Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментально-клиническое исследование антиоксидантных свойств флакозида при патологии печени

РГБ ОЛ

1 3 ^

На правах рукописи

ГАЛЛЯМОВА Рафия Касимовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ФЛАКОЗИДА ПРИ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ

14.00.25-фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск -

1 996

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, доктор медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор В.И. Ратников

доктор медицинских наук, профессор И.В. Чернова

профессор Л.П. Ларионов профессор Э.А. Оргеиберг

Ведущее учреждение - Институт фармакологии РАМН,

Москва

О (,

Зацита состоится¿¿У 1997 г. часов,

на заседании диссертационного Собета Д.08404.02 при Челябинской государственной медицинской академии по адресу:

454092, г.Челябинск, ул.Воровского.64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разосдан^^^^^дэб года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета-доктор медицинских наук,

профессор A.B. Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время выбор эффективных лекарственных средств при патологии печени невелик (Davis G.L., 1991; Рейзис А.Р. и др., 1992, 1996; Хазанов А.П., 1993; Лучшев Б.й.' и др.', 1995; Учайкин В.Ф. и др., 1995; Rvis-Moreno M., 1995; Pilette С.! 1995; Di-Bisceglie A.M., 1995). Несмотря на значительные достижения в изучении гепатитов различной этиологии, вопросы, связанные с причинами хронизации воспалительного процесса в печени и возможностью применения лекарственных средств с целью коррекции патологического состояния, остаются во многом неясными (Логинов A.C., 1991; АруинЛ.И., 1995; Серов В.В., Апросина З.Г., 1995). Разрешение этих задач является особенно важным при гепатите В, в связи с высоким уровнем заболеваемости HBV-инфекцией, ответственной за возникновение существенной части хронических форм, циррозов печени, гелатоцеллюлярного рака и 80% случаев злокачественного гепатита (Подымова С.Б., 1991, 1996; Ивлев A.C., Иваыкин В.Г. 1994; Учайкин В.Ф. и др., 1993, 1995; Perillo R.Р., 1995). Кроме того, в мире насчитывается более 300 млн носителей вируса В (Иахгильдян И.В., 1996; Maynard J.E. et all., 1988; Bonlno F. et al., 1993), среди которых высокий процент составляют дети.

Современные методы терапии хронического гепатита В (ХГВ) предполагают использование препаратов различного фармакологического действия: противовирусных (Ерыов Ф.И., 1995, 1996), иммуномодулируквдх (Алехин Е.К., Лазарева Д.Н., Сибиряк C.B., 1993; Утеыев B.C., Сергеев

A.C., Коростелев С.А., 1995), мембраностабилизируюцих (Скакун Н.П., 1993; Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1995) и других средств. Однако клиническое применение многих из созданных противовирусных средств оказапось ограниченным вследствие их недостаточной эффективности или проявленных побочных действий (Лучыев В.И. и др., 1995; Учайкин В.Ф. и др., 1995). Вместе с тем, в литературе имеются сведения о перспективности применения при патологии печени сравнительно новой фармакологической группы веществ, обладающей антиоксидантными свойствами (Albane Е. et al., 1993; Ames B.N. et al, 1993; Anderson P. et a]., 1994; Hal liwell R., 1994). Целесообразность развития указанного вида фармакотерапии обусловлена тем важным значением, которое имеет активация пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) в генезе печеночной патологии (Учайкин

B.Ф., 1977; Барановская В.Б., 1990; Кабакова А.Б., 1991). Эти вопросы особенно актуальны, в связи с их малой изученностью, для клиники детских инфекционных болезней (Малиновская В.В. и др., 1995)

Особый интерес с точки зрения выбора тактики поиска лекарственных

веществ для лечения патологических процессов в печени вызывают препараты природного происхождения. Так, в последние годы большое внимание уделяется использованию при хронической HBV-инфекции различных интер-феронов (Firbor J. et al., 1994; Zarski J.P. el al 1994; Pilette C., Cales P., 1995; Малиновская В.В. и др., 1995). В то же время остаются недостаточно изученными возможности применения для терапии лекарственных средств растительного происхождения. В этом аспекте особое внимание привлекают препараты, сочетающие несколько видов действия. В частности, подобным препаратом является флакозид, полученный из экстрактов листьев бархата амурского (Phellodendron amurense) и листьев бархата Лаваля (Phellodendron var. Laval le). Несмотря на то. что имеются сведения о противовирусной активности и гепатозащитных свойствах указанного препарата (Вичканова С. А. , Ыипулина Л.Д., 1987), его возможная роль в терапии заболеваний печени практически не исследована. Так, полностью не изучено влияние флакозида на процессы ПОЛ и состояние ан-тиоксидантной системы (АОС) организма, нарушения которых, как отмечено выше, нередко регистрируются при гелатобилиарной патологии.

Все перечисленное вше явилось обоснованием для экспериментального изучения антиоксидантных свойств флакозида и клинического исследования препарата в качестве средства этиопатогенетической терапии ХГВ у детей. Подобное исследование выполнено в соответствии с разрешением Фармакологического комитета РФ проведения клинических испытаний.

Цель работ. Проведение экспериментально-клинического исследования антиоксидантных свойств флакозида с анализом влияния указанного препарата на динамику биохимических, инструментальных и серологических показателей хронического гепатита В у детей.

Задачи исследования. 1.Определить характер воздействия флакозида на процессы перекисного окисления липидов при экспериментальных моделях гепатита.

2.Выявить влияние исследованного вещества на содержание церулоп-лазмина и активность пероксидазн в организме животных при инициации у последних реакций перекисного окисления липидов токсическими веществами.

3. Изучить влияние флакозида на процессы свободнорадикального окисления липидов у детей, больных хроническим гепатитом В.

4. Выяснить значение состояния антиоксидантной системы организма у больных ХГВ при клиническом применении флакозида.

5. Исследовать влияние флакозида, используемого в проводимой терапии, на течение хронического патологического процесса.

6.На основании полученных клинико-лабораторных данных определить

возможности и разработать схему применения флакозида при комплексном лечении детей с хроническим гепатитом В.

Научная новизна. Критериям новизны соответствует вся совокупность данных, полученных, при изучении влияния флакозида на процессы ПОЛ и состояние ДОС организма при моделировании патологии печени у экспериментальных животных. В частности, впервые установлено наличие у флакозида способности угнетать избыточную липопероксидацию, оказывая в то же время активирующее воздействие на пероксидазу и повшая уровень це-рулоплазмина в сыворотке крови.

Впервые проведено клиническое изучение эффективности флакозида при включении последнего в комплексную терапию ХГВ у детей. Новыми являются данные о терапевтическом действии флакозида при указанном заболевании, что проявлялось более быстрым купированием патологического процесса с нормализацией его лабораторных показателей.

В диссертации впервые разработана, апробирована и предложена для внедрения оптимальная схема применения флакозида в лечении детей, больных ХГВ.

Существенно расширены представления о характере фармакологической активности флакозида, как нового перспективного антиоксидантного средства, проявляющего свое действие, в частности, при патологии печени. Получены новые данные о способности эссенциале значительно оптимизировать влияние флакозида на оксвдантный статус организма и восстановление нарушенных функций печени.

Практическое значение. Изучение антиоксидантной активности флакозида послужило научным обоснованием для применения препарата в практическом здравоохранении в качестве патогенетического средства при фармакотерапии хронического гепатита В у детей. Внедрение флакозида в лечение указанного заболевания использовано также для повышения эффек тивности терапии гепатопротекторами.

Исследование показателей перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы здоровых детей и больных хроническим гепатитом позволило установить возрастные нормы, которые могут быть использованы в педиатрической практике. Определены наиболее информативные показатели, отражающие активацию процессов липидной пероксидации и нарушений ь антиоксидантной системе больных, необходимые и практической работе для выявления обострений хронического процесса.

На основании изучения влияния флакозида на биохимические показатели и динамику маркеров вируса В в периферической крови у больных хроническим гепатитом обоснована целесообразность систематического

контроля за функциональным состоянием печени, антиоксидантной системы организма и серологической характеристикой возбудителя для своевременного проведения повторного курса тералии. Использование в патогенетической терапии флакозида по предложенной схеме при обострениях хронического гепатита В у детей позволило сократить срок пребывания в стационаре, добиться более стабильной ремиссии и улучшить прогноз заболевания.

Внедрение в практику. Новые данные, расширяющие имеющиеся представления о фармакодинамике флакозида, используются при изучении фармакологии студентами Челябинской государственной медицинской академии.

Установленные нормативы и отбор наиболее информативных показателей перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы детского организма внедрены в повседневную работу городского гепатитного центра (специализированный инфекционный стационар, кабинет диспансерного наблюдения, санаторий). Лечение препаратом флакозид больных хроническим гепатитом В внедрено в детский инфекционный стационар клинической больницы N 8 города Челябинска.

Апробация работа. Материалы работы доложены и обсуждены на межинститутских научных конференциях "Актуальные вопросы теоретической и практической медицины" (Челябинск, 1993, 1994, 1995), на научной конференции НИИ детских инфекций (г.Санкт-Петербург, 1994), на объединенном заседании кафедр фармакологии и детских инфекционных болезней (Челябинск, 1996), на научно-практической и учебно-методической конференции специалистов здравоохранения Урала (Челябинск, 1996).

По основным положениям диссертационной работы опубликовано 5 статей.

Обьек и структура диссертаций. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложений. Указатель литературы включает 346 источников (230 отечественных и 116 зарубежных). Работа представлена на 189 страницах машинописного текста. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 19 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материала и методы исследования. В настоящей работе проведено экспериментально-клиническое изучение роли процессов свободнорадикаль-ного окисления липидов при патологии печени и возможности использования в качестве лечебного препарата флакозида. Флакозид. представляющий

собой индивидуальный флавоноидный гликозид 8-(3-метилбут-2-енил)-5,4 диокси-7-0-В-0-глюкопиранозилфлавононол, получен из листьев бархата амурского (Phellodendron amurense) и листьев бархата Лаваля (Phello-dendron var. LavalЗе Rode Spague) семейства рутовых (Rutaceae) и предложен для клинического изучения в виде таблеток белого цвета по 0,1 г. Для более полной характеристики фармакодинамики и перспективности применения нового препарата при патологии печени осуществлен полный цикл исследований антиоксидантных свойств флакозида от экспериментального изучения до этапа клинических испытаний.

Экспериментальная часть работы выполнена на 690 беспородных лабораторных мыиах обоего пола массой 18-21 г. Для оценки антиоксидантного эффекта у флакозида использованы две модели гепатита токсической этиологии, один из которых вызывали у грызунов путем подкожного 4х - кратного введения 50Х маслянного раствора тетрахлорметана (CCL4) в дозе 2 г/кг массы тела (Левыин Б.И., 1973). Для моделирования алкогольного гепатита животным предоставляли 15% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости без ограничений в потреблении корма (Лебедев И.В. , 1988). Целесообразность выполнения исследований на моделях алкогольного и CCL4 - гепатитов определялась рядом обстоятельств. Во-первых, учитывая антиоксидантную направленность в исследовании терапевтического эффекта флакозида, представлялось интересным проанализировать его способность подавлять индуцированные гепатотоксинами процессы ПОЛ. Моделям токсического гепатита отдано предпочтение в связи с тем, что используемые при этом яды-прооксиданты, каковыми являются СС!,4 и этанол, усиливают липопероксидацию с угнетением АОС печени (Са-ратиков A.C., Венгеровский А.И., 1995). Во-вторых, при выборе экспериментального гепатита не целесообразно было моделировать вирусную инфекцию, в реализации терапевтического эффекта против которой могло иметь значение собственное противовирусное действие препарата.

Интенсивность процессов ПОЛ "in vivo" и "in vitro" оценивалась no совокупности методов регистрации образующихся продуктов перекисного окисления липидов посредством ультрафиолетовой спектрофотометрии (Владимиров ¡O.A. , 1986). Экстракция липидов осуществлялась смесью геп-тан-изопропанол (Косухин А.Б., Ахметова B.C., 1987). Об активности свободнорадикаяьного окисления липидов судили по изменению концентрации первичных (диеновые коньюгаты гидроперекисей) и вторичных (кетоди-ены, сопряженные триены) продуктов ПОЛ в печени и крови животных, используя соотношение величин оптической плотности Е232/220 и Е278/220 (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., ЛифыицР.И., 1989). Динамика накопления малонового диальдегида (МДА), являющегося ключевым

промежуточным продуктом процессов ПОЛ, оценивалась традиционным способом с использованием тиобарбигуровой кислоты {Ргуог W.A., 1976).

В основу изучения интенсивности ферментативного и неферментативного ПОЛ положен метод комплексного спектрофотометрического определения первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации в гомогена-тах печени мышей в условиях''^ vitro". Исследования проводились параллельно в аскорбатзависимой (АЗП), НАДН-зависимой (НЗП) и в несодержа-■цей инициаторов ПОЛ системах (Карузина И.И., Арчаков А.И.. 1988).

Для оценки состояния АОС у подопытных животных регистрировали содержание церулоплазмина (ЦП) в крови и гомогенатах печени (Лившиц В.И., Король Д.Р., Лялюшко И.М., 1992). Пероксидазную активность определяли по методу Тэн Э.В. (1981), а содержание белка - методом Green-berg С., Craddock Р. (1982).

Степень выраженности синдрома цитолиза гепатоцитов оценивали по активности ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминот-рансферазы (АсАТ) (КолбВ.Г., Камышников B.C., 1976).

На клиническом этапе выполнения работы лабораторному и инструментальному обследованию при поступлении и после проведения стационарного лечения подвергнуто 100 детей, больных ХГВ, что позволило оценить эффект включения в комплексную патогенетическую терапию испытуемого препарата. Диагноз хронической формы НВ-вирусной инфекции у всех пациентов (64 мальчиков и 36 девочек, средний возраст которых составил 7,9+0,18 года) был установлен на основании изучения анамнеза заболевания, эпидемиологических данных, жалоб, объективных проявлений болезни, результатов лабораторных и инструментальных методов исследования. Продолжительность заболевания у детей до начала настоящего исследования составляла 1 11 лет (средняя длительность - 2,2+0,21 года). Группой сравнения служили 30 здоровых детей (20 мальчиков и 10 девочек, средний возраст - 7,1+0,14 года). Для оценки процессов перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы организма у наблюдаемых пациентов проводили специальные методы исследования, которые включали определение содержания: 1.малонового диальдегида в сыворотке крови по модифицированному методу Э.Н. Коробейниковой (1989); 2.диеновых коньюгат в сыворотке крови по методу В.А.Костюк, А.И. Потапович, Е.Ф.Лунец (1984); 3. диенкетона по методу В.А.Костюк, А.И.Потапович, Е.Ф. Лунец (1984); 4. церулоплазмина в сыворотке крови модифицированным методом Ревина (C.B. Бестужева, В.Г.Колб, 1976); 5. активности пе-роксидазы по методу Т.Попова, Л.Нейковска (1971).

Функциональные исследования печени включали определение в крови билирубина и его фракций по унифицированному методу Ендрассика-Клег-

горна-Гоффа, описанному В.В.Меньшиковым (1987); активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз по унифицированному методу Райтма-на-Френкеля (1978); общего белка рефрактометрическим методом и белковых фракций по унифицированному методу электрофоретического разделения на бумаге. Кроме того, у всех пациентов проведены тимоловая и сулемовая пробы по унифицированным методикам, описанным В.В.Меньшиковым (1987), и исследования периферической крови (Р.П.Золотницкая,1987). У обследованных детей проводились тесты, отражающие синтез в печени про-коагулянтов крови (фибриноген, протромбиновый индекс).

Методами радиоиммунного и иммуноферментного анализов у обследованных пациентов исключено наличие в организме вирусов гепатитов А, С, Д и выявлялись маркеры HBV-инфекции.

Радионуклидное сканирование печени и селезенки осуществляли с помощью сканирующих устройств, используя радиоактивные индикаторы, что имело важное значение в распознавании хронического гепатита. Кроме того, для идентификации хронической формы HB-вирусной инфекции использовали эхогепатографические (ЗГГ) и ультразвуковые исследования (УЗИ). Выполнены также фракционное дуоденальное зондирование и биохимическое исследование желчи по общепринятым методикам.

Результаты экспериментально-клинического изучения флакозида при патологии печени обработаны с помощью методов математической статистики. Для оценки эффективности терапии хронической формы HB-вирусной инфекции у детей по качественным показателям использовали метод математической обработки, предложенный P.A. Фишером (1958). Статистическая обработка цифровых данных проводилась общепринятыми методами вариационной статистики с применением I- критерия Стыодента. Различия считали достоверными при р.0,05. (Поляков И.В., Соколов Н.С., 1975).

Результата исследования и их обсуждение.

Проведенные исследования показали наличие однонаправленных изменений показателей содержания в гомогенатах печени и крови продуктов ПОЛ и состояния АОС у мышей при различных формах токсического поражения печени. Из двух токсических соединений, использованных в работе, большую активность в формировании патологического процесса в печени проявил CCL4, чем этанол. Это подтверждено тем, что, во-первых, цито-литический синдром регистрировался у животных после 4х - краткого введения тетрахлорметана. В опытах же с использованием этанола для затравки мышей биохимические признаки гепатита проявились лишь при 15-дневном приеме вещества. Во-вторых, более значительное увеличение аминотрансфераз в крови экспериментальных животных, характеризующее выраженность повышенной проницаемости клеточных мембран (Виноградова

Л.Ф., Мирзоян Ж.А.,1993; Гонский Я.И. и др., 1995), отмечено в серия> опытов с введением ССЬ4. Так, 4х-кратные инъекции тетрахлорметана V мышей спровоцировали увеличение содержания аланин- и аспартатаминот-рансфераз (АлАТ и АсАТ) в крови в среднем соответственно в 2,75 и 1,71 раза по сравнению с контролем, тогда как в сериях экспериментов с использованием этанола эти же показатели возросли лишь в 1,71 и 1,36 раза. В третьих, у грызунов, затравку которых проводили ССЬ4, зарегистрированы в 1,2 раза меньшие средние величины содержания белка в крови, по сравнению с опытами с этанолом. В-четвертых, статистически достоверное повышение концентрации билирубина в крови грызунов оказалось характерным только при ССЬ4 - гепатите.

Рисунок 1

ИЗЙЕНЕНИЕ РЯДА ШШйЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ У МЫШЕЙ ПРИ ИНДУЦИРОВАННОЙ ССЫ ИЛИ ЭТАНОЛОМ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ

1

300 -250 -200 -150 -100 -50 -

ААА

га

АА

**

ААА

га

АА

га

ААА

га

АлАТ

АсАТ

альбумин билирубин

Примечание. Средние изменения показателей в процентах по сравнению с началом эксперимента - 1 при воздействии:

ви

□

этанолом (40 тр ежедневно в течение 15 дней) - ССЬ4 (40 шд ежедневно в течение 4-х дней).

Кроме того, тетрахлорметановая затравка приводила к большему приросту содержания как первичных (Е232/220), так и вторичных (Е278/220) продуктов ПОЛ в тканях печени и крови у подопытных животных (рис.2).

В исследованиях установлено, что введение токсических веществ изменило не только содержание в организме животных продуктов ПОЛ, но также и уровни церулоплазмина и пероксидазы. Причем, действие CCL4 на указанные эндогенные антиоксиданты проявлялось в более значительной степени по сравнению с влиянием этанола на состояние АОС организма у экспериментальных животных. Так, средние величины содержания церулоплазмина и активности пероксидазы в крови мышей при CCL4 - затравке оказались ниже соответственно в 1,58 и 1,66 раза, чем после алкогольной интоксикации. Расчет коэффициента корреляции между снижением концентрации церулоплазмина и увеличением содержания малонового диальде-гида в крови грызунов (г=-0,71, pcO.OOl и г=-0,59, р<0,001 соответственно при тетрахлорметановом и алкогольном гепатитах) подтвердил зависимость интенсификации процессов ПОЛ от состояния АОС организма. Известно, что при чрезмерном поступлении в организм токсических веществ, в частности, тетрахлорметана или этанола, происходит истощение антиок-сидантной системы и накопление продуктов свободнорадикального окисления липидов (Лебедев И.В., 1988; Виноградова Л.Ф., 1993).

В проведенных экспериментах установлена прямая корреляционная зависимость между приростом показателя концентрации МДА в периферической крови грызунов и активностью АлАТ (г=0,78, р<0,001 - при тетрахлорметановом; г=0,77, р<0,001 - при алкогольном гепатитах). На основании этого можно предположить, что увеличение уровней продуктов ПОЛ имеет значение в повышении проницаемости клеточных мембран. Кроме того, известно, что с химической активностью свободнорадикальных продуктов тесно связаны не только процессы окислительной деградации липидов клеточных мембран, но и антигенного материала в фаголизосомах, а также экспрессия активности целого ряда медиаторов иммунитета и осуществление цитотоксических клеточноопосредованных реакций (Маянский Д.И., 1991; Takahaki 3. et а!., 1991; Hori Т. etal., 1992; Ward P.A., 1993).

При введении флакозида отмечалось уменьшение содержания в крови грызунов АлАТ (рис.3) при одновременном снижении концентрации продуктов ПОЛ (рис.4). Следует также отметить, что на фоне введения флакозида тяжесть спровоцированной тетрахлорметаном патологии печени уменьшилась. Нормализация содержания изученных продуктов ПОЛ под влиянием флакозида достигалась через 15 дней его применения при алкогольной и через 30 суток - при тетрахлорметановой патологии печени (табл.1).

- И -

Рисунок 2. СОДЕРЖАНИЕ ПРОДУКТОВ ПОЛ В ПЕЧЕНИ И КРОВИ МЫШЕЙ

ПРИ ТОКСИЧЕСКИХ ГЕПАТИТАХ

__- ССЬ4 - гепатит,

Е232/220 и Е273/220 - содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Рисунок 3

Влияние флакозида на тяжесть течения ССЬ4 -гепатита у мышей

8.7%

13%

60,9%

8,7%

47,8%

А

Примечание. Тяжесть поражения -печени оценивали по кратности увеличения АлАТ:

- ЛЕГКИЕ ПОРАЖЕНИЙ (В 2 РАЗА), -ПОРАЖЕНИЯ СРЕДНЕЙ ТЯЖЕСТИ (2-»РАЗА), -ТЯЖЕЛЫЕ ПОРАЖЕНИЯ {В 5 И БОЛЕЕ РАЗ),

I ' 3 -НЕТ ПОРАЖЕНИЙ.

А - ССЬ4- гепатит на фоне флакозида, Б - флакозид не вводился

Рисунок 4.

Эффект флакозида на накопление продуктов ПОЛ и уровень церулонлазмина в крови и печени мышей, подвергнутых воздействию ССЬ4 или этанола

Е232/220, печень

! 4

Ч •

К

( ;

» . •••

I-

цп

кровь

-Л —-4'-

! »'/

У?

/

Е278/220 кровь

Е232/220 кровь

4

5

Е278/220 печень

Примечание. Эффекты выражены в 1 к контролю (окружность проведена через 1007. отметку). Е232/220 - первичные, Е278/220 - вторичные продукты ПОЛ, ЦП-церулонлазмин. 1-5 - группы животных: 1-интактные мыии;2-мыыи, подвергавшиеся воздействию этанолом, но не получившие флакозид; 3-животные, получаваие флакозид на фоне введения этанола; 4- грызуны не получившие флакозид при затравке СШ; 5-иивотше, получившие флакозид при токсическом воздействии ССЬ4.

Таблица 1

ИЗШШННЯ СОДЕРЖАНИЯ НАЛОГОВОГО ДШЬДЕГИДА В ПЕЧЕНИ «.МЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ФЛАКСЗИДА

Условия эксперимента Продолжительность введений препарата (сутки) п Сод ержание МДА,мкмоль/мг

М+т р2-рЗ Р4-Р5

Интактные мыши, р1 - 15 0,160+0,021

Алкогольный

гепатит /контроль/, р2 - 12 0,445+0,041

Р2-Р1 <0,001

Алкогольный 5 10 0,389+0,031

гепатит + флакозид 10 8 0,271+0,039

в дозе 10 мг/кг, рЗ 15 10 0,164+0,016 ***

20 8 0,160+0,02.2 ***

ССЬ4 - гепатит

(контроль), р4 - 15 0,475+0,043

р4-р1 <0,001

СС14 - гепатит +

флакозид в дозе 10 8 0,405+0,078

10 мг/кг, р5 15 8 0,406+0,041

30 9 0,174+0,039 •kick

45 8 0,169+0,036 ***

Примечание. Злесь и далее по тексту: р - достоверность различий сравниваемых показателей, * - р<0,05, ** - p<0,Ql, *** - р<0,001

Экспериментальные исследования в условиях "in vitro" позволили установить, что при добавлении инициаторов ПОЛ к гомогенатам печени мыыей с токсическими формами гепатита, при предварительном введении флакозида, наблюдалось не снижение, а, наоборот, некоторый прирост продуктов перекисного окисления липидов. Подобное явление может быть обусловлено тем. что флакозид. препятствуя ПОЛ "in vivo", сохранял легко окисляемые фракции липидов, которые при последующем добавлении инициаторов пероксидации определяли в условиях "in vitro" прирост первичных и вторичных продуктов этого процесса (табл. 2).

- 15 -

Таблица 2. ВЛИЯНИЕ ФЛАКОЗИДА НА «РШПАТИВНОЕ (НЗП) И НЕФЕРЮТАТИВНОЕ (АЗП) ПОЛ

Вид Содержание первичных продуктов ПОЛ в гомогекатах печени

ПОЛ Интактные мыши Алкогольный гепатит Алкогольный гепатит + флакозид ССЬ4-гепатит ССЬ4-гепатит + флакозид

р1 Р2 рЗ р4 р5

АЗП НЗП 0,50410,02 0,36010,03 0,39210,02 р2-р1<0,05 0,200+0,03 р2- рКО, 05 0.60710.04 рЗ-р2<0,001 рЗ-р!>0,05 0,42010,03 рЗ-р2<0,001 рЗ-р1>0,05 0,16310,02 р4-р1<0,001 0,191+0,02 р4-р1<0,01 0,44310,03 р5-р4<0,001 р5-р!>0,05 0.36410,05 р5-р4<0.05 р5-р1>0,05

Содержание вторичных продуктов ПОЛ в гоыогенатах печени

АЗП НЗП 0,79710,06 0,58110,03 0,417+0,04 р2-р1<0,001 0,21710,02 р2-р1<0,001 0,73210,04 рЗ-р2< 0,001 рЗ-р1>0,05 0,57910,03 рЗ-р2< 0,001 рЗ-р1>0,05 0,27710,02 р4-р1<0,001 0,19910,02 р4-р1< 0,001 0,63710,03 р5-р4<0,001 р5-р1>0,05 0,43710,05 р5-р4<0,001 р5-р1>0,05

Следующим этапом анализа антиоксидантных свойств флакозида явилось исследование влияния препарата на содержание церулоплазмина и активность пероксидазы в организме подопытных животных. Оценка действия препарата с этой стороны представлялась чрезвычайно важной, так как, именно эндогенные антиоксиданты в значительной степени определяют скорость цепных свободнорадикальных реакций (Рейзис А.Р., 1992; МатЮЫИН Б.Н., 1992).

В целом проведенные серии экспериментальных исследований позволили выявить ряд особенностей влияния флакозида на состояние АОС мышей. Во-первых, флакозид, уменьшая содержание продуктов ПОЛ у эксперимен-

- 16 -

тальник животных, способствует восстановлению эндогенных антиоксидан-тов в организме. Данный феномен обусловлен, по-видимому, заметным снижением свободных радикалов, способных разрушать эндогенные антиокси-данты (Владимиров Ю.А., 1987; Пак С.Г. и др.,1991; РейзисА.Р., 1992). Во-вторых, продолжительность введения препарата для нормализации рару-шенного оксидантного состояния организма была вдвое короче (15 суток) при алкогольном поражении печени.

Получив убедительные данные, свидетельствующие о проявлении фла-козидом антиоксидантных свойств в экспериментальных условиях, нами проведены аналогичные исследования в клинике у детей с патологией печени. В качестве последней выбрано обострение хронического гепатита В. для которого, как следует из многочисленных источников мировой медицинской литературы, характерным является усиление процессов перекисно-го окисления липидов (Halliwel R., 1991; Clemens M.R., 1991; Diplock A.T., 1992; Anderson P. et al., 1994). Кроме того, многие авторы обнаружили у пациентов, обследованных в период обострения хронического гепатита В, феномен истощения эндогенной антиоксидантной системы организма (Рейзис А. Р. , 1992; Матюиин Б.Н., 1992; De Forg I.E. et al., 1992; Dumitresen С., 1992; Малиновская B.B. и др., 1995). С указанными выше целями нами проведены исследования ПОЛ и ряда показателей АОС организма у 100 детей, поступивших в стационар по-поводу обострения обнаруженной у них патологии печени.

Обострение инфекционного процесса сопровождалось отчетливыми признаками усиления свободнорадикальных реакций. Об этом свидетельствовало, в частности, повышение уровня малонового диальдегида в среднем в 1,5 раза. Одновременно у детей при поступлении на стационарное лечение регистрировалось повышение содержания в крови диенкетона в среднем в 1,98 раза относительно контрольного значения указанного показателя. При исследовании уровня диеновых коньюгат выявлены также сдвиги в сторону его увеличения в среднем в 1,71 раза по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей. Приведенные данные отражают в своей совокупности усиление реакций перекисного окисления липидов при неблагоприятном течении ХГВ, а именно, в период обострения данной патологии печени. Кроме того, при индивидуальном анализе историй болезни установлена определенная зависимость выраженности нарумений свободнорадикальных процессов от предшествующего числа обострений болезни. Так, у 36 из 100 пациентов в анамнезе имелось более 5 обострений ХГВ. Обнаружено, что, именно у этих пациентов, регистрировались наиболее высокие уровни исследованных продуктов ПОЛ. Таким образом, полученные данные полностью совпадают с результатами других авторов (Diplock А.Т., 1992; Anderson P. et al.. 1994) и свидетельствуют, что одним из патогенетических механизмов при обострении хронического Еирусного гепатита у де-

- 17 -

тей является усиление процессов перекисного окисления липидов.

Включение флакозида в лечение пациентов с ХГВ сопровождалось более быстрой нормализацией процессов ПОЛ, чем это достигалось при обычно проводимой терапии. Наиболее значительным терапевтическое действие отмечено после 4х- недельного применения исследованного препарата.

Действие флакозида сопоставлено с эффектами комплексного лечения больных ХГВ с добавлением вместо флакозида препарата эссенциале. Это было целесообразно, учитывая обсуждающийся в последние годы в литературе вопрос о вкладе полиненасыщенных фосфолипидов, входящих в состав эссенциале, в антиоксидантную активность организма (Саратов A.C., Венгеровский А.И., 1995) и стабилизацию клеточных мембран (Утешев B.C., Ласкова И.Л., 1995). Согласно полученным при этом данным, наиболее выраженное снижение содержания продуктов ПОЛ в периферической крови отмечено у пациентов, в комплекс медикаментозного лечения которых был включен не эссенциале, а флакозид. При этом средние показатели содержания малонового диальдегида, диеновых коньюгат, диенкетона в крови у больных после 4-х недельной терапии снижались до нормативных значений (табл.3). Кроме того, обнаружен синергизм при одновременном применении флакозида с эссенциале. Именно у детей, при лечении которых использованы оба препарата, наблюдалось наиболее быстрое восстановление уровней изученных продуктов ПОЛ. Обнаружена связь с указанными изменениями динамики заболевания, т.к. при одновременном использовании флакозида с эссенциале средний период пребывания больных в стационаре был наименее продолжительным (при использовании эссенциале - 52,9+5,72 суток; при использовании флакозида - 27,9t0,86 суток; при применении обоих препаратов - 21,9+1,03 суток). Вероятно, более быстрый эффект нормализации перекисного окисления липидов приводил к укорочению времени циркуляции в крови реактогенных метаболитов, повреждающих органы и ткани организма, и, в первую очередь, клетки печеночной паренхимы. На существование подобной причинно-следственной связи указывают многие исследователи, анализировавшие упомянутую нами зависимость (Clemens M.R., 1991; Cerutti Р. et al., 1992; Насыров X.M. и др., 1995).

С целью объективизации полученных данных о фармакологической коррекции процессов ПОЛ флакозидом у больных ХГВ проведено изучение состояния некоторых показателей собственной антиоксидантной защиты организма. При этом установлено, что снижение в среднем в 1,57 раза содержания церулоплазмина в периферической крови в периоде обострения ХГВ наблюдалось у 71 I детей. При обострении ХГВ отмечен также статистически достоверно низкий показатель активности пероксидазы, что обнаружено у 75 из 100 пациентов. Подобная направленность изменений исследованных показателей АОС организма может способствовать активации процессов ПОЛ в период обострения заболевания у обследованных лиц. Кроме

Таблица 3

ВЛИЯНИЕ ФЛАКОЗИДА НА ПЕРЕПИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ В У ДЕТЕЙ

Группы Число Показатели ПОЛ

наблюдения детей Малоновнй Диеновые Диенкетон,

днальдегид. коньюгатн, мкм/мл

нм/мл мкм/мл

М+т М+т М+Ш

Группа А 30

до лечения 5,25+0,190*** 5,28+0,204*** 2,56+0,273**

эссенциалием,р2

после лечения,рЗ 4,96+0,172 4,71+0,222 2,37+0,136

рЗ-р2 >0,05 >0,05 >0,05

Группа Б

до лечения 30

флакозидом,р4 5,27+0,199*** 5.35+0,319*** 2,51+0,158***

после лечения,р5 4,02+0,118 3,16+0,163 1,82+0,065

р5-р4 <0,001 <0,001 <0.01

Группа В

до лечения 30

флакозидом

с эссенциале.рб 5,82+0,226*** 5,73+0,234*** 2,78+0,105***

после лечения,р? 3,8110,136 3,44+0,085 1.54+0,054

р7-рб <0,001 <0,001 <0,001

Контрольная

группа, р1 30 3.62+0,036 2.74+0.136 1,52+0,085

(здоровые дети) .. ,

Примечание. ** р<0,01. *** р< 0,001 - сравнение с контрольным значением р1.

того, при индивидуальном анализе анамнеза заболевания у пациентов отмечена зависимость степени нарушения изученных показателей антиокси-дантной системы от продолжительности хронического процесса. Так, наиболее низкие показатели АОС наблюдались у 14 детей, страдающих хроническим гепатитом В более 5 лет. При этом уровень церулоплазмина был снижен в среднем в 1,99 раза, а активность пероксидазы - в среднем в 3,04 раза против соответствующих величин у здоровых детей. Проведенное исследование выявило также значительные изменения антиоксидантного

статуса организма у больных хроническим гепатитом с частыми обострениями процесса. Показатели, отражающие состояние антиоксидантной системы у 36% пациентов с ежегодными неоднократными обострениями, были наиболее сниженными: уровни церулоплазмина и активности пероксидазы - в среднем в 2,03 и 3,5 раза соответственно. Подобное резкое изменение указанных величин свидетельствовует. по мнению большинства авторов, об истощении защитных антиоксидантных систем (Матюыин Б.Н., 1992; Albano Е., 1993; Ames B.N. et al., 1993).

После установления особенностей состояния некоторых показателей АОС организма детей с ХГВ, проведено исследование характера влияния на эти процессы флакозида, использованного на фоне обычно проводимой (базисной) терапии указанного заболевания. Анализ влияния флакозида на ан-тиоксидантный статус больного хроническим гепатитом В позволил установить, что применение препарата не только предупреждало дальнейшее снижение показателей содержания вышеописанных антиоксидантов, но и способствовало восстановлению последних до контрольного уровня у здоровых детей (табл. 4). Назначение больным ХГВ флакозида в комплексе с зссен-циапе имело ряд преимуществ, что находится в соответствии с результатами других авторов, показавших наличие антиокислительной активности у эссенциале (Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1995).

Отмеченное антиоксидантное действие флакозида сопровождалась изменением содержания аминотрансфераз в периферической крови. Установлена прямая корреляционная зависимость между снижением уровней МДА и АлАТ в периферической крови у больных детей ХГВ после приема препарата (г=0,69, р<0,001).

В ходе исследования у 872 детей с обострением хронического процесса HBV-инфекции выявлена анемия, что различными исследователями связывается с повышенным разрушением эритроцитов в условиях дефекта антиоксидантной защиты организма и активации процессов ПОЛ (Балкова В.В. и др., 1992; Зограбян Л.С., 1991; Королько Ю.Р., 1993). При использовании флакозида наблюдалось достоверное увеличение количества эритроцитов в периферической крови пациентов, что коррелировало с ингибированием препаратом процессов ПОЛ, в частности, с содержанием МДА (г=-0,57,р< 0,01).

На этапе изучения антиоксидантной активности исследованного препарата проведен анализ влияния флакозида на динамику показателей содержания белка в периферической крови, холестерина и - липопротеидов в желчи больных ХГВ. Результаты исследования показали, что флакозид, использованный в течение месяца в суточной дозе 10 мг/кг, стимулировал синтез белка. Полученные данные совпадали с имеющимися в литературе сведениями о том, что в периоде обострения хронического гепатита В нарушение синтеза белка, процессов желчеобразования и экскреторной функ-

Таблица 4. СОСТОЯНИЕ АЯГИОКСНДАНГНОЙ СИСТЕМЫ ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ХГВ,

ПРИ ЛЕЧЕНИИ ФЛАКОЗИДОМ

Группы Показатели ДОС

наблюдения Церулоплазмин, мг/л Пероксидаза,моль/с.л

М+т Достоверность различий М+т достоверность различий

п Р1 Р2 Р1 Р2

Группа А до лечения зссенциалием после лечения Группа Б до лечения флакозидом после лечения Группа В до лечения флакозидом с эссенциале после лечения Контрольная группа (здоровые дети) 30 30 30 30 186,6+15,56 182,0+17,74 179,0+12,04 323.2+14.80 173,5+16,84 294,9114.31 283,2+12,05 •к** *Л* *** < 0,001 < 0,001 2,8+0,27 3,4+0,35 2,9+0,25 4,9+0,29 2,2+0,21 4,2+0,36 5,0+0,27 *** ** * *** < 0,001 < 0,001

Примечание, п - число детей в группах наблюдения. р1-сравнение показателя с контрольным и р2 - с исходным значением.

ции печени могли быть обусловлены усилением перекисного окисления липи-дов ¡Виноградова Л.В. и др., 1989; МаНек г. е1а!., 1991). Известно, что антиоксиданты через систему цитохрома Р-450 способны катализировать биосинтез многих белков (Маие1Б К. е1а1., 1991), а увеличение, в частности, синтеза альбуминов может иметь важное значение для улучшения экскреторной функции печени (МаИе15 Г. е1 а1., 1991). Так, у 361 обследованных пациентов с обострением хронического гепатита В, у которых по данным УЗИ печени, желчного пузыря и дуоденального зондирования выявлена еще и дискенезия желчевыводящих путей, после 4-х недельного приема флакозида удалось восстановить биохимические показатели желчи.

Следует отметить, что нормализующее воздействие флакозида на такие важные патогенетические механизмы развития поражений печени, как активация процессов перекисного окисления липидов и снижение содержания некоторых антиоксидантных факторов, сопровождалось соответствующими клинико-лабораторными сдвигами, свидетельствующими о положительной динамике в развитии болезни. В частности, это подтверждено при исследовании серологических маркеров вируса гепатита В. Так, при использовании е комплексной терапии флакозида, соотношение серологических маркероЕ HBV-инфекции существенно изменилось через 6 месяцев после окончания лечения. Это происходило главным образом за счет урежения случаев выявления HBsAg в сыворотке крови у детей. Сходные результаты подучены у пациентов при клиническом исследовании комплексного использования флакозида с эссенциале. Частота же HBs-антигенемии у больных ХГВ, пролеченных эссенциале, по окончании б-ти месячного срока наблюдения колебалась примерно в тех же пределах, что и до начала терапии.

Сопоставляя данные проведенных клинических исследований флакозида, можно отметить, что эффективность препарата была более значительной у HBeAg-позитивных больных ХГВ. Это обстоятельство согласуется с данными других авторов (Bonino F. et al., 1994; Thomas H.C., Garman W.F., 1994), отметивших иммуномодулирующий эффект y HBeAg и иммуносупрессив-ный - у HBsAg с анти-НВсог. При этом ингибирование флакозидом процессоЕ ПОЛ является, по-видимому, одним из определяющих факторов в общей закономерности положительного влияния препарата на разные органы и системь больного ХГВ.

В результате выполненных исследований установлено, что одной иг важных сторон фармакодинамики флакозида является наличие у данного препарата отчетливого антиоксидантного действия. Этот эффект препарата реализуется как при моделировании в эксперименте патологии печени, так ^ в клинических условиях при терапии хронического гепатита В у детей.

ВЫВОДЫ

1. Флакозид в дозе 10 мг/кг подавляет накопление первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов, индуцированное тетрах-лорметаном и этанолом при моделировании у животных патологии печени, от степени тяжести которой зависит продолжительность введения препарата для достижения терапевтического эффекта.

2. Флакозид, уменьшая содержание продуктов ПОЛ в организме экспериментальных животных в условиях токсической патологии печени, одновременно поддерживает на более высоком уровне концентрацию церулоплазмина и активность пероксидазы в крови, усиливая в совокупности эффективную антиоксидантную защиту организма.

3. Антиоксидантное действие флакозида существенно облегчает течение патологического процесса при моделировании токсического поражения печени, повышая частоту легких форм гепатита и снижая долю тяжелых, что сопряжено с корригирукхдим влиянием препарата на функциональное состояние органа.

4. Обострение хронического гепатита В у детей сопровождается нарушением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния ан-тиоксидантной системы (ДОС) организма, проявляющимся повышенным содержанием продуктов ПОЛ в периферической крови при сниженной концентрации церулоплазмина и активности пероксидазы.

5. Включение флакозида в комплексную терапию при обострении ХГВ у детей сопровождается достижением более быстрой нормализации продуктов ПОЛ, что может быть усилено одновременным назначением зссенциале.

6. Флакозид оказывает положительное воздействие на антиоксидантную систему у детей с обострением ХГВ, повышая содержание в крови церулоплазмина и активности пероксидазы. Отмечен синергитический эффект при использовании флакозида совместно с эссенциале.

7. Модифицирующее воздействие флакозида на процессы ПОЛ и состояние АОС организма при обострении ХГВ у детей сопровождается более быстрым достижением клинического эффекта и сокращением сроков лечения.

СПИСЖ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТБ5Е ДИССЕРТАЦИИ

I. Эффективность применения флакозида в лечении хронического гепатита у детей //Актуальные вопросы практической и теоретической медицины: Тез.докл.конф. -Челябинск, 1993. - С.127-128. (соавт. Бондаренко В.В.).

2. Патогенетические аспекты вирусных гепатитов у детей //Актуальные вопросы практической и теоретической медицины: Тез. докл. научн. конф. - Челябинск, 1994. - С.115-118. (соавт. Чернова й.В., Дик Г.А., Бондаренко В.В.).

3. Влияние флакозида на перекисное окисление липидов и иммунный статус детей при хроническом вирусном гепатите //Детские и инфекции: сб.научн.трудов. - Санкт-Петербург, 1994. -С.153-154. (соавт. Бондаренко В.В., Маркова И.В.).

4. Целесообразность применения антиоксидантной терапии при хронических вирусных гепатитах у детей //Актуальные вопросы практической и теоретической медицины: Тез. докл. конф,- Челябинск, 1995. -С.78.

5. Исследование фармакодинамики флакозида при хроническом гепатите В у детей //Современная технология и проблемы постдипломной подготовки специалистов здравоохранения: Тез. докл. научн. конф. Урала. -Челябинск, 1996. -С.25-27. (соавт. В.И. Ратников).