Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Молекулярно-клеточные механизмы старения тимуса человека

На правах рукописи

□03055485

ПОЛЯКОВА Виктория Олеговна

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ ТИМУСА ЧЕЛОВЕКА

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2007

003055485

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Ноздрачев Александр Данилович

доктор биологических наук Белушкина Наталья Николаевна

Ведущая организация:

Российский научно-исследовательский институт геронтологии Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится 23 апреля 2007 г. в_часов на заседании

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан___

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцент

2007 г.

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Тимус является органом, в котором наиболее ярко проявляются тесные клеточные взаимодействия между тремя регуляторными системами - нервной, иммунной и эндокринной, обеспечивающие необходимый молекулярный коммуникационный диалог, направленный на обеспечение физиологических процессов как в самой железе, так и в живом организме в целом.

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста, инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии меток микроокружения и недостаточной выработкой сигнальных молекул, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов.

Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса. Участие иейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН был сконструирован синтетический дипептид вилоп (Lys-Glu), обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами. Изучение действия вилона на эпителиальные клетки тимуса (ТЭК) и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволило расширить представления о механизмах функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать новые подходы к пептидергической регуляции функций железы в процессе старения организма. В настоящее время в процессе разработки других биологически активных пептидов, перспективными представляются трипептиды Т-32 (Н-Glu-Asp-Ala-OH), Т-38 (H-Lys-Glu-Asp-OH) и тетрапептид кардиоген (H-Ala-Glu-Asp-Arg-ОН), однако, детально их иммуногеропротекторные свойства не изучены.

До сих пор многие вопросы, связанные с нейроиммуноэндокринными сигнальными взаимодействиями в тимусе при стареиии остаются невыясненными. Так, в частности, открытым остается вопрос о разнообразии гормональных фенотипов клеток тимуса и участии конкретных сигнальных молекул в индукции дифференцировки Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса, недостаточно выяснена роль сигнальных молекул тимуса в регуляции пролиферации, дифференцировки и старения клеток тимуса, отсутствуют работы по установлению взаимосвязей изменения синтеза и секреции тех или иных сигнальных молекул тимуса с конкретной возрастной патологией, сопровождающейся проявлениями иммуиодефицитов.

Проведение фундаментальных исследований в этом направлении позволит проследить динамику возрастных структурно-функциональных изменений тимуса, установить роль и значение взаимодействий клеток и сигнальных молекул в инволюции железы; детально изучить участие ключевых сигнальных молекул в нейроиммупоэндокринных механизмах старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является изучение нейроиммупоэндокринных механизмов старения тимуса человека.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи при исследовании тимуса человека in vivo и in vitro:

• изучить структурно-функциональные особенности антенатального гистогенеза, постнагалыюго онтогенеза и старческой инволюции тимуса;

• верифицировать экспрессию' ключевых нейрОимМуноэндокринных сигнальных молекул в тимусе с иммупофеногипическим картированием синтезирующих их клеток;

• изучить возрастные особенности экспрессии иейроиммуноэндокриниых сигнальных молекул в кпегках паренхимы и микроокружения тимуса человека;

• изучить нейроиммуноэндокринные молекулярные взаимодействия в тимусе при дифференцировке стволовых и старении иммунокомпетентных коммитированных клеток;

• изучить возможность регуляции дифферепцировки иммунокомпетентных клеток под действием пептидов и мелатонина для оценки перспективности разработки геропротекторных препаратов в этом направлении;

• определить роль и значение нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в. механизмах старения тимуса.

Научная новизна работы

Впервые показано, что основными структурно-функциональными изменениями ткани тимуса в процессе онтогенеза и старения являются гетерогенность и. гетерохронность возникновения и развития трансформаций в различных структурных элементах железы, проявляющиеся на всех уровнях организации тимуса. Установлено, что в процессе старения тимуса инволютивные изменения затрашвагот как паренхиму, так и микроокружение железы (тучные клетки, макрофаги, дендритные клетки, эндотелий капилляров). При этом в процессе старения в тимусе прежде всего отмечается резкое уменьшение числа Т-лимфоцитов и ТЭК. Установлено, что инволютивные изменения, развиваясь в ходе онтогенеза и при старении в различных клетках тимуса гетерохронно, носят общий характер, как для клеток паренхимы, так и для микроокружения. Основные из них сводятся к следующему: гетерохроматизация и появление внутриядерных включений, гипоплазия и деструкция белоксинтезирующих органелл - митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом, пластинчатого комплекса.

В тимусе человека впервые зарегистрирована активная экспрессия пептидных гормонов и биогенных аминов. Серотонин, мелатонин и соматостатин верифицируются в ТЭК, формирующих тельца Гассаля и в тучных клетках. Отдельные ТЭК демонстрируют иммунореактивность к глюкагону и гастрину. Экспрессия эндотелина-1 обнаружена, в капиллярах тимуса. В различных субпопуляциях тимонитов. человек находящихся на различной стадии дифферепцировки, впервые идентифицированы, следующие гормоны: в предшественниках Т-лимфоцитов (СВ4~СП8~) содержатся серотонин и мелатонин; в незрелых кортикальных клетках обнаружен только серотонин, в зрелых

медуллярных клетках выявлен серотонин, мелатонин, р-эндорфин и гисгамин. При старении в тимусе человека усиливается экспрессия серотонина и эндотелина-1, что свидетельствует об их иммунотропной роли, направленной на поддержание иммунитета в стареющем организме через активацию Т-лимфоцитов.

Впервые установлено, что транскрипционные протеины, регулирующие дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЬР - необходимые для созревания и функционирования Т-лимфоцитов экспрессируются в тимусе человека, начиная с внутриутробного развития железы и их экспрессия снижается в процессе онтогенеза и старения. Применение моноклональных антител к протеину СВ35 позволило верифицировать дендритные клетки в тимусе человека в процессе онтогенеза и проследить динамику снижения их количества и интенсивности экспрессии С1)35 при старении.

Зарегистрированы корреляционные связи между пролиферацией и апонтозом клеток тимуса и локальной экспрессией гормонов в железе. Выявлена отчетливая тенденция к усилению с возрастом экспрессии серотонина и снижению выработки соматостатнна в ТЭК, росту пролиферативной активности тимоцитов » корковом веществе, снижению индексов пролиферации в мозговом веществе. Максимальная интенсивность экспрессии антиапоп-

тозного белка тс1-1 отмечена у эмбрионов, ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоп-тозного белка р53, что свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии гпс1-1, а с уменьшением экспрессии фактора р53. Обнаружение четких корреляций между экспрессией указанных гормонов и пролиферативной активностью тимоцитов отражает важное участие нейроиммуноэндокринных механизмов в паракринной регуляции морфо-функционального созревания тимуса в процессе онтогенеза и старения.

В тимусе людей пожилого и старческого возраста зарегистрировано достоверное возрастание экспрессии МО-синтазы, что свидетельствует о компенсаторной роли этого фермента в инволюционных процессах, развивающихся в тимусе с участием свободных радикалов при старении организма. , . , •

Проведенные исследования позволили впервые оценить роль и значение пепти-дергичесгсой регуляции в процессах дифференцировки и старения иммунокомпетентных клеток. Синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген при введении их в культуру иммунокомпетентных клеток костного мозга и печени плодов человека 14-26 недель развития значительно повышают экспрессию лимфоидных и миелоидных линейных маркеров. Мишенями действия пептидов в данном случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие СВ34. Показано, что инкубация с пептидами тимоцитов плодов человека и мононуклеаров крови взрослых людей вызывает изменение экспрессии маркеров популяций и субггсшуляций лимфоцитов. Установлено, что спектр эффектов, оказываемых пептидами на кроветворные клетки и лимфоциты, может рассматриваться как проявление их влияния на геном и клеточную мембрану.

Впервые установлено, что экспрессия сигнальных факторов дифференцировки ТЭК -протеинов Рах1, НохаЗ и Т1ьР, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах, активно усиливается под действием синтетических пептидов.

Практическая ценность работы

Установление факта снижения при старении уровня экспрессии транскрипционных протеинов, регулирующих дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и Т1.Р, - необходимых для созревания и функционирования Т-лимфоцитов, свидетельствует о том, что данный феномен можно расценить как ключевое звено в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста. Возрастание экспрессии протеина СП35 на дендритных клетках тимуса у людей пожилого и старческого возраста отражает способность дендритных клеток выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах, частота которых с возрастом повышается.

Показана перспективность детального изучения мелатонина и синтетических пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена в качестве иммуногеропротекторов, поскольку установлено, что они обладают свойствами снижать уровень гибели тимоцитов путем апоптоза, повышать пролифератиьную активность клеток тимуса, усиливать выработку цитокинов и экспрессию сигнальных факторов дифференцировки ТЭК.

Проведенные исследования свидетельствуют о важной роли нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в регуляции онтогенеза тимуса, что, в свою очередь, демонстрирует несомненную перспективность поиска и разработки методов пептидер-гической регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма.

Основные положения, выпоенные на защиту

1. Основными структурно-функциональными изменениями паши тимуса в процессе онтогенеза и старения являются гетерогенность и гетерохронность возникновения и развития трансформаций в различных структурных элементах железы на всех уровнях се организации.

■! 2: Инволюптаные изменения, развиваясь в ходе онтогенеза и при старении в различных клетках^тимус.а гетерохронно, носят общий характер как для клеток паренхимы, так и для микроокружения.

3. В тимусе человека активно экспрессируются многочисленные сигнальные молекулы, участвующие в нейроиымуноэндокриниой регуляции функционирования тимуса на всех этапах онтогенеза и старения.

4. Резкое снижение в процессе старения экспрессии транскрипционных протеинов, регулирующих дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЫ' - необходимых для созревания и функционирования Т-лимфоцитов является ключевым звеном в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста.

5. Дендритные клетки тимуса, активно экспрессируя протеин СШ5, сохраняют способность выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах у людей пожилого и старческого возраста. ....

6. Структурно-функциональная инволюция тимуса начинается у человека уже в период раннего постнатального онтогенеза.

7. Нейроиммуноэндокринпые сигнальные молекулы являются ключевыми факторами контроля дифференцировки. стволовых иммунокомпетентпых лсле.ток в коммитированные стадии. . ,....,,,.

8. Мелатонин и синтетические пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают выраженными иммуногеропротекторными свойствами, что позволяет считать перспективным поиск и разработку методов пептидергической регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма. ,

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на

VI научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002), II съезде геронтологов и гериатров России (Москва, 2003), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003), VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2003» (Санкт-Петербург, 2003), VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004), XIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2004), XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Антверпен, Бельгия, 2004), I Международной конференции' «Молекулярная медицина и биобезопасиость» (Москва, 2004), Юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона (Санкт-Петербург,' 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005), XIV Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Сапгст-Петербург, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием "Дни иммунологии в Сангст-Петербурге 2005" (Санкт-Петербург, 2005), II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), VI международной конференции по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005), II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых больных и инвалидов» (Москва, 2005), Г/ национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005),

VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), X Путинской школе-конференции молодых ученых «Пиология - наука XXI века» (Пущино, 2006), IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), X Всероссийском научном Форуме с международным участием им.

академика В.И. Иоффе «Днй иммунологии и Санкт-Петербурге 2006» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006), 16 Европейском конгрессе по иммунологии (Париж, Франция, 2006), II Международном экологическом симпозиуме (Полоцк, Республика Беларусь, 2006), конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии (Санкт-Петербург, 2006), Ученом совете Санкт-Петербургского инегитута биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2006).

Результаты работы отражены в цикле работ, удостоенном Молодежной премии Санкт-Петербурга в области науки 2004 года, премии Геронтологического общества РАН за лучшую работу молодых ученых России по геронтологии (2004 год), а также в отчетах по исследовательским проектам, поддержанных грантами Президента РФ для молодых кандидатов наук, РФФИ, Комитета по высшей школе и науке Администрации Санкт-Петербурга (2003-2007 годы).

Реализации результатов исследования

Результаты исследований изложены в четырех главах в книге «Руководство по нейроиммуиоэндокринологии» (М., Медицина, 2006), которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов. Результаты работы используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Сашст-Петербургского государственного университета, Института • физиологии им. И.П. Павлова РАН, Медицинского радиологического научного центра РАМН, Института иммунологии ФМБА РФ, Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Института цитологических исследований (Валенсия, Испания).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 58 печатных работ, из них монографий - 2, глав в руководстве - 4, статей - 14, тезисов докладов -38.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа являлась научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 346 страницах, содержит 23 таблицы и иллюстрирован 115 рисунками. Указатель литературы содержит 384 источник, из которых отечественных - 156, зарубежных - 228.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . - .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общий дизайн и направления исследований

Изучение молекулярной и клеточной биологии клеток тимуса человека в процессе их дифференцировки, развития и старения проводилось в условиях in vivo и in vitro.

Исследование онтогенеза и старения тимуса in vivo

Исследования проведены на тимусе людей разных возрастных групп, умерших от различных соматических заболеваний, полученном при аутопсиях в патологоанатомических отделениях ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Огта РАМН, Санкт-Петербургской городской больницы №3 и в Санкт-Петербургском городском патологоанатомическом бюро. Образцы тимуса детей в возрасте б мес. - 4 лет получены при операциях по устранению врожденных пороков сердца в НИИ кардиохирургии им. В.И. Бураковского ГУ Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н Бакулева РАМН. Предварительно проведенные специальные исследования структурно-функциональной организации тимуса человека в онтогенезе на большой когорте пациентов (63 человека: 39 мужчин и 24 женщины, возраст от 2 до 46 лет), умерших от сердечно-сосудистых заболеваний (пороки сердца, острый инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии, гипертоническая болезнь) не выявили достоверных различий в его строении и функционировании в течение достаточно длительного периода онтогенеза. Поэтому, исходя из основной цели исследования - изучения нейроиммуноэндокринных молекулярных механизмов старения тимуса - для дальнейшего анализа материал онтогенетически был разделен на 4 группы:

• 1-я группа: эмбриональный тимус (внутриутробная смерть с 22 по 33 неделю

развития);

« 2-я группа-, тимус детей б мес. - 4 года;

« 3-я группа-, область тимуса у пожилых людей (60-74 года);

• 4-я группа-, область тимуса у людей старческого возраста (75-89 лет).

Исследование дифференцировки и старения клеток тимуса in vitro

Исследования проводились на культуре клеток тимуса человека, прошедших 1, 4 и 7 пассажей. Культуры клеток, прошедшие 1 пассаж расценивали как молодые, 4 пассажа - как зрелые, 7 пассажей - как старые культуры. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса эмбрионов человека 20-недельного срока развития, полученных из абортного материала, В качестве тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S, ранее полученной путем трансформации ТЭК эмбрионального тимуса человека материалом, содержащим вирус SV40 и последующего клонирования трансформированных клеток. ТЭК 1-3 суток, как без стимуляции, так и в условиях стимуляции.

ТЭК культивировали не только порознь (в монокультурах), но и совместно с тимоцитами (в ко-культурах с соотношением ТЭК к тимоцитам, равном 1:10). Мелатонин и пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген вводили в культуры в концентрациях 20 и 200 нг/'мл. Подсчет гшеток в культурах ткани производили при увеличении хЮОО и рассчитывали среднее количество клеток па 1 мм2. Пролиферацию оценивали радиометрически по включению 3Н-тнмидина.

Изучение иентидергнческой регуляции дифференцировки иммуиокомпетеитных

стполовых клеток in vitro

Объектом получения иммунокомпетентпых стволовых клеток служили костный мозг, печень и тимус эмбрионов 14-26 педель гестацин. Клетки, извлеченные из органов плодя,

культивировали в 24-луночных планшетах (Costar) при 37°С в атмосфере с 5% СОг в среде RI'MI 1640 (Flow) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов теленка (Sigma), L-глутамина (300 мкг/мл; Flow), HEPES-буфера (0,02 М; Serva) и геитамицина (100 мкг/мл; Фармахим). Исходная концентрация составляла 106 клеток/мл. Каждая проба ставилась в двух повторпостях. Исследовали активность следующих коротких пептидов, сконструированных и синтезированных в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН: Т-32, ■ Т-38 и кардиогена. Популяции клеток культивировали с указанными пептидами в течение 1 ч при 37°С в концентрациях - 2, 20 и 200 нг/мл.

Молекулярио-биологические методы

Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цигофлуорометрии с применением моноклональных антител к CD3, CD8, GDI 9,. CD2S и HLA-DR, меченых флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) и к CD4, CD 14, CD56 меченых фикоэритрином (Сорбент-Сервис). Для определения экспрессии антигенов клетки инкубировали с мечеными моноклональными антителами в течение 30 мин. при 37°С. В ряде случаев оценивалась одновременная экспрессия двух антигенов с использованием различных флуорохромов и двуцветной цигометрии. Контролем служили пробы клеток, не обработанные антителами (контроль антител), а также пробы, обработанные антителами, но не пептидами (контроль пептидов). Связывание антител, меченых флуорохромом, (т.е. экспрессию антигенов) оценивали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson) с использованием программы CellQuest 3.1. Клетки анализировали (по 10 000 клеток на образец) в лучах аргонового лазера (15 мВт, 488 им) при скорости потока 6000 клеток в секунду. Для удаления CD34+ клеток-предшественников в пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Costar) помещали 1,5 мл моноклональных антител к CD34 (Сорбент-Сервис) разведенные в 50 раз средой RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки эмбриона теленка и инкубировали их в течение ночи при 37°С. После отмывания в чашку помещали 2 мл суспензии (510б клеток в 1 мл) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С после чего собирали неприлипшие клетки. Полноту удаления CD34+ клеток контролировали цитофлуорометрически с использованием ФИТЦ-меченых антител к CD34. Экспрессию мембранных молекул (CD69, HLA-DR и CD54) для оценки активации клеток определяли с использованием набора моноклональных антител (Caltag). Апоптоз оценивали цитофлуорометрически путем определения процента гиподигщоидных- клеток с предварительной окраской фиксированных клеток йодидом пропидия. Секрецию тимулина и цитокинов оценивали путем определения их содержания в культуральных супернатантах исследуемых субстанций методом ELISA с использованием тест - наборов (Протеиновый контур). Все пробы ставились в триплетах.

Методы функциональной морфологии

Для цитологического исследования срезы или суспензии клеток окрашивались гематоксилином-эозином, по Ван Гизону и толуидиновым синим. Нейроиммуноэндокринные иммуноцитохимические фенотипы клеток тимуса при исследованиях как in vivo, так и in vitro изучали с применением моиоклональных антител к серотонину (Novocastra, 1:250), мелатонину (CIDtech Res. Inc., 1:200), гастрину, глюкагону, инсулину, соматостатину, ß-эндорфину (все Dako, 1:250), сигнальным факторам дифференцировки ТЭК - протеинам Paxl (предоставлены Dr. J. Wallin, Max-Plunk Institute of Immunobiology, Freiburg, Germany, 1:200), НохаЗ (предоставлены Prof. N.R. Manley, HHMI, University of Utah, USA, 1:150), и TLP (предоставлены Dr. M. Bevan, HHMI, University of Washington, USA, 1:100); сигнальному фактору дифференцировки дендритных клеток - протеину CD35 (Dako, 1:100); ключевым регуляторным белкам пролиферации и аиоптоза - PCNA, Ki-67, р53, niel-1 (все Dako, 1:150), основному ферменту, регулирующему накопление в тканях свободных,-

радикалов - NO-CHiiTá3e (Novocastra, 1:200). Лршрофильиые ¡белки -областей ядрышковых организаторов : (ОЛОР)1 выявляли в клетках!с помощью нитрата серебра. Подсчет аргирофильных гранул проводили в 100 клетках при увеличении хЮОО и рассчитывали среднее число rpäiryrt серебра гга 1 ядро тимоцига и ТЭК, определяя среднее количество гранул в каждой исследованной группе.'

Иммунофлуоресцентную конфокальную микроскопию (ИКФМ) проводили на срезах-, приготовлеггных в криостате Leica СМ1850 (при исследованиях in vivo) или на нефиксированных суспензиях клеток (при исследованиях in vitro). Криостатные срезы (7 мкм)/ мазки клеточных суспензий высушивали в течение ночи и фиксировали в ацетоне 10 мин при -20°С перед иммуноокрашиванием'. Срезы/мазки клеток обрабатывались первичными антителами к эндотелину-1 (1:150), протеинам Paxl (1:200), НохаЗ (1:150), и TLP (1:100) в течение 1 часа. Визуализация экспрессии указанных сигнальных молекул проводилась с использованием наборов для иммунофлуоресцептной визуализации щелочной фосфатазы Vector Red (Vector Lab.) согласно коммерческому протоколу фирмы. Левамизол (1.25 шМ) добавлялся при инкубации со щелочной фосфатазой набора |для блокады эндогенной активггости фермеггта. Изучение препаратов проводили В конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 при увеличении х400 и хЮОО с использованием системы. MRC-1024, укомплектованной программой компьютерной обработки конфокальных микроскопических изображений для построения трехмерных изображений LaserSharp 5.0 (Bio-Rad) в Биомедицннском исследовательском центре принца Филиппа (Валенсия, Испания).

Для электронно-микроскопического исследования в условиях in vivo ткаггь тимуса с помощью лезвия нарезали на кусочки размером 1мм3 в капле глготаральдегада (2,5%). Материал фиксировался в смеси Карновского с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия. Заливка производилась в смесь эпоггов. Для электронно-микроскопического исследования срезы контрастировались уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Для верификации секреторных гранул на ультраструктурном уровне использовали метод уранаффинной реакции. Электронно-микроскопические исследования проводились на электронном микроскопе JEM-1 OOS (JEOL) в лаборатории экспериментальной патоморфологии Медицинского радиологического научного центра РАМН (Обнинск).

Цифровую микроскопию и морфометрическог исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4,0». В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении 400х. Оптическую плотность экспрессии измеряли в условных единицах. Также определяли площадь экспрессии, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками к общей площади клеток в поле зреггия, выражаемое в процентах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых гормонов и сигнальных молекул в клетках и тканях.

Результаты исследований обрабатывались с помощью компьютерной программы STATISTICA 5.0 (Síatsoft).

Автор выражает глубокую благодарном/, академику РАМН Л.А; Боксрия (ГУ Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н Бакулева РАМН) за предоставление образцов тимуса детей, полученных при операциях гго устранению врожденных пороков сердца; академику РАМН Э.К. Айламазяггу (ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Огга РАМН) за предоставление аутопсишшх образцов тимус а плодов и новорожденных; академику РАМН Г.Т. Сухих (ГУ Всероссийский центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН) за предоставление образцов иммунокомпетентных стволовых клеток человека; заслуженному деятелю пауки РФ профессору A.A. Ярилииу (Институт

иммунологии ФМБА Минздравсоцразвития РФ, Москва) за консультации по культивированию дифференцированных клеток тимуса; кандидату медицинских наук В.В. Южакову (Медицинский радиологический научный центр РАМН) за консультации по электронно-микроскопическому исследованию клеток тимуса; а также зарубежным коллегам - профессору .1. Hernandez-Yago (Биомедицинский исследовательский центр принца Филиппа, Валенсия, Испания) за организацию и консультации при проведении конфокальной микроскопии, профессору N.11. Мап1еу (Медицинский институт Ховарда Хыоджеса, Университет Юта, США), доктору М. Веуап (Медицинский институт Ховарда Хыоджеса, Университет Дж. Вашингтона, США) и доктору .1. Wal]in (Институт иммунобиологии Макса Планка, Фрайбург, Германия) за любезное предоставление антител к сигнальным факторам дифференцировки ТЭК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОКСУЖДЕНИЕ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОНТОГЕНЕЗА И СТАРЧЕСКОЙ ИНВОЛЮЦИИ ТИМУСА

При изучении структурно-функциональных изменений тимуса на ультраструктурном уровне не было отмечено принципиально значимых отличий в различных возрастных группах (от 6 мес. до 46 лет), поэтому описываемые результаты в этих группах характерны для данного общего периода до 46 лет, который отвечает критериям, общепринятого в эндокринологии термина, обозначаемого как «активный органофункциональный возраст». Следует обратить внимание на то, что в процессе старения тимуса в инволютивные процессы активно вовлекается не только паренхима, но и микроокружение органа (капилляры, клетки стромы, нейроны и нервные окончания). В процессе старения в тимусе прежде всего отмечается уменьшение числа Т-лимфоцитов и ТЭК. При этом обращает на себя внимание тот факт, что объем клеток при старении не является однозначной величиной - некоторые клетки уменьшаются в объеме, атрофируются, однако часть клеток паренхимы тимуса (особенно ТЭК) увеличивается в объеме, что, по-видимому, следует рассматривать как проявление адаптации в связи с уменьшением числа клеток и изменением условий их жизнедеятельности.

В процессе старения происходят изменения во всех органеллах клеток тимуса. Среди органелл при старении раньше других и наиболее постоянно изменяются энергообразующие структуры - изменяются количество, форма, величина и внутренняя структура митохондрий. Матрикс митохондрий чаще просветлен неравномерно, кристы расположены неправильно, число их уменьшено вследствие разрушения, гомогенизации, фрагментации. Нередко происходят спирализация и утолщение внутренней митохондриальной мембраны с формированием миелиноподобных структур. Общее количество митохондрий уменьшается. Вместе' с тем в отдельных клетках, особенно в ТЭК появляются крупные митохондрии, сохраняющие структуру мембран и многочисленных плотно упакованных крист, умеренно просветленный матрикс. В процессе старения в клетках тимуса изменяются и белоксинтезирующие оргапеллы цитоплазмы - уменьшается площадь шероховатого эндошшматичсского регикулума, его цистерны, как правило, расширены, плотность расположения рибосом на мембранах регикулума снижается. В процессе онтогенеза и старения отмечается неоднородность перестройки пластинчатого комплекса (аппарата Гольджи): в большинстве тимоцитов отмечается атрофия формирующих его канальцев и везикул, в то время как во многих ТЭК встречаются гиперплазия и гипертрофия структур пластинчатого комплекса.

При старении в тимоцитах и ТЭК наблюдается увеличение числа первичных лизосом, располагающихся в различных участках цитоплазмы, преимущественно вблизи или в непосредственном контакте с поврежденными оргапеллами (чаще митохондриями), что позволяет рассматривать увеличение числа первичных лизосом как проявление

инволютивных изменений в клетках при старении. При старении отмечаются изменения поверхностной мембраны клеток, наряду с сохранением ее непрерывности и целостности наблюдаются очаговые уплотнение отдельных участков, повышенное сродство к осмию. В паренхиме клеток при старении также отмечаются особенности структуры межклеточных контактов. При этом площадь поверхностных мембран клеток увеличивается ие только за счет увеличения объема клетки, ио и за счет формирования многочисленных микроворсин в межклеточных промежутках, что особенно демонстративно в области контакта клеток с капиллярами.

Таким образом, резюмируя вышеизложенный материал, можно выделить три типа общих структурно-функциональных изменений в клетках тимуса в процессе онтогенеза и при старении: изменение размеров и эухроматинизация ядра; гетероморфизм изменений в митохондриях; деструкция различной степени выраженности внутриклеточных органелл.

Ультраструктура Т-лимфоцитов в процессе старения железы

В активном органофункциональном возрасте Т-лимфоциты (тимоциты) имеют крупное ядро, содержащее в основном диффузный хроматин, которое отличается более светлой кариоплазмой и имеет неправильную форму за счет многочисленных инвагинаций ядерной мембраны. Ядрышко крупное, расположено чаще по центру ядра. В цитоплазме много митохондрий, они имеют округлые или овальные профили, содержат неплотно упакованные поперечно расположенные кристы. Шероховатый эндоплазматический рстикулум, расположенный чаще вблизи ядра, представлен цистернами, содержащими на мембранах значительное количество рибосом. Элементы гладкой эндоплазматической сети в значительном количестве располагаются в цитоплазме на периферии клетки у мембраны. Выраженный пластинчатый комплекс расположен перинуклеарно. В процессе старения количество Т-лимфоцитов прогрессивно уменьшается, ядра тимоцитов приобретают еще более неправильную, порой причудливую форму за счет увеличения количества и глубины инвагинаций клеточной мембраны вглубь ядра, содержащего эухроматин; ядрышко при этом остается крупным. Пластинчатый комплекс с признаками выраженной дистрофии. Отдельные митохондрии гипертрофированы. Заметно увеличивается количество первичных и вторичных лизосом, связанных с аутофагическими вакуолями и липидными каплями.

Ультраструктура микроокружепия тимуса при старении железы

К микроокружению тимуса относятся эпителиальные клетки, тучные клетки (мастоциты), дендритные клетки, макрофаги и эндотелиоциты капилляров. В активном органофункциональном возрасте эпителиальные ¡слетки тимуса (ТЭК) имеют полигональную форму, округлое центрально расположенное ядро, цитоплазма их богата органехшами, из которых превалируют митохондрии и рибосомы. Гранулярная эндоплазматическая сеть в виде густо расположенных цистерн, мембраны которых богаты рибосомами. В цитоплазме темных клеток обилие свободных рибосом и полисом. Митохондрии овальной формы, содержат рыхло расположенные кристы, матрикс их умеренной электронной плотности.

Активно развит пластинчатый комплекс. В цитоплазме содержатся секреторные гранулы, в которых синтезируются и депонируются различные гормоны. В процессе старения происходят изменения в ультраструктуре ТЭК. Ядра клеток сохраняют форму, имеют ровные очертания и содержат преимущественно эухроматин. Электронная плотность цитоплазмы повышается, в основном, за счет накопления липофусцина. Уменьшается общее количество, органелл и секреторных гранул. В цитоплазме располагаются немногочисленные, часто единичные митохондрии; они резко набухшие, отечные, с редуцированными кристами. Цистерны шероховатого эндоллазматического ретикулума расширены, мембраны содержат немногочисленные рибосомы. Пластинчатый комплекс расположен у ядра, имеет слабо выраженный ламиллярный

компонент и мелкие везикулы. В цитоплазме определяются единичные липицные капли (диаметром 100-400 нм) и многочисленные микропиноцитозные везикулы.

В активном органофункциональном возрасте тучные клетки имеют округлую форму и сравнительно большие размеры - свыше 20 мкм в диаметре. Ядро клеток округлое, плазматическая мембрана имеет множественные дупликатуры в виде сосочков и выпячиваний. Цитоплазма содержит множество митохондрий. Эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и -рибосомы рззвиты слабо.• Мастоциты содержат многочисленные секреторные гранулы, в одной клетке может находиться 100-500 гранул, размеры которых достигают 5000-7000 А в диаметре. Гранулы мастоцитов окружены мембраной, имеющей общее строение с цитоплазматической мембраной клеток, и характеризуются кристаллической структурой, утрачиваемой в процессе активации клеток. При старении не происходит особо значимых изменений в ультраструктуре мастоцитов, за исключением снижения количества митохондрий и гиперплазии лизосом. .

В активном органофункциональном возрасте зрелые дендритные тетки отличаются удлиненной формой, наличием цитоплазматических отростков, которые не формируют сплошного поля, а проникают между тимоцитами и ТЭК. Дендритные клетки часто располагаются между паренхимой и стромой железы, как бы обрамляя капилляры микроокружения своими отростками. Ядра дендритных клеток электронно-плотные, содержат гетерохроматин, располагающийся у ядерной мембраны. В цитоплазме выражены цистерны шероховатого эпдоплазматического ретикулума, митохондрии имеют сравнительно плотный матрикс и поперечно расположенные кристы; в цитоплазме на периферии клетки И в отростках встречаются секреторные гранулы, являющиеся местом синтеза и накопления многочисленных биологически активных сигнальпых молекул, продуцируемых дендритными клетками для осуществления их антиген-презентирующей функции.

Возрастные изменения в дендритных клетках тимуса проявляются изменением формы ядер, которые становятся фестончатыми за счет инвагинаций ядерной мембраны. Увеличивается доля гетерохроматина в ядре, что отражается в резком повышении его электронной плотности. В некоторых митохондриях просветляется матрикс, встречаются единичные набухшие органеллы. Характерно накопление с возрастом в цитоплазме дендритных клеток липофусцина и аутофагосом.

В активном органофункциональном возрасте макрофаги тимуса характеризуются выраженным полиморфизмом вследствие наличия переходных форм. Встречаются свободные клетки округлой формы, отличающиеся высокой функциональной активностью, и малоактивные фиксированные макрофаги звездчатой формы. Последние прикрепляются своими отростками к внеклеточному матриксу. Размеры клеток в среднем составляют 20 мкм в диаметре. Ядро неправильной формы, с углублениями, в цитоплазме — множественные органеллы.

Активированные клетки отличаются выраженным развитием эндоплазматической сети и значительным количеством лизосом. В непосредственной близости от мембраны клеток имеется большое количество актиновых филаментов и микротрубочек, необходимых для миграции и фагоцитоза. При старении количество и функциональная активность макрофагов усиливается, о чем свидетельствует гиперплазия рибосом и лизосом, усиление профилей эндоплазматического ретикулума и пластинчатого комплекса. В ряде макрофагов обнаруживаются картины деления ядра.

Капилляры микроокружения тимуса у пожилых и старых людей, как и у молодых, имеют эндотелиоциты фенестрированного типа. В активном органофункциональном возрасте функциональное состояние капилляров более активно, о чем свидетельствуют выраженный микропинсцитоз и умеренное набухание митохондрий. При старении капилляры чаще имеют суженный просвет, матрикс эндотелиоцитов уплотнен, микропиноцитоз не выражен. В некоторых участках перикапиллярное пространство расширено, заполнено белковыми массами и волокнистыми структурами типа коллагена.

ЭКСПРЕССИЯ НЕЙРОИММУНОЭНДОКРИННЫХ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В ТИМУСЕ ЧЕЛОВЕКА В ПРОЦЕССЕ ОНТОГЕНЕЗА

Возрастные особенности экспрессии биогенных аминов и пептидных гормонов

В ТЭК, формирующих тельца Гассаля, верифицируется экспрессия серотонина и соматостатина, -а также гастрина. Отдельные ТЭК демонстрировали иммунопозитивную реакцию с антителами к глюкагону. Общее количество клеток, экспрессируюгцих серотонин и соматостатин с возрастом не изменяется, однако, в то же время изменяется уровень синтеза гормонов в отдельных клетках, о чем свидетельствует достоверное изменение показателей оптической плотности в тимусе детей разных возрастных групп - синтез серотонина в клетках усиливается с возрастом, а соматостатина - снижается. Иммуноцитохимическое исследование позволило также обнаружить в различных субпопуляциях тимоцитов человека, находящихся на различной стадии дифференцировки, следующие гормоны: в предшественниках Т-лимфоцитов (СВ4~С1)8~) содержатся серотонин и мелатоиин; в незрелых кортикальных клетках (СГ>4+С08*) обнаружен только серотонин, в зрелых медуллярных клетках выявлен серотонин, мелатонии, Д-эндорфин и гистамин. Учитывая ведущую роль сосудотропных гормонов - серотонина и эндотелина-1 в формировании, развитии и функционировании микроокружения в тимусе, было проведено изучение возрастных особенностей экспрессии этих гормонов в клетках тимуса человека.

Экспрессия серотонина. В группе детей умерших антенатально экспрессия серотонина обнаружена в стенках сосудов медуллярной и кортикальной зонах, тучных клетках, располагающихся в медуллярной зоне и соединительнотканной строме тимуса, а также в отдельных тельцах Гассаля. По сравнению с 1-ой возрастной группой на срезах тимуса детей 2-ой возрастной группы отмечается интенсивное иммуноокрашивание с антителами к серотонину в тельцах Гассаля. Во внутридольковых периваскулярных пространствах (ВПП) наблюдаются небольшие скопления серотонин-иммунопозитивных клеток округлой формы, которые, видимо, формируют эндотелий новообразующихся сосудов. На препаратах тимуса людей пожилого возраста экспрессия серотонина верифицируется в тучных клетках, локализованных в медуллярной зоне и ВПП.

Также интенсивно окрашиваются немногочисленные тельца Гассаля, преимущественно с деформированной капсулой. В 4-ой возрастной группе (люди старческого возраста) тимус практически полностью замещен жировой тканью. Специфическое иммуноокрашивание на серотонин наблюдается в паренхиме немногочисленных тимусных долек в скоплениях клеток, возможно, формировавших тельца Гассаля. Также иммуноокрашенные тучные клетки обнаруживаются в субкапсулярной зоне.

Подсчет процента суммарной площади иммуноокрашенных структур показал, что, в среднем, у детей, умерших на первом году жизни, суммарная площадь экспрессии составляет 1.74±0.99%; для группы людей пожилого возраста этот показатель составляет 2.02+ 0.27%; в группе людей старческого возраста - 2.09+0.31%; в тимусе детей, умерших антенатально, выявлено самое высокое значение: процент суммарной гглощади экспрессии серотонина составляет 3.64+1.66. Полученные результаты свидетельствуют о повышении экспрессии серотонина с возрастом, что отражает вовлечение эндогенного серотонина в поддержание функций иммунной системы при старении.

Экспрессия эндотелина-1. Экспрессия эндотелина-1 иммуноцитохимически верифицирована в сосудах тимуса, локализованных во всех тимусных компартментах (субкапсулярной зоне, корковом, мозговом веществе) у людей всех четырех возрастных групп.

При сравнении средних значений оптической плотности в исследуемых возрастных группах обнаружено, что у пожилых и старых людей оптическая плотность эндотелин-иммуноокрашенных структур достоверно выше, чем у детей. Статистически достоверные различия были зарегистрированы только в объединенных группах (1+2 и 3+4), внутри этих

объединенных групп достоверных различий между сравниваемым показателем зарегистрировано не было.

Статистическая обработка результатов показала, что различия показателя процента суммарной площади специфически иммуноокрашенных структур с антителами к эндотелину-1 между группами детей первого года жизни и эмбрионами сроком с 22 по 33 неделю внутриутробного развития недостоверны.

Сравнение старших возрастных групп между собой также не- выявило достоверных различий в проценте суммарной площади иммуноокрашенных структур. Однако, при сравнении объединенной группы детей (1+2) и объединенной группы пожилых и старых людей (3+4), было обнаружено достоверно большее значение этого показателя в старшей возрастной группе.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют об усилении экспрессии серотонина и эндотелина-1 в тимусе человека при старении. Учитывая присущие серотонину и эндотелину-1 иммунотропные свойства, основным из которых является активация функции Т-лимфоцитов, можно предположить, что при возрастной инволюции тимуса усиление экспрессии этих гормонов отражает их комплексную роль, направленную на поддержание иммунитета в стареющем организме.

Возрастные особенности экспрессии сигнальных факторов дифференцировки ТЭК

Рах1, НохаЗ и ТЬР

Транскрипционные протеины, регулирующие дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЬР - необходимые для созревания и функционирования Т-лимфоцитов экспрессируются в тимусе человека, начиная с внутриутробного развития железы. Нами зарегистрирована экспрессия всех трех факторов на изученном материале, начиная с 22 недель внутриутробного развития до 89 лет. Во внутриутробном периоде (1-я группа) и у деггей 2-ой группы экспрессия Рах1, НохаЗ и ТЬР регистрируется в ТЭК, локализованных как в корковом, так и в мозговом веществе, тогда как в 3-ей и 4-ой возрастных группах указанные протеины экспрессируются только в кортикальных ТЭК. С возрастом происходит редукция экспрессии всех трех изученных транскрипционных факторов (табл. 1). Обращает на себя внимание тот факт, что если экспрессия протеинов Рах1 и ТЬР в ТЭК снижается в процессе онтогенеза и старения как по показателям оптической плотности и площади экспрессии, то степень синтеза протеина НохаЗ в отдельных клетках с-возрастом не изменяется (показатели оптической плотности практически не меняются), однако общее количество ТЭК, его экспрессирующих также достоверно снижается.

Возрастные особенности экспрессии сигнального фактора дифференцировки дендритных клеток СВ35

В 1-ой и 2-ой группах (22-33 недели внутриутробного развития и б мес - 4 года) специфическое иммуноокрашивание клеток с антителами к СБ35 обнаружено преимущественно в корковом веществе, а также в непосредственной близости от ВПП. В некоторых случаях экспрессия СШ5 идентифицировалась в медулле, тогда как в тимусе людей пожилого и старческого возраста наблюдалось иммуноокрашивание дендритных клеток преимущественно в медулле, а также вокруг ВПП.

Сравнение средних значений оптической плотности для разных возрастных групп позволило получить следующие результаты: минимальное значение (2,30+0,28) обнаружено в тимусе плодов и оно достоверно отличается (р<0,05) от значений других трех групп (дети первого года жизни - 2,33±0,20; люди пожилого возраста - 2,35+0,31; люди старческого возраста - 2,35±0,34). Также достоверные отличия (р<0,05) наблюдаются между 2 группой и объединенной 3 и 4 группами.

Таблица 1

Показатели экспрессии протеинов Рах1, НохаЗ и Т1Л' в ТЭК тимуса человека в процессе онтогенеза и старения

группа Рах1 НохаЗ ТЬР

опт. плотн. (У-е.) площадь экспр. (%) опт. плотн. (У-е.) площадь экспр. (%) опт. плотн. (У-е.) площадь экспр. (%)

1 1.4б±0.03 3.24±1.45 1.37±0.03 3.46±0.52 2.11±0.15 4.26±1.73

2 2.05±0.0б* 3.36±1.54 1.44±0.02 5.28±1.13* 4.02±0.11* 5.7б±1.18*

3 0.54±0.02* 1.24±0.06* 1.36±0.02 1.97±0.08* 2.02*0.09 3.12±0.07*

4 0.39±0.01* 0.99±0.03* 1.47±0.03 1.54±0.06* 0.97±0.02* 2.11±0.04*

*- р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем в 1 группе

Средние значения процента суммарной площади также различаются между группами: эти показатели достоверно меньше (р<0,05) в 1 и 4 группах (28,33±0,98 и 26,27±0,17 соответственно) по сравнению со 2 и 3 группами (32,02+0,75 и 33,19±1,19 соответственно). Таким образом, применение моноклональных антител к протеину СВ35 позволило верифицировать дендритные клетки в тимусе человека в процессе онтогенеза и проследить динамику изменения их количества и интенсивности экспрессии С035 при старении.

Полученные результаты свидетельствуют о достоверном снижении популяции дендритных клеток у людей старческого возраста, что связано со структурной инволюцией железы. Однако, при этом экспрессия протеина С03 5 на них возрастает у людей пожилого и старческого возраста, отражая способность дендритных клеток выполнять защитную функцию от атаки собственной системой комплемента, которая может происходить при аутоиммунных процессах, частота которых с возрастом повышается.

Иммуноцитохимическая верификация экспрессии ключевых регуляторных белков

пролиферации и апоптоза

Пролиферативная активность тимоцитов в пост наталь пом онтогенезе. Насыщенность корковой зоны тимуса по ядрам составляет 41014±462 клетки на 1 мм2 площади среза для детей в возрасте 6 мес.; 41948±Н47 - для возрастной группы 1-2 года и 43137±762 - для группы 2-4 года. Основная популяция пролиферирующих клеток в тимусе детей располагается в корковом веществе с тенденцией концентрироваться в периферической зоне долек. В мозговом веществе лимфоцитов содержится существенно меньше, чем в коре вчлочковой железы. Эпителиальные клетки местами формируют хорошо выраженные тельца Гассаля. В мозговой зоне определяется достаточно высокая количественная плотность клеток: 32262±1423 для детей в возрасте 6 мес; 34835±911 - для возрастной группы 1-2 года и 33667±490 - для группы 2-4 года, однако реакцию на РСЫА и циклин А дают единичные ядра.

Изучение параметров пролиферативной активности клеток тимуса показало наличие достоверной положительной связи (г = +0,8; р<0,05) между экспрессией РСЭДА и циклина А в ядрах тимоцитов коркового вещества и отрицательной корреляции (г = -0,9; р<0,01) между индексами пролиферации в корковом и мозговом веществе вилочковой железы (рис. 1). Кроме того, в процессе исследования получены сведения о корреляционных связях между экспрессией серотонина и соматостатина в эпителиальных клетках телец Гассаля и пролиферативной активностью тимоцитов человека по индексу РСЫА (рис. 1).

Рис. 1. Корреляционные связи между пролиферативной активностью тимоцитов по РСЫА и циклину А, а также содержанием серотонина и соматостатина в эпителиальных клетках

телец Гассаля. .

КВ - корковое вещество; ОП - оптическая плотность иммуногистохимической реакции;

ТГ - тельца Гассаля.

По-видимому, выявленные корреляционные связи отражают процесс морфо-функционального созревания тимуса. При этом прослеживается отчетливая тенденция к усилению с возрастом экспрессии серотонина в эпителиальных клетках, росту пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе, снижению индексов пролиферации в мозговом веществе. , :

Также в постнатальном онтогенезе происходит снижение экспрессии соматостатина эпителиальными клетками. Обнаружение четких корреляций между экспрессией указанных гормонов и пролиферативной активностью тимоцитов отражает важное участие; нейроиммуноэндокринных механизмов в паракринной регуляции локального гомеостаза тимуса.

Апоптоз клеток тимуса в онтогенезе и при старении. Экспрессия антиапоптозного белка тсЫ была обнаружена во всех структурах нелимфоидного компонента тимуса -капсуле, междольковых перегородках, тельцах Гассаля и стенках сосудов у людей во всех возрастных группах, однако, степень ее выраженности была неодинакова. В изученных группах была выявлена негативная корреляция между площадью экспрессии белка тсЫ в структурах нелимфоидного компонента тимуса и возрастом людей.

Так максимальная площадь экспрессии протеина шс!-1 была обнаружена в тимусе детей 1 группы (3,9±0,7%). У детей 2 группы эта величина оказалась достоверно ниже (р<0,05) и составила 3,1±0,2% (р<0,05). Площадь экспрессии белка тсЫ оказалась существенно ниже в 3 и 4 группе (у людей пожилого и старческого возраста) по сравнению с первыми двумя группами (р<0,05) и составила 1,3±0,3% и 1,4±0,5% соответственно. Достоверных различий площади экспрессии тсЫ между 3 и 4 группой при этом не обнаружено. При изучении -оптической плотности шс1-1-иммуиопозитивно окрашенных структур не выявлено достоверных различий между возрастными группами, однако тенденция к уменьшению ее значений в 3 и 4 группах присутствует по сравнению с 1 и 2 группами.

Экспрессия белка р53 в структурах нелимфоидного компонента тимуса людей 1 и 2 групп была обнаружена в капсуле, междольковых перегородках и сосудах, единичные иммунопозитивно окрашенные ядра встречались в тельцах Гассаля. В пожилом и старческом возрасте экспрессия белка р53 отмечалась в единичных сохранившихся эпителиальных клетках среди жировой ткани. Отмечено достоверное увеличение площади экспрессии белка р53 во 2 возрастной группе по сравнению с 1 группой (площадь экспрессии 0,54±0,08 и 0,84±0,06 соответственно, р<0,05). В 3 и 4 группах экспрессия р53 была выявлена во всех структурах нелимфоидного компонента тимуса, однако процент площади окрашивания в этих группах оказался достоверно ниже, чем во 2 группе. Кроме того, было обнаружено, что у людей старческого возраста происходит уменьшение экспрессии фактора р53 по сравнению с пожилыми людьми (р<0,05). Интересно, что достоверных различий между величинами относительной оптической плотности между изученными возрастными группами при этом выявлено не было.

Проведенные исследования позволили верифицировать экспрессию белка тс1-1 во всех структурах нелимфоидного компонента тимуса, однако, при этом был зарегистрирован следующий факт - максимальная интенсивность экспрессии белка тс1-1 была отмечена только у эмбрионов, ее быстрое снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза.

Сопоставление результатов интенсивности экспрессии протеинов тс1-1 и р53 позволяет сделать вывод об интенсивности процесса апоптоза и, соответственно скорости инволюции в рассматриваемых возрастных группах. В тимусе людей пожилого и старческого возраста продолжается экспрессия белка тс1-1, хотя и на заметно белее низком по сравнению с эмбрионами и детьми первого года жизни уровне. В то же время плошадь экспрессии белка р53 ниже более чем на 20% у людей пожилого возраста и на 40% у людей старческого возраста по сравнению с детьми первого года жизни. Эти данные, по-видимому, отражают замедление процессов инволюции в этих возрастных группах.

Иммуноцитохимическая верификация экспрессии ¡МО-синтазы в тимусе человека в онтогенезе и при старении

В 1 и 2 возрастных группах экспрессия КЮ-синтазы обнаружена преимущественно в тучных клетках, располагающихся в медуллярной и кортикальной зонах тимуса, а также в непосредственной близости к тельцам Гассаля и стенкам сосудов. В тимусе людей пожилого и старческого возраста экспрессия >ТО-синтазы верифицируется в крупных одиночно располагающихся тучных клетках неправильной формы, локализованных в медуллярной зоне, ВПП и около телец Гассаля. Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить, что показатель оптической плотности иммуноокрашенных на N0-синтазу тучных клеток достоверно повышается в процессе постнатального онтогенеза и наиболее высок у людей пожилого и старческого возраста (рис. 2А).

Подсчет процента суммарной площади иммуноокрашенных на ЫО-синтазу тучных клеток показал, что этот показатель имеет самое высокое значение для группы пожилых людей, что достоверно выше (р<0,05), чем в тимусе плодов и у людей старческого возраста (рис. 2Б). Также достоверное отличие показателей процента суммарной площади (р<0,05) наблюдается между 1 и 2 группами (рис. 2Б).

Достоверное возрастание экспрессии 'ЫО-сиитазы у людей пожилого и старческого возраста свидетельствует о комкенсагорной роли этого ферметй в инволюционных процессах, развивающихся в тимусе с участием свободных радикалов при старении организма.

2,36 £ ¿,34а 8 2.34 | 2,336 | 2,33 к 2.325

1 Ф г 2,31

о 2,305 2.3

И

1 2 3

возрастные группы

12 3 4

воэрлстныэ группы

40.00 | 39.00

3 30.00

0

1 25.03

I 20.00

я 15.00

I ю.оо &

* 5.00

о.оо

Рис. 2. Показатели оптической плотности ИО-сиятазы в тучных клетках тимуса человека в разных возрастных группах. * - р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем и группах 1 и 2; ** - р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем группах 1,2 и 3 и - р0.05 по сравнению с аналогичным показателем в группе I.

Щ - р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем в группах 1 и 4.

МЕЛАТОНИН И СТАРЕН И К ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК Ш ШЛО

В настоящее время многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о важной роли мелатонина (МТ) - гормона, синтезируемого пине ало цитами эпифиза « другими клетками диффузной Нейронммуноэндокринной системы п регуляции физиологических и патологических процессов н живом организме. Основными эффектами МТ являются универсальная координация ИМ биологических ритмов, иммуностимулирующее действие, проявление антноксидантпых свойств, цич-остатичсекое и антиопухолевое действие. При старении происходит инволюция шнеалыюй железы, гипоплазия экстрапинеальных источников МТ, что приводит к резкому снижению продукции гормона н развитию патологических состояний, ассоциированных с возрастом. Описанные сведения подтверждают концепцию существования тесных связей между МТ и старением и отражают актуальность изучения механизмов проявления МТ геро протекторных свойств.

Поскольку, тимус - основной орган иммунной системы при старении проявляет выраженные признаки структурно-функциональной инволюции и, тем самым, негативно влияет на иммунологическую реактивность стареющего организма, представляется актуальным и целесообразным изучить возможность коррекции иммунодефицит в, ассоциированных со старением, или их профилактики через реализацию геропротекторных свойств МТ по отношению к клеткам тимуса.

Исследования но экспрессия маркеров активации в старых культурах клеток тимуса (7 пассажей) показали разнонаправленное действие МТ на .экспрессию СП69 с одиой стороны и Ш.Л-ПЕ и СП54 - с другой, причем направленность действия МТ на ТЭК И тимоциты была противоположной. МТ подавляет экспрессию молекул СП54 и НЬА-Вк, а так же раннего актив анионного антигена СП69. МТ слабо влияет на спонтанную выработку тимулина, ко почти полностью отменяет ее усиление. вы5ванное контактом ТЭК с тймоцитами. МТ' так же усиливает наработку ИЛ-1[5 и ИЛ-7 п старой монокультуре ТЭК, однако, н ко-культурс ТЭК и -гимонитоп, МТ проявляет ннгибидующее действие (табл. 2)

Пролиферативную активность ТЭК, прошедших 1, 4 и 7 пассажей оценивали в присутствии МТ и без него. ТЭК пассировали в присутствии эпидермального фактора роста (ЭГФ); при введении МТ ЭГФ в среде отсутствовал. Значимого влияния на включение метки в 1-суточные культуры ТЭК 1-го и 4-го пассажей из наблюдалось, однако при действии МТ на пролиферацию ТЭК 7-го пассажа достоверное усиление пролиферации было зарегистрировано при дозе МТ 20 нг/мл (рис. 3).

При изучении экспрессии белков ядрышковых организаторов было показано, что в ТЭК контрольной группы среднее число гранул на 1 ядро составляло 22,7±0,47. При действии МТ наблюдалось снижение гранул серебра в ядрах ТЭК. При концентрации МТ 20 нг/мл среднее число гранул серебра на ядро эпителиальной клетки составляло 20,7±0,51, а при концентрации 200 нг/мл - 20,9±0,5б, что было достоверно ниже контрольных значений соответственно на 9,6% и 8,6% (р<0,01 и р<0,02 соответственно). Регистрируемые различия в содержании гранул серебра в ядрах клеток в зависимости от дозы МТ недостоверны (р<0,5).

Таблица 2

Влияние МТ на секрецию тимулина, ИЛ-1Р и ИЛ-7 в монокультуре ТЭК и их ко-культуре с тимоцитами

секретируемые вещества, нг/мл монокультура ТЭК ко-культура ТЭК+тимоциты -

контроль МТ контроль МТ

Тимулин 34±3 25±6* 135±11 36±3*

ИЛ-lß 0,12±0,01 0,45*0,05* "0,41 ±0,01 0,23±0,03*

ИЛ-7 0,74±0,03 4,38±0,19* 5,81±0,58 4,22±0,26*

*- р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе

МТ не оказывал значимого влияния ни на спонтанную, ни на индуцированную пролиферацию периферических Т-лимфоцитов (р<0,05). Отклонения от средних значений при использовании различных доз МТ носили разнонаправленный характер. Отсутствие ко-стимулируюшсго эффекта МТ, возможно, связано с использованием высоких концентраций ФГА (10 мкг/мл) для стимуляции Т-клеток. МТ не влияет на клеточный цикл покоящихся мононуклеаров. Значимые эффекты отсутствуют и в отношении ФГА-активированных клеток, однако при высоких дозах намечается тенденция к повышению доли клеток, находящихся в фазах клеточного цикла G2/M. Статистически значимого влияния МТ на апоптоз стимулированных Т-клеток не отмечено, но проявлялась четкая тенденция к усилению апоптоза мононуклеаров.

Высокие дозы МТ снижали число Т-клеток, экспрессирующих ИФНу. Установлено, что повышение соотношения ИФНу4" и ИЛ-4+ клеток закономерно проявляется при использовании доз МТ 20 нг/мл.

Таким образом, проведенные исследования позволили детализировать влияние различных доз МТ на клетки тимуса при их старении in vitro. Обработка тимоцитов человека МТ in vitro, влияет на проявления активации тимоцитов, индуцируемые контактом с ТЭК: МТ ослабляет экспрессию раннего маркера активации CD69 и усиливает экспрессию поздних маркеров активации CDS4 и HLA-DR. Исследования показали, что МТ защищает тимоциты от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК. МТ подавляет экспрессию CD54 (ICAM-1), продукта МНС II (HLA-DR) и раннего маркера активации CD69. Экспрессия двух первых молекул имеет прямое отношение процессам селекции, поскольку ее условием является адгезия тимоцитов к ТЭК и распознавание тимоцитами молекул МНС на поверхности ТЭК.

700

650

600

550

500

ИГ

А 4 пассаж -в—7 пассаж

20

200

Рис. 3. Влияние МТ на пролиферацию ТЭК 4 и 7 пассажей. По оси ординат интенсивность

включения

3Н тимидина (имп/мин) в ТЭК, по оси абсцисс - доза МТ, нг/мл

Функциональное назначение молекулы С1)69 на ТЭК не установлено; она является лишь признаком активации клеток. МТ усиливает спонтанную выработку цитокинов, не влияет на спонтанную выработку тимулина, но отменяет усиление секреции этого гормона под влиянием контакта ТЭК с тимоцитами.

МТ оказывает выраженное действие на мопонуклеары крови и активированные Т-лимфоциты. Он ослабляет экспрессию внутриклеточного ИЛ-4, а высокие дозы МТ - также внутриклеточного ИФНу. При низких дозах этого вещества создаются условия для сдвига баланса цитокинов в пользу ИФНу, что, очевидно, отражает преобладание дифференцировки активированных Т-лимфоцигов в ТЫ-клетки. МТ оказывает определенное действие на процессы образования рибосом в тимоцитах и ТЭК при их совместном культивировании.

МТ снижает экспрессию аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов (ОЯОР), ответственных за синтез, сборку и транспорт рибосом в цитоплазму, предопределяя таким образом снижение синтеза белка и образования рибосом. МТ вызывал значительное снижение уровня экспрессии аргирофильных белков в ТЭК, что можно рассматривать как отражение угнет ения транскрипционной активности рибосомных генов, а также подавления пролиферативной активности клеток.

Проведенные исследования показали, что МТ может явиться перспективным геропротектором по отношению к иммунной системе, однако, для разработки конкретных рекомендаций по его применению требуется продолжение детального изучения механизма действия различных доз данного гормона.

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Задачей данного этапа исследования явилось изучение способности коротких синтетических пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена воспроизводить события дифференцировки лейкоцитов (особенно лимфоцитов) из гемопоэтических клеток-предшественников человека, а также модифицировать мембранный фенотип зрелых лимфоцитов.

В качестве маркеров линии миелоидных клеток избрана молекула С1)! 4 (рецептор для липополисахарида, участвующий в распознавании этой молекулы вместе с ТЬК4),

экспрессирующаяся преимущественно на моноцитах (более слабо - на гранулоцитах). Для В-лимфоцитов общепризнанным маркером служит молекула CD19, экспрессирующаяся на стадии npoBl - еще до появления на поверхности клетки рецептора BCR. Маркером NK-клеток является молекула CD56, которая лкспрессируется на NK-клетках разных стадий развития. Основным линейным маркером Т-клеток служит CD3 — часть рецепториого комплекса, свойственная веем (ар и у5) Т-клеткам, а маркерами субпопуляций - CD4 - ко-рецептор Т-хелперов и CD8 - ко-рецептор циготоксических Т-лимфоцитов; все эти молекулы появляются на клетках Т-ряда сразу после завершения перестройки генов TCR и их экспрессии.

Перечисленные маркеры практически не экспреесируются или слабо экспрессируются на клетках печени и костного мозга эмбрионов указанных сроков развития. Проведена оценка их появления (эксггрессии) на клетках в результате часовой инкубации с пептидами при 37°С. Появление (экспрессия) маркера расценивалось как отражение дифференцировки клеток в соответствующем направлении.

Экспрессия маркеров миелоидных клеток, Т-, В-лимфоцигов и NK-клеток

При инкубации клеток костного мозга с пептидами Т-32, Т-38 и кардиогеном в концентрации 2, 20 и 200 нг/мл регистрировалось появление на клетках исследованных линейных маркеров. Как правило, они экспрессировались на небольшом проценте клеток, не превышающем 20% (обычно - 5-15%). Однако, в связи с тем, что данные проточной цитометрии основаны на анализе очень большого числа клеток (в наших опытах - 10 000 на образец) даже небольшое превышение уровня контроля может рассматриваться как проявление эффекта. Экспрессия маркера миелоидных клеток CD 14 регистрировалась уже при действии минимальной концентрации пептида Т-32 - 2 нг/мл, при повышении эффект пептида ослабевал, но продолжал оставаться достоверно значимым (рис. 4).

Анализ действия пептидов на экспрессию в костном мозгу маркеров В-лимфоцитов (CD19) и NK-клеток (CD56) позволил установить значимый эффект только при действии пептида Т-38 и кардиогена. Эффект выявлялся при промежуточной дозе (20 нг/мл) и был выражен в сходной степени для обоих пептидов в обеих пробах костного мозга. Дозовые кривые выглядят практически идентичными для обоих маркеров.

Мп: 29.42 . CV: 216.39

[86-255] 133 (В.9 %)

10;

Ml

10! 10! FL2-H

10!

10*

Мп: 269.46 CV: 57.11

¡92-255] 322 (20.6%)

Рис. 4. Гистограмма экспрессии СО!4 клетками костного мозга эмбриона человека без обработки пептидами (а) и после обработки пептидом Т-32 (б) в концентрации 2 нг/мл. По оси абсцисс - концентрация пептида, нг/мл, по оси ординат - процент клеток, несущих

изучаемый маркер.

Оценка реализации эффекта пептидов через действие на стволовые клетки или ранние клетки-предшественники, эксирессирующие CD34

Оценивая способность пептидов индуцировать экспрессию линейных маркеров, рассматриваемую как проявление дифференцировки клеток, мы предполагали, что мишенью действия пептидов являются если не стволовые кроветворные клетки, то ранние клетки-предшесгаепники, коммутированные в направлении того или иного ряда (например общий миелоидный предшественник - СМР или общий лимфоидный предшественник - CLP).

Маркером стволовых клеток и самых ранних форм коммиттированные предшественников у человека является молекула CD34 (гликозилированный рецептор селектинов). Для обоснования этого предположения следовало выяснить, связаны ли описанные выше эффекты пептидов с действием на CD34+ клетки или на иные, более зрелые клетки, содержащиеся в кроветворных органах. Для этого нами изучена способность пептидов вызывать индукцию линейных маркеров па ингактных популяциях клеток печени и костного мозга эмбрионов и на тех же популяциях после освобождения их от CD34+ клеток. Во всех случаях успешной индукции маркеров было однозначно показано, что она предотвращается удалением CD34+ клеток из исследуемых суспензий.

Результаты оценки влияния удаления CD34+ клеток на экспрессию CD19 на клетках костного мозга плодов человека, индуцированную пептидами Т-32 и Т-38 (оба в дозе - 20 нг/мл), следующие. Процент CD 19* клеток после обработки указанными пептидами суспензии костного мозга повышался с 3,4% до 10-12%, но после удаления CD34+ клеток он не только не повышался, но даже снижался практически до 0 (0,4%). Причины этого повышения остаются пока неясными и требуют проведения специального исследования, (не входящего в задачи данной работы). Тем более выразительным представляется полное исчезновение CD19-позитивных клеток под влиянием указанных пептидов.

Аналогичные результаты получены при изучении экспрессии на клетках печени плода человека молекулы CD56 - маркера NK-клегок. При действии кардиогена (в дозе 20 нг/мл) на интактные клетки печени процент CD56+ клеток повысился с 0,6% до 6,3%, а при его действии на клетки печени, освобожденные от CD344" клеток индукции CD56* клеток не происходило. Пептид Т-38 оказал аналогичное, но более слабое действие.

Обобщая данные приведенных выше экспериментов, можно констатировать, что экспрессия линейных маркеров лимфоцитов (CD19, CD56) во всех случаях отменяется после удаления из суспензии костного мозга или печени плодов CD34* клеток, что свидетельствует о том, что пептиды индуцируют экспрессию линейных маркеров на стволовых клетках или ранних кроветворных предшественниках, несущих молекулу CD34. Само по себе удаление CD344 клеток несколько повышало процент CD19+ клеток в исходной суспензии.

Влияние пептидов на дифференцировку тимоцитов

В тимусе происходит развитие Т-клеточной линии лимфоцитов. При этом изменяется экспрессия мембранных маркеров, в особенности связанных с распознаванием аитигена. На ранней стадии развития тимоциты не экспрессируют молекулу CD3, представляющую собой часть рецепторного комплекса, а также ко-рецепторы CD4 и CD8. На стадии незрелых коргикальных тимоцитов, преобладающих в тимусе, присутствуют одновременно все названные молекулы. Наконец, зрелые медуллярные тимоциты экспрессируют CD3 и один из ко-рецепторов. Перечисленные изменения экспрессии ко-рецепторов происходят в результате постоянно происходящей в процессе развития клеток смены нейроиммунозндокримных молекулярных сигналов.

Планируя данный этап исследования, маловероятным представлялась способность исследуемых пептидов оказать влияние на такой фундаментальный и комплексный процесс, как перестройка генов TCR, по можно было предположить, что они Moiyr способствовать или препятствовать экспрессии более лабильных вспомогательных молекул, каковыми

являются CD3, CD4 и CDS. Исходя из этого, задачей данного этапа работы явилось изучение влияния пептидов на экспрессию названных молекул, как в суммарной популяции тимоцитов, так и в изолированных субпоиуляцпях клеток, соответствующих основным стадиям развития тимоцитов.

Кроме того, возможно еще одной точкой реализации эффектов изучаемых пептидов на дифференцировку тимоцитов является их влияние на соотношение различных субпопуляций зрелых клеток - CD4+ Т-хелперов и CD8+ Т-киллеров, а также- на формирование естественных регуляторных Т-клеток фенотипа CD4+CD25+, которые развиваются из тех же клеток-предшественников, что и названные субпопуляции. Решению этих вопросов посвящен данный раздел работы.

Влияние пептидов на экспрессию маркеров Т-клеток и их субпопуляций

Инкубация нефракционированных тимоцитов с исследованными пептидами выявила разнонаправленное их действие на экспрессию основных маркеров Т-клеток и их субпопуляций. Так, число клеток, экспрессирующих CD3, при действии пептидов Т-32 и Т-38 снижалось, в то время как кардиоген усиливал экспрессию этого маркера. В действии на экспрессию ко-рецепторов CD4 и CD8 преобладало иигибирующее действие всех трех пептидов с перераспределением этих ко-рецепторов между CD3" и CD3+ клетками. Анализ ко-экспрессии молекул CD4 и CD8 выявил возрастание доли CD4 CD8+ клеток за счет снижения содержания зрелых клеток - только С04ЧЛЭ8~ (при действии пептида Т-32) или одновременно CD4+CD8"n CD4~CD8+ клеток (при действии пептидов Т-32 и Т-38).

При изучении действия пептидов в культурах субпопуляций тимоцитов, изолированных путем фракционирования на магнитных бусах, не выявлено значимого влияния всех трех пептидов на экспрессию молекул CD3, CD4 и CD8 на самых молодых клетках тимуса, относящихся к субпопуляции CD4CD8", при этом пептид Т-32 снижал долю CD3h клеток в этой фракции. При оценке действия пептидов на изолированную фракцию CD4*CD8+ тимоцитов в качестве преобладающего эффекта обнаружено ослабление экспрессии обоих ко-рецепторов и, следовательно, снижение доли CD4+CD8+ клеток. Наиболее закономерно этот эффект проявлялся при действии пептидов Т-32 и Т-38. При этом увеличивалась доля зрелых тимоцитов, экспрессирующих один из ко-рецепторов при параллельном уменьшении содержания в этой фракции CD3+ тимоцитов.

Таким образом, при действии пептидов на кортикальные незрелые тимоциты проявлялся эффект, который можно рассматривать как проявление созревания меток, однако характерного для этого процесса усиления экспрессии молекулы рецепторного комплекса CD3 при этом не происходило. Аналогичный эффект наблюдался при действии пептидов на фракции зрелых «одинарно положительных» тимоцитов (CD4+CD8~n CD4"CD8+ клеток). Их численность не претерпевала значительных изменений, но в обеих фракциях закономерно уменьшалась доля клеток, экспрессирующих CD3, особенно при действии пептидов Т-32 и Т-38.

Влияние пептидов на дифференцировку естественных регуляторных CD4+CD25+

Т-клеток

Важнейшей функциональной субпопуляцией Т-лимфоцитов являются естественные регуляторные клетки, имеющие феиотип CD4+CD25+Foxp3+, основная функция которых состоит в предотвращении аутоиммунных процессов. Поскольку развитие аутоиммунных заболеваний достаточно часто сопряжено со старением, было проведено изучение влияния пептидов на формирование клеток с фенотипом CD4*CD25+ в культурах клеток эмбриональной печени, нефракционировапнных тимоцитов эмбрионов человека, клетках периферической крови, а также в основных фракциях тимоцитов.

Основные полученные результаты сводятся к следующему. Ни в одном случае инкубации клеток эмбриональной печени и мопонуклеаров периферической крови с исследуемыми

пептидами не удалось индуцировать экспрессию указанной комбинации маркеров, в то время как при действии пептидов на нефракционированные тимоциты наблюдалось повышение содержания CD4 CD25* клеток под влиянием пептидов Т-32 и Т-38.

При культивировании с пептидами фракций тимоцитов, лишенных CD4 (CD4"CD8", CD4" CD8+) не наблюдалось появления на поверхности клеток CD25 и его сочетания этой молекулы с CD4. В то же время невысокий (но статистически достоверный) уровень CD25 экспрессировался при действии пептида Т-32 (в дозах 20 и/или 200 нг/мл) на CD4+ клетки фракций CD4+CD8+ и CD4+CD8". Во всех случаях процент индуцируемых CD4+CD25+ клеток был невелик (2,5 - 7%), но он значимо превышал уровень этих клеток в контроле (0 - 1,8%).

Полученные данные свидетельствуют о том, что пептид Т-32 способен индуцировать дифференцировку регуляторных Т-клеток, но не из клеток-предшественников и не из зрелых Т-лимфоцитов, а из С04*С025- тимоцитов.

Пептидергическая регуляция формирования иммунофенотипов лимфоцитов периферической крови человека

Влияние пептидов на мембранный фенотип лимфоцитов крови

На данном этапе проведено изучение действия пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена в трех концентрациях (2; 20 и 200 нг/мл) на численность мононуклеаров периферической крови, экспрессиругощих маркеры В-, NK- и Т-клеток, а также их субпопуляций и активированных форм.

Содержание В-клеток, экспрессирукицих CD19, в норме варьирует в пределах 7-10%. Пептиды Т-32 и Т-38 во всех трех концентрациях вызывали снижение процента CD19+ клегок примерно в 2 раза - до 4,5-5,5%. Содержание NK-клеток, экспрессирующих CD56, в норме составляет 3-7%. Тенденция к повышению содержания CD56+ клеток (до 8-10%) выявлена в культурах, обработанных концентрацией (20 и 200 нг/мл) пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена. Численность CD31" Т-клеток варьирует в норме в диапазоне 65-80%. Существенных отклонений в их численности под влиянием культивирования в присутствии пептидов не наблюдалось, хотя в ряде случаев их процент превышал 80% (особенно при действии пептидов Т-32 и Т-38 в концентрациях соответственно 200 и 20 нг/мл, когда процент CD3% клеток превышал 85%).

Более четко проявлялось влияние пептидов на экспрессию раннего маркера активации -молекулы CD69. В норме содержание CD3+CD69+ клеток не превышало 0,5%. Пептиды Т-38 и кардиоген в концентрации 200 нг/мл вызывали повышение процента этих клеток соответственно до 25,8 и 13,8% (рис.5). Однако пептиды еще сильнее увеличивали процент активированных мононуклеаров, не относящихся к Т-клеткам (вероятно, В-лимфоцитов и примеси моноцитов). В норме содержание CD3"CD 19+ клеток также было ниже 0,5%.

Пептид Т-38 в концентрациях 20 и 200 нг/мл, а также кардиоген во всех испытанных концентрациях повышали содержание этих клеток до 6-12% (максимум - 11,8% при действии пептида 9 в концентрации 200 нг/мл).

HLA-DR, молекула МНС класса II, в норме экспрессируется на В-лимфоцитах, а в условиях активации - наТ-клетках и моноцитах, являясь поздним активационным маркером. Инкубация с пептидами оказала на экспрессию HLA-DR менее значительное действие, чем на экспрессию CD69. Некоторое повышение процента CDS^HLA-DR* клеток (т.е. проявление поздней активации Т-клеток) наблюдалось при действии пептида Т-32 (20 иг/мл)

Содержание CD4~CD25+ может рассматриваться как еще один показатель активации лимфоцитов (за вычетом CD4+ клеток). В нормальной крови эти клетки практически отсутствуют (<0,5%). Очень значительное повышение содержания этих клеток (до 20-30%) наблюдается под влиянием пептидов Т-32, Т-38 (20 и 200 нг/мл), кардиогена (2, 20 и 200 нг/мл) (рис. 10). Пептид Т-38 и кардиоген вызывают также раннюю активацию лимфоцитов. Ни один из пептидов не вызывал экспрессии CD25 на CD4+ клетках, т.е. не индуцировал фенотип естественных регуляторных Т-клеток.

Как известно, соотношение CD4+ и CD8* Т-клсток в периферической крови близко к 2:1, и их проценты составляют соответственно 40-50% и 20-30%. «Дубль-положительные» (CD4*CD8+) Т-клетки практически отсутствуют в периферической крови (<1%). Существенных отклонений от нормы содержания CD44" и CD8+ клеток под влиянием пептидов Т-38 и кардиогена не наблюдалось. Значительное снижение процента CD4 клеток (31,7%) наблюдалось только при действии кардиогена в единственной концентрации (20 нг/мл). Напротив, сильное снижение процента «одинарно-положительных» CD84" клеток (до-6-15%) зарегистрировано при действии всех трех пептидов - Т-32 (200 нг/мл), Т-38 (20 нг/мл) и кардиогена (все испытанные концентрации).

Во всех случаях снижения содержания одинарно-положительных клеток ре111стрировалось резкое возрастание содержания «дубль-положительных» (CD4 CD8 ) Т-клеток. Их процент, таким образом, сильно возрастал при действии пептидов Т-32 и Т-38 (200 нг/мл) и кардиогеиа (все три концентрации). При этом процент CD4+CD84 клеток превышал 20% или приближался к этому уровню, т.е. превосходил нормальный уровень в 20-50 раз. Описанные сдвиги могут трактоваться как экспрессия молекулы CD4 на поверхности CD8+ клеток и только в одном случае (кардиоген - 20 нг/мл) - одновременно как появление молекулы CD8 на поверхности CD4 клеток.

А

78.5% о

0.2%

CD3 CD3-pe/CDi9-fitc

г> О.

Х„ U- vii-^ij!'

CD69

О „...,., "......... ........

10- 10' 10" 21.1% FL1-H

10'

54.3%

25.8%

10J 0.2%

3'

CD3

CD3-pe/CD69.fite

10 В.2%1

о*

CD69

10' 10- 103 10! FL1-H 11.1

73.5% о

CD3 С 33-pe/CD6S>-fitc

10 16.7%

10'

CD69

10* FL1-H

10 !

10*

8.0%

68.5% сэ

13.8%

CD3 CD3-pe/CD©-fitc

а.

X г, U. л ^ t ■ :

а < • ' CD69

□

1U 10' 10' 10' ю-

9.1% FL1-H 8.6%

Рис. 5. Экспрессия раннего маркера активации СЭбУ па Т (СОЗ4- правый верхний квадрант) и не-Т (ОБЗ-- правый нижний квадрант) клетках крови под влиянием пептидов. А - контроль; К - пептид Т-38, 200 нг/мл; В и Г - кардиоген в концентрациях 20 и 200 нг/мл соответственно.

Таким образом, проведенные исследования показали, что пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген оказывают выраженное лимфотропное действие при исследовании в культуре мононуклеаров крови человека, которое проявляется в некотором" снижении экспрессии маркера В-клеток (CD 19) и повышении - маркера NK-клеток (CD56), активации мононуклеаров (как Т-, так и не-Т-клеток), а также экспрессии ко-рецептора CD4 на значительной части CDS* клеток, т.е. в появлении большого числа CD4*CD8' клеток.

Экспрессия ко-рецепторов Т-клеток и молекулы CD25 на популяциях мононуклеаров крови человека, освобожденных от клеток, несущих один из ко-рецепторов (CD4 или CD8)

Магнитная иммуноселекция приводила к эффективному (практически полному) освобождению популяции мононуклеаров от CD4+ или CD8+ клеток: их уровень после фракционирования был в обоих случаях ниже 1%. После инкубации с пептидами в культуре мононуклеаров, освобожденных от CD4+ клеток, во всех случаях наблюдалась индукция экспрессии CD4: процент CD4+ клеток возрастал с 0+0,1% до 9,3+0,7%. Еще более был выражен эффект индукции молекулы CD8 на CD8~ клетках: процент клеток, несущих CD8, возрастал с 0,7±0,1% до 18,3+0,3%, т.е. эффект был выражен сильнее в два раза, чем в случае индукции CD4+ клеток. При этом под действием пептидов ни в одном случае не экспрессировались одновременно оба ко-рецепгора и не наблюдалось изменений содержания клеток, экспрессирующих тог рецептор, против которого не осуществлялась иммуноселекция.

Иммуноцнтохимическое и электронно-микроскопическое изучение действия пептидов

на дифференцировку стволовых клеток лимфоидного ряда тимуса человека

Данный этап исследования посвящен выяснению сигнальных молекулярных внутриклеточных механизмов поддержания пула дифференцированных клеток, индукция образования которых была стимулирована изучаемыми пептидами. При этом оценивалось влияние пептидов на жизнеспособность и функционалыгую активность как самих дифференцированных клеток, сформированных из стволовых клеток, так и различных оргапелл в них в условиях направленной пептидергической регуляции.

В данном случае объектом исследования послужили культуры субпопуляций тимоцигов, изолированных путем фракционирования на магнитных бусах:

1) предшественники Т-лимфоцитов (CD4~CD8~),

2) незрелые кортикальные клетки (CD4+CD8+),

3) зрелые медуллярные клетки (CD4+CD8~),

4) регуляторные Т-лимфоциты (С04+С025+).

Исследовали культуры клеток после воздействия на них трех коротких пептидов -Т-32, Т-38 и кардиогена (каждый в дозе 200 нг/мл). Клетки были прокультивированы с пептидами в течение 1 ч при 37°С. Контролем служили пробы клеток, не обработанных пептидами.

Для исследования жизнеспособности и функциональной активности клеток на указанных образцах проведено изучение экспрессии следующих маркеров: протеина р53 (проапоптозпый фактор), протеина mcl-l (аптиапоптозный фактор), циклина Ki-67 (фактор пролиферации). Поскольку известно, что белок р53 является проапоптозным белком, участвующим в запуске программы клеточной гибели, а экспрессия белка mel-1 напротив ингибируст процесс апоптоза, одновременное определение этих маркеров позволяет оценить долю клеток вступивших в апоптоз и долю клеток, имеющих внутреннюю защиту от запуска программируемой клеточной гибели.

На этих же образцах клеточных культур проведено ультраструктурное исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии с использованием уранафинной реакции.

Иммунокнтохимическое изучение субпопуляций к легок лимфоидногй ряда ни различных стадиях их дифференциацией из стволовых кЛеток

При иммупоцитохимическчм исследовании но всех сипах коммитированцых клеток лимфоидного ряда на различных стадиях их дифференцирован из ствол оных клеток была зарегистрирована экспрессия протейное Ю-67, р53 и тс!-!

Пролифератиячан активность (маркер - протеин К1-67). Морф о метрический анализ показал, что изучаемые пептиды оказываю!' неодинаковое действие на пролиферацию кооптированные клеток на различных стадиях их дифференцировки. Так, степень Пролиферативной активности преишесч пен пикон Т-лимфоцитов(С04 "СВ8") под действием пептидов Т-32, Т-38 и Кардиогена практически не отличается от котрольных показателей. Пролиферация незрелых кортикальных клеток ((Х>4*СШЦ) пол действием истияон Т-32 и Т-38 достоверно увеличивается (по только но показателю площади экспрессии), а под действием кардиогена ¡1С изменяется. Увеличение пролиферации незрелых кортикальных клеток иод действием пептидов Т-32 и Т-38 но показателю площади экспрессии (при не измен с иной оптической плотности) свидетельствует о достоверном увеличении пула незрелых кортикальных клеток.

контропь лцпшд T 3i cil;-;;! i!1 мардиигтеи

* . Показатели достоверно отличаются от ^рол я (р^О.Об)

Рис. 6. Оптическая плотность протеина Ki-67 в субпопуляциях-клеток тимуса человека н.ч различных этапах их дифференцировки из стволовых клеток

KOFJifjaiît ' I - ' ! ' "' i ' nemri^r.Jfs Кардиоген

* Показатели достоверно отличайся от контроля (р<0{)'-■

Рис, 7. Цйощадь экспрессии протеина Ki-67 в субпопуляциях клеток тимус|Человека на различных этапах их дифференцировки из стволовых клеток

Пролиферация зрелых медуллярных клеток (С1)4*СП)8~) усиливается под действием пептидов Т-32 и кардиогена, в то время как пептид Т-38 на этой стадии дифференцировки коммитированных клеток оказывается неэффективным.

Сводные результаты исследования эффектов пептидов на пролиферативную активность лимфоидных клеток отражены на рис. 6, 7.

Регуляция апоптоза (маркеры - протеин тс1-1 и р53). Эффекты изучаемых пептидов на процесс апоптоза оценивали по экспрессии двух ключевых молекул, поддерживающих баланс выживающих и умирающих клеток - протеина тс!-1 (антиапоптозного фактора) и протеина р53 (проапоптозный фактор).

Морфометрический анализ показал, что изучаемые пептиды оказывают неодинаковое действие на процессы апоптоза коммитированных клеток на различных стадиях их дифференцировки. Так, активность апоптоза в предшественниках Т-лимфоцитов(С04~СШ~) под действием пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена практически не отличается, от контрольных показателей. Процессы апоптоза в незрелых кортикальных клеток (СП4+С08*) под действием пептидов Т-32 и Т-38 достоверно снижаются (о чем свидетельствует достоверное возрастание экспрессии протеина тс1-1 с одновременным снижением экспрессии протеина р53), причем пептид Т-38 на этой стадии дифференцировки лимфоидных клеток более активен. Под действием кардиогена баланс апоптоза на этой стадии дифференцировки не изменяется.

Апоптоз на стадии зрелых медуллярных клеток (СП4ЧЖ8~) усиливается под действием пептида Т-32 (экспрессия протеина тс1-1 достоверно снижается, а протеина р53 возрастает), в то время как пептид Т-38 на этой стадии дифференцировки коммитированных клеток, наоборот, усиливает экспрессию протеина тс\-1 (не изменяя достоверно показатели экспрессии протеина р53), что свидетельствует о его способности стабильно обеспечивать жизнеспособность лимфоидных клеток на этой стадии их дифференцировки. Кардиоген не проявляет тропных к апоптозу свойств на описанных стадиях дифференцировки лимфоидных клеток.

Все изученные пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген проявляют выраженный антиапоптозный эффект в отношении регуляторных Т-лимфоцитов (СБ4+С025+), наиболее активным при этом оказывается пептид Т-38. Достоверное увеличение обеих параметров (оптической плотности и площади экспрессии) свидетельствует о высокой способности данных пептидов обеспечивать выживаемость клеток лимфоидного ряда для их последующей дифференцировки и функционирования.

Электронно-микроскопическое изучение субпопуляций клеток лимфоидного ряда на различных стадиях их дифференцировки из стволовых клеток

При электронно-микроскопическом исследовании культур коммитированных клеток эмбрионального тимуса человека определяется четыре субпопуляции клеток: предшественники Т-лимфоцитов - СВ4"С08~, незрелые кортикальные клетки - СВ4ЧЛ38+, зрелые медуллярные клетки — СП4+СИ8~ и регуляторные Т-лимфоциты - СС4+С025+.

Предшественники Т-лимфоцитов располагаются изолированно друг от друга, имеет округлую форму и сглаженную поверхность. Ядра крупные, занимают большую часть клетки, как правило, имеют правильную форму с неглубокими инвагинациями. Хроматин мелкодисперсный, распределен более или менее равномерно. В ядрах выявляются одно - два хорошо выраженных ядрышка, прилегающих к ядерной мембране. Основными цитоплаз-матическими органеллами этих клеток являются митохондрии и полирибосомы. Митохондрии чаще всего имеют округлую или овальную форму. Плотность их матрикса варьирует, однако клеток, содержащих митохондрии с уплотненным матриксом, относительно немного. Топографически большая часть цитоплазматических органелл локализуется в перинуклеар-ном пространстве. Полирибосомы, имеющиеся в большом количестве, занимают большую часть цитоплазмы; мембраны зернистого цитоплазматического ретикулума единичные и обнаруживаются не во всех клетках.

В незрелых кортикальных клетках пластинчатый комплекс развит слабо, во многих клетках обнаружить его не удается. Среди этой субпопуляции клеток эмбрионального тимуса часто выявляются клетки в разных стадиях митоза. По ультраструктурным характеристикам этот тип клеток можно отнести к низкодифференцированным, еще не имеющим выраженных признаков лимфоидной принадлежности.

На поверхности зрелых медуллярных клеток, формирующих скопления в виде небольших кластеров, появляются цитоплазматические отростки, иногда переплетающиеся между собой. Относительное содержание цитоплазмы в клетках увеличивается. Перинуклеарно практически во всех клетках определяются элементы пластинчатого комплекса и мелкие гранулы невысокой электронной плотности. В ядрах по периметру внутреннего листка кариолеммы отмечается слабая конденсация хроматина. Размеры и форма ядер варьируют: наряду с клетками, содержащими небольшие ядра правильной формы, обнаруживаются клетки с крупными ядрами овальной формы, часто с большими углублениями. Ядра содержат одно-два Крупных ядрышка, имеющих гомогенную тонкозернистую структуру. " ' ' '

Регуляторные Т-лимфоциты, как правило, образуют органотипические пласты,'имеют полигональную форму и тесно сцеплены между собой. Между отдельными клетками выявляются переплетающиеся цитоплазматические отростки в виде межклеточной «сеточки». В ядрах клеток, входящих в состав симпластов, увеличивается содержание гетерохроматина. В хорошо выраженных ядрышках появляются признаки фибриллярного строения. В цитоплазме увеличивается содержание цистерн зернистого эндопяазматического ретикулума и элементов пластинчатого комплекса, что свидетельствует об усилении секреторной функции этих клеток. В цитоплазме клеток в зоне пластинчатого комплекса появляется небольшое число, электронно-плотных гранул. Гранулы варьируют в размерах, имеют относительно гомогенную структуру центральной части и дают отчетливую уранаффинпозитивную реакцию, свидетельствующую о секреторной природе этих органелл. По периферии гранул определяется плотный узкий ободок, центральная зона гранул имеет несколько меньшую электронную плотность.

Полученные данные по ультраструктурному исследованию коммитированных клеток эмбрионального тимуса человека на различных стадиях их дифференцировки из стволовых клеток свидетельствуют о способности изученных пептидов усиливать пролиферацию и функциональную активность внутриклеточных органелл в коммитированных клетках лимфоидного ряда на различных стадиях их дифференцировки из стволовых клеток. Наиболее заметная активация наблюдается у органелл, задействованных в процессах дифференцировки и пролиферации клеток - полирибосом и пластинчатого комплекса. В ядрах клеток увеличивается содержание гетерохроматина В хорошо выраженных ядрышках появляются признаки фибриллярного строения. В цитоплазме увеличивается содержание цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума и элементов пластинчатого комплекса, что свидетельствует об усилении секреторной функции этих клеток. В цитоплазме клеток в зоне пластинчатого комплекса формируются электронно-плотные секреторные гранулы.

Следует отметить, что на различных стадиях дифференцировки коммитированных клеток, как в контроле, так и под действием пептидов при электронно-микроскопическом исследовании обнаруживаются как делящиеся клетки, так и гибнущие в форме апоптоза, что свидетельствует о балансе пролиферации и апоптоза на всех стадиях развития Т-лимфоцитов из стволовых клеток.

Таким образом, проведенное электронно-микроскопическое исследование показало, что под действием пептидов уменьшается число клеток на разных стадиях гибели пу тем апоптоза, который проявляется маргинацией хроматина и. уплотнением цитоплазмы, однако при этом (особенно при действии пептида Т-38) цитоплазматические органеллы сохраняются достаточно стабильно. На ранних стадиях апоптоза определяются резко очерченные локальные уплотнения ядерного хроматигга в виде гомогенной массы вдоль ггуклеолеммы, конденсация цитоплазмы при хорошей сохранности цитоплазматических органелл и исчезновение ворсинок. На поздней стадии апоптоза появляются признаки фрагментации

цитоплазматических органелл, образование мембраноограниченных микровакуолей и распад ядра на отдельные фрагменты. Однако, обращает внимание, что под действием пептидов таких клеток относительно немного, гораздо чаще встречаются нормально делящиеся клетки.

Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных факторов дифференцировки ТЭК при старении культур

Применение метода конфокальной микроскопии для изучения влияния пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена на экспрессию сигнальных факторов дифференцировки ТЭК - протеинов Рах1, НохаЗ и Т1.Р при старении культур показало, что все исследуемые пептиды обладают способностью активно усиливать экспрессию вышеуказанных маркеров, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах (табл. 3). Обращает на себя внимание тот факт, что показатели экспрессии указанных факторов в старых культурах (прошедших 7 пассажей) под действием пептидов имеют тенденцию даже превышать соответствующие показатели контроля (молодые культуры, прошедшие 1 пассажа). При этом наибольшей активностью среди изученных пептидов обладает пептид Т-38 (табл. 3).

Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки ТЭК в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген усиливают пролиферативную активность Т-лимфоцитов, ко-культивированных с ТЭК. Об этом свидетельствуют показатели количества тимоцитов в старых культурах (прошедших 7 пассажей), которые практически приближаются к контрольным значениям (при действии пептида Т-32) и даже превышают их (при действии пептидов Т-38 и кардиогена). Наибольшей активностью в этом отношении также обладает пептид Т-38 (табл. 4).

Проведенные исследования показали, что основными структурно-функциональными изменениями ткани тимуса в процессе онтогенеза и старения являются гетерогенность и гетерохронность возникновения и развития трансформаций в различных структурных элементах железы. Гетерогенность и гетерохронность проявляются на всех уровнях организации тимуса, однако они выражены неодинаково в различных клетках как паренхимы органа, так и микроокружения. Гетерогенность и гетерохронность также наблюдаются и на уровне внутриклеточных органелл, так, например, нередко измененные митохондрии и компоненты эндоплазматиЧеского ретикулума соседствуют с совершенно сохранными структурами. В основе этих явлений лежит принадлежность клеток, несущих эндокринный и иммунный фенотип к популяции дифференцированных постмитотических клеток, которые не утрачивают способность к митотическому делению при определенных условиях и сохраняют способность к восстановлению за счет стволовых клеток, длительность жизни которых значительно меньше продолжительности жизни всего организма.

Таблица 3

Морфометрнческие показатели экспрессии факторов дифференцировки ТЭК при действии пептидов в стареющих культурах

количество пассажей ТЭК (монокультура) Рах1 (площадь экспрессии) НохаЗ (площадь экспрессии) ТЬР (площадь экспрессии)

контр Т-32 Т-38 кард контр Т-32 Т-38 кард КО!ГГр Т-32 Т-38 кард

X пассаж (молодые культуры) 2.24 ± 0.08 2.56 ± 0,06 2.74 ± 0.05 • 2.19 ± 0.09 1.74 ± 0.06 1.92 0.20 2.68 0,09* 1.68 0.05 2.06 0.16 2.68 0.06* 4.12 ± 0.26* 2.17 0.05

4 пассажа (зрелые культуры) 1.16 ± 0.04* 5 64 1.05* 9.16 1.72* 3.46 ± 0.21* 0.72 ± 0.03* 3.16 ± 032* 5.75 =Ь 0.16* 1.63 * 0.03* 2.17 0.08 4.64 * 0.25* 5.84 л 0.64* 4.12 ± 0.68*

7 пассажей (старые культуры) 0.39 ± 0 01* 2.72 * 0.09* 284 ± 0.20* 3.88 0.15* 0.30 0.01* 4.52 * 0.31* 5.26 А 0.21* 2.54 ± 0.09* 2.38 ± 0.12 4.82 £ 0.32* 6.26 ± 1.16* 4.26 ± 0.82*

*- р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе Примечание: контр - контроль; кард - кардиоген.

Таблица 4

Количество Т-лимфоцитов (на 1 мм2) в стареющих ко-культурах с ТЭК при действии пептидов

количество пассажей контроль пептид Т-32 пептид Т-38 кардиоген

1 пассаж (молодые культуры) 23254±1272 27394*1316* 29058*1422* 24627*1254

4 пассажа (зрелые культуры) 18675*1178* 28627*1228* 32163*1527* 23416*1330*

7 пассажей (старые культуры) 14242*927* 24225*1264* 30263*1464* 26262*1038*

*- р<0.05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе

Следует отметить, что неравномерность инволютивных изменений (гетерогенность) и их разновременность (гетерохронность) являются общими чертами, характерными для процесса старения, и прежде всего, отмечаемые в эндокринных железах и иммунокомпетеитных органах. Подобные явления описаны в надпочечниках, гонадах, гипоталамусе [Ступина А. С. и др., 1986].

Проведенные нами исследования подтвердили данные, касающиеся других органов о том, что в тимусе также инволютивные процессы, связанные со старением, включают в себя изменения паренхиматозных элементов органа, стенок капилляров, а также межуточной соединительной ткани, что имеет особенно важное значение в эндокринных железах, богатых капиллярной сетью. В процессе старения в зидокринных железах происходит уменьшение числа клеток паренхимы. Это представляет собой общебиологический процесс, который описан почти во всех органах [Sato Т., Tauchi Н., 1978] и рассматривается как результат недостаточной физиологической регенерации.

Нами обнаружено появление в процессе старения клеток тимуса внутриядерных включений, особенно этот феномен характерен для ТЭК. Ранее, подобное явление было описано для гипоталамических нейронов [Ступина А. С. и др., 1987], а также для глиальных клеток и некоторых эпителиальных клетках, как в норме, так и в патологии [Tateshi J. et al., 1984]. Происхождение внутриядерных видов включений неодинаково. Как показано I. Fukui (1978), фибриллярные включения являются негистоновой фракцией ядерных белков и содержат актин и тубулин, что позволяет предположить их участие во внутриядерной динамике. Наличие внутриядерных включений преимущественно в клетках старых животных позволяет связать их с возрастными особенностями метаболизма. По-видимому, уменьшая эффективный ядерный объем, включения нарушают полноценное функционирование клеток. Появление этих структур при патологических процессах дает основание рассматривать их как признаки гибели клеток [Brion I. eí al., 1982]. К таковым можно отнести вакуолеобразные включения, являющиеся, по нашему мнению, начальными признаками глубоких изменений ядра с развитием вакуолизации.

Таким образом, в структуре ядер клеток тимуса, особенно ТЭК, при старении развиваются изменения, свидетельствующие, с одной стороны, о снижении интенсивности белкового синтеза (гетерохроматизация, появление внутриядерных включений); с другой стороны, об адаптационных процессах, направленных на поддержание функции ядра (в части клеток увеличиваются объем ядер, площадь ядерных мембран).

Нами показано, что в процессе старения происходят изменения во всех органеллах тимоцитов, ТЭК и клеток микроокружения. Среди органелл клетки при старении раньше других и наиболее постоянно изменяются энергообразующие структуры: меняются форма, величина, внутренняя структура митохондрий, а также их число.

Изменяются в процессе старения и белоксинтезирующие органеллы цитоплазмы: уменьшается площадь гранулярной эндоплазматической сети, цистерны ее, как правило, расширены; снижается плотность расположения рибосом на мембранах ретикулума. Вместе с тем в отдельных клетках структурная организация гранулярной эндоплазматической сети имеет признаки высокой степени синтетических процессов — обилие канальцев и цистерн, мембраны которых богаты рибосомами, близость их к митохондриям и ядерной мембране.

Неоднозначны при старении перестройки пластинчатого комплекса: нередко в рядом расположенных клетках наряду с атрофией его канальцев и везикул в некоторых встречаются гиперплазия и гипертрофия структур пластинчатого комплекса, увеличиваются объем и площадь элементов комплекса, что также можно рассматривать как адаптационную реакцию.

Характерны для процессов старения изменения лизосомального аппарата. Наблюдается увеличение числа первичных лизосом, располагающихся в различных участках цитоплазмы, преимущественно вблизи или в непосредственном контакте с поврежденными органеллами (чаще митохондриями), что позволяет рассматривать увеличение числа первичных лизосом как реакцию на старческую инволюцию тимуса.

Нередко первичные лизосомы обнаруживаются в области пластинчатого комплекса, что указывает на процесс их формирования. Наиболее постоянный признак старения клетки - появление вторичных лизосом и постлизосом в виде остаточных телец и миелиноподобных структур. Вторичные лизосомы встречаются в различных участках цитоплазмы, чаще — на периферии клетки, и имеют сложное строение, включая липидные капли, электронно-плотный материал, гомогенный или волокнистый, а также зерна липофусцина. Наиболее многочисленные исследования, посвящены накоплению липофусцина в клетках нервной системы в процессе старения [Агафонов В. А., 1977; 1кес1а Н. е1 а1., 1985; Р15с11ег-Со1Ьпе К., е1 а1., 2005] них показано, что степень накопления липофусцина соответствует выраженности других морфологических признаков старения и свидетельствует о темпе этого процесса. При этом появление липофусцина в клетках при старении рассматривается как накопление балластных веществ — недоокисленных продуктов липидного распада.

Следует отметить, что описанные нами инволютивные изменения в ядре и цитоплазме клеток тимуса выражены в различных клетках неодинаково и встречаются не во всех клеточных элементах; рядом с измененными клетками или органеллами присутствуют полностью сохранившиеся структуры. Это позволяет считать, что и в пожилом и старческом возрасте инволютивный тимус сохраняет определенную (хотя и редуцированную) структурно-функциональную потенцию для регуляции иммунных процессов. Учитывая это, поиск и разработка иммуногеропротекторов является перспективной задачей геронтологии, поскольку в тимусе в определенной мере сохраняются внутриклеточные мишени для их действия.

Полученные нами данные об изменении уровней экспрессии некоторых ключевых сигнальных молекул в клетках тимуса в процессе онтогенеза и старения позволяют более детально представлять механизм сложных нейроиммуноэндокринных взаимоотношений, складывающихся в органе в процессе его жизнедеятельности

В наших исследованиях был обнаружен высокий уровень экспрессии серотонина в период эмбриогенеза (22-33 неделя внутриутробного развития) и в период раннего онтогенеза (первые 4 года жизни). Ранее нами было показано [В.О. Полякова и др., 2002], что серотонин в тимусе экспрессируется, начиная с 12 недели внутриутробного развития. Таким образом, экспрессия серотонина в период становления тимуса как лимфоидного органа может свидетельствовать в пользу того, что эндокринная функция тимуса на ранних этапах развития является приоритетной.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о положительных корреляционных связях между усилением экспрессии серотонина в ТЭК человека с возрастом и усилением пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе, что

подтверждает имеющиеся в литературе сведения о митогенном действии эндогенного серотонина на пролиферацию лимфоидных клеток и ингибирующем действии на этот процесс соматостатина [Conlon J.M., Larhammar D., 2005].

В тимусе, подвергшемся возрастной инволюции, когда паренхима в значительной степени замещена жировой тканью, и снижены все показатели Т-системы иммунитета, экспрессия серотонина поддерживается на высоком уровне. В нашей работе показана интенсивная экспрессия этого гормона в тимусе людей старческого возраста. На nain взгляд, это может отражать тот факт, что роль тимуса как эндокринной железы остается существенной в организме человека даже после значительного угасания иммунной функции органа. Также был обнаружен феномен усиления экспрессии эндотелина-1 в тимусе на фоне возрастной инволюции железы. У людей старше 50 лет процесс замещения паренхимы тимуса жировой тканью достигает своего пика, а это, в свою очередь, влечет за собой значительное снижение функций иммунной системы. Для эндогенных эндотелинов показаны эффекты поддержания и стимуляции пролиферации тимоцитов [Kasahara S., Cooper E.L., 2004] и клеток эндотелия [Hansenne I., 2005]. Принимая во внимание эти данные, зарегистрированное нами усиление экспрессии эндотелина-1 при старении можно расценивать как компенсаторную функцию, которую несут сосуды тимуса, способствуя ■ поддержанию базового уровня продукции Т-лимфоцитов в тимусе.

В обеспечении иммунной функции тимуса большое значение имеет нормальное развитие и функционирование ТЭК и клеток микроокружения. Сигнальные факторы дифференцировки ТЭК - транскрипционные протеины Paxl, НохаЗ и TLP экспрессируются, начиная с эмбриональных стадий развития тимуса [Rehman H.U., Masson Е.А., 2005]. Экспрессия указанных протеинов необходима для формирования тимусного микроокружения, являющегося необходимым условием созревания нормальных Т-лимфоцитов. В наших исследованиях впервые показано снижение экспрессии сигнальных факторов дифференцировки ТЭК - протеинов Paxl, НохаЗ и TLP в процессе онтогенеза и старения тимуса у человека, что согласуется с вышеприведенными данными, касающимися экспериментальных животных. Теоретические предпосылки возможности усиления экспрессии этих факторов в клетках тимуса у старых людей для поддержания его иммунокомпетентной функции оказались перспективными, о чем свидетельствует анализ полученных данных при применении пептидов, изложенный ниже в соответствующем разделе.

Старение живого организма сопровождается снижением интенсивности пролиферации и потерей клеток. Процесс возрастной элиминации клеток генетически детерминирован, и имеет одинаковые цитологические и биохимические проявления в различных органах и тканях, обозначаемые как физиологическая программированная,гибель клеток или "апоптоз". Термин "апоптоз" был впервые предложен в 1972 году Kerr et al. для обозначения особого типа клеточной гибели, морфологически отличающегося от некроза. Показано, что апоптозная гибель клеток, будучи инициированной различными эндогенными и экзогенными стимулами очень низкой интенсивности, осуществляется по особой программе, способствующей элиминации нежизнеспособных клеток, несущих критические структурные повреждения ДНК.

Основным регулятором апоптоза у млекопитающих является ген bcl-2, активная экспрессия которого тормозит развитие апоптоза. Прямым отражением этого служит факт массивной клеточной гибели нервных и гемопоэтических клеток в процессе эмбрионального развития мутантных мышей с "выключенным" bcl-2 геном. Эти данные в свою очередь подтверждают мнение о том, что стимуляция апоптоза укорачивает длительность жизни организмов [Smith R.G., Betancourt L., Sun Y., 2005]. Известно, что возрастная инволюция эпифиза, тимуса, половых желез, других органов и тканей у млекопитающих сопровождается апоптозом клеток их паренхимы. При этом доказано, что у человека патологическая индукция апоптоза приводит как к возникновению и развитию тяжелых заболеваний, сопровождающихся массивной дегенерацией клеток (например, болезнь Альцгеймера), так и

к преждевременному старению [Wu Y.H, Swaab D.F., 2005]. Поэтому одним из актуальных направлений в современной геронтологии является поиск и разработка препаратов, стабилизирующих физиологическую гибель клеток путем апоптоза в нормально функционирующих органах на генетически детерминированных уровнях.

В связи с тем, что белок mcl-l (который входит в семейство Ъс1-2) играет ключевую роль в обеспечении выживания клеток, препятствуя развитию апоптоза, его экспрессию в различных структурах активно исследуют в последние годы. В настоящее время экспрессия протеина mcl-l обнаружена в дифференцированном эпителии предстательной железы, молочной железы, кишечника, легких и других органов, а также в B-лимфоцитах. В то же время отсутствуют работы об экспрессии фактора mcl-1 в эпителиальных структурах тимуса.

Проведенные нами исследования позволили верифицировать экспрессию ключевых белков программированной клеточной гибели - проапоптозного белка р53 и антиапоптозного белка mcl-l в структурах нелимфоидного компонента тимуса людей разных возрастных групп. При этом был зарегистрирован следующий факт - максимальная интенсивность экспрессии белка mcl-l была отмечена только у эмбрионов, ее быстрое снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатаяьного онтогенеза.

Сопоставление результатов интенсивности экспрессии протеинов mcl-l и р53 позволяет сделать вывод об интенсивности процесса апоптоза и, соответственно скорости инволюции в рассматриваемых возрастных группах. Интересные результаты получены для людей пожилого и старческого возраста, в тимусе которых продолжается экспрессия белка mcl-l, хотя и на заметно более низком по сравнению с эмбрионами и детьми первого года жизни уровне. В то же время площадь экспрессии белка р53 ниже более чем на 20% у людей пожилого возраста и на 40% у людей старческого возраста по сравнению с детьми первого года жизни. Эти данные, по-видимому, отражают замедление процессов инволюции в этих возрастных группах.

Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают полученные нами ранее данные в исследованиях in vitro и сведения из литературы о том, что инволюция тимуса начинается уже в первый год жизни ребенка [Кветной И.М., Полякова В.О., Ярилин A.A., 2005, Ollson K.M., 2005].

По данным литературы известно, что к 40 годам происходит замещение значительной части паренхимы тимуса жировой тканью, после достижения этого возраста инволюция органа замедляется и атрофия паренхимы происходит со скоростью 0,1 % в год. Исходя из полученных нами результатов, можно предположить, что замедление инволюции связано не с увеличением продукции антиапоптозного белка mcl-l в нелимфоидном компоненте тимуса, а с возрастным уменьшением экспрессии проапоптозного фактора р53.

Проведенные нами исследования подтверждают складывающиеся в последние годы представления о том, что тучные клетки (мастоциты) продуцируют не только биогенные амины, некоторые регуляторные пептиды и гликозоаминогликаны, но обладают разнообразной гормональной функцией, экспрессируя обширный класс сигнальных молекул, обеспечивающих локальную регуляцию нейроиммуноэндокринных межклеточных коммуникаций в различных органах при конкретных обстоятельствах.

Верифицированная нами экспрессия NO-синтазы в тучных клетках тимуса человека свидетельствует об активном участии мастоцитов в механизмах окислительного стресса, который является одной из наиболее частых причин развития инволюционных, нейродегенеративных и гипоксических процессов, сопровождающих процессы старения и приводящих к структурно-функциональной атрофии органов и тканей.

Полученные результата свидетельствуют о достоверном возрастании экспрессии NO-синтазы в тучных клетках тимуса у людей пожилого и старческого возраста по показателю оптической плотности, что отражает усиление их синтетической функции для данного фермента. При этом, общее количество тучных клеток, иммунореактивных к NO-синтазе (по показателю процента суммарной площади), возрастая у людей пожилого возраста, снижается в старческом возрасте до антенатального уровня.

Зарегистрированные факты представляют большой интерес, иллюстрируя возрастающее усиление синтеза ключевого фермента накопления свободных радикалов в ткани тимуса в процессе онтогенеза, что, естественно, приводит к инволюционным процессам, сопровождающим старение организма. Подобная возрастная динамика зарегистрирована нами в ткани тимуса и со стороны дендритных клеток, что является еще одним из проявлений сохранения определенных (хотя и значительно сниженных) •иммунологических функций-тимуса у старых людей. Учитывая, что дендритные:тклетки, с одной стороны, являются основными антиген-презентирующими клетками, а с другой, несут, помимо этого, выраженные регулягорные свойства, экспрессируя многие цитокины и цитотоксические факторы, сохранение в какой-то мере их функции в старческом возрасте обеспечивает необходимую протекцию старого организма от инфекционных факторов, аллергенов и опухолетропных воздействий. Полученные нами результаты свидетельствуют о достоверном возрастании экспрессии протеина СШ5 на дендритных клетках тимуса человека в процессе онтогенеза, что, по-видимому, может служить защитой этих важных клеток от атаки собственной системой комплемента, которая может происходить при аутоиммунных процессах, частота которых повышается с возрастом. Такая защита представляется особенно важной в связи с тем, что, как показано нами, количество дендритных клеток в тимусе у людей старческого возраста достоверно уменьшается, что по-видимому, связано со структурной инволюцией железы.

Резюмируя полученные нами данные по изучению особенностей экспрессии .ключевых сигнальных молекул в тимусе в процессе его онтогенеза и старения, следует подчеркнуть, что инволюционные морфологические изменения в тимусе, регистрируемые при старении, не носят фатального характера. Сохраняя (хотя и в сниженной мере) присущие ему регуляторные нейроиммуноэндокринные функции, верифицируемые при иммуногистохимических исследованиях, тимус участвует в обеспечении адаптационных и компенсаторно-приспособительных процессов в старом организме для обеспечения его жизнедеятельности.

В настоящее время многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о важной роли мелатонина (МТ) - гормона, синтезируемого пинеалоцитами эпифиза и другими клетками диффузной нейроиммуноэндокринной системы в регуляции физиологических и патологических процессов в живом организме [Квегаой И.М., 2002; Саг<ИпаИ О., 2004]. Основными эффектами МТ являются универсальная координация им биологических ритмов, иммуностимулирующее действие, проявление антиоксидантных свойств, цитостатическое и антиопухолевое действие.

При старении происходит инволюция пинеальной железы, гипоплазия экстра-пинеальных источников МТ, что приводит к резкому снижению продукции гормона и развитию патологических состояний, ассоциированных с возрастом. Описанные сведения подтверждают концепцию существования тесных связей между МТ и старением и отражают актуальность изучения механизмов проявления МТ геропротекторных свойств. Проведенные нами исследования позволили детализировать влияние различных доз МТ на клетки тимуса при их старении т vitro. Обработка тимоцитов человека МТ т vitro, влияет на проявления активации тимоцитов, индуцируемые контактом с ТЭК: МТ ослабляет экспрессию раннего маркера активации СЭ69 и усиливает экспрессию поздних маркеров активации СВ54 и НЬА-1Ж. Исследования показали, что МТ защищает тимоциты от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК.

МТ оказывает выраженное действие на мононуклеары крови и активированные Т-лимфоциты. Он ослабляет экспрессию внутриклеточного ИЛ-4, а высокие дозы МТ -также внутриклеточного ИФНу. При низких дозах этого вещества создаются условия для сдвига баланса цитокинов в пользу ИФНу, что, очевидно, отражает преобладание дифференцировки активированных Т-лимфоцитов в ТЫ-клетки. Ослабление выработки ИЛ-4 дает основание надеяться на проявление благоприятного действия МТ при аллергических заболеваниях. Проведенное исследование показало, что МТ оказывает определенное

действие на процессы образования рибосом в тимоцитах и ТЭК при их совместном культивировании. МТ снижает экспрессию аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов (ОЯОР), ответственных за синтез, сборку и транспорт рибосом в цитоплазму, предопределяя, таким образом, снижение синтеза белка и образования рибосом. МТ вызывал значительное снижение уровня экспрессии аргирофильных белков в ТЭК, что можно рассматривать как отражение угнетения транскрипционной активности рибосомных генов, а также подавления пролиферативной активности (слеток. ■

Имеющиеся в литературе и наши данные позволяют предполагать, что инволюция • вилочковой железы имеет место уже в период полового созревания. Атрофия коры органа сопровождается снижением выброса в кровь гормонов тимуса, что приводит к подавлению иммунных реакций, в частности тех, которые связаны с функцией Т-кяеток. Снижение продукции тимусом множества секреторных факторов, в том числе тимопоэтина, тимозина а-1, тимулина, тимического гуморального фактора с возрастом обусловлено функциональной активностью эпителиальных секреторных клеток тимуса.

При инволюции вилочковой железы число лимфоцитов, циркулирующих в крови, существенно не уменьшается, а скорее изменяется пропорция субпопуляций Т-клеток, что ведет к снижению титра антител. Так, например, ответ организма хозяина на трансплантат с возрастом снижается.

Инволюция тимуса проявляется снижением его способности вносить вклад' в окончательную дифференцировку лимфоцитов. Последнее, возможно, является причиной снижения способности иммунной системы отличать чужеродные макромолекулы от собственных и активации аутоиммунных процессов. Возрастная инволюция тимуса, занимающего ключевую позицию в иммунной системе, играет важную роль в происходящем по мере старения угнетении иммунитета, приводящем к возникновению в пожилом возрасте многообразных дисфункций гомеостаза.

Изучение и разработка подходов профилактики иммунного истощения открывает новые перспективы продления периода активной жизнедеятельности человека. Проведенные нами исследования показали, что МТ может явиться перспективным геропротектором по отношению к иммунной системе, однако, для выяснения детального механизма его действия с учетом применения различных доз подобные исследования должны быть продолжены и детализированы.

Проведенные в последние годы исследования по изучению роли пептидов в организме человека и животных позволили оценить и уточнить влияние, этих- веществ на течение обменных процессов на всех уровнях организации живой материи: молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом, органном и орГанизменном. В настоящее время система пептидов рассматривается в качестве универсальной при нейроиммуноэндокринных взаимодействиях. Эти представления позволяют расширить понимание общности сложных и взаимосвязанных между собой механизмов химической регуляции процессов жизнедеятельности организма и разработать принципиально новые подходы к коррекции гомеостатических нарушений. Особое внимание геронтологов сосредоточено на выяснении биологических механизмов, лежащих в основе заболеваний, Присущих людям пожилого возраста - иейродегенеративных, онкологических заболеваний, патологии, связанной с ослаблением иммунной системы организма. ,

Фундаментальные исследования, предпринятые с этой целью на молекулярном и клеточном уровне, предоставляют неопровержимые доказательства ключевой роли эндогенных пептидов в регуляции гомеостаза и дисбаланса их продукции при старении организма. Учитывая эти обстоятельства нами было проведено изучение трех синтетических пептидов - Т-32, Т-38 и кардиогена на дифференцировку иммунокомпетентных клеток с целью оценить возможность пептидергической коррекции нарушенных при старении функций тимуса как иммунокомпетентного органа.

Анализируя полученные данные можно резюмировать, что наиболее характерным эффектом исследованных пептидов является ослабление экспрессии маркеров популяции и

субпопуляций Т-клсток CD3, CD4 и CD8. Ослабление экспрессии CD3 проявлялось как в целой популяции тимоцитов, так и в изолированных фракциях. При действии на нефракционированиые тимоциты регистрировалось увеличение доли CD4 CD8 за счет снижения содержания более зрелых CD4+CD8" или CD4~CD8+. В то же время в изолированной фракции CD4+CD8+ тимоцитов доля клеток с таким фенотипом уменьшалась. Полученные данные не дают права трактовать их как свидетельство влияния пептидов на дифференцировку или селекцию тимоцитов, скорее они модулируют экспрессию мембранных молекул на клетках, не перемещая их по стадиям развития. Однако, при этом уровень экспрессии мембранных молекул может изменять функции клеток, в частности их ответ па антигены.

. Проведенные исследования показали, что пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген, оказывают выраженное лимфотропное действие при исследовании в культуре мононуклеаров крови человека, которое проявляется в некотором снижении, экспрессии маркера B-клеток (CD19) и повышении - маркера NK-kjictok (CD56), активации мононуклеаров (как Т-, так и не-Т-клеток), а также экспрессии ко-рецептора CD4 на значительной части CDS'" клеток, т.е. в появлении большого числа CD4fCD8+ клеток. Последний эффект, наиболее сильно выраженный, свидетельствует о том, что пептиды определенным образом снимают репрессию генов второго ко-рецептора (обычно CD4). Это явление описано при некоторых условиях активации периферических Т-лимфоцитов [Ярилин A.A., 2001].

Данные о влиянии изучаемых пептидов на популяции зрелых лимфоцитов периферической крови, свидетельствуют о том, что помимо слабо выраженного модифицирующего действия на экспрессию популяциопных маркеров (ослабление экспрессии CD19, усиление экспрессии CD56 и CD3), наблюдается два сильно выраженных эффекта: 1)экспрессия маркеров активации (CD69, HLA-DR, CD25) как на Т-клетках, так и на других моноуклеарах (при этом активация не сопровождалась пролиферацией клеток -пептиды несколько ослабляют митоген-индуцированную пролиферацию Т-клеток); 2) одновременная экспрессия обоих ко-рецепторов (CD4 и CD8), как правило, за счет экспрессии молекул CD4 на CD84" Т-клетках. Если изменение уровня экспрессии маркеров популяций можно трактовать как модуляции, обусловленные изменением конформации мембраны, то два последних феномена вероятнее реализуются на уровне генов. Экспрессия второго ко-рецептора на зрелых клетках может в определенных условиях сопровождать активацию меток.

Применение метода конфокальной микроскопии для изучения' влияния пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена на экспрессию сигнальных факторов дифференцировки ТЭК - протеинов Paxl, НохаЗ и TLP при старении культур показало, что все исследуемые пептиды обладают способностью активно усиливать экспрессию вышеуказанных маркеров, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах.

Известно, что экспрессия вышеуказанных пептидов является ключевым механизмом регуляции созревания и функционирования Т-лимфоцитов. Резкое снижение уровня синтеза транскрипционных протеинов, зарегистрированное нами в тимусе человека при старении, естественно влечет и значительную редукцию Т-лимфоцитов в пожилом и старческом возрасте, что приводит к возникновению иммунодефицитов и других тяжелых иммунных и эндокринных нарушений. Поэтому особого внимания заслуживает установленный нами факт, свидетельствующий о том, что параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки ТЭК в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролифератишгую активность Т-лимфоцитов, ко-культивированных с ТЭК, поднимая ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

Таким образом, проведенные исследовании демонстрируют несомненную перспективность поиска и разработки методов пептидергической регуляции и коррекции иммунного гомсостаза для профилактики возрастных нарушений нейроиммуноэндокринной регуляции.

39

ВЫВОДЫ

1. В процессе старения тимуса ипволютивные изменения развиваются гетерохронно и затрагивают как паренхиму, так и микроокружение железы (тучные клетки, макрофаги, дендритные клетки, эндотелий капилляров). Основные из них сводятся к следующему: гетерохроматизация и появление внутриядерных включений, гипоплазия и деструкция белоксинтезирующих органелл- - митохондрий, эидоплазматического ретикулума, рибосом, пластинчатого комплекса. В процессе старения в тимусе прежде всего отмечается резкое уменьшеггае числа Т-лимфоцитов и ТЭК.

2. В тимусе человека впервые зарегистрирована активная экспрессия пептидных гормонов и биогенных аминов. Серотонин, мелатонин и соматостатин верифицируются в ТЭК, формирующих тельца Гассаля, и в тучных клетках. Отдельные ТЭК демонстрируют иммунореактивность к глюкагону и гастрину. Экспрессия эндотелина-1 обнаружена в капиллярах тимуса. В различных субпопуляциях тимоцитов человека, находящихся на различной стадии дифференцировки, впервые идентифицированы следующие гормоны: в предшественниках Т-лимфоцитов (СВССБЙ") - серотонин и мелатонин; в незрелых кортикальных клетках (С04+СР81) - только серотонин, в зрелых медуллярных клетках -серотонин, мелатонин, р-эндорфин и гистамин.

3. При старении в тимусе человека усиливается экспрессия серотонина и эндо-телина-1, что свидетельствует об их иммунотропной роли, направленной на поддержание иммунитета в стареющем организме через активацию Т-лимфоцитов.

4. Транскрипционные протеины, регулирующие дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЬР — необходимые для созревания и функционирования Т-лимфоцитов экспрессируются в тимусе человека, начиная с внутриутробного развития железы и их экспрессия снижается в процессе онтогенеза и старения. Учитывая их важную роль в регуляции созревания и поддержания пула Т-лимфоцнгов, данный факт можно расценить как ключевое звено в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста.

5. Впервые зарегистрировано значительное снижение популяции дендритных клеток у людей старческого возраста, что связано со структурной инволюцией железы. Однако, при этом экспрессия протеина СП35 на них возрастает у людей пожилого и старческого возраста, отражая способность дендритных клеток выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах, частота которых с возрастом повышается.

6. Пролиферация и аггаптоз клеток тимуса корреляционно связаны с локальной экспрессией гормонов. Выявлена отчетливая тенденция к усилению с возрастом экспрессии серотонина и снижению выработки соматостатина в ТЭК, росту пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе, снижению индексов пролиферации в мозговом веществе. Максимальная интенсивность экспрессии антиапоптозного белка шс!-1 отмечена у эмбрионов, ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоптозного белка р53, что свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии тс1-1, а с уменьшением экспрессии фактора р53. Обнаружение четких корреляций между экспрессией указанных гормонов и пролиферативной активностью тимоцитов отражает важное участие нейроиммуноэндокринпых механизмов в паракринной регуляции морфо-функционального созревания тимуса в процессе онтогенеза и старения.

7. В тимусе людей пожилого и старческого возраста достоверно возрастает экспрессия МО-синтазы, что свидетельствует о компенсаторной роли этого фермента в инволюционных процессах, развивающихся в тимусе с участием свободных радикалов при старении организма.

8. Мелатонин обладает иммуногеропротекторными свойствами. Показано его участие в защите тимоцитов от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК, обусловленное снижением экспрессии аргирофильпых белков областей ядрышковых организаторов под его

действием. Ои также усиливает спонтанную выработку цитокинов тимоцитами. Разработка конкретных рекомендаций по его применению требует продолжения детального изучения механизма действия различных доз данного гормона.

9. Проведенные исследования позволили впервые оценить роль и значение пептидергической регуляции в процессах диффереицировки и старения иммунокомпетент-ных клеток. Синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиогеп при введении их в культуру клеток тимуса плодов человека 14-26 недель развития повышают экспрессию лимфоидных и миелоидных линейных маркеров на 15%. Мишенями действия пептидов в данном случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессиирующие CD34.

10. Инкубация с пептидами тимоцитов плодов человека и моионуклеаров крови взрослых людей вызывает изменение экспрессии маркеров популяций и субпопуляций лимфоцитов. На тимоцитах наблюдается снижение экспрессии CD3, CD4 и CD8, на лимфоцитах крови - ослабление экспрессии CD19 и усиление - CD56 и CD3. Пептиды Т-32 и Т-38 вызывают экспрессию CD25 на CD4+ клетках тимуса плодов человека, индуцируя, таким образом, проявление мембранного фенотипа естественных регуляторных Т-клеток (CD4<"CD254). Все исследуемые пептиды вызывают экспрессию CD4 на CD8+ лимфоцитах крови взрослых людей, способствуя появлению Т-клеток, экспрессирующих оба ко-рецептора (С04+С08+ - фенотип кортикальных тимоцитов). Спектр эффектов, оказываемых пептидами на кроветворные клетки и лимфоциты, может рассматриваться как проявление их влияния на геном (дифференцировка клеток) и клеточную мембрану (модулирующие эффекты).

11. Изученные пептиды оказывают неодинаковое действие на пролиферацию субпопуляций клеток на различных стадиях их диффереицировки. Под действием пептидов Т-32 и Т-38 усиливается пролиферация незрелых кортикальных клеток. Пептиды Т-32 и кардиоген усиливают пролиферацию зрелых медуллярных клеток (CD4+CD8~). Все изученные пептиды проявляют выраженный пролиферотропный эффект в отношении регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25+), что свидетельствует о высокой способности пептидов усиливать выживае,мость и ускорять дифференцировку клеток лимфоидного ряда.

.12. Изученные пептиды оказывают неодинаковое действие на процессы апоптоза в субпопуляциях клеток на различных стадиях их диффереицировки. Активность апоптоза в предшественниках Т-лимфоиитоb(CD4 CD8~) под действием пептидов не изменяется. Процессы апоптоза в незрелых кортикальных клеток (CD4*CD84) под действием пептидов Т-32 и Т-38 достоверно снижаются. Апоптоз на стадии зрелых медуллярных клеток (CD4+CD8~) усиливается под действием пептида Т-32, в то время как пептид Т-38 на этой стадии диффереицировки коммитированных клеток, наоборот, усиливает экспрессию протеина mcl-1, что свидетельствует о его способности стабильно обеспечивать жизнеспособность лимфоидных клеток на этой стадии их диффереицировки. Все изученные пептиды проявляют выраженный антиапоптозный эффект в отношении регуляторных Т-лимфоцитов (CD4*CD25*), наиболее активным при этом оказывается пептид Т-38.

13. Под действием пептидов усиливается жизнеспособность коммитированных клеток лимфоидного ряда, что проявляется наиболее заметной активацией органелл, задействованных в процессах диффереицировки и пролиферации клеток - полирибосом и пластинчатого комплекса. Проведенные исследования свидетельствуют о высокой способности пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена обеспечивать выживаемость клеток лимфоидного ряда для их последующей диффереицировки и функционирования.

14. Все исследуемые пептиды обладают способностью активно усиливать экспрессию сигнальных факторов диффереицировки ТЭК - протеинов Paxl, НохаЗ и TLP, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах. Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов диффереицировки ТЭК в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают нролиферативную активность Т-лимфоцитов, ко-культивированных с ТЭК и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

15. Проведенные исследования свидетельствуют о важной роли нейроимму-ноэндокринных сигнальных молекул в регуляции онтогенеза тимуса, что, в свою очередь, демонстрирует несомненную перспективность поиска и разработки методов пептидерги-ческой регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При диагностике иммунодефицитных состояггггй, протекающих самостоятельно, или отягощающих течение других заболеваний у больных пожилого и старческого возраста, рекомендуется проводить иммуноферментный анализ содержаггия мелатонигга, факторов дифференцировки ТЭК и дендритных клеток тимуса для выяснения сохранности функций железы в стареющем организме.

1. При возникновении нейроиммуноэндокринпых нарушений у пожилых и старых людей рекомендуется проводить анализ содержания мелатонина в крови или мочи и при его дефиците применять препараты мелатонигга в качестве сопутствующей терапии основных заболеваний.

3. Учитывая установленные иммуногеропротекторные свойства пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена целесообразно провести клинические испытания их в качестве геропротекторных средств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕР ТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Биогероктологические аспекты исследования нейраэндокршшых клеток в культуре ткани / Чалнсова Н.И., Кветной U.M., Коновалов С.С., Князышн И.В., Полякова В.О. // Усп. геронтол. -2005. - № 17. - С. 42-49.

2. Влияние аминокислот и антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов на культуру лимфоидной ткани / Чалисова 1Ш., Закуцкий А.Н., Анискина А.И., Полякова В.О., Филиппов C.B., Зезюлин П.Н. // Мед. акад. журнал. - 2006. - Т. 49, № 6. - С. 57-63.

3. Мелатонин - молекулярный маркер опухолевых и нейродегенеративных заболеваний / Квешой И.М., Кветная Т.В., Раяхлин Н.Т., Хейфец В.Х., Эркавдес-Яго X., Полякова В.О., Трофимов A.B., Блеса Х.-Р. // Молек. мед. - 2005. - № 1. - С. 25-34.

4. Молекулярная нейроиммуноэндокринологня тимуса / ПоляковаВ.О., Кветной И.М., Ярилин A.A., ■ Пальцев М.А. // Молек. мед.- 2006.-№ 5. - С. 3-12.

5. Нейроиммуноэндокршшые механизмы регуляции пролиферативной активности тимоцитов в посгнаталыгом онтогенезе / Кветной U.M., Южаков В.В., Полякова В.О., Ярилин A.A., Курилец Э.С., Михнна J1.H., Трофимов A.B., Коновалов С.С., Шарова Н.И., Никонова М.Ф. // Мед. акад. журнал. - 2004. - Т. 47, № 4. - С. 52-58.

6. Полякова В.О. Экспрессия ключевых регуляторных белков апоптоза и их роль в возрастной инволюции ммуса человека / Полякова В.О., Беиберин В.В. // Усп. геронтол. - 2006. - № 19. - С. 28-32.

7. Полякова В.О. Экспрессия серотонина и эндогелика - 1 в тимусе человека при старении / Полякова В.О. // Усп. геронтол. - 2007. - № 20. - С. 46-51.

8. Полякова В.О. Экспрессия транскрипционных факторов дифферепцировки эпителиальных клеток тимуса человека при старении / Полякова В.О. /У Вести. Уральск, мед. акад. науки. - 2006 - N° 3-1 (14).-С.191-193.

9. Экспрессия аршрофильных белков областей ядрышковых организаторов в тимоцитах и эпителиальных клетках тимуса человека в условиях совместного культивирования при действии пептидов пилона и эпиталона / Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Ярилин A.A., ШароваН.И., Митнепа М.М., Хавмнсон В.Х., Полякова В.О., Трофимов A.B., Кветной И.М. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2004. -№11. - С. 667-670.

10. Эффекты действия мелатонина на старение клеток тимуса и периферические Т-лимфоциты m vitro / Полякова В.О., Ккязькин И.В., Коновалов С.С., Кветной И.М., Трофимов A.B., Чернышова E.H., Чебракова A.IO. // Усп. геронтол. - 2005. 17. - С. 10-14.

í

Статьи в зарубежных журналах

11. Extrapineal melatonin: general conception, localization and biological role in Ihc visual system / Kvetnoy I.M., Smimova I.O., Polyakova V.O. // Neuroembryology and Aging - 2007. - Vol. 6. - N1. -P. 32-42.

12. Hormonal function and proliferative activity of thymic cells in humans: immunocytochemical correlations / Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Trofimov A.V., Yuzhakov V.V., Yarilin A.A., Kurilets E.S., Mikhina L.N., Sharova N.I., Nikonova M. F. // Neuroendocrinology Letters. - Jv"»24. -2003.-P. 263-268.

Монографии

13. Нейроиммуноэндокринологня тимуса / Кветной И.М., Ярилин A.A., Полякова В.О., Ккязькин И.В. // Санкт-Петербург. Деан - 2005. - 160 с.

14. Полякова В.О. Тимус, и старение (нейроиммуноэндокршшые механизмы) / Полякова В.О., Кветной И.М. // С-Пб. Система. - 2004. - 102 с!

Главы в руководстве

15. Молекулярная физиология нейроиммуиоэндокршщых взаимодействий / Пальцев М.А., Кветной И.М., Полякова В.О., Князькип И.В., Ипгель И.Э., Южаков В.В. // В кн.: «Руководство но пейроиммуноэндокринолог пи». - М. Медицина. - 2006. - С. 131- 149.

16. Нейроиммуноэндокришгые механизмы старения / Пальцев М.А., Кветной И.М., Полякова В.О., Снбароа Д.А., Козлов К.Л., Коновалов С.С. // В кн.: «Руководство по нейроимиуно-эндокринологнн». - М. Медицина. - 2006. - С. 150-174.

17. Нейроиммукоэндокринология тимуса / Пальцев М.А., Кветаой U.M., Ярилик A.A., Полякова В.О. // В юг.: «Руководство по нейроиммуноэпдокринологии». - М. Медицина. — 2006. - С. 248-285.

18. Сигнальные молекулы, осуществляющие нейроиммуноэндокрингале взаимодействия У Пальцев М.А., Кветной И.М., Голубев А.Г., Квегная 'Г.В., Полякова В.О. // В кн.: «Руководство по нейроиммуноэпдокринологии». - М. Медицина. - 2006. - С. 77- 130.

Статьи в других журналах

19. Геропротекгорное и регуляторнос влияние мелатонина на тимоциты в исследованиях in vitro / Полякова И.О., Князькин И.В., Трофимов A.B., Кветной И.М. // Альманах «Геронтология и гериатрия». - Москва. 2005. - Вып. 4. - С. 230-232.

20. Полякова В.О. Молекулярная патофизиология старения тимуса / Полякова В.О., Кветной И.М. // Клин, патофизиол. - 2006. - № 1. - С. 89-94.

Тезисы докладов

21. Влияние пептидного биорегулятора вилона на функции клеток иммунной системы / Полякова В.О., Князькин И.В., Ярилик A.A., Кветной И.М. // Материалы VI научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002". Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4. - № 2. - С. 130-131.

22. Возрастная динамика экспрессии NO-синтазы и CD35 в тучных и дендритных клетках тимуса человека / Полякова В.О., Федорова Е.С., Чернышева Е.В., Чебракова А.Ю., Князькин И.В., Зезголин П.Н. // Матер. II научно-практической конференции с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой. - Санкт-Петербург. -2006. - С. 180-181.

23. Возрастная динамика экспрессии гормонов в тимусе человека / Чернышева Е.В., Полякова В.О., Чебракова АЛО., Федорова Е.С., Зезюлин П.Н. // Матер, конфер. «Перспективы фундаментальной геронтологии». - Санкт-Петербург.-2006.-С. 157-158.

24. Возрастные изменения экспрессии вазоэктивных гормонов и факторов апоптоза в тимусе человека / Полякова В.О., Чернышова Е.9., Чебракова АЛО., Зезюлин П.Н., Федорова Е.С. // Медицинская иммунология. - Т. 8. - № 2-3. - 2006. - С. 380-381.

25. Геропротектокые эффекты мелатонина на старение клеток тимуса in vitro / Полякова В.О., Чебракова А.Ю., Чернышова Е.В. // Вестник молодых ученых. Физиология и медицина. Всероссийская конференция молодых исследователей. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 93.

26. Геропротекгорное действие мелатонина па клетки тимуса / Полякова В.О., Кветной И.М., Князькин И.В., Трофимов A.B. // IV национальный конгресс геронтологов и гериаторов Украины. Проблемы старения и долголетия. - 2005. - Т. 14. - С. 46-47.

- 27. Геропротекгорное действие мелатонина на клетки тимуса / Полякова В.О., Князькин И.В., Зезюлин П.Н., Тафеев Ю.А. II Тезисы докладов III Всероссийской научно практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых». - Москва. - 2006. - С. 75-76.

28. Гормоны в иммунокомпетентных клетках: иммуноцитохимическая локализация / Полякова В.О., Федорова Е.С., Зезюлин П.Н. // Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье»,- СПб. - 2006. - С. 266.

29. Изучение тканеспецифических эффектов пептидов на эпителиальные клетки в процессе дифференцировки и старения in vitro /Полякова В.О., Ярилик A.A., Коновалов С.С. // Материалы VII научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2003". Медицинская иммунология. -Т. 5. - №3-4. - 2003. - С. 213.

30. Иммуногеропротекториые эффекты синтетических пептидов / Полякова В.О., Коновалов С.С., Трофимов A.B. /7 II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 2005.-С. 103.

31. Кютной И.М. Иммукоцитохммичеекая верификация экспрессии гормонов в иммунокомпетентных клетках / Кветной И.М., Полякова В.О. /1 Материалы IX Всероссийского научного Форума с международным участием им. Академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005". Медицинская иммунология. - Т. 7. - № 2-3. - 2005. - С. 273-274.

32. Квегпой U.M. Эпителиальные клетки тимуса и пинеалоцигы: структурное сходство и функциональное единство / Кветной И.М., Полякова В.О. // Медицинская иммунология. - 'Г. 8. -№2-3. - 2006. - С. 144-145.

33. Клинические, экологические и биологические аспекты нейроиммуноэндокрннных межклеточных взаимодействий / Квегной И.М., Кветная Т.В., Полякова В.О., Рыльчиков И.В. // III международный экологический симпозиум d городе Полоцке. - Полоцк. - 2006. - С. 187-188.

34. Мелатонин в иммунокомпетентных клетках: синтез, депонирование, биологическая роль / Кветиой И.М., Кветная Т.В., Полякова В.О., Трофимов A.B., Князькии И.В., Зезюлин П.Н., Филиппов C.B. // Материалы XIII Российского национального котресса «Человек и лекарство». -Москва.-2006.-С. 161.

35. Нейроиммуноэндокринология тимуса: экспрессия гормонов и пролиферагивная активность / Полякова В.О., Кветиой U.M., Ярили« A.A., Коновалов С.С., Князькии И.В. // Нейроиммунология. - Т. 1. - №2. - 2003. - С. 118-119.

36. Особенности экспрессии гормонов в иммунокомпетентных клетках (три старении in vitro / Полякова В.О., Коновалов С.С., Князькии И.В., Зезюлин П.Н., Терземан М.В., Тафеев IO.A. // Матер, конфер. «Перспективы фундаментальной геронтологии». - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 104-105.

37. Пептидергическая профилактика старения тимуса / Полякова В.О., Трофимов А. В., Зезюлин П.11. // «Актуальные вопросы внутренних болезней». Сборник трудов научной конференции. - СПб.~ 2006.-С. 50-51.

38. Полякова В.О. Пепгкдер!ическам рефляция экспрессии аргврофильных белков областей ядрышковых организаторов в тимоцитах человека / В.О. Полякова, A.B. Трофимов // Седьмая Всероссийская медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - СПб, 2004. - С. 231.

39. Полякова B.C. Влияние вилокз на структурно-функциональную организацию желудочно-кишечного тракта и иммунокомпетентных органов в радиационной модели преждевременного старения / Полякова В.О., Барыкина О.П. // II съезд геронтологов и гериатров России. Клиническая геронтология. -Т.О. --№ 9. - 2003. -С.173.

40. Полякова В.О. Возрастные особенности гормональных фенотипов иммунокомпетентных клеток / Полякова В.О. // VII международный симпозиум «Биологические механизмы старения» -Харьков. - 2006. - С. 33-34.

41. Полякова В.О. Изучение эффектов вилоиа и эииталоиа на культуру периферических Т-лимфоцитов / Полякова В.О., Трофимов A.B. // Мед. акад. журнал .- 2004. - Т. 4, Аг° 3. - С. 57.

42. Полякова В.О. Иммуноцитохимическая веификация экспрессии гормонов в иммунокомпетентных клетках / Полякова В.О. // Материалы 10-й Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология—наукаXXI века». -Пущино. -2006. - С. 159.

43. Полякова В.О. Короткие пептиды как модуляторы нейроиммупноэндокргашых взаимодействий в тимусе: исследования in vitr-o / Полякова В.О., Коновалов С.С. // Нейроиммунология. - Т.2. -№2. - 2004. - С. 86.

44. Полякова В.О. Межклеточные иммуноэндокринные взаимодействия в тимусе: роль паракршшой гормональной регуляции / Полякова В.О., Кветиой И.М. // Материалы VII Всероссийской конференции по патологии клетки. М.: Медицина для всех. - 2005. - С. 99-100.

45. Полякова В.О. Мелатонин: регуляторное действие на клетки тимуса / Полякова В.О., Ккязькин И.В. // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -Москва. -2005. - С. 514.

46. Полякова В.О. Молекулярные маркеры экспрессии гормонов в иммунокомпетентных клетках / Полякова В.О., Трофимов A.B. // Материалы 11 Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, Россия. -20-21 октября 2005. -С. 211-212.

47. Полякова В.О. Паракринная гормональная регуляция пролиферативнон активности клеток тимуса человека / Полякова В.О. // Материалы X Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005». - 2005. - С. 470-471.

48. Полякова В.О. Паракринная и гормональная регуляция пролиферативнон активности тимоцигов человека / Полякова В.О. // Рос. физиол. журнал им. И.И. Сеченова. XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. - 2004. -Т. 90, № 8. - С. 120-121.

49. Полякова В.О. Пептиды тимуса и эпифиза: профилактика преждевременного старения / Полякова В.О., Коновалов С.С. // II Всероссийская научно-практическая конференция «Общество, государство и медицина для пожилых больных и инвалидов». -■ Москва. 2005. -С. 152-154.

50. Полякова B.C. Экспрессия гормонов н тимусе как паракришялй молекулярный фактор реализации функции Т-лимфоцитов / Полякова В.О. // Материалы I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобгаопашость». - Москва, Россия. - 26-28 октября 2004. - С. 154-155.

51. Полякова В.О. Экспрессия гормонов п тимусе человека / Полякова В.О. // Материалы VII Российского форума «Мать и дитя». - Москва. - 11-14 октября 2005. - С. 584-585.

52. Полякова В.О., Кветной И.М. Диффузная пейроиммуноэндокринная система: структурно-функциональные основы нейроиммуноэндокринологии / Полякова В.О., Кветной И.М. // Нейроиммунологкя. - Т.З. - №2. - 2005. - С. 194.

53. Регуляторпые пептиды — ключевые сигнальные молекулы нейроиммуноэндокринных межклеточных взаимодействий / Кветной И.М., Кветная Т.В., Полякова В.О., Рыльчиков И.В. // II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 2005. - С. 60.

54. Чернышева Е.В. Экспрессия ссротонииа и эндотелииа-1 в тимусе людей разных возрастных групп / Чернышева Е.В., Полякова В.О. // Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье».- СПб. - 2006. - С. 381-382,55. Экстрапинеалыгый мелатонин: роль в иейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза/ Кветной

И.М., Князькик И.В., Кветная Т.В., Полякова В.О., Трофимов А.В. И Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2005. - С. 406-407.

56. Neuroirmmmoendocrine interactions and role of extrapineal melatonin in premature aging / Polyakova V., Trofimov A., Knyazkin I., Konovalov S. // Abstr. б"1 Intern. Conference on Neuroimmunomodulation. - Athens (Greece). - 2005. - P. 65-66.

57. Neuroimmunoendocrinology:. microscopical advances for creation of new discipline / Kvetnoy I.M., Kvetnaia T.V., Polyakova V.O., Trofimov A.V., Knyazkin I.V., Konovalov S.S. // Proc. XIII European Congress of Microscopy. - Antwerp, Belgium. -,2004. - P. 37-38.

58. Polyakova V. Hormones it\ human thymus: correlations between their expression and proliferative activity of T-lymphocytes / Polyakova V. // Abstr. 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology. 16lh European Congress of Immunology. —Paris (France). - 2006. - P. 443.

ПОЛЯКОВА В.О. Молекулярно-клеточные механизмы старения тимуса

человека.

// Автореф. дис. ... докт. биол. наук: 14.00.53, СПб., Система, 2007. - 48 с.

Формат 60x84 1/8. Объем 2,0 усл. п.л. Тираж 150 экз. Заказ ¿"-^"Ьесплапю. Подписано к печати 15.02.2007. Отпечатано с готового оригинал-макета Изд-во «Система». Санкт-Петербург

Актуальность проблемы

Тимус является органом, в котором наиболее ярко проявляются тесные клеточные взаимодействия между тремя регуляторными системами - нервной, иммунной и эндокринной, обеспечивающие необходимый молекулярный коммуникационный диалог, направленный на обеспечение физиологических процессов как в самой железе, так и в живом организме в целом.

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста, инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой сигнальных молекул, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов.

Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса. Участие нейрогуморапьных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН был сконструирован синтетический дипептид вилон (Lys-Glu), обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами. Изучение действия вилона на эпителиальные клетки тимуса (ТЭК) и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволило расширить представления о механизмах функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать новые подходы к пептидергической регуляции функций железы в процессе старения организма. В настоящее время в процессе разработки других биологически активных пептидов, перспективными представляются трипептиды Т-32 (Н-С1и-Азр-А1а-ОН), Т-38 (Н-ЬуБ-ОШ-АБр-ОН) и тетрапептид кардиоген (Н-А1а-01и-Азр-Ащ-0Н), однако, детально их иммуногеропротекторные свойства не изучены.

До сих пор многие вопросы, связанные с нейроиммуноэндокринными сигнальными взаимодействиями в тимусе при старении остаются невыясненными. Так, в частности, открытым остается вопрос о разнообразии гормональных фенотипов клеток тимуса и участии конкретных сигнальных молекул в индукции дифференцировки Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса, недостаточно выяснена роль сигнальных молекул тимуса в регуляции пролиферации, дифференцировки и старения клеток тимуса, отсутствуют работы по установлению взаимосвязей изменения синтеза и секреции тех или иных сигнальных молекул тимуса с конкретной возрастной патологией, сопровождающейся проявлениями иммунодефицитов.

Проведение фундаментальных исследований в этом направлении позволит проследить динамику возрастных структурно-функциональных изменений тимуса, установить роль и значение взаимодействий клеток и сигнальных молекул в инволюции железы; детально изучить участие ключевых сигнальных молекул в нейроиммуноэндокринных механизмах старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является изучение нейроиммуноэндокринных механизмов старения тимуса человека.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи при исследовании тимуса человека in vivo и in vitro:

• изучить структурно-функциональные особенности антенатального гистогенеза, постнатального онтогенеза и старческой инволюции тимуса;

• верифицировать экспрессию ключевых нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в тимусе с иммунофенотипическим картированием синтезирующих их клеток;

• изучить возрастные особенности экспрессии нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в клетках паренхимы и микроокружения тимуса человека;

• изучить нейроиммуноэндокринные молекулярные взаимодействия в тимусе при дифференцировке стволовых и старении иммунокомпетентных коммитированных клеток;

• изучить возможность регуляции дифференцировки иммунокомпетентных клеток под действием пептидов и мелатонина для оценки перспективности разработки геропротекторных препаратов в этом направлении;

• определить роль и значение нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в механизмах старения тимуса.

Научная новизна работы

Впервые показано, что основными структурно-функциональными изменениями ткани тимуса в процессе онтогенеза и старения являются гетерогенность и гетерохронность возникновения и развития трансформаций в различных структурных элементах железы, проявляющиеся на всех уровнях организации тимуса. Установлено, что в процессе старения тимуса инволютивные изменения затрагивают как паренхиму, так и микроокружение железы (тучные клетки, макрофаги, дендритные клетки, эндотелий капилляров). При этом в процессе старения в тимусе прежде всего отмечается резкое уменьшение числа Т-лимфоцитов и ТЭК. Установлено, что инволютивные изменения, развиваясь в ходе онтогенеза и при старении в различных клетках тимуса гетерохронно, носят общий характер, как для клеток паренхимы, так и для микроокружения. Основные из них сводятся к следующему: гетерохроматизация и появление внутриядерных включений, гипоплазия и деструкция белоксинтезирующих органелл - митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом, пластинчатого комплекса.

В тимусе человека впервые зарегистрирована активная экспрессия пептидных гормонов и биогенных аминов. Серотонин, мелатонин и соматостатин верифицируются в ТЭК, формирующих тельца Гассаля и в тучных клетках. Отдельные ТЭК демонстрируют иммунореактивность к глюкагону и гастрину. Экспрессия эндотелина-1 обнаружена в капиллярах тимуса. В различных субпопуляциях тимоцитов человека, находящихся на различной стадии дифференцировки, впервые идентифицированы следующие гормоны: в предшественниках Т-лимфоцитов (СБ4"СВ8*) содержатся серотонин и мелатонин; в незрелых кортикальных клетках (СВ4+С08+) обнаружен только серотонин, в зрелых медуллярных клетках выявлен серотонин, мелатонин, р-эндорфин и гистамин. При старении в тимусе человека усиливается экспрессия серотонина и эндотелина-1, что свидетельствует об их иммунотропной роли, направленной на поддержание иммунитета в стареющем организме через активацию Т-лимфоцитов.

Впервые установлено, что транскрипционные протеины, регулирующие дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЬР - необходимые для созревания и функционирования Т-лимфоцитов экспрессируются в тимусе человека, начиная с внутриутробного развития железы и их экспрессия снижается в процессе онтогенеза и старения. Применение моноклональных антител к протеину СОЭ5 позволило верифицировать дендритные клетки в тимусе человека в процессе онтогенеза и проследить динамику снижения их количества и интенсивности экспрессии СБ35 при старении.

Зарегистрированы корреляционные связи между пролиферацией и апоптозом клеток тимуса и локальной экспрессией гормонов в железе. Выявлена отчетливая тенденция к усилению с возрастом экспрессии серотонина и снижению выработки соматостатина в ТЭК, росту пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе, снижению индексов пролиферации в мозговом веществе. Максимальная интенсивность экспрессии антиапоптозного белка шс1-1 отмечена у эмбрионов, ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоптозного белка р53, что свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии шсМ, а с уменьшением экспрессии фактора р53. Обнаружение четких корреляций между экспрессией указанных гормонов и пролиферативной активностью тимоцитов отражает важное участие нейроиммуноэндокринных механизмов в паракринной регуляции морфо-функционального созревания тимуса в процессе онтогенеза и старения.

В тимусе людей пожилого и старческого возраста зарегистрировано достоверное возрастание экспрессии ЫО-синтазы, что свидетельствует о компенсаторной роли этого фермента в инволюционных процессах, развивающихся в тимусе с участием свободных радикалов при старении организма.

Проведенные исследования позволили впервые оценить роль и значение пептидергической регуляции в процессах дифференцировки и старения иммунокомпетентных клеток. Синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген при введении их в культуру иммунокомпетентных клеток костного мозга и печени плодов человека 14-26 недель развития значительно повышают экспрессию лимфоидных и миелоидных линейных маркеров. Мишенями действия пептидов в данном случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие СБ34. Показано, что инкубация с пептидами тимоцитов плодов человека и мононуклеаров крови взрослых людей вызывает изменение экспрессии маркеров популяций и субпопуляций лимфоцитов. Установлено, что спектр эффектов, оказываемых пептидами на кроветворные клетки и лимфоциты, может рассматриваться как проявление их влияния на геном и клеточную мембрану.

Впервые установлено, что экспрессия сигнальных факторов дифференцировки ТЭК - протеинов Рах1, НохаЗ и ТЪР, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах, активно усиливается под действием синтетических пептидов.

Практическая ценность работы

Установление факта снижения при старении уровня экспрессии транскрипционных протеинов, регулирующих дифференцировку ТЭК -Рах1, НохаЗ и ТЪР, - необходимых для созревания и функционирования Т-лимфоцитов, свидетельствует о том, что данный феномен можно расценить как ключевое звено в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста. Возрастание экспрессии протеина СБ35 на дендритных клетках тимуса у людей пожилого и старческого возраста отражает способность дендритных клеток выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах, частота которых с возрастом повышается.

Показана перспективность детального изучения мелатонина и синтетических пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена в качестве иммуногеропротекторов, поскольку установлено, что они обладают свойствами снижать уровень гибели тимоцитов путем апоптоза, повышать пролиферативную активность клеток тимуса, усиливать выработку цитокинов и экспрессию сигнальных факторов дифференцировки ТЭК.

Проведенные исследования свидетельствуют о важной роли нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в регуляции онтогенеза тимуса, что, в свою очередь, демонстрирует несомненную перспективность поиска и разработки методов пептидергической регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Основными структурно-функциональными изменениями ткани тимуса в процессе онтогенеза и старения являются гетерогенность и гетерохронность возникновения и развития трансформаций в различных структурных элементах железы на всех уровнях ее организации.

2. Инволютивные изменения, развиваясь в ходе онтогенеза и при старении в различных клетках тимуса гетерохронно, носят общий характер как для клеток паренхимы, так и для микроокружения.

3. В тимусе человека активно экспрессируются многочисленные сигнальные молекулы, участвующие в нейроиммуноэндокринной регуляции функционирования тимуса на всех этапах онтогенеза и старения.

4. Резкое снижение в процессе старения экспрессии транскрипционных протеинов, регулирующих дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЬР -необходимых для созревания и функционирования Т-лимфоцитов является ключевым звеном в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста.

5. Дендритные клетки тимуса, активно экспрессируя протеин С035, сохраняют способность выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах у людей пожилого и старческого возраста.

6. Структурно-функциональная инволюция тимуса начинается у человека уже в период раннего постнатального онтогенеза.

7. Нейроиммуноэндокринные сигнальные молекулы являются ключевыми факторами контроля дифференцировки стволовых иммунокомпетентных клеток в коммитированные стадии.

8. Мелатонин и синтетические пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают выраженными иммуногеропротекторными свойствами, что позволяет считать перспективным поиск и разработку методов пептидергической регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург,

2002), II съезде геронтологов и гериатров России (Москва, 2003), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург,

2003), VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2003» (Санкт-Петербург, 2003), VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004), XIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург,

2004), XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Антверпен, Бельгия, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург,

2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва,

2005), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»

Москва, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005), XIV Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005" (Санкт-Петербург, 2005), II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), VI международной конференции по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005), II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых больных и инвалидов» (Москва, 2005), IV национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), X Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), X Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006), 16 Европейском конгрессе по иммунологии (Париж, Франция, 2006), II Международном экологическом симпозиуме (Полоцк, Республика Беларусь, 2006), конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии (Санкт-Петербург, 2006), Ученом совете Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2006).

Результаты работы отражены в цикле работ, удостоенном Молодежной премии Санкт-Петербурга в области науки 2004 года, премии Геронтологического общества РАН за лучшую работу молодых ученых России по геронтологии (2004 год), а также в отчетах по исследовательским проектам, поддержанных грантами Президента РФ для молодых кандидатов наук, РФФИ, Комитета по высшей школе и науке Администрации Санкт-Петербурга (2003-2007 годы).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований изложены в четырех главах в книге «Руководство по нейроиммуноэндокринологии» (М., Медицина, 2006), которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов. Результаты работы используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургского государственного университета, Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Медицинского радиологического научного центра РАМН, Института иммунологии ФМБА РФ, Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Института цитологических исследований (Валенсия, Испания).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 58 печатных работ, из них монографий - 2, глав в руководстве - 4, статей - 14, тезисов докладов -38.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа являлась научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 346 страницах, содержит 23 таблицы и иллюстрирован 115 рисунками. Указатель литературы содержит 384 источник, из которых отечественных - 157, зарубежных - 227.

выводы

1. В процессе старения тимуса инволютивные изменения развиваются гетерохронно и затрагивают как паренхиму, так и микроокружение железы (тучные клетки, макрофаги, дендритные клетки, эндотелий капилляров). Основные из них сводятся к следующему: гетерохроматизация и появление внутриядерных включений, гипоплазия и деструкция белоксинтезирующих органелл - митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом, пластинчатого комплекса. В процессе старения в тимусе прежде всего отмечается резкое уменьшение числа Т-лимфоцитов и ТЭК.

2. В тимусе человека впервые зарегистрирована активная экспрессия пептидных гормонов и биогенных аминов. Серотонин, мелатонин и соматостатин верифицируются в ТЭК, формирующих тельца Гассаля, и в тучных клетках. Отдельные ТЭК демонстрируют иммунореактивность к глюкагону и гастрину. Экспрессия эндотелина-1 обнаружена в капиллярах тимуса. В различных субпопуляциях тимоцитов человека, находящихся на различной стадии дифференцировки, впервые идентифицированы следующие гормоны: в предшественниках Т-лимфоцитов (СВ4'СБ8') -серотонин и мелатонин; в незрелых кортикальных клетках (С04+СБ8+) -только серотонин, в зрелых медуллярных клетках - серотонин, мелатонин, (3-эндорфин и гистамин.

3. При старении в тимусе человека усиливается экспрессия серотонина и эндотелина-1, что свидетельствует об их иммунотропной роли, направленной на поддержание иммунитета в стареющем организме через активацию Т-лимфоцитов.

4. Транскрипционные протеины, регулирующие дифференцировку ТЭК - Рах1, НохаЗ и ТЪР - необходимые для созревания и функционирования Т-лимфоцитов экспрессируются в тимусе человека, начиная с внутриутробного развития железы и их экспрессия снижается в процессе онтогенеза и старения. Учитывая их важную роль в регуляции созревания и поддержания пула Т-лимфоцитов, данный факт можно расценить как ключевое звено в механизмах нарушения иммунитета у людей пожилого и старческого возраста.

5. Впервые зарегистрировано значительное снижение популяции дендритных клеток у людей старческого возраста, что связано со структурной инволюцией железы. Однако, при этом экспрессия протеина С035 на них возрастает у людей пожилого и старческого возраста, отражая способность дендритных клеток выполнять защитную функцию при аутоиммунных процессах, частота которых с возрастом повышается.

6. Пролиферация и апоптоз клеток тимуса корреляционно связаны с локальной экспрессией гормонов. Выявлена отчетливая тенденция к усилению с возрастом экспрессии серотонина и снижению выработки соматостатина в ТЭК, росту пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе, снижению индексов пролиферации в мозговом веществе. Максимальная интенсивность экспрессии антиапоптозного белка шс1-1 отмечена у эмбрионов, ее снижение происходит в течение уже первых месяцев постнатального онтогенеза с параллельным возрастанием экспрессии проапоптозного белка р53, что свидетельствует о ранней инволюции тимуса. Замедление процесса инволюции в тимусе людей пожилого и старческого возраста связано не с усилением экспрессии шс1-1, а с уменьшением экспрессии фактора р53. Обнаружение четких корреляций между экспрессией указанных гормонов и пролиферативной активностью тимоцитов отражает важное участие нейроиммуноэндокринных механизмов в паракринной регуляции морфо-функционального созревания тимуса в процессе онтогенеза и старения.

7. В тимусе людей пожилого и старческого возраста достоверно возрастает экспрессия Ж)-синтазы, что свидетельствует о компенсаторной роли этого фермента в инволюционных процессах, развивающихся в тимусе с участием свободных радикалов при старении организма.

8. Мелатонин обладает иммуногеропротекторными свойствами. Показано его участие в защите тимоцитов от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК, обусловленное снижением экспрессии аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов под его действием. Он также усиливает спонтанную выработку цитокинов тимоцитами. Разработка конкретных рекомендаций по его применению требует продолжения детального изучения механизма действия различных доз данного гормона.

9. Проведенные исследования позволили впервые оценить роль и значение пептидергической регуляции в процессах дифференцировки и старения иммунокомпетентных клеток. Синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген при введении их в культуру клеток тимуса плодов человека 14-26 недель развития повышают экспрессию лимфоидных и миелоидных линейных маркеров на 15%. Мишенями действия пептидов в данном случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие CD34.

10. Инкубация с пептидами тимоцитов плодов человека и мононуклеаров крови взрослых людей вызывает изменение экспрессии маркеров популяций и субпопуляций лимфоцитов. На тимоцитах наблюдается снижение экспрессии CD3, CD4 и CD8, на лимфоцитах крови - ослабление экспрессии CD 19 и усиление - CD56 и CD3. Пептиды Т-32 и Т-38 вызывают экспрессию CD25 на CD4+ клетках тимуса плодов человека, индуцируя, таким образом, проявление мембранного фенотипа естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+). Все исследуемые пептиды вызывают экспрессию CD4 на CD8+ лимфоцитах крови взрослых людей, способствуя появлению Т-клеток, экспрессирующих оба ко-рецептора (CD4+CD8+ - фенотип кортикальных тимоцитов). Спектр эффектов, оказываемых пептидами на кроветворные клетки и лимфоциты, может рассматриваться как проявление их влияния на геном (дифференцировка клеток) и клеточную мембрану (модулирующие эффекты).

11. Изученные пептиды оказывают неодинаковое действие на пролиферацию коммитированных клеток на различных стадиях их дифференцировки. Под действием пептидов Т-32 и Т-38 усиливается пролиферация незрелых кортикальных клеток. Пептиды Т-32 и кардиоген усиливают пролиферацию зрелых медуллярных клеток (СЭ4+С08"). Все изученные пептиды проявляют выраженный пролиферотропный эффект в отношении регуляторных Т-лимфоцитов (СВ4+СЭ25+), что свидетельствует о высокой способности пептидов усиливать выживаемость и ускорять дифференцировку клеток лимфоидного ряда.

12. Изученные пептиды оказывают неодинаковое действие на процессы апоптоза коммитированных клеток на различных стадиях их дифференцировки. Активность апоптоза в предшественниках Т-лимфоцитов(СБ4'С08") под действием пептидов не изменяется. Процессы апоптоза в незрелых кортикальных клеток (С04+СБ8+) под действием пептидов Т-32 и Т-38 достоверно снижаются. Апоптоз на стадии зрелых медуллярных клеток (С04+С08") усиливается под действием пептида Т-32, в то время как пептид Т-38 на этой стадии дифференцировки коммитированных клеток, наоборот, усиливает экспрессию протеина тс1-1, что свидетельствует о его способности стабильно обеспечивать жизнеспособность лимфоидных клеток на этой стадии их дифференцировки. Все изученные пептиды проявляют выраженный антиапоптозный эффект в отношении регуляторных Т-лимфоцитов (СЭ4+С025+), наиболее активным при этом оказывается пептид Т-38.

13. Под действием пептидов усиливается жизнеспособность коммитированных клеток лимфоидного ряда, что проявляется наиболее заметной активацией органелл, задействованных в процессах дифференцировки и пролиферации клеток - полирибосом и пластинчатого комплекса. Проведенные исследования свидетельствуют о высокой способности пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена обеспечивать выживаемость клеток лимфоидного ряда для их последующей диффереицировки и функционирования.

14. Все исследуемые пептиды обладают способностью активно усиливать экспрессию сигнальных факторов диффереицировки ТЭК -протеинов Рах1, НохаЗ и ТЬР, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах. Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов диффереицировки ТЭК в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность Т-лимфоцитов, ко-культивированных с ТЭК и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

15. Проведенные исследования свидетельствуют о важной роли нейроиммуноэндокринных сигнальных молекул в регуляции онтогенеза тимуса, что, в свою очередь, демонстрирует несомненную перспективность поиска и разработки методов пептидергической регуляции и коррекции иммунного гомеостаза при старении организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При диагностике иммунодефицитных состояний, протекающих самостоятельно, или отягощающих течение других заболеваний у больных пожилого и старческого возраста, рекомендуется проводить иммуноферментный анализ содержания мелатонина и факторов дифференцировки ТЭК и дендритных клеток тимуса для выяснения сохранности функций железы в стареющем организме.

2. При возникновении нейроиммуноэндокринных нарушений у пожилых и старых людей рекомендуется проводить анализ содержания мелатонина в крови или мочи и при его дефиците применять препараты мелатонина в качестве сопутствующей терапии основных заболеваний.

3. Учитывая установленные иммуногеропротекторные свойства пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена целесообразно провести клинические испытания их в качестве геропротекторных средств.