Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении

/ /

На правах рукописи

ТАРНОВСКАЯ Светлана Игоревна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ СТАРЕНИИ

14.01.30 - геронтология и гериатрия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 КАЛ 2014

005547941

Санкт-Петербург - 2014

005547941

Работа выполнена в лаборатории биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Хавинсон Владимир Хацкелевич

доктор биологических наук Якуцени Павел Павлович

Официальные оппоненты:

Назаров Петр Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, заведующий лабораторией общей иммунологии отдела иммунологии.

Розенгарт Евгений Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова», руководитель группы функциональной биохимии беспозвоночных.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук «Инситут физиологии им. И.П. Павлова»

Защита диссертации состоится «¿¡ХЛ> С/¿-¿/¿■¿Л _ 2014 г. в часов на заседании Диссертационного Совета в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197119, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197119, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан «/%» ^/7//?/,/'2014 г.

у

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Л.С. Козина

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Встречаемость сахарного диабета 2-ого типа и хронического панкреатита неуклонно возрастает [Wild S. et al., 2004]. По данным экспертной комиссии ВОЗ, к настоящему времени сахарным диабетом страдают более 382 млн человек в мире. Этот показатель ежегодно возрастает на 5-10%. Увеличение распространенности сахарного диабета в первую очередь наблюдается среди лиц старше 60 лет [Дедов И.И., 1998; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2009]. По степени важности это заболевание стоит непосредственно после сердечных и онкологических заболеваний. Хронический панкреатит также является распространенным заболеванием поджелудочной железы. В разных странах панкреатит составляет 5-7 новых случаев на 100 000 человек. При этом за последние 50 лет произошел примерно двукратный прирост заболеваемости. Это связано не только с улучшением диагностики заболевания, но и с усилением воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, которые ослабляют защитные механизмы, а также с постарением населения развитых стран [Минушкин О.Н., 2001].

Одной из причин ассоциированного с возрастом развития сахарного диабета 2-ого типа и хронического панкреатита является уменьшение численности ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы [Мойса С.С., Ноздрачёв А.Д., 2011; Шестакова М.В., Викулова O.K., 2007]. На субклеточном уровне это связано с нарушением экспрессии сигнальных молекул -маркеров функциональной активности клеток поджелудочной железы.

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии был синтезирован пептид KEDW (Lys-Glu-Asp-Trp-NH2) [Khavinson V.Kh. et al., 2009]. В экспериментальных исследованиях на животных и при клинических испытаниях у пациентов (60-75 лет) с сахарным диабетом 2-го типа выявлено, что пептид снижает уровень глюкозы в крови. Установлено, что при ал-локсановом сахарном диабете у крыс пептид способствовал достоверному снижению уровня глюкозы в крови на 35%, что корреллировало с уменьшением летальных исходов [Khavinson V.Kh. et al., 2010]. У пациентов, страдающих сахарным диабетом 2-го типа, пептид снижал уровень глюкозы в крови натощак и при стандартном глюкозотолерантном тесте, уменьшал концентрацию инсулина в плазме крови и индекс инсулинорезистентности [Korkushko O.V. et al., 2011]. Кроме того, установлено, что пептид способен проникать в ядро и ядрышко клеток и модулировать действие эндонуклеаз [Fedoreyeva L.I. et al., 2011]. Однако молекулярный механизм его действия изучен недостаточно.

Целью исследования явилось изучение молекулярных механизмов действия пептида KEDW на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы при старении.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние пептида KEDW на развитие процессов пролиферации в эксплантатах от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани поджелудочной железы.

2. Оценить возрастную динамику экспрессии факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы (Ptfla, НохаЗ, Схс112, Pdxl, Рахб, Рах4, Foxa2, Nkx 2.2) в диссоциированной культуре под действием исследуемого пептида KEDWh контрольного пептида AEDL.

3. Изучить возрастные особенности экспрессии проапоптотического (р53) и антиапоптозного (Мс1-1) белков и факторов пролиферации (KÍ67, PCNA) в диссоциированной культуре клеток поджелудочной железы под действием исследуемого пептида KEDW и контрольного пептида AEDL.

4. Провести исследование влияния пептида KEDW на экспрессию генов PDX1, NGN3, MNX1, РАХб, FOXA2, NKX2-2, NKX6.1, НОХАЗ, РАХ4 в культуре клеток поджелудочной железы.

5. Оценить физическими методами исследования взаимодействие пептида KEDW с дезоксирибонуклеиновой кислотой.

6. Найти предполагаемые сайты связывания для пептида KEDW в промо-торных участках генов PDX1, NGN3, MNX1, РАХб, FOXA2, NKX2-2, NKX6.1, НОХАЗ, РАХ4.

7. Выявить различия структурно-конформационного и физико-химического поведения пептида KEDW и контрольного пептида AEDL.

8. Построить компьютерные модели межмолекулярного, атом-атомного взаимодействия исследуемого пептида KEDW и контрольного пептида AEDL с молекулами дезоксирибонуклеиновой кислоты и коровыми ги-стонами.

Научная новизна работы

Впервые выявлены молекулярные изменения клеток поджелудочной железы при старении, выражающиеся в снижении синтеза и экспрессии функционально важных сигнальных молекул - факторов пролиферации и дифференцировки эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы. На клеточном уровне установлено, что пептид KEDW способен усиливать процессы репарации и восстановления сниженных или утраченных функций клеток поджелудочной железы путем активации экспрессии ряда сигнальных молекул. Экспериментально выявлено, что наиболее выраженный эффект пептид проявляет в «старых» культурах клеток. Установлено, что пептид KEDW обладает тканеспецифичностью - во всех исследуемых группах был выявлен эффект пептида KEDW на культуры клеток поджелудочной железы, тогда как контрольный пептид AEDL не обладает таким действием. Пептид KEDW способен усиливать экспрессию генов факторов дифференцировки эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы в «старых»

культурах клеток. Пептид обладает антиапоптозным действием на клетки поджелудочной железы, которое особенно выражено в «старых» культурах клеток.

Впервые было изучено взаимодействие пептида с ДНК методами кругового дихроизма, вискозиметрии и УФ-спектроскопии. Установлено, что пептид связывается с ДНК, но этот процесс протекает достаточно медленно (в течение нескольких часов) и практически без участия электростатических сил. В результате комплексообразования, которое реализуется в большой бороздке ДНК с участием азотистых оснований и пептида, наблюдается снижение изгибной жесткости ДНК и дестабилизация вторичной структуры макромолекулы.

Впервые получена атомистическая модель молекулярного взаимодействия пептида КЕБШ с дуплексом ДНК. Выявлено, что пептид взаимодействует с азотистыми основаниями ДНК, образуя с ними водородные, ионные, я-катионные, стекинговые и гидрофобные связи. Впервые получена атомистическая модель взаимодействия пептида с гистонами. Наиболее энергетически выгодные комплексы пептид образует с коровым гистоном Н3.2, выполняющего важную роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Выдвинуто предположение, что связывание пептида КЕВ\\^ с ДНК и гистонами может служить одним из механизмом его панкреопротекторного действия.

Практическая ценность работы

С точки зрения клеточной биологии детальное выяснение молекулярных изменений в клетках поджелудочной железы при старении значительно расширяет представление о механизмах развития патологии поджелудочной железы, ассоциированной с возрастом. Проведенные цитологические и гистологические исследования позволили выявить новую клеточную фармакотроп-ную мишень для действия пептида - малодифференциированные

клетки поджелудочной железы. Это позволяет расширить сферу его возможного терапевтического применения в лечении нарушений метаболического обмена, связанных с ухудшением функций Р-клеток, посредством их замещения, а также повышения их функциональной активности при возрастной инволюции. Важно отметить, что пептид КЕО\¥ может явиться препаратом, обеспечивающим сохранность функционирования поджелудочной железы за счет дифференцировки клеток, находящихся на стадии покоя в различных субпопуляциях клеток поджелудочной железы.

Предложенные компьютерные модели комплексов пептида КЕО\У с ДНК и коровыми гистонами необходимы для понимания молекулярных механизмов действия коротких пептидов и их роли в эпигенетической регуляции различных процессов в клетке при старении. Достигнутый уровень рассмотрения атом-атомных взаимодействий является принципиальной точкой развития дальнейших работ, связанных с направленным поиском и конструированием лекарственных средств, предназначенных для предупреждения или лечения возрастных патологий поджелудочной железы.

Положения, выносимые на защиту

1. Пептид КЕОШ обладает способностью стимулировать пролифератив-ные процессы в ткани поджелудочной железы старых крыс.

2. Основным изменением поджелудочной железы при старении является снижение синтеза факторов дифференцировки (РШа, Рс1х1, Рахб, Роха2, Мкх 2.2, НохаЗ) и пролиферации (РСЫА, Ю67) в эндокринных и экзокринных клетках поджелудочной железы.

3. Геропротекторное свойство пептида КЕО^/ выражается в нормализации экспрессии факторов дифференцировки и пролиферации панкреатических клеток, что приводит к восстановлению функциональной активности поджелудочной железы при старении и доказывает возможность пептидной регуляции функций поджелудочной железы.

4. Увеличение экспрессии генов факторов дифференцировки в культурах клеток поджелудочной железы при добавлении пептида указывает на эпигенетический механизм его действия. Наиболее выраженный эффект проявляется в «старых» культурах клеток.

5. Пептид КЕО\У образовывает устойчивые комплексы с ДНК. Низкая скорость образования комплекса с ДНК объясняет более позднее проявление его максимального эффекта.

6. Предложенные компьютерные модели взаимодействия пептидов с ДНК и норовыми гистоновыми белками по уровню детализации достигают атомистической точности, что открывает дополнительные возможности для обоснования характера молекулярных механизмов пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 24 научных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на VII научно-практической герон-тологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); на V юбилейной Международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2012» (Белгород, Россия, 2012);. на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2012); на IV Ежегодной научной конференции «ФЦСКЭ имени В.А. Алмазова» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на II Международной конференции «Генетика старения и долголетия» (Москва, Рос-

сия, 2012); на Международном форуме «Старшее поколение 2012» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное»; на VIII Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на научно-практической конференции с международным участием «Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика»; на III Съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, Россия, 2012); на Международном совещании «Количественный имиджинг и спектроскопия в нейронауках» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на VIII научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на 20 Мировом конгрессе IAGG международной ассоциации геронтологов и гериатров по геронтологии и гериатрии (Сеул, Южная Корея, 2013); на конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы геронтологии и гериатрии» (Киев, Украина, 2013); на Европейской конференции, посвященной использованию программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012 (Амстердам, Нидерланды, 2013); на VIII Европейском конгрессе по биогеронтологии (Бе-эр-Шева, Израиль, 2013); на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, Россия, 2013); на молодежной научной конференции «Студенты и молодые ученые - инновационной России» (Санкт-Петербург, Россия, 2013); на Всероссийской молодежной конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты старения. Хрупкость: модели, маркеры, фенотипы. Результаты проекта "Хрусталь"» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).

Личный вклад автора

Основные результаты получены лично автором, как и их анализ с применением современных методов статистической обработки.

Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в планировании, проведении экспериментов, статистической обработке и анализе данных молекулярного механизма взаимодействия пептидов с молекулами ДНК и гистонами. Автор принимала участие во всех экспериментах, включавших в себя органотипическое и диссоциированное культивирование клеток, иммуноцитохимическое окрашивание, микроскопию, морфометрию, физические методы исследования и молекулярное моделирование взаимодействия пептидов с ДНК и коровыми гистонами, а также статистический анализ данных.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложению собственных результатов исследования и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список литературы содержит 197 источников, в том числе 35

отечественных h 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 62 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пептидные биорегуляторы

В исследовании изучали влияние на дифференцировку клеток поджелудочной железы следующих пептидов: пептида KEDW (Lys-Glu-Asp-Trp-NH2, панкраген, молекулярная масса 576 Да), полученного классическим методом пептидного синтеза в растворе [Khavinson V.Kh et al, 2009a] и пептида AEDL (Ala-Glu-Asp-Leu-OH, бронхоген, молекулярная масса 446 Да), полученного классическим методом пептидного синтеза в растворе [Khavinson V.Kh et al, 20096].

Исследование влияния пептида KEDW на клеточную пролиферацию в органотипической культуре поджелудочной железы молодых и старых

крыс

Эксперименты проведены на 900 эксплантатах поджелудочной железы 3-месячных (молодые) и 24-месячных (старые) крыс линии Вистар. Эксплантаты помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием, заливали 3 мл питательной среды и культивировали в термостате при температуре 37° С. Пептид KEDW вводили в культуральную среду в эффективной концентрации 2 нг/мл. На 3-й сутки эксплантаты просматривали под фазово-контрастным микроскопом, определяли индекс площади (ИП), как соотношение площади всего эксплантата к площади центральной зоны.

Исследование влияния пептида KEDW на синтез сигнальных молекул в диссоциированных культурах клеток поджелудочной железы

Исследование проводили на культурах клеток 3 и 14 пассажей поджелудочной железы человека MIA РаСа-2, полученных в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург). 3 пассаж расценивали как «молодые» культуры, а 14 пассаж - как «старые» культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры разделили на 3 группы: в 1 группу (контрольную) вводили физиологический раствор, во 2 группу добавляли контрольный тетрапептид (AEDL, 20 нг/мл), а в 3 группу - исследуемый тетрапептид (KEDW, 20 нг/мл). Клетки культивировали во флаконах Jet Biofil («Биолот») площадью 25 см2 в 5 мл ростовой среды при температуре 37°С в среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина («Биолот»), 15% сыворотки плодов коровы SC-BIOL («Биолот») и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Исходная концентрация клеток составила 106 клеток/мл. Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к проапоптоти-ческому белку р53 (1:50, «Dako»); антиапоптотическому белку Мс1-1 (1:40,

«Novocastra»); маркерам пролиферации Ki67 (1:100, «Novocastra») и PCNA (1:100, «Novocastra») и факторам дифференцировки эндокринных и экзо-кринных клеток поджелудочной железы Rtfla, Pdxl, Рахб, Foxa2 Nkx2.2, Рах4 (1:50, «Abcam»). В качестве вторичных антител применяли биотинили-рованные антимышиные иммуноглобулины («Novocastra»), Пермеабилиза-цию проводили с применением 0,1 % тритона XI00. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина («EnVision Detection System», Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse).

Морфометрический метод исследования

Оценку результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическим методом. Морфометрическое исследование проводили согласно основным принципам морфометрии и стереологии [Автандилов Г.Г., 1990] с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа «Nikon Eclipse Е400» (Япония), цифровой камеры «Nikon DXM1200» (Япония), персонального компьютера на базе «Intel Pentium 4» и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 5.2». Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый сигнальный белок.

Метод анализа количественной полимеразной ценной реакции

Концентрации матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК) PDX1, NGN3, MNX1, РАХб, FOXA2, NKX2-2, NKX6.1, НОХАЗ, РАХ4 оценивали методом количественного ПЦР-анализа. Очистку суммарной РНК из клеток, стабилизированных реагентом «RNAprotect Cell Reagent», осуществляли с помощью набора «RNeasy Mini Kit» методом, рекомендованным фирмой-производителем («Qiagen», Германия). Полученные образцы РНК использовали для синтеза первой нити кДНК с помощью затравки oligo(dT)i8 («Син-тол», Россия) и набора обратной транскрипции «Omniscript RT Kit» («Qiagen», Германия). На каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 мкл использовали 1 мкг очищенной суммарной РНК. Полученную реакционную смесь использовали непосредственно как матрицу для ПЦР из расчета 1 мкл смеси на реакцию объемом 25 мкл. Количественную ПЦР в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя «SYBR Green I» проводили с помощью набора «QuantiFast SYBR Green PCR Kit» («Qiagen», Германия) в термоциклере «CFX96 Real-Time PCR Detection System» («BioRad Laboratories», Inc., США). Первичную статистическую обработку результатов и построение диаграмм осуществляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения «CFX Manager Software». Все концентрации нормализовали относительно мРНК «GAPDH», концентрацию которой во всех образцах принимали за 1. В экспериментах использовали по 3 независимых образца клеток каждой группы (биологические параллели). Для каждого образца кДНК проводили минимум три параллельные ПЦР в сосед-

них лунках прибора (технические параллели). Конструирование олигонук-леотидных праймеров осуществляли с помощью онлайн-сервиса «NCBI Primer-Blast». При этом использовали пары праймеров, один из которых соответствовал пограничным участкам двух соседних экзонов. Соответствующие олигонуклеотиды были синтезированы в фирме «Синтол» (Россия).

Физические методы исследования взаимодействия пептида KEDW с

молекулой ДНК

Для изучения взаимодействия пептида KEDW с ДНК использовали ДНК тимуса теленка («Sigma»), молекулярную массу которой определяли из характеристической вязкости в 0,15 моль/л NaCl (ММ=9><106). ДНК растворяли в дистиллированной воде и после 4 сут. выдержки при температуре 4°С добавляли раствор NaCl до достижения концентрации 0,005 моль/л и 1 моль/л. После фильтрации раствора и определения концентрации ДНК готовили ее комплексы с пептидом сливанием равных объемов растворов компонентов соответствующей ионной силы. Концентрацию ДНК в растворе определяли по разнице оптического поглощения при X = 270 нм и X = 290 нм, гид-ролизованных в течение 15 мин в 6%-ной НСЮ4 при температуре 100°С. На-тивность молекулы ДНК контролировали по величине гиперхромного эффекта при денатурации макромолекулы на длине волны 260 нм. Растворы ДНК и пептида KEDW смешивали вместе и изучали их спектральные характеристики физическими методами через 1 сут. после смешивания и хранения при температуре 4° С. Исследование спектральных характеристик выполняли на спектрофотометре «СФ-56» (Россия) и дихрографе «Autodichrograph Mark IV» (Франция). Вязкость растворов определяли с помощью ротационного низкоградиентного вискозиметра типа Зимма-Крозерса [Frisman E.V. et al., 1965].

Компьютерное моделирование взаимодействия пептидов с ДНК и

гистонами

Молекулярное моделирование комплекса пептидов с ДНК и с гистонами выполняли с использованием программного обеспечения «Molecular Operating Environment 2012.10» (Chemical Computing Group, Канада). В качестве контрольного пептида выбирали пептид AEDL. Оптимальные трехмерные структуры пептидов KEDW и AEDL находили методом конформацион-ного поиска в различных силовых полях [Ferguson D.M., Raber D.J., 1989; Шестакова H.H., Розенгарт Е.В., 1995]. Главные результаты получены в поле MMFF94X. Влияние растворителя учитывали в неявном виде с введением внутренней диэлектрической константы равной 1, а внешней - 80 (генерализованное приближение Борна). С полученными конформерами пептидов проводился докинг с ДНК и гистонами. В качестве двухцепочечной молекулы ДНК выбран дуплекс B-формы d(ATATGGCAGGGGTAA)2, содержащий предполагаемый сайт связывания GGCAG. Для построения моделей гистонов использовали метод гомологического моделирования, который позволяет оценивать степень гомологии первичной структуры исследуемых белков с

белками из базы данных Protein Data Bank, трехмерная структура которых расшифрована методами рентгеноструктурного анализа или ядерно-магнитного резонанаса [Berman Н.М. et al., 2000]. Для создания моделей ги-стонов использовали структуру нуклеосомы 3AV1, расшифрованную методом рентгеноструктурного анализа [Tachiwana Н. et al., 2011].

Для моделирования комплекса пептида с двухцепочечной ДНК и ги-стонами использовали метод молекулярного докинга, суть которого состояла в подборе оптимальной взаимной ориентации молекул при их связывании и образовании стабильного комплекса. При расчете оптимальных ориентаций пептидов в дуплексе ДНК и коровых гистонах учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. Использовали силовое поле Amberl2EHT и генетический алгоритм поиска GBVI/WSA [Corbeil C.R. et al., 2012; Gerber P.R., Müller К., 1995]. После построения молекулы ДНК, гистонов и пептидов протонирова-ли при pH 7 и Т=300 К. Энергию взаимодействия пептидов с ДНК определяли по значению оценочной функции AG, ккал/моль [Nairn М. et al., 2007]. Было проведено по 10 итераций докинга пептидов с дуплексом ДНК и гистона-ми. Решения докинга ранжировали по убыванию от наиболее энергетически выгодного решения до наименее энергетически выгодного решения.

Статистические методы обработки результатов исследования

Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения от среднего и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе "Statistica v.6.1". Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала-Уоллиса) [Гланц С., 1999]. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние пептида KEDW на клеточную пролиферацию в органотипиче-ской культуре поджелудочной железы молодых и старых крыс

Установлено, что KEDW стимулировал клеточную пролиферацию в эксплантатах как от молодых, так и от старых крыс. Зона роста эксплантатов при этом увеличивалась статистически достоверно на 18-24% по сравнению с контролем. В исследованных в качестве отрицательного контроля других тканях пептид KEDW не оказывал стимулирующего влияния (ткани коры и подкорковых образований головного мозга, предстательной железы, мочевого пузыря), и значения ИП оставались на уровне контроля. Контрольный пептид AEDL не оказывал стимулирующего влияния на эксплантаты поджелудочной железы молодых и старых крыс.

Влияние пептида КЕБХУ на экспрессию факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении

При старении культур в контрольной группе клеток площадь экспрессии всех маркеров, кроме Рах4, снижалась (табл. 1).

Таблица 1

Влияние пептида на площадь экспрессии факторов дифференцировки в

диссоциированных культурах клеток поджелудочной железы

Группа Контроль (М±ш; %) Контрольный пептид (М±т; %) КЕБ\У (М±т; %)

«Молодые» культуры «Старые» культуры «Молодые» культуры «Старые» культуры «Молодые» культуры «Старые» культуры

Рс1х1 2,84±0,08 1,05±0,05 3,05±0,13 1,15±0,05 3,63±0,22* 2,75±0,14**

РШа 1,48±0,08 0,32±0,03 1,65±0,12 0,45±0,01** 2,04±0,11* 1,95±0,05**

Рахб 2,32±0,07 1,15±0,02 2,29±0,2 1,35±0,04** 2,96±0,11* 2,64±0,05**

Еоха2 1,55±0,14 0,45±0,02 1,63±0,05 0,36±0,06 1,66±0,14 0,75±0,01**

№х2.2 1,32±0,06 0,34±0,03 1,45±0,08 0,40±0,03 1,74±0,06* 0,68±0,05**

Рах4 0,96±0,06 1,19±0,03 1,16±0,07* 1,38±0,03** 1,26±0,11* 1,74±0,03**

НохаЗ 5,40±0,27 2,70±0,13 6,90±0,34* 3,70±0,18** 8,60±0,43* 10,20±0,51**

Схс112 8,30±0,40 7,30±0,36 8,90±0,44 8,30±0,41** 10,10±0,50* 12,60±0,63**

*-р<0,05 по сравнению с контрольными клетками в «молодых» культурах; **-р<0,05 по сравнению с контрольными клетками в «старых» культурах.

Наиболее выраженное снижение экспрессии было отмечено для маркера РШа, который является фактором дифференцировки ацинарных клеток поджелудочной железы. Площадь его экспрессии в «старых» культурах уменьшалась в 4,6 раза по сравнению с «молодыми» культурами (р<0,05). При введении контрольного пептида в «молодых» и «старых» культурах клеток поджелудочной железы экспрессия маркера РШа достоверно не изменялась (табл.1). Под действием пептида КЕО\¥ в «молодых» и «старых» культурах клеток площадь экспрессии РШа увеличивалась соответственно в 1,5 и 6 раза (р<0,05). Фактор дифференцировки Р<1х1 является ключевым маркером созревания всех типов эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы. Площадь экспрессии Рёх1 уменьшалась в «старых» культурах в 2,7 раза по сравнению с «молодыми» культурами. Под действием пептида ЫЮ\У площадь экспрессии Рс1х1 в «молодых» культурах увеличивалась в 1,3 раза, а в «старых» культурах - в 2,6 раза. При введении контрольного пептида АЕОЬ экспрессия Рс1х1 увеличивалась в «молодых» и «старых» культурах на 10% по сравнению с контролем. Таким образом, пептид КЕБ\У оказывал более выраженное стимулирующее влияние на экспрессию Рс1х1 по сравнению с контрольным пептидом АЕОЬ. В созревании а-, 0-, 5- и РР-клеток поджелудочной железы участвуют факторы дифференцировки Рахб, Боха2, N10(2.2. Их площадь экспрессии в «старых» культурах клеток снижалась в 2-4 раза по сравнению с «молодыми» клетками (табл.1). Под действием пептида

КЕО\\^ площадь экспрессии маркера Роха2 в «молодых» культурах достоверно не изменялась, а площадь экспрессии Рахб и Ыкх2.2 увеличивалась в 1,3 раза. В «старых» культурах под влиянием пептида КЕО\¥ площадь экспрессии Роха2, Ыкх2.2 и Рахб возрастала соответственно в 1,6; 2 и 2,3 раза по сравнению с контролем. Контрольный пептид АЕБЬ не влиял на площадь экспрессии маркера Роха2 в «молодых» и «старых» культурах. При этом контрольный пептид оказывал слабое стимулирующее действие на площадь экспрессии маркера Ыкх2.2 в «молодых» культурах и на Рахб в «старых» культурах.

При исследовании действия пептида КЕО\¥ на экспрессию генов факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы было выявлено, что при добавлении пептида в «молодых» культурах клеток поджелудочной железы наблюдалось снижение экспрессии мРНК генов РБХ1, РАХ6, НОХАЗ, РАХ4 соответственно в 1,6; 2,2; 1,7; 1,4 раза и увеличение экспрессии мРНК генов ЖШЗ, ШХ1, РОХА2, ЫКХ6.1 соответственно в 1,3; 1,6; 1,3; 1,3 раза (табл. 2). В «старых» культурах клеток при добавлении пептида КЕБ\¥ наблюдалось увеличение экспрессии мРНК всех исследуемых генов, кроме МЫХ1 и НОХАЗ. Их экспрессия, напротив, снижалась под действием пептида в 1,5 и 2,4 раза по сравнению с контролем. Наиболее выраженный эффект наблюдался при исследовании экспрессии генов РБХ1, МОШ, РАХ6: пептид увеличивал их экспрессию соответственно в 1,6; 2,7; 1,8 раза по сравнению с контролем в «старых» культурах клеток.

Таблица 2

Влияние пептида на экспрессию матричной рибонуклеиновой кислоты

генов факторов дифференцировки

мРНК/кол-во повторов Контроль Добавление КЕБ\У

«молодые» культуры (М±т; %) «старые» культуры (М±т; %) «молодые» культуры (М±т; %) «старые» культуры (М±т; %)

РйХ1 0,55±0,02 0,85±0,07* 0,35±0,01* 1,35±0,06**

N€N3 0,30±0,01 0,50±0,02* 0,40±0,02* 1,35±0,06**

ШХ1 0,50±0,05 1,10±0,20* 0,80±0,08 0,75±0,05**

РАХ6 0,66±0,03 0,75±0,06* 0,30±0,03* 1,37±0,08**

ЕОХА2 0,83±0,09 0,95±0,09* 1,10±0,08* 1,25±0,06**

ЫКХ2-2 1,15±0,10 0,50±0,04* 1,10±0,05 0,80±0,06**

ИКХ6.1 0,77±0,07 0,80±0,05* 1,05±0,05* 1,20±0,07**

НОХАЗ 0,70±0,10 1,10±0,20* 0,40±0,02 0,45±0,03**

РЛХ4 1,30±0,09 0,75±0,06* 0,90±0,04* l,0ft±0,10**

*-р<0,05 по сравнению с контролем в «молодых» культурах; **-р<0,05 по сравнению с контролем в «старых» культурах.

Снижение экспрессии генов в «молодых» культурах клеток под действием пептида, вероятно, связано с компенсаторной реакцией клеток на его воздействие.

Влияние пептида КЕБХУ на экспрессию факторов пролиферации и апоптоза в клетках поджелудочной железы при старении

В «старых» культурах клеток при введении пептида КЕО\У наблюдалось снижение площади экспрессии р53 в 1,5 раза и увеличение экспрессии белка Мс1-1 в 1,3 раза по сравнению с контролем (табл. 3). Контрольный пептид АЕОЬ достоверно не влиял на экспрессию маркеров р53 и Мс1-1 (р<0,05). Пептиды не действовали на экспрессию маркеров апоптоза в «молодых» культурах клеток. Однако в «молодых» культурах клеток при добавлении пептида КЕБ\^ наблюдалось достоверное увеличение площади экспрессии маркера К167 в 1,4 раза (табл. 3).

Таблица 3

Влияние пептида на площадь экспрессии факторов пролиферации и

апоптоза в диссоциированных культурах клеток поджелудочной железы

Группа Контроль (M±m; %) Контрольный пептид (М±т; %) KEDW (M±m; %)

«Молодые» культуры «Старые» культуры «Молодые» культуры «Старые» культуры «Молодые» культуры «Старые» культуры

р53 4,9±0,2 4,7±0,2 5,2±0,3 5,5±0,3** 3,3±0,1* 3,1±0,1**

Мс1-1 5,0±0,2 4,7±0,2 4,6±0,2 4,4±0,2 4,4±0,2* 6,3±0,3**

Ki67 3,0±0,1 2,2±0,1 3,3±0,2 3,2±0,2** 4,1±0,2* 4,6±0,2**

PCNA 3,3±0,2 3,0±0,1 3,2±0,1 2,7±0,1** 3,4±0,1* 4,6±0,2**

*-р<0,05 по сравнению с контролем в «молодых» культурах;

**-р<0,05 по сравнению с контролем в «старых» культурах.

В «старых» культурах клеток при добавлении пептида площадь экспрессии маркера Ki67 увеличивалась в 2 раза по сравнению с соответствующим контролем. При добавлении контрольного пептида AEDL в «молодых» и «старых» культуры клеток достоверных изменений экспрессии маркера Ki67 не наблюдалось. Площадь экспрессии маркера пролиферации PCNA при добавлении пептидов KEDWh AEDL в «молодых» культурах клеток достоверно не изменялась. Однако при введении пептида KEDW в «старые» культуры клеток экспрессия маркера пролиферации PCNA увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с контролем. Пептид AEDL оказывал противоположное действие и снижал экспрессию маркера PCNA в «старых» культурах клеток (табл. 3).

Исследование спектральных характеристик образования комплексов дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидами

Для рассмотрения взаимодействия пептидов с природной ДНК использовали водно-солевые растворы высокомолекулярной двухцепочечной ДНК. В таком случае сложно получить информацию о высокоспецифичном взаимодействии пептида с определенной последовательностью ДНК, но полученные таким образом сведения о комплексообразовании могут способствовать пониманию общих закономерностей связывания компонентов. При смешивании равных объемов растворов ДНК и пептида KEDW в 0,005 М NaCl спектр

поглощения реализуемой системы, зарегистрированным сразу после приготовления, совпадал с суммой спектров свободных соединений соответствующих концентраций. Однако через 1 сутки при хранении раствора при температуре 4°С взаимодействие проявилось - спектр комплекса имел большую интенсивность по сравнению с суммой спектров компонентов до взаимодействия (рис. 1 А, графики 1 и 2 соответственно). Помимо гиперхромного эффекта, который может свидетельствовать о некоторой дестабилизации вторичной структуры ДНК при связывании, наблюдался длинноволновый сдвиг максимума поглощения с 260 нм до 275 нм (рис. 1 А, график 1). Аналогичные результаты были получены при использовании соответствующих растворов в 1 М NaCl, что указывало на отсутствие влияния электростатических взаимодействий на процесс комплексообразования. При изучении влияния пептида сравнения AEDL на спектральные свойства ДНК в растворе малой ионной силы (0,005 М NaCl) был обнаружен гипохромный эффект в области длин волн менее 272 нм, а при больших длинах волн появлялось «плечо» (рис. 1 Б). Иной результат (гиперхромный эффект) на полосе поглощения ДНК фиксировался в растворе 1 М NaCl. Это не могло быть связано с увеличением оптической плотности из-за рассеяния вследствие агрегации, так как вне полос поглощения компонентов оптическая плотность раствора была равна нулю. Эти результаты указывали на различие во взаимодействии пептида сравнения AEDL с ДНК при разных концентрациях NaCl.

В обоих случаях при связывании пептидов с ДНК во взаимодействие были вовлечены азотистые основания, так как именно они отвечали за спектральные свойства ДНК.

А Б

D -*-1

240

260 280 X, nm

зоо

240

260

X, nm

280

300

Рис. 1. Зависимость оптической плотности (D) растворов молекул ДНК и пептидов KEDW (А) и AEDL (Б) от длины волны (А) в 0,005 М NaCl. 1 -спектр поглощения комплекса ДНК с пептидом; 4 — вычисленная сумма спектров поглощения ДНК и пептида.

Важнейшим свойством пептидов является их оптическая активность, что связано с наличием в составе всех природных а-аминокислот (кроме глицина) асимметрического атома углерода, четыре валентные связи которого

заняты различными заместителями. Характерный спектр кругового дихроизма (КД) пептидов, спектры КД свободной ДНК и комплекса ДНК-пептид в растворах при 0,005 М NaCl приведены на рисунке 2. При изучении спектров КД было выявлено, что пептид KEDW оказывал специфическое воздействие на вторичную структуру ДНК в 0,005 М NaCl (рис. 2 А). При большой концентрации соли спектры КД комплекса и пептида KEDW отличались от наблюдаемых в 0,005 М NaCl. По-видимому, конформация пептида зависела от экранировки ионогенных групп. Однако его связывание с ДНК осуществлялось вне зависимости от этого. Спектр комплекса отличался от спектра компонентов (рис. 2 А).

А Б

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма ДНК (1), пептида (2), комплекса ДНК-пептид (3) в 0,005 М ЫаС1. С(рер)=1 мг/мл, С(ЭЫА)=0,05 мг/мл. Обозначения: X - длина волны, Ае - разность коэффициентов молярной экстинк-ции право- и левополяризованного света; А - пептид КЖ)\У; Б - пептид АЕБЬ.

При изучении спектров кругового дихроизма ДНК, пептида сравнения АЕБЬ и их комплекса при двух концентрациях соли также выявлено, что пептид сравнения АЕБЬ оказывал специфическое воздействие на вторичную структуру ДНК именно в растворе малой ионной силы (рис. 2. Б).

Моделирование молекулярных взаимодействий пептидов с молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты

Проведен докинг пептидов КЕБXV и АЕБЬ в дуплексе ДНК 5'-А1Т2А3Т4О5ОбС7А8О9О10О11О,2Т13А14А|53'* ЗТ30А29Т28А27С26С25О24Т23С22С21С20С19А18Т17Т16-5' Основные результаты докинга были получены в силовом поле Атс1ег12ЕНТ. В таблице 4 приведены результаты докинга комплексов, значения энергии связи которых ниже -5 ккал/моль. Комплексы с энергией связи выше -5 ккал/моль являются маловероятными. Пептид КЕБШ взаимодействовал как с малой, так и с большой бороздками ДНК. Оказалось, что наиболее энергетически выгодным явилось взаимодействие пептида КЕО¥/ с

малой бороздкой ДНК, энергия связи такого комплекса составила -10,3 ккал/моль. В малой бороздке тетрапептид образовывал водородные и ионные связи между аминогруппами Lys и атомами кислорода фосфатных групп и дезоксирибоз С21 и G12. Третьим по значению энергии явился комплекс ДНК-пептид, локализованный в большой бороздке ДНК.

Таблица 4

Результаты докинга пептида KEDW в молекуле ДНК_

Дуплекс ДНК 5'—>3' AG, ккал/моль Бороздка ДНК

А Т А Т G G С А G G G G T A A

1 * * * * -10,3 малая

2 * * * * -9,0 малая

3 * * * -8,5 большая

4 * * * -8,4 малая

5 * * * -7,5 большая

6 * * * * -7,3 большая

7 * * * * -6,9 малая

8 * * * -6,2 большая

9 * * * -6,1 малая

10 * * * -6 большая

11 * -5,8 малая

12 * * * -5,5 большая

Символами «*» отмечены сайты взаимодействия тетрапептида с ДНК. AG - значение оценочной функции взаимодействия пептида с ДНК.

Пептид образовывал две специфические водородные связи между N7 G5 и амидной группой концевого участка пептида, и между карбонильной группой основной цепи Asp пептида и N4 С25. Образовывались также водородные связи между двумя NH34" группами Lys и фосфатными кислородами G24. Энергия связи такого комплекса составила -8,5 ккал/моль. В большой бороздке ДНК пептид в основном связывался боковыми группами с азотистыми основаниями ДНК, образуя специфические контакты. Так, аминогруппа боковой цепи Тгр нековалентно связывалась с атомами Об гуанина и N7 аденина, карбоксильные группы Asp и Glu взаимодействовали с N4 цистеина, N2 гуанина (рис. 3 А, Б, В). В малой бороздке ДНК пептид в основном образовывал водородные и ионные связи с атомами кислорода фосфатных групп и дезоксирибозой соседних нуклеотидов. Однако встречались и специфические контакты, образованные между NH3+ боковой группы лизина и 02 Т4 и N3 А27. Такие контакты встречались реже, чем при взаимодействии пептида с большой бороздкой ДНК (табл. 4). Таким образом, 9 сайтов связывания пептида KEDW с ДНК включены в последовательность GGCAG, предполагаемом специфическом сайте связывания для пептида KEDW, и 6 из них находились в большой бороздке ДНК. Был проведен докинг контрольного пептида AEDL, не оказывающего биологического действия на клетки поджелудочной железы, с дуплексом ДНК. Найдено 20 решений докинга, из которых 18 локализованы в малой бороздке, а 2 - в большой.

В таблице 5 представлены первые 12 решений докинга. Максимальная энергия взаимодействия пептида с ДНК составила -9,2 ккал/моль. Пептид АЕБЬ связывался с другим участком ДНК - ТАТ, который не совпадал с сайтом связывания для (табл. 5).

Таблица 5

Дуплекс ДНК 5'->3' АО, ккал/моль Бороздка ДНК

А Т А Т О о с А О в в в т А А

1 * * * -9,2 малая

2 * * * -9,1 малая

3 * * * -8,6 малая

4 * * * -7,91 малая

5 * * * -7,77 малая

6 * * -7,7 малая

7 * * -6,9 малая

8 * * * -6,72 малая

9 * * * 6,6 малая

10 * * -6,5 малая

11 * * -5,6 малая

12 * * -5,38 малая

Рис. 3. Пептид КЕВ\¥ в большой бороздке дуплекса ДНК, образованной последовательностью СвСАС. А: комплекс с АО= -8,5 ккал/моль; Б: комплекс с Ав= -7,3 ккал/моль; В: комплекс с АО= -5,5 ккал/моль. С - цито-зин; в - гуанин; А - аденин; Т - тимин. Пунктиром изображены водородные связи.

Символами «*» отмечены сайты взаимодействия пептида с ДНК. Ав -значение оценочной функции взаимодействия пептида с ДНК.

Моделирование молекулярных взаимодействий пептидов с коровыми

гистонами

В таблице 6 представлены результаты докинга пептидов с коровыми гистонами. Как и в случае с ДНК, пептид КЖ>\¥ выступал в качестве донора протонов. Он образовывал сеть водородных связей между аминогруппами

лизина и карбоксильными группами аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты гистонов. Пептид образовывал также л-катионные связи с атомами углеродов боковых групп серина, лейцина и аспарагина.

Таблица 6

Результаты докинга пептидов с коровыми гистонами

КЕЭ\¥ АЕБЬ

Гистон Дй Домен Контакты Дв Домен Контакты

Н2А ЗАУ1С -6,6 Центральный домен Ьу5(МН3+)—»АБР77(СОО"); ЬузОГНз*)—01и„(С00'); Тгр(0)-А5р,7(СН2) -6,5 Центральный домен Ьеи(СОО")<-Аг^(>Ш2); Ьеи(СОО")*—Аг87(МН2); А8Р(СО)^АГ87(МН); аи(СОО>-Аг8„(1МН2)

Н2А ЗАУЮ -7,1 Петля 2 ТгрР)-Ьеи52(СНз); Ьу5(КНз+)->01и48(СОО'); Ьу5(ЫНз+)—»Азр77(СОО'); ЬуБ(ЫНз+)—»01и79(С00"); Азр(СОО)<-С1и78СМН) -6,5 С-конец Ьеи(СОО')«—Аг8]6(>Щ2); Ьеи(СОО-)^Агё16(ЫН2); Ьеи(СОО-)^Агв„(Ш,); А5р(СОО")<-ету1 ,(N11); ОкССООЭ-^АгаСЫНг); 01и(С00)-^Аг84(КН2)

Н2В ЗАУШ -7,2 Ы-конец Тгр(1ЧН)—»С1и4(СОО~); Ьу5рга3+)-.С1и4(СОО); Ьу5(МНз''')->01и4(СОО'); Тгр(0)-5ег,(СН) -5,8 С-конец Ьеи(СОО')<-ТЬгб5(ОН);

Н2В ЗАУ1Н -7,4 Левый домен - -7,9 Левый домен 01и(МН)->5ег«,(С0); С1и(СОО~)«—Уа180(СН)

Н3.2 ЗАУ1А -8,8 Левый домен Ьуз(Шз+)^С1и9!(СОО); Тгр(>Ш)->01им(С00); Тгр(СО№Г) (оч _ ,оп Аг§64(ЫН3+) -8,3 Центральный домен А1а(КН2)<-А5п109(МН2);

Н3.2 ЗАУ1Е -8,4 Центральный домен аи(СОО>-Азпл)(КН2) -7,4 Центральный домен А5р(СО)<-А5р70(ЫН2)

Н4 ЗАУ1В -7,7 Центральный домен Тгр(СООТГ)<-Аг8,з(МН2); С1и(СОО') ,„„ _ ,„„ Аг893(КН3+); Ьу5(ЫНз+)->С1и7!(СОО-); ЬуБ(ЫН3+) ,оп _ ,„„ 01и75(С00); Ьу5(Ш3^Аг&8(СО) -6,9 Петля 1 А1а(СО) .-Аг8з6(МН2); А8р(СОО-)*-Аге4„(Ш2); АэрССОО" ),„,,-, „АгЕзб№*); Ьеи(СОО' )»-Ьу5з2(КНз+); Ьеи(СОО')«—Ьу$з2(МНз+)

Н4 ЗАУ1Р -8 Петля 1 01и(С00')-^Ьуз,з^Нз*); аи(СО)«—ЬуБ1з(ЫНз+); Азр(СОО~)«—5ег29(>Ш); Азр(СОО")<—С1узо(НН); Тгр(С0ЫН")»-Аг827(Шз4); А5р(СОО'),-„„„„„ Аг827(МНз+); Тгр(СОМН-) ,„„ _ ,„„ Агг2,СШ3*) -7,9 Петля 1 Ьеи(СОО')«—11е28(ЫН); Ьеи(СОО')«—Аг82](МН2); С1и(СОО-)^Агг21(Ш2); А1а(ЫН2)*-Агб17(ЫН); А$р(СОО-)<-Аг82;(КН2); Азр(СО) ^АгЫЫН); АэрССОО")«—С1уз0(МН)

Стрелками показано направление передачи протона; Первой указана аминокислота пептида, а второй - аминокислота гистона; ДО - значение оценочной функции взаимодействия, ккал/моль. - ионные связи; Тгр(0)-л-катионные взаимодействия между индольным кольцом триптофана и положительно заряженным атомом гистона.

Наиболее энергетически выгодный комплекс пептид образовывал с ги-стоном Н3.2 (ЗАУ1А), связываясь с левым доменом. Однако ключевую роль в эпигенетических механизмах играют >1-, и С-концевые участки гистонов, модификация которых может привести к активации экспрессии генов. Такой комплекс пептид образовывал с гистоном Н2В (ЗАУШ), взаимодействуя с № концевым участком. Пептид АЕБЬ выступал в качестве акцептора протонов и образовывал сеть из водородных связей между карбоксильными группами лейцина, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты с аминогруппа-

ми аргининов гистонов (табл. 6). Эпигенетический механизм регуляции пептид АЕОЬ может выполнять через связывание с С-концевыми участками гистонов Н2А (ЗАУШ) и Н2В (ЗАУШ), с которыми он образовывал наиболее энергетически выгодные комплексы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При старении культуры клеток поджелудочной железы наблюдалось значительное снижение экспрессии сигнальных молекул, важных для поддержания функциональной активности панкреатических клеток. Так, при старении культуры экспрессия факторов дифференцировки РШа и Рс1х1, регулирующих развитие клеток-предшественников всех ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы снижалась на 80% и 63%, соответственно. Такие изменения могут вызывать нарушения экзокринной и эндокринной функций поджелудочной железы, что является причиной развития хронического панкреатита и сахарного диабета. Введение пептида КЕБХУ увеличивало экспрессию белков РШа и Рс1х1 в клетках поджелудочной железы, восстанавливая их до уровня в «молодых» культурах. В созревании а-, 0-, 8- и РР-клеток поджелудочной железы участвуют факторы дифференцировки Рахб, Еоха2, N1^x2.2. Их экспрессия при старении снижалась на 50%, 70% и 74% соответственно. При введении пептида КЕБХУ значимый эффект наблюдался для фактора дифференцировки а-клеток Рахб: пептид восстанавливал его экспрессию в клетке до уровня в «молодых» культурах. Пептид также подействовал на экспрессию белка Роха2, однако не восстановил ее до нормы. Экспрессия белка Рах4, секретируемого предшественниками 5-клеток и Р-клеток, при старении культур и при добавлении пептида КЕЭ\¥ практически не изменялась. Следовательно, пептид КЕОХУ способствовал разнонаправленной дифференцировке клеток поджелудочной железы.

Методом количественной полимеразной цепной реакции было выявлено, что пептид КЕБ\У увеличивал экспрессию генов факторов дифференцировки РБХ1, ЖЖ?, РАХ6, РОХА2, ККХ2-2, N10(6.1, РАХ4 в «старых» культурах клеток. Наиболее выраженный эффект наблюдался при исследовании экспрессии генов РПXI, МЖ3, РАХ6. Увеличение экспрессии белков Рс1х1, Рахб, Роха2, №х2.2, Рах4 в «старых» культурах клеток при добавлении пептида КЕО\У корреллировало с увеличением их матричной РНК. Механизм действия пептида КЕО\У, надо полагать, связан с его взаимодействием с ДНК и активацией экспрессии соответствующих генов. Возрастная инволюция поджелудочной железы также характеризовалась снижением экспрессии следующих сигнальных молекул: Мс1-1, РСЫА и К167. Исследуемый пептид обладал способностью усиливать экспрессию этих сигнальных молекул, увеличивая, таким образом, пролиферативный потенциал клеток. Стимуляция экспрессии антиапоптотического маркера Мс1-1 и подавление синтеза проап-оптозного маркера р53 в «старых» культурах клеток поджелудочной железы указывало на повышение функциональной активности эндокринных клеток поджелудочной железы при старении.

На основании данных физических методов исследования (УФ спектроскопии, кругового дихроизма, вискозиметрии) можно заключить, что пептид связывался с ДНК, но этот процесс протекал достаточно медленно (в течение несколько часов) и практически без участия электростатических сил. В результате комплексообразования, которое реализовывалось в бороздке ДНК с участием азотистых оснований и пептида, наблюдалось снижение изгибной жесткости ДНК и дестабилизация вторичной структуры макромолекулы. Результат комплексообразования пептида с ДНК не зависел от ионной силы раствора, а тип спектра соответствовал регистрируемому при связывании различных лигандов (двухвалентных ионов щелочноземельных металлов, протонов, цис-ДДП) с N7 гуанина в большой бороздке ДНК [КаБуапепко N. е1 а1., 1999; Каэ'уапепко Ы.А. е! а1., 2002]. Методами молекулярного моделирования исследована возможность взаимодействия пептидов КЕБ\¥ и АЕБЬ с двойной спиралью ДНК. Результаты докинга, проведенного с учетом электростатики, показали возможные варианты взаимодействия пептидов как в малой, так и в большой бороздке ДНК. Была обнаружена специфичность связывания пептида КЕВ\У с последовательностями ввСЛв и ССАСА. Предполагаемые сайты связывания найдены в промоторных участках генов РВХ1, тт, ШХ1, РАХб, РОХА2, МКХ2-2, N0X6.1, НОХАЗ, РАХ4. Пептид КЕО\У на 1,5-2 ккал/моль образовывал более устойчивые комплексы с ДНК, чем пептид АЕБЬ. Взаимодействие пептида КЕО\¥ с нуклеотидами осуществлялось за счет вандерваальсовых, электростатических взаимодействий и образования водородных связей между функциональными группами молекул. Оказалось, что пептид не интеркалировал между азотистыми оснований ДНК и не разрушал ее вторичную структуру. Пептид взаимодействовал с большой бороздкой ДНК по нескольким положениям: N7 гуанина, N6 адени-на, С5 тимина и N4 цитозина. Помимо водородных связей пептид образовывал л-катионные связи с положительно заряженными атомами ДНК за счет индольного кольца триптофана. Полученные в результате молекулярного моделирования структурные модели и выявленные особенности взаимодействия пептидов с азотистыми основаниями последовательностей нуклеотидов подтвердили раннее выдвинутые предположения о возможности и характере образования комплексов пептидов с нуклеиновыми кислотами [АшБтоу У.К, Юшушбоп У.КЬ., 2010].

Установлено, что короткие пептиды модулируют действие эндонукле-аз [Теёогеуеуа Ь.1„ УапуизЫп В.Р., 2011]. Модуляция пептидами действия эн-донуклеаз может происходить благодаря сайт-специфическому связыванию пептида с ДНК, которое защищает ДНК от ферментативного гидролиза. Модуляция действия эндонуклеаз пептидами в свою очередь модулируется ги-стонами, тем самым, в клетке гистоны хроматина определенно могли влиять на связывание коротких пептидов с ДНК. Методами молекулярного моделирования рассчитаны энергии взаимодействия пептидов КЕО\¥ и АЕБЬ с ко-ровыми гистонами. Оказалось, что пептиды в равной степени образовывали энергетически выгодные комплексы с различными доменами коровых гисто-нов. Однако если предположить, что биологический эффект пептидов связан

с активацией экспрессии генов, то вероятнее всего этот механизм осуществлялся непосредственно через связывание со специфическим сайтом и запуском процесса транскрипции.

Один из наиболее вероятных механизмов активации генов короткими пептидами следующий: пептиды селективно связываются с промоторными сайтами генов, что делает эти сайты недоступными для ферментов ДНК-метилтрансфераз, и в результате промотор останется неметилированным, а это является решающим элементом активации большинства генов. Таким образом, специфические пептид-ДНК взаимодействия могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки [Назаров П.Г., 1998], и возможно этот механизм играет важную роль уже на самых ранних этапах зарождения жизни и эволюции.

ВЫВОДЫ

1. Пептид КЕБ\У обладет способностью стимулировать пролифератив-ные процессы в ткани поджелудочной железы старых крыс на 24 %.

2. При старении клеток поджелудочной железы экспрессия факторов дифференцировки в них снижается. Пептид КЕБ\У стимулирует экспрессию факторов дифференцировки ацинарных (Р(1х1, Р1йа) и островковых (Рс1х1, Рахб, Рах4, Роха2, N1^x2.2) клеток поджелудочной железы в «молодых» и «старых» культурах. Наиболее выраженный эффект наблюдается в «старых» культурах, в которых пептид увеличивает площадь экспрессии Рс1х1 в 2,6 раза, Р1йа в 6 раза, Рахб в 2,3 раза, Рах4 в 1,5 раза, Роха2 в 1,6 раза, Ыкх2.2 в 2 раза.

3. Добавление пептида КЕО'\У в культуру клеток поджелудочной железы увеличивает экспрессию антиапоптозного белка Мс1-1 в 1,3 раза, факторов пролиферации РСИА и И 67 в 1,5 и 2 раза соответственно, и снижает экспрессию проапоптозного белка р53 в 1,5 раза в «старых» культурах клеток поджелудочной железы, что свидетельствует о его влиянии на процесс стимуляции клеточного обновления.

4. Добавление пептида в «старые» культуры клеток поджелудочной железы увеличивает экспрессию генов факторов дифференцировки РИХ1 в 1,6 раза, в 2,7 раза, РАХ6 в 1,8 раза, РОХА2 в 1,3 раза, ИКХ2-2 в 1,6 раза, ЫКХ6.1 в 1,5 раза, РАХ4 в 1,3 раза до уровня экспрессии в «молодых» культурах и снижает экспрессию генов МЫХ1 и НОХАЗ соответственно в 1,5 и 2,4.

5. Анализ спектральных характеристик выявил, что пептид КЕЭ\У образовывает комплекс с молекулой ДНК, который не зависит от ионной силы раствора, а тип спектра соответствует регистрируемому спектру при связывании различных лигандов с атомом азота в 7 положении (N7) гуанина в большой бороздке ДНК.

6. Предполагаемыми сайтами связывания для пептида КЕВ\¥ являются последовательности СОСАв и ССАСА, найденные в промоторных участках генов РОХ1, ЫвЮ, ШХ1, РАХ6, РОХА2, ИКХ2-2, ИКХ6.1, НОХАЗ, РАХ4.

7. Результаты конформационного анализа пептида KEDW свидетельствуют о наличии внутримолекулярных я-катионных связей между индоль-ным кольцом триптофана и аминогруппами лизина, что придает молекуле устойчивую конформацию в виде сферы. Контрольный пептид AEDL не имеет устойчивой конформации, а боковые группы молекулы обладают высокой подвижностью (количество конформеров ~ 200).

8. Построены компьютерные модели межмолекулярного, атом-атомного взаимодействия пептида KEDW и контрольного пептида AEDL с ДНК и ги-стонами Н2А, Н2В, Н3.2, Н4. Образование комплексов пептида KEDW с ДНК и гистонами является более энергетически выгодным, чем образование комплексов пептида AEDL с этими молекулами. Пептид KEDW выступает в качестве донора протонов, а контрольный пептид AEDL является акцептором, что указывает на различный механизм связывания пептидов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Индукционное действие пептида KEDW на дифференцировку и функциональную активность различных типов эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы позволяет рассматривать пептид KEDW как перспективное средство для коррекции функциональной активности клеток поджелудочной железы при старении. А это имеет важное значение для разработки методов терапии сахарного диабета и панкреатита, особенно у лиц пожилого возраста.

2. Предложенные компьютерные модели целесообразно использовать для установления механизмов биологической активности коротких пептидов, количественной оценки их предполагаемой активности и направленного поиска новых геропротекторов с заданными фармакологическими свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ

1. Влияние панкрагена на дифференцировку клеток поджелудочной железы при их старении / В.Х. Хавинсон, А.О. Дурнова, В.О. Полякова, Г.Х. То-либова, Н.С. Линькова, И.М. Кветной, Т.В. Кветная, С.И. Тарновская // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 154 №10.-С. 498-501.

2. Механизм биологической активности коротких пептидов: проникновение в клетку и эпигенетическая регуляция экспрессии генов / В.Х. Хавинсон, А.Ю. Соловьёв, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, Л.К. Шатаева // Успехи современной биологии. - 2013. - Т. 133, № 2. - С. 197-203.

3. Пептиды тканеспецифически стимулируют дифференцировку клеток при их старении / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, В.О. Полякова, О.В. Хей-фец, С.И. Тарновская, И.М. Кветной // Клеточные технологии. - 2012. №1. - С. 34-37.

4. Тарновская, С.И. Исследование взаимодействия тетрапептидов с ДНК методами молекулярной механики / С.И. Тарновская, П.П. Якуцени, В.Х.

Хавинсон // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. -Т. 156, № 11.-С. 637-641.

5. Тетрапептид стимулирует функциональную активность клеток поджелудочной железы при старении / В.Х. Хавинсон, H.H. Севостьянова, А.О. Дурнова, Н.С. Линькова, С.И. Тарновская, A.B. Дудков, Т.В. Кветная // Успехи геронтологии. - 2012. - Т. 25. N. 4. - С. 680-684.

Тезисы докладов

6. Исследование взаимодействия олигопептидов с молекулой ДНК в растворе / Е.А. Морозова, H.A. Касьяненко, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова // «Студенты и молодые ученые - инновационной России: материалы работ молодежной научной конференции». - СПб. - 2013. - С. 151-152.

7. Молекулярные механизмы антидиабетического эффекта тетрапептида / И.М. Кветной, В.О. Полякова, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // Геронтологические чтения. - СПб. - 2012. - С. 10.

8. Панкраген стимулирует экспрессию фактора дифференцировки ЬохаЗ в культуре клеток поджелудочной железы при старении / В.О. Полякова, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон // Пуш-ковские чтения. - СПб. - 2011. - С. 94-95.

9. Пептидергическая регуляция синтеза серотонина в клетках поджелудочной железы при старении / В.Х. Хавинсон, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, М.Б. Тендлер, В.В. Бенберин // III Съезде геронтологов и гериатров России. - Новосибирск. - 2012. - С. 420.

Ю.Пептидергическая регуляция функций клеток поджелудочной железы / A.B. Дудков, С.И. Тарновская, В.В. Бенберин // II Российский конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное». - СПб. - 2012. - С. 165-166.

11.Роль диффузной нейроиммуноэндокринной системы в механизмах старения / Н.С. Линькова, A.B. Дудков, В.Е. Проняева, С.И. Тарновская // Старшее поколение. - СПб. - 2012. - С. 56.

\1.Тарновская, С.И. Молекулярно-клеточные механизмы пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении / С.И. Тарновская // Актуальные вопросы геронтологии и гериатрии. - Киев. - 2013. - С. 58.

13.Тарновская, С.И. Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при возрастной патологии / С.И. Тарновская, В.В. Бенберин // «Фундаментальные аспекты старения. Хрупкость: модели, маркеры, фенотипы. Результаты проекта "Хрусталь"». - СПб. - 2013. - С. 19

14. Тарновская, С.И. Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp Стимулирует Экспрессию Схс112 В Поджелудочной Железе / С.И. Тарновская // IV Ежегодная научная конференция «ФЦСКЭ имени В. А. Алмазова». - СПб. - 2012. - С. 15.

15.Тарновская, С.И. Тетрапептид стимулирует дифференцировку ß-клеток поджелудочной железы при старении / С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, A.B. Дудков, В.Х. Хавинсон // Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика. - Киев. - 2012. - С. 42.

\6.Тарновская, С.И. Тетрапептид стимулирует процессы клеточного обновления в поджелудочной железе при старении / С.И. Тарновская // III Съезд геронтологов и гериатров России. - Новосибирск. - 2012. - С. 382.

17.Тарновская, С.И. Тетрапептид стимулирует экспрессию матриксных ме-таллопротеиназ в культуре клеток поджелудочной железы человека / С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, М.Б. Тендлер // Человек и лекарство. -Москва. - 2012. - С. 428.

18.Тарновская, С.И. Тетрапептиды стимулируют экспрессию дифференци-ровки а-клеток поджелудочной железы при старении / С.И. Тарновская // Геронтологические чтения. - Белгород. - 2012. - С. 18.

19.Тетрапептид восстанавливает экспрессию фактора Ptfla в ацинарных клетках при их старении / В.В. Бенберин, С.И. Тарновская, А.В. Костылев // III Съезд геронтологов и гериатров России. - Новосибирск. - 2012. -С.32.

20.Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp регулирует экспрессию генов транскрипционных факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы / В.Х. Хавинсон, В.В. Ашапкин, Н.С. Линькова, С.И. Тарновская, Б.Ф. Ванюшин // Белки и пептиды. - Уфа. - 2013. - С. 110.

21.Induction of cell differentiation as geroprotective mechanism of peptides in neuro-immune-endocrine organs / V. Khavinson, N. Linkova, S. Tarnovskaya, V. Pronyaeva, S. Trofimova // The 20th IAGG world congress of gerontology and geriatrics. - Seoul. - 2013. - P. S348.

22.Molecular mechanism of tetrapeptide geroprotection and its genomic regulation / V.Kh. Khavinson, S.I. Tarnovskaya, V.E. Pronyaeva, N.S. Linkova, A.V. Dudkov // 2nd International Genetics of Aging and Longevity conference. -Moscow. - 2012. - P. 34

23.Tarnovskaya, S. Mechanisms of the peptidergic regulation of cell differentiation in the pancreas: molecular modeling in silico / S. Tarnovskaya, G. Ryshak, P. Yakutseni P. // Quantitative imaging and spectroscopy in neuroscience. - St. Petersburg. - 2012. - P. 41-42.

24.The role of peptide signal molecules in the functioning of the neuro-immune-endocrine system in ageing / V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, S.I. Tarnovskaya, V.E. Pronyaeva, R.S. Umnov, Т.Е. Nichik, N.A. Chervjakova // 8th European Congress of Biogerontology. - Beer-Sheva. - 2013. - P. 17.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

KEDW Пептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 (панкраген)

AEDL Пептид Ala-Glu-Asp-Leu-OH (бронхоген)

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ГПП-1 Глюкагонподобный пептид-1

ИП Индекс площади

КД Круговой дихроизм

лп Лекарственный препарат

мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

п.н. Пара нуклеотидов

сд Сахарный диабет

Pdxl Pancreatic and duodenal homeobox-1

Nkxö.l Nk6 transcription factor homolog A

Ngn3 Neurogenin 3

MafA Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family

NeuroDl Neurogenic differentiation 1

Ptfla Pancreas specific transcription factor la

Mcl-1 Myeloid leukemia cell differentiation protein

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PDB Protein Data Bank, база данных белковых структур

Автор выражает глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ профессору И.М. Кветному, профессору В.О. Поляковой (ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН), профессору Н.И. Чалисовой (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН), профессору H.A. Касьяненко (Санкт-Петербургский государственный университет), член-корр. РАН, профессору Б.Ф. Ванюшину (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова) за консультации и помощь в проведении ислледований.

Работа С.И.Тарновской на тему «Молекулярно-клеточные механизмы пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении» заняла I место на конкурсе молодых ученых на соискание премии имени академика В.В. Фролькиса (Киев, Украина, 2013).

УКАЗАТЕЛЬ ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. — М.: Медицина, 1990. — 384 е.; Гланц С. Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1990. — 459 е.; Дедов И.И. Сахарный диабет в Российской Федерации: проблемы и пути решения// Сахарный диабет. - 1998.-№ 1.-С. 7-21.; Дедов И.И., Шестакова М.В. Значимость результатов исследования ADVANCE для контроля сахарного диабета в России // Сахарный диабет. - 2009. - № 2. - С. 4-5.; Минушкин О.Н. Хронический панкреатит // Терапевтический архив. -2001. - № 1. - С. 62-65.; Мойса С.С., Ноздрачвв А.Д. Нарушения углеводного обмена и факторы, способствующие их развитию в процессе онтогенеза // Успехи геронтологии. - 2011. — Т. 21, №. 1. - С. 61-68.; Назаров П.Г. Новые функции цитокинов //Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 19-94.; Шестакова М.В., Вику-лова O.K. Современные возможности фармакотерапии сахарного диабета 2 типа при помощи аналогов глю-кагоноподобного петида-1 (ГПП-1) 11 Сахарный диабет. - 2007. - № 1. - С. 9-15.; Шестакова H.H., Розен-гарт Е.В. Конформационные различия при сорбции холиновых лигандов в активном центре ацетилхо-линэстеразы // Биоорганическая химия. - 1995. - Т. 21, № 5. - С. 323-329.; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. // Biogerontology. - 2010. - № 11. - P. 139-149.; Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - P. 235-242.; Corbeil C.R., Williams C.I., Labute P. Variability in docking success rates due to dataset preparation // J Comput Aided Mol Des. - 2012. - Vol. 26. - P. 775-786.; Fe-doreyeva L.I., Kireev I J., Khavinson V.Kh., Vanyushin B.F. Penetration of short fluorescence-labeled peptides into the nucleus in hela cells and in vitro specific interaction of the peptides with deoxyribooligonucleotides and DNA // Biochemistry. - 2011. - Vol. 76, № 11. - P. 1210-1219.; Fedoreyeva L.I., Vanyushin B.F. CNG site-specific and methyl-sensitive endonuclease WEN1 from wheat seedlings // Biochemistry. - 2011. - Vol. 76, N. 6. - P. 651-657.; Ferguson D.M., Raber D.J. A new approach to probing conformational space with molecular mechanics: random incremental pulse search // J. Am. Chem. Soc. - 1989. - Vol. 111. - P. 4371-4378.; Frisman E.V., Schagina L.V., Vorobiev V.l. A glass rotation viscometer // Biorheology. - 1965. - Vol. 2. - P. 189-194.; Gerber P.R., Müller К. MAB, a generally applicable molecular force field for structure modelling in medicinal chemistry // J. Comput. Aided Mol. Des. Jun. - 1995. - Vol. 9, N. 3. - P. 251-268.; Kas'yanenko N.A., Aia E.E.F., Bogdanov A.A., Kosmotyn-skaya Yu V., Yakovlev K.I. Comparison of DNA complexation with antitumor agent cis-DDP and binuclear bivalent platinum compound containing pyrazine // Mol. Biol. - 2002. - Vol. 36. - P. 745-752.; Kasyanenko N., Prokho-rova S., Haya E., Sudakova S. Interaction of protonated DNA with trans-dichlorodiammineplatinum // Colloids and surfaces A. - 1999. - Vol. 141. - P. 121-128.; Khavinson V.Kh., Gapparov M.M.-G., Sharanova N.E., Vasilyev A.V., Ryzhak G.A. Study of biological activity of KEDW endogenous tetrapeptide // Bull. Exp. Biol. Med. - 2010. - Vol. 149, № 3. _ p. 351-353.; Khavinson V.Kh., Malinin V.V., Grigoriev Е.1., Ryzhak G.A. Tetrapeptide regulating blood glucose level in diabetes mellitus // US Patent N 7,491,703 17.02. 2009a.; Khavinson V.Kh., Ryzhak G.A., Grigoriev E.I., Ryadnova I.Yu. Peptide substance restoring respiratory organs function.// Patent US 7.625.870, 20096; Korkushko O.V., Khavinson V.Kh., Shatilo V.B., Antonyk-Sheglova I.A., Bondaienko E.V. Prospects of using pancragen for correction of metabolic disorders in elderly people // Bull. Exp. Biol. Med. - 2011. - Vol. 151, № 4. _ p. 454-456.; Nairn M., Bhat S., Rankin K.N., Dennis S., Chowdhury S.F., Siddiqi I., Drabik P., Sulea Т., Bayly C.I., Jakalian A., ct al. Solvated interaction energy (SIE) for scoring protein-ligand binding affinities. 1. Exploring the parameter space // J Chem Inf Model. - 2007. - Vol. 47. - P. 122-133.; Tachiwana H., Osakabe A., Shiga Т., Miya Y., Kimura H., Kagawa W., Kurumizaka H. Structures of human nucleosomes containing major histone H3 variants // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. - 2011. - Vol. 67. - P. 578-583.; Wild S„ Roglic G., Green A., Sicree R., King H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030 // Diabetes Care. - 2004. - Vol. 27, N. 5. - P. 1047-1053.

ТАРНОБСКАЯ Светлана Игоревна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ СТАРЕНИИ // Автореф.

дис. канд. биол. наук: 14.01.30; 03.03.04 - СПб., 2014. -26 с._

Подписано в печать 14.04.14 Формат 60*84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,75.

Тираж 100 экз. Заказ 26.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ»

Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ»

197376, С.-Петербург, ул. проф. Попова, 5