Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов

Трофимов, Александр Владиславович

Диссертации по медицине → Геронтология и гериатрия

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Трофимов, Александр Владиславович Санкт-Петербург 2011 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.30

Автореферат диссертации по медицине на тему Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов

ТРОФИМОВ Александр Владиславович

МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДОВ

14.01.30 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 4 АПР 2011

Санкт-Петербург - 2011

4843707

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМП

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Хавинсон Владимир Хацкелевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Малинин Владимир Викторович

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сапронов Николай Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Цыган Василий Николаевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «25» апреля 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3). Автореферат разослан «24» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема старения является одним из приоритетных направлений современной биологии и медицины. В настоящее время в мире в общей численности населения прогрессивно увеличивается доля лиц пожилого и старческого возраста [Сафарова Г.Л., 2009]. Увеличение средней продолжительности жизни, а, следовательно, и прогрессирующее старение населения [Коркушко О.В. и др., 2002] приведет в ближайшем будущем к необходимости решения целого ряда медицинских, социальных и экономических проблем. В связи с этим основная задача гериатрии -профилактика возрастной патологии становится важнейшим медицинским направлением.

Старение является сложным многоуровневым процессом, который проявляется как гипопластическими изменениями клеток и тканей организма, так и снижением их функциональной активности. Процессы старения связаны с многочисленными морфологическими и функциональными изменениями, обусловленными патологическими или компенсаторными реакциями [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Хавинсон В.Х. и др., 2008].

Основным проявлением старения является инволюция трех важнейших регуляторных систем — нервной, иммунной и эндокринной [Пальцев М.А. и др., 2006]. Возраст-ассоциированные изменения этих систем связаны с общими законами старения организма, но имеют свои особенности, обусловленные структурно-функциональной спецификой каждого органа. На клеточном и субклеточном уровнях организации данный процесс проявляется в нарушении синтеза и секреции многих сигнальных молекул и, прежде всего, пептидов. Известно, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [Корнева Е.А. и др., 1988; Шатаева Л.К. и др., 2003; Хавинсон В.Х., 2009].

Многолетние исследования показали, что синтетические пептиды способны восстанавливать различные функции органов и тканей при их возрастной инволюции. Однако методология исследования механизмов действия геропротекторных пептидов до сих пор полностью не определена.

В связи с этим представляется актуальным разработка единой методологии исследования механизмов действия пептидов на нейроиммуноэндокринные, молекулярные и межклеточные взаимодействия при старении организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилась методологии исследования механизмов действия геропротекторов.

разработка пептидных

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать действие пептидов Т-31, Т-34 и Т-38 на синтез белков цито- и кариоскелета в культуре мышиных фибробластов.

2. Оценить влияние пептидов Т-31 и Т-34 на развитие апоптоза в культуре мышиных фибробластов и эпителиоцитов желудка человека.

3. Изучить действие пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 на дифференцировку полипотентной ткани ранней гаструлы Хепорш \aevis.

4. Исследовать влияние пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 на активацию, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток костного мозга и печени эмбриона, малодифференцированных клеток тимуса и периферической крови человека.

5. Изучить влияние пептидов Т-34 и Т-38 на структуру ткани двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки крыс в модели радиационного старения.

6. На основе разработанной методологии исследований оценить геропротекторные механизмы действия пептидов на нейроиммуноэндокринную систему.

Научная новизпа и практическая значимость работы

Впервые проведены широкие многоплановые исследования, позволившие разработать методологию исследования пептидных биорегуляторов и выяснить нейроиммуноэндокринные основы пептидной регуляции процессов старения.

Применение метода флюоресцентной конфокальной микроскопии позволило показать тканеспецифическое участие пептида Т-31 в индукции синтеза белков цито- и кариоскелета в культуре фибробластов мыши. Пептид Т-31, имеющий сродство к хрящевой ткани, активировал экспрессию актина, виментина, тубулина и ламинов А и С. При этом пептиды Т-34 и Т-38, специфичность которых направлена на ткани бронхов и сосудов, не оказывали такого эффекта.

Показано, что пептиды Т-31 и Т-34 в культурах фибробластов мыши и эпителиоцитов желудка человека проявляли антиапоптотический эффект, реализуемый путем повышения сопротивляемости митохондрий к бактериальным повреждениям.

Впервые выдвинуто предположение о том, что мишенями действия геропротекторных пептидов являются внутриклеточные сигнальные молекулы, активность которых реализуется через осуществляемую пептидами реструктуризацию белков цитоскелета и внутриядерные белки, регулирующие соотношение гетеро- и эухроматина в ядре. Кроме того, установлено, что пептиды снижают уровень'апоптоза, усиление которого является одним их ключевых признаков старения.

Методом клеточных культур впервые получены данные о тканеспецифическом действии пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 на дифференцировку полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы лягушки. Установлено, что пептиды АКС-П и АП-0 запускают развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия, тогда как пептиды АК-0 и АЕ-0, синтезированные на основе экстрактов из тканей мозга, не влияют на развитие сомитов. При этом пептид АЕ-0 индуцирует дифференцировку нервной ткани. Выявлено, что в основе способности пептидов стимулировать развитие полипотентных клеток лежит усиление синтеза белка а-актина. Впервые сделан вывод о том, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность стимулировать процессы клеточной дифференцировки.

Методом проточной цитометрии проведено комплексное исследование действия пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток тимуса, костного мозга, печени и периферической крови человека. Установлено, что пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-А и Т-31 при введении в культуру клеток костного мозга и печени эмбриона вызывают экспрессию лимфоидных и миелоидных маркеров на 3-15% клеток. Мишенями действия синтетических пептидов в этом случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие молекулу CD34. Показано, что в зависимости от структуры пептида дифференцировка кроветворных клеток-предшественников

осуществляется различными путями.

Впервые выявлена стимуляция созревания тимоцитов человека при инкубации с пептидами. При этом отмечена смена мембранного фенотипа предшественников Т-клеток в направлении дифференцировки и усиление их пролиферации. Появление новых молекул на поверхности тимоцитов под влиянием пептидов во всех случаях реализуется в результате синтеза белка de novo и отменяется блокаторами синтеза белков. Впервые получены данные о том, что пептид Т-37 активирует эпителиальные клетки тимуса (ТЭК), индуцируя экспрессию на их поверхности молекулы HLA-DR; при этом степень апоптоза ТЭК снижается, а их пролиферативная способность возрастает.

При действии пептидов АТ-0, АВ-А и Т-37 на лимфоциты крови in vitro изменяется экспрессия маркеров основных популяций лимфоцитов: снижается экспрессия маркера В-клеток, усиливается экспрессия маркеров натуральных киллеров (NK-клеток) и Т-лимфоцитов. Под влиянием указанных пептидов впервые зарегистрирована экспрессия второго корецептора CD4 на зрелых регуляторных Т-клетках с фенотипом CD8+.

Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что спектр биологического действия изученных пептидов на клетки иммунной системы является разнонаправленным. Пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-А и Т-31 вызывают дифференцировку стволовых клеток, пептиды АТ-0, АВ-17, Т-31 и Т-37 воздействуют на тимоциты, при этом эффекты пептида Т-37

связаны с эпителиальными клетками тимуса, АТ-О, АВ-А и Т-37 влияют на активность зрелых лимфоцитов периферической крови.

Использование методов проточной цитометрии и клеточных культур позволило выявить активирующий эффект пептидов на различные субпопуляции иммунных клеток. Впервые выдвинуто предположение о том, что пептидные биорегуляторы в первую очередь воздействуют на иммунную систему, инволюция которой при старении выражена наиболее ярко.

В радиационной модели старения изучены геропротекторные эффекты пептидов Т-34 и Т-38 на клетки двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса крыс. Впервые установлено, что пострадиационное восстановление структуры двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса определяется тканеспецифическими свойствами исследованных пептидов.

Показано, что пептид Т-34, имеющий сродство к тканям дыхательной системы, не оказывал положительного воздействия на облученные органы. Однако пептид Т-38, мишенью действия которого является сосудистая ткань, усиливал пролиферацию выживших после радиационного воздействия клеток кишечника, активировал гемопоэз в селезенке и лимфопоэз в тимусе. Действие пептида Т-38 на облученные ткани выражалось в отсутствии отека и нарушений со стороны сосудистого русла.

Применение совокупности использованных в работе методов исследования позволило сформировать системный подход к анализу механизма действия геропротекторных пептидов, а также установить, что исследуемые пептиды воздействуют на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток различных тканей путем стимуляции синтеза регуляторных белков, экспрессия которых снижается при старении.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Применение методов клеточных культур, флюоресцентной конфокальной микроскопии и проточной цитометрии позволило показать, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность регулировать морфо-функциональное состояние на уровне органов, тканей, клеток и внутриклеточных сигнальных молекул.

2. Геропротекторный пептид Т-31 индуцирует синтез белков цито-и кариоскелета в фибробластах мышей, что позволяет предположить его участие в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов путем реструктуризации белков цитоскелета и изменения структуры хроматина через воздействие на синтез ядерных белков.

3. В основе геропротекторного действия пептидов АТ-О, АВ-17, АВ-А, Т-31, АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 лежит стимуляция дифференцировки стволовых клеток костного мозга, печени

эмбрионов человека и полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки. Направление дифференцировки полипотентной ткани и стволовых клеток определяется выбранным пептидом.

4. Основой геропротекторного действия пептидов является их способность активировать иммунную систему, подверженную старению в первую очередь. Пептиды АТ-0, АВ-А, АВ-17, Т-31 и Т-37 оказывают селективное действие на различные популяции иммунных клеток тимуса и периферической крови человека: АТ-0, АВ-17, АВ-А и Т-31 усиливают дифференцировку иммунных клеток тимуса; АТ-0, АВ-17, Т-31, Т-37 влияют на активацию, апоптоз и пролиферацию тимоцитов и эпителиальных клеток тимуса; АТ-0, АВ-А и Т-37 индуцируют активацию, пролиферацию и дифференцировку иммунных клеток периферической крови.

5. Молекулярные механизмы действия геропротекторных пептидов проявляются на тканевом и органном уровне. Пептид Т-38 способствует постлучевому восстановлению тканей двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки' в модели радиационного ускоренного старения на крысах. Стимулирующий эффект пептида Т-38 выражается в восстановлении сосудистого компонента указанных органов, что отражает его тканеспецифичность.

6. Разработанная методология исследования пептидных геропротекторов позволила установить, что в основе их действия лежит регуляция активности сигнальных молекул в органах нейроиммуноэндокринной системы.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Бельгия, 2004); IX Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2004); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург,

2004); IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Украина, 2005); II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,

инвалидов» (Москва, 2007); IV Международном конгрессе «Человек, спорт, здоровье» (Санкт-Петербург, 2009); XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2010); XV Юбилейного Российского национального конгресса «Человек и его здоровье и III российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований изложены в 2 главах в книге «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов; в главе в книге «Избранные лекции по геронтологии», рекомендованной УМО при ММА им. И.М. Сеченова в качестве учебного пособия для системы послевузовского медицинского образования.

Результаты работы используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Белгородского государственного университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них -16 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ, 2 статьи в других изданиях, 2 монографии, 2 главы в руководствах и 23 тезиса докладов.

Связь с научно-исследовательской работой института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 содержит анализ данных литературы по особенностям возрастной инволюции различных органов и тканей, пептидной регуляции гомеостаза при старении и роли снижения синтеза белков и пептидов в развитии патологии, ассоциированной с возрастом. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в диссертационной работе. В главе 3 изложены результаты исследований по влиянию геропротекторных пептидов на экспрессию белков цито- и кариоскелета, а также митохондриальные механизмы апоптоза. Глава 4 посвящена описанию воздействия пептидных биорегуляторов на дифференцировку полипотентной эмбриональной ткани. В главе 5 представлены результаты, отражающие влияние геропротекторных пептидов на иммунные клетки человека. Глава 6 посвящена исследованию эффектов пептидных биорегуляторов на различные ткани в модели радиационного старения.

Текст диссертации изложен на 235 страницах, содержит 4 таблицы, иллюстрирован 72 рисунками. Список литературы содержит 340 источников, из них отечественных - 171, зарубежных -169.

Личный вклад автора

Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в разработке комплексного подхода к изучению механизмов геропротекторного действия пептидных биорегуляторов с использованием метода клеточных культур, конфокальной и флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и морфометрии, и выборе объектов изучения, наиболее полно отражающих геропротекторное действие пептидных биорегуляторов на различных уровнях организации живой материи. Кроме того, диссертантом выполнен анализ всех полученных данных и развитие идеи пептидной регуляции нейроиммуноэндокринных взаимодействий при старении.

Автор предложил новую методологию для всестороннего изучения механизмов действия геропротекторных пептидов, на основе которой как в данной работе, так и в последующих исследованиях, можно получать важные практические и фундаментальные результаты, существенно расширяющие возможности клинической и теоретической геронтологии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Характеристика исследуемого материала Объектом для исследования воздействия пептидов АТ-0; АВ-9; AB-17; АВ-А, АК-0, АЕ-0, АКС-П, АП-0, Т-31; Т-33, Т-34; Т-37 и Т-38 были выбраны тимус, костный мозг, печень и кровь человека; тимус, слизистая оболочка желудка и селезенка крыс, а также клеточные культуры мышиных фибробластов, эпителиоцитов желудка человека и полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы лягушек Xenopus laevis.

Для создания клеточных культур были взяты образцы тимуса, костного мозга и печени эмбрионов человека на 14-26 неделе гестации, а также кровь взрослых людей.

Культуры полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы Xenopus laevis получали путем выделения соответствующей ткани из зародышей. Кроме того, в работе исследовали культуру эпителиальных клеток кишечника человека SGC7901 и культуру мышиных эмбриональных фибробластов (MEF+/+, нокаутная линия мышей LMNA).

Исследования по ускоренному (радиационному) старению тимуса, двенадцатиперстной кишки и селезенки выполнены на самцах крыс линии Вистар в возрасте 2,5 месяцев с массой тела 140-150 г. Животные содержались в условиях вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе питания.

Пептидные геропротекгоры, используемые в работе, были сконструированы в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН. Многолетний опыт исследования различных пептидных биорегуляторов показал, что наиболее перспективными из них в качестве геропротекторов являются:

АТ-0 (H-Lys-Glu-Asp-Gly-OH, пептид семенников),

АК-0 (H-AIa-Glu-Asp-Pro-OH, пептид коры головного мозга),

АЕ-0 (H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH, пептид эпифиза),

АКС-П (H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2, пептид поджелудочной железы),

АП-0 (H-Lys-Glu-Asp-Pro-OH, пептид простаты),

АВ-9 (Na-(y-L- Glu)-L- Lys, пептид тимуса),

AB-17 (H-Lys(H-GIu-OH)-OH, пептид сетчатки),

Т-31 (H-Ala-Glu-Asp-OH, пептид хрящевой ткани),

Т-33 (H-Glu-Asp-Arg-OH, пептид головного мозга),

Т-34 (H-Glu-Asp-Gly-OH, пептид слизистой оболочки бронхов),

Т-38 (H-Lys-Glu-Asp-OH, пептид сосудов).

Моделирование ускоренного старения

Моделью ускоренного старения тимуса, двенадцатиперстной кишки и селезенки служили органы, полученные от крыс линии Вистар, подвергшихся действию ионизирующего излучения на аппарате ЛУЧ в разовой дозе7Гр.

Все животные были разделены на 4 группы: 1 группа - контроль, 2 группа - у-облучение в дозе 7 Гр, 3 группа - у-облучение с последующим введением пептида Т-34 и 4 группа - у-облучение с последующим введением пептида Т-38. Исследуемые пептиды начинали вводить животным 3 и 4 групп внутрибрюшинно через 2 часа после облучения по 0,5 мкг на крысу в течение 5 дней.

Выведение животных из опыта и выделение тимуса, селезенки и проксимального отдела двенадцатиперстной кишки проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) на 7 сутки после облучения в утреннее время.

Методы культивирования клеток

Культивирование всех исследуемых клеток, кроме эктодермы ранней гаструлы лягушки, проводили при температуре 37°С во влажной инкубационной среде RPMI 1640 Flow, содержащей 50 мл/л С02 в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ICN Biomedicals), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma), L-глутамина (300 мкг/мл; Flow), HEPES-буфера (0,02 M; Serva) и гентамицина (100 мкг/мл; Фармахим). Клетки размещали по 106 клеток на лунку в планшете из 24 лунок (Costar). Для повышения статистической достоверности данных каждую пробу ставили 2 раза. Клетки пассировали в культуральной среде в течение 5 суток, после чего забирали для исследования.

Иммунные клетки костного мозга, печени, крови и тимуса человека культивировали с пептидами АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 в концентрациях - 2, 20 и 200 нг/мл в течение 1 часа при температуре 37°С.

Эпителиоциты кишечника человека и мышиные эмбриональные фибробласты после пассирования делили на 5 группы для создания контрольного и экспериментальных образцов.

Образцы 1 (контрольной) группы оставляли интактными. В образцы культур эпителиоцитов кишечника 2 группы вводили пептид Т-34, а в культуры фибробластов, разделенные на 3 части, один из пептидов - Т-31, либо Т-34, либо Т-38 в дозе 10 мМ. В 3 группы добавляли Helicobacter pylori для деструкции митохондрий. В образцы культур 4 группы, также разделенные на 3 части, по той же схеме вводили сначала один из пептидов - Т-31, либо Т-34, либо Т-38, а затем Helicobacter pylori. В образцы культур 5 группы, разделенные на 2 части, вводили антибиотик клацид, применяемый при лечении желудка, или пептид Т-34 с целью сравнения эффективности действия пептида и фармакологического препарата.

Создание культуры полипотентной ткани из эктодермы ранней гаструлы Xenopus laevis осуществляли по следующей схеме. Участки из крыши полости дробления ранних гаструл Xenopus laevis помещали в раствор с пептидами АП-0, АК-0, АКС-П и АЕ-0 в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100 и 200 нг/мл на 60 мин. Далее культуральный материал переносили в стерильный раствор Ниу-Твитти, содержащий антибиотики, и культивировали в течение 4-5 суток. В качестве контроля вместо инкубации с пептидами использовали раствор Ниу-Твитти. Для каждой концентрации пептидов было изучено 30 культур, 20 культур служили в качестве контроля.

Цитофлуориметрический метод

Экспрессию молекул на поверхности иммунных клеток под действием пептидов и без их влияния оценивали методом проточной цитофлуориметрии с применением моноклональных антител.

В работе использовали моноклональные антитела к CD3, CD8, CD19, CD25, CD69 и HLA-DR, меченные флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и моноклональные антитела к CD3, CD4, CD14, CD56, меченные фикоэритрином (Сорбен-Сервис, Москва; Becton Dickinson, USA). Для определения экспрессии антигенов клетки инкубировали с мечеными моноклональными антителами в течение 30 мин при температуре 37°С.

Исследуемые маркеры были выбраны в соответствии со специфичностью их экспрессии на мембранах различных популяций иммунных клеток.

Контролем служили пробы клеток, не обработанных антителами (контроль антител), а также пробы, обработанные антителами, но не содержащие пептидов (контроль пептидов). Связывание антител, меченных флуорохромом, оценивали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson) с использованием программного обеспечения CellQuest 3.1 Software. Анализировали 10 000 клеток в одном образце в лучах аргонового лазера (15 мВт, 488 нм) при скорости потока 6000 клеток в секунду.

Для удаления CD34+ клеток-предшественников в пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Costar) помещали 1.5 мл моноклональных антител к CD34 (Сорбент-Сервис, Москва), разведенных в 50 раз средой RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки эмбриона теленка. Антитела инкубировали в течение 12 ч при температуре 37°С. После отмывания в чашку помещали 2 мл суспензии иммунных клеток (5x106 клеток в 1 мл) и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С, после чего собирали не прилипшие клетки. Полноту удаления CD34+ клеток контролировали на цитометре с использованием FITC-меченых антител к CD34.

Фракционирование тимоцитов осуществляли с использованием ферромагнитных шариков (CD48, CD8 Positive Isolation Kit, DYNAL).

Для оценки пролиферации лимфоцитов использовали метод, основанный на определении разведения флуоресцентной метки CFSE

при делении клеток. Лимфоциты предварительно метили этим красителем, затем инкубировали с пептидами или без них и подвергали проточной цитометрии.

Апоптоз тимоцитов оценивали по накоплению гиподиплоидных предшественников Т-лимфоцитов. Клетки фиксировали 70% этанолом в течение 1 часа, после отмывания их прокрашивали в течение 15 минут 0,15% раствором пропидия йодида в физиологическом растворе, забуференном фосфатом натрия с рН=7,4 и содержащим 0,1% тритона Х-100 и 0,1% цитрата натрия. Клетки подвергали проточной цитофлуорометрии и оценивали их численность в пике, располагающемся левее пика, соответствующего диплоидным клеткам.

Гистологические методы

Кусочки тимуса, селезенки и двенадцатиперстной кишки крыс объемом 1 см3, а также эксплантаты полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки фиксировали в течение 24 часов кислой жидкостью Буэна.

Тканевые блоки обезвоживали с помощью автоматической станции проводки материала Leica ТР1020 и заключали в Paraplast Plus (Kendall). Парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma). Общую гистологию органов крыс и эксплантатов полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином.

Иммуногистохилшческие методы

Изучение пролиферативной активности тканей тимуса, селезенки и двенадцатиперстной кишки крыс проводили с применением мышиных монокпонапьных антител к маркеру пролиферации клеток PCNA (Dako, 1:50). Для выявления мышиных иммуноглобулинов использовали универсальный биотин-стрептавидин-пероксидазный набор

(MP Biomedicals). Субстратный фермент проявляли диаминобензидином (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, Dako). Иммуногистохимическое выявление антигенов на гистологических срезах было выполнено согласно протоколу для иммунопероксидазных методов исследования.

Для получения цветного фотоиллюстративного материала пероксидазу проявляли аминоэтилкарбазолом (АЕС+ Substrate Chromogen, Dako) с последующей докраской ядер гематоксилином и заключением препаратов в водорастворимую среду (Faramount, Dako).

Методы с применением конфокальной и электронной микроскопии

Электронно-микроскопическое исследование органов крыс проводили на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL).

Иммунофлюоресцентную конфокальную лазерную микроскопию использовали для исследования митохондрий, изолированных из культуры

эпителиоцитов кишечника. Лизис клеток осуществляли в изотоническом буфере, содержащем 200 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ EDTA, 10 мМ HEPES, в течение 30 мин. Для получения обогащенной фракции митохондрий супернатант дополнительно центрифугировался в течение 20 мин при 12000 g.

Фракцию, содержащую изолированные митохондрии, помещали на двуслойные стекла с камерами 4,3 мм2 (Nalge Nunc Inc.). В каждую камеру добавляли 2 мкл моноклональных антител к митохондриальному зеленому флуоресцентному протеину (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) и инкубировали в течение 1 ч.

Конфокальную микроскопию митохондрий с определением оптической плотности и площади экспрессии проводили в инвертированном конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 при х400, хбОО и хЮОО с использованием системы MRC-1024, укомплектованной компьютерной программой обработки конфокальных микроскопических изображений LaserSharp 5.0 (Bio-Rad).

Для иммунофлюоресцентного исследования эпителиоциты кишечника инкубировали в первичных моноклональных мышиных антителах к актину (Mubio Products B.V., 1:50), виментину (Mubio Products В.V., 1:50), тубулину (Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:50), ламину A (Abeam, 1:100) и ламину С (Abeam, 1:100). В качестве вторичных антител использовали кроличий антимышиный Ig, коньюгированный с FITC (Dako, 1:100).

Иммунофлюоресцентное исследование полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы Xenopus laevis проводили с использованием мышиных антител к a-актину (Abeam, 1:100). Вторичные антикроличьи антитела, меченные FITC, использовали в разведении 1:30 (Sigma).

Морфометрия и компьютерный анализ микроскопических изображений

Морфометрическую оценку данных, полученных методом иммуногистохимии, выполняли на световом микроскопе Olympus СХ41 с микрофотосъемкой на цифровую камеру Nikon Coolpix 4500.

Индекс пролиферации по PCNA (ipcna) в двенадцатиперстной кишке крыс рассчитывали в процентах как отношение количественной плотности иммуноокрашенных ядер к количественной плотности ядер клеток, окрашенных гематоксилином. Относительную фракцию пролиферирующих клеток no PCNA определяли как произведение объемной доли зоны пролиферации и ipcna-

Количественную плотность ядер клеток и митозов в лимфоидных органах определяли на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, стандартным способом с использованием морфометрической сетки при х40 для двенадцатиперстной кишки и иммерсионном увеличении 100 в лимфоидных органах. Для характеристики митотической активности клеток использовали митотический индекс (1„„т.). Количественные

исследования пролиферативной активности клеток проводили с использованием маркеров PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и БДУ (бромдезоксиуридин) в системе анализа микроскопических изображений с применением компьютерной программы Analysis 5.0.

Статистическая обработка результатов исследования Характер статистического распределения признаков анализировали с помощью ^-критерия Пирсона. Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента.

Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние пептидов на экспрессию белков цито-и кариоскелета и митохондриальные механизмы апоптоза

Известно, что в основе старения лежит изменение соотношения пролиферативной и апоптотической активности клеток в сторону усиления программированной клеточной гибели. Кроме того, важную роль в подготовке клетки к делению и реализации апоптотического каскада играют белки цито- и кариоскелета.

В связи с этим первая часть исследования была проведена в культуре мышиных фибробластов.

1 (контрольная) группа. Через 1 сут культивирования монослой клеток был целостным и равномерным, фибробласты сохраняли обычную форму и размеры. Плотность монослоя на 1 сут составляла 774 клетки/мм2, на 3 сут - 1519 клеток/мм2, на 5 сут - 2020 клеток/мм2, что соответствовало стационарной фазе роста.

В стационарной фазе роста фибробласты имели четко очерченные ядерную и клеточную оболочки. Цитоплазма клеток была гомогенной и характеризовалась стандартным уровнем экспрессии белков цито-и кариоскелета. Большинство клеток имели 1 центрально расположенное ядро правильной округлой формы с 1 или 2 ядрышками.

В контроле митохондрии фибробластов имели нормальную округлую или овальную форму с отчетливой флуоресценцией крист и матрикса.

2 группа (введение Т-31, или Т-34, или Т-38). Среди исследуемых пептидов только Т-31 стимулировал экспрессию белков цито-и кариоскелета в культивируемых фибробластах. Экспрессия актина по показателю оптической плотности при действии пептида Т-31 возрастала с 1,5 до 5,0 у.е. Оптическая плотность экспрессии виментина

фибробластами под действием пептида Т-31 возрастала с 1,8 до 4,3 у.е., тогда как пептид Т-34 оказывал обратный эффект - под его влиянием этот показатель снижался по отношению к контролю. Пептид Т-31 также увеличивал оптическую плотность экспрессии белка микротрубочек тубулина с 1,1 до 4,3 у.е.

Под влиянием пептида Т-31 оптическая плотность экспрессии ламина А в культуре фибробластов возрастала с 1,4 до 3,6 у.е., тогда как после добавления в культуру пептида Т-34 этот показатель снижался до 1,1 у.е. Оптическая плотность ламина С в фибробластах при действии пептида Т-31 увеличивалась с 1,3 до 3,3 у.е.

3 группа (введение Helicobacter pyloriJ. Под воздействием Helicobacter pylori наблюдалась деструкция митохондрий, происходило нарушение целостности их мембраны и крист, снижалась интенсивность флуоресценции белка mito-GFP. Уменьшение оптической плотности экспрессии mito-GFP с 2 у.е. в контроле до 0,3 у.е. при микробном воздействии подтвердило визуальное снижение флюоресценции данного белка после введения в культуру Helicobacter pylori.

4 группа (введение Т-31 или Т-34 + Helicobacter pylori). Оптическая плотность экспрессии mito-GFP под действием пептидов Т-31 и Т-34 по сравнению с 3 группой возрастала с 0,3 у.е., соответственно, до 1,4 и 3,1 у.е. Вероятно, пептиды Т-31 и Т-34 обладают выраженной антиапоптотической активностью в отношении фибробластов, выражающейся в повышении резистентности митохондрий к повреждающим агентам и их устойчивости к инициации программированной клеточной гибели по митохондриальному пути.

Согласно данным, полученным на культуре мышиных фибробластов, наиболее выраженной антиапоптотической активностью среди исследованных пептидов обладал Т-34. В связи с этим во 2 части эксперимента нами было изучено его влияние на митохондриальные механизмы апоптоза в культуре эпителиоцитов желудка человека.

В контроле митохондрии в эпителиальных клетках желудка имели нормальную округлую или овальную форму с отчетливой флуоресценцией крист и матрикса. По показателю оптической плотности экспрессия белка mito-GFP составила 2,57 у.е. при площади экспрессии 3,42%.

Введение в культуральную среду Helicobacter pylori вызывало фрагментацию митохондрий, при этом снижалась интенсивность флуоресценции mito-GFP, что отражалось в уменьшении оптической плотности до 0,35 у.е., а площади экспрессии до 0,63%.

При действии пептида Т-34 с последующим введением Helicobacter pylori отмечалась сохранность структуры митохондрий. При этом экспрессия mito-GFP достигала контрольных показателей (рис. 1А, Б). Кроме того, выявленная антиапоптотическая активность пептида Т-34 была выше по сравнению с действием антибиотика клацида, применяемого в качестве антибактериального препарата при лечении патологии желудка, ассоциированной с Helicobacter pylori (рис. 1 В, Г).

Кроме того, пептиды обладают свойством тканеспецифичносги в отношении стимуляции синтеза белка. Так, пептид Т-31, имеющий сродство к хрящевой и соединительной ткани, активировал экспрессию белков цитоскелета (актина, виментина и тубулина) и кариоскелета (ламина А и С) фибробластов.

А Б В Г

Рис. 1. Экспрессия белка mito-GPF в эпителиоцитах желудка, конфокальная микроскопия, хбОО: А - контроль, Б - при введении Helicobacter pylori, В - при введении Helicobacter pylori и пептида Т-34, Г - при введении Helicobacter pylori и антибиотика клоцида.

Данный этап исследований позволил установить, что пептидные биорегуляторы стимулируют экспрессию белков цито- и кариоскелета и способствуют повышению сопротивляемости митохондрий к деструкции по действием Helicobacter pylori, тем самым снижая вероятность возникновения апоптоза. Поскольку при старении наблюдается снижение экспрессии белков и усиление апоптотических процессов, можно сделать вывод о том, что в основе геропротекторного действия пептидов на уровне клетки лежит их способность стимулировать экспрессию структурных белков и снижать вероятность развития программированной клеточной гибели.

Влияние пептидов на дифференцировку полипотентной эмбриональной ткани

Полипотентные клетки являются важным компонентом ткани, осуществляющим процессы репарации и замещения вступивших в апоптоз дифференцированных клеток. При возрастной инволюции стимуляция дифференцировки полипотентных клеток может рассматриваться как один из возможных механизмов поддержания функциональной активности тканей при их атрофии у людей пожилого и старческого возраста. Данный этап исследования был посвящен оценке возможного действия пептидных геропротекторов на полипотентные клетки.

Во всех контрольных культурах полнпотентной эмбриональной ткани, в качестве которой была выбрана эктодерма ранней гаструлы лягушки Xenopus laevis, на 5 день инкубации развивался только атипичный эпидермис.

При добавлении в эмбриональную ткань пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100 и 200 нг/мл наблюдалась индукция развития эпидермиса, сомитов, мезенхимы и нервной ткани. Индукция того или иного вида дифференцированной ткани в полнпотентной культуре зависела как от вида изучаемого пептида, так и от его концентрации.

Пептид АКС-П проявлял максимальную индукционную активность в отношении полипотентных клеток в дозе 2 нг/мл. При этом наблюдалось развитие более 35% эктодермалыюй ткани в направлении эпидермиса, мезенхимы и сомитов. Менее выраженный эффект в отношении дифференцировки полипотентной ткани в направлении 3 указанных типов наблюдался в концентрации пептида АКС-П 20 нг/мл (рис. 2А).

Пептид АП-0 в концентрации 20 нг/мл вызывал дифференцировку более 45% полипотентной ткани в эпидермис и около 30% - в мезенхиму и сомиты (рис. 2Б).

Кроме того методом иммунофлюоресцентной конфокальной микроскопии было показано, что под действием пептида АП-0 по сравнению с контролем возрастает интенсивность свечения основного белка цитоскелета - a-актина. Полученный результат может указывать на участие a-актина в процессах ремоделирования цитоскелета при клеточной дифференцировке.

В отличие от пептидов АКС-П и АП-0, пептиды АК-0 и АЕ-0, имеющие сродство к тканям мозга и нейроиммуноэндокринной системы, не вызывали дифференцировку исследуемой полипотентной ткани в направлении сомитов. Пептид АК-0 в концентрации 10 нг/мл индуцировал дифференцировку 80% клеток исследуемой культуры в направлении эпидермиса и мезенхимы. В дозах 2, 20 и 100 нг/мл указанный эффект АК-0 был выражен слабее, а в концентрации 50 и 200 нг/мл исследуемый пептид не влиял на полипотентные клетки (рис. 2В).

Пептид АЕ-0 в дозах 10, 50 и 100 нг/мл стимулировал дифференцировку около 14% полипотентных клеток в отношении эпителиальной и нервной тканей (рис. 2Г).

Полученные данные позволили установить, что в зависимости от вида пептида происходит индукция дифференцировки полипотентной ткани в том или ином направлении. Так, синтетические пептиды АКС-П и АП-0, родственные тканям поджелудочной железы и простаты, запускают развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия. В то же время, пептиды АК-0 и АЕ-0, синтезированные на основе экстрактов из тканей мозга, не влияют на развитие сомитов. При этом пептид АЕ-0 индуцирует дифференцировку нервной ткани.

2 10 20 50 100 200 концентрация АКС-П, нг/мл

2 10 20 50 100 200 концентрация АП-0, нг/мл

■ Эпидермис Ш Сомиты □ Мезенхима |

■ Эпидермис О Сомиты □ Мезенхима

2 10 20 50 100 200 концентрация АК-0, нг/мл

■ Эпидермис □ Мезенхима I

2 10 20 50 100 200 концентрация АКС-П, нг/мп

{□Эпидермис ■ Нервная ткань I

Рис. 2. Спектр тканей, развившихся из эктодермы ранней гаструлы Хепорт 1аеук под действием пептидов в различных концентрациях: А - АКС-П, Б - АП-0, В - АК-0, Г-АЕ-0.

Вероятно, одним из механизмов геропротектоного действия пептидов является их способность стимулировать дифференцировку полипотентной ткани, что приводит к увеличению количества функционально активных клеток, которое при старении снижается практически во всех органах и тканях.

Влияние пептидов на иммунные клетки человека

Многочисленные исследования свидетельствуют, что наиболее подверженной возрастной атрофии является иммунная система, а снижение количества и активности иммунных клеток является причиной повышения числа инфекционных и аутоиммунных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.

В связи с этим третий этап исследования был посвящен оценке действия пептидных геропротекторов на клетки иммунной системы в культурах тканей.

Влияние пептидов на дифферепцировку стволовых клеток

кроветворных органов При инкубации клеток костного мозга эмбриона с пептидами АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл в 5-20% случаев регистрировалось появление на стволовых клетках исследованных дифференцировочных маркеров.

Экспрессия маркера миелоидных клеток СБ 14 в культуре клеток костного мозга регистрировалась при действии пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 в концентрации 2 нг/мл, а также при действии пептидов АВ-17 и АВ-А в дозе 20 нг/мл (табл. 1). Ни один из исследуемых пептидов не влиял на экспрессию в костном мозге маркера В-лимфоцитов СО 19 и МК-клеток СЭ56 (табл. 1).

Индукцию экспрессии СБЗ вызывали пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-А и Т-31 в минимальной концентрации 2 нг/мл. Эффект пептидов АТ-0 и АВ-17 был выражен несколько сильнее, чем пептидов АВ-А и Т31 (табл. 1).

Таблица 1

Способность пептидов индуцировать экспрессию маркеров дифферен-

цировки иммунных клеток костного мозга и печени эмбрионов человека

Пептид CD14# CD56# CD19# CD3# CD4* CD8*

АТ-0 + - - ++ ++ ++

АВ-17 - - - ++ ++ ++

АВ-9 + - - - + +

АВ-А ++ - - + + +

Т-31 + - - + + +

Т-34 + - - - - -

Т-37 + - - - - -

# - в клетках костного мозга, *- в клетках печени, - отсутствие эффекта, неслабо выраженный эффект, + умеренный эффект, ++ сильный эффект

При этом ни один из исследуемых пептидов не вызывал экспрессию маркеров зрелых Т-клеток - CD4 и CD8. Таким образом, под влиянием пептидов в популяции клеток костного мозга удается выявить клетки фенотипов CD3+CD4" и CD3+CD8~, что соответствует раннему этапу созревания Т-лимфоцитов.

В культуре клеток эмбриональной печени исходно содержалось около 20% CD3+ клеток, 0,5% CD4+ клеток и 1% CD8+ клеток (рис. 3).

В отличие от ситуации с костным мозгом, при обработке клеток печени пептидами АТ-0, АВ-17, АВ-9, АВ-А и Т-31 удалось индуцировать экспрессию молекул CD4 и CD8 в 60-80% CD3+ клеток, что можно расценивать как стимуляцию дифференцировки Т-клеток.

Наиболее активны в этом отношении оказались пептиды АТ-0 и АВ-17, несколько менее активны были пептиды АВ-9, АВ-А и Т-31 (табл. 1). Стимулирующий эффект пептидов АТ-0 и АВ-17 на дифференцировку Т-лимфоцитов печени был наиболее выражен при максимальной концентрации пептидов - 200 нг/мл; достоверное усиление экспрессии CD4 зарегистрировано также при действии указанных пептидов в дозе 20 нг/мл.

CD3/CD4

Контроль

05%

CD4 CWpe/CDMtc

■ Утй£ .15 ■ CD3 Ifc-

10 10' 10- 10 10' 79.1% FL1-H 195%

CD3/CD8 Ю%

10%

CD8 CD8-pe/CD3-fflc

CD3 'та.-» in, ■ i ,-__

78.3%

FL1-H

10; 19.7%

Пептид АТ-0 (200 нг/мл)

8.8% 112%

10 10' 10 10 10' 61.6% FL1-H 18.4%

9.5%,

10" 10' 10 10 10' 68.1% FL1-H 17.5

Рис. 3. Экспрессия корецепторов CD4 и CD8 на CD3+ и CD3 на клетках эмбриональной печени по данным цитофлуориметрии.

По осям абсцисс - экспрессия CD3, по осям ординат - экспрессия CD4 (верхние рисунки) и CD8 (нижние рисунки). Свидетельством экспрессии корецепторов CD4 и CD8 служит повышение содержания клеток в верхних квадрантах.

Была проведена сравнительная оценка способности пептидов вызывать индукцию маркеров различных субпопуляций иммунных клеток

на интактных клетках печени эмбрионов и на те же популяции после их освобождения от ранних форм предшественников иммунных клеток, несущих рецептор CD34.

Индукция экспрессии CD3 на клетках печени эмбриона человека под влиянием пептида АВ-17 в дозе 200 нг/мл возрастала в 2 раза. Отмечалась отмена этого эффекта после удаления CD34+ клеток. Под влиянием пептида АВ-17 в дозе 20 нг/мл количество CD4+ клеток печени увеличивалось с 1,8% до 4,4%, причем этот эффект предотвращался удалением CD34+ клеток: 3,2% в контроле и 1,7% при обработке пептидом АВ-17. В этом же опыте наблюдалось усиление экспрессии CD3 под влиянием пептида АВ-17 с 32,7% до 47,:2% и отмена этого феномена после удаления CD34+ клеток.

Число CD8+ клеток в суспензии из печени эмбриона, исходно равное 1,6%, возрастало под влиянием пептида АВ-17 в дозе 20 нг/мл до 7,0%. После удаления CD34+ клеток пептиды практически не индуцировали экспрессию маркера CD8.

Проведенные исследования показали, что из всех изученных пептидов на дифференцировку стволовых клеток и предшественников иммунных клеток наибольший эффект оказывают пептиды АТ-0 и АВ-17 в концентрациях 2 и 20 нг/мл. Пептиды АТ-0 и АВ-17 индуцировали дифференцировку клеток костного мозга эмбриона человека в миелоидные CD14+ клетки и ранние CD3+ предшественники Т-лимфоцитов. При этом указанные пептиды не стимулировали дифференцировку клеток костного мозга в NK-клетки, В-лимфоциты и зрелые Т-лимфоциты. В эмбриональных клетках печени пептиды АТ-0 и АВ-17 индуцировали дифференцировку 60-80% CD3+ клеток в CD4+ клетки (Т-хелперы) и CD8+ клетки (цитотоксические Т-клетки). Поскольку дифференцировка предшественников Т-лимфоцитов под действием исследуемых пептидов отменялась при удалении CD34+ клеток-предшественников, можно предположить, что пептиды АТ-0 и АВ-17 способствуют дифференцировке стволовых клеток через воздействие на CD34+ клетки.

Влияние пептидов на мембранный фенотип лимфоцитов крови

Содержание В-клеток, экспрессирующих CD 19, в крови человека варьировало в пределах 7-10%. Пептиды АТ-0 и Т-37 в 3 концентрациях вызывали снижение количества CD19+ клеток приблизительно в 2 раза -с 8,2% до 4,5%.

Содержание NK-клеток, экспрессирующих CD56, в крови составляло около 3%. Тенденция к повышению содержания CD56+ клеток с 2,5% до 8-9% была выявлена в культурах, обработанных всеми исследуемыми пептидами в концентрации 200 нг/мл, а также более низкими концентрациями пептида Т-37. Максимальный эффект был достигнут при действии пептида АТ-0 в концентрации 200 мкг/мл.

Известно, что соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в крови составляет 2:1, при этом двойные положительные CD4+CD8+ Т-клетки

в крови составляют менее 1%. Под действием пептида Т-37 зарегистрировано увеличение содержания CD4+CD8+ клеток с 0,8% до 28,3% с параллельным снижением числа CD8+ клеток с 30,7% до 7,1% (рис. 4).

Менее выраженная индукция двойных положительных Т-лимфоцитов наблюдалась под действием пептидов АТ-0 и АВ-17.

При действии пептидов на фракции CD4+ и CD8+ клеток эффект зависел от степени их очистки. При неполном освобождении от клеток противоположной субпопуляции наблюдалось четко выраженное усиление экспрессии маркера, свойственного удаленной субпопуляции. Однако появление недостающего корецептора происходило не в форме коэкспрессии, как было описано для нефракицонированных мононуклеаров, а путем формирования альтернативной одинарно положительной субпопуляции.

Рис. 4. Коэкспрессия маркеров CD4 и CD8 на Т-клетках крови: А - в контроле, Б - при действии пептида Т-37 в дозе 20 нг/мл.

Показано, что при обработке фракции CD4"CD8+ клеток пептидом Т-37 в ней появлялось более 10% CD4+ клеток. Наоборот, при обработке фракции CD4+CD8 клеток пептидом Т-37 в ней появилось 18% CD8+ клеток. При полном освобождении от примеси клеток, положительных по второму маркеру (CD4 или CD8), ни появления клеток отсутствующей субпопуляции, ни коэкспрессии молекул CD4 и CD8 не наблюдалось.

Таким образом, под действием пептидов АТ-0 и Т-37 в дозах 20 и 200 нг/мл снижалась экспрессия маркера CD 19 на В-клетках и повышалась экспрессия маркера CD56 на NK-клетках. Кроме того, исследуемые пептиды повышали экспрессию корецептора CD4 на значительной части CD8+ клеток, то есть стимулировали появление двойных положительных CD4+CD8+ клеток. В частично очищенных субпопуляциях CD4+ и CD8+ клеток пептиды АТ-0 и Т-37 индуцировали образование клеток, несущих

альтернативный корецептор. Вероятно, пептиды АТ-0 и Т-37 способны активировать гены 2 корецептора на СЭ4+ и С08+ лимфоцитах.

Влияние пептидов на активацию, пролиферацию и апоптоз лимфоцитов крови

При обработке мононуклеаров и частично очищенных субпопуляций иммунных клеток пептидами АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, 'Г-31, Т-34 и Т-37 усиливалась экспрессия молекул активации С025, С069, С025, НЬА-ОЯ и СБ56.

В контроле содержание СБЗ+ НЬА-БК+ клеток не превышало 0,7%. Пептиды АВ-А (2 нг/мл) и Т-31 (20 и 200 нг/мл) вызывали повышение количества данной субпопуляции клеток до 5-7%. В контроле содержание СОЗХЮ19+ клеток составило около 0,5%. Пептид Т-37 (20 и 200 нг/мл) повышал содержание этих клеток до 6-12%. Таким образом, мононуклеары, относящиеся к различным популяциям, проявляют признаки поздней активации под влиянием пептидов АВ-А, Т-31 и Т-37.

Инкубация иммунных клеток крови с исследуемыми пептидами оказывала менее выраженное действие на экспрессию раннего маркера активации СБ69 по сравнению с НЬА-ВК. Тенденция к повышению количества СБЗ+СВ69+ клеток наблюдалось при действии пептидов АТ-0 (200 нг/мл), АВ-17 и АВ-9 (20 и 200 нг/мл) и АВ-А (2 нг/мл).

Фенотипы Т-клеток С04"С025+ и С08+СБ25+ могут рассматриваться как еще один показатель активации лимфоцитов, поскольку в норме в крови эти клетки практически отсутствуют. Инкубация крови с пептидами АВ-А (200 нг/мл), Т-31 и Т-37 (2, 20 и 200 нг/мл) увеличивала число С04"СБ25+ и С08+СБ25+ клеток до 20-30%. При этом ни один из указанных пептидов не вызывал экспрессию молекулы СБ25 на С04+ клетках, то есть не индуцировал дифференцировку лимфоцитов в направлении Т-хелперов.

Пролиферацию лимфоцитов оценивали по разведению флуоресцентной метки СРйЕ, что позволяет определить часть клеток, прошедших разное число митозов. Пептиды АВ-9, Т-31 и Т-37 во всех исследуемых концентрациях достоверно не влияли на пролиферацию иммунных клеток. Пептиды АТ-0 и АВ-А (200 нг/мл) стимулировали пролиферацию мононуклеаров крови, что выразилось в снижении количества неделящихся клеток с 68% до 25-40% и увеличении числа клеток, прошедших 3 и более делений, с 7% до 40-60%. При этом пептид АТ-0 оказывал более выраженный митогенный эффект по сравнению с пептидом АВ-А (табл. 2).

При совместном действии с индуктором митоза ФГА часть пептидов проявила тенденцию к подавлению пролиферации Т-лимфоцитов, что выражалось в повышении доли неделящихся клеток и снижении числа клеток, прошедших 3 и более митозов.

Таблица 2

Влияние пептидов АТ-0 и АВ-А на пролиферацию нестимулированных мононуклеаров крови человека

Число делений Контроль Пептиды

АТ-0 АВ-А Т-37 АВ-9 Т-31 ФГА

0 делений 68,3% 25,6% 31,4% 41,0% 67,2% 58,5% 32,4%

1-2 деления 28,9% 16,6% 25,7% 39,7% 26,1% 37,3% 37,3%

3-4 деления 6,6% 60,5% 46,2% 21,2% 4,7% 6,5% 27,6%

Влияние пептидов на апоптоз лимфоцитов оценивали по формированию гиподиплоидной фракции на гистограмме мононуклеарных клеток, окрашенных иодидом пропидия. Было установлено, что пептид Т-37 (200 нг/мл) вызывал усиление апоптоза СБ8+ клеток с 20 до 39%.

Проведенные исследования позволили установить, что наиболее выраженное влияние на активацию, пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов и других мононуклеаров крови оказывают АТ-0, Т-37 и АВ-А в концентрациях 20 и 200 нг/мл.

Указанные пептиды в большей степени стимулируют поздние этапы активации иммунных клеток крови, о чем свидетельствует индуцированное ими повышение экспрессии молекулы НЬА-ОИ, тогда как их влияние на ранние этапы активации, оцениваемое по экспрессии СБ69, практически не изменяется. Интересно также отметить, что действие пептидов Т-37 и АВ-А на активность иммунных клеток является видоспецифическим. Так, наибольший активационный эффект исследуемые пептиды оказывали на цитотоксические Т-лимфоциты, о чем свидетельствует индуцируемая ими коэкспрессия молекулы С025.

Кроме того, было показано, что пептиды Т-37 и АВ-А и особенно АТ-0 стимулируют естественную пролиферацию иммунных клеток крови, что выражается в увеличении числа мононуклеаров, прошедших 3 и более митотических делений. Интересно также отметить, что пептид Т-37 обладает разнонаправленным действием и способен индуцировать не только пролиферацию, но и апоптоз иммунных клеток крови.

Влияние пептидов на мембранный фенотип и дифференцировку тимоцитов

Экспрессия мембранных маркеров на поверхности тимоцитов под действием пептидов была изучена в 6 экспериментах: в 3 из них исследовали тимоциты плодов на 14-20 неделе гестации, еще в 3 опытах -тимоциты детей в возрасте до 1,5 лет.

В 4 из 6 экспериментов пептиды АТ-0, АВ-9, АВ-17, Т-31 и Т-37 вызывали снижение содержания незрелых кортикальных СБ4+СБ8+

тимоцитов. Снижение содержания CD4+CD8+ клеток сопровождалось увеличением количества Т-хелперов (рис. 5). Такие изменения являются результатом утраты CD8 и могут служить признаком созревания тимоцитов и их перехода в зрелую субпопуляцию CD4+CD8" клеток.

Однако в 2 опытах при действии пептидов АТ-0, АВ-17 и АВ-9 наблюдалось противоположное явление - повышение содержания CD4+CD8+ тимоцитов за счет падения числа CD4+ клеток. Возможно, указанный эффект связан с коэкспрессией молекулы CD8 на юных CD3" CD4+. В этих же опытах пептиды Т-31 и Т-37 вызывали экспрессию молекулы CD4 на CD8+ клетках и молекулы CD8 на CD4+. Подобная вариабельность реакции клеток, вероятно, обусловлена гетерогенностью биологического материала - разным исходным состоянием тимоцитов, зависящим от возраста плода или иных причин.

Под действием пептида Т-37 наблюдался рост числа CD3hl клеток с 9% до 25-30%, что является показателем функционального созревания тимоцитов, происходящего в процессе успешно пройденного этапа положительной селекции.

Другой эффект влияния пептидов, связанный с CD3+ клетками, состоит в изменении их доли среди CD4+ и CD8+ клеток. В контроле более 50% CD4+ и 70-80% CD8+ клеток экспрессировало CD3. при действии пептида Т-37 доля CD3+ клеток среди CD44" тимоцитов снижалась до 35%, а среди CD8+ тимоцитов повышалась до 92%. Аналогичный эффект в отношении CD8+ клеток оказывал пептид Т-31. Эти изменения можно трактовать как показатель уменьшения числа CD4+ клеток и увеличения CD8+ клеток среди тимоцитах, в которых реализован процесс перестройки и экспрессии генов TCR.

4.3%

90.6%

11 8%

80.3%

CD4 CD4-pe/CD8-fitc

о о,

Хгч Li_ Oj о. и_

CD8 О.

CD о

10" 10' 10- 10 2.8% fl1-h

10* 2.3%

CD4 CD4pe/CD8-fitc g^ajffiftV

CD8

10" 10' 10- 10 10' 4 0% FL1-H 3.3%

Рис. 5. Изменение фенотипа тимоцитов от СБ4+СР8+ к СБ4+СВ8" при их созревании: А - в контроле, Б - при действии пептида Т-37 в дозе 200 нг/мл.

Таким образом, максимальное воздействие на дифференцировку тимоцитов оказывали пептиды Т-31 и Т-37 в концентрациях 20 и 200 нг/мл. Хотя действие могло существенно варьировать от опыта к опыту, доминирующим было снижение численности незрелых CD4+CD8+ клеток, сопровождающееся нарастанием числа зрелых CD4+ и CD8+ клеток. При этом более выраженный эффект исследуемые пептиды оказывали на численность CD4+ клеток по сравнению с CD8+ тимоцитами.

Пептид Т-37 при взаимодействии с клетками-предшественниками эмбриональных тимоцитов CD4"CD8" индуцировал появление до 7% CD4+ и до 14% CD4+CD8+ клеток. Вероятно, CD4+ клетки в данном случае представляли собой незрелую фракцию одинарно положительных тимоцитов. При действии на CD4"CD8" субпопуляцию тимоцитов детей пептид Т-37 индуцировал экспрессию корецептора CD8. Возможно, это связано с возрастными особенностями процессов тимической дифференцировки незрелых одинарно положительных клеток, большая часть которых у плодов составляет CD4+, а у детей CD8+ субпопуляцию. Появление новых молекул на поверхности CD4"CD8" тимоцитов под действием пептидов является результатом синтеза белка de novo, поскольку его ингибитор циклогексимид отменял эффект пептидов.

При инкубации с пептидами незрелых тимоцитов фракции CD4+CD8+ регистрировалась утрата под влиянием пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, Т-31 и Т-37 корецептора CD8 или CD4, или обоих корецепторов. В соответствии с уменьшением числа двойных положительных тимоцитов при действии пептидов с 1 до 19% возрастало число одинарных CD4+ клеток, что служит признаком созревания тимоцитов.

Большинство пептидов ослабляло экспрессию молекулы рецепторного комплекса CD3 на поверхности CD4+CD8+ тимоцитов. Так, пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-9 и Т-31 снижали содержание как CD3+CD4+, так и CD3+CD8+ клеток, способствуя накоплению CD3" вариантов, в то время как пептид Т-37 повышал количество CD3 +С04+клеток. Нарастание CD3" вариантов CD4+CD8+ может свидетельствовать о модуляции поверхности этих клеток с маскировкой молекул CD3.

Действие пептидов на зрелые одинарно положительные тимоциты оценивали с использованием 2 вариантов процедуры выделения этих клеток. Первый вариант состоял в освобождении от клеток, несущих альтернативный корецептор. При втором варианте выделения клетки дополнительно сорбировали на бусах, несущих антитела к данному корецептору, и затем снимали с бус.

Число эффектов пептидов, достаточно разнообразных при их действии на частично очищенные популяции, существенно снижалось в результате второй фазы очистки. Возможно, часть эффектов в первом случае была обусловлена действием пептидов на CD4'CD8' клетки.

При действии пептида Т-37 на частично очищенные CD4'CD8+ клетки наблюдалась индукция молекулы CD4 на 10-20% клеток. Выраженность коэкспрессии CD8 при действии пептидов на CD4+CD8'

клетки в процессе очистки этой фракции клеток эмбрионального тимуса ослаблялась.

Однако в эксперименте на тимоцитах детей было зарегистрировано повышение числа CD4+CD8+ клеток в очищенной фракции CD4+CD8 под влиянием пептида Т-37, что может быть обусловлено дифференцировкой юных CD4+CD3" клеток.

Коэкспрессия молекул CD8 и CD4 на поверхности соответственно CD4+CD8" и CD4"CD8+ клеток полностью отменялась, если обработка пептидами происходила в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида. Таким образом, появление CD4+CD8+ клеток являлось результатом синтеза белка de novo.

При изучении влияния пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, Т-31 и Т-37 на дифференцировку тимоцитов было установлено, что максимально выраженный эффект оказывал пептид Т-37 в концентарциях 20 и 200 нг/мл. Было показано, что пептиды усиливают дифференцировку тимоцитов на всех этапах их развития: от CD4 CD8" предшественников до незрелых двойных положительных клеток. Кроме того, у незрелых тимоцитов под действием пептида Т-37 наблюдалась экспрессия корецептора CD3hl, что является дополнительным свидетельством дифференцировки тимоцитов. При этом у зрелых одинарноположительных тимоцитов пептиды вызывали коэкспрессию второй сигнальной молекулы, что указывает на способность пептидов индуцировать синтез белка. Эксперименты с блокатором синтеза белка циклогексимидом позволили показать, что пептиды не стимулируют процесс синтеза белка, а влияют на его синтез de novo.

Влияние пептидов на пролиферацию и апоптоз тимоцитов

В норме для тимоцитов характерен относительно высокий уровень пролиферативной активности - до 20-25% спонтанно пролиферирующих клеток. Было показано, что инкубация культуры тимоцитов с пептидами не вызывала значительных изменений пролиферации клеток.

При оценке пролиферации по включению пропидия йодида из всех исследуемых пептидов только АВ-17 в концентрации 200 нг/мл вызвал повышение количества клеток, находящихся в клеточном цикле с 24% до 39%. Оценка пролиферации по разведению метки с CFSE оказалась в данном случае менее информативной: все испытанные пептиды несколько повышали исходно низкое число делившихся в течение 1 суток клеток.

Под влиянием индуктора митоза ФГА доля тимоцитов, находящихся в цикле, возрастала до 39%. В присутствии пептидов АВ-17, АВ-9 и Т-37 доля циклирующих тимоцитов возрастала до 45-49%. Максимальный эффект составил 52% и наблюдался при действии на тимоциты пептида АВ-9. Эти данные свидетельствуют о способности пептидов обеспечивать переход тимоцитов на стадию функционально зрелых клеток, способных развить пролиферативный ответ на стимуляцию.

Пептиды АТ-О, АВ-9, АВ-17 и Т-31 практически не оказывали влияния на уровень апоптоза культивируемых тимоцитов. Однако пептид Т-37 примерно двукратно повысил его уровень. ФГА также оказывал на тимоциты проапоптотический эффект. На этом фоне было выявлено защитное действие пептида АВ-9 (рис. 6).

А Б

гч

Р12-Н РЬ2-Н

Рис. 6. Апоптоз тимоцитов: А - в контроле, Б - при действии пептида Т-37 в дозе 200 нг/мл. Мерой апоптоза служило содержание клеток в гиподиплоидном пике, расположенном левее диплоидного.

Усиливающее или ослабляющее действие пептидов на апоптоз тимоцитов может свидетельствовать об усилении или ослаблении процессов селекции тимоцитов. Таким образом, пептиды, усиливающие апоптоз, возможно, могут препятствовать развитию аутоиммунных процессов.

Проведенные эксперименты показали, что испытанные пептиды оказывают нерезко выраженное влияние на баланс пролиферации и апоптоза тимоцитов: единичные пептиды стимулируют спонтанную и ФГА-индуцированную пролиферацию, усиливая апоптоз нестимулированных и ослабляя - стимулированных клеток. При этом пептид АВ-9 усиливает пролиферацию и ослабляет апоптоз ФГА-стимулированных тимоцитов.

Влияние пептидов на эпителиальные клетки тимуса

В данной серии экспериментов исследовалось действие пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, Т-31 и Т-37 в концентрации 200 нг/мл на активацию ТЭК, определяемое по экспрессии молекул НЬА-ВЯ и С069, а также на уровень спонтанного апоптоза клеток.

В контроле уровень активации ТЭК был низким: количество клеток, экспрессирующих поздний маркер активации НЬЛ-БЯ, составило 4,2%, а число ТЭК, экспрессирующих ранний маркер активации СЭ69, было равным 1,2%. При этом количество клеток, имеющих оба маркера активации, составило всего лишь 0,8%.

Среди исследованных пептидов только АТ-0 (200 нг/мл) повышал число НЬА-ОЯ+ ТЭК до 10,4%. При этом ни один пептид не оказывал влияния на уровни экспрессии С069 и коэкспрессии С069 и НЬА-ОЯ.

Число апоптотических ТЭК в контроле составляло 20-25%. Пептиды АВ-17 и Т-37 снижали этот уровень до 10-14%.

Полученные данные позволяют предположить, что изучаемые пептиды оказывают специфическое влияние на процессы активации и пролиферации иммунных клеток, как в тимусе, так и в других лимфоидных органах, тогда как их влияние на другие клетки, например, на ТЭК, выражено более слабо.

На данном этапе исследования установлено, что пептиды АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 оказывают многочисленные эффекты, большей частью стимулирующие, на дифференцировку, активацию, пролиферацию и апоптоз иммунных клеток человека в костном мозге, печени и тимусе эмбрионов, а также в тимусе детей до 1,5 лет. При этом характер воздействия зависит от структуры пептида и ткани, с которой он взаимодействует, а также от его концентрации.

Стимуляция активности и дифференцировки иммунных клеток в различных органах иммунной системы под действием пептидов свидетельствует о повышении ее функциональной активности. Следует подчеркнуть, что пептидные геропротекгоры влияют на активность иммунных и эпителиальных клеток тимуса, возрастная инволюция которого наиболее выражена по сравнению с другими органами иммунной системы. Таким образом, восстановление функций центрального и перифирического отделов иммунной системы под действием пептидных биорегуляторов является важным компонентом в лечении и профилактике инфекционных и иммунопатологических состояний у людей пожилого и старческого возраста.

Влияние пептидов на морфо-функционалыюе состояние различных органов в модели ускоренного старения

Применение различной методологии на предыдущих этапах исследования позволило установить, что механизм действия геропротекторных пептидов заключается в регуляции экспрессии различных внутриклеточных белков. Целью завершающего этапа работы явилось выявление геропротекторного эффекта пептидных биорегуляторов на тканевом уровне.

Исследование индуцированного облучением (ускоренного) старения двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса проводили на крысах линии Вистар. Все животные были разделены на 4 группы - контрольную (интактную), подвергшуюся воздействию у-излучения, облученную и получавшую контрольный пептид Т-34, подвергшуюся воздействию у-излучения и получавшую исследуемый пептид Т-38.

В 1 (контрольной) группе внутренние органы животных соответствовали норме. Весовой диапазон для селезенки составил 570-870 мг, для тимуса - 400-550 мг.

Двенадцатиперстная кишка. В строме ворсинок верифицировано много функционально активных клеток - лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов. Эпителий слизистой оболочки кишечника находился в состоянии постоянного обновления, основу которого составляла пролиферация стволовых и дифференцирующихся клеток генеративной зоны. Основная масса РСЫА+ пролиферирующих клеток располагалась в криптах. Линейные размеры зоны пролиферации составили 190±3 мкм. 1рсыд, относительная фракция пролиферирующих клеток с PCNА-позитивной реакцией и 1мит составили соответственно 63,3±1,2%, 17,Ш,5% и 2,54±0,04%.

Селезенка. Соединительнотканная капсула органа была относительно тонкой и содержала многочисленные коллагеновые волокна. В центрах размножения фолликулов белой пульпы выявлялись делящиеся клетки и отдельные лимфоциты, вступившие в апоптоз.

Наиболее высокая интенсивность иммуноокрашивания РСЫА+ ядер определялась в субкапсулярной зоне селезенки и очагах экстрамедуллярного кроветворения. Интегральная количественная плотность клеток в субкапсулярной зоне составила 9439±165, их 1МНГ составил 1,42±0,17%. БДУ+ клетки определялись в центрах размножения фолликулов и островках гемопоэза.

Тимус. В дольках отчетливо различалось темное корковое вещество и более светлое мозговое вещество. Насыщенность корковой зоны по ядрам составляла 32600±251 клеток на мм2 площади среза. Основная популяция пролиферирующих клеток в тимусе располагалась в слое коркового вещества. 1рскл и 1М1ГГ составили соответственно 23,6 ± 1,4% и 2,16 ±0,11%.

Во 2 группе (облучение) масса тела животных снижалась на 3,75% относительно контроля. Внутренние органы были умеренно анемичны. Масса селезенки и тимуса снижалась и составила, соответственно, 220-400 и 90-140 мг.

Двенадцатиперстная кишка. На 7 сутки после облучения рельеф слизистой оболочки практически полностью восстанавливался и мало отличался от контроля. Однако высота и плотность расположения ворсинок были несколько снижены. В криптальном эпителии были видны дегенеративно измененные ядра клеток. Отчетливо был выражен отек подслизистой и слизистой оболочек.

Линейные размеры зоны пролиферации достоверно увенличивались по отношению к контролю и составили 211±3 мкм. Клеточность в криптах возрастала на 10% относительно контроля и составила 8181±138, а относительная фракция пролиферирующих клеток по РСОД увеличивалась по сравнению с 1 группой на 35% (рис. 6Б). Количество БДУ+ ядер, характеризующих пролиферативную активность клеток,

достоверно не изменялась (рис. 6А). и 1мит. составили соответственно 66,7+1,5%, и 2,79+0,06%, что достоверно не отличалось от контроля.

Селезенка. После облучения отмечалось сокращение белой пульпы и атрофия периартериальных муфт. На месте лимфоидных фолликулов были видны центральные артерии, вокруг которых верифицировались распадающиеся лимфоциты, плазматические и ретикулярные клетки. Периферические синусы в селезенке переполнялись кровью, а строма в субкапсулярной зоне была практически оголена. Наблюдались лишь единичные гемопоэтические островки в виде небольших микроколоний. Клеточность в субкапсулярной зоне селезенки снижалась более чем в 2 раза, а в микроколониях гемопоэза - на 14% по сравнению с контрольной группой.

На фоне резкого уменьшения клеточности 1мит. возрастал почти в 2 раза относительно контроля и составил 3,57±0,33%, а в островках гемопоэза относительная фракция пролиферирующих клеток по РСНА увеличивалась почти на 60% (рис. 7А, Б).

Тимус. Размеры долек тимуса были значительно уменьшены, деление на корковое и мозговое вещество стиралось. Клеточность коркового вещества снижалась. Часто обнаруживались фигуры митозов и деструкция эпителиальных клеток, ядра которых находились в состоянии кариопикноза и кариорексиса. Отмечался отек соединительно-тканных перегородок. Строма была набухшая, отечная, с жировой инфильтрацией по периферии долек.

Клеточность в корковом веществе тимуса у облученных крыс снижалась почти в 2 раза, а 1мит. возрастал по отношению к контролю до 3,57+0,33%. РСЫА+ ядра густо заполняли периферию редуцированных долек, где определялось интенсивное промечивание пролиферирующих клеток БДУ.

В 3 группе (облучение + Т-34), так же как и во 2 группе, отмечалась анемия внутренних органов. Масса тимуса составила 70-130 мг. Масса селезенки составила 290-510 мг и была больше, чем в группе облученных животных, но не достигала контрольных значений.

Двенадцатиперстная кишка. Гистоархитектоника слизистой оболочки значительно не отличалась от контроля. Высота и плотность расположения ворсинок была несколько снижена, отмечалось некоторое расширение крупных сосудов и капилляров в подслизистой основе и собственной пластинке слизистой с формированием периваскулярного и вазогенного отека стромы.

Клеточность в криптальном отделе кишки снизилась до 7617±165 относительно контрольной группы. Однако достоверных изменений линейных размеров зоны пролиферации, 1рскд, относительной фракции пролиферирующих клеток с РСИА-позитивной реакцией и 1мнт По сравнению со 2 группой зарегистрировано не было.

Селезенка. Структурно-функциональная организация селезенки соответствовала картине, полученной для 2 группы. При этом отмечались

характерные признаки воспалительной реакции - расширение сосудов и инфильтрация красной пульпы полиморфно-ядерными лейкоцитами.

В тимусе наблюдались гистофизиологические изменения, характерные для острой пострадиационной инволюции этого органа. Септы и капсула были разрыхлены, отечны, в некоторых образцах выявлялось опустошение корковой зоны и редукция мозгового вещества. В корковом и мозговом веществе капилляры были расширены, наблюдался отек.

При иммуноокрашивании на РСИА и БДУ распределение пролиферирующих клеток носило гнездный характер с визуальным снижением их численности даже по периферии коркового вещества.

В 4 группе (облучение + Т-38) ткани двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса не имели признаков анемии, характерных для животных 2 и 3 групп. Прирост массы тела животных составил 6,3%, относительно 2 группы.

Двенадцатиперстная кишка. По структурно-функциональному состоянию слизистая оболочка не отличалась от контроля. Восстанавливался клеточный состав собственной пластинки. Отмечалась нормализация структуры микроциркуляторного русла, подслизистой основы и нервных ганглиев.

35 30

" 25 - 20

I 15 10 5 0

-1-

гЕЕ-

г»

(О с

е- ?

Рис. 7. Пролиферативная активность клеток двенадцатиперстной кишки:

А - 8-фазная фракция пролиферирующих клеток по индексу БДУ, Б - относительная фракция пролиферирующих клеток по PCNA. * - р<0,05 по сравнению со 2 и 3 группами.

Линейные размеры зоны пролиферации расширялась до 237+3 мкм. и 1М1гт составили соответственно 69,5±0,4% и 2,83±0,05%%, что достоверно выше по сравнению со 2 группой. Зона пролиферативной активности клеток в криптальном отделе и была больше по сравнению

с контролем. Индекс БДУ и общая объемная фракция пролиферирующих клеток возрастали по сравнению со 2 группой (рис. 7А, Б).

Селезенка. Под действием пептида Т-38 в селезенке определялось относительное увеличение содержания белой пульпы и появление крупных гемопоэтических островков. В лимфатических фолликулах и парафолликулярной зоне повышалось содержание крупных лимфобластов, многие из которых находились в состоянии митоза. В гемопоэтических колониях видны многочисленные гемоцитобласты и мегакариоциты.

Группы РСЫА+ клеток были верифицированы по всей паренхиме селезенки, причем в зонах гемопоэза они формировали обширные скопления. Относительная фракция пролиферирующих клеток по РСЫА имела тенденцию к повышению по сравнению с группой облученных животных и достоверно возрастала по сравнению с контролем (рис. 8Б). В центрах размножения формирующихся лимфатических фолликулов возрастала 8-фазная фракция пролиферирующих клеток (рис. 8А).

а 40

Облучение Облучение + Облучен/е + Т-34 Т-38

гЗп

Контроль Облучение Облучение Облучение + Т-34 + Т-38

Рис. 8. Пролиферативная активность клеток субкапсулярной зоны и гемопоэтических островков селезенки:

А - 8-фазная фракция пролиферирующих клеток по индексу БДУ, Б - относительная фракция пролиферирующих клеток по РСНА, * - р<0,05 по сравнению со 2 и 3 группами, ** - р<0,05 по сравнению контролем.

Тимус. После введения пептида Т-38 в дольках тимуса просматривалась дифференциация на корковое и мозговое вещество. По периферии коркового вещества наряду с увеличением клеточности появлялись крупные лимфобласты, наблюдались многочисленные фигуры митозов. Кровеносные капилляры были сужены, без выраженных признаков периваскулярного отека.

РСНА+ и БДУ+ клетки верифицировались по всей площади коркового вещества. Относительная фракция пролиферирующих клеток по PCNA возрастала почти на 50% относительно контроля и была выше, чем во 2 и 3 группах (рис. 9Б). Кроме того, наблюдалась тенденция к увеличению митотической активности и индекса Б-фазной фракции клеток (рис. 9А).

Под действием пептида Т-38 у облученных животных наблюдался прирост массы тела, а в исследуемых органах отсутствовали признаки анемии. Пептид Т-38 стимулировал пролиферативную активность в тканях кишечника, селезенки и тимуса.

* 20

ш 15

5 10

^ °

1 03" О га с о. *

■а- ? Ц

Облучение Облучение + Облучение + Т-34 Т-38

Контроль Облучение Облучение облучение + Т-34 + т-38

Рис. 9. Пролиферативная активность клеток в корковой зоне тимуса: А - 5-фазная фракция пролиферирующих клеток по индексу БДУ, Б - относительная фракция пролиферирующих клеток по РСНА, * - р<0,05 по сравнению со 2 и 3 группами.

Способность всех указанных тканей к пролиферации была выше, чем в контрольной группе и в сравнении с группой облученных животных. Кроме того, под влиянием пептида Т-38 в тимусе проявлялось деление на кортикальную и медуллярную зоны, которое полностью исчезало при облучении, что указывает на возможность геропротекторного действия пептида Т-38 в отношении вилочковой железы.

Данные, полученные в модели ускоренного старения на крысах, свидетельствуют о том, что выявленные в ходе разработки методологии исследования геропротекторных пептидов молекулярно-клеточные механизмы проявляются на тканевом уровне, что подтверждает эффективность применения коротких пептидов для восстановления функций нейроиммуноэндокринной системы, снижающейся при старении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили разработать методологию изучения механизмов действия пептидных геропротекторов, а также выяснить молекулярно-клеточные основы взаимодействия пептидов с биологическими объектами.

Целью первого этапа исследования явилось изучение молекулярных механизмов действия пептидов на уровне синтеза белка и регуляции апоптоза.

Проведенные на культуре фибробластов исследования показали, что пептиды обладают свойством тканеспецифичности в отношении стимуляции синтеза белка. Так, пептид Т-31, имеющий сродство к хрящевой ткани, активировал экспрессию белков цитоскелета (актина, виментина и тубулина) и кариоскелета (ламина А и С). При этом пептиды Т-34 и Т-38, тканеспецифичность которых направлена на ткани дыхательной и сосудистой систем, не оказывали такого эффекта.

Тканеспецифическая активация синтеза белков цитоскелета под действием геропротекторных пептидов позволяет предположить, что одной из мишеней их действия являются внутриклеточные сигнальные молекулы, активность которых реализуется через осуществляемую пептидами реструктуризацию белков цитоскелета. Также представляется вероятным, что пептидная регуляция синтеза внутриядерных белков может приводить к изменению соотношения гетеро- и эухроматина в ядре, что, в свою очередь, способствует изменению интенсивности экспрессии различных генов.

Кроме того, оба исследованных пептида, в особенности Т-34, показали выраженный антиапоптотический эффект в культуре фибробластов, реализуемый путем повышения сопротивляемости митохондрий к бактериальным повреждениям путем блокады митохондриапьного каскада выработки проапоптозных каспаз.

Поскольку при старении наблюдается снижение экспрессии белков и усиление апоптотических процессов, можно сделать вывод о том, что в основе геропротекторного действия пептидов на уровне клетки лежит их способность стимулировать экспрессию структурных белков и снижать вероятность развития программированной клеточной гибели.

Известно, что с возрастом снижается способность клеток к дифференцировке, в связи с чем, третья часть исследования была посвящена изучению воздействия пептидов на полипотентную эмбриональную ткань.

Установлено, что в зависимости от вида пептида происходит индукция дифференцировки полипотентной ткани в том или ином направлении. Пептиды АКС-П и АП-0, родственные тканям поджелудочной железы и простаты, запускают развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия. В то же время, пептиды АК-0 и АЕ-0, синтезированные на основе экстрактов из тканей мозга, не влияют на

развитие сомитов. При этом пептид АЕ-0 индуцирует дифференцировку нервной ткани. Показано, что в основе способности пептидов стимулировать развитие полипотентных клеток лежит усиление синтеза а-актина.

На первых 2 этапах исследования удалось установить, что геропротекторный эффект пептидов в модели ускоренного старения является тканеспецифичным, а в его основе лежит индукция пептидами синтеза белков цито- и кариоскелета и ингибирование процессов апоптоза. Кроме того, одной из возможных мишеней действия пептидов могут являться стволовые клетки, которые в зависимости от вида вводимого пептида способны дифференцироваться в различные ткани организма.

Задачей следующего этапа исследования явилось обобщение всех эффектов пептидов, полученных в предыдущих опытах, на примере иммунной системы, процессы возрастной инволюции в которой наиболее выражены.

Было установлено, что пептиды АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 оказывают многочисленные эффекты, большей частью стимулирующие, на дифференцировку, активацию, пролиферацию и апоптоз иммунных клеток человека в костном мозге, печени и тимуса эмбрионов, а также в тимусе детей до 1,5 лет.

Изученные пептиды, в особенности АТ-0 и АВ-17, стимулируют дифференцировку стволовых СБ34+ клеток-предшественников костного мозга и печени эмбрионов человека. Под действием указанных пептидов стволовые клетки костного мозга дифференцируются в направлении миелоидных СБ14+ клеток и незрелых СБЗ+ Т-лимфоцитов, а клетки печени - в зрелые Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки.

Пептиды АТ-0 и Т-37 способствуют изменению фенотипа зрелых Т-клеток крови и тимуса, что свидетельствует об индукции синтеза рецепторных белков. Зрелые Т-лимфоциты крови изменяли свой фенотип с С04'СБ8+ и С04+СЭ8" на СВ4+СБ8+. Аналогичный эффект был получен при влиянии пептида Т-37 на зрелые Т-лимфоциты тимуса.

Пептиды АТ-0, АВ-А, АВ-9 и Т-37 усиливают активацию иммунных клеток человека и способствуют повышению их пролиферативной активности на фоне снижения апоптоза.

Пептиды АТ-0, АВ-А и Т-37 в дозах 20 и 200 нг/мл усиливали экспрессию маркера поздней активации НЬЛ-БК на мембране цитотоксических Т-лимфоцитов крови, повышали их митотическую способность снижали уровень апоптоза. Сходное действие на активацию, пролиферацию и апоптоз тимоцитов оказывал пептид АВ-9 в концентрациях 20 и 200 нг/мл.

Поскольку инволюция иммунной системы является основной причиной развития целого ряда иммунопатологических процессов, особенно сильно выраженных в пожилом и старческом возрасте, исследование механизмов действия пептидных биорегуляторов на различные компоненты иммунной системы позволило открыть новые перспективы для диагностики и коррекции иммунной патологии.

Применение разработанной методологии исследования позволило сделать ввод о том, что под действием пептидов происходит стимуляция активности и дифференцировки иммунных клеток, что, в свою очередь, свидетельствует о повышении ее функциональной активности. Следует подчеркнуть, что пептидные геропротекторы влияют на активность иммунных и эпителиальных клеток тимуса, возрастная инволюция которого наиболее выражена по сравнению с другими органами иммунной системы.

Применение разработанной методологии на предыдущих этапах исследования позволило установить, что механизм действия геропротекторных пептидов заключается в регуляции экспрессии различных внутриклеточных белков. Целью завершающего этапа работы явилось выявление геропротекторного эффекта пептидных биорегуляторов на тканевом уровне.

Был проведен сравнительный анализ влияния пептидов Т-34 и Т-38 на органы крыс в модели радиационного старения. Было показано, что облучение вызывает ряд патологических процессов, которые на уровне органов выражаются в снижении их массы, на уровне тканей проявляются в деструкции сосудистого русла, отеке ткани, снижении клет;очности и на уровне клеток выражаются в изменении структуры их ядер, что, возможно, приводит к снижению синтеза белка.

Под действием пептида Т-38, тропного к сосудистой ткани, наблюдалось выраженное усиление процессов пролиферацаии во всех исследуемых тканях, а патология сосудистого русла, индуцированная облучением, полностью отсутствовала. Вероятно, синтетический пептид Т-38, оказывая тканеспецифическое действие на ткань сосудов, и, тем самым, улучшая трофику тканей, способствовал активации в них пролиферативных процессов.

Результаты исследований в модели ускоренного старения показали, что молекулярно-клеточные механизмы действия геропротекторных пептидов проявляются на тканевом уровне, что подтверждает эффективность применения коротких пептидов для восстановления функций нейроиммуноэндокринной системы, снижающейся при старении.

Таким образом, комплексное использование методов клеточных культур, конфокальной иммунофлюоресцентной микроскопии, морфометрии, проточной цитометрии позволило сформировать новый подход к методологии исследования молекулярно-клеточных механизмов действия пептидных геропротекторов. В результате применения указанной

методологии исследования были сформулированы следующие механизмы геропротекторного действия пептидов.

Разработка методологии исследования механизмов действия геропротскторных пептидов позволила выявить перспективные направления для дальнейшего изучения пептидной регуляции старения. В основе предложенной методологии лежит новый подход к тестированию пептидных геропротекторов, который в данной работе был применен к нейроимуноэндокринной системе, играющей ключевую роль в поддержании гомеостаза при старении организма.

Новый подход к скринингу пептидных геропротекторов является позволяет существенно расширить представления о тканеспецифическом действии пептидов и проанализировать механизмы данного явления. Разработанная методология позволила показать, что все пептиды можно разделить на группы в соответствии с механизмом их действия. Например, пептиды АТ-0, АВ-9, АВ-17, Т-34 и Т-37 оказывают выраженный стимулирующий эффект на пролиферативную активность иммунных клеток, тогда как пептиды АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 стимулирую дифференцировку полипотентных клеток, а пептид Т-34 снижает вероятность развития апоптоза эпителиоцитов желудка по митохондриальному пути.

В целом, применение разработанной методологии позволит выявить механизмы действия синтетических пептидов, что, в итоге, будет способствовать наиболее эффективному применению указанного класса биорегуляторов в клинической гериатрии.

ВЫВОДЫ

1. Пептид Т-31 активирует экспрессию белков цитоскелета (актина, виментина и тубулина) и кариоскелета (ламина А и С) в культуре фибробластов. Пептид Т-34 предотвращает развитие апоптоза по митохондриальному пути, в культурах фибробластов и эпителиоцитов кишечника. Снижение апоптоза и усиление экспрессии структурных белков способствуют повышению функциональной активности на уровне клетки и ткани, которая снижается при старении.

2. Пептиды АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 индуцируют дифференцировку культуры полипотентной ткани. Пептиды АКС-П и АП-0 индуцируют развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия. Пептид АК-0 активирует дифференцировку в направлении мезенхимальной ткани и эпителия, а пептид АЕ-0 стимулирует развитие нервной ткани. Дифференцировка полипотентной ткани может служить дополнительным резервом для увеличения пула

функционально активных клеток, гибель которых при старении организма усиливается.

3. Пептиды АТ-0 и АВ-17 стимулируют дифференцировку стволовых СБ34+ клеток-предшественников костного мозга и печени эмбрионов человека. Под действием указанных пептидов клетки костного мозга развиваются в направлении миелоидных СБ14+ клеток и незрелых СОЗ+ Т-лимфоцитов, а клетки печени - в зрелые Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки.

4. Пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-9 и Т-37 усиливают активацию иммунных клеток человека, и способствует повышению их пролиферативной активности. Пептиды АТ-0, АВ-17 и Т-37 усиливают экспрессию маркера поздней активации НЬА-БЯ на мембране цитотоксических Т-лимфоцитов крови и повышают их митотическую активность. Аналогичное действие на активацию и пролиферацию тимоцитов оказывал пептид АВ-9.

5. Пептиды АВ-9, АВ-17 и Т-37 снижают уровень апоптоза клеток тимуса, но не влияют на апоптоз клеток периферической крови. В отношении эпителиальных клеток тимуса антиапоптотическим эффектом обладают пептиды АВ-17 и Т-37. Антиапоптотический эффект в отношении Т-клеток тимуса оказывает пептид АВ-9.

6. Увеличение пролиферативной активности, снижение апоптоза, усиление дифференцировки иммунных клеток в органах центральной и периферической иммунной системы, под действием пептидов является перспективным направлением ' в иммунопатологических состояний, число которых увеличивается у лиц пожилого и старческого возраста.

7. В модели радиационного старения на крысах пептид Т-3 8 восстанавливает структуру двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса путем тканеспецифического действия на сосудистый компонент указанных органов.

8. В основе разработанной методологии заложен новый подход к тестированию пептидных геропротекторов, перспективность которого продемонстрирована на различных тканях нейроиммуноэндокринной системы, играющей ведущую роль в процессе старения организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Дальнейшее исследование фармакологического действия геропротекторного пептид Т-38 позволит оценить эффективность его применения в качестве радипротекторного средства и при нарушениях кровоснабжения различных органов, поскольку для него показано репаративное действие на сосудистую ткань.

2. Выявленный стимулирующий эффект пептида Т-31 на синтез белков цито- и кариоскелета может быть рекомендован для дальнейшего скринига, с целью оценки перспективности его применения в качестве стимулятора репаративных процессов.

3. Антиапоптотический механизм действия геропротекторного пептида Т-3 4 может найти свое применение в терапии патологических состояний, связанных с программированной гибелью клеток или нарушением пути их нормальной дифференцировки. Кроме того, дальнейшее сравнительное исследование фармакологического действия пептида Т-3 4 и антибиотика клацида может открыть перспективный путь для его применения в качестве альтернативы антибиотикотерапии при некоторых заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

4. Дальнейшее исследование фармакологической активности пептидов АТ-0, АВ-17, АВ-9 и Т-37 позволит разработать препараты для лечения гематологических заболеваний, поскольку они оказывают стимулирующий эффект на дифференцировку и пролиферацию иммунных клеток тимуса и периферической крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАКМинобрнауки РФ

1. Влияние пептидов эпифиза на функции тимуса при его старении/ Н.С. Линькова, A.B. Трофимов, В.О. Полякова, H.H. Севостьянова, И.М. Кветной //Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, № 4. - С. 543546.

2. Индуцированное старение тимуса: радиационная модель и перспективы применения низкоинтенсивного лазерного излучения/ H.H. Севостьянова, A.B. Трофимов, Н.С. Линькова, В.О. Полякова, И.М. Кветной//Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, № 4. . с. 547553.

3. Компенсаторное действие пептидов эпифиза на органы иммунной и эндокринной системы у эпифизэктомированных крыс/ Линькова Н.С., Хавинсон В.Х., Трофимов A.B., Дудков A.B. // Научные ведомости Белгородского государственного университета» серии «Медицина. Фармация» 2011. - Вып. 13/1. - С. 86-90.

4. Мелатонин - молекулярный маркер опухолевых и нейродегенеративных заболеваний/ И.М. Кветной, Т.В. Кветная, Н.Т. Райхлин, В.Х. Хейфец, X. Эрнандес-Яго, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, Х.-Р. Блеса// Молек. мед. - 2005. - № 1.- С. 25-34.

5. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения /Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Трофимов A.B., Полякова В.О., Севостьянова H.H., Кветной И.М.// Успехи современной биологии. -2011.-Т. 131,№2.-С. 115-121.

6. Нейроиммуноэндокринные механизмы регуляции пролиферативной активности тимоцитов в постнатальном онтогенезе/ И.М. Кветной, В.В. Южаков, В.О. Полякова, А.Л. Ярилин, Э.С. Курилец, Л.Н. Михина, A.B. Трофимов, С.С. Коновалов, Н.И. Шарова, М.Ф Никонова// Мед. акад. журнал. - 2004. - Т. 47, № 4. - С. 52-58.

7. Нейроиммуноэндокринные механизмы старения/ М.А. Пальцев, И.М. Кветной, В.О. Полякова, Т.В. Кветная, A.B. Трофимов //Успехи геронтологии. - 2009. - Т. 22, № 1. - С. 24-36.

8. Нейроэндокринный и пролиферативный потенциал клеток кишечника человека при старении/А.В. Трофимов, H.H. Севостьянова, Н.С. Линькова, А.Н. Колмаков, В.О. Полякова//Бюлл. эксп. биол. мед. - 2010. - Т. 150, № 12. - С. 682-685.

9. Особенности эпифизарно-тимических взаимоотношений при старении /Н.С. Линькова, A.B. Трофимов, В.О. Полякова, H.H. Севостьянова, И.М. Кветной // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1. - С.38-42.

10. Пептид эпифиза восстанавливает функциональную активность поджелудочной железы при индуцированном старении / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Трофимов A.B., Дудков A.B. // Научные

ведомости Белгородского государственного университета» серии «Медицина. Фармация» - 2011. - Вып. 13/1. - С. 81-85.

11. Пептидергическая регуляция дифференцировки, пролиферации и апоптоза тимоцитов прии старении вилочковой железы/ Н.С. Линькова, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, И.М. Кветной,

B.Х. ХавинсошУБюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 2. - С. 203206.

12. Пептидная регуляция репаративных процессов в органах иммунной системы при ускоренном старении/В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, И.М. Кветной, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, H.H. Севостьянова, Р.И. Абдулрагимов//Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2010. - Вып. 12/1. - № 22 (93). - С. 57-61.

13. Репаративное действие пептида везугена на структуру двенадцатиперстной кишки в модели ускоренного старения/Г.А. Рыжак, H.H. Севостьянова, Т.В. Кветная, A.B. Трофимов, Н.С. Линькова, Е.А. Гусельникова, Л.А. Грабежев, С.С. Коновалов//Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. -2010.-Вып. 12/1.-№22 (93).-С. 53-56.

14. Трофимов A.B. Функциональная морфология старения/Трофимов A.B. // Успехи геронтологии. - 2009. - Т. 22, № 3. - С. 401-408.

15. Экспрессия аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов в тимоцитах и эпителиальных клетках тимуса человека в условиях совместного культивирования при действии пептидов вилона и эпиталона / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Е.А. Смирнова, A.A. Ярилин, Н.И. Шарова, М.М. Митнена, В.Х. Хавинсон, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, И.М. Кветной // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2004. - Т. 137, № 6. - С. 667-670.

16. Эффекты действия мелатонина на старение клеток тимуса и периферические Т-лимфоциты in vitro/B.O. Полякова, И.В. Князькин,

C.С. Коновалов, И.М. Кветной, A.B. Трофимов, E.H. Чернышова, А.Ю. Чебракова//Успехи геронтологии. - 2005, - № 17. - С. 10-14.

Статьи в зарубежных журналах

17. Hormonal function and proliferative activity of thymic cells in humans: immunocytochemical correlations/I.M. Kvetnoy, V.O. Polyakova, A.V. Trofimov, V.V. Yuzhakov, A.A. Yarilin, E.S. Kurilets, L.N. Mikhina, N.I. Sharova, M.F. Nikonova//Neuroendocrinol. Let. - № 24. -2003.-P. 263-268.

Монографии

18. Роль нейроиммуноэндокринных механизмов в онкогеронтологии предстательной железы и мочевого пузыря/ В.Х. Хейфец, И.М. Кветной, И.В. Князькин, A.B. Трофимов, А.Т. Супиев // СПб.: Система. - 2004. - 92 с.

19. Трофимов A.B. Нейроэндокринные клетки желудочно-кишечного тракта в моделях преждевременного старения/А.В. Трофимов, И.В. Князькин, И.М. Кветной// СПб.: ДЕАН. - 2005. - 208 с.

Главы в руководствах

20. Нейроиммуноэндокринология желудка и кишечника/М.А. Пальцев, И.М. Кветной, И.В. Козлова, A.B. Трофимов//Руководство по нейроиммуноэндокринологии. - М.: Медицина. - 2006. - С. 222-238.

21. Хавинсон В.Х., Коновалов С.С. Избранные лекции по геронтологии /Лекция 5. Роль нейроэндокршшых клеток желудочно-кишечного тракта при старении / И.В. Козлова, В.В. Южаков, A.B. Трофимов, Р.В. Анциферов - СПб.: Прайм-ЕВРОЗНАК. - 2009. - С. 305-448.

Статьи в других журналах

22. Геропротекторное и регуляторное влияние мелатонина на тимоциты в исследованиях in vitro / В.О. Полякова, И.В. Князькин, A.B. Трофимов, И.М. Кветной// Альманах «Геронтология и гериатрия». -2005. - Вып. 4. - С. 230-232.

Тезисы докладов

23. Адреналин-индуцированная глаукома как модель ускоренного старения глаза/ В.Н. Алексеев, A.B. Трофимов, Е.Б. Мартынова, Н.Ю. Чурилина //Матер. IV научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов». -Москва,2007.-С. 11-12.

24. Везуген как геропторектор, активирующий пролиферацию и дифференцировку тимоцитов/А.В. Трофимов, В.О. Полякова, Н.С. Линькова, H.H. Севостьянова, Р.И. Абдулрагимов//Матер. XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни». - Москва, 2010. - С. 84.

25. Восстановление структуры клеток тимуса под действием везугена в модели радиационного старения / H.H. Севостьянова, A.B. Трофимов, Н.С. Линькова, С.С. Коновалов, Л.А. Грабежев, В.О. Полякова// Матер. XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни». - Москва, 2010. -С. 79.

26. Геропротекторное действие мелатонина на клетки тимуса/ В.О. Полякова, И.М. Кветной, И.В. Князькин, A.B. Трофимов // Матер. IV национального конгресса геронтологов и гериаторов Украины «Проблемы старения и долголетия» -2005. - Т. 14. - С. 46-47.

27. Изменение уровня синтеза белка Ki-67 в щитовидной железе как показатель возрастного снижения адаптации к физическим нагрузкам/ О.Н. Зугаирова, В.О. Полякова, С.С. Коновалов, A.B. Трофимов //Матер. IV Международного конгресса «Человек, спорт, здоровье». - Санкт-Петербург, - 2009. - С. 128.

28. Исследование пролиферативной активности клеток кишечника человека при старении/ A.B. Трофимов, Н.С. Линькова, А.Н. Колмаков, H.H. Севостьянова, В.О. Полякова// Матер. XV Международной научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». - Санкт-Петербург, - 2010. - С. 397.

29. Линькова Н.С. Молекулярные механизмы репарационного действия пептидов на язву желудка / Линькова Н.С., Трофимов A.B. // Матер, научно-практической конференции «Старшее поколение» СПб., 2011.-С. 23.

30. Мелатонин в иммунокомпетентных клетках: синтез, депонирование, биологическая роль/ И.М. Кветной, Т.В. Кветная, В.О. Полякова,

A.B. Трофимов, И.В. Князькин, П.Н. Зезюлин, C.B. Филиппов //Матер. XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, - 2006. - С.161.

31. Паракринная регуляция локального гомеостаза тимуса при его старении/Н.С. Линькова, A.B. Трофимов, В.О. Полякова, H.H. Севостьянова, Р.И. Абдулрагимов, С.С. Коновалов//Матер. XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни». - Москва, - 2010. — С. 47-48.

32. Пептидэргическая регуляция дифференцировки тимоцитов при старении тимуса/ Н.С. Линькова, A.B. Трофимов, В.О. Полякова, И.М. Кветной//Матер. XV Международной научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». -Санкт-Петербург, - 2010. - С. 373.

33. Полякова В.О. Изучение эффектов вилона и эпиталона на культуру периферических Т-лимфоцитов/ В.О. Полякова, A.B. Трофимов// Матер. Девятой Российской конференции «Гепатология сегодня» -Москва. - 2004. - С. 57.

34. Полякова В.О. Иммуногеропротекторные эффекты синтетических пептидов/В.О. Полякова, С.С. Коновалов, A.B. Трофимов// Матер. II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. - Санкт-Петербург, - 2005. - С. 103.

35. Полякова В.О. Молекулярные маркеры экспрессии гормонов в иммунокомпетентных клетках / В.О. Полякова, A.B. Трофимов// Матер. И-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва. - 2005. - С. 211-212.

36. Полякова В.О. Пептидергическая профилактика старения тимуса/

B.О. Полякова, A.B. Трофимов, П.Н. Зезюлин //Сб. трудов научной конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней». - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 50-51.

37. Полякова В.О. Пептидергическая регуляция экспрессии аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов в тимоцитах человека/ В.О. Полякова, A.B. Трофимов //Матер. VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых

исследователей «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. — 2004.-С. 231.

38. Регенераторная способность печени при различных вариантах течения и исходах ХГВ / И.Я. Шапиро, A.B. Шабров, Т.В. Сологуб, В.Е. Карев, В.А. Цинзерлинг, A.B. Трофимов //Матер. IX Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 2004. - С. 65.

39. Сравнительное действие везугена и везилюта на восстановление функций тимуса при его старении/Л.А. Грабежев, A.B. Трофимов,

H.С. Линькова, В.О. Полякова//Матер. XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни». -Москва,2010.-С. 22.

40. Трофимов A.B. Т-хелперы эпифиза и их роль в возрастной инволюции нейроиммуноэндокринной системы /Трофимов A.B., Линькова Н.С., Дудков A.B. // Матер, научно-практической конференции «Старшее поколение» СПб., 2011. - С. 37.

41. Экспрессия SMA-a в печени при различных вариантах течения и исходах хронического гепатита В/ И.Я. Шапиро, A.B. Шабров, Т.В. Сологуб, В.Е. Карев, В.А. Цинзерлинг, A.B. Трофимов//Матер. IX Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва. -

2004. - С. 30.

42. Экстрапинеальный мелатонин: роль в нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза/ И.М. Кветной, И.В. Князькин, Т.В. Кветная,

B.О. Полякова, A.B. Трофимов//Матер. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2005. -

C. 406-407.

43. Gastrointestinal melatonin plays a coordinating role in local intercellular relationships in premature aging/ A.V. Trofimov, Yu.A. Tafeev,

I.V. Knyazkin, S.S. Konovalov //VI European Congress «Healthy and active ageing for all europeans». - St.-Peterburg. - 2007. - P. 73-74.

44. Neuroimmunoendocrine interactions and role of extrapineal melatonin in premature aging/ V. Polyakova, A. Trofimov, I. Knyazkin, S.Konovalov //Abstr. 6th Intern. Conference on Neuroimmunomodulation. - Athens,

2005.-P. 65-66.

45. Neuroimmunoendocrinology: key role of microscopy for the creation of new discipline/I.M. Kvetnoy, T.V. Kvetnaia, V.O. Polyakova, A.V. Trofimov, I.V. Knyazkin, S.S. Konovalov// Proc. XIII European Congress of Microscopy. - Antwerpen. - 2004. - P. 37-38.

Трофимов Александр Владиславович МЕТОДОЛОГИЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДОВ// Автореф. дис. докт. мед. наук: 14.01.30-СПб., 2011.-47 с.

Подписано в печать «16»марта2011. Формат 60*84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ ^ Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Оглавление диссертации Трофимов, Александр Владиславович :: 2011 :: Санкт-Петербург

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ СТАРЕНИЯ НА СИСТЕМНОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ.

1.1. Возрастная инволюция нейроиммуноэндокринной системы.

1.1.1. Возрастная инволюция иммунной системы.

1.1.2. Возрастная инволюция нервной системы.

1.1.2.1. Возрастная инволюция пинеальной железы.

1.1.2.2. Возрастная инволюция центральной нервной системы.

1.1.3. Возрастная инволюция эндокринной и пищеварительной систем

1.1.3.1. Возрастная инволюция поджелудочной железы.

1.1.3.2. Возрастная инволюция желудочнокишечного тракта.

1.1.3.3. Возрастная инволюция печени.

1.1.4. Возрастная инволюция сетчатки.

1.2. Пептидергическая регуляция гомеостаза при старении.

1.2.1. Роль пептидергической регуляции в процессах старения.

1.2.2. Феноменология пептидных биорегуляторов.

1.3. Роль белков и пептидов в ультраструктурной организации и функционировании клеток в норме, при индуцированном старении и возрастассоциированной патологии.

1.3.1. Цитоскелет и кариоскелет: структурная организация, свойства и функции.

1.3.2. Роль апоптоза в функционировании клеток в норме, при патологии и старении.

1.3.3. Индуцированное старение клеток под действием радиации.

Введение диссертации по теме "Геронтология и гериатрия", Трофимов, Александр Владиславович, автореферат

Проблема старения является одним из приоритетных направлений современной биологии и медицины. В настоящее время в мире в общей численности населения прогрессивно увеличивается доля лиц пожилого и старческого возраста [Сафарова Г.Л., 2009]. Увеличение средней продолжительности жизни, а, следовательно, и прогрессирующее старение населения [Коркушко О.В. и др., 2002] приведет в ближайшем будущем к необходимости решения целого ряда медицинских, социальных и экономических проблем. В связи с этим основная задача гериатрии — профилактика возрастной патологии становится важнейшим медицинским направлением.

Основным проявлением старения является инволюция трех важнейших регуляторных систем - нервной, иммунной и эндокринной [Пальцев М.А. и др., 2006]. Возраст-ассоциированные изменения этих систем связаны с общими законами старения организма, но имеют свои особенности, обусловленные структурно-функциональной спецификой каждого органа. На клеточном и субклеточном уровнях организации данный процесс проявляется в нарушении синтеза и секреции многих сигнальных молекул и, прежде всего, пептидов. Известно, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [Корнева Е.А. и др., 1988; Шатаева Л.К. и др., 2003; Хавинсон В.Х., 2009].

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилась разработка методологии исследования механизмов действия пептидных геропротекторов.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

3. Изучить действие пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 на дифференцировку полипотентной ткани ранней гаструлы Хепорш

4. Исследовать влияние пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 на активацию, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток костного мозга и печени эмбриона, I малодифференцированных клеток тимуса и периферической крови человека.

6. Разработать методологию исследования, позволяющую оценить геропротекторные механизмы действия пептидов на нейроиммуноэндокринную систему.

Научная новизна работы

Впервые выдвинуто предположение о том, что мишенями действия геропротекторных пептидов являются внутриклеточные сигнальные молекулы, активность которых реализуется через осуществляемую пептидами реструктуризацию белков цитоскелета и внутриядерные белки, регулирующие соотношение гетеро- и эухроматина в ядре. Кроме того, установлено, что пептиды снижают уровень апоптоза, усиление которого является одним их ключевых признаков старения.

Практическая значимость работы

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

2. Геропротекторный пептид Т-31 индуцирует синтез белков цито- и кариоскелета в фибробластах мышей, что позволяет предположить его участие в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов путем реструктуризации белков цитоскелета и изменения структуры хроматина через воздействие на синтез ядерных белков.

3. В основе геропротекторного действия пептидов АТ-0, АВ-17, АВ-А, Т-31, АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 лежит стимуляция дифференцировки стволовых клеток костного мозга, печени эмбрионов человека и полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки. Направление дифференцировки полипотентной ткани и стволовых клеток определяется выбранным пептидом.

5. Молекулярные механизмы действия геропротекгорных пептидов проявляются на тканевом и органном уровне. Пептид Т-38 способствует постлучевому восстановлению тканей двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки в модели радиационного ускоренного старения на крысах. Стимулирующий эффект пептида Т-38 выражается в восстановлении сосудистого компонента указанных органов, что отражает его тканеспецифичность.

Апробация работы

2005); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); VI Интернациональной конференции по нейроиммуномодуляторам (Греция, 2005); VIII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006); Научной конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006); VI европейском конгрессе «Здоровье и активное долголетие для всех европейцев» (Санкт-Петербург, 2007); IV Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2007); IV Международном конгрессе «Человек, спорт, здоровье» (Санкт-Петербург, 2009); XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2010); XV Юбилейном Российском национальном конгрессе «Человек и его здоровье» и III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010).

Реализация результатов исследования

Результаты работы используются в научной, педагогической, и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Белгородского государственного университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них -16 статей в журналах, включенный в Перечень ВАК Минобрнауки, 2 статьи в других изданиях, 2 монографии, 2 главы в руководствах и 23 -тезисов докладов.

Связь с научно-исследовательской работой института

Структура и объем диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов"

выводы

1. Пептид Т-31 активирует экспрессию белков цитоскелета (актина, вимеитина и тубулина) и кариоскелета (ламина А и С) в культуре фибробластов. Пептид Т-34 предотвращает развитие апоптоза по митохондриальному пути, в культурах фибробластов и эпителиоцитов кишечника. Снижение апоптоза и усиление экспрессии структурных белков способствуют повышению функциональной активности на уровне клетки и ткани, которая снижается при старении.

3. Пептиды АТ-0 и АВ-17 стимулируют дифференцировку стволовых С034+ клеток-предшественников костного мозга и печени эмбрионов человека. Под действием указанных пептидов клетки костного мозга развиваются в направлении миелоидных СБ14+ клеток и незрелых СБЗ+ Т-лимфоцитов, а клетки печени - в зрелые Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки.

4. Пептиды АТ-0, АВ-17, АВ-9 и Т-37 усиливают активацию иммунных клеток человека, и способствуют повышению их пролиферативной активности. Пептиды АТ-0, АВ-17 и Т-37 усиливают экспрессию маркера поздней активации НЬА-БК на мембране цитотоксических Т-лимфоцитов крови и повышают их митотическую активность. Аналогичное действие на активацию и пролиферацию тимоцитов оказывал пептид АВ-9.

6. Увеличение пролиферативной активности, снижение апоптоза, усиление дифференцировки иммунных клеток в органах центральной и периферической иммунной системы, под действием пептидов является перспективным направлением коррекции иммунопатологических состояний, число которых увеличивается у лиц пожилого и старческого возраста.

7. В модели радиационного старения на крысах пептид Т-38 восстанавливает структуру двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса путем тканеспецифического действия на сосудистый компонент указанных органов.

8. Разработана методология в основу которой заложен новый подход к тестированию пептидных геропротекторов, перспективность которого продемонстрирована на различных тканях нейроиммуноэндокринной системы, играющей ведущую роль в процессе старения организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Дальнейшее исследование фармакологического действия геропротекгорного пептида Т-38 позволит оценить эффективность его применения в качестве радипротекторного средства и при нарушениях кровоснабжения различных органов, поскольку для него показано репаративное действие на сосудистую ткань.

2. Выявленный стимулирующий эффект пептида Т-31 на синтез белков цито- и кариоскелета может быть рекомендован для дальнейшего скрининга, с целью оценки перспективности его применения в качестве стимулятора репаративных процессов.

3. Антиапоптотический механизм действия геропротекторного пептида Т-34 может найти свое применение в терапии патологических состояний, связанных с программированной гибелью клеток или нарушением пути их нормальной дифференцировки. Кроме того, дальнейшее сравнительное исследование фармакологического действия пептида Т-34 и антибиотика клацида может открыть перспективный путь для его применения в качестве альтернативы антибиотикотерапии при некоторых заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Трофимов, Александр Владиславович

1. Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. -М.: Медицина, 2006. 192 с.

2. Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной, иммунной // Успехи физиологических наук. -1996. №7. - С. 3-19.

3. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб., 2008. - 434 с.

4. Анисимов В.Н. Современные представления о природе старения // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 120, № 2. - С. 146-164.

5. Анисимов В.Н. Физиологические функции эпифиза (геронтологический аспект) // Рос. физиол. журнал. 1997. - Т. 83, № 8. -С. 97-105.

6. Анисимов В.Н. Эпифиз (шишковидная железа) и опухолевый рост // Вопр. онкол. 1980. - № 8. - С. 97-105.

7. Анисимов В.Н., Арутюнян A.B., Хавинсон В.Х. Мелатонин и эпиталамин угнетают процесс перикисного окисления липидов у крыс // Докл. РАН. 1996. - Т. 348. - С. 765-767.

8. Анисимов В.Н., Бохелер K.P., Хавинон В.Х., Анисимов В.Н. Изучение действия пептидов вилона и эпиталона на экспрессию генов в сердце мыши с помощью технологии на основе микрочипов // Бюл. экспер. биол. 2002. - Т. 133, № 3. - С. 340-347.

9. Анисимов В.Н., Мыльников C.B., Опарина Т.И., Хавинсон В.Х. Влияние мелатонина и эпиталамина на продолжительность жизни и перикисное окисление липидов у Drosophila melanogaster // Докл. РАН. -1997. -Т. 352, № 5. С. 704-707.

10. Анисимов В.Н., Соловьев М.В. Эволюция концепций в геронтологии. СПб., 1999. - 130 с.

11. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х. Влияние полипептидного препарата эпифиза на продолжительность жизни и частоту спонтанных опухолей у старых самок крыс // ДАН СССР. 1991. - Т. 319, № 1. - С. 250-253.

12. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х. Проименение пептидных препаратов эпифиза (шишковидной железы) в онкологии: двадцатилетний опыт исследования эпиталамина // Вопр. онкологии. -1993а.-Т. 39, №4-6.-С. 131-142,

13. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Роль пептидов эпифиза в регуляции гомеостаза: 20-летний опыт исследований // Успехи соврем. Биологии. 19936. - Т. 113, вып. 6. - С. 752-762.

14. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Эпифиз и рак // Успехи современной биологии. 1980. - Т. 89, вып. 2. - С. 283-291.

15. Анохин П.К. Узловые вопросы теории функциональной системы. М.: Наука, 1980. - 197 с.

16. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерархия // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 1982. Т. 18, № 1.-С. 3-10.

17. Ашмарин И.П. Перспективы практического прирменения и некоторые фундаментальные исследования малых регуляторных пептидов // Вопр. мед. химии. — 1984. Т. 30. - Вып. 3. - С. 2-7.

18. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче // Физиология человека и животных / ВИНИТИ. М., 1988. - Т. 34.- 184 с.

19. Ашмарин И.П., Кулашев А.П., Чепурнов С.А. Каскадные однонаправленные регуляторные процессы, осущестляемые короткоживущими пептидами (тиролиберин.) // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова. 1989. - Т 75. - С. 627-632.

20. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные петиды,функционально-неприрывная совокупность // Биохимия. — 1986. — Т. 51, №4.-С. 531-545.

21. Бабков В.В. Н.К. Кольцов и его Институт в 1938-39 гг. // Онтогенез. 1992. - Т. 23, №4. - С. 443-459.

22. Болдырев A.A. Нейрональные рецепторы в клетках иммунной системы // Природа. 2005. - № 7. -С. 45-51.

23. Брискин Б.С., Лузина С.Н., Костюченко Л.Н. Хирургические болезни в гериатрии. — М.: Бином-пресс, 2006. — 336 с.

24. Васин М.В. Профилактика и лечение радиационных поражении организма // Радиационная медицина. Т.1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл. 11. - М.: Изд. AT, 2004. - С. 678-787.

25. Валенкевич J1.H., Яхонтова О.И. Болезни органов пищеварения. Руководиство по гестроэнтерологии для врачей. СПб.: Деан, 2006. - 656 с.

26. Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И. Клиническая энтерология. -СПб.: Гиппократ, 2001. 288 с.

27. Войтон Е.В., Рыжак Г.А. Коррекция возрастных изменений кожи методами клеточной и биорегулирующей терапии // Успехи геронтологии. 2005. - вып. 16. - С. 70-75.

28. Воробьев Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. М.: Энергоатомиздат, 1985. - 296 с.

29. Гериатрия в лекциях. Архив журнала «Клиническая геронтология» 1995-2000 г. М.: Ньюдиамед, 2002. — 404 с.

30. Гомазков O.A. Физиологически активные петиды: справочное руководство. -М.: ИПГМ, 1995. 144 с.

31. Гончарова Н.Д., Венгерин A.A., Шмалий A.B., Хавинсон В.Х. Пептидная коррекция возрастных нарушений функции эпифиза у обезьян // Успехи геронтологии. — 2003. — вып. 12. С. 121-127.

32. Гончарова Н.Д., Хавинсон В.Х., Лапин Б.А. Пинеальная железа и200возрастная патология (механизмы и коррекция). СПб.: Наука, 2007. — 168 с.

33. Гордеева A.B., Лабас Ю.А. Одноклеточные альтруисты // Природа.-2005.-№ 6.-С. 27-33. С

34. Гринцевич И.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Серый C.B. Влияние тималина на вилочковую железу и некоторые иммунологические показатели у облученных животных // Радиобиология. 1984. - Т.24, № 4. -С. 537-540.

35. Гроссман М. Кратная история эндокринологии пищеварения. Желудочно-кишечные гормоны и патология пищеварительной системы. -М.: Медицина, 1981.-342 с.

36. Гуськова А.К. Классификация лучевой болезни // Радиационная медицина. Т.2. - Радиационные поражения человека. - Гл. 3. - М.: Изд. AT, 2001. - С. 41-61.

37. Гуськова А.К. Радиационная патология человека // Радиационная медицина. Т.1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл.2. М.: Изд. AT, 2004. - С. 90-121.

38. Данилова K.M. Некоторые аспекты естественного старения // Современные проблемы радиобиологии. Проблемы радиационной геронтологии (особенности возрастных изменений облученного организма). М.: Атомиздат, 1978. - Т. 7. - С. 7-27.

39. Даренская Н.Г. Реакция организма на лучевое воздействие // Радиационная медицина. Т. 1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл. 8.- М.: Изд. AT, 2004а. - С. 531-603.

40. Даренская Н.Г. Реакция основных систем организма // Радиационная медицина. Т. 1. - Теоретические основы радиационноймедицины. Гл. 6.1-6.3. - М.: Изд. AT., 20046. - С. 294-326.

41. Даренская Н.Г. Тканевая радиочувствительность // Радиационная медицина. Т.1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл. 5.- M.: Изд. AT. 2004. - С. 278-293.

42. Елецкий Ю.К., Зорина О.М. Ультраструктурный анализ, влияние ваготамии на состояние экзокринного отдела поджелудочной железы крыс // Арх. анат. 1979. - № 12. - С. 34-41.

43. Ермилов В.В., Водовозов A.M. Роль локальтного амилоидоза тканей дна глаза в патогенезе сенильной макулопатии // Вестник офтальмологии. 1995. - Т. 111, № 4. - С. 24-27.

44. Ермилов В.В., Трофименко О.В. // Успехи геронтологии. 1998. -Т. 2.-С. 117-119.

45. Зайратьянц О.В., Хавинсон В.Х., Кузьменко Л.Г. Продукция тимусом иммуномодулирующих полипептидов при его острой (акцидентальной) инволюции у детей // Архив патологии. — 1990. Т. 52, №1,-С. 25-28.

46. Земчихина В.Н., Голубева О.Н. Способность мезенхимных стволовых клеток к нейральной дифференцировке in vitro // Цитология. -2005. Т. 47, № 7. - С. 644-649.

47. Звенигородская Л.А., Горуновская И. Г. Особенности язвенной болезни у пожилых лиц с сопутствующей ишемической болезнью сердца // Эксперементальная гастроэнтерология. 2002 - № 3. - С. 16-21.

48. Иванов A.A., Клемпарская H.H., Шальнова Г.А. Противолучевые эффекты иммуноглобулинов. М.: Энергоатомиздат, 1990. - 176 с.

49. Ивашкин В.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей: Руководство для врачей. М.: М-Вести, 2002,- 416 с.

50. Карпов P.C., Слепушкин В.Д., Мордовии В.Ф., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Грищенко В.И. Использование препаратов эпифиза в клинической практике. Томск: Издательство томского университета -1985.- 152 с.

51. Кветная Т.В., Князькин И.В. Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии. 2-е изд. СПб: Издательство ВМедА, 2004. - 111 с.

52. Кветная Т.В., Князькин И.В., Кветной И.М. Мелатонин -нейроиммуноэндокринный маркер возрастной патологии. СПб: Деан, 2005. - 142 с.

53. Кветной И.М., Балмасова И.П. К вопросу о гуморальной регуляции в иммунной системе // Вопросы адаптации, компенсации, реабилитации при патологических процессах. Куйбышев, 1982. - С. 112.

54. Кветной И.М., Балмасова И.П., Смородинов А.П. Эндокринная функция апудоцитов иммунокомпетентных органов при некоторых формах иммунного ответа // Бюлл. экспер. биол. 1983. - № 9. - С. 78-79.

55. Кветной И.М., Южаков В.В. Диффузная эндокринная система: Руководство по гистологи. Т. 2. - СПб.: Спецлит, 2001. - 562 с.

56. Кветной И.М., Ярилин A.A., Полякова В.О., Князькин И.В. Нейроиммуноэндокринология тимуса. СПб.: Деан, 2005. — 160 с.

57. Климов П.К. Пептиды и пищеварительная система. Д.: Наука, 1983.-272 с.

58. Климов П.К. Функциональные взаимосвязи в пищеварительной системе. Л.: Наука, 1976. - 271 с.

59. Князькин И.В., Цыган В.Н. апоптоз в онкоурологии. СПб.: Наука, 2007. 240 с.

60. Кожемякин А.Л., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Участие циклазной системы в молекулярных механизмах регуляции дифференцировки иммунокомпетентных клеток // Биохимия. — 1984. — Т. 49, вып. 4. С. 658-666.

61. Коноплянников А.Г. Клеточные основы радиационных эффектов человека // Радиационная медицина. Т.1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл. 4. - М.: Изд. AT., 2004. - С. 189-277.

62. Коркушко О.В., Хавинсон В.Х., Шатило В.Б. Пинеальная железа: пути коррекции при старении. СПб.: Наука, 2006. — 205 с.

63. Коркушко О.В., Хавинсон В.Х., Бутенко Г.М., Шатило В.Б. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения. СПб.: Наука, 2002. - 202 с.

64. Коркушко О.В., Чеботарев Д.Ф., Каменовская О.Г. Гериатрия в терапевтической практике. Киев: Здоровье, 1993. — 840 с.

65. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л.: Наука, 1988.-251 с.

66. Кочеткова Н.Г. Влияние фетальных тканей на процессы инволюции тимуса в эксперименте // Успехи геронтологии. — 2008. Т.21, № l.-C. 56-61.

67. Краснянский Г.A., Рыжак Г.А. Применение пептидных биорегуляторов в комплексном лечении пародонтита. // Материалы Российской научно-практической конф. «Рациональное использование лекарств». Пермь, 2004. - С. 246-247.

68. Крыжановский Г.Н., Кабань И.Н., Магаева C.B., .Кучеряну C.B., Кабань Н.В. Болезнь Паркинсона. М.: Медицина, 2002. - 335 с.

69. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. СПб.: Наука, 1998.-310 с.

70. Лазебник Л.Б. Генез полиморбидности // Клиническая геронтология. 2001. - Т. 7, № 1-2. - С. 3-5.

71. Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю. Возрастные изменения печени (клинические и морфологические аспекты) // Клиническая геронтология. -2007. Т. 13, № 1.-С. 3-9.

72. Лазебник Л.Б. Практическая гериатрия (Избранные клинические и организационные аспекты). М., 2002. — 556 с.

73. Логинов A.C., Звенигородская Л.А., Тутемен A.B. Эффективность нового пептидного препарата иммунофана в терапии длительно незаживающих язв желудка и 12-перстной кишки // Практикующий врач. 1998. - № 2. - С. 18-20.

74. Мазурик В.К. Радиационно-химические, молекулярные и биохимические основы биологического действия излучений // Радиационная медицина. Т.1. - Теоретические основы радиационной медицины. - Гл. 3. - М.: Изд. AT, 2004. - С. 122-188.

75. Мазурик В.К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53 // Радиационная биология. Радиобиология.- 2001,- Т. 41, № 5. - С. 548572.

76. Максимов И.Б., Анисимова Г.В. Инволюционные центральныехориоретинальные дистрофии: применение пептидных биорегуляторов в комплексном лечению — Спб.: Фолиант, 2001. — 88 с.

77. Мелентьев А.С., Гасилин B.C., Гусев К.И. Гериатрические аспекты внутренних болезней. М., 1995. — 394 с.

78. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение из костного мозга, лимфоцитов и тимуса полипептидов, регулирующих процессы межклеточной кооперации в системе иммунитета // Докл. АН СССР. — 1981а.-Т. 261,№ 1.-С. 235-239.

79. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение, очистка и идентификация иммуномодулирующего полипептида, содержащегося в тимусе телят и человека // Биохимия. 19816. - Т.46, вып. 9. - С. 16521659.

80. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Иммунологическая функция тимуса // Успехи современной биологии. — 1984. — Т. 97, вып. 1. С. 3646.

81. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем цитомедины // Успехи соврем, биологии. - 1983. - Т. 96. - вып. 3. - С. 339-352.

82. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы в профилактике и лечении возрастной патологии // Успехи геронтологии. -1997.-№ 1.-С. 74-79.

83. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения). СПб.: Наука, 1996.-74 с.

84. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1985. - № 4. - С. 581-587.

85. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. СПб.: Наука, 2000. - 158 с.

86. Науменко Е.В. Центральная регуляция гипофизарно-надпочечникового комплекса. Д.: Наука, 1971. - 162 с.

87. Науменко Е.В., Попова Н.К. Серотонин и мелатонин в регуляции эндокринной системы. Новосибирск: Наука, 1975. - 218 с.

88. Новиков B.C., Булавин Д.В., Цыган В.Н. Программированная клеточная гибель. Глава 2. — под. ред. Новикова B.C. - СПб.: Наука, 1996.-276 с.

89. Офтальмогериатрия /Под ред. H.A. Пучковской; Амн СССР. -М.: Медицина, 1982. 304 с.

90. Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуноэндокринологии. М.: Медицина, 2006. - 384 с.

91. Петров Р.В., Михайлова A.A., Фонина JI.A., Степаненко Р.Н. Миелопептиды. М.: Наука, 2000. - 181 с.

92. Поворознюк В.В., Нейко Е.М., Головач И.Ю. Глюкокортикоид-индуцированный остеопароз // JliK. Справа. 1996. — Т. 5. — С. 34-41.

93. Полякова В.О., Кветной И.М. Тимус и старение (Нейроиммуноэндокринные механизмы). СПб.: Система, 2004. - 104 с.

94. Протасова Т.Г. Патологическая анатомия острой лучевой болезни // Радиационная медицина. Т.2. - Радиационные поражения человека. - Гл. 6. - М.: Изд. AT, 2001. - С. 142-160.

95. ЮО.Прощаев К.И., Ильницкий А.Н., Коновалов С.С., Хавинсон В.Х. Избранные лекции по гериатрии. СПб., 2008. - 784 с.

96. Полякова В.О., Квктной И.М., Хавинсон В.Х., Марьянович А.Т., Коновалов С.С. Тимус и старение // Успехи геронтологии. — 2001. вып. 8.-С. 50-57.

97. Потапенко А.И. Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином. Автореф. дис. докт. биол. наук. - М.: МГУ, 1999.-34 с.

98. Райхлин Н.Т., Кветной И.М., Соломатина Т.М. APUD-система и гормональные основы деятелности желудочно-кишечного тракта // Сов. мед. 1983. -№ 6. - С. 53-59.

99. Розум В.М. Эпифиз (шишковидное тело) и АПУД-система // Бюллетень экспериметальной биологии. 1990. - Т. 110, № 11. - С. 545548.

100. Рыбников В.Ю., Закуцкий Н.Г. Пептидная регуляция функций мозга / Под ред. В. X. Хавинсона. СПб.: Фолиант, 2000. - 40 с.

101. Рыжак Г.А., Коновалов С.С. Геропротекторы в профилактике возрастной патологии СПб.: Прайм-еврознак, 2004. — 160 с.

102. Самойлов В.И., Васильев Ю.М. Механизмы социального поведения тканевых клеток позвоночных: культуральные модели // Журнал общей биологии. 2009. - Т. 70, № 3. - С. 239-244.

103. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. СПб.: Спецлит, 2007. -560 с.

104. Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам гомеостаза. М.: Медицина. - 1977. -351 с.

105. Саркисов Д.С., Пальцын A.A., Втюрин Б.В. Приспособительная перестройка биоритмов. М.: Медицина, 1975. - 182 с.

106. Сафарова Г.Л. Демография старения: современное состояние иприоритетные направления исследований // Успехи геронтологии. — 2009. -Т. 22, № 1.-С. 49-60.

107. Селидовкин Г.Д. Лечение и профилактика острой лучевой болезни от внешнего облучения // Радиационная медицина. Т.2. Радиационные поражения человека. - Гл. 5. - М.: Изд. AT, 2001а. - С. 129141.

108. Селидовкин Г.Д. Острая лучевая болезнь // Радиационная медицина. Т.2. - Радиационные поражения человека. - Гл. 4. - М.: Изд. AT, 20016. - С. 62-107.

109. Смирнов B.C., Хавинсон В.Х., Яковлев Г.М. , Новиков B.C. Коррекция радиационных иммунодефицитов. — СПб.: Наука. 1992. — 32 с.

110. Трофимов A.B. Функциональная морфология старения // Успехи геронтологии. 2009. - Т.22, № 3. - С. 401-408.

111. Трофимова C.B., Максимов И.Б., Нероев В.В. Регуляторное действие пептидов сетчатки. — СПб.: Фирма Коста, 2004. — 160 с.

112. Трофимова C.B., Хавинсон В.Х. Сетчатка и старение // Успехи геронтологии. 2002. - вып. 9. — С. 79-82.

113. Суханов А.Д., Голубева О.Н. Концепции современного естествознания.- М.: Дрофа, 2006. 256 с.

114. Уголев A.M., Ефимова Н.В., Скворцова Н.Б. Функции кишечной гормональной (энтериновой) системы // Успехи физиол. наук. 1976а. -Т. 7, № 3. - С. 6-33.

115. Уголев A.M., Скворцова Н.Б. Непищеварительные функциикишечной гормональной системы (физиологическое значение и клинические проблемы) // Клин. мед. 19766. - № 3. - С. 15-22.

116. Турчанинова Л.Н., Колосова Л.И., Малинин В.В., моисеева А.Б., Ноздрачев А.Д., Хавинсон В.Х. Влияние тетрапептида кортагена на регенерацию седалищного нерва // Бюллетень экспериментальной биологии и имедицины. 2000. — Т. 130, № 12. — С. 654-656.

117. Уголев A.M., Скворцова Н.Б. Непищеварительные функции кишечной гормональной системы (физиологическое значение и клинические проблемы) // Клин. мед. 19766. - № 3. - С. 15-22.

118. Уголев A.M. Энтериновая (кишечная) гормональная система -Л.: Наука, 1978.

119. Филев Л.В., Гуревич К.Я., Шелухин В.А., Хавинсон В.Х., Белоцерковская Э.А. Функционально-морфологические особенности лимфопоэза при травматической болезни // Вестник хирургии. 1984. -Т. 133, №7.-С. 83-85.

120. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука. -2009. - 50 с.

121. Хавинсон В.Х. Способ получения пептидов, обладающих тканеспецифической активностью, и фармацевтические композиции на их основе // Патент РФ № 2161501. 2001 а.

122. Хавинсон В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 20016. - Т. 132, № 8. - С. 228-229.

123. Хавинсон В.Х. Тетрапептид, обладающий геропротекторной активностью, фармакологическое средство на его основе и способ его применения. Патент РФ № 2157233. 1999.

124. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Пептидная регуляция старения: 35-летний опыт исследований // Бюллетень экспериментальной биологии имедицины. 2009. - Т. 148, № 7. - С. 108-113.

125. Хавинсон В.Х., Анисимов C.B., Малинин В.В., Анисимов В.Н. Пептидная регуляция генома и старение. — М.: Издательство РАМН, 2005. -208 с.

126. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян A.B., Малинин В.Г. Свободнорадикальное окисление и старение.- СПб.: Наука, 2003а.- 327 с.

127. Хавинсон В.Х., Жуков В.В. Пептиды тимуса и механизмы иммуномодуляции // Успехи современной биологии. — 1992а. Т. 112, вып. 4. - С. 554-570.

128. Хавинсон В.Х., Кветной И.М. Пептидные биорегуляторы ингибируют апоптоз // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. - Т. 130, № 12. - С. 657-659.

129. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Ашмарин И.П. Пептидэргическая регуляция гомеостаза // Успехи современной биологии. — 2002а. — Т. 122, №2.-С. 190-203.

130. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Ингель И.Э., Марьянович А.Т. Возрастная инволюция органов и тканей // Успехи физиологических наук. 20036. - Т. 34, № 1. - С. 79-92.

131. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Коновалов С.С. Пептидэргическая регуляция гомеостаза. СПб.: Наука, 2003в. - 194 с.

132. Хавинсон В.Х., Коновалов С.С. Избранные лекции по геронтологии. СПб., 2008а. - 896 с.

133. Хавинсон В.Х., Коновалов С.С., Южаков В.В., Попучиев В.В.,

134. Кветной И.М. Модулирующее влияние эпиталамина и эпиталонпа на функциональную морфологию селезенки старых пинеалэктомированных крыс // Бюллетень эксп. биологии и медицины. — 2001а. Т. 131, № 3. - С. 338-346.

135. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Механизмы геропротекторного действия пептидов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 20026. Т. 133.-С. 4-10.

136. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидная регуляция иммунобиологических механизмов старения // Аллергология и иммунология. 20086. - Т. 9, № 4. - С. 443-444.

137. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения. — СПб.: Фолиант, 20016. 160 с.

138. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Препараты эпифиза и тимуса в геронтологии. СПб.: Фолиант, 19926. - 50 с.

139. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Малинин В.В. Молекуцлярная физиология старения // Успехи геронтологии. 2001в. - вып. 7. - С. 6571.

140. Хавинсон В.Х., Серый C.B., Малинин В.В. Коррекция пептидами тимуса и костного мозга радиационных нарушений иммуно- и гемопоэза // Радиобиология. 1991. - Т. 31, вып. 4. - С. 501-505.

141. Хелимский A.M. Эпифиз (шишковидная железа). М.: Медицина, 1963.- 187 с.

142. Хлыстова З.С., Калинина И.И., Хавинсон В.Х. Динамика локализации тималина в клетках тимуса человека в эмбриогенезе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989. - Т. 108, № 12.-С. 743-746.

143. Хлыстова З.С., Калинина И.И., Хавинсон В.Х. Участие эпидермиса кожи в системе иммуногенеза у человека // Иммунология. — 1994. -№3.- С. 25-28.

144. Хмельницкий O.K., Гринцевич И.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние тималина на морфофункциональное состояние вилочковой железы у мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1982. - Т. 94, № 9. - С. 120-122.

145. Хмельницкий O.K., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Изменение гистологической структуры органов иммуногенеза при воздействии иммуномодуляторов // Архив патологии. 1986. - Т. 48, вып. 5. - С. 4953.

146. Чазов Е.И., Исаченков В.А. Эпифиз: место и роль в системе нейроэндокринной регуляции. М.: Наука, 1974. - 238 с.

147. Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х., Давьтденко В.В., Доровский A.A., Вербовая Т.А., Пеннияйнен В.А. Влияние цитомединов на развитие органотипической культуры различных тканей внутренних органов крысы // Цитология. 2000. - Т. 42, № 12. - С. 1144-1147.

148. Шапорт B.C., Шелепов В.П. О взаимосвязях и ипусковых механизмах расстройств гомеостаза в опухолевом организме // Арх. Патологии. 1983. - Т. 45, №> 8. - С. 3-12.

149. Шатаева Л.К., Хавинсон В.Х., Ряднова И.Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы). — СПб.: Наука, 2003. -222 с.

150. Шерешевская О.И. Старение глаз. М.: Медицина, 1970. - 148 с.

151. Шульпина Н.Б. Биомикроскопия глаза. М.: Медицина, 1974ю -216 с.

152. Южаков В.В., Райхлин Н.Т., Кваетной И.М., Яковлева Н.Д., Курилец Э.С., Манохина Р.П. Слоаременные методы изучения функциональной морфологии эндокринных клеток // Арх. патологии. -1996.-Т. 58, №2.-С. 21-28.

153. Южаков В.В., Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Фомина Н.К., Кузнецова М.Н. Кинетика роста и функциональная морфология саркомы М-1 у интактных крыс и после гамма-облучения // Вопросы онкологии. — 2001.-Т. 47, №3.-С. 328-334.

154. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. — 608с.

155. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы // Иммунология. — 1996. №1. - С. 4-10.

156. Яцемирская P.C., Беленькая И.Г. Социальная геронтология. М.: Владос, 2003.-224 с.

157. Abdul Н.М., Furman J.L., Sama М.А., Mathis D.M., Norris C.M. NFATs and Alzheimer's Disease // Mol Cell Pharmacol. 2010. - Vol. 2, N 1. -P 7-14.

158. Akazawa Y., Cazanave S., Mott J.L., Elmi N., Bronk S.F., Kohno S., Charlton M.R., Gores G.J. Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocyte lipoapoptosis // J. Hepatol. 2010. - Vol. 52, N4.-P. 586-593.

159. Alison M.R. Assessing cellular proliferation: what's worth measuring? //Hum. Exper. Toxicol. 1995. - Vol. 14. - P. 935-944.

160. Andres V., Gonzalez J.M. Role of A-type lamins in signaling,transcription, and chromatin organization // J. Cell Biol. 2009. - Vol. 187, N 7.-P. 945-957.

161. Anisimov V.N., Bondarenko L.A., Khavinson V.K. Effect of pineal peptide preparation (epithalamin) on life span and pineal and serum melatonin level in old rats // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992. - Vol. 673. - P. 53-57.

162. Anisimov V.N., Mylnikov S.V., Khavinson V.K. Pineal peptide preparation epithalamin increases the lifespan of fruit flies, mice and rats // Mech. Ageing Dev.- 1998.-Vol. 103.-P. 123-132.

163. Anisimov V.N., KhavinsonV.K., Morzov V.G. Twenty years of study ' on effects of pineal peptide preparation: epithalamin in experimentalgerontology and oncology // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 719. - P. 483-493.

164. Arking R. Biology of aging. Observations and principles. 2nd edit. -Sunderland: Sinauer, 1998. 486 p.

165. Asashima M., Nalcano H., Shimada K., Kinoshita K., Ishii K., Shibai H., Ueno N. Mesodermal induction in early amphibian embryos by actin A (erytroid differentiation factor) // Roux's Arch. Dev. Biol. 1990. - Vol. 198. -P. 330-335.

166. Aw D., Silva A.B., Palmer D.B. The effect of age on the phenotype and function of developing thymocytes // J. Comp. Pathol. 2010. - Suppl. 1. -P. S45-59.

167. Bach A.G., Miihlbauer E., Peschke E. Adrenoceptor expression and diurnal rhythms of melatonin and its precursors in the pineal gland of type 2 diabetic goto-kakizaki rats // Endocrinology. 2010. - Vol. 151, N 6. - P. 2483-2493.

168. Banks P.A., Conwell D.L., Toskes P.P. The management of acute and chronic pancreatitis // Gastroenterol Hepatol N.Y. 2010. - Vol. 6, N 2. -Suppl. 3. - P. 1-16.

169. Barcellos-Hoff M.H., Brooks A.L. Extracellular signaling via the microenvironment: a hypothesis relating carcinogenesis, bystander effects and genomic instability // Radiat. Res. 2001. - Vol. 156. - P. 618-627.

170. Barcellos-Hoff M.H., Park C., Wright E.G. Radiation and the microenvironment-tumorigenesis and therapy // Nat. Rev. Cancer. 2005.-Vol. 5,N 11. - P. 867-875.

171. Benitez S., Sosa C., Tomasini N., Macias A. Both JNK and apoptosis pathways regulate growth and terminalia rotation during Drosophila genital disc development // Int. J. Dev. Biol. 2010,- Vol. 54, N 4. - P. 643-653.

172. Bergonie J., Tribondeau L. De quelques résultats de la radiothérapie et essai de fixation dune technique rationelle // CR des Seances de' Acad. des Sci. 1906. - V. 143. - P. 983-985.

173. Bernstein S., Smith Lois E.H., Somilari Richard I., Guo Yan Age

174. Related retinal gene expression changes and ARMD // Abst. of Conference on «Aging retina and early degeneration». Boston, 2001. - P. 28.

175. Berthiaume F., Aparico C.L., Eungdamroung J., Yarmush M.L. Age-and disease-related decline in immune function: an opportunity for "thymus-boosting" therapies // Tissue Eng. 1999. - Vol. 5, N 6. - P. 499-514.

176. Borjigin J., Li X., Snyder S.H. The pineal gland and metationin: molecular and pharmacologic regulation // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. -1999.-Vol. 39.-P. 53-65.

177. Bristow R.G., Hill R.P. Comparison between in vitro radiosensitivity and in vivo radioresponse following fractionated treatment and in vitro/in vivo correlations // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1990. Vol. 18. -P. 331-345.

178. Bolus N.E. Basic review of radiation biology and terminology // J. Nucl. Med. Technol. 2001. - Vol. 29. - P. 67-73.

179. Bressler N.M., Bressler S.B. Preventive ophthalmology: age-related macular degeneration // Ophthalmology. 1995. - Vol. 102. -P. 1206-1211.

180. Browder T., Butterfield C.E., Kralig B.M., Shi B., Marshall B., O'Reilly M.S., Folkman J. Antiangiogenic scheduling of chemoterapy improves efficacy against experimental drug-resistantcancer // Cancer Res. — 2000. Vol. 60,N7.-P. 1878-1886.

181. Buchter, M., Halter, F., Uht, W. Pancreatic Diseases: New Horizons // Digestive Surgery 1994. -Vol. 11, N 3-6. - P. 459-468.

182. Calhoun M.E., Wiederhold K.H., Amramowski D., Phinney A.L., Probst A., Sturchler-Pierrat C. Neuron loss in APP transgenic mice // Nature. -1998. Vol. 395. - P. 755-756.

183. Chaigne-Delalande B., Moreau J.F., Legembre P.Rewinding the DISC // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2008. - Vol. 56, N 1. - P. 9-14.

184. Cho D.H., Nakamura T., Lipton S.A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration // Cell Mol Life Sci. 2010. - Vol. 132. - P. 5662.

185. Cocburn D. Retinitis pigmentosa: Av rewiew of the tapeto-retinal dystrophies // Amstr. J. Ophtomet. 1985. - Vol. 68. - P. 138-143.

186. Cremesti A.E., Goni F.M., Kolesnick R. Role of sphingomyelinase and ceramide in modulating rafts: do biophysical properties determine biologic outcome? // FEBS Lett. 2002. Vol. 531, N 1. - P. 47-53.

187. Dickon D.W. The pathogenesis of senile plaques // J. Neuropathol.

188. Exp. Neurol. 1997. - Vol. 56. - P. 321-339.

189. Dilman V.M., Anisimov V.N., Ostroumova M.N., Khavinson V.K., Morozov V.G. Increase in lifespan of rats following polypeptide pineal extract treatment // Exp. Pathol. (Jena). 1979. - Vol. 17, N 9. - P. 539-545.

190. Dysken M.W., Falk A., Pew B., Kuskowski M., Krahn D.D. Gender differences in TRH-stimulated TSH and prolactin in primary degenerative dementia and eldery controls // Biol. Psychiatry. 1990. - Vol. 28. - P. 144150.

191. Duszczyszyn D.A., Williams J.L., Mason H., Lipiere Y., Antel J., Haegert D.G. Thymic involution and proliferative T-cell responses in multiple sclerosis//J. Neuroimmunol. 2010. -Vol. 15, N 1-2.-P. 73-80.

192. El-Sokkary G.H., Reiter R.J., Abdel-Ghaffar S.K. Melatonin supplementation respores cellular proliferation and DNA syntesis in the splenic and thymic lymphocytes of old rats // Neuroendocrinol. Lett. 2003. - Vol. 24, N3-4.-P. 215-223.

193. Elvevold K., Smedsrod B., Martinez I. The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity // Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2008b. - Vol. 294, N 2. - P. G391-400.

194. Engedal N., Auberger P., Blomhoff H.K. Retinoic acid regulates Fas-induced apoptosis in Jurkat T cells: reversal of mitogen-mediated repression of Fas DISC assembly // J. Leukoc Biol. 2009. - Vol. 3. - P. 469480.

195. Fabris N., Vocchegiani E., Provinciali M. Plasticity of neuroendocrine-thymus interaction during aging // Exp. Gerontol. 1997. -Vol. 32, N4-5.-P. 415-429.

196. Falcon J., Besseau L., Fuentes M., Sauzet S., Magnanou E., Boeuf G. Structural and functional evolution of the pineal melatonin system in vertebrates // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2009. -Vol. 63. P. 101-111.

197. Friedman N.J., Pineda R., Kaiser P.K. The Massachusetts eye and ear infirmary illustrated manual of ophtalmology. USA, Philadelphia. -1998. -432 p.

198. Fujikura Y., Wang Y.H., Tsuchida M. Morphological and flow cytofluorometrical analyses of regenerated rat thymus after irradiation // Arch. Histol. Cytol. 1997. - Vol. 60, N 1. - P. 79-87.

199. Galand P., Degraef C. Cyclin/PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labelling for marking S phase cells in paraffin sections from animal and human tissues // Cell & Tissue Kinetics.-1989. Vol. 22, N 5. - P. 383-392.

200. Gardner T.B., Levy M.J. EUS diagnosis of chronic pancreatitis // Gastrointest Endosc. 2010. - Vol. 71, N 7. - P. 1280-1289.

201. Gerdes J., Shwab U., Lemke H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation // Int. J. Cancer. 1983. - Vol. 31. - P. 3-20.

202. Gratzner H.G. Monoclonal antibody to 5-bromo and 5-iododeoxyuridine: a new reagent for detection of DNA replication // Science. -1982. Vol. 218. - P. 474-475.

203. Gu X.L., Long C.X., Sun L., Xie C., Lin X., Cai H. Astrocytic expression of Parkinson's disease-related A53T alpha-synuclein causes neurodegeneration in mice //Mol. Brain. 2010. - Vol. 3, N 12. - P. 235-242.

204. Hall E.J., Giaccia A.J. Acute effects of total-body irradiation // Radiobiology for the radiobiologist, 6th ed., Lippincott Co. Philadelphia-Tokyo. -2006a.-P. 117-128.

205. Hall E.J., Giaccia A.J. Clinical response of normal tissues // Radiobiology for the radiobiologist, 6th ed., Lippincott Co. Philadelphia-Tokyo. 2006b. - P. 327-348.

206. Han D., Ding Y., Liu S.L., Wang G., Si I.C., Wang X., Cui L., Huang D. Double role of Fas ligand in the apoptosis of intervertebral disc cells in vitro // Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai). 2009. - Vol.41, N 11. - P. 938-947.

207. Harlin H., Reffey S.B., Duckett C.S., Lindsten T., Thompson C.B. Characterization of XIAP-deficient mice // Mol. Cell Biol. 2001. - Vol. 21, N 10.-P. 3604-3608.

208. Harman D. Aging and disease: extending functional life span // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1996a. - Vol. 786. - P. 321-336.

209. Harman D. A hypothesis on the pathogenesis of Alzheimer's disease // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1996b. - Vol. 786. - P. 152-68.

210. Haynes B.F., Markert M.L., Sempowski G.D. The role of the thymus in immune reconstitution in aging, bone marrow transplantation and HIV-1 infection // Annu. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 18. - P. 529-560.

211. Hoffmann J.C., Pappa A., Krammer P.H., Lavrik I.N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation // Mol. Cell Biol. 2009. -Vol. 16. - P. 4431-4440.

212. Huh H, Lee Y.J., Kim J.H., Kong M.H., Song K.Y., Choi G. The Effects of TWEAK, Fnl4, and TGF-betal on Degeneration of Human Intervertebral Disc // J. Korean Neurosurg Soc. 2010. - Vol. 47, N 1. - P. 3035.

213. Hussein N.R. Helicobacter pylori and gastric cancer in the Middle East: A new enigma? // World J. Gastroenterol. 2010. - Vol. 16, N 26. - P. 3226-3234.

214. Justino L., Kergoat H., Kergoat M.J. Changes in the retonocortical evoked potentials in subjects 75 years of age and older // Clin. Neurophysiol. — 2001.-Vol. 112, N7.-P. 1343-138.

215. Kamisawa T., Takuma K., Egawa N., Tsuruta K., Sasaki T. Autoimmune pancreatitis and IgG4-related sclerosing disease // Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 2010. -Vol. 7. - P. 401-409.

216. Katsanos K.H., Tatsioni A., Tsakiris V., Christodoulou D., Tsianos E.V. Helicobacter pylori is a major public health priority in western Balkans: An endoscopy referral center experience // Eur. J. Intern. Med. 2010. - Vol. 21, N4. -P. 306-309.

217. Kelley K.W., Davila D.R., Brief S., Simon J., Arkins S. A pituitary-thymus connection during aging // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1988. - Vol. 521. -P. 88-98.

218. Khavinson V. Kh. Peptides and aging // Neuroendocrinology Lett. — 2002. Vol. 23. - Suppl. 3. - Special Issue. - 144 p.

219. Khavinson V. Kh., Goncharova N., Lapin B. Synthetic tetrapeptide epitalon restores disturbed neuroendocrine regulation in senescent monkeys // Neuroendocrinol. Lett. 2001. - Vol. 22. - P. 251-254.

220. Khavinson V.Kh., Izmaylov D.M., Obukhova L.K., Malinin V.V. Effect of Epitalon on the lifespan increase in Drosophila malanogaster // Mech. Aging. Dev.-2000.-Vol. 120.-P. 141-149.

221. Khavinson V.Kh., Malinin V.V., Trofimova S.V., Zemchikhina V.N. Inductive activity of retinal peptides // Bull. Exp. Biol. Med. 2002. -Vol. 134, N5.-P. 482-484.

222. Kelly R.D., Alberio R., Campbell K.H. A-type lamin dynamics in bovine somatic cell nuclear transfer embryos // Reprod. Fertil. Dev. 2010. — Vol. 22, N6.-P. 956-965.

223. Kim A., Kilimnik G., tiara M. In situ quantification of pancreatic beta-cell mass in mice // J. Vis. Exp. 2010. - Vol. 40. - P. 425-429.

224. Kim N.H., Oh M.K., Park H.J., Kim I.S. Auranofm, a Gold(I)-Containing Antirheumatic Compound, Activates Keapl/Nrf2 Signaling via Racl/iNOS Signal and Mitogen-Activated Protein Kinase Activation // J. Pharmacol Sei.-2010.-Vol. 113,N3.-P. 246-254.

225. Kriegebaum C., Gutknecht L., Schmitt A., Lesch K.P., Reif A. Serotonin now: Part 1. Neurobiology and developmental genetics // Fortschr. Neurol. Psychiatr.-2010.-Vol. 78, N 6. P. 319-331.

226. Leigh B.R., Khan W., Hancock S.L., Knox S.J. Stem cell factor enhances the survival of murine intestinal stem cells after photon irradiation II Radiat. Res. 1995. - Vol. 142, N.l. - P. 12-15.

227. Lionetto M.G., Giordano M.E., Calisi A., Caricato R., Hoffmann E., Schettino T. Role of BK channels in the apoptotic volume decrease in nativeeel intestinal cells // Cell Physiol. Biochem. 2010. - Vol. 25, N 6. - C. 733744.

228. Lopashov G.V., Zemchikhina V.N. Hierarchy of inductive events // Dev. Growth. Differ. 1997. - Vol. 39, N 6. - P. 661-665.

229. Lopez-Munoz F., Marin F., Alamo C. The historical background of the pineal gland: II. From the seat of the soul to a neuroendocrine organ // Rev. Neurol.-2010.-Vol. 50, N2.-P. 117-125.

230. Lundy S.K., Fox D.A. Reduced Fas ligand-expressing splenic CD5+ В lymphocytes in severe collagen-induced arthritis // Arthritis Res. Ther. 2009. -Vol. 11, N. 4. -P. 123-129.

231. Mallik M., Lakhotia S.C. The developmentally active and stress-inducible noncoding hsromega gene is a novel regulator of apoptosis in Drosophila // Genetics. 2009. - Vol. 183, N 3. - P. 831-852.

232. Martin F.A., Perez-Garijo A., Morata G. Apoptosis in Drosophila: compensatory proliferation and undead cells // Int. J. Dev. Biol. 2009. - Vol. 53, N8-10.-P. 1341-1347.

233. Meltzer C.C., Smith G., DeKosky S.T., Pollock B.G., Mathis C.A., Moore R.Y. Serotonin in aging, late-life depression, and Alzheimer's disease: the emerging role of functional imaging //Neuropsychopharmacology. 1998. -Vol. 18.-P. 407-430.

234. Miyachi K., Fritzler M.J., Tan E.M. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells. // J. Immunol. 1978. - Vol. 121. - P. 2228-2234.

235. Moraes A.S., Mondin M., Beletti M.E., Aguiar-Perecin M.L., Guaraldo A.M., Mello M.L. Age-related association of rDNA and telomeres with the nuclear matrix in mouse hepatocytes // Cell Biol. Int. 2010. — Vol. 23.-P. 321-328.

236. Moran A.P. The Role of Endotoxin in Infection: Helicobacter pylori and Campylobacter jejuni // Subcell Biochem. 2010. - Vol. 53. - P. 209-240.

237. Moreno S., Ferraro E., Eckert S., Cecconi F. Apafl reduced expression levels generate a mutant phenotype in adult brain and skeleton // Cell Death Differ. 2002. - Vol. 9, N 3. - P. 340-342.

238. Morozov V.G., Khavinson V. Kh. Natural and syntetic thymic peptides as therapeutics for immune dysfunction // Int. J. Immunopharmacol. -1997.-Vol. 19.-P. 501-505.

239. Motta-Ramirez G., Ortiz-Leon J., Urbina De la Vega F., Mejia-Nogales R., Barinagarrenteria-Aldatz R. Duodenal diverticular disease as incidental finding in computed tomography // Rev. Gastroenterol Mex. 2010. -Vol. 75, N2.-P. 165-170.

240. Mustapha N.M., Tarr J.M., Kohner E.M., Chibber R. NADPH Oxidase versus Mitochondria-Derived ROS in Glucose-Induced Apoptosis of Pericytes in Early Diabetic Retinopathy // J. Ophthalmol. 2010. - P. 346-353.

241. Nakasu S., Nakasu Y., Fukami T., Matsuda M. Immunohistochemical proliferation markers may overestimate the growth potential after ionizing radiation // Neurol. Med. Chir. 2003.- Vol. 43. - P. 521-527.

242. Neufeld A. Aging is risk factor for the loss of retinal ganglion cell // Abst. of Conference on «Agig retina and early degeneration». — Boston, 2001. -P. 23.

243. Ng C.P., Zisman A., Bonavida B. Synergy is achieved by complementation with Apo2L/ TRAIL and actinomycin D in Apo2L/ TRAIL-mediated apoptosis of prostate cancer cells: role of XIAP in resistance // Prostate. 2002. - Vol. 53, N 4. - P. 286-299.

244. Nipic D., Pirc A., Banic B., Suput D., Milisav I. Preapoptotic cell stress response of primary hepatocytes // Hepatology. 2010. - Vol. 51, N 6. — P. 2140-2151.

245. Olsson M., Vakifahmetoglu H., Abruzzo P.M., Hogstrand K., Grandien A., Zhivotovsky B. DISC-mediated activation of caspase-2 in DNAdamage-induced apoptosis // Oncogene. 2009. - Vol. 28, N 18. - P. 19491959.

246. Orr W.C., Sohal R.S. Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster // Science. -1994.-Vol. 263(5150).-P. 1128-1130.

247. Pariente A., Pinet M., Moride Y., Merlière Y., Moore N., Fourrier-Réglat A. Factors associated with persistence of cholinesterase inhibitor treatments in the elderly // Pharmacoepidemiol Drug Saf. 2010. - Vol. 19, N 7.-P. 680-686.

248. Parihar A., Parihar M.S., Nazarewicz R., Ghafourifar P. Importance of cytochrome c redox state for ceramide-induced apoptosis of human mammary adenocarcinoma cells // Biochim Biophys Acta. — 2010. N 7. - P. 646-654.

249. Pawlik T., Keomarsi K. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004. Vol. 59. - P. 928942.

250. Penit C., Ezine S. Cell proliferation and thymocyte subset reconstitution in sublethally irradiated mice: compared kinetics of endogenous and intrathymically transferred progenitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989. Vol. 86, N 14. - P. 5547-5551.

251. Pierrefiche G., Laborit H. Oxygen free radicals, melatonin, and aging // Exp. Gerontol. 1995. - Vol. 30, N 3-4. - P. 213-227.

252. Price D.L., Walker L.C., Martin L.J., Sisodia S.S. Amiloidosis in aging and Alzheimer's disease // Am. J. Pathol. 1992. - Vol. 141. - P. 767772.

253. Polak J.M., Bloom S.R. J. Immunocytochemistry of the diffuse neuroendocrine system // Immunocytochemistry: modern methods and applications / Eds. J. Polak, S. Van Noorden. John Wrihgt and Sons 1986. -Vol. 27, N 10.-P. 328-248.

254. Potten C.S. Interleukin-11 protects the clonogenic stem cells in murine small-intestinal crypts from impairment of their reproductive capacity by radiation // Intern. J. Cancer. 1995. - Vol. 62, N 3. - P. 356-361.

255. Raikhlin N.T., Kvetnoy I.M. The APUD system (diffuse endocrine system) in normall and pathological states // Physiol. Gen. Biol. Rev. 1994. -Vol. 8, N4.-P. 1-44.

256. Rajesh G., Girish B.N., Vaidyanathan K., Saumya M., Balakrishnan V. Folate deficiency in chronic pancreatitis // JOP. 2010. - Vol. 11, N 4. - P. 409-410.

257. Reiter R.J., Tan D.X., Fuentes-Broto L. Melatonin: a multitasking molecule//Prog. Brain Res.-2010.-Vol. 181.-P. 127-151.

258. Rose A., Grandoch M., Vom Dorp F., Rubben H., Rosenkranz A., Fischer J.W., Weber AA. Stimulatory effects of the multi-kinase inhibitor sorafenib on human bladder cancer cells // Br. J. Pharmacol. 2010. - Vol. 160, N7.-P. 1690-1698.

259. Roy A., Hong J.H., Lee J.H., Lee Y.T., Lee B.J., Kim K.S. In vitro activation of procaspase-8 by forming the cytoplasmic component of the death-inducing signaling complex (cDISC) // Мої. Cells. 2008.-Vol. 26, N 2. - P. 165-170.

260. Ruckert F., Samm N., Lehner A.K., Saeger H.D., Grutzmann R., Pilarsky C. Simultaneous gene silencing of Bcl-2, XIAP and Survivin re-sensitizes pancreatic cancer cells towards apoptosis // BMC Cancer. 2010. — Vol. 10, N 1.-P. 379-384.

261. Ryzhak G.A., Rutkovskaya V.N. Complex administration of peptide geroprotectors for the prevention of age-related pathology // Advances in Gerontology. 2007. - Vol. 20, N 3. - P. 173-174.

262. Salvesen G.S., Riedl S.J. Structure of the Fas/FADD complex: a conditional death domain complex mediating signaling by receptor clustering // Cell Cycle. 2009. -Vol. 8, N 17. - P. 2723-2727.

263. Sarks S.H. Agreeing and degeneration in the macular region. A clinico-pathological study // Brit. J. Ophthalmol. 1976. - Vol. 60, N 5. - P. 324-341.

264. Sastry P.S., Rao K.S. Apoptosis and the nervous system // J. Neurochem. 2000. - Vol. 74. - P. 1-20.1. V*

265. Schoumacher M., Goldman R.D., Louvard D., Vignjevic D.M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia // J. Cell Biol. 2010. - Vol. 189, N 3. - P. 541556.

266. Shilo K., Mani H., Deshpande C., Ozbudak I.H., Travis W.D., Galvin J.R., Franks T.J. Diffuse thymic fibrosis: histologic pattern of injury or distinct entity? // Am. J. Surg Pathol. 2010. - Vol. 34, N 2. - P. 211-215.

267. Seong J., Kim S.H., Lee W.J., Suh C.O., Min J.S. Strain-specific differences in radiation-induced apoptosis in murine tissues // J. Korean. Cancer Assoc. 1997. - Vol. 30. - P. 1259-1268.

268. Sewerynek E., Melchiorri D., Chen L., Reiter R.J. Melatonin reduces both basal and bacterial lipopolysaccharide-induced lipid peroxidation in vitro // Free Radic. Biol. Med. 1995. - Vol. 19, N 6. - P. 903-909.

269. Singh S., Kumar S., Dikshit M. Involvement of the mitochondrial apoptotic pathway and nitric oxide synthase in dopaminergic neuronal death induced by 6-hydroxydopamine and lipopolysaccharide // Redox. Rep. -2010. -Vol. 15,N3.-P. 115-122.

270. Singh R., Wang Y., Schattenberg J.M., Xiang Y., Czaja M.J. Chronic oxidative stress sensitizes hepatocytes to death from 4-hydroxynonenal by JNKc-Jun overactivation // Am. J. Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009. - Vol. 297, N 5. - P. G907-917.

271. Smith J.C., Price B.M.G., Van Nimmen K., Huylibroeck D. Identification of a potent Xenopus mecoderm-inducing factor as a gomologue of actin A // Nature. 1990.-Vol. 345.-P. 732-734.

272. Snow A.L., Pandiyan P., Zheng L., Krummey S.M., Lenardo M.J. The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases // Immunol. Rev. 2010. - P. 68-82.

273. Suever J.D., Chen Y., McDonald J.M., Song Y.Conformation and free energy analyses of the complex of calcium-bound calmodulin and the Fas death domain//Biophys J. 2008. - Vol. 95, N 12.-P. 5913-5921.

274. Thomas S., Mayer L., Sperber K. Mitochondria influence Fas expression in gpl20-induced apoptosis of neuronal cells // Int. J. Neurosci. -2009.-Vol. 119, N2. -P. 157-165.

275. Tiedemann H. Substances with morphogenetic activity in différenciation vertebrates // The Biochemistry of Animal Development. -1975.-Vol. 111.-P. 258-287.

276. Tiedemann H., Becker U. Uber die primaren Schritte bai der embryonalen Induction // Embriologia. 1961. - Vol. 6. - P. 204-218.

277. Tudek B., Winczura A., Janik J., Siomelc A., Foksinski M., Olinski R. Involvement of oxidatively damaged DNA and repair in cancer development and aging // Am. J. Transi. Res. 2010. - Vol. 2, N 3. - P. 254284.

278. Tuvignon N., Abousalham A., Tocques F., De Caro J., De Caro A., Laugier R., Carrière F. Development of an indirect method for measuring porcine pancreatic lipase in human duodenal fluid // Anal. Biochem. 2008. -Vol. 383, N2.-P. 289-295.

279. Uchiyama H., Nakamura T., Komazaki S., Takio K., Asashima M., Sugino H. Localization of activin and follistatin proteins in the Xenopus oocyte // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 202, N 1. - P. 484-489.

280. Wang Y.-H., Tokuda N., Tamechika M., et. al. Vascular and stromal cell changes in irradiated and recovering rat thymus // Histol. Histopathol. 1999. - Vol. 14. - P. 791-796.

281. Wood R.D., Shivji M.K.K. Which DNA polymerases are used for DNA-repair in eukariotes? // Carcinogenesis. 1997. - Vol. 18. - P. 605-610.

282. Wu M., Wang B., Fei J., Santanam N., Blough E.R. Important roles of Akt/PKB signaling in the aging process // Front Biosci (Schol Ed). 2010. -Vol. 2.-P. 1169-1188.

283. Wu S.G., Miyamoto T. Radioprotection of the intestinal crypts of mice by recombinant human interleukin-1 alpha // Radiat. Res. 1990. - Vol. 123, N 1. -P. 112-115.

284. Xu Z., Tang K., Wang M., Rao Q., Liu B., Wang J. A new caspase-8 isoform caspase-8s increased sensitivity to apoptosis in Jurkat cells // J. Biomed. Biotechnol. -2009. -P. 1234-1239.

285. Yoo N.J., Kim H.S., Kim S.Y. Immunogistocemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas // Acta Path. Microbiol. Et Immunel Scand. -2003. Vol. 111, N 3. - P. 382-388.

286. Zhang L., Niu T., Yang S.Y., Lu Z., Chen B. The occurrence and regional distribution of DR4 on herniated disc cells: a potential apoptosis pathway in lumbar intervertebral disc // Spine (Phila Pa 1976). 2008. - Vol. 33, N4.-P. 422-427.

287. Zhang L., Smyrk T.C. Autoimmune pancreatitis and IgG4-related systemic diseases// Int J Clin Exp Pathol. 2010. - Vol. 3, N 5. - P. 491-504.

288. Zemchikhina V.N., Lopashov G.V. Significance of the surface membrane of the embryonic eye for lens induction // Dokl. Akad. Nauk. — 1997. Vol. 356, N 3. - P. 409-411.