Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Паттерн экспрессии микроРНК при предопухолевых заболеваниях и раке гортани

На правах рукописи

НИКИТИНА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА

ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ микроРНК ПРИ ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И РАКЕ ГОРТАНИ

14.01.12 - онкология

2 8 ОКТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск 2015

005563939

005563939

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Томский научно-исследовательский институт онкологии» и Национальном исследовательском Томском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук Литвинов Николай Васильевич, заведующий лабораторией онковирусологии Томского НИИ онкологии

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Поспехова Наталья Ивановна

ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, руководитель отдела лабораторной генетики

доктор медицинских наук Рукша Татьяна Геннадьевна

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, заведующая кафедрой патологической физиологии им. проф. В.В.Иванова

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина», г. Москва.

Защита диссертации состоится «24» ноября 2015 года в /_ на заседании

диссертационного совета Д208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии ни. H.H. Петрова» Минздрава России по адресу: 197758, Санкт-Петербург, нос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, нос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68) и на сайте httn:/Avw\v. niioncologii.ru/ru/notle/284

Автореферат разослан октября 2015

года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

БАХИДЗЕ Елена Вилльевна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. МикроРНК относятся к классу малых молекул РНК длиной 19-24 нуклеотида, которые связываясь с З'-UTR мРНК генов-мишеней по принципу полной или частичной комплементарное™, постранскрипционно регулируют генную экспрессию (Bartel 2004; Zamore and Haley 2005). Благодаря такому механизму микроРНК участвуют в регуляции многих клеточных процессов, включая развитие, дифференцировку, апоптоз, пролиферацию, ответ на стрессовое воздействие, метаболизм, секрецию инсулина (Ambros 2004). Показано, что в опухоли часто наблюдается аберрантная экспрессия микроРНК, которая свидетельствует о важной роли этих молекул в процессе канцерогенеза (Esquela-Kerscher and Slack 2006).

Экспрессия микроРНК отличается значительной тканевой специфичностью и аберрантный паттерн экспрессии микроРНК различается в зависимости от тканевого происхождения опухоли, роли микроокружения и генов-мишеней задействованных в канцеронегезе опухоли анализируемой локализации (Tian, Zhang et al. 2014). Описание аберрантного паттерна при верифицированном диагнозе злокачественной патологии важно с точки зрения понимания механизмов канцерогенеза, поиска новых мишеней для таргетной терапии и маркеров для прогноза и мониторинга заболевания (Hackl, Brunner et al. 2010). Первые шаги в анализе уровня экспрессии микроРНК при опухолях области головы и шеи были сделаны на клеточных линиях, полученных от плоскоклеточных карцином (Jiang, Lee et al. 2005; Lu, Getz et al. 2005; Volinia, Câlin et al. 2006). Однако же эти данные не позволяют отследить этапы канцерогенеза и оценить вовлеченность и участие микроРНК в трансформацию клеток, что на практике может быть использовано для уточняющей диагностики и оценки риска прогрессии заболевания при мониторинге предопухолевой патологии гортани у пациента. Таким образом, представилось перспективным провести анализ паттерна экспрессии микроРНК одной из малоизученных локализаций в этом отношении - гортани, злокачественные патологии которой занимают второе место по частоте заболеваемости среди злокачественных новообразований (ЗНО) области головы и шеи в мире (Chu and Kim 2008). Анализ образцов с предопухолевыми изменениями и оценка риска развития рака гортани у этих больных, помимо фундаментального знания, достаточно актуальна и с точки зрения определения тактики ведения таких пациентов.

Канцерогенез опухолей гортани является многоступенчатым и растянутым во времени процессом, занимающим чаще всего десятки лет, и протекающем на фоне хронических воспалительных заболеваний (Weller, Nankivell et al. 2010), a зачастую и на фоне хронической инфекции - вируса папилломы человека (ВПЧ) (Jayaprakash, Reid et al. 2011). Принимая это во внимание, представилось перспективным оценить частоту встречаемости высокоонкогенных типов ВПЧ, молекулярного показателя специфичного для данной локализации, и оценить его вклад и возможную связь с аберрантной экспрессией анализируемых микроРНК.

Среди микроРНК интереса, включенных в исследование были выбраны те молекулы, относительно которых в литературе представлены данные, доказывающие их значительную роль в канцерогенезе при других локализациях. Так, для микроРНК-21, -18а, -200а, -200с, -205, -221, -494 было показано, что они играют одну из ключевых ролей в регуляции процессов клеточного цикла, алоптоза, роста, инвазии, пролиферации клеток при опухолях репродуктивных систем у женщин (рак молочной железы, рак яичников), раке легкого, желудка и многих других локализациях (Esquela-Kerscher and Slack 2006; Korpal, Lee et al. 2008; Cochrane, Howe et al. 2009; Krichevsky A.M. 2009; Qin, Zhang et al. 2013). Кроме того, отмечено их непосредственное участие в формировании иммунного ответа (микроРНК-155) (Teng and Papavasiliou 2009).

Высочайшая специфичность паттерна микроРНК, в сравнение с профилем мРНК в ткани, говорит о пригодности малых молекул в качестве высокоинформативных

биомаркеров злокачественной опухоли (Jiang, Lee et al. 2005; Lu, Getz et al. 2005). В литературе представлены отдельные работы посвященные оценке возможности использования в качестве диагностического маркера ЗНО профиля микроРНК слюны пациентов с ЗНО ротовой полости (Park, Zhou et al. 2009; Liu, Kao et al. 2010).

Развитие злокачественной патологии зависит от молекулярных параметров (как опухоли так и микроокружения), и от особых этиологических факторов (как ВПЧ-инфекция), и от сопутствующих патологических предопухолевых состояний (доброкачественные новообразования или хронические воспалительные реакции). В своей работе мы провели учет всех особенностей, связанных с исследованием микроРНК при патологиях гортани, выстроив патологический ряд от образцов без дисплазии до верифицированного рака IV стадии, оптимизировав выборки по исходным клинико-патологическим параметрам. Использование оценки паттерна экспрессии микроРНК в патологически измененной относительно нормальной ткани гортани тех же пациентов и биоматериале полученном неинвазивным методом (слюны) позволило расширить представления о молекулярных основах канцерогенеза и выявить перспективные биомаркеры для ранней диагностики,мониторинга предопухолевой патологии и оценки риска развития злокачественных опухолей гортани.

Цель:

Исследование паттерна экспрессии микроРНК у пациентов с предопухолевыми изменениями и плоскоклеточными карциномами гортани в сравнительном аспекте, в зависимости от клинико-патологических параметров и исхода заболевания.

Задачи исследования:

1. Исследовать паттерн экспрессии микроРНК в патологически измененной ткани от пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани;

2. Оценил, экспрессию микроРНК в опухолевой ткани от пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани и ее связь с клинико-патологическими показателями, исходом заболевания;

3. Провести сравнительную оценку экспрессии микроРНК в опухолевой и прилежащей нормальной ткани от ВПЧ-позитивных и ВПЧ-негативных пациентов;

4. Сравнить паттерны экспрессии микроРНК в патологически измененной ткани у пациентов с предопухолевыми и злокачественными заболеваниями гортани;

5. Изучить уровень микроРНК в слюне пациентов с предопухолевыми и злокачественными патологиями гортани.

Научная новизна работы.

Впервые изучен паттерн экспрессии микроРНК-21, -18а, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 не только в опухолевой ткани, но и в патологически измененной ткани, относительно прилежащей нормальной ткани в ряду образцов без дисплазии к дисплазии III степени и раку гортани. Выделена группа микроРНК, для которых наблюдается повышение экспрессии в патологически измененной ткани по мере утяжеления диагноза (микроРНК-21, -155, -200с, -205). В опухоли гортани выявлена аберрантная гиперэкспрессия онкогенных микроРНК-21, -155, -205 и гипоэкспрессия онкосупрессорной микроРНК-200а. Впервые показана возможность использования показателя уровня экспрессии восьми анализируемых микроРНК в качестве потенциального фактора риска развития рака гортани из предопухолевых патологий.

Впервые изучен паттерн восьми микроРНК в слюне пациентов с предопухолевыми патологиями и раком гортани. Показано снижение уровня некоторых микроРНК в слюне больных раком гортани по сравнению с пациентами с дисплазиями II-III степени. Впервые проанализирована связь ВПЧ с уровнем экспрессии микроРНК-21, -18а, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 у лиц с патологиями гортани.

Теоретическая и практическая значимость.

Выявленное повышение экспрессии микроРНК-21, -155, -200с и -205 в ряду патологических состояний от образцов без диспластических изменений к ДШ и далее к раку гортани расширяет теоретические представления о механизмах канцерогенеза, позволяя предположить, что молекулярно-генетические нарушения на уровне регуляции экспрессии микроРНК происходят уже на начальном этапе формирования предопухолевой патологии (в образцах без дисплазии) и усиливаются по мере ее развития. Среди анализируемых микроРНК выявлены новые потенциальные маркеры, определение которых в патологически измененной ткани у пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани может быть использовано для оценки риска злокачественной трансформации, что даст возможность формировать группы повышенного риска развития рака гортани.

Аберрантный паттерн экспрессии онкогенных микроРНК-21, -155, -205 и онкосупрессорной микроРНК-200а в опухолевой ткани гортани свидетельствует о перспективности дальнейших исследований этих микроРНК в качестве новых мишеней для таргетной терапии рака гортани. Изучение уровня микроРНК в биоматериале полученном неинвазивным способом (слюне) позволило выявить ассоциацию ряда микроРНК с раком гортани. Определение паттерна микроРНК в слюне является перспективным для дальнейших исследований в плане возможности разработки неинвазивных методов определения риска злокачественной трансформации предопухолевых патологий гортани и дискриминации дисплазии II-III степени и рака гортани ранней стадии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аберрантная экспрессия микроРНК обнаруживается в образцах как предопухолевой патологии, так и в опухолевой ткани, что свидетельствует о важной роли микроРНК в развитии диспластических изменений плоскоклеточного эпителия гортани и его злокачественной трансформации.

2. Значительная гиперэкспрессия онкогенных микроРНК-21, -155, -205 и гипоэкспрессия онкосупрессорной микроРНК-200а в опухоли гортани относительно прилежащей нормальной ткани определяет перспективность исследований этих микроРНК в качестве мишеней для таргетной терапии.

3. Оценка уровня микроРНК в слюне может быть использована для разработки неинвазивных методов определения риска злокачественной трансформации предопухолевых патологий гортани.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н. В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», г. Томск (2010, 2011, 2013 гг); X конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2014», г. Санкт-Петербург (2014г.); дважды на V Всемирном конгрессе, посвященном проблематике опухолей головы и шеи («5th world Congress of IFHNOS & annual meeting of the AHNS»), г. Нью-Йорк, США (2014г.); на VIII Съезде онкологов и радиологов стран-участников СНГ, г. Казань (2014г); на XVIII Российском онкологическом конгрессе, г. Москва (2014г.); на международном симпозиуме посвященном проблематике ВПЧ-позитивных опухолей головы и шеи (International Symposium on HPV Infection in Head and Neck Cancer), г. Познань, Польша (2014г.); на Всероссийской конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н. В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», г. Томск (2014, 2015гг); на VII съезде Российского общества медицинских генетиков, г. Санкт-Петербург (2015г.); на международной конференции «Клеточные и молекулярные механизмы взаимоотношения опухоли и микроокружения» («Cellular and molecular mechanisms of tumor-microenvironment crosstalk»), г. Томск (2015г.).

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты внедрены в теоретические курсы «Эволюционная биология» и «Эволюционная генетика» на кафедре цитологии и генетики Биологического института

Томского государственного университета, а также результаты внедрены в практику Томского НИИ онкологии для определения риска развития и прогнозирования злокачественного новообразования на основе определения паттерна микроРНК в слюне пациентов.

Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 20 печатных работах, из них - 4 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 303 источника, из них 11 отечественных и 292 зарубежных.

Материалы и методы исследования.

В настоящей работе проанализирован материал, собранный от пациентов с предопухолевыми патологиями и первично диагностированными плоскоклеточными карциномами гортани, проходящих обследование/лечение в клинике Томского НИИ онкологии. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288), получено разрешение этического комитета института. Материалом для исследования послужили операционный материал или биоптаты патологически измененной и нормальной ткани от пациентов с предраковыми патологиями (п=26) и со злокачественными новообразованиями гортани (п=55), а также слюна этих пациентов. Группу с предопухолевыми заболеваниями составили 14 человек без диспластических изменений ткани гортани, у остальных выявлены дисплазии I, II и III степени (2, 3 и 7 пациентов, соответственно). В группе больных ЗНО у 24 человек выявлен рак I-II стадии, у 31 - рак III-IV стадии; отсутствие регионарных метастазов зафиксировано у 43 больных, у 12 пациентов выявлены 1 и более метастазов в регионарные лимфоузлы; отдаленного метастазирования не выявлено (п=55).

Для молекулярно-генетического анализа использованы методы экстракции РНК из опухолевой и прилежащей нормальной ткани набором реагентов miRVana™ (Ambion, USA), из слюны - с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, USA), согласно стандартному протоколу с модификацией. Обратно-транскриптазная ПЦР для микроРНК hsa-microRNA-18а-5р, hsa-microRNA-21-5p, hsa-microRNA-155-5p, hsa-microRNA-200a-3p, hsa-microRNA-200c-3p, hsa-microRNA-205-5p, hsa-microRNA-221-Зр и hsa-microRNA-494-Зр проведена с применением специфичных праймеров особой шпилевидной конструкции (Chen С, et al, 2005). Количественная ПЦР в режиме реального времени проведена с использованием специфичных праймеров к анализируемым микроРНК (Iyevleva, Kuligina et al. 2012) на приборе RotorGene 6000 (Corbett Research, Australia). В качестве гена-рефери выбрана микроРНК-103 (Peltier and Latham 2008), уровень экспрессии микроРНК в ткани рассчитан согласно методу Pfaffl (Pfaffl 2001), в слюне - по методу ACt (Livak and Schmittgen 2001). Для определения вирусоносительства в образцах ткани проведена экстракция ДНК из ткани стандартным фенольным методом с использованием протеиназы К с последующей постановкой ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» и «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL» (Россия).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 8.0» и программы PAST V2.17, а также в программе визуализации NovaSpark. Сравнение значений уровня экспрессии между подгруппами проведено с использованием t-теста Уэлша (Ruxton 2006). Для установления связи между изучаемыми вирусо-генетическими и клинико-морфологическими параметрами был проведен ряд тестов - дискриминантный, корреляционный и двублоковый PLS-анализ. Для оценки ассоциации между изменением уровня экспрессии микроРНК и риском развития и/ прогрессии патологии гортани использовали критерий Фишера. Прогностическая

значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РГ оценена с использованием программы Survival Analysis. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценена по критерию Log-rang теста. Для всех статистических подсчетов применен критерий множественности сравнения Бенджамини-Хохберга (FDR - false discovery rate).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Профиль экспрессии микроРНК в группе пациентов с предраковыми заболеваниями гортани

Проведено определение уровня экспрессии микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221 и -494 на 26 образцах полученных от больных предопухолевыми и/или хроническими воспалительными заболеваниями гортани. Для оптимизации выборки проведена оценка внутренней структуры данных и вклада клинико-патологических параметров (пол, возраст, диагноз, степень дисплазии и ВПЧ-инфицирование) на экспрессию анализируемых микроРНК методом многомерного анализа данных (двублоковый PLS-анализ). Выявлен выпадающий образец с нетипичным для общей группы паттерном экспрессии (данные не представлены), который получен от пациентки 23 лет с папилломатозом гортани, который в последующем анализе исключен из выборки.

При стратификации группы пациентов по половой принадлежности и возрасту дискриминантный анализ не показал статистически значимой разницы в совокупном уровне экспрессии. Не выявлено разницы в экспрессии и при попарном сравнении экспрессии отдельных микроРНК (данные не представлены), что позволило для дальнейшего анализа выбрать всю когорту пациентов кроме женщины в возрасте 23 лет, что составило 96% (25/26) от изначальной выборки пациентов.

Анализ паттерна экспрессии анализируемых микроРНК выявил отклонения экспрессии в патологически измененной ткани относительно прилежащей нормальной среди пациентов с предопухолевыми заболеваниями ткани гортани. Для микроРНК-200а, -205, -221 отмечена тенденция к повышению экспрессии по мере утяжеления диагноза, хотя изменения не укладываются в 5% барьер FDR (табл. 1).

Таблица 1 - Уровень экспрессии микроРНК в патологически измененной ткани относительно прилежащей нормальной от пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани___

микроРНК N MeaniSE Р FDR, %

-18а 24 -0,09±0,10 0,417 47,7

-21 25 0,31±0,28 0,278 37,1

-155 25 0,14±0,26 0,598 59,8

-200а 22 -0,84±0,37 0,033 13,4

-200с 25 -0,60±0,30 0,057 11,4

-205 25 -0,73±0,31 0,025 20,4

-221 25 -1,07±0,50 0,040 10,8

-494 25 -0,54±0,42 0,210 33,6

Примечание: N - объем выборки в подгруппе; Mean±SE - средний уровень экспрессии ± ошибка среднего; уровень значимости рассчитан по t-критерию Стьюдента (t-test for single means); значение нормы экспрессии соответствует 0_

Данных о роли микроРНК в процессе канцерогенеза опухолей ОГШ на клинических образцах пациентов с гистологически верифицированной дисплазией I-III степени в литературе отражено крайне мало и впервые представлены Cervighe N. К. et al в 2009 году (Cervigne, Reis et al. 2009). В своей работе авторы получили интересные результаты о

повышении экспрессии микроРНК-21, -181Ь и -345 по мере утяжеления степени дисплазии, что свидетельствует о вовлеченности малых молекул-регуляторов в трансформацию клеток. Примечательно, что авторы обнаружили, что паттерн экспрессии непрогрессирующих и прогрессирующих лейкоплакий различается, и общая экспрессия микроРНК второй подгруппы гораздо ближе к группе больных раком ротовой полости, что может быть использовано для прогнозирования заболевания.

Нами проведен многомерный анализ с использованием данных по экспрессии анализируемых микроРНК, однако дискриминантный анализ не выявил различий в совокупном уровне экспрессии микроРНК в зависимости от диагноза (Р (16,22) = 1,102630, р<0,4080). При сравнении же экспрессии микроРНК по отдельности внутри подгрупп дая некоторых микроРНК, которые отнесены к группе онкогенных, выявлено повышение их экспрессии по мере утяжеления диагноза. Средний уровень экспрессии микроРНК-21 и -155 повышается с повышением степени дисплазии, что графически представлено на рисунке 1.

Степень дисплазии

Степень дисплазии

А Б

Рисунок 1 - Экспрессия микроРНК-21 (А) и -155 (Б) в группе пациентов с дисплазиями. Примечание - 0 - группа без дисплазий, п=14; 1 - группа с Д1, п=2; 2 - группа с ДП, п=3; 3 ■ группа с ДШ, п=7.

Тенденция повышения экспрессии этих микроРНК в ряду гистологического диагноза от легкой дисплазии (I степень) к тяжелой дисплазии (III степени) позволяют предположить, что по мере развития предопухолевой патологии происходит накопление молекулярных нарушений связанных с микроРНК и ассоциированных с прогрессией заболевания. Полученные нами данные согласуются с гипотезой о том, что большинство генетических изменений приобретаются клеткой на ранних этапах канцерогенеза опухолей головы и шеи (На, Benoit et al. 2003). На P.K. et al (2003) в эксперименте на клинических образцах нормального эпителия, дисплазий, рака области головы и шеи показали, что образцы с предопухолевыми изменениями имеют аберрантную экспрессию около 334 генов в сравнении с группой контроля (здоровая ткань) (На, Benoit et al. 2003). При сравнении же группы с предопухолевыми заболеваниями и раком выявлена значимая разница в экспрессии в значительно меньшем количестве генов - лишь для 23.

Для правильной постановки гистологического диагноза и ведения пациентов в клинической практике существенным моментом для отнесения пациента к группе риска развития злокачественной патологии является однозначное разделение на подгруппы лиц без диспластических изменений и с дисплазией II-III степени. В своем исследовании для детального анализа паттерна экспрессии микроРНК в подгруппах, в виду малочисленности выборки нами были объединены подгруппы образцов без диспластических изменений и Д1, а также ДП и ДШ, что также обосновано с точки зрения гистологической стратификации диагноза (Подцубный Б.К. 2009). Показано повышение экспрессии микроРНК-21, -155, -

8

200с и -205 среди больных с Д11 и ДШ в сравнении с пациентами первой подгруппы (15vsl0, р=0,019, р=0,045, р=0,020 и р=0,038, соответственно, табл. 2). Однако несмотря на тот факт, что значения р для этих микроРНК превышают 5% порог FDR, рассчитанные значения чувствительности и специфичности для микроРНК-21 показали обнадеживающие значения - 60% и 90%, соответственно. Установлено, что в группе пациентов с ДН-Ш, в сравнении с группой лиц без дисплазии и Д1, количество случаев с гиперэкспрессией микроРНК-21в 1,5 раз выше, чем с гипоэкспрессией. Это свидетельствует о том, что риск прогрессии заболевания повышается при повышении экспрессии микроРНК-21 (OR=13,5, CI 95%, (1,34-135,9), р=0,017). Эти данные позволяют судить о перспективности использования показателя экспрессии микроРНК-21 в патологически измененной ткани при гистологической верификации диагноза.

Таблица 2 — Уровень экспрессии микроРНК в патологически измененной ткани в зависимости от степени дисплазии._

микроРНК Без дисплазии-Д1 Д II-III Р FDR, %

N MeaniSE N MeaniSE

-18а 14 -0,07±0,13 10 -0,11±0,18 0,861 86,1

-21 15 -0,17±0,39 10 1,04±0,28 0,019 15,5

-155 15 -0,27±0,33 10 0,74±0,35 0,045 9,1

-200а 13 -0,99±0,50 9 -0,63±0,58 0,641 85,4

-200с 15 -1,15±0,34 10 0,24±0,44 0,020 8,1

-205 15 -1,20±0,43 10 -0,02±0,32 0,038 10,3

-221 15 -0,98±0,66 10 -1,22±0,79 0,819 93,6

-494 15 -0,89±0,63 10 -0,01 ±0,45 0,267 42,7

Примечание: N - объем выборки в подгруппе; Меап±8Е - средний уровень экспрессии ± ошибка среднего; уровень значимости рассчитан по ^критерию Уэлша; значение нормы экспрессии соответствует 0_

Относительно функциональной роли микроРНК-21, -200с и -205 в канцерогенезе стоит упомянуть их общую вовлеченность в этот процесс и контроль многих генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоза, роста и дифференцировки опухолевой ткани (Hong, Han et al. 2013; Qin, Zhang et al. 2013; Feng, Wang et al. 2014). Интересно отметить, что в частности для микроРНК-155 показано участие в регуляции активации воспалительных каскадов. Это является показателем важной связующей роли микроРНК-155 между хроническим воспалением и злокачественной патологией (Tili, Michaille et al. 2011), развитие которой проходит через стадию предракового состояния, важной особенностью которого в свою очередь является наличие в большинстве этих случаев хронического воспаления.

Таким образом, в ходе исследования нами показана тенденция аберрантного повышения экспрессии микроРНК-21, -155, -200с и -205 в ряду патологических состояний от образцов без дисплазии к ДШ. Эти данные не только позволяют предположить немаловажное участие этих микроРНК в малигнизации ткани гортани, но и свидетельствуют, что молекулярно-генетические нарушения происходят и накапливаются по мере развития диспластического состояния, а значения чувствительности и специфичности в 60% и 90%, соответственно, при определен™ экспрессии микроРНК-21 позволяют предположить о хорошем диагностическом потенциале этого показателя. Экспрессия микроРНК у пациентов с прел опухолевыми заболеваниями в зависимости от ВИЧ-инфицирования

Канцерогенез опухолей гортани является многоступенчатым и растянутым во времени процессом, занимающим чаще всего десятки лет, и протекающем на фоне

хронических воспалительных заболеваний (Weller, Nankivell et al. 2010), а зачастую и на фоне хронической инфекции (Jayaprakash, Reid et al. 2011). Принимая во внимание вышеупомянутые факты, представилось перспективным оценить частоту встречаемости высокоонкогенных типов ВПЧ в этой группе, а также связь между инфицированием вирусом папилломы человека и экспрессией микроРНК.

В группе пациентов с предопухолевыми заболеваниями частота встречаемости ВПЧ составила 7,7% (2 из 26), что несколько ниже аналогичного показателя согласно данным мировой литературы. В обоих вирус-позитивных образцах выявлен 16 тип ВПЧ, причем ДНК папилломавируса также была обнаружена и в прилежащей нормальной ткани пациента.

Дискриминантный анализ экспрессии 8 микроРНК не выявил различий между подгруппами вирус-инфицированных и вирус-негативных пациентов с предопухолевыми заболеваниями (F (8,12) = 1,235220, р < 0,3577). Однако сравнение значений экспрессии по каждой микроРНК в отдельности показал значимое повышение экспрессии микроРНК-21 (23vs2, р=0,002) у вирус-позитивных лиц, а также тенденцию повышения экспрессии микроРНК-18а (22vs2, р=0,041), значение р которой не преодолевает 5% барьер FDR (данные не представлены). Однако делать какие-то однозначные выводы на столь ограниченной по количеству вирус-позитивных человек выборке в условиях данной работы не представляется возможным. Эти данные требуют уточнения на расширенных выборках пациентов.

Паттерн экспрессии микроРНК при злокачественных опухолях гортани

Прежде всего для унификации выборки было проведено изучение внутренней структуры данных, которое позволяет определить выбросы, а также связи между всеми анализируемыми клинико-патологическими и молекулярными характеристиками методом многомерного анализа данных. Результаты двублокового PLS-анализа по экспрессии микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 и клинико-патологических характеристик (пол, возраст, стадии Т и N, степень дифференцировки опухоли, ВПЧ-инфицирование) 55 пациентов с первичным диагнозом рака гортани позволил выявить подгруппу из 6 выпадающих образцов с отличным от остальных образцов уровнем экспрессии (данные не представлены). Группирующим признаком для них явился возраст пациентов. Показано, что все 6 выпадающих образцов принадлежали пациентам в возрасте до 45 лет (86% от анализируемой когорты данной возрастной подгруппы), причем 3 из них получены от женщин (60% от всех женщин, включенных в анализ). Таким образом, пациенты в возрасте до 45 лет представляют собой обособленную подгруппу и имеют отличный паттерн экспрессии микроРНК от пациентов старшего возраста, что было учтено при последующей обработке данных и эти пациенты были исключены из анализа.

Для оценки влияния возраста на уровень экспрессии микроРНК когорта пациентов была разделена на три условные подгруппы согласно представленным выше результатам и с учетом классических подходов стратификации онкологических больных по данному показателю: 1. до 45 лет (п=7); 2. 45-65 лет (п=39); 3. старше 65 лет (п=9).

При сопоставлении уровня экспрессии по каждой микроРНК в отдельности выявлено, что только уровень экспрессии микроРНК-494 у лиц с диагнозом рак гортани в возрасте до 45 лет значимо снижен в сравнении с больными в возрасте 45-65 лет, а также лицами старше 65 лет (7 vs 36, р = 0,00038 и 7 vs 9, р = 0,00039, соответственно). Для этой микроРНК также наблюдалась слабая положительная корреляция с возрастом пациентов обоих полов (г=0,37, р=0,006) (данные не представлены).

С целью различения выборки пациентов всех возрастов по нескольким переменным одновременно (анализируемым микроРНК) проведен дискриминантный анализ, который позволяет выявлять различия между группами и дает возможность классифицировать объекты по принципу максимального сходства. Выявлено, что уровень экспрессии 8 микроРНК значимо отличается в зависимости от возраста пациентов (F (16,74) = 3,632211 р

< 0,0001, рис. 15), причем основной вклад в разделение группы осуществляется за счет микроРНК-494, которая имеет самый высокий уровень корреляции с возрастом (г=0,37).

■ • до 45 лет ■ 45-65 лет ж старше 65 лет

. ■ ■■■■ ■ ■ ■ ■ m ■ * ■ ■ ж! ■ ■ ■ ж " * ^ ■ ж ■ • •• • • • •

-4 -3 -2 -1 0 1 2345

д ROOTJ

Рисунок 2 — Графическое отображение данных по экспрессии анализируемых микроРНК в зависимости от возраста пациентов. Примечание - А: по осям X и Y в виде ROOT-1 и ROOT-2, представлены результаты дискриминантного анализа в виде условных значений по экспрессии микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 в зависимости от возраста пациентов. Точками, квадратами и крестиками обозначены пациенты в возрасте до 45 лет, 45-65 года и старше 65 лет, соответственно.

Учитывая результаты, представленные выше, для оценки влияния половой принадлежности на паттерн экспрессии микроРНК в ткани пациентов РГ выбрана подгруппа лиц старше 45 лет.

В литературе представлены данные подтверждающие возможное участие некоторых микроРНК в биологическом старении. Так, показана гиперэкспрессия микроРНК-34а в ткани и крови мышей старшего возраста в сравнении с молодыми мышами (Li, Khanna et al. 2011). Hooten NN et al (2010) на примере мононуклеаров периферической крови 28 человек выявили снижение экспрессии микроРНК-155 у пожилых людей в сравнении с людьми более молодого возраста (Hooten, Abdelmohsen et al. 2010).

Дискриминантный анализ профиля экспрессии 8 микроРНК показал отсутствие значимых различий изучаемых показателей в зависимости от пола пациентов (F (8,37) = 1,218869 р<0,3154). Однако сравнение уровня экспрессии по каждой микроРНК в отдельности позволило выявить значимое различие между женщинами и мужчинами для микроРНК-200а и -21 (2vs46, р=0,006 и р=0,003, соответственно), что однако может объясняться и эффектом малых выборок в связи с малочисленностью группы пациентов женского пола.

В литературе освещены результаты экспериментов и по выявлению влияния эстрогена на уровень экспрессии микроРНК на примере клеточной линии рака молочной железы. Используя метод микрочипов, авторы получили доказательство связи половой компоненты с изменением уровня экспрессии 23 микроРНК, причем результат был подтвержден методом ПЦР для 8 из них, в списке которых также была и выявленная нами микроРНК-21 (Maillot, Lacroix-Triki et al. 2009).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что такой фактор как возраст пациентов может существенно увеличивать вариабельность значений экспрессии микроРНК. Образцы, полученные из опухоли гортани женщин также могут сильно выпадать из общей когорты по значениям экспрессии микроРНК. Это определяет необходимость учета половозрастной компоненты при планировании исследования и анализе экспериментальных данных, а также при подборе группы контроля с сопоставимым соотношением пациентов по этому критерию. В результате проведенного исследования из

дальнейшего анализа были исключены больные раком гортани с возрастом моложе 45 лет и женщины.

Для выявления общего профиля экспрессии микроРНК включенных в анализ выбрана группа мужчин в возрасте старше 45 лет, что составило абсолютное большинство от изначально анализируемой когорты (84%). Среди пациентов для некоторых микроРНК выявлен аберрантный уровень экспрессии в опухолевой ткани относительно прилежащей нормальной ткани. Установлена гиперэкспрессия микроРНК-21, -155 и -205 (р=0,00005, р=0,00008 и р=0,00085, соответственно) и гипоэкспрессия микроРНК-200а у пациентов мужского пола старше 45 лет с первичным диагнозом рака гортани (табл. 3).

Таблица 3 - Средний уровень экспрессии микроРНК в опухолевой относительно прилежащей нормальной ткани у пациентов

микроРНК N MeaniSE Р FDR, %

-18a 45 0,23±0,12 0,071 11,39

-21 46 0,98±0,22 0,00005 0,04

-155 46 0,76±0,18 0,00008 0,03

-200a 46 -0,85±0,24 0,0008 0,22

-200c 46 -0,11±0,18 0,569 65,05

-205 44 0,66±0,22 0,003 0,75

-221 43 -0,31±0,23 0,174 23,24

-494 43 -0,08±0,25 0,762 76,21

Примечание: Mean±SE - средний уровень экспрессии ± ошибка среднего; уровень значимости рассчитан по t-критерию Стьюдента (t-test for single means); значение нормы экспрессии соответствует 0

Наши результаты согласуются с данными литературы полученными на опухолях других локализаций, и для некоторых микроРНК по опухолям головы и шеи. Так, известно, что микроРНК-21, -155 и -205 играют в клетке онкогенную роль и повышение их экспрессии связано с регуляцией различных процессов задействованных в канцерогенезе. МикроРНК-200а является известным онкосупрессором, исходя из функций выполняемых ею в клетке, относительно этой микроРНК также отмечено снижение ее экспрессии по сравнению с нормальной тканью.

В литературе представлено значительное количество данных о гиперэкспрессии микроРНК-21 как в клеточных линиях опухолей головы и шеи, так и клинических образцах (Chen, Cabay et al. 2013). Наши результаты согласуются с данными, полученными Ren J, et al (2010) и Cao P. et al (2012). Ren J. et al (2010) в своей работе показали, что в образцах рака гортани наблюдается гиперэкспрессия микроРНК-21 в сравнении с нормальной тканью (п=39), причем повышение экспрессии этой микроРНК ассоциировано с низкой степенью дифференцировки ткани, стадиями ТЗ-4, а также со статусом метастазирования (Ren, Zhu et al. 2010). Исследовав методом ПЦР 48 парных образцов, полученных от пациентов с раком гортани, Cao P. et al (2013) выявили значимую гиперэкспрессию микроРНК-21, -93, -205 и -708, но не для микроРНК-155, которая также входила в их исследование (Cao, Zhou et al 2013).

В зависимости от локализации микроРНК-155 может играть двойственную роль в канцерогенезе. При опухолях головы и шеи представлены отдельные работы, в которых показана гиперэкспрессия микроРНК-155 в опухолевой ткани. Следует отметить, что большинство этих исследований были проведены без стратификации опухолей головы и шеи по отдельным локализациям (Chang, Jiang et al. 2008; Hui, Lenarduzzi et al. 2010' Chen, Jin et al. 2012).

Многочисленные исследования показали онкосупрессорную роль микроРНК-200 в канцерогенезе опухолей мочевого пузыря, молочной железы, а также ротовой и носовой полостей и др. (Feng, Wang et al. 2014).

Относительно регуляции экспрессии микроРНК-205 при опухолях головы и шеи в литературе также приведены весьма противоречивые данные. Одни авторы отмечают ее гиперэкспрессию (Tran, McLean et al. 2007; Fletcher, Heaford et al. 2008; Qu, Liang et al. 2012; Cao, Zhou et al. 2013), другие гипоэкспрессию (Childs, Fazzari et al. 2009; Zidar, Bo§tjan£i£ et al. 2011; Kim, Park et al. 2014), что авторы объясняют возможными влияниями выбора гистотипов опухоли, ее подтипов, микроокружения и регуляции генов-мишеней. Противоречивы данные относительно роли микроРНК-205 и при раке гортани. Cao P. et al (2012) выявили значимую гиперэкспрессию микроРНК-21, -93, -205 и -708 у пациентов с раком гортани (Cao, Zhou et al. 2013). Однако же Tian L. et al (2014) выявили онкосупрессорную роль микроРНК-205 при раке гортани in vitro (культура Нер-2 клеток) и in vivo (п=30), показав значимое понижение ее экспрессии в опухолевых клетках (Tian, Zhang et al. 2014).

Для оценки экспрессии микроРНК между подгруппами согласно стадии распространенности опухолевого процесса в виду малочисленности выборок нами были объединены пациенты с I и II стадиями, а также лица с III и IV стадиями. Сравнение этих подгрупп попарно не выявило значимых различий в уровне экспрессии анализируемых микроРНК (данные не представлены). Что также было выявлено и по результатам дискриминантного анализа (F (24,81) = 0,6882100 р=0,8492). Несмотря на значительный разброс значений между подгруппами выявлена положительная корреляция для микроРНК-21 со стадией опухоли (г=0,32, р=0,029), однако этот уровень значимости не удовлетворяет критерию FDR.

Не выявлено влияния лимфогенного метастазирования на результаты общего паттерна экспрессии анализируемых микроРНК в группе мужчин старше 45 лет (F (16,54) =0,9711054, р < 0,4995), что также показано и для каждой микроРНК в отдельности (данные не представлены). Хотя для микроРНК-200с выявлено значительное понижение уровня экспрессии у пациентов без метастазирования в сравнении с подгруппой лиц с 1 и более лимфогенных метастазов, однако с учетом поправки FDR это значение статистически не значимо.

В данной работе не выявлено ассоциации между аберрантной экспрессией анализируемых микроРНК и стадией распространенности опухолевого процесса

Для микроРНК-18а наблюдается тенденция к повышению уровня экспрессии от низкой к высокой степени дифференцировки ткани, что, однако, не является статистически значимым с учетом критерия FDR (данные не представлены). Отсутствие значимой разницы в уровне экспрессии анализируемых микроРНК в подгруппах мужчин старше 45 лет в зависимости от стадии дифференцировки опухолевой ткани также показано и дискриминантным анализом (F (16,52) =0 ,7395738, р< 0,7415).

Вероятно в силу малой информативности показателя, в литературе крайне мало уделяется внимания ассоциации аберрантной экспрессии микроРНК и степени дифференцировки опухолевой ткани. Из широкого спектра анализируемых микроРНК такая взаимосвязь выявлена, например, для микроРНК-21. Ren J. et al (2010) показали, что в образцах рака гортани повышение экспрессии этой микроРНК ассоциировано с низкой степенью дифференцировки ткани, стадиями Т3.4, а также со статусом метастазирования (Ren, Zhu et al. 2010).

Экспрессия микроРНК в зависимости от налнчия ДНК вируса папилломы человека в ткани пациентов с паком гортанн

По оценкам разных авторов, от 25% до 35% опухолей головы и шеи ассоциировано с ВПЧ-инфекцией (McKaig, Baric et al. 1998; Gillison, Koch et al. 2000; Киселев 2000).

Предполагают, что как одна из возможных причин в различиях клинических показателей ВПЧ-позитивных опухолей является воздействие вирусных генов на микроРНК хозяина (Lajer and Buchwald 2010), что было экспериментально показано, например, для кластера микроРНК-15/16, семейства микроРНК-17-92, микроРНК-21, -23Ь, -34а и кластера микроРНК-106b/93/25 (Zheng and Wang 2011). Однако данный вопрос крайне слабо освещен в литературе.

В данном исследовании инфицированность ВПЧ обследованных лиц с РГ в опухолевой ткани составила 14,5% (8/55), а в прилежащей нормальной ткани - 12,7% (7/55). В подавляющем большинстве вирус-позитивные случаи являлись моноинфекцией (89%). Стоит отметить, что у лиц с РГ спектр типов ВПЧ разнится в нормальном эпителии и в опухолевой ткани. Ведущим типом в вирус-позитивных образцах нормальной ткани являлся ВПЧ16 (66,6%), другие типы представлены значительно реже: ВПЧ31/33/45 по 16,6%. В опухолевой же ткани пациентов также доминировал ВПЧ16 (71,4%), а остальные встречались лишь в единичных случаях: ВПЧЗ1/45/51 по 14,2%. Интересно отметить, что парно позитивными оказались всего 4 случая, т.е. в них определялся ВПЧ одного и того же типа как в нормальной, так и в опухолевой ткани пациента. Причем 3 из 4 пар содержали ДНКВПЧ16.

Проведена оценка влияния папилломавирусной инфекции в опухолях гортани на уровень экспрессии микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221 и -494. Анализ совокупного значения уровня экспрессии восьми микроРНК не выявил разницы между подгруппой вирус-позитивных и вирус-негативных опухолей мужчин старше 45 лет (F (8,30) = 0,4905575, р < 0,8531), также как и при индивидуальном сравнении по каждой микроРНК.

Анализ общей выживаемости в группе больных раком гортани

Двухгодичная выживаемость больных была оценена на примере 36 (78%) прослеженных пациентов из группы мужчин старше 45 лет с диагнозом первичного рака гортани. Анализ показателей общей выживаемости в подгруппах лиц с повышенной (1п>1) и пониженной экспрессией (1п<1) анализируемых микроРНК была схожа и статистически не различалась (данные не представлены).

Сравнительная характеристика профиля экспрессии микроРНК в группах пациентов с предопухолевыми заболеваниями и раком гортани

Учитывая полученные предварительно результаты, для сравнительного анализа образцов пациентов выбраны оптимизированные группы: 1 - пациенты старше 40 лет с предопухолевыми изменениями гортани (п=25); 2 - больные мужского пола старше 45 лет со злокачественными новообразованиями гортани (п=46).

Показано значимое различие в паттерне экспрессии 8 микроРНК в группах пациентов с предопухолевыми и со злокачественными заболеваниями гортани (F (8,51) = 2,9204, р < 0,0078, рис. 3). Нами были рассчитаны показатели чувствительности и специфичности теста основанного на расчете экспрессии восьми микроРНК для двух подгрупп, показатели которых составили 67% и 85%, соответственно.

При обработке данных методом визуализации NovaSpark, выявлено, что 20-модель представления данных по совокупному значению экспрессии анализируемых микроРНК позволяет разделить сравниваемые нами подгруппы согласно этому показателю. Интересно отметить, что на графике крайние левые и правые кривые, область экспрессии которых не пересекается между подгруппами, принадлежат пациентам молодого и старшего возраста (средний возраст составил 48,4 года и 61,2 года, соответственно), а также они получены от лиц без диспластических изменений (4 из 5 случаев) и от пациентов с поздними стадиями распространенности опухолевого процесса Тз^ (6 из 6 случаев), соответственно.

А

Рисунок 3 - Графическое отображение данных по экспрессии анализируемых микроРНК в зависимости от диагноза. Примечание - А: по осям X и Y в виде ROOT-1 и Factorl, представлены результаты дискриминантного анализа в виде условных значений по экспрессии микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 в зависимости от диагноза пациентов. Точками указаны лица с предопухолевой патологией; квадратами -пациенты с РГ; Б: 20-модель представления данных по экспрессии микроРНК в зависимости от диагноза пациентов. Оранжевый и голубой цвета соответствуют образцам, полученным от пациентов с предопухолевой патологией и РГ, соответственно.

Основываясь на результатах по уровню экспрессии микроРНК при предопухолевых патологиях, которые были представлены выше, нами проведено сравнение уровня экспрессии отдельных микроРНК между тремя подгруппами - без дисплазии-Д1, ДН-П и TI-IV. Выявлено, что у пациентов с раком гортани значимо гиперэкспрессированы микроРНК -205, -155, -200с и -21 (15vs46, р=0,0002, р=0,008, р=0,009, р=0,013, соответственно) в сравнение с группой без диспластических изменений (табл. 4). Интересно отметить, что показатели экспрессии в подгруппах лиц с дисплазиями II-III и раком гортани были схожи и статистически не различались, что позволяет судить о близости этих подгрупп на молекулярном уровне.

Таблица 4 - Уровень экспрессии микроРНК в патологически измененной ткани у больных с предопухолевыми патологиями и раком гортани._____

Микро РНК Без дисплазии- Д1 ДИ-111 РГ Pi FDR, % р2 FDR, %

N MeaniSE N MeaniSE N MeaniSE

-18а 14 -0,07±0,13 10 -0,11±0,18 45 0,23±0,12 0,098 15,7 0,130 52,0

-21 15 -0,17±0,39 10 1,04±0,28 46 0,98±0,22 0,013 2,5 0,877 116,9

-155 15 -0,27±0,33 10 0,74±0,35 46 0,76±0,18 0,008 3,1 0,956 95,6

-200а 13 -0,99±0,50 9 -0,63±0,58 46 -0,85±0,24 0,798 79,8 0,727 116,3

-200с 15 -1,15±0,34 10 0,24±0,44 46 -0,11±0,18 0,009 2,5 0,476 95,2

-205 15 -1,20±0,43 10 -0,02±0,32 44 0,66±0,22 0,0002 0,2 0,084 66,9

-221 15 -0,98±0,66 10 -1,22±0,79 43 -0,31±0,23 0,341 39,0 0,279 74,4

-494 15 -0,89±0,63 10 -0,01±0,45 43 -0,08±0,25 0,233 31,1 0,903 103,2

Примечание: N - объем выборки в подгруппе; Меап±5Е - средний уровень экспрессии ± ошибка среднего; уровень значимости рассчитан по ^критерию Уэлша; р1 - «без дисплазии-Д1» уэ «РГ», р2 - «Д11-Ш» ув «РГ»; значение нормы экспрессии соответствует 0

Установлено, что в группе пациентов с раком гортани, в сравнении с группой лиц с диспластическими изменениями, количество случаев с гиперэкспрессией микроРНК-205 (1п>0) в 2,98 раз выше, чем с гипоэкспрессией. Это свидетельствует о том, что риск прогрессии заболевания повышается при повышении экспрессии микроРНК-205 (OR=4,79, CI 95%, 1,41-16,26, р=0,007). Также показано, что частота случаев с повышенным уровнем экспрессии микроРНК-155 в 2 и более раза в патологически измененной ткани наблюдается значимо чаще у пациентов с раком гортани, чем у лиц без диспластических изменений, а риск развития заболевания возрастает (OR=6,82, CI 95%, (1,68-27,66), р=0,004). Наиболее примечательно, что данные показатели формируются не только за счет поздних стадий рака. Так, даже при сравнении подгрупп лиц без дисплазии против Ti-2, частота случаев с повышенным в 2 и более раза уровнем экспрессии микроРНК-155 по-прежнему превалирует у пациентов с ЗНО, а риск прогрессии заболевания увеличивается (OR=5,33, CI 95%, (1,15-24,68), р=0,028).

Таким образом, полученные нами результаты показали, что уровень экспрессии микроРНК-21, -155, а также -205 постепенно повышается по мере малигнизации процесса в ряду образцов «отсутствие дисплазии—»дисплазия II—»дисплазия III степени—«рак гортани». Это свидетельствует об участии этих микроРНК в регуляции процессов, задействованных в канцерогенезе опухолей гортани, а положительные результаты при учете частоты встречаемости случаев с гиперэкспрессией микроРНК-155 и 205 позволяет судить о предполагаемой ценности этих показателей для определения риска развития злокачественных опухолей у пациентов с предопухолевыми патологиями гортани.

Полученные данные согласуются с данными представленными в мировой литературе относительно микроРНК-21, -155 и -205, которые играют важные функциональные роли в развитии злокачественной патологии других локализаций. Показано, что микроРНК-21 принимает участие во многих ключевых процессах, которые позволяют нормальной клетке переродиться в опухолевую — это и регуляция клеточного цикла, апоптоза, клеточного роста и инвазии, пролиферации и ангиогенеза (Krichevsky A.M. 2009; Krutovskikh and Herceg 2010). МикроРНК-155 в свою очередь может активировать клеточную пролиферацию, ингибировать апоптоз и ускорять рост опухоли (Chen, Cabay et al. 2013). Относительно же микроРНК-205 в литературе представлены противоречивые результаты: показана ее онкогенная роль, при регуляции генов принимающих участие в pl4ARF пути (Childs, Fazzari et al. 2009), онкогена PTEN, что приводит к активации PDK/Akt-сигнального пути (Qu, Liang et al. 2012), a также регуляции клеточной

пролиферации, метастазирования и ангиогенеза (Xie, Zhao et al. 2012) и онкосупрессорная роль путем подавления пролиферации при ЗНО (репрессируя гены ЕгЬВЗ, E2F1 и гены МАРК- и AR-сигнальных путей), а также препятствуя процессу эпителиально-мезенхимального перехода и подавляя инвазию (через репрессию генов РКСе, ZEB1/2, ММР2 и ММР9, VEGF-Â) (Qin, Ren et al. 2013). Эти данные позволяют судить о сложной функциональной роли микроРНК-205, которая может зависеть от гистотипов опухоли, ее подтипов и микроокружения (Tian, Zhang et al. 2014), a также этапа канцерогенеза и регулируемых ею генов-мишеней.

Коэкспрессия микроРНК у больных паком гоптаии

Результаты корреляционного анализа 46 образцов мужчин старше 45 лет с первичным раком гортани свидетельствуют о том, что между некоторыми микроРНК существует взаимосвязь. Положительная корреляция отмечена для онкогенных микроРНК -21 и -155 (г=0,31, р=0,00001); микроРНК-200с и -18а(г=0,38, р=0,001), 200с и -205 (г=0,34, р=0,025) , -200а и -221 (г=0,35, р=0,021) (рис. 4), а также наблюдается тенденция положительной корреляции между микроРНК-21 и -200с (г=0,31, р=0,036), однако значение р не удовлетворяет 5% поправке FDR.

Рисунок 4 — Корреляционные связи между показателями относительного уровня экспрессии изучаемых микроРНК в опухолевой ткани больных РГ.

Коэкспрессия микроРНК у больных с предопухолевымн патологиями гортани

Для гетерогенной группы пациентов с предопухолевымн изменениями ткани гортани также выявлена сложная сеть положительной корреляционной связи между микроРНК, а именно: микроРНК-21 и -155, -494 (г=0,60, р=0,001; г=0,42, р=0,036, соответственно), микроРНК-155 и -494 (г=0,55, р=0,005), микроРНК-200с и -205, -494 (г=0,60, р=0,001; г=0,55, р=0,005), микроРНК-494 и -205 (r=0,51, р=0,009), а также микроРНК-200с и -494 (г=0,40, р=0,046, однако значение р не удовлетворяет поправке FDR) (рис. 5).

Полученные результаты говорят о наличии связи между некоторыми микроРНК, которая может быть основана на участии их в процессах внутриклеточной регуляции генов.

Анализ корреляционных взаимосвязей в группе пациентов с предопухолевымн патологиями выявил как схожие, так и отличные схемы взаимодействия между анализируемыми микроРНК в сравнении с группой больных раком гортани. Так, выявлено, что в обеих группах отслеживается корреляция между онкогенными микроРНК-21 и -155, для которых было показано повышение уровня экспрессии по мере утяжеления диагноза и гиперэкспрессия при РГ. Показана положительная корреляционная взаимосвязь в обеих группах между микроРНК-200с и -205, для которых также прослеживается тенденция к повышению экспрессии от 0 к тяжелой степени дисплазии у пациентов с предопухолевымн патологиями и от Т1-2 к Тз-i у больных раком гортани. Учитывая вовлеченность этих

микроРНК в регуляцию многих генов, задействованных в канцерогенезе, что было описано выше, полученный результат позволяет судить о важной роли этих микроРНК в трансформации клеток, аберрантная экспрессия которых фиксируется уже на ранних этапах малигнизации.

Рисунок 5 - Схема коэкспрессии микроРНК в ткани больных с предопухолевыми изменениями гортани.

Определение профилей микроРНК в слюне пациентов

Благодаря значительному количеству исследований посвященных слюнной диагностике в настоящее время в литературе даже вошел в обиход термин «salivaomics» (Yan, Yu et al. 2008). Однако же в мировой литературе исследований посвященных проблеме канцерогенеза и предсказательной ценности использования слюнных микроРНК при злокачественных опухолях крайне ограничено.

Для оценки возможности использования для диагностики биоматериала полученного неинвазивным путем было проанализировано 23 образца слюны полученной от пациентов с патологиями гортани. При использовании выбранных нами методик по выделению РНК и количественному анализу 8 микроРНК обнаружено, что при использовании этого типа биоматериала результат стабильно фиксируется для всех микроРНК, кроме микроРНК-494, для которой уровень определялся только в 33% случаев, в связи с чем, для проведения анализа в слюне были выбраны только микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221. Авторы, работающие в данной области исследований отмечают, что, несмотря на широкий спектр микроРНК представленных в слюне, их профиль все же ограничен в сравнение с профилем микроРНК экспрессирующихся в ткани (Bahn, Zhang et al. 2015).

В силу малочисленности подгрупп не представилось возможности проанализировать влияние половозрастной компоненты на уровень микроРНК в слюне, однако проведена оценка влияния стадии распространенности опухолевого процесса. Дискриминантный анализ уровня семи микроРНК не показал различий в зависимости от стадии распространенности опухолевого процесса (F (21,9) = 0,939, р<0,5736). Не выявлено значимых различий в уровне отдельных микроРНК между подгруппами пациентов с Т 1.2 и Тз-4 стадиями (данные не представлены), однако для микроРНК-200а наблюдается тенденция к понижению ее уровня во второй группе (7vs8, р=0,033), хотя значение не удовлетворяет 5% поправке FDR.

Дискриминантный анализ уровня 7 микроРНК не выявил значимых различий между подгруппами пациентов с лимфогенным метастазированием и без. Однако применение подхода пошаговой дискриминации позволило определить три микроРНК, которые играют существенную роль в формировании специфичной картины уровня микроРНК для каждой

из анализируемых подгрупп. Таким образом, дискриминантный анализ по микроРНК-21, -18а и -205 показал значимую разницу в их уровне между подгруппами лиц без метастазов против подгруппы с лимфогенным метастазированием (Р (3,10) = 6,01, р < 0,0131, рис. 6а). Получены весьма обнадеживающие показатели чувствительности и специфичности данного подхода, показатели которых составили 100% и 80%, соответственно.

При обработке данных методом визуализации №>уа8рагк, также выявлено, что на 20-модели представления данных по совокупному значению уровня микроРНК-21, -18а и -205 образцы полученные от пациентов с метастазами и без располагаются в двух непересекающихся областях, что позволяет однозначно разделить сравниваемые нами подгруппы (рис. 66). Полученные нами результаты позволяют судить о перспективности использования подобных подходов (дискриминантный анализ и визуализация данных в программе №>уа8рагк) для уточнения диагноза, однако стоит отметить, что данные получены на небольшой выборке и требуют уточнения и верификации.

Для микроРНК-21 также выявлено значимое повышение уровня в образцах полученных из слюны пациентов с метастазами в сравнении с подгруппой лиц без регионарного метастазирования (12уз4, р=0,001). А

Рисунок 6 - Графическое отображение данных по уровню анализируемых микроРНК в слюне в зависимости от лимфогенного метастазирования. Примечание - А: по осям X и Y в виде ROOT-1 и Factorl, представлены результаты дискриминантного анализа в виде условных значений по уровню микроРНК-18а, -21, -205 в зависимости от лимфогенного метастазирования. Точками и квадратами обозначены пациенты без метастазов и с лимфогенными метастазами, соответственно; Б: 20-модель представления данных по уровню микроРНК в зависимости от лимфогенного метастазирования. Оранжевый и голубой цвета соответствуют образцам, полученным от пациентов без метастазов и с лимфогенными метастазами, соответственно.

Проведен сравнительный анализ изменения уровня микроРНК в группе лиц с предопухолевой патологией и раком гортани. Дискриминантный анализ данных по уровню 7 микроРНК позволил выявить значимое различие в показателях между пациентами с

предраковыми изменениями и раком гортани (Р (21,29) = 5,55, р < 0,0033, рис. 7а). Примем рассчитанные показатели чувствительности и специфичности этого теста составили 71% и 93%, соответственно. Визуализация результатов в программе ЫоуаЗрагк, показала, что на 20-модели представления данных по совокупному значению уровня анализируемых микроРНК, образцы, полученные от пациентов с предопухолевой патологией и раком гортани имеют тенденцию к группировке согласно верифицированным диагнозам (рис. 76).

А

Без дисплазии -Д Ш Pax гортани

Рисунок 7 - Уровень 7 микроРНК в слюне в зависимости от диагноза. Примечание - А: по осям X и Y в виде ROOT-1 и Factor-1, представлены результаты дискриминантного анализа в виде условных значений по уровню микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205 и -221, в зависимости от диагноза. Б: 20-модель представления данных по уровню микроРНК в зависимости от диагноза. Оранжевый и голубой цвета соответствуют образцам, полученным от пациентов без дисплазий-ДШ и раком гортани, соответственно.

Показано достоверное различие в уровне некоторых отдельных микроРНК в слюне пациентов в зависимости от диагноза. Так, у пациентов с предраковой патологией в слюне обнаружен повышенный уровень микроРНК-21 и -200с в сравнении с группой пациентов с диагнозом рака гортани (7vsl6, р=0,011, 7vsl6, р=0,0061, соответственно, данные не представлены). Более того, при сравнении подгрупп лиц с дисплазией II-III степени и пациентов с 1-П-стадиями рака статистическая значимость значений уровня сохраняется, что говорит в пользу возможности использования этого параметра в слюне для уточнения диагноза в дополнение к основным диагностическим методам. К сожалению, в литературе данных по изменению уровня микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221 в слюне не представлено. Однако N.J. Park et al (2009) в своей работе приводят результаты о специфичности паттерна микроРНК-31, -200а и -125а в слюне, собранной от пациентов с диагнозом рака ротовой полости в сравнении с аналогичным показателям у здоровых доноров (Park, Zhou et al. 2009). Yang et al. (2013) на группе пациентов с прогрессирующей и непрогрессирующей лейкоплакиями выявили специфичный паттерн микроРНК для каждой из подгрупп (Yang, Li et al. 2013). Также авторы провели параллель между тканью и слюной, отметив, что паттерн микроРНК перекликается в обоих типах биоматериала,

позволяя при работе со слюной выявлять подгруппу пациентов с низким уровнем прогрессии патологии уже на ранних стадиях малигнизации.

Полученные результаты по определению уровня микроРНК в слюне пациентов с предопухолевой патологией и раком гортани свидетельствуют, что этот биоматериал подходит для данной процедуры и показывает стабильный, воспроизводимый результат для подавляющего большинства проанализированных микроРНК (всех кроме микроРНК-494). Данные дискриминантного анализа по определению уровня микроРНК-21, -18а и -205 о возможности разделения подгрупп лиц по статусу регионального метастазирования позволяют предположить, что слюна может быть использована для уточнения диагноза при злокачественной патологии. В то время как наличие значимой разницы в уровне микроРНК-18а, -21 и -200с между подгруппами лиц с ДП-Ш и больных РГ Ti-2 свидетельствует о том, что слюна, биоматериал полученный неинвазивным путем, может быть использована для уточнения диагноза при предопухолевых состояниях гортани. Однако эти пилотные данные требуют уточнения на более крупной и унифицированной по клинико-патологическим параметрам выборке и выявления показателей чувствительности и специфичности подхода. Выводы:

1. В патологически измененной ткани больных с предопухолевыми патологиями гортани относительно прилежащей нормальной ткани показано снижение экспрессии микроРНК -200а, -205 и -221 (р<0,05, 5<FDR<20%). Выявлено повышение экспрессии микроРНК-21, -155, -200с и -205 у пациентов с дисплазией II-III степени по сравнению с пациентами без дисплазии (р<0,05, 5<FDR<20%).

2. Онкогенные микроРНК-21, -155, 205 статистически значимо (р<0,05, FDR<5%) гиперэкспрессированы, а онкосупрессорная микроРНК-200а гипоэкспрессирована в опухоли гортани относительно прилежащей нормальной ткани.

3. Установлено отсутствие ассоциации между аберрантной экспрессией анализируемых микроРНК и стадией опухолевого процесса, лимфогенным метастазированием, степенью дифференцировки опухолевой ткани, двухгодичной выживаемостью. Возраст и пол пациентов существенно увеличивают вариабельность значений экспрессии микроРНК.

4. Уровень экспрессии онкогенных микроРНК-21, -155 и -205 повышается в патологически измененной ткани в ряду от образцов без дисплазии до рака гортани, что свидетельствует о значимости этих микроРНК для процесса злокачественной трансформации эпителия гортани. Статистически значимо частота случаев с гиперэкспрессией микроРНК-205 и -155 выше при раке гортани, чем при предопухолевых патологиях. Определение паттерна экспрессии восьми анализируемых микроРНК позволяет дискриминировать образцы с предопухолевой патологией и раком гортани с чувствительностью 67% и специфичностью 85% (р=0,0078).

5. Аберрантная экспрессия микроРНК-21 в ткани статистически значимо повышена в группе лиц с вирус-позитивными предопухолевыми патологиями по сравнению с вирус-негативными пациентами. У больных раком гортани не установлено ассоциации ВПЧ инфекции с уровнем экспрессии микроРНК.

6. Уровень микроРНК-18а, -21 и -200с в слюне статистически значимо (р<0,05, FDR<5%) снижен у больных раком гортани ранних стадий по сравнению с пациентами с дисплазиями II-III степени. Паттерн микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205 и -221 в слюне позволяет дискриминировать пациентов с предопухолевыми патологиями от больных раком гортани с чувствительностью 71% и специфичностью 93%.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е. Методы выделения полной фракции РНК из эпителиальной ткани. // Материалы VI региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы

экспериментальной и клинической онкологии». - Томск, 2011. - Сибирский онкологический журнал, Приложение 1 - С.86-87.

2 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е., Мухамедов М.Р., Уразова Л.Н. Профиль экспрессии MicroRNA в ткани больных новообразованиями области головы и шеи.// Сборник научных трудов «Актуальные вопросы клинической онкологии». - Санкт-Петербург, 2011. - С. 207209.

3 Никитина Е.Г.. Уразова Л.Н., Кульбакин Д.Е., Мерзлякова M.K. MiRNA-363 в ВПЧ-позитивных и ВПЧ-негативных опухолях области головы и шеи.// Материалы пятнадцатого онкологического конгресса. - Москва, 2011. - С. 132-133.

4 Nikitina E.G.. Urazova L.N, Stegny V.N. MicroRNAs and human cancer.// Experimental oncology. -2012. - VoI.34(l). - P.2-8 (IF-0,657)

5 Никитина Е.Г.. Уразова Л.Н., Кульбакин Д.Е. Черемисина O.B. MiRNA-200a у больных опухолями головы и шеи.// Вопросы онкологии. - 2012 - Приложение 3. С. 104105.

6 Никитина Е.Г.. Уразова Л.Н., Кульбакин Д.Е., Черемисина О.В., Бычков В.А., Мерзлякова М.А. Профиль экспрессии miRNA-200a в ткани и сыворотке больных опухолями гортани.// Седьмой съезд онкологов и радиологов стран СНГ / Казахский НИИ онкологии и радиологии. - Астана, 2012. — С. 101.

7 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е., Бычков В.А., Мерзлякова М.К. Сравнительный анализ экспрессии микроРНК в эпителиальной ткани и сыворотке больных злокачественными заболеваниями головы и шеи.// Материалы VIII региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». -Томск, 2013. - Сибирский онкологический журнал, Приложение 1 - С.68-69.

8 Никитина Е.Г.. Мерзлякова М.К., Бычков В.А., Кульбакин Д.Е., Черемисина О.В., Уразова Л.Н. Применение метода ПЦР в режиме реального времени для выявления частоты встречаемости ВПЧ высокого онкогенного риска среди больных// Вопросы онкологии. -2013. - Приложение 3. - С. 498-499.

9 Никитина Е.Г.. Мерзлякова М.К., Бычков В.А., Кульбакин Д.Е., Черемисина О.В., Уразова Л.Н. Оптимизация подхода к выявлению вируса папилломы человека в ткани больных плоскоклеточными карциномами гортани.//Сборник материалов Всероссийской научной школы-конференции для молодых ученых РАМН по онкологии «Современная онкология: достижения и перспективы». - Новосибирск, 2013. — С. 15-16.

10 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е., Уразова Л.Н., Черемисина О.В. МикроРНК при опухолях головы и шеи различного генеза.// Вопросы онкологии. - 2014. - Приложение 3. -С. 408-409.

11 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е., Уразова Л.Н., Черемисина О.В. МикроРНК в эпителиальной ткани лиц с предопухолевыми заболеваниями и карциномой гортани.// Сибирский онкологический журнал. - 2014.-Приложение 1. -С.93-94.

12 Ннкнтнна Е.Г.. Уразова Л.Н., Черемисина О.В., Кульбакин Д.Е., Стегний В.Н. Вариабельность и уровень экспрессии микроРНК в ткани опухолей головы и шеи Л Сибирский онкологический журнал. -2014. -№3. - С. 28-33 (IF-0,69)

13 Бычков В.А., Уразова Л.Н., Никитина Е.Г.. Черемисина О.В., Чижевская С.Ю. Папилломавируспая инфекция и прогрессия опухолей головы и шеи.// Иифекцни и иммунитет. - 2014. - Т4, №2. - С.162-167 (IF-0,245).

14 Nikitina Е.. Bychkov V., Kulbakin D., Urazova L., Cheremisina O., Choinzonov E. Noninvasive approach based on microrna analysis in larynx cancer diagnostics. // A Century of progress in head & neck cancer: 5 th world Congress of IFHNOS & annual meeting of the AHNS. -New-York, USA, 2014 (http://ahns.jnabstracts.com/Detail.aspx?ID=57233).

15 Bychkov V., Nikitina E.. Kulbakin D., Urazova L., Cheremisina O., Choinzonov E. Prevalence and type distribution of high risk HPV both in normal and malignant tissues of head

and neck cancer patients. // A Century of progress in head & neck cancer: 5 th world Congress of IFHNOS & annual meeting of the AHNS. - New-York, USA, 2014 (http://ahns.jnabstracts.com/Detail.aspx?lD=57237).

16 Никитина Е.Г. Перспективы использования малоинвазивных подходов в диагностике рака гортани. // Евразийский онкологический журнал. -2014. -№ 3 - С. 1015-1016.

17 Никитина Е.Г.. Черемисина О.В., Уразова JI. Н. МикроРНК в канцерогенезе опухолей гортани.// Злокачественные опухоли. - 2014. - № 3(10). - С. 210.

18 Никитина Е.Г.. Черемисина О. В., Кульбакин Д. Е., Литвяков Н.В. Аберрантная экспрессия микроРНК при раке гортани. // Материалы конференции «VII съезд Российского общества медицинских генетиков». - 2015. - С. 52-53.

19 Ннкнтина Е.Г.. Черемисина О.В., Бычков В.А., Кульбакин Д.Е., Чойнзонов Е.Л., Стегнии В.Н., Литвяков Н.В. Экспрессия микроРНК в опухолевой ткани у больных раком гортани.// Сибирский онкологический журнал. - 2015. - №2. - С. 46-52 (IF-0,69).

20 Никитина Е.Г.. Кульбакин Д.Е. микроРНК в эпителиальной ткани лиц с предопухолевыми заболеваниями и карциномой гортани.// Сибирский онкологический журнал. - 2015. - Приложение 1. - С. 65 (http://oncology.tomsk.ru/nii/jounial/2015/prill/files/s0jj3ril_l_2015_65.pdf).

Результаты интеллектуальной деятельности:

Получено свидетельство о государственной регистрации базы данных №20156220688 от 28 апреля 2015 г. Никитина Е.Г., Бычков В.А., Черемисина О. В., Кульбакин Д. Е., Чижевская С.Ю., Ибрагимова М.К., Уразова Л.Н., Литвяков Н.В., Чойнзонов Е.Л. «База данных учета клинико-патологических, вирусологических и молекулярных параметров предопухолевых и опухолевых патологий гортани». Благодарности:

Автор выражает благодарность заведующей отделением эндоскопии Томского НИИ онкологии профессору Черемисиной О.В., заведующему отделением опухолей головы и шеи академику РАН Чойнзонову Е.Л., научному сотруднику отделения опухолей головы и шеи к.м.н. Кульбакину Д.Е., заведующему лаборатории молекулярной онкологии НИИ онкологии им. H.H. Петрова, г. Санкт-Петербург, профессору Имянитову E.H. и сотрудникам лаборатории, ведущему научному сотруднику лаборатории молекулярно-генетических систем Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, д. б. н. Ефимову В.М. Грантовая поддержка:

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке по проекту Министерства образования и науки Российской Федерации - Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (Соглашение 14.578.21.0031, уникальный идентификатор RFMEF 157814X0031).

Издание подготовлено в авторской редакции Отпечатано на участке цифровой печати Издательского Дома Томского государственного университета Заказ № 2807 от «10» октября 2015 г. Тираж 100 г. Томск Московский тр.8 тел. 53-15-28