Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Возрастная динамика экспрессии гормонов в тимусе человека

На правах рукописи

ЧЕРНЫШОВА Елена Викторовна

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГОРМОНОВ В ТИМУСЕ ЧЕЛОВЕКА

14 00 53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ооз

Санкт-Петербург - 2008

003168987

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Полякова Виктория Олеговна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кветная Татьяна Викторовна

доктор биологических наук Чернышева Марина Павловна

Ведущая организация:

ГУ «Институт физиологии им И П Павлова» РАН

Защита диссертации состоится « 2008 г в часов

на заседании диссертационного совета Д 601 001 01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197110, Санкт-Петербург, пр Динамо, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр Динамо, д 3)

Автореферат разослан « » _2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тимус является ключевым органом в системе нейроиммуноэндокриннои регуляции, выполняя роль иммунного органа и эндокринной железы, осуществляя при этом важные функции, обеспечивающие структурное и функциональное созревание иммунокомпетентных клеток Основная функция тимуса направлена на формирование рециркулирующего пула зрелых Т-лимфоцитов, что включает в себя дифференцировку Т-лимфоцитов (в частности, появление у них антиген-распознающих рецепторов), разделение Т-клеток на субпопуляции и отбор (селекцию) клонов Т-лимфоцитов, способных распознавать чужеродные антигены Указанные процессы контролируются сигнальными молекулами клеток микроокружения путем их влияния на предшественники Т-лимфоцитов и созревающие тимоциты

Реализуя эндокринную функцию, тимус способен продуцировать различные биологически активные вещества, играющие ведущую роль не только в иммунологических, но и в других физиологических процессах. В тимусе животных и человека была обнаружена экспрессия хромогранина А [Brelinska R, Ostalska D, Zabel M, 2000], который играет роль кофактора во внутриклеточной продукции гормонов Также показано, что в тимусе птиц и млекопитающих синтезируется ряд биогенных аминов и пептидных гормонов, характерных для других органов и тканей Ранее в тимусе была показана экспрессия серотонина, мелатонина, глюкагона, инсулина, гастрина [Гордон Д С , Сергеева В Е , Зеленова И Г, 1982, Milicevic N М, Appassamy Р М, Glic М , et al, 1994, Kvetnoy IМ. et al, 2003]

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [Полякова В О, Кветной И М, 2004] Сосудистое русло является неотъемлемым компонентом всех органов и играет чрезвычайно важную роль в их функционировании Таким образом, возрастные изменения сосудов микроокружения могут в значительной степени отразиться на функции тимуса Основным вазоактивным гормоном является эндотелии-1, однако данных об экспрессии эндотелина-1 в тимусе в литературе не обнаружено

Несмотря на то, что в последнее время большое внимание уделяется изучению эндогенных факторов, препятствующих возрастной инволюции тимуса, в частности, неспецифических тимусных гормонов, роль этих молекул, продуцируемых в тимусе, остается малоизученной, хотя для некоторых из них показано наличие рецепторов на клетках иммунной системы Учитывая тот факт, что локальная продукция гормонов, а также присутствие рецепторов к ним на иммунокомпетентных клетках могут играть существенную роль в регуляции возрастных изменений в тимусе, верификация и изучение возрастной динамики экспрессии неспецифических гормонов в тимусе является актуальной проблемой современной биогеронтологии.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является верификация и изучение возрастной динамики экспрессии гормонов - серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи

1 верифицировать экспрессию серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза,

2 изучить возрастную динамику экспрессии серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека,

3 выявить корреляции между динамикой экспрессии указанных гормонов и старением у человека,

4 оценить вклад возрастных изменений экспрессии исследуемых гормонов в процессы старческой инволюции тимуса

Научная новизна

В работе впервые верифицирована экспрессия гормонов - хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона и эндотелина-1 в тимусе человека на всех этапах онтогенеза и установлена возрастная динамика их паракринной секреции Установлена гистогенетическая и топографическая вариабельность секреции указанных гормонов на всех этапах онтогенеза и показана возможность выработки гормонов во всех клеточных и тканевых компартментах тимуса

Впервые зарегистрирована корреляция между интенсивностью экспрессии гормонов и возрастом, при этом показано, что гормональная активность тимуса продолжает сохраняться на высоком уровне даже при возрастной инволюции органа Усиление экспрессии ключевого нейроэндокринного маркера хромогранина А в тимусе человека при возрастной инволюции органа свидетельствует о сохранении гормональной функции тимуса в стареющем организме Установлено, что уровни экспрессии серотонина и глюкагона в тимусе человека постоянны на всех этапах онтогенеза, тогда как интенсивность экспрессии эндотелина-1 и инсулина достоверно увеличивается с возрастом

Полученные факты свидетельствуют о компенсаторной гиперфункции тимуса для гормонотропной регуляции процессов иммуногенеза при старении Стабильный уровень экспрессии глюкагона и усиление синтеза инсулина в тимусе человека в процессе старения отражает их важное значение не только в локальной регуляции иммуногенеза, но и как общегомеостатических гормонов, играющих значительную роль в эндогенных геропротекторных механизмах

Достоверное усиление экспрессии вазоактивного и иммунотропного гормона эндотелина-1 в тимусе человека с возрастом, наряду с сохранением высокого уровня экспрессии серотонина, также обладающего иммунотропными свойствами, является важным звеном в сигнальных механизмах поддержания иммунных процессов у пожилых и старых людей

Результаты исследования свидетельствуют о важной роли неспецефических гормонов в паракринной регуляции развития и функционирования тимуса человека на всех этапах онтогенеза, в том числе при старении

Практическая значимость

Впервые зарегистрирована возрастная компенсаторная эндокринная гиперфункция тимуса, направленная на обеспечение гормонотропной регуляции процессов иммуногенеза при старении Результаты исследования свидетельствуют о важной роли тимуса не только как иммунного, но и как эндокринного органа, обеспечивающего поддержание гормональной регуляции в стареющем организме, несмотря на развитие инволюционных процессов Полученные данные открывают перспективы для разработки подходов к стимуляции угасающих иммунных процессов при старении через регуляцию локальной секреции гормонов в тимусе человека

Положения, выносимые на защиту

1 Тимус человека является активно функционирующим эндокринным органом На всех этапах онтогенеза в тимусе зарегистрирована экспрессия хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона, эндотелина-1

2 Экспрессия указанных гормонов гистогенетически вариабельна и верифицируется в различных клеточных и тканевых элементах тимуса тимоцитах, эпителиальных клетках, клетках микроокружения, сосудах, структурах жировой и соединительной ткани

3 Гормональная активность тимуса не подвергается возрастной инволюции Для хромогранина А, эндотелина-1 и инсулина зарегистрировано даже усиление их секреции с возрастом

4 Возрастная эндокринная гиперфункция тимуса носит компенсаторный характер и направлена на обеспечение гормонотропной регуляции процессов иммуногенеза при старении

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

б

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и указателя литературы Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли гормонов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании Глава 3 представляет собственные экспериментальные данные изучения возрастной динамики экспрессии гормонов в тимусе человека и их обсуждение Текст диссертации изложен на 128 страницах, содержит 7 таблиц, иллюстрирован 37 рисунками Список литературы содержит 137 источников, из которых отечественных - 38

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 1 статья в журнале по перечню ВАК РФ, 12 тезисов докладов

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), II научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э С Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2006), конференции «Медицинская иммунология» (Санкт-Петербург, 2006), Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007), VI Европейском Конгрессе Международной Ассоциации Геронтологии и Гериатрии (Санкт-Петербург, 2007), III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э С Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2007), V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В Н Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), 11-й Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика исследуемого материала

Исследования проведены на тимусе людей разных возрастных групп, полученном при аутопсиях в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им Д О Отта РАМН и городской больнице №3 г Санкт-Петербурга Предварительно проведенные специальные исследования структурно-функциональной организации тимуса человека в онтогенезе на большой когорте пациентов в возрасте от 2 до 56 лет [Полякова В 0 , 2007], умерших от сердечнососудистых заболеваний (пороки сердца, острый инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии, гипертоническая болезнь) не выявили достоверных различий в его строении и функционировании в достаточно длительный период онтогенеза Также при изучении возрастных изменений тимуса на ультраструктурном уровне не было отмечено принципиально значимых отличий в различных возрастных группах (от 6 мес до 46 лет), на основании чего для тимуса введен термин «активный органофункциональный возраст» [Goldstein М, et al, 2001], который отвечает общепринятым критериям в эндокринологии

Поэтому, исходя из основной цели исследования - изучения возрастной динамики экспрессии гормонов - серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза -для дальнейшего анализа материал онтогенетически был разделен на 5 групп

1 плоды, умершие антенатально (19-22 недели внутриутробного развития, н в р);

2 новорожденные дети (2 суток-7 месяцев)

3 люди пожилого возраста (60-74 лет);

4 люди старческого возраста (75-89 лет),

5 долгожители (90 лет и старше)

Гистологические методы

Фрагменты тимуса фиксировали в нейтральном растворе формалина (рН=7,2), проводили через спирты, ксилолы и заливали в парафин по стандартной методике Для морфологического изучения срезы окрашивали гематоксилин-эозином и толуидиновым синим по стандартной методике [Полак Дж, Ван Норден С., 1987]

Гистохимические и иммуногистохимические методы

Для верификации в тканях тимуса экспрессии серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А был использован иммуногистохимический метод Срезы толщиной 3-5 мкм помещали на

предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma) Использовали первичные моноклональные антитела к хромогранину А (1 150, Dako), серотонину (1 '100, Dako), эндотелину-1 (1 100, Dako), инсулину (1 100, Dako), глюкагону (1-75, Dako) В качестве вторых антител использовали биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины из универсального набора (Dako) Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Dako)

Количественная оценка результатов исследования

Количественную оценку результатов исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения «АСТ-1» (версия 2 12) и «Видеотест-Морфология» (версия 5 0) Определяли два параметра оптическую плотность иммунопозитивного окрашивания (в относительных единицах) и суммарная площадь иммуноокрашенных клеток (в процентах)

Методы статистической обработки

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы StatSoft 5 0 Для оценки достоверности использовался двухсторонний t-критерий Стьюдента {t=(M i -M2)/s±( 1 /п i+1 /п2)}

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфологическая структура тимуса у людей разного возраста

При светооптическом исследовании в тимусе у эмбрионов и детей первого года жизни наблюдается обычная гистоархитектоника тимуса без выраженных изменений От соединительнотканной капсулы отходят перегородки (септы), делящие тимус на дольки, в которых располагаются эпителиальные клетки и лимфоциты У большинства эпителиальных клеток выявляются отчетливые отростки Тельца Гассаля, образованные эпителиальными клетками, располагаются в мозговом веществе

В группах людей пожилого возраста, старческого возраста и у долгожителей отмечаются инволютивные процессы в тимусе, большинство долек атрофировано и замещено жировой тканью В сохранившихся дольках отмечается присутствие гиперплазированных телец Гассаля

Верификация и возрастные особенности экспрессии хромогранина А

в тимусе человека

Экспрессия хромогранина А выявлена в тимусе людей всех изучаемых возрастных групп В группе плодов, умерших антенатально, специфическое иммуоокрашивание на хромогранин А обнаружено в паренхиме органа в медуллярной зоне и в соединительнотканной строме тимуса

На срезах тимуса детей, умерших в первый год жизни, снижается частота визуализации окрашенных клеток в строме органа, наблюдаются небольшие скопления крупных иммуноокрашенных клеток во внутридольковых периваскулярных пространствах (ВПП) медуллярной зоны

В группах людей пожилого возраста, старческого возраста и у долгожителей ткань тимуса практически полностью замещена жировой тканью Клетки, позитивно окрашенные к хромогранину А, встречаются реже Специфическое иммуноокрашивание наблюдается в паренхиме немногочисленных тимусных долек и в жировой ткани, замещающей основную массу органа (табл. 1).

Таблица 1

Экспрессия хромогранина А в клетках тимуса человека

№ групп-пы Возрастные пределы группы Среднее значение оптической плотности, условные единицы Среднее значение суммарной площади, %

1 19-22 неделя внутриутробного развития 0,174±0,001* 1,826±0,570*

2 2 суток-7 месяцев 0,226±0,015** 1,386*0,583""

3 60-74 года 0,304±0,011 0,73 8*0,231"**

4 75-89 лет 0,340±0,006 0,764±0,200***

5 90 лет и более 0,320±0,013 0,398±0,104

Примечание *- достоверное отличие от групп 3, 4, 5 (р<0,05), **-достоверное отличие от групп 4, 5 (р<0,05), *- достоверное отличие от группп 2, 3, 4, 5 (р<0,05), ""-достоверное отличие от групп 1, 3, 4, 5 (р<0,05), достоверное

^ отличие от групп 1,2,5 (р<0,05)

Оптическая плотность иммуноокрашенных клеток с вероятностью р<0,05 повышается с возрастом и наиболее высока у людей старческого возраста (0,340±0,006 у.е) При сравнении средних значений оптической плотности между группами плодов, умерших антенатально (0,174±0,001 у е), и детей первого года жизни (0,226±0,015 у е.) достоверных отличий не обнаружено, однако последовательное сравнение первой возрастной группы (плоды, умершие антенатально) с группами людей пожилого возраста (0,304±0,011 у е ), старческого возраста (0,340±0,006 у е.) и долгожителей (0,320±0,013 у е.) выявило достоверно большую интенсивность экспрессии в каждой из старших

возрастных групп (р<0,05) по сравнению с группой плодов, умерших антенатально.

Также достоверное отличие показателя оптической плотности обнаружено при сравнении групп первого года жизни с группами старческого возраста и долгожителей. В группе пожилого возраста уровень экспрессии хромогранина А достоверно не отличается от такового в группе детей первого года жизни. Между группами пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей достоверных отличий по оптической плотности окрашивания не обнаружено (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессия хромогранина А в клетках тимуса человека.

Примечание: Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 - люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; А - оптическая плотность иммуноокрашенных структур (условные единицы); *-достоверное отличие от групп 3, 4 и 5 (р<0,05); **-достоверное отличие от 1рупп 4 и 5 (р<0,05); В - Суммарная площадь иммуноокрашенных структур (%); *- достоверное отличие от группы 2, 3, 4, 5 (р<0,05); **- достоверное отличие от групп 1, 3, 4, 5 (р<0,05); ***- достоверное отличие от групп 1, 2, 5 (р<0,05).

В тимусе плодов, умерших антенатально, суммарная площадь экспрессии составляет 1,826±0,570%, у детей, умерших на первом году жизни, суммарная площадь экспрессии равна 1,386±0,583%, для группы людей пожилого возраста этот показатель составляет 0,738±0,231°/о, в группе людей старческого возраста - 0,764±0,200%, в группе долгожителей - 0,398±0,104% (рис. 1). Статистическая обработка данных показала достоверные отличия по этому признаку между всеми возрастными группами за исключением групп пожилого возраста и старческого возраста, в которых значения оказались близкими.

Поскольку хромогранин А является секреторным белком, содержащимся в гранулах нейроэндокринных клеток, и представляет собой их биологический маркер, экспрессия хромогранина А в тимусах эмбрионов, детей первого года жизни, людей пожилого возраста, людей старческого возраста и долгожителей указывает на наличие нейроэндокринных клеток в тимусе человека на всех этапах его жизни. На фоне общего уменьшения количества хромогранин А-иммунопозитивных клеток наблюдалось усиление экспрессии данного гормона, выраженное в достоверном увеличении показателя оптической плотности

клеток в тимусах людей старшего возраста по сравнению с группами эмбрионов и детей первого года жизни Эти результаты позволяют предположить, что с возрастом на фоне общей атрофии органа усиливается роль нейроэндокринной регуляции его функций за счет более активной экспрессии нейроэндокринных факторов

Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии серотонина в клетках тимуса людей разного возраста

В группе плодов, умерших антенатально, специфическое иммуноокрашивание на серотонин обнаружено в следующих структурах тимуса стенках сосудов медуллярной и кортикальной зон, крупных клетках неправильной формы в медуллярной зоне и соединительнотканной строме тимуса В отдельных случаях слабое окрашивание наблюдается в тельцах Гассаля (табл 2)

Таблица 2

Экспрессия серотонина в клетках тимуса человека

№ группы Возрастные пределы группы Средние значения оптической плотное! и, условные единицы Средние значения суммарной площади, %

1 19-22 неделя внутриутробного развития 1,972±0,006* 1,952±0,399

2 2 суток-7 месяцев 2,090±0,002 1,640±0,207*

3 60-74 года 1,996±0,002** 2,164±0,311

4 75-89 лет 2,028±0,002 1,522±0,057#*

5 90 лет и более 2,054±0,001 2,370±0,322

Примечание *-достоверное отличие от группы 2 (р<0,05), **-достоверное отличие от групп 2, 5 (р<0,05), "-достоверное отличие от групп 3, 5 (р<0,05), ""-достоверное отличие от групп 1,3,5 (р<0,05)

По сравнению с этой возрастной группой на срезах тимуса детей, умерших в первый год жизни, отмечается интенсивное иммуноокрашивание телец Гассаля. В ВПП наблюдаются небольшие скопления иммуноокрашенных клеток округлой формы, которые, формируют эндотелий новообразующихся сосудов Также иммуноокрашивание наблюдается в стенках сосудов и эритроцитах.

На препаратах тимуса людей пожилого возраста наблюдается иммуноокрашивание крупных одиночных клеток неправильной формы, локализованных в медуллярной зоне и внутридольковых периваскулярных пространств Также интенсивно окрашены немногочисленные тельца Гассаля,

преимущественно с деформированной капсулой. Наблюдается слабое окрашивание эпителиальных клеток в медуллярной зоне.

На срезах тимуса людей старческого возраста и долгожителей ткани тимуса практически полностью замещены жировой тканью. Специфическое иммуноокрашивание на серотонин наблюдается в паренхиме немногочисленных тимусных долек в скоплениях клеток, возможно, принадлежащих тельцам Гассаля, и в субкапсулярной зоне (табл. 2).

Подсчет оптической плотности иммуноокрашенных клеток показал, что в группе плодов, умерших антенатально интенсивность экспрессии составляет 1,972±0,006 у.е., в группе детей первого года жизни 2,090 ±0,002 у.е., в группе людей пожилого возраста 1,996±0,002 у.е., у людей старческого возраста 2,028±0,002 у.е., у долгожителей 2,054 ±0,001 у.е. (рис. 2).

ШГруппа 1 □ Группа 2 В Группа 3 а Группа 4 НГруппа 5

Рис. 2. Экспрессия серотонина в клетках тимуса человека.

Примечание: Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 - люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; А - Оптическая плотность иммуноокрашенных структур (условные единицы); ^-достоверное отличие от группы 2 (р<0,05); **-достоверное отличие от групп 2 и 5 (р<0,05); В - Суммарная площадь иммуноокрашенных структур (%); *-достоверное отличие от групп 3 и 5 (р<0,05); **-достоверное отличие от групп 1, 3 и 5 (р<0,05).

Подсчет суммарной площади окрашенных структур показал, что в тимусе плодов, умерших антенатально, этот показатель составляет 1,952±0,399%, у детей, умерших на первом году жизни, суммарная площадь экспрессии составляет 1,640±0,207%; для группы людей пожилого возраста этот показатель составляет 2,164±0,311%; в группе людей старческого возраста - 1,522±0,057%; в группе долгожителей - 2,370±0,322% (рис. 2).

Достоверно меньшей оказалась площадь экспрессии на препаратах тимуса детей первого года жизни и людей старческого возраста по сравнению с группой пожилых людей, и группой долгожителей. Также достоверным было отличие между площадью экспрессии в тимусах эмбрионов и таковой в тимусах людей старческого возраста (рис. 2).

Полученные нами данные демонстрируют, что площадь экспрессии серотонина примерно одинакова на препаратах тимуса детей первого года жизни и людей старческого возраста, а на срезах тимуса долгожителей площадь

экспрессии достоверно не отличается от таковой в тимусах плодов. Кроме того, нами обнаружен довольно высокий уровень экспрессии этого гормона в период эмбриогенеза (19-22 неделя внутриутробного развития) и в период раннего онтогенеза (первый год жизни) Анализ собственных результатов и сравнение их с данными литературы свидетельствует о том, что роль тимуса как эндокринной железы остается существенной в организме человека даже после значительного угасания иммунной функции тимуса Это дает основание предположить, что эндогенный серотонин вовлечен в поддержание функций иммунной системы у людей старшего возраста

Иммупогистохимическое исследование особенностей экспрессии эндотелина-1 в клетках тимуса людей разных возрастов

Экспрессия эндотелина-1 выявлена в сосудах тимуса, локализованных во всех тимусных компартментах (субкапсулярной зоне, корковом, мозговом веществе) Специфическое иммуноокрашивание обнаружено в тимусе людей всех исследуемых возрастных групп Полученные значения оптической плотности и суммарной площади окрашенных структур представлены в таблице 3

Таблица 3

Экспрессия эндотелина-1 в клетках тимуса человека

№ групп-пы Возрастные пределы Средние значения оптической Средние значения суммарной площади, %

группы плотности, условные единицы

1 19-22 неделя внутриутробного развития 2,120±0,007 3,328±0,506

2 2 суток-7 месяцев 2,094±0,005 2,578±0,322*

3 60-74 года 2,204±0,004** 4,336±0,580

4 75-89 лет 2,158±0,007 4,476±0,488

5 90 лет и более 2,254±0,001* 3,210±0,207##

Примечание ^-достоверное отличие от групп 1, 2 и 4 (р<0,05), ^^-достоверное отличие от группы 2 (р<0,05), "-достоверное отличие от групп 1, 3, 4 (р<0,05), -достоверное отличие от групп 3,4 (р<0,05)

Проведено сравнение средних значений оптической плотности иммунопозитивного окрашивания для всех возрастных групп Статистическая обработка данных подтвердила достоверность повышения оптической плотности специфически окрашенных структур на препаратах тимуса людей пожилого возраста и долгожителей по сравнению с таковой в тимусах детей первого года жизни (р<0,05) В тимусах людей старческого возраста

интенсивность экспрессии эндотелина-1 не отличалась от таковой в тимусах эмбрионов и детей первого года жизни (рис. 3).

Также нами были вычислены средние значения суммарной площади специфически окрашенных структур и проведено сравнение этих величин для разных возрастных групп. Численные значения этого показателя у людей разных возрастов следующие: 3,328± 0,506% - у детей, умерших антенатально; 2,578±0,322% - у детей, умерших в первый год жизни; 4,336 ±0,580% - у людей пожилого возраста; 4,476±0,488% - у людей старческого возраста, 3,210±0,207% - у долгожителей.

Нами выявлено статистически достоверное снижение площади экспрессии на препаратах тимуса детей первого года жизни при сравнении с площадью экспрессии на срезах тимуса плодов, умерших антенатально, людей пожилого и старческого возраста. На препаратах тимуса долгожителей выявлялась достоверно меньшая площадь экспрессии эндотелина-1 по сравнению с таковой в тимусах людей пожилого и старческого возраста (рис. 3).

□ Группа 1

□ Группа 2

□ Группа 3 £1 Группа 4 3 Группа 5

Рис. 3. Экспрессия эндотелина-1 в клетках тимуса человека.

Примечание: Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 - люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; А - Оптическая плотность иммуноокрашенных структур (условные единицы); *-достоверное отличие от групп 1, 2 и 4 (р<0,05); **-достоверное отличие от группы 2 (р<0,05); В - Суммарная площадь иммуноокрашенных структур (%); *- достоверное отличие от групп 1, 3, 4 (р<0,05); **- достоверное отличие от групп 3, 4 (р<0,05).

Используя иммуногистохимический метод нами впервые обнаружено, что в сосудах тимуса экспрессируется эндотелии-1. Для этого гормона был также выявлен феномен усиления экспрессии на фоне возрастной инволюции железы при том, что площадь экспрессии с возрастом не снижалась. У людей старше 50 лет процесс замещения паренхимы тимуса жировой тканью достигает своего пика, а это, в свою очередь, влечет за собой значительное снижение функций иммунной системы [Анисимова В.П., 1994].

Принимая во внимание этот факт и установленные ранее эффекты эндотелина-1, можно сделать вывод о том, что зарегистрированное нами

усиление экспрессии гормона в тимусе при старении является компенсаторным и направлено на поддержание базового уровня продукции Т-лимфоцитов

Известно, что серотонин и эндотелии-1, обладая вазоактивными свойствами, обладают способностью регулировать кровоснабжение тимуса и стимулировать иммунную функцию органа Оба гормона экспрессируются в тимусе на одинаково высоком уровне на ранних этапах развития и в преклонном возрасте Для эндотелина нами установлено достоверное усиление экспрессии в пожилом возрасте и у лиц старше 90 лет по сравнению с детьми первого года жизни

Учитывая присущие серотонину и эндотелину-1 иммунотропные свойства, основным из которых является активация функции Т-лимфоцитов, можно предположить, что при возрастной инволюции тимуса усиление экспрессии этих гормонов отражает их комплексную роль, направленную на поддержание иммунитета в стареющем организме

Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии инсулина в клетках тимуса людей разного возраста

Иммуногистохимический метод позволил выявить специфическое иммуноокрашивание к инсулину в тимусе людей всех возрастных групп На препаратах тимуса эмбриональной группы встречались крупные клетки с большим ядром и интенсивным специфическим иммуноокрашиванием цитоплазмы, причем окрашивание было распределено в цитоплазме неравномерно Эти клетки располагались вблизи междольковых септ или сосудов Также в паренхиме органа встречались менее интенсивно окрашенные округлые клетки, которые располагались небольшими скоплениями по 5-6 клеток В медуллярной зоне встречались окрашенные клетки неправильной формы с отростками

В группе детей первого года жизни иммуноокрашивание цитоплазмы наблюдалось в клетках неправильной формы, лежащих в паренхиме органа, и в эпителиальных клетках, расположенных вблизи вновь образующихся сосудов На препаратах были видны окрашенные участки цитоплазмы в медуллярном компартменте тимуса Округлые клетки со слабым неравномерным окрашиванием цитоплазмы встречались вблизи сосудов, иногда заполненных эритроцитами, которые не демонстрировали специфического окрашивания

В тимусах людей старшего возраста, в значительной степени претерпевших возрастную инволюцию, значительную часть органа занимали ячейки жировой и тяжи соединительной ткани, в пределах которых иммунопозитивное окрашивание встречалось в небольшом количестве В неатрофированной паренхиме органа специфического иммуноокрашивания не наблюдалось, за исключением скоплений эритроцитов, интенсивно окрашенных при применении антител к инсулину

Полученные значения оптической плотности и суммарной площади окрашенных структур представлены в таблице 4

Таблица 4

Экспрессия инсулина в клетках тимуса человека ___

№ группы Возрастные пределы группы Средние величины оптической плотности, условные единицы Средние величины суммарной площади, %

1 19-22 неделя внутриутробного развития 0,252*0,004* 0,348*0,048

2 2 суток-7 месяцев 0,330±0,002 0,304*0,024

3 60-74 года 0,350±0,011 0,814*0,072*

4 75-89 лет 0,386*0,007 0,728*0,030"

5 90 лет и более 0,346*0,004 0,360*0,080

Примечание; *- достоверное отличие от групп 2, 3, 4, 5 (р<0,05); достоверное отличие от групп 1, 2, 5 (р<0,05).

Статистическая обработка данных показала достоверно более низкое значение оптической плотности специфически окрашенных структур в тимусе плодов, умерших антенатально, по сравнению со значениями таковой в других возрастных группах (р<0,05) (рис. 4). Сравнение уровней экспрессии инсулина в тимусах людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей не выявило достоверных отличий между этими группами (рис. 4).

Определены средние значения суммарной площади специфически окрашенных структур и проведено сравнение этих величин для разных возрастных групп. Численные значения этого показателя у людей разных возрастов следующие: 0,348*0,048% - у плодов, умерших антенатально, 0,304±0,024% у детей первого года жизни, 0,814*0,072% - у людей пожилого возраста, 0,728±0,030% - у людей старческого возраста, 0,36*0,080% - в фуппе долгожителей (табл. 4).

Рис. 4. Экспрессия инсулина в клетках тимуса человека.

Примечание: Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 - люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; А - Оптическая плотность иммуноокрашенных структур (условные единицы); *- достоверное отличие от групп 2, 3, 4, 5 (р<0,05); В -Суммарная площадь иммуноокрашенных структур (%); *- достоверное отличие от групп 1, 2, 5 (р<0,05).

Статистическая обработка данных показала достоверность отличия суммарной площади инсулин-экспрессирующих структур на срезаз тимусов людей пожилого и старческого возраста по сравнению с таковой в тимусах плодов, умерших антенатально, детей первого года жизни и долгожителей (рис

4)

Таким образом, нами проведена сравнительная оценка уровней экспрессии инсулина в тимусе человека на разных этапах его онтогенеза Проведенное исследование позволило выявить экспрессию инсулина в тимусах эмбрионов и, на несколько более высоком уровне, в тимусах детей первого года жизни, людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей Подсчеты количественных показателей (оптической плотности и суммарной площади иммунопозитивных структур) показали, что в возрасте 60-74 лет, 75-89 лет, 90 лет и старше экспрессия инсулина в тимусе остается, в среднем, на том же уровне, что и в группах детей первого года жизни

Так как тимус людей старших возрастных групп в значительной степени атрофирован, инсулин-специфическое иммуноокрашивание наблюдалось, главным образом, в жировой и соединительной ткани, тогда как в группах эмбрионов и детей первого года жизни экспрессия инсулина выявлялась в клетках паренхимы железы Однако средние значения показателей уровня экспрессии инсулина для органа в целом не демонстрировали достоверного снижения синтеза гормона с возрастом

Полученные данные позволяют предположить, что экспрессия инсулина в тимусе призвана не только защищать организм от формирования аутоагрессивных клонов Т-лимфоцитов, но также осуществляет в органе дополнительные функции, изучение которых будет немаловажным в решении проблемы возрастной инволюции тимуса и связанных с этим иммунодефицитов у людей старшего возраста

Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии глюкагона в клетках тимуса людей разного возраста

В группе плодов, умерших антенатально, иммунопозитивное окрашивание наблюдалось в стенках сосудов, одиночных клетках в тимусной паренхиме и ВПП В группе детей первого года жизни, кроме того, окрашивались тельца Гассаля В группах людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей иммунопозитивные клетки обнаруживались в паренхиме тимуса и ВПП. Также интенсивно окрашивалась жировая ткань Показатели оптической плотности и процента суммарной площади клеток тимуса, экспрессирующих глюкагон, представлены в таблице 5

Таблица 5

Экспрессия глюкагона в клетках тимуса человека

№ группы Возрастные пределы группы Средние значения оптической плотности,условные единицы Средние значения суммарной площади, %

1 19-22 неделя внутриутробного развития 0,326±0,010 0,736±0,372

2 2 суток-7 месяцев 0,386±0,010 0,680±0,274#

3 60-74 года 0,424±0,011* 0,992±0,285

4 75-89 лет 0,420±0,006* 1,060±0,142

5 90 лет и более 0,366±0,030 0,512±0,099#

Примечание: *- достоверное отличие от группы 1 (р<0,05); *- достоверное отличие от группы 3 и 4 (р<0,05).

Нами проведено сравнение представленных в таблице 5 средних значений оптической плотности и суммарной площади иммуноокрашенных к глюкагону структур. Средние величины оптической плотности в тимусах людей пожилого и старческого возраста (0,424±0,011 у.е. и 0,420±0,006 у.е., соответственно) достоверно превышали таковое в тимусах плодов, умерших антенатально (0,326±0,010 у.е.). В тимусах детей первого года жизни и в тимусах долгожителей значения оптической плотности (0,386±0,010.у.е. и 0,366±0,030 у.е., соответственно) достоверно не отличались от таковых в других возрастных группах (табл. 5).

ПГруппа 1 □ Группа 2 0 Группа 3 ШГруппа 4 БГруппа 5

Рис. 5. Экспрессия глюкагона в клетках тимуса человека.

Примечание: Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 - люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; А - Оптическая плотность иммуноокрашенных структур (условные единицы); *- достоверное отличие от группы 1 (р<0,05); В - Суммарная площадь иммуноокрашенных структур (%); *- достоверное отличие от группы 3, 4 (р<0,05).

Средние значения суммарной площади структур, экспрессирующих глюкагон, следующие 0,736±0,372% в тимусах плодов, умерших антенатально, 0,680±0,274% в тимусах детей первого года жизни, 0,992±0,285% в тимусах людей пожилого возраста, 1,060±0,142% в тимусах людей старческого возраста, 0,512±0,099% в тимусах долгожителей Статистическая обработка данных выявила достоверно большую суммарную площадь глюкагон-иммунопозитивных структур в тимусах людей пожилого возраста и старческого возраста по сравнению с таковой в тимусах эмбрионов, младенцев и долгожителей (рис 5)

Результаты проведенного исследования показывают, что в тимусах людей старше 60 лет сохраняется экспрессия глюкагона Более того, интенсивность экспрессии и суммарная площадь экспрессии достоверно выше на препаратах тимусов людей пожилого и старческого возраста по сравнению с этими показателями в тимусах людей других возрастных групп

ВЫВОДЫ

1 В тимусе человека верифицирована экспрессия гормонов - хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона и эндотелина-1 на всех этапах онтогенеза и установлена возрастная динамика их паракринной секреции

2 Детально описана топография экспрессии гормонов в тимусе человека Установлено, что серотонин преимущественно экспрессируется в стенках сосудов, тельцах Гассаля, в паренхиме и строме органа, инсулин в пределах внутридольковых периваскуляных пространств, в паренхиме медуллярного компартмента, в жировой ткани, глюкагон в стенках сосудов, паренхиме тимуса, внутридольковых периваскулярных пространствах, тельцах Гассаля, в жировой ткани, хромогранина А в паренхиме, соединительнотканной строме и жировой ткани органа, эндотелии-1 в стенках сосудов

3 Усиление экспрессии ключевого нейроэндокринного маркера хромогранина А в тимусе человека при возрастной инволюции органа свидетельствует о сохранении гормональной функции тимуса в стареющем организме

4 Уровни экспрессии серотонина и глюкагона в тимусе человека постоянны на всех этапах онтогенеза, тогда как интенсивность экспрессии эндотелина-1 и инсулина достоверно увеличивается с возрастом Эти факты свидетельствуют о компенсаторной гиперфункции тимуса, направленной на гормонотропную регуляцию процессов иммуногенеза при старении

5 Стабильный уровень экспрессии глюкагона и усиление синтеза инсулина в тимусе человека в процессе старения отражает их важное значение не только в локальной регуляции иммуногенеза, но и как общегомеостатических гормонов, играющих значительную роль в эндогенных геропротекторных механизмах

6 Достоверное усиление экспрессии вазоактивного и иммунотропного гормона эндотелина-1 в тимусе человека с возрастом, наряду с сохранением высокого уровня экспрессии серотонина, также обладающего иммунотропными свойствами, является важным звеном в сигнальных механизмах поддержания иммунных процессов у пожилых и старых людей

7 Результаты исследования свидетельствуют о важной роли неспецифических гормонов в паракринной регуляции развития и функционирования тимуса человека на всех этапах онтогенеза, в том числе при старении

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется провести специальное исследование диагностической и прогностической ценности определения изученных гормонов в сыворотке крови при возрастных иммунодефицитах, что может явиться полезным для проведения профилактических и лечебных мероприятий, направленных на восстановление нормального уровня секреции гормонов общерегуляторного действия, продуцируемых в тимусе

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Возрастная динамика экспрессии гормонов в тимусе человека/ Е В Чернышова, В О Полякова, А Ю Чебракова, Е С Федорова, П Н Зезюлин //Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии» - СПб, 2006 -С 157-158

2 Возрастные изменения экспрессии р53 и mcl-1 в структурах нелимфоидного компонента

тимуса человека/ А Ю Чебракова, Е С Федорова, Е В Чернышова, И В Князькин , А В Трофимов//Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии» -СПб, 2006-С 159-160

3 Возрастная динамика экспрессии NO-синтазы и CD35 в тучных и дендритных клетках тимуса человека/ В О Полякова, Е С Федорова, Е В Чернышова, А Ю , Чебракова, И В Князькин, ПН Зезюлин// 11-я научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э С Пушковой «Пушковские чтения» -2006-С 180-181

4 Возрастные изменения экспрессии вазоактивных гормонов и факторов апоптоза в тимусе

человека/В О Полякова, Е В Чернышова, А Ю Чебракова, П Н Зезюлин, Е С Федорова //Медицинская иммунология-2006-Т 8-№2-3-С 380-381

5 Полякова В О Геропротекторные эффекты мелатонина на старение клеток тимуса in vitro/

В О Полякова, А Ю Чебракова, Е В Чернышова // Всероссийская конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» - СПб, 2005 -С 93

6 Чернышова Е В Возрастная динамика экспрессии серотонина в тимусе человека/Е В Чернышова//10-я Всероссийская медико-биологическая конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» - СПб, 2007 -С 505-506

7 Чернышова Е В Возрастная динамика экспрессии инсулина в тимусе человека/Чернышова, В О Полякова//Ш-я научно-практическая геронтоло-гическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э С Пушковой «Пушковские чтения» - СПб, 2007 - С 186

8 Чернышова Е В Возрастная динамика экспрессии глюкагона в тимусе человека/ Е В Чернышова, Е С Федорова // V Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения ВН Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» - СПб, 2007 -С 342

10 Чернышова ЕВ Возрастная динамика экспрессии хромогранина А в тимусе человека/ Чернышова ЕВ// 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых-Пущино, 2007-С 289

11 Чернышова ЕВ Экспрессия инсулина в тимусе людей разных возрастных групп/ Чернышова Е В, Федорова Е С //V Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения В Н Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» -СПб, 2007 -С 343

12 Чернышова ЕВ Экспрессия серотонина и эндотелина-1 в тимусе людей разных возрастных групп/Е В Чернышова, В О Полякова//9-я Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье» - СПб, 2006-С 381-382

13 Эффекты действия мелатонина на старение клеток тимуса и периферические Т-лимфоциты in vitro!В О Полякова, И В Князькин, С С Коновалов, И М Кветной, А В Трофимов, Е В Чернышова, А Ю Чебракова// Успехи геронтологии -2005 -Вып 17 -С 10-14

14 Chermshova Е V Age-related expression of serotonin and endothelin-1 m human thymus/ Chermshova E V, Knyazkin IV , Zezulm P N //International association of gerontology and geriatrics VI European Congress -SPb, 2007 -P 27

ЧЕРНЫШОВА Елена Викторовна ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ

ГОРМОНОВ В ТИМУСЕ ЧЕЛОВЕКА // Автореф дис канд биол наук 14 00 53 --

СПб, 2008 -21 с____

Подписано в печать 19 02 2008 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 _Тираж 100 экз Заказ У2_

Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С -Петербург, ул Большая Монетная, 5 лит А

Актуальность темы

Тимус является ключевым органом в системе нейроиммуноэндокринной'регуляции, выполняет роль иммунного органа и эндокринной железы, осуществляя при этом важные функции, обеспечивающие структурное и функциональное созревание иммунокомпетентных клеток. Основная функция тимуса направлена на> формирование рециркулирующего пула зрелых Т-лимфоцитов, что включает в себя дифференцировку Т-лимфоцитов (в частности, появление у них антиген-распознающих рецепторов), разделение Т-клеток на субпопуляции и отбор (селекцию) клонов Т-лимфоцитов, способных распознавать чужеродные антигены. Указанные процессы контролируются сигнальными молекулами клеток микроокружения4 путем их влияния на предшественники Т-лимфоцитов и созревающие тимоциты.

Реализуя эндокринную- функцию, тимус способен продуцировать различные биологически активные вещества, играющие ведущую роль не только в иммунологических, но и в других физиологических процессах. В тимусе животных и человека была обнаружена экспрессия хромогранина A [Brelinska R., Ostalska D., Zabel M., 2000], который играет роль кофактора во внутриклеточной продукции гормонов. Также показано, что в тимусе птиц и млекопитающих синтезируется ряд биогенных аминов и пептидных гормонов, характерных для других органов и тканей. Ранее в тимусе была показана экспрессия серотонина, мелатонина, глюкагона, инсулина, гастрина [Гордон Д.С., Сергеева В.Е., Зеленова И.Г., 1982; Milicevic N.M., Appassamy P.M., Glic M., et al., 1994; Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Trofimov A.V., et al., 2003].

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [Полякова В.О., Кветной И.М., Коновалов С.С., и др., 2007]. Сосудистое русло является неотъемлемым компонентом всех органов и играет чрезвычайно важную роль в их функционировании. Таким образом, возрастные изменения сосудов микроокружения могут в значительной степени отразиться на функции тимуса. Основным вазоактивным, гормоном является эндотелии-1, однако данных об экспрессии эндотелина-1 в тимусе в литературе' не обнаружено.

Несмотря на то, что в последнее время большое внимание уделяется изучению эндогенных факторов, препятствующих возрастной инволюции < тимуса, в частности, неспецифических тимусных гормонов, роль неспецифических гормонов в тимусе остается малоизученной, хотя для некоторых показано наличие рецепторов на клетках иммунной системы. Учитывая тот факт, что локальная продукция* гормонов, а также присутствие рецепторов к ним на* иммунокомпетентных клетках могут играть существенную роль в регуляции возрастных изменений в тимусе, верификация и изучение возрастной динамики экспрессии неспецифических гормонов в тимусе является актуальной проблемой современной биогеронтологии.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационного исследования является верификация и изучение возрастной динамики экспрессии гормонов серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Верифицировать экспрессию серотонина, эндотелина-1, инсулина,. глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза;

2. Изучить возрастную динамику экспрессии серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека;

3. Выявить корреляции между динамикой экспрессии указанных гормонов и старением у человека;

4. Оценить вклад возрастных изменений экспрессии исследуемых гормонов в процессы старческой инволюции тимуса.

Научная новизна

В работе впервые верифицирована экспрессия гормонов -хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона и эндотелина-1 в тимусе человека на всех этапах онтогенеза и установлена возрастная динамика их паракринной секреции. Установлена гистогенетическая и топографическая-вариабельность секреции указанных гормонов на всех этапах онтогенеза и показана возможность выработки гормонов во всех клеточных и тканевых компартментах тимуса.

Впервые зарегистрирована- корреляция между интенсивностью экспрессии гормонов и возрастом, при этом показано, что гормональная активность тимуса продолжает сохраняться на высоком уровне даже при возрастной инволюции органа. Усиление экспрессии ключевого нейроэндокринного маркера хромогранина А в тимусе человека при возрастной инволюции органа свидетельствует о сохранении гормональной функции тимуса в стареющем организме. Установлено, что уровни экспрессии серотонина и глюкагона в тимусе человека постоянны на всех этапах онтогенеза, тогда как интенсивность экспрессии эндотелина-1 и инсулина достоверно увеличивается с возрастом.

Эти факты свидетельствуют о компенсаторной гиперфункции тимуса для гормонотропной регуляции процессов иммуногенеза при старении. Стабильный уровень экспрессии глюкагона и усиление синтеза инсулина в тимусе человека в процессе старения отражает их важное значение'не только в локальной регуляции иммуногенеза, но и как общегомеостатических гормонов, играющих значительную роль в эндогенных геропротекторных механизмах.

Достоверное усиление экспрессии вазоактивного и иммунотропного гормона эндотелина-1 в тимусе человека с возрастом, наряду с сохранением высокого уровня экспрессии серотонина, также обладающего иммунотропными свойствами, является важным, звеном в сигнальных механизмах поддержания иммунных процессов у пожилых и» старых людей.

Результаты исследования свидетельствуют о важной роли неспецефических гормонов в паракринной регуляции развития и функционирования тимуса человека на всех этапах онтогенеза, в том числе при старении.

Практическая значимость

Впервые зарегистрирована возрастная компенсаторная эндокринная' гиперфункция тимуса, направленная на обеспечение гормонотропной' регуляции процессов иммуногенеза при старении. Результаты исследования^ свидетельствуют о важной роли тимуса не только как иммунного, но и как эндокринного органа, обеспечивающего поддержание гормональной регуляции в стареющем организме, несмотря на развитие инволюционных процессов. Полученные данные открывают перспективы для разработки подходов к стимуляции угасающих иммунных процессов при старении через регуляцию локальной секреции гормонов в тимусе человека.

Положения, выносимые на защиту

1. Тимус человека является активно функционирующим эндокринным органом. На всех этапах онтогенеза в тимусе зарегистрирована экспрессия хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона, эндотелина-1.

2. Экспрессия указанных гормонов гистогенетически вариабельна и верифицируется в различных клеточных и тканевых элементах тимуса: тимоцитах, эпителиальных клетках, клетках микроокружения, сосудах, структурах жировой и соединительной ткани.

3. Гормональная^ активность, тимуса' не подвергается возрастной инволюции. Для хромогранина А, эндотелина-1 и инсулина < зарегистрировано даже усиление их секреции с возрастом.

4. Возрастная. эндокринная гиперфункция тимуса носит компенсаторный характер и направлена на обеспечение гормонотропнойрегуляции процессов иммуногенеза при старении.

Связь с научно-исследовательскошработой Института

Диссертационная* работа является логическим продолжением, исследований, проводимых при выполнении магистерской диссертации В; лаборатории клеточной биологии и патологии СПб ИБГ СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли гормонов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет собственные экспериментальные данные изучения возрастной динамики экспрессии гормонов в тимусе человека. В разделе «заключение» обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 128 страницах, содержит 8 таблиц, иллюстрирован 37 рисунками. Список литературы содержит 149

7. Результаты исследования свидетельствуют о важной роли неспецефических гормонов в паракринной регуляции развития и функционирования тимуса человека на всех этапах онтогенеза, в том числе при старении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено сравнительное исследование внутритимусной экспрессии неспецифических гормонов на разных этапах онтогенеза человека. Гормон хромогранин А является классическим маркером нейроэндокринных клеток, анализ его экспрессии, помимо оценки уровня самого хромогранина А, дает возможность оценить общий гормональный статус ткани. В нашем исследовании хромогранин А был выявлен как в тимусах детей, так и в области тимуса людей 60-90 лет и более, причем на фоне уменьшения нейроэндокринных клеток тимусе, подвергшемся возрастной инволюции, оптическая плотность окрашивания к хромогранину А достоверно возрастала, что свидетельствует о важной и еще не установленной функции самого гормона в поддержании иммунного статуса организма.

Серотонин демонстрирует стимулирующее влияние на пролиферацию тимоцитов в корковом веществе тимуса. В нашем исследовании уровень экспрессии серотонина оказался одинаковым у плодов, умерших антенатально, детей первого года жизни, людей пожилого возраста, старческого возраста и долгожителей.

Можно предположить, что локально экспрессируемый инсулин вовлечен в поддержание функций иммунной системы после возрастной инволюции тимуса. Гормон эндотелии-1, помимо общеизвестных вазоактивных эффектов, вовлечен в развитие тимусных эпителиальных клеток на ранних этапах эмбриогенеза. Также, этот гормон стимулирует пролиферацию тимоцитов. Нами зарегистрирована достоверное усиление экспрессии гормона в тимусе человека при старении.

Серотонин и эндотелии-1 обладают вазоактивными свойствами, способны регулировать кровоснабжение тимуса и стимулировать иммунную функцию органа благодаря иммунотропным свойствам. Оба гормона экспрессируются в тимусе на одинаково высоком уровне на ранних этапах развития и в преклонном возрасте. Для эндотелина в нашем исследовании установлено достоверное усиление экспрессии в пожилом возрасте и после 90 лет. Учитывая присущие серотонину и эндотелину-1 иммунотропные свойства, основным из которых является активация фунуции Т-лимфоцитов, можно предположить, что при возрастной инволюции тимуса усиление экспрессии этих гормонов отражает их комплексную роль, направленную на поддержание иммунитета в стареющем организме.

Считавшиеся ранее тканеспецифичными гормоны инсулин и глюкагон сегодня обнаружены во многих тканях организма млекопитающих (Brimnes М.К., Jensen Т., Jorgensen T.N. et al., 2002; Kojima H., Fujimiya M., Matsumura K. et al., 2004). Внутритимусная экспрессия этих гормонов чрезвычайно важна на ранних этапах развития организма, когда происходит становление иммунной толерантности к антигенам собственного организма. Инсулину отводят стимулирующее влияние на пролиферацию тимоцитов (Freitas C.S., Dalman S.R., Abdelhay Е., 2004). В поддержку этих данных выступают и наши результаты, выявляющие достоверное усиление экспрессии инсулина, в тимусе человека с возрастом. Влияние глюкагона на клетки иммунной системы остается мало изученным, хотя рецепторы к этому гормону уже обнаружены на клетках лимфоидного и миелоидного ряда. Нами выявлен неизменный уровень экспрессии глюкагона в тимусе человека на этапе внутриутробного развития, в первый год жизни, после 60 лет, после 75 лет и у долгожителей.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований демонстрируют, что локально экспрессируемые в тимусе гормоны важны на всех этапах онтогенеза человека, играя важную роль не только в становлении иммунной аутотолерантности, но и в осуществлении паракринной сигнальной регуляции функций тимуса - ключевого органа иммунной и эндокринной систем.