Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при старении

На правах рукописи

РЫЖАК Анастасия Петровна

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ СТАРЕНИИ

14 00 53 - геронтология и гериатрия 14 00 46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2008

003169341

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и на кафедре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акад И П Павлова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Эмануэль Владимир Леонидович

Официальные оппоненты

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталия Михайловна

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им С М Кирова» Министерства обороны РФ

Защита диссертации состоится «¿2?» О/ОИА 2008 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 601 001 01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197119, Санкт-Петербург, пр Динамо, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Автореферат разослан «¿9» ^ЛЛр//^ Я 2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент

0/7 озина Л С

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Анализ демографической ситуации в развитых странах мира свидетельствует о том, что процесс старения населения будет продолжать прогрессировать [World Population Prospects, 2004] Дальнейший рост численности пожилых и старых людей ожидается и в общей численности населения России -доля лиц в возрасте старше 65 лет для всего населения России увеличится с 13,7% в 2005 г до 26,0% в 2050 г , то есть возрастет почти в 2 раза При этом доля лиц в возрасте старше 80 лет к 2050 г увеличится более чем в 3 раза по сравнению с показателем 2005 г [Пирожков С И и соавт , 2007]

В связи с приведенными выше демографическими тенденциями особую роль приобретает развитие геронтологии и гериатрии — отрасли медицины, изучающей механизмы процессов старения организма и развития заболеваний, ассоциированных с возрастом, а также методов их профилактики и лечения Среди заболеваний, наиболее часто встречающихся у людей старших возрастных групп и значительно снижающих качество их жизни, следует особо отметить заболевания поджелудочной железы, частота которых значительно прогрессирует с возрастом

К наиболее распространенным заболеваниям поджелудочной железы, ассоциированным с возрастом, относятся инсулиннезависимый сахарный диабет 2 типа (ИНСД) и хронический панкреатит В последние десятилетия наблюдается значительное увеличение заболеваемости сахарным диабетом (СД) в мире Это особенно относится к экономически развитым странам, где диабетом страдают до 10% населения Увеличение распространенности заболеваемости СД в первую очередь наблюдается среди лиц старше 40 лет Каждые 15 лет заболеваемость СД удваивается [Дедов ИИ, Балаболкин M И, 2006], при этом важно отметить, что это происходит с основном за счет увеличения количества больных инсулиннезависимым диабетом

Важную роль в снижении качества жизни людей пожилого и старческого возраста играет хронический панкреатит, заболеваемость которым, как известно, с возрастом увеличивается Хронический панкреатит — достаточно частое заболевание в разных странах заболеваемость панкреатитом составляет 5-7 новых случаев на 100 000 человек. При этом за последние 40 лет произошел примерно двукратный прирост заболеваемости Это связано не только с улучшением диагностики заболевания, но и с увеличением употребления алкоголя в некоторых странах, усилением воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, которые ослабляют различные защитные механизмы, а также с постарением населения развитых стран [Кокуева О В и соавт ,2001, Минушкин О H, 2001].

Негативное влияние патологических состояний поджелудочной железы на качество жизни, в первую очередь, лиц пожилого и старческого возраста диктует необходимость поиска новых эффективных и безопасных средств для профилактики и коррекции выраженных возрастных изменений в подже-

лудочной железе, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с возрастом, - ИНСД и хронического панкреатита

В связи с выше изложенным изучение возрастных изменений и механизмов развития патологических состояний поджелудочной железы, ассоциированных с возрастом, и поиск средств для их профилактики и коррекции является актуальной задачей геронтологии и клинической лабораторной диагностики

Целью исследования явилось изучение возрастных морфо-функциональных изменений поджелудочной железы и механизмов пептидер-гической регуляции ее функции при старении

Задачи исследования

1 Изучить морфологические изменения поджелудочной железы при старении

2 Выявить корреляцию структурных и функциональных изменений поджелудочной железы при старении

3 Сравнить функциональную активность поджелудочной железы у молодых и старых животных

4 Изучить морфо-функциональные изменения поджелудочной железы в разных экспериментальных моделях преждевременного старения

5 Изучить морфо-функциональные изменения поджелудочной железы в экспериментальной модели сахарного диабета

6 Изучить механизмы пептидергической регуляции функции поджелудочной железы при старении и развитии возрастной патологии

Научная новизна работы

Впервые выявлены морфо-функциональные изменения поджелудочной железы при старении, выражающиеся в гипоплазии и дистрофии эпителия мелких выводных протоков, фиброзе междольковых перегородок и склерозе стенок крупных сосудов, а также нарушении структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса, коррелирующие со снижением секреции соматостатина и глюкагона Установлено уменьшение доли пролиферирующих клеток в тканях поджелудочной железы при старении, приводящее к снижению уровня физиологической регенерации ор-ганаВпервые в экспериментальной модели преждевременного старения (эпифизэктомия) доказано геропротекторное действие пептидов эпифиза, выражающееся, в первую очередь, в восстановлении микроциркуляторного русла и нормализации экспрессии соматостатина и глюкагона в островках поджелудочной железы

В модели преждевременного старения, вызванного радиационным повреждением, показано значительное снижение уровня репаративной регенерации органа на фоне микроциркуляторных изменений При этом установлено, что пептиды панкраген и Т-38 активизируют процессы пострадиационной репарации в тканях поджелудочной железы, что приводит к усилению экспрессии инсулина, соматостатина и глюкагона в панкреатических островках до нормальных возрастных значений

В экспериментальной модели сахарного диабета впервые выявлено модулирующее действие панкрагена, выражающееся в усилении экспрессии инсулина В-клетками и ослаблении продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса в условиях действия стрептозотоцина

В работе впервые выявлены механизмы пептидергической регуляции функции поджелудочной железы, которая выражается в нормализации состояния микроциркуляторного русла, восстановлении функциональной активности островковых и ацинарных клеток, а также в стабилизации морфо-функциональной структуры поджелудочной железы

Практическая ценность работы

Детальное выяснение морфо-функциональных изменений поджелудочной железы при старении значительно расширяет представления о механизмах развития патологии поджелудочной железы, ассоциированной со старением, что создает предпосылки для разработки патогенетических методов ее профилактики и коррекции

Установленное геропротекторное действие пептидных препаратов на различные структуры поджелудочной железы свидетельствует о перспективности создания новых эффективных средств для профилактики и коррекции возрастных изменений поджелудочной железы, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с возрастом При этом установлены механизмы протекторного и корригирующего действия пептидов эпифиза, панкрагена и Т-38, заключающиеся в улучшении состояния микроциркуляторного русла, повышении функциональной активности островковых и ацинарных клеток за счет стабилизации структурно-функционального состояния поджелудочной железы

Положения, выносимые на защиту

1 Основными изменениями поджелудочной железы при старении являются дисфункции микроциркуляторного русла, а также нарушения структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса и ацинарной ткани

2 Возрастные изменения поджелудочной железы коррелируют со снижением синтеза и секреции инсулина, соматостатина и глюкагона и приводят к уменьшению доли пролиферирующих клеток в поджелудочной железе старых животных

3 Геропротекторные свойства пептидов эпифиза выражаются в нормализации экспрессии соматостатина в Б-клетках под действием эпиталона и экспрессии глюкагона в А-клетках поджелудочной железы под действием эпиталамина на фоне восстановления микроциркуляторного русла

4 Пептиды Т-38 и панкраген активизируют процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе старых крыс в модели радиационного старения за счет нормализации микроциркуляторного русла и усиления функциональной активности клеток, что сопровождается восстановлением нормальных уровней экспрессии инсулина, глюкагона и соматостатина

5 Панкраген способствует развитию репаративных и компенсаторных процессов в поджелудочной железе при экспериментальном сахарном диабе-

те, что приводит к усилению экспрессии инсулина В-клетками и ослаблению продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса по сравнению с показателями у животных, подвергнутых воздействию стрептозотоцина

6 Пептидергическая регуляция функции поджелудочной железы при старении реализуется за счет влияния пептидов на состояние микроциркуля-торного русла и функциональную активность островковых и ацинарных клеток

Связь с планом НИР

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗОРАМН

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению собственных результатов исследования и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения Список литературы содержит 197 источников, в том числе 89 отечественных и 108 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 3 таблицами и 72 рисунками

Апробация работы

Результаты исследования доложены на Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), II и III научно-практических геронтологических конференциях с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2006 и 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), Международном конгрессе «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» (Санкт-Петербург, 2007), IV Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, 2007), XII Международной научно-практической конференции «Пожилой больной Качество жизни» (Москва, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола, 2007), VI Европейском конгрессе по геронтологии (Санкт-Петербург, 2007), проблемной комиссии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальная модель преждевременного старения, вызванного эпифизэктомией

Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 3 месяцев с массой тела 180-200 г Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания в осенне-зимний период 70 животных методом рандомизации были разделены на семь групп по 10 животных в каждой группе 1 группа (контроль) была представлена интактными животными У животных 2-7 групп был удален эпифиз (эпифизэктомия - ЭЭ) Начиная с 21-х суток после операции, животным 2 и 3 групп подкожно вводили стерильный 0,9% раствор натрия хлорида (физиологический раствор) в объеме 0,5 мл в течение последующих 10 дней Животным 4 и 5 групп по такой же схеме вводили опиталон в дозе 0,5 мкг на крысу, а животным 6 и 7 групп - эпиталамин в дозе 0,5 мг на крысу в 0,5 мл физиологического раствора

Выведение животных из опыта и выделение органов проводили утром с 10 до 12 часов при естественном освещении под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) Животных 1, 2, 4, 6 групп выводили из опыта через 3 суток после окончания введения препаратов (на 33 сутки после операции ЭЭ), а крыс 3, 5, 7 групп - через 12 суток после введения препаратов (на 42 сутки после эпифизэктомии)

Кусочки поджелудочной железы фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна - для свето-микроскопических исследований и по Карнов-скому - для электронной микроскопии Обезвоживание материала и заливку в парафин для световой микроскопии и смесь эпонов для ультраструктурного исследования проводили по общепринятым методикам [Кветной И М, Южа-ков В В , 1996] Применяли обзорную окраску гематоксилином и эозином

Парафиновые срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma, США) Ультратонкие срезы толщиной 100 нм, приготовленные на ультрамикротоме LKB-7A (LKB, Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца

Общегистологическое и иммуногистохимическое изучение проводили на микроскопе Jenamed-2 (Zeizz, Германия) Электронно-микроскопическое исследование осуществляли с использованием электронного микроскопа JEM-1 OOS (JEOL, Япония)

Экспериментальная модель преждевременного старения, вызванного радиационным повреждением

Морфо-функциональное исследование выполнено на 50 самцах крыс линии Вистар, содержавшихся в обычных условиях вивария при дневном осве-

щении и сбалансированном рационе питания в осенне-зимний период Экспериментальные животные методом рандомизации были разделены на 5 групп по 10 животных в каждой группе 1 группа - контрольная, интактные молодые крысы в возрасте 3 месяцев с массой тела 180-200 г, 2 группа - интактные старые крысы в возрасте 20 месяцев с массой тела 450-480 г, 3 группа - старые крысы в возрасте 20 месяцев с массой тела 450-480 г, подвергнутые гамма-облучению, 4 группа - старые крысы в возрасте 20 месяцев с массой тела 450-480 г, подвергнутые гамма-облучению, которым вводили препарат Т-38, 5 группа - старые крысы в возрасте 20 месяцев с массой тела 450480 г, подвергнутые гамма-облучению, которым вводили препарат панкра-ген

Общее однократное гамма-облучение животных 3, 4 и 5 групп выполняли на кобальтовом аппарате «ЛУЧ» при мощности дозы 30 сГр/мин Препарат Т-38 животным 4 группы и панкраген животным 5 группы начинали вводить через 1 сутки после облучения по 1,0 мкг на крысу в 1,0 мл физиологического раствора курс введения состоял из пяти инъекций через сутки внут-рибрюшинно инсулиновым шприцем

Выведение животных из опыта проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг), у крыс 3, 4 и 5 групп поджелудочную железу извлекали на 14 сутки после облучения

Поджелудочную железу фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна Тканевые блоки обезвоживали и заключали в Paraplast Plus (Kendall, США) Парафиновые срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma, США)

Общую гистологию исследуемого органа изучали на микротомных срезах, окрашенных гематоксилином и эозином

Светомикроскопические исследования выполняли на микроскопе OLYMPUS СХ41 (Япония) с микрофотосъемкой на цифровую камеру Nikon Coolpix 4500 (Япония) при 3-х уровнях увеличений

Экспериментальная модель сахарного диабета

Исследование проводили на 28 крысах-самцах линии Вистар в возрасте 3 месяцев с массой тела 150-250 г Животных методом рандомизации разделили на 4 группы по 7 животных в каждой группе I (контрольную) группу составили интактные животные Крысам II, III и IV групп вводили стрептозо-тоцин (Sigma, США) из расчета 50 мг/кг массы тела животного в 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (pH 4,5) внутрибрюшинно однократно Стрептозотоцин является противоопухолевым алкирующим веществом, которое вызывает деструкцию B-клеток поджелудочной железы, в результате чего синтез инсулина в них уменьшается, а в тяжелых случаях полностью прекращается

Через 2-3 недели после введения стрептозотоцина у экспериментальных животных развивался сахарный диабет, сопровождавшийся соответствующими клиническими проявлениями гипергликемией, полиурией, глюкозурией

Животным III группы вводили панкраген внутримышечно в дозе 100 мкг на крысу ежедневно в течение первых 10 суток после введения стрептозото-цина Животным IV группы тот же препарат вводили перорально (через зонд) в дозе 100 мкг (1 таблетка) на крысу в 2 мл воды по той же схеме

Кусочки поджелудочной железы крыс контрольной и подопытных групп забирали через 20 суток после воздействия стрептозотоцина и через 10 суток после окончания введения панкрагена, фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем безвоживали материал в автоматической станции Leica TP 1020 и заливали в парафин Парафиновые срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma, США)

Для обзорного изучения срезы окрашивали гемаюксилином и эозином

Иммуногистохимические методы исследования

Иммуногистохимические исследования поджелудочной железы в экспериментальной модели эпифизэктомии выполняли с помощью монокло-нальных кроличьих антител к глюкагону (Dako, Дания, титр 1 40), соматостатину (Dako, титр 1 40) и АБП набора (с использованием авидин-биотин-пероксидазного комплекса) с целью выявления кроличьих иммуноглобулинов (Sigma kit, США)

Для изучения пролиферативной активности клеток использовали мышиные моноклональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA Моноклональные антитела идентифицировали АБП набором для выявления мышиных иммуноглобулинов (Vectastain kit, США)

Иммуногистохимическое выявление антигенов на гистологических срезах выполняли согласно основным требованиям для иммунопероксидазных методов [Полак Дж, Ван Норден С , 1987, Polak J М , Van Noorden S , 1983]

Количественные исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений (Imstar) с применением прикладных компьютерных лицензионных программ Morphostar и Colquant (Imstar) согласно основным принципам стереологии и морфометрни [Автан-дилов Г.Г, 1990]

Исследование глюкагон- и соматостатин-продуцирующих клеток поджелудочной железы включало вычисление их объемной доли (pg|U, pst) и оптической плотности (OpDg|U, OpDst)

Для иммуногистохимических исследований поджелудочной железы в экспериментальной модели радиационного повреждения и стрептозотоци-нового сахарного диабета использовали мышиные моноклональные антитела к инсулину (1 100), кроличьи антитела к глюкагону (1 50), кроличьи антитела к соматостатину (1 70) (Novocastra, США), мышиные моноклональные антитела к PCNA при разведении 1 50 (клон PC 10, Dako) с применением биотин-стрептавидин-пероксидазных наборов для выявления мышиных и кроличьих иммуноглобулинов (MP Biomedicals, США) Субстратный фермент проявляли диаминобензидином (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, Dako)

Иммуногистохимическое выявление антигенов на гистологических срезах проводили согласно основным требованиям для иммунопероксидазных методов, описанных выше

Электронно-микроскопическое исследование поджелудочной железы

Фрагмент ткани поджелудочной железы с помощью лезвия нарезали на кусочки размером 1 мм3 в капле 2,5% раствора глютаральдегида, которые фиксировали в смеси Карновского (10 мл 25% раствора глютаральдегида, 5 мл 40% раствора формальдегида, 85 мл 0,1 М раствора фосфатного буфера рН 7,2-7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнительно фиксировали в течение 1 ч в 1% растворе четырехокиси осмия при комнатной температуре Далее материал обезвоживали в спиртах восходящей крепости (от 75% до 100%), затем пропитывали и заливали в смесь эпонов, которая состоит из смеси А (62 мл эпона 812 и 100 мл додецил-янтарного ангидрида) и смеси В (100 мл эпона 812 и 89 мл метил-надик ангидрида) Смесь эпонов для заливки материала готовили из 2,5 мл смеси А, 2,5 мл смеси В и 0,15 мл отвердителя 2,4,6три(диметиламинометил)-фенола (DMP-30) Полимеризацию залитого материала проводили в термостате в течение 20 ч при температуре 37°С и затем в течение 24 ч при температуре 58 °С

Для получения полутонких и ультратонких срезов использовали ультрамикротом LKB-7A и изготовитель ножей KNIF-MARKER LKB-91 (LKB, Швеция)

Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рей-нольдсу, совместное использование которых увеличивает контрастность препарата по сравнению с их раздельным применением

Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) в трансмиссионном режиме

Морфометрический метод исследования

Морфометрическое исследование проводили согласно основным принципам морфометрии и стереологии [Автандилов ГГ, 1990] с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400 (Япония), цифровой камеры Nikon DXM1200 (Япония), персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4 0»

В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении х400 Оптическую плотность экспрессии исследуемых маркеров измеряли в условных единицах Определяли также площадь экспрессии, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах Указанные параметры отражают интенсивность синтеза и накопления исследуемых гормонов и сигнальных молекул в клетках поджелудочной железы

Пептидные биорегуляторы

В исследовании изучали влияние на морфо-функциональную организацию поджелудочной железы следующих пептидных биорегуляторов

Эпиталамин® - лекарственный препарат, представляющий собой комплекс низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой от 1 до 10 кДа, выделенных из гипоталамо-эпифизарной области головного мозга молодых животных методом уксуснокислой экстракции [Патент РФ № 2163129, 2001]

Эпиталон® - тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly (молекулярная масса 390 Да), который получают традиционным методом пептидного синтеза в растворе [Патент РФ № 2157233, 2000]

Панкраген® - тетрапептид Lys-Glu-Аэр-Тгр-ЫНг (молекулярная масса 576 Да), получаемый классическим методом пептидного синтеза в растворе [Патент РФ № 2242241, 2004]

Т-38 - трипептид Lys-Glu-Asp (молекулярная масса 390 Да), получаемый классическим методом пептидного синтеза в растворе [Патент РФ № 2295970, 2006]

Статистические методы обработки результатов исследования

Статистическую обработку результатов исследования проводили по стандартным программам для персональных компьютеров Использовали специализированные пакеты прикладных программ для медико-биологических исследований ("Statistica-5 0" и "Microsoft Excell"), обеспечивающих выполнение общепринятых математико-статистических методов (расчет параметров вариации признаков, t-критерий Стьюдента для зависимых равновеликих и независимых разновеликих выборок) [Григорьев С Г и соавт, 2002]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние пептидов эпифиза на морфо-функциональную структуру поджелудочной железы в модели преждевременного старения, вызванного эпифизэктомией

Результаты изучения поджелудочной железы животных 2 группы через 1 и 1,5 месяца после эпифизэктомии показали, что ее гистоархитектоника в целом сохраняется Однако количественный анализ микроскопических изображений выявил существенные отличия от показателей у интактных животных 1 (контрольной) группы (табл 1) Объемная доля А-клеток составляет 12,2±1,1%, а их оптическая плотность - 0,111±0,006 уел ед, что на 12% меньше контрольных значений (р<0,05) При анализе соматостатин-содержащих D-клеток установлено увеличение их объемной доли на 15,5% по отношению к контролю, величина которой составляет 5,2±0,2% (в кон-

трольной группе - 4,5±0,9%), оптическая плотность их при этом уменьшена на 12% по сравнению с показателем у контрольных животных и составляет 0,142±0,001 уел ед (в контроле - 0,160±0,006 уел ед , р<0,05)

Таблица 1

Влияние пептидов эпифиза на количественные характеристики исследуемых параметров в поджелудочной железе эпифизэктомированных животных

(М±ш)

Группа животных Соматостатин-содержащие клетки Глюкагон-содержащие клетки

Pst , % OpDst, уел ед Pglu , % OpDgiu, уел ед

1 группа-контроль 4,5±0,9 0,160±0,006 12,8+2,5 0,12610,004

2 группа -1 месяц после ЭЭ + физ р-р 5,2±0,2 0,142±0,001* 12,211,1 0,111+0,006*

3 группа - 1,5 месяца после ЭЭ + физ р-р 5,4±0,4 0,14510,004* 12,7+2,2 0,114+0,001*

4 группа -1 месяц после ЭЭ + эпиталон 4,7±1,3 0,15810,007* 12,512,2 0,123+0,003*

5 группа -1,5 месяца после ЭЭ + эпиталон 5,5±1,3 0,15710,016 13,211,9 0,12410,010

6 группа -1 месяц после ЭЭ + эпитала-мин 5,4±1,1 0,16210,005* 10,911,5 0,13510,006*

7 группа -1,5 месяца после ЭЭ + эпи-таламин 5,0+0,9 0,15610,002° 11,311,8 0,136+0,004°

* Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле, й Р<0,05 по сравнению с показателем у животных 2-й группы, Р<0,05 по сравнению с показателем у животных 3-й группы

Рис. 1. Капилляр в экзокринной части поджелудочной железы крысы 2 группы через 1 месяц после эпифизэктомии. х38000.

Через 1 и 1,5 месяца после эпифизэктомии со стороны капилляров отмечается очаговый стаз крови, просвет капилляров частично, а чаще полностью занят эритроцитами, эндотелиальные клетки в состоянии выраженного локального отека, в эндотелиоцитах отмечаются дистрофические изменения, количество пиноцитозных пузырьков в них уменьшается (рис. 1). Количество перицитарных клеток, лежащих вдоль капилляров, значительно уменьшено, цитоплазма их просветлена, а цитоплазматические отростки либо укорочены, либо вообще не визуализируются. Выявленные изменения приводят к существенному снижению тонуса сосудов и прочности эндотелия.

У животных 4 группы через 1 месяц после эпифизэктомии (через 3 суток после окончания введения эпиталона) в поджелудочной железе существенных особенностей не выявляется. Колебания показателей количества и оптической плотности глюкагон-содержащих А-клеток находятся в пределах контрольных значений. Однако отчетливо прослеживаются положительные отличия от показателей у животных 2 группы: оптическая плотность А-клеток составляет 0,123±0,003 усл.ед. (у животных 2 группы - 0,111±0,006 усл.ед., р<0,05). Подобные результаты зарегистрированы и при анализе поведения соматостатин-содержащих О-клеток: оптическая плотность О-клеток составляет 0,158±0,007 усл.ед. (у животных 2 группы - 0,142±0,001 усл.ед., р<0,05).

Со стороны микроциркуляторного русла поджелудочной железы электронно-микроскопическая картина достаточно спокойная и практически не отличается от нормы. Стенка капилляров обычной толщины, однако обращает на себя внимание почти полное отсутствие перицитов, окружающих ка-

пилляры, и более заметно выражена агрегация эритроцитов в просвете сосудов.

В поджелудочной железе животных 5 группы через 1,5 месяца после эпифизэктомии (через 12 дней после окончания введения эпиталона) достоверных изменений в количественных показателях содержания А- и О-клеток, а также в структурно-функциональной организации капилляров и других сосудов микроциркуляторного русла по сравнению показателями у животных 4 группы не отмечено.

Рис. 2. Капилляр в экзокринной части поджелудочной железы крысы 7 группы через 1,5 месяца после эпифизэктомии и через 12 дней после окончания введения эпиталамина. х42000.

Морфо-функциональная структура поджелудочной железы животных 6 группы через 1 месяц после ЭЭ (через 3 суток после окончания введения эпиталамина) характеризуется колебанием исследуемых параметров в пределах контрольных значений. Так, объемная доля глюкагон-содержащих А-клеток составляет 10,9+1,5% (в контроле - 12,8±2,5%), а объемная доля соматостатин-содержащих Б-клеток - 5,4+1,1% (в контроле - 4,5±0,9%). Однако при этом оптическая плотность А-клеток составляет 0,135+0,006 усл.ед., что на 21,6% больше, чем у животных 2 группы после эпифизэктомии (р<0,05), а оптическая плотность О-клеток составляет 0,162±0,002 усл.ед., что на 14% больше показателя у животных 2 группы (р<0,05). Эти показатели практически не отличаются от показателей у интактных животных 1 группы (контроль).

В поджелудочной железе животных 7 группы через 1,5 месяца после ЭЭ (через 12 суток после окончания введения эпиталамина) эффект эпиталамина проявляется в снижении объемной доли соматостатин-содержащих Б-клеток

по отношению к контролю и, особенно, по отношению к показателю у животных 3 группы Так, оптическая плотность Б-клеток у крыс 7 группы составляет 0,156±0,002 услед (у животных 3 группы - 0,145±0,004 уел ед , р<0,05), а оптическая плотность А-клеток - 0,136±0,004 уел ед (у животных 3 группы - 0,114±0,001 уел ед , р<0,05) Как видно из данных таблицы, количественные показатели содержания А- и О-клеток сохраняются на уровне контрольных значений

Модулирующее влияние эпиталамина проявляется в изменении микро-циркуляторного русла в эти сроки эксперимента Со стороны капилляров отмечаются ультраструктурные изменения, свидетельствующие об активном функционировании микроциркуляторного русла Просвет капилляров широкий, эритроциты находятся в свободном состоянии, эндотелий обнаруживает инвагинированную поверхность, что наряду с отчетливым обнаружением ор-ганелл в цитоплазме эндотелиоцитов свидетельствует об активном функционировании микроциркуляторного звена Крупные перициты также отчетливо выявляются вдоль стенки капилляров (рис 2)

Таким образом, в модечи преждевременного старения, вызванного эпи-физэктомией, в поджелудочной железе крыс наблюдаются характерные возрастные изменения структуры ткани, сопровождающиеся неравномерным увеличением объемной доли О-клеток с достоверным снижением их оптической плотности, что свидетельствует о снижении синтеза и секреции сомато-статина в поджелудочной железе при старении Со стороны А-клеток отмечается достоверное снижение оптической плотности через 1 месяц после эпи-физэктомии, однако через 1,5 месяца синтез глюкагона опять повышается и даже недостоверно превышает контрольные показатели

Выявленная взаимосвязь структурных и функциональных изменении в ткани поджелудочной железы может служить диагностическим критерием преждевременного старения и развития связанной с ним возрастной патологии поджелудочной железы

Изучение действия пептидов эпифиза показало их стабилизирующее влияние на секреторную функцию поджелудочной железы при моделировании старения При этом выявлено, что влияние эпитапона больше проявляется в отношении О-клеток и связанного с ними синтеза соматостатина, в то время как эпиталамин более тропно влияет на А-клетки и синтез глюкагона Важно отметить нормализацию микроцируляторного русла под действием пептидов эпифиза

Результаты проведенного исследования в модели преждевременного старения, обусловленного эпифизэктомией, показали наличие у пептидов эпифиза геропротекторных свойств по отношению к поджелудочной железе Это дает основание считать, что комбинация применения обоих пептидов может оказаться полезной и взаимодополняющей при коррекции разных типов нарушений функций поджелудочной железы при старении

Влияние пептидов на клеточную репарацию поджелудочной железы старых крыс после радиационного повреждения

При анализе гистологического строения поджелудочной железы старой крысы обращает на себя внимание увеличение содержания междольковой соединительной ткани В ациноцитах базофильная часть выглядит суженной, а ацидофильная - расширена и заполнена эозинофильными зимогеновыми гранулами Ядра экзокринного эпителия полиморфны некоторые с признаками дистрофии, другие увеличены в размерах Эпителий мелких протоков также имеет признаки умеренной дистрофии Стенки междольковых сосудов частично склерозированы Визуализируется локальное разрастание соединительной ткани и в междольковых перегородках В островках Лангерганса снижена клеточность Некоторые эндокринные клетки выглядят гипертрофированными, при этом начинают дифференцироваться границы клеток

В поджелудочной железе старых крыс отмечается явное снижение интенсивности иммуноокрашивания В-клеток на инсулин, особенно в центральных зонах островков Лангерганса А-клетки дают достаточно интенсивное иммуноокрашивание на глюкагон, однако их относительное содержание в островках, по-видимому, снижается Часто А-клетки концентрируются по периферии островков в виде небольших групп

Привлекает внимание выраженный полиморфизм иммуноморфологии соматостатин-продуцирующих клеток не только в разных островках, но даже в пределах одного островка Снижение положительной реакции на сомато-статин в одних Б-клетках сопровождается усиленным накоплением гормона в других

Таблица 2

Влияние пептидов на пролиферативную активность клеток поджелудочной железы крыс в радиационной модели старения

Группа животных Количественная плотность РСЫА, ед на 1 мм2 среза Индекс РСЫА, %

Интактные молодые крысы 8265±276 22,7±1,6

Интактные старые крысы 7321±312* 16,7±2,1*

Старые крысы +у-облучение 6524±328# 28,3±2,4*

Старые крысы +у-облучение+Т-3 8 7812±265л 32,8±2,8

Старые крысы +у-облучение+панкраген 8176±218л 34,5±1,8Л

* р<0,05 по сравнению с показателем у молодых животных,

* р<0,05 по сравнению с показателем у интактных старых крыс, лр<0,05 по сравнению с показателем у старых облученных крыс

На обзорных препаратах, иммуноокрашенных на РСЫА, численная плотность пролиферирующих клеток снижена даже по периферии долек Как правило, видны лишь небольшие скопления клеток с РСЫА-положительными ядрами В островковой части слабую положительную реакцию на PCNA дают единичные ядра клеток Количественная плотность РСЫА на срезах поджелудочной железы старых животных, как показано в таблице 2, составила 7321±312 ед на 1 мм среза, что на 11,4 % меньше, чем на срезах поджелудочной железы молодых крыс (8265±276 ед на 1 мм2 среза, р<0,05), а индекс РСЫА на срезах ткани старых крыс был на 26,5% меньше, чем на срезах поджелудочной железы молодых животных (16,7±2,1 % и 22,7±1,6 %, соответственно, р<0,05)

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что у старых животных на фоне начального фиброза междольковых перегородок и признаков склероза стенок крупных сосудов появляются морфологические признаки дистрофических изменений эпителия мелких выводных протоков и гипоплазии эпителия как экзокринной, так и эндокринной частей поджелудочной железы Судя по снижению численной плотности РСКЛ-положительных ядер клеток, снижается уровень физиологической регенерации этого органа по сравнению с показателями у молодых животных 1 группы Отмеченные изменения сопровождаются нарушением структурно-функциональной организации эндокринных клеток островкового аппарата поджелудочной железы

Через две недели после гамма-облучения в поджелудочной железе старых крыс определяется выраженное полнокровие сосудистого русла Междольковые септы расширены за счет периваскулярного отека Стенки междольковых сосудов и выводных протоков утолщены с разрастанием адвентициональной ткани В экзокринной части желе5ы усиливается клеточный полиморфизм в некоторых ацинарных клетках заметно сужается базофильная базальная часть и снижается насыщенность апикальной части зимогеновыми гранулами Встречаются эпителиальные клетки в состоянии отсроченного пострадиационного апоптоза

Полнокровие сосудов определяется и в островках Лангерганса Эпителий островков умеренно полиморфный за счет атрофии части клеток Ядра отдельных клеток находятся в состоянии пикноза По периферии островков отмечается появление небольших скоплений мелких эпителиальных клеток с базофильными ядрами

При интегральной оценке экспрессии инсулина в В-клетках животных 3 группы существенных изменений в интенсивности иммуноокрашивания (с учетом диапазона варьирования плотности реакции) относительно старых необлученных крыс отмечено не было Выявлено некоторое снижение продукции глюкагона в А-клетках и соматостатина в О-клетках

Судя по численной плотности РСЫА-положительных ядер клеток в паренхиме поджелудочной железы, уровень репаративной регенерации в этом органе после гамма-облучения у старых животных достаточно низкий как в островках Лангерганса, так и в ацинарной ткани Это подтверждают

результаты количественного определения плотности РСЫА на срезах ткани поджелудочной железы старых животных после облучения этот показатель уменьшился на 10,1 % по сравнению с показателем на срезах ткани интакт-ных старых животных и на 21,1 % по сравнению с показателем у молодых животных и составил 6524±328 ед на 1 мм2 среза (табл 2, р<0,05)

Достоверное снижение количественной плотности РСИА-положительных ядер клеток на срезах ткани поджелудочной железы служит диагностическим признаком преждевременного старения органа

Хорошо известно, что поджелудочная железа относится к радиорезистентным органам Отмеченные нами пострадиационные изменения соответствуют данным литературы о реакции таких систем на действие ионизирующей радиации Признаки повреждения эпителия в виде гибели отдельных клеток и компенсаторной гипертрофии других могут быть обусловлены как прямым лучевым действием, так и опосредованы через сосудистую реакцию

На фоне введения препарата Т-38 старым облученным крысам определяется нормализация гистологического рисунка поджелудочной железы Снижается выраженность отека вокруг сосудов и в соединительно-тканных перегородках Обращает на себя внимание снижение полнокровия и нормализация капиллярного русла в островках Лангерганса Увеличивается содержание базофильной субстанции в базальной части ацинусов, а среди ацинар-ных клеток достаточно редко, но все же встречаются фигуры митоза На препарате, окрашенном гематоксилином и эозином, существенных визуальных отличий морфологического состояния островковых клеток на фоне введения панкрагена от отмеченных выше изменений у старых необлученных крыс не определяется

Иммуногистохимический анализ показал, что в эндокринных клетках некоторых островков под действием панкрагена усиливается экспрессия инсулина, глюкагона и соматостатина до уровня, визуализируемого у старых необлученных крыс Примечательно, что в паренхиме поджелудочной железы при этом появляются небольшие поля и группы клеток с отчетливой реакцией их ядер на РСМА по сравнению с поджелудочной железой старых облученных крыс 3 группы При количественном определении плотность РСМД-положительных ядер клеток превышает показатель у старых интактных животных и приближается к показателю у молодых крыс (8176±218 ед на 1 мм2 среза) Об ускорении пролиферативных процессов свидетельствует также повышение индекса РСЫА до 34,5±1,8%, что в 1,5 раза выше показателя у молодых животных (табл 2). Кроме того, в некоторых островках регистрируются целые группы пролиферирующих клеток

Отмеченный факт свидетельствует о том, что пролиферативный пул как островных, так и ацинарных клеток поджелудочной железы под действием пептидов Т-38 и панкрагена значительно возрастает Кроме усиления экспрессии РС1ЧА отмечается увеличение количества митозов в паренхиме поджелудочной железы, что отражает увеличение количества клеток, вступивших в деление из фазы Б клеточного цикла Нормализующее действие на микроциркуляторное русло в большей степени отмечено у пептида Т-38

Таким образом, результаты сравнительного исследования позволяют предположить, что у старых облученных крыс препараты панкраген и Т-38 активизировали процессы пострадиационной репаративной регенерации и способствовали восстановлению нарушенного эндокринного гомеостаза и микроциркуляторного русла в поджелудочной железе старых животных.

Влияние панкрагена на функциональную морфологию поджелудочной железы крыс в условиях экспериментального сахарного диабета

Проведенные ранее исследования показали, что синтезированный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН тетрапетид панкраген (Ьуэ-ОШ-Азр-Тгр-ЫНг) регулирует метаболические процессы в ткани поджелудочной железы [Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2002].

В настоящем разделе изучали влияние панкрагена на функциональную морфологию поджелудочной железы в модели экспериментального сахарного диабета у крыс.

Результаты исследования показали, что при действии стрептозотоцина средняя площадь экспрессии инсулин-продуцирующих В-клеток в поджелудочной железе крыс II группы резко снижается по сравнению с показателем в контрольной группе и составляет всего 2,42±0,78% (рис. 3), в то время как средняя площадь экспрессии глюкагон-продуцирующих А-клеток, наоборот, возрастает в 2 раза и достигает 6,24±0,62% (рис. 4). При этом средняя оптическая плотность интенсивности иммуногистохимической реакции практически не меняется и составляет для В-клеток 2,37±0,01 у.е., а для А-клеток -2,31 ±0,02 у.е.

Рис. 3. Влияние панкрагена на экспрессию инсулина В-клетками поджелудочной железы. Средняя площадь экспрессии инсулина; ** р<0,05 по сравнению с показателем в группе !; р<0,05 по сравнению с показателем в группе 2.

Рис, 4. Влияние панкрагена на экспрессию глюкагона А-клетками поджелудочной железы. Средняя площадь экспрессии глюкагона; ** р<0,05 по сравнению с показателем в группе ¡.

В ацинарной ткани возрастает средняя площадь экспрессии PCNA до 5,59±1,41%, оптическая плотность при этом не изменяется и составляет 2,32±0,01 у.е. (рис. 3). Экспрессия белка р53 также увеличивается: средняя площадь экспрессии становится равной 4,53±1,03%, оптическая плотность -2,33±0,01 у.е. (рис. 4).

Таким образом, при диабете закономерно снижается продукция инсулина B-клетками и возрастает синтез глюкагона А-клетками. Происходит активация как апоптоза, так и пролиферации экзокриноцитов, о чем можно судить по изменению показателей экспрессии маркеров PCNA и р53.

В ткани поджелудочной железы животных III и IV групп в результате действия панкрагена вслед за введением стрептозотодина отмечаются выраженные компенсаторные изменения; улучшаются показатели морфо-функциональной активности как островкового аппарата, так и экзокринной части железы, нарушенные в условиях экспериментального диабета. Так, средняя площадь экспрессии инсулина в B-клетках поджелудочной железы животных III и IV групп составляет, соответственно, 6,43±0,35% и 5,53±0,52%, что достоверно выше показателя у животных II группы — 2,42±0,78% (р<0,05), хотя показатели оптической плотности инсулина в В-клетках поджелудочной железы животных всех четырех групп колеблются в пределах схожих значений (рис. 3). Средняя площадь экспрессии глюкагона А-клетками поджелудочной железы животных III и IV групп (рис. 4) приближается к показателям животных I (контрольной) группы и составляет, соответственно, 4,67±0,56% и 4,16±0,31% (у животных контрольной группы -3,43±0,42%, р<0,05).

Рис. 5. Влияние панкрагена на экспрессию маркера пролиферирующих клеток РСЫА. Средняя площадь экспрессии РСКА. ** р<0,05 по сравнению с показателем в группе 1; * р<0,05 по сравнению с показателем в группе 2.

Рис. б. Влияние панкрагена на экспрессию маркера проапоптозного белка р53. Средняя площадь экспрессии р53.

*р<0,05 по сравнению с показателем в группе 2.

Средняя площадь экспрессии маркера пролиферирующих клеток поджелудочной железы PCNA (2,8±0,64% и 1,73±0,64%, соответственно, против 1,92±0,55% в контроле, р<0,05) и средняя площадь экспрессии маркера про-апоптозного белка р53 (1,27±0,12% и 0,51±0,5%, соответственно, против 0,58±0,43% в контроле, р<0,05) у животных III и IV групп также приближаются к показателю у животных контрольной группы (рис 5, 6)

Введение стрептозотоцина приводит к развитию морфо-функциональной картины диабета в ткани поджелудочной железы При этом отмечается стимулирующее действие стрептозотоцина на пролиферативную активность и индукцию апоптоза в ацинарной ткани Под действием панкрагена происходит стимуляция репаративных и компенсаторных процессов в поджелудочной железе, о чем свидетельствует усиление экспрессии инсулина В-клетками и ослабление продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса В ацинарной ткани показатели пролиферативной активности и апоптоза экзокри-ноцитов приближаются к показателям у животных контрольной группы

Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что панкра-ген обладает тропностью к тканям поджелудочной железы и оказывает значительный терапевтический эффект, восстанавливая функцию эндокринного и экзокринного отделов органа как при пероральном, так и при инъекционном применении

Таким образом, при проведении настоящего исследования выявлены морфо-функциональные изменения, которые происходят в ткани поджелудочной железы при старении — как у интактных старых животных, так и в моделях преждевременного старения, вызванного эпифизэктомией или радиационным повреждением Некоторые из них согласуются с данными литературы в частности, изменения функциональной активности клеток эндокринной части поджелудочной железы Вместе с тем, выявлены существенные изменения структурной организации микроциркуляторного русла органа в условиях преждевременного старения, что позволяет расширить представления о механизмах развития патологии поджелудочной железы, ассоциированной с возрастом

Важное значение имеет обнаружение геропротекгорных свойств коротких пептидов в отношении морфологии и функциональной активности поджелудочной железы Результаты исследования свидетельствуют о перспективности применения трипептида Т-38, тетрапептидов эпиталона и панкрагена, а также пептидного биорегулятора эпиталамина для комплексной профилактики и коррекции возрастных изменений поджелудочной железы

ВЫВОДЫ

1 Морфо-функциональные изменения поджелудочной железы у животных при старении выражаются в гипоплазии и дистрофии эпителия мелких выводных протоков на фоне фиброза междольковых перегородок и склероза стенок крупных сосудов, а также в нарушении структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса

2 Возрастные изменения структуры поджелудочной железы сопровождаются снижением оптической плотности и А-клеток, свидетельствующим о снижении синтеза и секреции, соответственно, соматостатина и глкжагона при старении

3. При старении происходит снижение уровня физиологической регенерации органа, отражением чего служит уменьшение доли пролиферирующих клеток как в ацинусах, так и в островках, по сравнению с показателями у молодых животных

4 При моделировании преждевременного старения (эпифизэктомия) отмечаются различные нарушения микроциркуляторного русла поджелудочной железы (стаз крови, локальный отек, гипоплазия перицитарных клеток вдоль капилляров и появление дистрофических изменений цитоплазмы в них)

5 Пептиды эпифиза обладают геропротекторными свойствами и оказывают стабилизирующее действие на морфо-функциональную структуру поджелудочной железы при старении На фоне восстановления микроциркуляторного русла под действием эпиталона отмечается нормализация экспрессии соматостатина в Б-клетках островков, а под действием эпиталамина - нормализация экспрессии глкжагона в А-клетках

6 При изучении поджелудочной железы в модели радиационного старения изменения структуры органа свидетельствуют о значительном снижении уровня репаративной регенерации и выражаются в повреждении эпителия в виде гибели отдельных клеток и компенсаторной гипертрофии других, что связано с развитием микроциркуляторных изменений

7 Пептиды Т-38 и панкраген активизируют процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе старых крыс в модели радиационного старения, о чем свидетельствует усиление пролиферации клеток, что сопровождается повышением экспрессии инсулина, соматостатина и глкжагона до нормальных возрастных значений При этом более выраженное действие на микроциркуляторное русло поджелудочной железы оказывает пептид Т-38, что выражалось в нормализации архитектоники капилляров, снижении полнокровия сосудов

8 Панкраген приводит к развитию репаративных и компенсаторных процессов в поджелудочной железе в экспериментальной модели сахарного диабета, о чем свидетельствует усиление экспрессии инсулина В-клетками и ослабление продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса по сравнению с показателями у животных, подвергнутых воздействию стрептозотоцина

9 Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при старении осуществляется за счет влияния пептидов на состояние микроцир-куляторного русла (трипептид Т-38, пептиды эпифиза) и функциональную активность островковых и ацинарных клеток (панкраген), а также стабилизирующего действия на морфо-функциональную структуру поджелудочной железы (пептиды эпифиза)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для коррекции возрастных нарушений функций поджелудочной железы целесообразно комплексное взаимодополняющее применение пептидных препаратов, оптимизирующих нейроэндокринную регуляцию функции органа (эпиталон и эпиталамин), нормализующих микроциркуляцию (пептид Т-38) и функцию островковых и ацинарных клеток поджелудочной железы (панкраген)

2 Разработанные на экспериментальной модели критерии возрастных изменений морфо-функционального состояния поджелудочной железы могут быть рекомендованы для морфологической диагностики состояния поджелудочной железы в клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние тетрапептида панкрагена на функциональную морфологию поджелудочной железы крыс в условиях экспериментального сахарного диабета/ И М Кветной, А П Рыжак, И Н Костючек, Ю А Тафеев //Бюл эксперим биол и мед -2007 - Т 143, № 3 - С 340343

2 Иммунологическая диагностика в клинике внутренних болезней/ Рекомендации по применению в лечебно-диагностическом процессе/ Е Е Зуева, А В Куртова, Е Б Сиваченко, А П Рыжак, О В Галкина - СПб Изд-во СПбГМУ, 2007 - 56 с

3 Костючек ИН Особенности диагностики нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы/ И Н. Костючек, А П Рыжак // Тез докл II научн -практ геронтологической конфер с междунар участием «Пушковские чтения», Санкт-Петербург, 2006 - С 115-116

4 Костючек И Н Особенности фиброкистозных изменений в молочной железе у женщин различного возраста/ И Н Костючек, А П Рыжак, Т С Смирнова // Тез докл Всеросс конфер «Перспективы фундаментальной геронтологии», Санкт-Петербург, 2006 - С 68-69

5 Рыжак А П Влияние пептидов эпифиза на морфо-функциональную структуру поджелудочной железы при старении/ АП Рыжак, ИН Костючек, И М Кветной // Успехи геронтологии - 2007 - Т 20, № 2 -С 97-100

6 Рыжак А П Влияние пептида эпифиза на морфо-функциональные изменения поджелудочной железы в модели преждевременного/ А П Рыжак, И Н Костючек // Матер XIV Российского нац конгресса «Человек и лекарство» Москва, 2007 - С 871-872

7 Рыжак А П Влияние пептидного препарата эпифиза на возрастные изменения поджелудочной железы у крыс/ А П Рыжак, И Н Костючек // Матер междунар конгресса «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» - Санкт-Петербург, 2007 - С 78

8 Рыжак А П Возрастные изменения поджелудочной железы крыс при лучевом поражении/ АП Рыжак// Матер Межрегиональной научно-практ конф «Медицинские проблемы пожилых» Йошкар-Ола, 2007 -С 47-48

9 Рыжак А П Изучение влияния тетрапептида на поджелудочную железу крыс на модели экспериментального сахарного диабета/А П Рыжак, И Н Костючек// Тез докл Всеросс конфер «Перспективы фундаментальной геронтологии», Санкт-Петербург, 2006 -С 111-112

10 Рыжак А П Пептидергическая регуляция возрастных изменений микроциркуляторного русла поджелудочной железы у крыс/ А П Рыжак // Материалы IV Всероссийской научн -практ конф «Общество, государство и медицина для пожилых», Москва, 2007 - С 86-87

11 Рыжак A U Пептидергическая регуляция морфологических изменений поджелудочной железы у старых крыс/ А П Рыжак // Материалы XII Междунар научн -практ конф «Пожилой больной Качество жизни» -Клиническая геронтология -2007 -Т 13, №9 —С 89

12 Рыжак АП Пептидергическая регуляция функции поджелудочной железы в экспериментальной модели ускоренного старения у крыс/ А П Рыжак, И М Кветной, В J1 Эмануэль // Успехи геронтологии -2008 -Т21,№2 -С 78-85

13 Рыжак А П Сравнительное изучение морфологии поджелудочной железы молодых и старых крыс/А П Рыжак// Тез докл III научн -практ геронтологической конфер с междунар участием «Пушковские чтения», Санкт-Петербург, 2007 - С 179-181

\А Ryzhak А Р Correction of age-relations in rat pancreas by pineal peptide bioregulators/A P Ryzhak, IN Kostyuchek// Advances in Gerontology -2007 - Vol 20, N3 -P 66

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АБП метод - иммуногистохимический метод с использованием авидин-биотин-пероксидазного комплекса

ДНЭС - диффузная нейроэндокринная система ДГА - дегидроэпиандростерон ДГАС - дегидроэпиандростерон сульфат ИНСД - инсулиннезависимый сахарный диабет

НГН - нарушенная гликемия натощак

НТГ - нарушенная толерантность к глюкозе

СД - сахарный диабет

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФРК - физиологический раствор Кунса

ЭЭ - эпифизэктомия

CRM - caloric restriction mimetics

DPP-IV - дипептил-пептидаза-IV

GIP - глюкозозависимый инсулинотропный пептид

GLP-1 - глюкагоно-подобный пептид

PCNA - proliferating cell nuclear antigen (пролиферирующий клеточный ядерный антиген)

P(st, giu) - объемная плотность структур (интегральный показатель содержания структур в объеме ткани, %), st - соматостатин, glu -глюкагон

OpD(st, giU) - оптическая плотность интенсивности иммуногистохимического окрашивания структур на срезе (условные единицы), st — соматостатин, glu - глюкагон

РЫЖАК Анастасия Петровна Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при старении // Автореф дис канд мед наук 14 00 53,

14 00 46 - - СПб , 2008 - 25 с_

Подписано в печать 19 02 2008 Формат 60*84 1/16

Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0

Тираж 100 экз Заказ

Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С -Петербург, ул Большая Монетная, 5 лит А

Актуальность проблемы

Анализ демографической ситуации в развитых странах мира свидетельствует о том, что процесс старения населения будет продолжать прогрессировать [World Population Prospects, 2004]. Дальнейший рост численности пожилых и старых людей ожидается и в общей численности населения России - доля лиц в возрасте старше 65 лет для всего населения России увеличится с 13,7% в 2005 г. до 26,0% в 2050 г., то есть возрастет почти в 2 раза. При этом доля лиц в возрасте старше 80 лет к 2050 г. увеличится более чем в 3 раза по сравнению с показателем 2005 г. [Пирожков С.И. и соавт., 2007].

В связи с приведенными выше демографическими тенденциями особую роль приобретает развитие геронтологии и гериатрии - отрасли медицины, изучающей механизмы процессов старения организма и развития заболеваний, ассоциированных с возрастом, а также методов их профилактики и лечения [Фролькис В.В., 1970, 1981, 1988, 1999]. Старение организма неразрывно связано с возрастной инволюцией наиболее I важных для его жизнедеятельности органов и систем.

Старение - процесс сложной перестройки и приспособления организма к изменяющимся во времени условиям его существования, поэтому он регулируем и управляем. Это создает предпосылки для научного поиска активного вмешательства в процесс старения, контроля за ходом возрастной эволюции организма: несмотря на снижение адаптационных возможностей организма в ходе старения, следует искать пути активного воздействия на организм с целью совершенствования его биологических возможностей [Анисимов В.Н., Соловьев М.В., 1999].

В настоящее время геронтология располагает рядом методов и средств, способствующих улучшению здоровья, психических и физических возможностей пожилых и старых людей. Наиболее изученными и действенными из них являются рациональный режим мышечной активности, сбалансированное питание, отказ от употребления алкоголя и табака [Коркушко О.В. и соавт., 2002]. Важная роль отводится генетическим факторам [Бочков Н.П., 1999; Бочков Н.П. и соавт., 2002]. По мере увеличения возраста происходят значительные морфо-функциональные изменения в эндокринной и иммунной системах, которые возникают на уровне клетки и выражаются снижением энергетического мембранного потенциала, сдвигами в проницаемости мембран, нарушениями взаимосвязи между органоидами клетки, ослаблением окислительных процессов. Изменение трофики тканей, приводящее к ослаблению их адаптационных возможностей, требует направленного воздействия средств, способных осуществлять коррекцию нарушений клеточного метаболизма, нормализацию ней-роэндокринной регуляции, иммунитета, восстанавливать компенсаторные механизмы организма [Петров Р.В., Хаитов P.M., 1975; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001].

Опубликовано много исследований, позволяющих считать, что этот процесс можно отсрочить за счет продления периода активного долголетия. Такие обнадеживающие данные получены для различных органов и и систем [Хавинсон В.Х. и др., 2003]. В'частности, с помощью новейших методов. исследования было показано, что тимус у взрослых людей может способствовать восстановлению Т-клеток, хотя ранее считалось, что по достижении человеком подросткового возраста тимус перестает функционировать [Douek D.C., Koup R.A., 2000]. По данным Hasegawa А. и соавторов, пинеальная железа, человека не подвергается выраженной дегенерации в процессе возрастной инволюции: авторы не обнаружили корреляции между весом эпифиза и возрастом пациента [Hasegawa А. et al., 1987]. Таким образом, есть основания полагать, что организм обладает потенциальными эндогенными механизмами, способными обеспечить более долгую жизнь. Для продления активного периода жизни человека важно выяснить эти механизмы для различных органов и систем и разработать способы влияния на них. Обеспечение постоянства внутренней среды организма гомеостаза) осуществляется сложным комплексом реакций, которые, прежде всего, предполагают тесное взаимодействие нервных и эндокринных механизмов регуляции. Нейроэндокринной системе при этом отводится роль главного интегрирующего звена в развитии местных и общих компенсаторно-приспособительных реакций всех структурных уровней [Горизонтов П.Д., 1981; Гольдберг Е.Д. и соавт., 1996].

Среди заболеваний, наиболее часто встречающихся у людей старших возрастных групп и значительно снижающих качество их жизни, следует особо отметить заболевания поджелудочной железы, частота которых значительно прогрессирует с возрастом.

К наиболее распространенным заболеваниям поджелудочной железы, ассоциированным с возрастом, относятся инсулиннезависимый сахарный, диабет 2 типа (ИНСД) и хронический панкреатит. В последние десятилетия наблюдается значительное увеличение заболеваемости сахарным диабетом (СД) в мире. Это особенно относится к экономически развитым странам, где диабетом страдают до 10% населения. Увеличение распространенности заболеваемости СД в первую очередь наблюдается среди лиц старше 40 лет. Каждые 15 лет заболеваемость СД удваивается [Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2006], при этом важно отметить, что это происходит с основном за счет увеличения количества больных инсулиннезависимым диабетом.

Важную роль в снижении качества жизни людей пожилого и старческого возраста играет хронический панкреатит, заболеваемость которым, как известно, с возрастом увеличивается. Хронический панкреатит — достаточно частое заболевание: в разных странах заболеваемость панкреатитом составляет 5-7 новых случаев на 100 000 человек. При этом за последние 40 лет произошел примерно двукратный прирост заболеваемости. Это связано не только с улучшением диагностики заболевания, но и с увеличением употребления алкоголя в некоторых странах, усилением воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, которые ослабляют различные защитные механизмы организма, а также с постарением населения развитых стран [Кокуева О.В. и соавт., 2001; Минушкин О.Н., 2001].

В литературе встречаются противоречивые данные, освещающие морфологические аспекты возрастных изменений в поджелудочной железе. Основное внимание исследователей направлено, в первую очередь, на изменения в клетках В-островков Лангерганса, ответственных за синтез инсулина, что связано с их ролью в регуляции уровня глюкозы в крови. Однако при формировании предпосылок для развития возрастной патологии важное значение имеют структурные и функциональные изменения, которые происходят при старении с другими структурами - А-клетками, секретирующими глюкагон, Э-клетками, вырабатывающими соматостатин, и др. Большое значение для изучения механизмов развития возрастной патологии имеет изучение пролиферативного потенциала различных клеток поджелудочной железы.

Негативное влияние патологических состояний поджелудочной железы на качество жизни, в первую очередь, лиц пожилого и старческого возраста диктует необходимость поиска новых эффективных и безопасных средств для профилактики и коррекции выраженных возрастных изменений в поджелудочной железе, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с возрастом, - ИНСД и хронического панкреатита.

В связи с изложенным выше изучение возрастных изменений и механизмов развития патологических состояний поджелудочной железы, ассоциированных с возрастом, и поиск средств для их профилактики и коррекции является актуальной задачей геронтологии и клинической лабораторной диагностики.

Целью исследования явилось изучение возрастных морфо-функциональных изменений поджелудочной железы и механизмов пепти-дергической регуляции ее функций при старении.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические изменения поджелудочной железы при старении.

2. Выявить корреляцию структурных и функциональных изменений поджелудочной железы при старении.

3. Сравнить функциональную активность поджелудочной железы у молодых и старых животных.

4. Изучить морфо-функциональные изменения поджелудочной железы в разных экспериментальных моделях преждевременного старения.

5. Изучить морфо-функциональные изменения поджелудочной железы в экспериментальной модели сахарного диабета.

6. Изучить механизмы пептидергической регуляции функции поджелудочной железы при старении и развитии.возрастной патологии. I

Научная новизна работы

Впервые выявлены морфо-функциональные изменения поджелудочной железы при старении, выражающиеся1 в гипоплазии и дистрофии эпителия мелких выводных протоков, фиброзе междольковых перегородок и склерозе стенок крупных сосудов, а также нарушении структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса, коррелирующие со снижением секреции соматостатина и глюкагона. Установлено уменьшение доли пролиферирующих клеток в тканях поджелудочной железьь при старении, приводящее к снижению уровня физиологической регенерации органа.

Впервые в экспериментальной модели преждевременного старения (эпифизэктомия) доказано геропротекторное действие пептидов эпифиза, выражающееся, в первую очередь, в восстановлении микроциркуляторного русла и нормализации экспрессии соматостатина и глюкагона в островках-поджелудочной железы.

В модели преждевременного старения, вызванного радиационным повреждением, показано значительное снижение уровня репаративной регенерации органа на фоне микроциркуляторных изменений. При этом установлено, что пептиды панкраген и Т-38 активизируют процессы пострадиационной репарации в тканях поджелудочной железы, что приводит к усилению экспрессии инсулина, соматостатина и глюкагона в панкреатических островках до нормальных возрастных значений.

В экспериментальной модели сахарного диабета впервые выявлено модулирующее действие панкрагена, выражающееся в усилении экспрессии инсулина В-клетками и ослаблении продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса в условиях действия стрептозотоцина.

В работе впервые выявлены механизмы пептидергической регуляции функции поджелудочной железы, которая выражается в нормализации1 состояния микроциркуляторного русла, восстановлении функциональной активности островковых и ацинарных клеток, а также в стабилизации морфо-функциональной структуры поджелудочной железы.

Практическая ценность работы

Детальное выяснение морфо-функциональных изменений поджелудочной железы при старении значительно расширяет представления о механизмах развития патологии поджелудочной железы, ассоциированной со старением, что создает предпосылки для разработки патогенетических методов ее профилактики и коррекции.

Установленное геропротекторное действие пептидных препаратов на различные структуры поджелудочной железы свидетельствует о перспективности создания новых эффективных средств для профилактики и коррекции возрастных изменений поджелудочной железы, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с возрастом. При этом установлены механизмы протекторного и корригирующего действия пептидов эпифиза, панкрагена и Т-38, заключающиеся в улучшении состояния микроциркуляторного русла, повышении функциональной активности островковых и ацинарных клеток за счет стабилизации структурно-функционального состояния поджелудочной железы.

Положения, выносимые на защиту

1. Основными изменениями поджелудочной железы при старении являются дисфункции микроциркуляторного русла, а также нарушения структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса и ацинарной ткани.

2. Возрастные изменения поджелудочной железы коррелируют со снижением синтеза и секреции инсулина, соматостатина и глюкагона и приводят к уменьшению доли пролиферирующих клеток в поджелудочной железе старых животных.

3. Геропротекторные свойства пептидов эпифиза выражаются в нормализации экспрессии соматостатина в О-клетках под действием эпитало-на и экспрессии глюкагона в А-клетках поджелудочной железы под действием эпиталамина на фоне восстановления микроциркуляторного русла.

4. Пептиды Т-38 и панкраген активизируют процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе старых крыс в модели радиационного старения за счет нормализации микроциркуляторного русла и усиления функциональной активности клеток, что сопровождается восстановлением нормальных уровней экспрессии инсулина, глюкагона и соматостатина.

5. Панкраген способствует развитию репаративных и компенсаторных процессов в поджелудочной железе при экспериментальном сахарном диабете, что приводит к усилению экспрессии инсулина В-клетками и ослаблению продукции глюкагона А-клетками островков Лангер ганса по сравнению с показателями у животных, подвергнутых воздействию стрептозо-тоцина.

6. Пептидергическая регуляция функции поджелудочной железы при старении реализуется за счет влияния пептидов на состояние микроциркуляторного русла и функциональную активность островковых и ацинарных клеток.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению собственных результатов исследования и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы и приложения. Список литературы содержит 197 источников, в том числе 89 отечественных и 108 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 72 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Морфо-функциональные изменения поджелудочной железы у животных при старении выражаются в гипоплазии и дистрофии эпителия мелких выводных протоков на фоне фиброза междольковых перегородок и склероза стенок крупных сосудов, а также в нарушении структурно-функциональной организации эндокринных клеток островков Лангерганса.

2. Возрастные изменения структуры поджелудочной железы сопровождаются снижением оптической плотности Б- и А-клеток, свидетельствующим о снижении синтеза и секреции, соответственно, соматостатина и глюкагона при старении.

3. При старении происходит снижение уровня физиологической регенерации органа, отражением чего служит уменьшение доли пролиферирующих клеток как в ацинусах, так и в островках, по сравнению с показателями у молодых животных.

4. При моделировании преждевременного старения (эпифизэктомия) отмечаются различные нарушения микроциркуляторного русла поджелудочной железы (стаз крови, локальный отек, гипоплазия перицитарных клеток вдоль капилляров и появление дистрофических изменений цитоплазмы в них).

5. Пептиды эпифиза обладают геропротекторными свойствами и оказывают стабилизирующее действие на морфо-функциональпую структуру поджелудочной железы при старении. На фоне восстановления микроциркуляторного русла под действием эпиталона отмечается нормализация экспрессии соматостатина в Э-клетках островков, а под действием эпиталамина - нормализация экспрессии глюкагона в А-клетках.

6. При изучении поджелудочной железы в модели радиационного старения изменения структуры органа свидетельствуют о значительном снижении уровня репаративной регенерации и выражаются в повреждении эпителия в виде гибели отдельных клеток и компенсаторной гипертрофии других, что связано с развитием микроциркуляторных изменений.

7. Пептиды Т-38 и панкраген активизируют процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе старых крыс в модели радиационного старения, о чем свидетельствует усиление пролиферации клеток, что сопровождается повышением экспрессии инсулина, соматостатина и глюкагона до нормальных возрастных значений. При этом более выраженное действие на микроциркуляторное русло поджелудочной железы оказывает пептид Т-38, что выражалось в нормализации архитектоники капилляров, снижении полнокровия сосудов.

8. Панкраген приводит к развитию репаративных и компенсаторных процессов в поджелудочной железе в экспериментальной модели сахарного диабета, о чем свидетельствует усиление экспрессии инсулина В-клетками и ослабление продукции глюкагона А-клетками островков Лангерганса по сравнению с показателями у животных, подвергнутых воздействию стрептозотоцина.

9. Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при старении осуществляется за счет влияния пептидов на состояние микроциркуляторного русла (трипептид Т-38, пептиды эпифиза) и функциональную активность островковых и ацинарных клеток (панкраген), а также стабилизирующего действия на морфо-функциональную структуру поджелудочной железы (пептиды эпифиза).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для коррекции возрастных нарушений функций поджелудочной железы целесообразно комплексное применение пептидных препаратов, оптимизирующих нейроэндокринную регуляцию функции органа (эпиталон и эпиталамин), нормализующих микроциркуляцию (пептид Т-38) и функцию островковых и ацинарных клеток поджелудочной железы (панкраген).

2. Разработанные на экспериментальной модели критерии возрастных изменений морфо-функционального состояния поджелудочной железы могут быть рекомендованы для морфологической диагностики состояния поджелудочной железы в клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения.