях нрактичсскй изометрического сокращения камер сердца (ВДИЛЖ и ВДНПЖ - дальнейшее обозначение-VPMAXLV и VPMAXRV).

Методика определения кислотно-основного состояния крови.

С помощью метода мнкро-Аструп определялись показатели кислотно-основного состояния и газы артериальной (AHB, АРН, АРС02, АР02, АНСОЗ) и венозной крови (VHB, VPH, VPC02, VP02, VHC03). Анализ проб и их автоматическая обработка осуществлялись на микроанализаторе ОР-215.

Методы оценки лизосомной активности.

После регистрации функциональных показателей Производили экстирпацию сердца и печени. Органы помещали в ледяные буферные растворы для гомогенизации.

Гомогенат 1:10 подвергали дифференциальному центрифугированию (Ruth, 1978> на ультрацентрифуге L8-M фирмы "Вескшап"(США)

Получали лизосомный супернатанг (надосадочная жидкость) и обогащенную лизосомами фракцию (осадок), которую ресуспендировали 1:0,5 (сердце) и 1:¿> (печень) в буферном растворе 0.7 M сахарозы, I мМ ЭДТА ("Серва",ФРГ), pH 31 7.0. О структурной целостности лиэосом судили по величине активности лизосомных ферментов в различных фракциях. ,

Изучаемые активности лизосомных ферментов.

1.Активность ферментов, определяемая в супернатанте, обозначалась как свободная (Г.М.Дрогова, 1987) или неседимвнтируемая активность -NSA (Б.Ф.Коровкин и др., 198/; В.А.Фролов, 1986).

¿■Активность ферментов, определяемая в обогащенном лизосомном осадке и дбетупная для субстрата, характеризовалась как доступная . активность '- ЕД (Б.Ф.Коровкин и др., 1987; Г.М.Дрогова, 1987; В.А.Фролов, 1986)

3.После дезинтеграции мембран лиэосом методом замораживания и оттаивания (С.Buya et al., 1978) определялась общая активность фермента (СА)

Методы статистического анализа результатов.

1. Факторный анализ - это метод, с помощью которого исследуются взаимосвязи между наблюдаемыми переменными. В качестве количественной меры ейязн между переменными используются коэффициенты корреляции. Й результате анализа корреляционной матрицы получают величины, так называемые факторы, которые являются линейными комбинациями соответствующих • Переменных. Факторы представляют собой величины, не поддающиеся непосредственному измерению. Они не сразу определяются однозначно. После того, как было определено минимальное число факторов, адекватно описывающих наблюдаемые корреляции, а так же значения общностей каждой переменной, следующий шаг состоит в нахождении легко интерпретируемых факторов с помощью различных процедур вращения. При этом число

. факторов и значения общностей переменных фиксируются.

2. Метод главных компонент ориентирован на дисперсии. В качестве . первой главной компоненты в многомерном пространстве измерений

избирают направление, вдоль которого массив наблюдений имеет наибольший разброс (дисперсию). Выбор каждой последующей главной компоненты происходит так, чтобы разброс (дисперсия) наблюдений вдоль нее был максимальным и, чтобы эта главная компонента была ортогональна другим, уже выбранным ранее, главным компонентам.

3. Метол канонических корреляций позволяет определить наличие связи между линейными комбинациями двух каких-либо наборов взаимосвязанных между собой групп переменных. Он продуцирует некоррелированные пары одномерных переменных, являющихся лнн^йнмми комбинациями исходных. Причем аба члена пары коррелированы друг с

•другом. Пара с наибольшей по абсолютному значению корреляцией называется перной. Остальные пары упорядочиваются по убыванию вплоть до последней, которая может иметь и нулевую корреляцию. Соответствующие линейные комбинации называются каноническими переменными. Это позволяет выявить скрытые связи между группами.

4. Многомерный дисперсионный анализ позволяет выявить влияние качественных факторов на группу взаимосвязанных переменных, связью между которыми пренебречь нельзя.

Третья глава содержит собственные исследования.

Медико-биологические эксперименты по выявлению воздействия внешних факторов на функционирование биологических систем и организмов ло своей природе всегда являются многопараметрическими, поскольку внешние факторы, как правила, оказывают комплексное воздействие на различные системы организма и проявляются на разных уровнях его функционирования. Поэтому при статистической обработке ' приходится иметь дело с многомерными массивами данных. Исследование отдельных параметров может не отражать реально существующих внешних эффектов, так как, чаще всего, отдельные измеряемые параметры не несут достаточно полной информации о функционировании организма в целом или его частей.

В данной работе предлагается методика статистического анализа экспериментальных данных, основанная на комплексной обработке массивов большого числа измеряемых параметров, характеризующих различные стороны жизнедеятельности организмов.

На первом ,?тапд вся совокупность полученных данных обрабатывалась пятью методами факторного анализа: методом общностей равных множественных коэффициентов корреляции, поиска общностей методом итераций, методом максимального правдоподобия, центроидным методом н методом главных осей. Результаты различных подходов

сравнивались и выявлялся наилучший способ группировки параметров. В результате установлено оптимальное количество групп (факторов) и был определен их состав.

методом главных компонент для выяснения ее структуры, т.е. выявлению количества относительно независимых параметров, характеризующих поведение соответствующей группы переменных.

выделенными группами с помощью метода канонических корреляций.

Эта методика была применена для анализа упомянутого рышс хропобиологичсского эксперимента. Статистический анализ был применен к 19 измеренным параметрам (АРМАХ, APMIN, VPREALLV, VPMAXLV, VPREALRV, VPMAXRV, AHB, АРН, АРС02, АР02, АНСОЗ, VHB, VPH, VPC02, VP02, VHC03, CA, NSA, ЕА). В результате факторного анализа весь массив данных, в зависимости от метода, подразделился на 5 или 7 групп, структура которых затем была проанализирована методом главных компонент. Для выявления остаточных связей между группами методом канонических корреляций было взято 7 групп, выделенных на предыдущих этапах анализа:

Между первой и второй группам: была выявлена очень сильная корреляционная связь. Следовательно, эти две группы, фактически, образуют одну.

Окончательным результатом предварительной обработки данных является выделение следующих сравнительно независимых групп, сильно связанных между собой переменных:

каждая из выделенных групп подвергалась анализу

производился анализ остаточных связей между

1). АНСОЗ, VHC03; 2). АРН, АРС02, VPH, VPC02;

3). VPREALLV, VPMAXLV, VPREALRV, VPMAXRV;

4). АРМАХ, APMIN; 5). CA, NSA, EA; 6). AP02, VP02; 7). AHB, VHB.

1). АНСОЗ, APH, APC02, VHC03,„VPH, VPC02;

2). VPREALLV, VPMAXLV, VPREALRV, VPMAXRV;

3). АРМАХ, APMIN; 4). CA, NSA, EA; 5). AP02, VP02; 6). АНН, VHB.

Для исследования влияния временного, суточного и сезонного фактороп использовались методы многомерного многофакторного дисперсионного анализа. Они применялись по отдельности к каждой выделенной группе параметров. Использование многомерного дисперсионного анализа здесь обусловлено необходимостью учета значимых корреляций между параметрами внутри каждой отдельной группы. Пренебрежение этими связями ведет к серьезному искажению получаемых результатов (это имело бы место в случае применения одномерного

дисперсионного анализа к каждой переменной). В частности, гяо можно.

1

продемонстрировать на примере первой группы, для которой был проведен одномерный трехфакторный дисперсионный анализ для каждого из 6 параметров, входящих в эту группу. Сравнение результатов такого анализа с многомерным анализом проведенным сразу для всей группы показало, что в то время как одномерный анализ* указывает на отсутствие значимости фактора "время" для параметров АРН и VPH, для всей группы (при. многомерном анализе) уровень значимости этого фактора равен 0.025 (т.е. является значимым).

Дисперсионный анализ проводился как по иерархической схеме, где о

»

качестве главного фактора рассматривался "сезон", вторичного фактора -"дата" и третичного • "время", так и по полностью перекрестной схеме. Многомерный трехфакторный дисперсионный апллиз при иерархической классификации показал, что все группы исследованных параметров значимо (с уровнем значимости < 0.05) зависят от всех трех факторов ("время", "дата", "сезон"). Дисперсионный анализ при полностью перекрестной классификации выявил значимую зависимость всех факторов и всех их

взанмодейстний (парных и тройного) для первой, второй и пятой групп параметров. Для т[ тьей группы существует значимая зависимость только от "сезона" и его взаимодействий (парных и Тройного) с двумя другими факторами, для шестой группы • "дата", "сезон" и взаимодействия "время"-"сезо) ", "время"-"дата"-"сезои". Дла четвертой группы трехфакгорпый анализ провести не удалось из-за пропущенных значений экспериментальных величин.

В ааключецни перечислены основные результаты, полученные н диссертации, коротко говориться о перспективах применения предложенного истода статистического анализа данных.

. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫПОДЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Предложена методика статистического анализа данных, получаемых и ходе мсдико-биологическнх экспериментов, предназначенных для выявления воздействий внешних факторов, механизмы которых неизвестны, на функционирование биологических систем и организмов. Этот метод заключается в комплексной обработке массивов большого числа измеряемых параметров, характеризующих различные стброны жизнедеятельности организмов, результатом которой является выделение , сравнительно независимых групп сильно связанных между собой ' переменных и последующее изучение этих групп с помощью многомерного дисперсионного анализа.

2. Применение этого метода к данным хронобиолог; еского эксперимента, проведенного сотрудниками кафедры патологической . физиологии медицинского факультета РУДН, позволило выявить структуру взаимосвязей параметров ряда физиологических систем подопытных животных.

3. Установлено, что влияние внешний факторов оказывается' заметным уже на этане предварительного анализа экспериментальных

данных и выражается и воздействии на формирование структур линейных комбинаций параметров, входящих в отдельные группы и называемых в математической статистике факторами.

4. Метод позволил показать, что как правило, отдельные функциональные группы параметров описываются одним или несколькими статистическими факторами. В частности, биохимические параметры (СА, NSA, ЕА) описываются одним фактором, а параметры кислотно-основного состояния ЦНВ, АРН, АРС02, АР02, АНСОЗ, VHB, VPH, VPCQ2, VP02, VHC03) описываются тремя факторами, т.е. образуют три сравнительно самостоятельные Группы параметров (1. АНСОЗ, АРН, АРС02, VHC03, VPH, VPC02; 2. АР02, VP02; З.АНВ, VHB-).

5. Применение метода многомерного многофакторного дисперсионного анализа позволило подтвердить аффект временной, суточной и наиболее сильной сезонной зависимости в рассмотренном вксперименте.

6. Методы факторного анализа подтвердили более важную роль

4

параметров правогЪ желудочка сердца. Бшло показано, что в значения фактора, характеризующего поведение максимального и реального давлений желудочков сердца относительно больший вклад вносят Параметры правого желудочка.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Пухлянко М.Е., Шустов A.C., Фролов В.А., Пухляико В П. Статистический анализ хроиобиологических эффектов в кардиологии // Третья международная конференция "Математика. Компьютер. Образование".Тсз.докл.-М.1996,-С.К)8

2. Шустов A.C., Пухлянко М.Е., Фролов В.А., Пухлянко В.П. Статистическое исследование влияния временных факторов й кардиологии // Труды третьей международной конференции "Математика. Компьютер. Образование", Дубна 29 января • 3 февраля 1996, М.: РИИС ФИАН, 199Ö.-С..Ч36-338

3. Шустов A.C., Пухляико М.Е., Фролов В.А., Пухлянко В.П. Статистический анализ влияния сезонного и суточного факторов на сердечно-сосудистую систему подопытных животных // Четпертая международная конференция "Математика. Компьютер. Образование". Тез.локл.-МЛ997.-СЛ76.

4. Пухляико М.Е., Шустов A.C., Фролов В.А., Пухлянко В.П. Анализ

хроиобиологических эффектов в кардиологии с помощью методов

■о

многомерного дисперсионного анализа // Труды второй межвузовской конференции "Актуальные проблемы экологии", Москва 27-28 мая 1996, М.: Изд-во РУДН. - в печати

5. Шустов A.C., Пухлянко М.Е., Фролов В.А., Пухлянко В.П. Применение факторного анализа для первичной обработки данных и группировки параметров 8 хронобиологичлскнх экспериментах //Там же.

Пухлннко М.Е. (Россия) ПЛЛШИ'ОИЛШШ И ПРОВЕДЕНИЕ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА И МВДИКО-ВИОЛОШЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ Предложена методика статистического анализа данных, получаемых в ходе медико-биологических экспериментов, нредназначенных для выявления |к>здсйс1 вин внешних качественных факторов, механизмы которых неизвестны, на функционирование биологических систем и оршнип.чоо. Метод был применен для анализа данных хронобнологического »кснсримеита.

Усыновлено, что влияние внешних факторов оказывается заметным уже на franc предварительного анализа данных и выражается в ншдействнн на формирование структур линейных комбинаций групп параметров.

С помощью мегодов многомерного дисперсионного анализа подтвержден эф<(*жт временной, суточной и, наиболее сильной из них, слюнной зависимости.

Pukhlyanko М.Е. (Russia) PLANNING AND CONDUCTING STATISTICAL ANALYSIS IN MEDICO-BIOLOGICAL EXPERIMENTS The given method statistical analysis data of medico-biological experiments shows the Intimate connection between the external factors and the functions of the biological systems of the organism. The exact mechanism of its action is unknown. This method was applied for the analysis data of ' chronobioiogical experiment.

It was established, that the influence of the external factors was noticeable even at the preliminary data analysis, an'' have expressed itself in the formation of structural linear combination group parameters.

The multivariate analysis of variance method has confirmed the effect of time, date and season. Not to forget that the seasonal dependence dominated the rest.