Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологический и иммуногистохимический анализ лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки: дифференциальная диагностика и прогноз

На правах рукописи

Авдалян Ашот Меружанович

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕЙОМИОМЫ И ЛЕЙОМИОСАРКОМЫ ТЕЛА МАТКИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗ

14.03.02 — патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» МЗ РФ и Алтайском филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» РАМН (Барнаул)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Лазарев Александр Федорович

доктор медицинских наук,

профессор Климачев Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских нгук, Лапий Галина Анатольевна профессор заведующая лабораторией ФГБУ «НИИ региональ-

ной патологии и пэтоморфологии» СО РАМН

доктор медицинских наук Кливер Евгений Эдуардович

ведущий научный сотрудник ФГБУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина» МЗ РФ

доктор медицинских наук, Пекарев Олег Григорьевич профессор профессор кафедры ГБОУ ВПО «Новосибирского

государственного медицинского университета» МЗ РФ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_»_2013 г. в 10.00

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и пэтоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « _ » __ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 доктор биологических наук, профессор

ЦИЬ.-.'^'11-^

013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гладкомышечные доброкачественные и злокачественные опухоли тела матки с точки зрения эпидемиологии и распространенности являются гетерогенной группой опухолей. Встречаемость лейомиомы (ЯМ), по данным исследований различных авторов, колеблется от 20 до 70% (Вихляева Е.М., 2004; Viville В., 1997), а частота заболеваемости достигает 47,3 на 1000 обследованных. Следует отметить, что хотя JIM - опухоль не злокачественная, она быстро растет и практически в 75% завершается гистерэктомией (Сидорова И.С. 2009; Stewart Е.А. 2001), а результаты лечения гонадотропными рилизинг факторами и эмболизация маточных артерий далеки от желаемых (Robboy J. et al, 2000; Shime H. et al., 2002). В то же время частота встречаемости лейо-миосаркомы (ЛМС) на фоне JTM матки, по данным различных авторов, колеблется от 0,3 до 1,8% (Козаченко В.П., 2005; Boquist L.L. et al., 1992; Vilos GA. et al., 2008).

На всех этапах морфологического исследования JIM возникает большое количество нерешенных вопросов: речь идет прежде всего о пато-морфологических характеристиках опухоли, а при миомэктомии - дальнейшем выборе лечения на основании патоморфологического заключения (Вихляева Е.М. 2004; Коган Е.А. и др., 2005; Politi К. et al., 2004; Chen L. et al., 2008). Всесторонняя морфофункциональная характеристика JIM закономерно приведет к выбору более рациональных способов лечения и углубит понимание морфогенетических процессов малигнизации (Esposito N.N. et al., 2006).

До настоящего времени в клинической патологии обсуждаются вопросы молекулярно-биологических характеристик клеток (продукция белков экстрацеллюлярного матрикса, особенности метаболизма, количество рибосомальных белков (AgNOR), ангиогенез, пролиферативная активность (ПА), состояние системы апоптоза и рецепторного статуса клеток JIM) в разграничении опухолей различного гистологического строения, особенно так называемых митотически активных и опухолей с неясным злокачественным потенциалом (STUMP), что требует углубленного многопланового исследования (Леваков С.А. и др., 2001; Зайратьянц О.В. и др., 2005; Robboy S.J., 1990; Bell S.W. et al., 1994; Gokaslan H. et al., 2005; Rammeh-Rommani S. at. al., 2005; Chang S.O. et al., 2009). Проблемы дифференциальной диагностики и прогнозирования злокачественных и доброкачественных ГМО тела матки в настоящее время привели к широкомасштабным исследованиям патоморфологических и иммуногистохимических характеристик неоплазий этого типа (Robboy S.J. et al., 1990; Bell S.W. et al., 1994; Dreinhofer K.E. et al., 1994; Layfield L.J. et al., 2000).

Злокачественные новообразования мягких тканей остаются одним из самых сложных разделов онкологии как в диагностике, так и прогнозиро-

вании течения заболевания (Франк Г.А., 2004). JIMC составляет 1 - 1,3% злокачественных новообразований матки (Giuntoli R.L., 2003) и 25-60% сарком матки (Лазарева Н.И., 2005; Robboy S.J., 2000; Harry V.N., 2007). ЛМС тела матки считается относительно высокозлокачественной опухолью с колебанием 5-летней выживаемости от 18,8% до 65% (Bodner К. et al., 2003; Livi L., 2003; Wu T.I. et al., 2005). Изучению критериев прогноза при этой локализации посвящено небольшое число работ (Гагуа И.Р. и др., 2007). Ряд авторов считает, что данная опухоль практически нечувствительна к химио- и лучевой терапии (Dinh Т.А. et al., 2004; Giuntoli R.L. et al., 2003; Giuntoli R.L., 2004; Ghaemmaghami F., 2008), и причины остаются неизвестными.

Улучшение результатов лечения зависит как от ранней диагностики, так и от уточнения критериев прогноза. Продолжается поиск уточняющих критериев, основанных в основном на морфологических параметрах ЛМС (Tsushima К. et al., 1988; Kuratsu S. et al., 1995; Wu T.I. et al., 2005). Следует отметить, что, с точки зрения гистологических вариантов опухоли, ЛМС являются гетерогенной группой (Silva E.G. et al., 2005; Vigone A. et al., 2005). В то же время вариант ЛМС с большим количеством многоядерных клеток не выделен в отдельную группу и не рассмотрены патоморфологи-чески особенности такой опухоли. Многие авторы подчеркивают прогностическую значимость целого ряда морфологических характеристик, но не уточняют их клиническое значение. В связи с этим в последнее время появились попытки создания многофакторных систем прогноза злокачественных неоплазий, учитывающих ряд факторов, не предусмотренных в классификации по системе TNM и FIGO, а наиболее перспективной представляется разработка комбинированных моделей на основе алгоритмов с использованием клинических и патоморфологических и биомолекулярных маркеров (Юрин А.Г., 2009; Kim H.L. et al., 2004; Coindre J. et al., 2001; Giuntoli R.L. et al., 2003; Dinh T.A. et al., 2004).

К малоизученным вопросам влияния морфофункциональных характеристик опухолевых клеток на выживаемость больных ЛМС до настоящего времени можно отнести: степень развитости экстрацеллюлярного матрикса, морфофункциональную активность рибосомальных белков, ан-гиогенез, ПА, активность гиразных ферментов, влияющих на способность разрушения спутываний ДНК, состояние системы апоптоза и рецепторного статуса опухоли и степень васкуляризации перитуморозной ткани (Гагуа И.Р., 2007; Nordal R.R. ct al., 1995; Chen L. et al., 2008).

Таким образом, представляется важным исследовать патоморфо-логические параметры клеток гладкомышечных опухолей тела матки в сопоставлении с неизмененным миометрием с оценкой их взаимосвязи с клиническими параметрами и прогрессии неопластичсского процесса.

Цель исследования: изучить клинико-морфологические и биохимические параметры лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки и их значение в дифференциальной диагностике и индивидуальном прогнозе.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимосвязь биомолекулярных характеристик неизмененного миометрия, лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки с возрастом, репродуктивной функцией, размером опухоли, локализацией, количеством образований и стадией процесса.

2. Выделить основные критерии дифференциальной диагностики в балльной системе оценки на основании комплекса значимых клинико-морфологических параметров лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки.

3. Выявить гистологические типы лейомиомы тела матки с биомолекулярными изменениями, близкими по характеристикам к лейомиосаркоме для формирования особых групп клинического наблюдения и лечения больных лейомиомой тела матки.

4. Определить значимые биомолекулярные факторы риска в развитии рецидивирования и метастазирования лейомиосаркомы после радикальных операций.

5. Выделить клинико-морфологические, гистохимические, морфоденси-тометрические и иммуногистохимические особенности гистологического варианта лейомиосаркомы с большим количеством многоядерных клеток.

6. Определить роль клинических, клинико-морфологических, мор-фоденситометрических, гистохимических и иммуногистохимических показателей экспрессии ключевых маркеров клеточного цикла и апоптоза, ангиогенеза, продукции внеклеточного матрикса с разграничением факторов благоприятного и неблагоприятного прогноза в оценке 10-летней общей выживаемости больных лейомиосаркомой тела матки.

7. Провести многофакторный анализ наиболее важных критериев прогноза по данным 10-летней выживаемости с использованием изученного комплекса клинико-морфологических и молекулярно-биологических параметров с разработкой модели построения индивидуального прогноза больных лейомиосаркомой тела матки.

Научная новизна. Впервые на большом клиническом материале выявлены и систематизированы взаимосвязи патоморфологических параметров гладкомышечных клеток с рядом клинических характеристик: возрастом, репродуктивной функцией, количеством опухолевых узлов в теле матки, локализацией образований, размером узлов JIM и стадией заболевания JTMC тела матки по критериям FIGO. Установлены закономерности изменений пролиферативной активности, количества AgNOR, метаболизма, ангиогенеза, шаперонной транслокации, состояния системы апоптоза, рецепторного статуса, гиразного пути предупреждения спутывания двунитчатой ДНК во время репликации, рекомбинации и транскрипции, экстрацеллюлярного матрикса и морфоденситометрических параметрах гладкомышечных клеток в HM, JIM и ЛМС тела матки.

Связь клинико-морфологических характеристик опухоли и биомолекулярных параметров клетки позволила разработать алгоритм дифференциальной диагностики гладкомышечных образований тела матки.

При алгоритмическом решении вопроса дифференциальной диагностики определены морфологические типы ЛМ с критическими нарушениями процессов роста и дифференцировки клеток для рационального планирования лечения больных доброкачественными гладкомышечными опухолями тела матки. Установлено, что в комплекс алгоритма необходимо включение митотического индекса, анализа ядрышкового аппарата с выявлением количества AgNOR, метаболической активности и профиля гладкомышечной клетки, экспрессии Ki-67 и BrdU-метки, исследование активности р53 и Topoisomerase IIa, а критический конкордантный рост этих показателей служит критерием установления лейомиосаркомы в сложных случаях дифференциальной диагностики.

Впервые определены значимые факторы риска развития рецидива и метастазирования ЛМС на основе комплекса клинических и биомолекулярных критериев: стадия процесса, массивный одиночный узел, занимающий более I гисто-анатомической области тела матки. Морфофунк-циональными факторами риска в развитии рецидива и метастазирования являются высокая активность ЩФ эндотелия сосудов опухоли, высокая плотность сосудов микроциркуляции опухоли и перитуморозной зоны, высокие показатели гаюидности ядер опухоли, большое количество и кариоплазматическая реаранжировка AgNOR ядер клеток опухоли, высокая пролиферативная активность с гиперэкспрессией Ki-67 и BrdU-метки, высокая активность р53, высокая экспрессия Topo IIa, негативный про-гесгероновый рецепторный статус образования.

На основании патоморфологических и молекулярно-биологических характеристик гистологических типов JIMC тела матки и особенностях 10-летней выживаемости выделен особый тип саркомы с большим количеством многоядерных клеток. Установлено, что такой тип опухоли обладает значимо высокой пролиферативной активностью, нарушением процессов активации/супрессии апоптоза, реаранжировкой AgNORs, высокой метаболической активностью и инверсией метаболического профиля и неблагоприятным прогнозом.

Впервые на обширном материале оценена прогностическая значимость степени злокачественности сарком мягких тканей по системе критериев FNCLCC на основании 10-летней выживаемости больных лейомиосарко-мой тела матки в сопоставлении с неизученными до настоящего момента молекулярно-биологическими параметрами: аргирофильными белками области ядрышковых организаторов, рецепторным статусом опухоли, активностью Topoisomerase IIa и шаперона HSP70 (с определением ну-клеолярной транслокации белка).

Впервые на основании морфологического метода исследования определена роль ангиогенеза перитуморозной зоны миометрия в выживаемости больных ЛМС тела матки. Показано, что на неблагоприятный исход в большей степени влияет высокая плотность сосудов перитуморозной зоны, чем плотность микроциркуляции непосредственно опухоли.

На основе многофакторного регрессионного анализа по Коксу сопоставлены классические клинико-морфологические и молекулярно-био-логические прогностические критерии с определением прогностического предиктора и наиболее значимых критериев 10-летней выживаемости с разработкой модели построения индивидуального прогноза больных JIMC тела матки. Установлено, что для индивидуального прогнозирования (персонификации наблюдения за больной) на современном этапе необходимо использование комбинированной модели прогноза, включающей биомолекулярные показатели: плоидность клеток JIMC (х2 82,4), CD31 перитуморозной зоны (х2 73,4), количество AgNOR (х2 59,9), количество клеток в S-фазе цикла (BrdU-метка) (х2 48,9), степень злокачественности по FNCLCC (х2 42,5), зрелость сосудов опухоли (х2 38,8), тип реакции шаперонаHSP70 (х2 38,8), степень экспрессии Topoisomerase IIa(х2 35,1).

Теоретическая и практическая значимость. Проведение сравнительного анализа между некоторыми вариантами клеточной JIM и ЯМС низкой степени злокачественности на основе современных морфологических и молекушфно-биологических методов позволило выработать новые подходы к дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных опухолей тела матки. Алгоритм решения вопроса дифференциальной диагностики основан на определении пролиферативного статуса, состояния системы апоптоза и количества аргирофильных рибосомальиых белков, рецепторного статуса опухолевых клеток. Использование алгоритма дифференциальной диагностики позволит выделить группы миом, близких по молекулярному «портрету» к JIMC низкой степени злокачественности.

В результате обобщения полученных данных оценена прогностическая значимость ряда параметров JIMC, включающих патоморфологические и биомолекулярные характеристики опухолевых клеток (плоидность клеток JIMC, степень ангиогенеза перитуморозной зоны, количество AgNORs клеток опухоли, количество клеток в S-фазе цикла, степень злокачественности по критериям FNCLCC, тип реакции шаперона HSP70, степень экспрессии Topoisomerase IIa), что позволит оптимизировать клиническое прогнозирование с доминированием персонифицированного прогноза заболевания и выделением групп больных различной степени риска по неблагоприятному прогнозу.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биомолекулярные параметры опухолевых клеток JIM и JIMC тела матки: метаболическая активность, активность ЩФ сосудов и ПМЦР, плоидность и площадь ядер опухолевых клеток, количество AgNOR, экспрессия Ki-67 и BrdU-метка, экспрессия р53, BCL-2 и их конкордантность, экспрессия Topoisomerase IIa, локализация HSP70 в ядре, рецепторный статус и степень злокачественности взаимосвязаны с рядом клинических параметров: репродуктивной функцией, размером опухоли, локализацией и количеством узлов в теле матки, клинической скоростью роста образования, а также стадией заболевания при лейомиосаркоме тела матки.

2. Изученные экспоненциальные изменения процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза, продукции экстрацеллюлярного матрикса, количества аргирофильных белков в области ядрышкового организатора и инверсия метаболического профиля гладкомышечной клетки позволяют использовать эти критерии в качестве дифференциально-диагностических в сложных случаях между JIM и J1MC grade I. Основой определения экспоненциальных изменений в гладкомышечных опухолях тела матки служит сопоставление изучаемых маркеров с неизмененным миометрием пери-туморозной зоны («базальный» уровень экспрессии). Определение типа опухоли основывается на алгоритмическом способе решения с балльной системой оценки.

3. Одиночные JIM, близкие по своим морфофункциональным характеристикам к JIMC низкой степени злокачественности, характеризуются гиперэкспрессией аргирофильных белков области ядрышковых организаторов, увеличением экспрессии р53 и Ki-67, увеличением BrdU-метки, усилением метаболической активности клеток по уровню НАДН2-диафоразы и инверсией метаболического профиля с преобладанием анаэробного пути гликолиза, увеличением экспрессии фермента-гиразы Topoisomerase IIa. Опухоли с данными характеристиками имеют высокий риск малигнизации.

4. Клинически значимым фактором риска развития рецидива и мета-стазирования JIMC тела матки I-II стадии является массивный одиночный узел, занимающий более 1 гисто-анатомической области тела матки. Кли-нико-морфофункциональные характеристики опухоли являются наиболее важными в прогнозировании развития рецидива и метает аз ирования JIMC.

5. Наиболее частым гистологическим типом лейомиосаркомы тела матки является веретеноклеточный. В 19,7% случаев регистрируется особая форма JIMC с большим количеством многоядерных клеток, которая обладает отличными от остальных типов патоморфологическими и молеку-лярно-биологическими характеристиками и неблагоприятным прогнозом, что позволяет выделить этот тип в отдельную форму JIMC тела матки.

6. Ведущими критериями выживаемости больных JIMC являются мор-фофункциональные. В меньшей степени влияют на прогноз клинические параметры. Факторы неблагоприятного исхода JIMC тела матки I-II стадии при индивидуальном моделировании прогноза включают высокую степень плоидности опухоли, высокую ПМЦР перитуморозной ткани, увеличение количества аргирофильных белков области ядрышковых организаторов обоих кластеров в нуклеолонемном типе ядра опухолевых клеток, увеличение клеток в S-фазе митотического цикла, степень злокачественности по критериям FNCLCC grade III, незрелый компонент сосудов опухоли, ядерно-ядрышковый тип реакции шаперона HSP70, высокую активность гиразы Topoisomerase IIa.

7. Комбинированная клинико-морфофункциональная модель индивидуального прогноза основана на балльной оценке наиболее значимых

клинических и биомолекулярных критериев. Такая система анализа приводит к увеличению результативности оценки 10-летней выживаемости больных ЛМС тела матки до показателя х2= 138,5.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Ташкент, 2004); международном Европейском конгрессе ЕССО 14 (Barcelona, 2007); XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); международной конференции ESMO-2008; XI конкурсе молодых ученых, 2007; международной конференции «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); Всероссийских конференциях патологов с международным участием, посвященных памяти О.К.Хмельницкого (Санкт-Петербург 2009, 2011); III Всероссийском съезде патологоанатомов (Самара, 2009); Всероссийской конференции с международным участием по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2008, 2009); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы онкологии» (Барнаул, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии» (Барнаул, 2009); Всероссийской конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии» (Барнаул, 2010); Всероссийской конференции с международным участием «Инновации в онкологии» (Барнаул, 2011); Ученом совете ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» МЗ РФ.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 56 научных работ, из них 23 в журналах по списку ВАК, 1 в зарубежном рецензируемом журнале. Получен патент на изобретение № 2010123137/15(032953) от 6.10.2011 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследований», 10 глав «Результатов собственных исследований», обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и указателя цитируемой литературы. Общий объем диссертации 439 стр. машинописного текста. Указатель литературы содержит 825 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 177 таблицами и 149 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного клинико-морфо-логического обследования и лечения 85 больных ЯМ тела матки с клиникой быстрорастущей JIM и 198 случаев JIMC тела матки с известным прогнозом, пролеченных в Алтайском крае и республике Алтай за период 1986 - 2009 г. (за 24 года). Средний возраст пациенток с ЛМ составил 47,1 ±7 лет (min. 27; max. 66; moda 46), а средний возраст пациенток с ЛМС составил 52,1±1,3 (min. 23; max. 77; moda 50). Единичная ЛМ встретилась в 30 случаях (35,3%), а множественная - в 55 (64,7%). ЛМС в основном была представлена одиночным узлом -177 случаев (89,3%), в 22 случаях

(10,7%) узлов было 2. Как при JIM, так и JIMC исследованию подвергали наибольший и наименьший узлы. Во всех случаях забирали миометрий ПЗ (непосредственно прилегающий к образованию).

Используемые классификации. Стадию процесса оценивали по критериям FIGO (2007). В исследование включали только опухоли с 1 и II стадией процесса. Количество случаев с I стадией было 129 (65,2%), со II-69 (34,8%).

Рецидивирование и метастазирование. Развитие процессов прогресси-рования опухоли после проведенной операции наблюдали у 39 больных, что составило 19,7%. Развитие рецидива ЛМС в малом тазу, париетальной и висцеральной брюшине было отмечено в 10,3% (4 человека), метастазирование в лимфоузлы малого таза, парааортальные, брыжеечные - у 15 человек (38,5%), у 20 человек были выявлены отдаленные метастазы в легких (51,2%). Группы больных с рецидивом и метастазированием были объединены в одну группу рецидивных случаев.

Гистологические типы опухолей классифицировали в соответствии с WHO классификацией опухолей молочной железы и женских половых органов (2003). Для анализа особой формы J1MC была выделена саркома с большим количеством многоядерных клеток в составе структуры неопла-зии. Простых JIM было исследовано 132 узла; митотически активных - 8; клеточных - 12; эпителиоидноклеточных - 8; атипических («причудливая») - 10; опухолей с неясным злокачественным потенциалом (S TUMP)

- 6. При анализе типов JIM выборка была не слепой и не преследовала цели анализа встречаемости гистологических типов.

Веретеноклеточных JIMC было исследовано 114 (57,6%); эпителиоидноклеточных - 42 (21,2%); с большим количеством многоядерных клеток

- 39 (19,6%); миксоидных - 3 (1,6%), их в исследование не включили.

Степень злокачественности оценивали по критериям, предложенным FNCLCC, которые учитывают ряд патоморфологических критериев: диф-ференцировку, митотическую активность и массивность некроза опухоли, выражаемых в баллах. Опухолей с характеристикой G1 было 90 (45,5%), G2 - 51 (25,8%) и G3 - 57 (28,7%).

Методы иммуногистохимического исследования. Иммуногистохи-мическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового и полимерного иммунопероксидазного метода с моно- и поликлональными антителами. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).

Для дифференциально-диагностической панели при анализе JIMC с большим количеством многоядерных клеток использовали следующие моноклональные антитела и разведения: Desmin «Dako», 1:100; EMA, «Dako», 1:200; Myogcnin, «Dako», 1:200; S-100, «Dako», 1:200; Vimentin, «Dako», 1:200; SMAa, «BioGenex», 1:100; CD68, «BioGenex», 1:50. К

JIMC с большим количеством многоядерных клеток относили опухоли с позитивным иммунофенотипом к антителам Vimentin, Desmin, SMAa.

Для исследования основных характеристик опухолевых клеток использовали следующие моноклональные антитела и разведения: Ki-67, MIB-1, «Dako», 1:25; р53, D07, «Dako», 1:25; CD31, JC70, «Dako», 1:10; Bcl-2, МКА124, «Dako», 1:10; Receptor Progesterone, PgR 636, «Dako», 1:40; Receptor estrogene, 1D5, «Dako», 1:150; Bromodeoxyuridine, Bu20a, 1:7 (для предобработки использовали раствор BrdU (SigmaB 5002,7 mglmlsaline; Sigma), который вводили в маточную артерию и инкубировали при температуре 37°С 24 ч. Далее, вместо предобработки 2М HCL и последующи) использования протеазы по Harms G. et al. (1986) мы использовали обработку в нитратном буфере с pH 6.0 в модификации Tang X. et al. (2007) и Muskhelishvili L. et al. (2003); Topoisomerase IIa, Ki-S, «Dako», 1:150; HSP70, W27, «Diagnostic BioSystems», 1:25.

Оценку экспрессии молекулярно-биологических маркеров проводили согласно общепринятым методикам и протоколу производителя.

Исследование ферментов. Для исследования НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ на замораживающем микротоме готовили срезы толщиной 10-15 мкм. Свежезамороженные нефиксированные срезы собирали в раствор 0,85% сахарозы, затем наклеивали на чистое предметное стекло, просушивали при комнатной температуре и инкубировали в субстрате соответствующего фермента: НАДН2-диафораза (IUBMB 1.6.99.1), сук-цинатдегирогеназа СДГ (IUBMB 1.3.99.1) и лактатдегидрогеназа ЛДГ (IUBMB 1.1.1.27). В части случаев ядра докрашивали 0,1% водным раствором нильского голубого. Активность ферментов в гладкомышечных клетках оценивали количественным методом Р.П.Нарциссова, основанным на подсчете образованных в клетке видимых гранул формазана, при использовании n-нитротетразолия фиолетового в абсолютных цифрах. Кроме того, на свежезамороженных нефиксированных срезах опухоли толщиной 30-40 мкм, окрашенных на щелочную фосфатазу(ЩФ) (IUBMB 3.1.3.1) по Гомори, оценивали характер и степень выраженности реакции эндотелия сосудистого русла.

Исследование AgNOR. Использовали набор реактивов Bio-Optica (LOT 04-045801). Для изучения AgNOR срезы окрашивали AgN03 по двухступенчатому методу Y. Daskaletal (1980). Высчитывали среднее количество гранул серебра на 1 ядро миоцита (кариоплазматический кластер (КПкл) и нуклеолярный кластер (Нкл)). Подсчет гранул вели на компьютерном анализаторе изображений в автоматическом режиме с помощью программы ImageJ 1.35. В классификации видов ядрышек и распределения нуклеолярного кластера гранул учитывали следующие типы: 1) нуклеолонемные, характерные для клеток зреющих, новообразованных, фактически недифференцированных; 2) кольцевидные, характерные для зрелых клеток; 3) переходные, характерные для вызревающих (Арвеладзе Ю.Р., 2001; Crocker J., 1990; Vandelaer М. et al., 1999).

Морфоденситометрический метод исследования. МДМ исследование проводили с целью определения площади ядер исследуемых клеток, оптической плотности объекта с вычислением содержания Фельген-ДНК ядер в единицах плоидности (с). Для суждения об общем количестве генетического материала в ткани или опухоли использовали обобщенный показатель кинетики количества ДНК в единицах плоидности, теоретическая физическая основа которого заложена в законе оптической плотности объекта Бугера - Ламберта (Aubele М., 1994), представляющий собой отношение интегральной оптической плотности Фельген - ядра миоцита к средней интегральной оптической плотности Фельген-ядра лимфоцита с коэффициентом 1.6.

Статистический анализ результатов исследования. Выживаемость рассчитывали двумя способами, по методикам и формулам, предложенным Мерабишвили В.М. (2006) и Cutler S., Ederer F. (1958). Для оценки индивидуального прогноза использовали методику, предложенную Юриным А.Г. и соавт. (2009) и Frank 1. et. al. (2002). В баллах оценивали только наиболее значимые критерии прогноза, определенные при многофакторном анализе по Коксу. Для этого первым этапом создавали таблицу значений chi-square (Х2), где значения получали в результате многофакторного анализа по Коксу. Вторым этапом суммировали все полученные баллы и оценивали вес каждого параметра (получали соответствующий коэффициент от 0 при допороговом значении и до 9 баллов в зависимости от веса параметра при превышении критической отметки параметра, влияющего на прогноз). Третьим этапом при индивидуализации прогноза проводили суммацию всех исследуемых параметров и при получении суммы баллов оценивали риск развития неблагоприятного прогноза, сформировав 3 группы риска.

Алгоритм дифференциально-диагностических критериев, включающий не менее 8 основных параметров, имеющих экспоненциальную кривую (независимо от знака) изменения в содержании или качественной характеристике параметра, был экстраполирован из работы по алгоритмизации исследований цервикальной неоплазии по Хмельницкому O.K. (2000) и дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных ГМО тела магки по Robboy B.J. et al. (1998) и Bell S.W. et al. (1994).

При выборе статистических процедур учитывали требования Международного конгресса по гармонизации GCP «Статистические принципы для клинических исследований» (1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Внеклеточный матрнкс в гладкомышечных опухолях тела матки. В нашем исследовании в ЛМС продукция ВКМ была сопряжена с рядом клинических и биомолекулярных параметров: рецепторным статусом (г=0,38) с более выраженной продукцией ВКМ в рецептор-позитивных

Опухоль Фиброз ст ромы, степень выраженности

+ ++ +++

Лейомиома БДУ 26,1%±4,5* 50%±5,2* 23,9%±4,4*

Лейомиосаркома БДУ 54,5%±4,2* 34,8%±3,3* 10,7%±2,Г

Примечание:' - значимые различия при р<0,05 JIM от ЛМС.

JIMC, экспрессией Topo IIa (г=0,49) с усилением синтетической функции по мере уменьшения экспрессии гиразы, экспрессией Ki-67 (г=0,38) с увеличением фиброза при низкой экспрессии белка, количеством AgNOR (г=0,51), морфоденситометрическими показателями клеток (г=0,48) с уменьшением синтеза ВКМ при увеличении показателя плоидности и площади клеток ЛМС.

Выявлены корреляции с биомолекулярными факторами: рецепторным статусом (г=0,42) с выраженным фиброзом стромы в позитивных к РП и РЭ JIM, коэкспрессией Вс1-2 и р53 (г=0,39), экспрессией Ki-67 (г=0,39) с увеличением фиброза при низкой экспрессии белка, BrdU-меткой (г=0,48) с увеличением фиброза при небольшом S-индексе, МДМ показателями клеток (г=0,43) с уменьшением синтеза ВКМ при увеличении показателя плоидности и площади клеток JIM, с ПМЦР и активностью ЩФ (г=0,86) с уменьшением продукции ВКМ в опухолях с высокой развитостью сосудов, метаболической активностью и профилем (г=0,52) с усилением фиброза, сопряженного с высокой метаболической активностью и инверсией метаболического профиля клеток опухоли за счет усиления ЛДГ.

Неизмененный миометрий ПЗ характеризовался умеренной либо слабой продукцией ВКМ практически в 89%. Избыточная продукция ВКМ оказалась характерной преимущественно для ДМ: пра!сгически в 74% случаев опухоль была фиброзирована более чем на 10% (++ и +++), случаев с низкой продукцией ВКМ было 26,1% (табл. 1). В то же время, при JIMC основная часть случаев характеризовалась низкой продукцией коллагена (+ - 54,5%). JIMC с преобладанием высокой продукции ВКМ встречались значимо реже, чем в случаях JIM: в 10,7% случаев JIMC строма была фиброзирована более чем на 25% (р<0,05). Дифференциально-диагностическая значимость параметра продукции в диагностике JIM и JIMC была высокой (t=37,2), но корреляционная зависимость была равной г=0,3 (р<0,05). Следует отметить, что эпителиоидный тип, атипическая и в меньшей степени митотически активная и клеточные JIM характеризовались меньшей продукцией ВКМ относительно простой JIM. В то же время ЛМС значимо отличалась от JIM стабильно низкой синтетической функцией атипических миоцитов, что было закономерно и для JIMC с большим количеством многоядерных клеток. Выявлена положительная корреляция продукции ВКМ с митотической активностью JIM и степенью злокачественности JIMC (г=0,39-0, 43, р<0,002).

При оценке количества продуцируемого коллагена в зависимости от степени злокачественности ЛМС по критериям FNCLCC были получены определенные зависимости. В данной категории исследуемых образований были получены значимые отличия в группах G3 и G1 по степени фиброза опухоли: при низкой степени злокачественности (Gl) значимо реже встречали опухоли с низким фиброзом относительно группы с G3 (46,7±5,2 и 68,4±6,2% соответственно, р=0,01), а в группе с умеренным фиброзом случаев с Gl становилось значимо больше - 43,3±5,2% относительно группы GUI - 21 ±5,3%, р=0,002 (г=0,58).

Таким образом, по мере уменьшения степени злокачественности происходило усиление синтетической функции с увеличением количества продуцируемого ВКМ в виде коллагена общего типа. Данная закономерность была показательна для всех типов ЛМС, в том числе и с большим количеством многоядерных клеток. Анализ кривых общей выживаемости больных с различной степенью продукции ВКМ выявил достоверные различия в данных между случаями ЛМС с показателями продукции ++, +++ с +. Общая 10-летняя выживаемость у пациентов со слабой продукцией ВКМ составила 25±6,3%, а при показателе «+++» - 66,7±7%.Низкую синтетическую функцию клеток ЛМС следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Метаболическая активность и профиль клеток НМ, ЛМ и ЛМС. При выявлении связи метаболической активности клеток ЛМС (по уровню НАДН2) была обнаружена корреляция с размером неоплазии с высоким уровнем метаболизма в крупных узлах (r=0,41); с количеством узлов ЛМС с высшим уровнем метаболизма в одиночном узле (г=0,52); степенью злокачественности с ростом метаболизма и инверсией профиля по мере увеличения степени злокачественности (г=0,36). В то же время связи с локализацией образования, развитием рецидива и стадией процесса ЛМС выявлено не было. В ЛМ активность НАД(Ф)-зависимых ферментов коррелировала с репродуктивной функцией (г=0,46) с пиком метаболизма у больных репродуктивного возраста, локализацией узла ЛМ с более высоким уровнем в субсерозных образованиях (г=0,38).

НМ ПЗ характеризовался невысокой общей метаболической активностью по уровню НАДН2-диафоразы (табл. 2). Процессы аэробного окисления (СДГ) значимо преобладали над процессами анаэробного (ЛДГ) пути метаболизма. Вместе с тем, общая метаболическая активность (НАДН2) была выше в ПЗ ЛМС, нежели ЛМ.

Анализ метаболической активности ЛМ показал, что уровень метаболизма был значимо выше в JIM независимо от гистологического типа по уровню НАДН2 относительно НМ (р<0,0001). Следует отметить, что преобладающим путем метаболизма в миоме относительно НМ был анаэробный гликолиз (р<0,0001), а аэробный тип метаболизма был значимо ниже (р<0,0001). В ЛМС отмечали наивысший пик активности всех путей метаболизма с высоким уровнем как СДГ (60,6±12), так и ЛДГ (31,7±5,7)

Гистологический тип Активность фермента

НАДН2 СДГ ЛДГ

Лейомиома БДУ 36,1±1,5* 13,7±0,9* 20,1 ±1,7*

Неизмененный миометрий ПЗ JIM 22,8±1,5* 18,7±1,2" 14,1±2,2*

ЛМС БДУ 146,3±23.5* 60,6±12* 31,7±5,7"

Неизмененный миометрий ПЗ ЛМС 51,2±8,1* 10,2±0,3* 16,8±0.8*

Примечание: * - значимые различия при р<0,05 в НМ ПЗ (JIM и JIMC) от ЛМ и от ЛМС.

относительно не только миометрия ПЗ, но и JIM, хотя преобладающим был аэробный путь.

Следует сказать, что уровень общего метаболизма по содержанию НАДН2 был несколько выше в простой и эпителиоидной ЛМ относительно клеточной и митотически активной (р<0,05), и в основном это происходило за счет инверсии дыхательного ансамбля в пользу анаэробного пути (р<0,0001). Так, аэробный путь метаболизма, по данным содержания СДГ, был самым низким в простых JIM с высокой степенью гиалиноза. По мере увеличения клеточности и роста митотической активности происходил и рост активности СДГ в митохондриях до 15,3±1 при клеточной и 16,4±1,9 при митотически активной миомах и снижение ЛДГ до 16,3±1,7 и 14,7±1,5 соответственно. Метаболическая активность и профиль при ЛМС также варьировали в зависимости от гистологического типа. JIMC с большим количеством многоядерных клеток обладала наибольшей активностью НАДН2, и, соответственно, общим уровнем метаболизма относительно эпителиоидной и веретеноклеточной ЛМС (173,3±5,6, 147,5±6,6 и 140,5±3,1 соответственно, р<0,05).

Дифференциально-диагностическая значимость метаболизма и профиля «дыхательного ансамбля» в диагностике JIM и J1MC была наиболее высокой относительно всех изученных параметров при статистической значимости в t=82-207 и корреляционной зависимости - от г=0,56 до г=0,84, р<0,05.

При анализе связи метаболической активности и метаболического профиля с рядом биомолекулярных маркеров были выявлены ряд корреляций при ЛМ с продукцией ВКМ (инверсия метаболического профиля до преобладания анаэробного гликолиза при избыточной продукции ВКМ (ЛДГ 11,9±1,4 при + и 24,5±1,2 при +++), активностью ЩФ с усилением активности анаэробного гликолиза при снижении активности ЩФ (r=0,4-0,51), МДМ параметрами клеток JIM с сопряженным увеличением показателей (г=0,36-0,4), активность ЛДГ коррелировала с количеством AgNOR (г=0,4) и шаперонной экспрессией с ростом активности ЛДГ при цитоплазматической локализации HSP70 (г=0,49). Не было получено связи

метаболической активности и пролиферативным статусом JIM, рецептор-ным статусом и активностью белков-регуляторов апоптоза.

При JIMC по мере роста активности ЩФ росла и активность НАДН2 и ЛДГ (г=0,37), хотя ни ПМЦР, ни степень зрелости не были связаны с метаболической активностью^ количеством аргирофильных белков со снижением общей напряженности метаболизма по мере увеличения числа AgNOR (п=0,36), активность дегидрогеназ сопряженно возрастала с активностью гиразы (г=0,38).

Особенности архитектоники и активность трансмембранного энзима ЩФ. Сопоставление активности ЩФ с рядом клинико-морфоло-гических характеристик у больных JIM выявило ряд корреляций с размером JIM (г=0,75): активность ЩФ выше в небольших миомах; скоростью роста (г=0,36): ниже уровень ЩФ в медленно растущих JIM; локализацией (г=0,75): выше в субмукозных узлах; количеством JIM (г=0,7): выше в случае множественных узлов. При JIMC корреляций с клинико-морфоло-гическими параметрами было меньше, но были получены определенные зависимости активности ЩФ с репродуктивной функцией больных J1MC (г=0,42): более высокую активность ЩФ обнаруживали в период менопаузы, при множественной саркоме в теле матки активность ЩФ была несколько ниже, чем при одиночном узле (г=0,38), стадией JIMC (г=0,33): высокая активность фермента во II стадии; развитием рецидива и метастазов (г=0,35): риск рецидива возрастал при усилении активности ЩФ.

Для фибромиом с выраженным склерозом были характерны лишь обрывки сосудов, замурованных среди фиброзной ткани, а также слабая реакция эндотелия на ЩФ. В простых JIM развитие МЦР имело более выраженный характер, преобладали прекапиллярный и посткапиллярный компоненты и анастомозы между ними, истинные капиллярные петли встречались реже. Клеточные JIM характеризовались интенсивным окрашиванием эндотелия сосудов на ЩФ и наличием множества истинных капиллярных сосудистых петель с незавершенностью строения некоторых петель и большим количеством растущих новообразованных капилляров. JTM без уточнения гистологического типа характеризовались преимущественно небольшой активностью ЩФ сосудов: в 43,5% случаев активность была низкой, в 34,8% - умеренной, высокая степень активности - в 21,7% случаев (табл. 3). Анализ активности ЩФ в сосудах в зависимости от гистологического типа JIM показал, что практически в 45% простых опухолей активность фермента была либо низкой, либо умеренной.

J1MC характеризовались интенсивным окрашиванием эндотелия сосудов на щелочную фосфатазу и наличием множества истинных капиллярных сосудистых петель вне зон некроза. Кроме того, в большинстве случаев выявляли незавершенность строения некоторых петель и большое количество растущих новообразованных капилляров в зоне свободной от некротических изменений. Следует сказать, что сосудистая архитектоника JIMC была во многом схожа с архитектоникой сосудов JIM клеточной и

Таблица 3. Активность II] Ф сосудов JIM различного гистологического типа

Гистологический тип JIM Активность ЩФ

+ -н- +++

Лейомиома БДУ 43,5%±7,8 34,8%±8,4 21,7%±9,4*

Лейомиосаркома БДУ 31,2%±5,8 22,7%±6,2 46,l%t5,3*

Примечание:' - значимые различия при р<0,05 JIM от JIMC при +++.

митотически активной, но с преобладанием капилляров и небольшим числом модульных сосудов. Анализ активности фермента в зависимости от гистологического типа JIMC выявил, что выраженная степень активности ЩФ была характерна для саркомы с большим числом многоядерных клеток: выраженная степень при такого типа неоплазии была характерна в практически 77% случаев. Несколько ниже, но статистически значимо активность фермента оказалась характерна для веретеноклеточного варианта - в 23,7% (р<0,05).

Дифференциально-диагностическая значимость активности ЩФ и типа архитектоники в диагностике JIM и JIMC была крайне невысока при статистической значимости в t=32,l и отсутствием корреляционной зависимости от г=0,18. Поиск корреляций активности трансмембранного фермента ЩФ с рядом биомолекулярных параметров при JIM выявил следующий комплекс взаимосвязей - с продукцией ВКМ: выше с низкой продукцией коллагена (i=0,86), активностью ЛДГ с сопряженным усилением анаэробного гликолиза в условиях роста 1ЦФ (г=0,51), МДМ параметрами с усилением ЩФ при росте площади и плоидности (г=0,47), экспрессией Ki-67 с ростом активности ЩФ при увеличении индекса метки (г=0,86), с активностью р53 с ростом экспрессии белка при росте ЩФ (г=0,41).

При JIMC были выявлены корреляции лишь с активностью НАД(Ф) ферментов (г=0,37) и экспрессией р53, при увеличении которого активность ЩФ резко снижалась (г=0,53).

Анализ кривых общей 10-летней выживаемости больных с различной степенью активности ЩФ выявил достоверные различия в показателях. Так, у пациентов с высокой активностью фермента 10-летняя выживаемость была 30±5,9%, а при низкой активности - 70±8,3%. Таким образом, высокую степень активности ЩФ JIMC следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Плотность микроциркуляторного русла и количество AgNOR эндотелия сосудов HM, JIM и JIMC. Анализ ПМЦР и зрелости сосудов образования наряду с исследованием сосудистой архитектоники и связь этих параметров с клинико-морфофункциональными характеристиками опухоли и, что особенно важно, с выживаемостью больных JIMC в настоящее время приобретает особое значение (FDA 2011; Verheul H.W. et al., 2004). Немаловажное место в данном аспекте занимает сопоставление ПМЦР опухоли ПЗ и образования ЗНО в целом и тела матки в частности (Hollemann D. et al, 2011).

Таблица 4. ПМЦР и активность AgNOR эндотелия НМ ПЗ, ЛМ и ЛМС тела матки

Объект исследования Плотность МЦР по данным CD31 Ag-NOR эндотелия

Неизмененный миометрий 62,4±2,6 2,85±0,1*

Лейомиома БДУ 50,4±4,6 4,5±0,1*

Лейомиосаркома БДУ 70,6±3,6 9,8±1,5*

Примечание:' - р<0,05 при сравнении HM, JIM и JIMC по количеству AgNOR сосудов.

При выявлении взаимосвязи показателей ПМЦР и количества AgNOR эндотелия сосудов с некоторыми клинико-морфологическими параметрами были обнаружены корреляции ЛМС: в период менопаузы показатели ПМЦР были выше, чем в репродуктивный период (г=0,36); размером саркомы с относительно высокими показателями ПМЦР в образованиях до 7 см. (г=0,37); локализацией ЛМС с высокими уровнями ангиогенеза в субмукозной саркоме (г=0,36); количеством узлов с высокими уровнями в одиночном узле (г=0,37); степенью злокачественности с выраженным ангиогенезом при Gl (г=0,42).

Кроме того, была выявлена связь ПМЦР опухоли с рецидивированием процесса (г=0,37): риск развития возрастал при росте ПМЦР. При JIM ПМЦР и количество AgNOR эндотелия сосудов было взаимосвязано с репродуктивной функцией с относительно высокими показателями в период репродуктивный (г=0,6); размером JIM с высокими показателями в JIM более 3,5 см. (т=0,7); скоростью роста миомы с высокими показателями в клинически быстрорастущих неоплазиях (г=0,5); локализацией JIM с высокими показателями в субмукозных и интрамуральных JIM (г=0,7); количеством узлов с высокими показателями ангиогенеза в одиночных узлах (r=0,8); МА с выраженным ангиогенезом в образованиях с высокой МА. Интересно отметить, что степень васкуляризации опухоли далеко не всегда была выше ПМЦР перитуморозной зоны. В 30% случаев было выявлено, что ПМЦР НМ ПЗ была значимо выше, чем самой опухоли. Несомненно, данная характеристика должна была найти свое отражение и на прогнозе, что и было продемонстрировано ниже.

Вместе с тем при анализе зрелости и скорости роста сосудов НМ, ЛМ и ЛМС по данным количества AgNOR эндотелиоцитов было выявлено, что число AgNOR эндотелия сосудов в опухоли было значимо выше, чем число белков эндотелия сосудов ПЗ - 1,85±0,1 против 4,5±0,1 и 9,8±1,5 в JIM и ЛМС соответственно, причем преобладающим типом ядрышек становились более активные нуклеолонемные (табл. 4). Выявленный рост количества аргирофильных белков показал, что скорость неоангиогенеза сосудов МЦР в ЛМ значимо ниже, а степень зрелости сосудов значимо выше аналогичных показателей JIMC, что говорило о напряженности процессов неоангиогенеза в ЛМС тела матки.

О 1000 2000 3000 4000 0 1000 2000 3000 4000

Дни Дни

Рис. 1. График кумулятивной выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от ПМЦР ЛМС (а) и ПЗ (б).

При анализе связи ПМЦР с рядом биомолекулярных маркеров были выявлены ряд корреляций при ЛМ: продукцией ВКМ с уменьшением степени ангиогенеза при росте продукции ВКМ (г=0,47); НАД(Ф) ферментами и профилем с усилением ЛДГ и снижением СДГ при уменьшении степени кровоснабжения образования (г=0,44-0,6); МДМ параметрами ядер (г=0,51); количеством А§>1СЖ с ростом ПМЦР при увеличении арги-рофильных белков (г=0,69); с ВгсЮ-меткой и увеличением ПА при росте ПМЦР (г=0,64); белками регуляторами апоптоза с ростом ПМЦР при росте экспрессии Вс1-2 и р53 (г=0,57); РП и РЭ статусом с уменьшением ПМЦР при негативном статусе (г=0,47).

При ЛМС корреляции с биомолекулярными параметрами носили ограниченный характер: относительное увеличение МДМ-параметров при снижении площади ядер, но при увеличении плоидности (г=0,51); количество AgNOR с ростом ПМЦР при небольшом количестве аргиро-фильных белков (г=0,39); ПА и рост Кь67 и Вг(Ш-метки при уменьшении ПМЦР (г=0,67); активность белка р53 с ростом ПМЦР при снижении экспрессии р53 (г=0,38); рецепторный статус опухоли со снижением ПМЦР при позитивных опухолях.

Анализ кривых общей 10-летней выживаемости больных с различной ПМЦР ЛМС не выявил достоверных различий в показателях при высокой и низкой ПМЦР опухоли (рис. 1, а, б). Вместе с тем, анализ влияния на 10-летнюю выживаемость ПМЦР псритуморозной ткани показал, что при высокой ПМЦР (более 62 на 2 мм2) выживаемость была значимо ниже, чем до уровня порогового показателя (15,4%±5,7 против 63,6%±5,9 соответственно) (см. рис. 1, б). Таким образом, ПМЦР перитуморозной зоны более 62 на 2 мм2 следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Морфоденситометрические параметры ядер клеток HM, JIM и ЛМС. При анализе взаимосвязи МДМ-параметров с рядом клинических показателей при JIMC значимых корреляций было обнаружено немного, но следует отметить, что при массивном опухолевом узле параметр пло-идности был значимо выше (г=0,36); при множественном узле параметр плоидности был значимо выше одиночной неоплазии (г=0,39), и по мере увеличения степени злокачественности происходил значимый рост МДМ-параметров (г=0,3 8). Кроме того, при увеличении плоидности опухолевых клеток риск развития рецидива и метастазирования был выше (г=0,54). Сопоставление МДМ параметров ядер JIM с клинко-морфологически-ми параметрами выявило ряд интересных взаимосвязей: корреляцию с репродуктивной функцией больных с относительно высокими МДМ-параметрами в репродуктивный период (г=0,36); размерами образования с ростом параметров по мере увеличения размера JIM (г=0,47); скоростью роста JIM с ростом параметров в клинически быстро растущих образованиях (г=0,43); локализацией с относительно высокой плоидностью при субмукозных образованиях (г=0,8).

Содержание ДНК в единицах плоидности в патологически неизмененной ткани в ядрах миоцитов ПЗ не превышало 4,1±0,08с, а площадь ядра составила 55,2±0,5 мкм2. Гладкие миоциты в JIM характеризовались значимым увеличением плоидности и площади ядер до 6,8±0,2с и 70,1 ± 1,4 мкм2 соответственно относительно миоцитов ПЗ. Несколько отличалась большими МДМ-параметрами атипическая JIM, хотя при остальных типах ЛМС значимых отличий не было. Площадь и плоидность ядер ве-ретеноклеточной ЛМС тела матки практически соответствовала средним показателям при JIMC БДУ (82,2±1,9, 8,6±0,2 и 85,2±2,1, 9,4±0,3 соответственно, р=0,06). Эпителиоидная JIMC характеризовалась небольшим ядром, значимо меньшим по площади относительно других типов злокачественной опухоли. По тенденции к более низким МДМ показателям была сопоставима со своим доброкачественным аналогом (68,7±3,7, 8,2±0,6 и 57,8±2,1, 4,2±0,3 соответственно, р<0,05). Наивысший пик площади и плоидности ядер были отмечены в ядрах ЛМС с большим числом многоядерных клеток с показателями опухолевой анеуплоидии до 12,4±0,7. Дифференциально-диагностическая значимость показателя плоидности и площади ядер клеток ЛМ и ЛМС оказалась невысокой и не имеющей стратегической значимости при г=0,22-0,27 и t=32,1-49,6.

При анализе модальности гистограмм плоидности для миометрия ПЗ был характерен унимодальный тип распределения с пиком в области квадроплоидного набора. Вместе с тем, встречалось около 5% клеток с показателями полиплоидного набора хромосом (8с). JIM характеризовалась бимодальным типом распределения с пиками в области квадро- и пентаплоидного набора. Кроме того, были отмечены пулы клеток с более полиплоидным набором: около 12% клеток были с плоидностью 8с, а порядка 2% - с признаками анеуплоидии и плоидностью в 12-13 с. Гладкие

атипические миоциты J1MC отличались от миоцитов ПЗ мультимодальным распределением по характеристике плоидности с пиками в районе 4с, 8с, Юс, 12с, 14с. Практически 20% клеток характеризовались крайним полимофризмом с выраженной степенью анеуплоидии (от 14с до 21с).

Сопоставление МДМ-параметров с биомолекулярными характеристиками JIM также выявило ряд интересных взаимосвязей: по мере усиления продукции ВКМ происходило уменьшение плоидности и площади ядер (г=0,43), увеличение активности ЩФ сопровождалось снижением показателей МДМ-параметров (г=0,47). По мере увеличения МДМ-параметров происходило значимое усиление метаболической активности (г=0,38), ПМЦР (г=0,5), увеличение числа AgNOR ядер JIM (г=0,51). Негативный рецепторный статус JIM сопровождался увеличением плоидности и площади ядер (г=0,4).

При JIMC взаимосвязь МДМ-параметров с биомолекулярными параметрами носила аналогичное направление: при снижении показателя МДМ-параметров происходило сонаправленное снижение продукции ВКМ (г=0,48). При росте площади и плоидности ядер J1MC ПМЦР снижалась (г=0,51), уменьшалась степень зрелости сосудов ЛМС (г=0,36), увеличивалось количество AgNOR (г=0,43), увеличивалась экспрессия Ki-67 и BrdU-метка (г=0,39), р53 (r=0,49), Topo II (г=0,48). Как и при JIM, при ЛМС при негативном рецегггорном статусе показатели плоидности и площади ядер значимо уменьшались (г=0,4).

Анализ кривых общей выживаемости больных с различными МДМ-параметрами выявил достоверные различия в показателях между случаями с плоидностью ядер клеток JIMC до 9,4с и более порогового показателя и площадью ядер до 85,2 мкм2 и более. Общая выживаемость была почти в 4 раза ниже у пациентов с превышением пороговых МДМ показателей (77,1±5,6 и 6,3±3,5% для параметра плоидности и 65,1±6 и 14,3±5,4% для параметра площади ядер). Высокие уровни МДМ-показателей ядер клеток ЛМС следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Морфофункциональиая характеристика ядрышкового аппарата клеток HM, JIM и JIMC. При поиске взаимосвязи количества AgNOR с важными клинико-морфоло-гическими параметрами было выявлено, что в клетках ЛМС увеличение количества AgNOR отмечали в период менопаузы; при опухоли до 7 см; нескольких саркоматозных узлах; при увеличении степени злокачественности и стадии процесса по FIGO (г=0,36-0,57, р<0,05). При рецидивирующем характере течения ЛМС были выявлены более высокие показатели кариоплазматического кластера AgNOR, чем при безрецидивном (г=0,44). При JIM увеличение количества AgNOR выявляли в репродуктивном возрасте относительно менопаузы; при размере JIM более 3,5 см; в клинически быстрорастущих опухолях; в одиночных узлах относительно множественных и при высокой митотической активности (г=0,47-0,77, р<0,05).

Таблица 5. Количество и характер распределения AgNOR в ядрах клеток миометрия ПЗ, ЛМ и JIMC тела матки

Исследуемый объект Среднее количество AgNOR на ядро Различные клеточные кластеры AgNOR

Нуклеолярный Кариоппазматический

Неизмененный миометрий 3,5±0,1* 2,3±0,04* 1,2±0,09*

Лейомиома БДУ 5,3±0,2* 4,4±0,2* 2,1±0,1*

Лейомиосаркома БДУ 22,1±2,Г 10,8±0,3* 11,2±0,8*

Примечание:' - р<0,05 при сравнении HM, JIM и JIMC.

Среднее количество аргирофильных гранул на ядро в НМ ПЗ составило 3,4±0,1, из них гранул нуклеолярного кластера было 65,7%, а кариоплазматического - 34,3%, а ядрышки были в подавляющем большинстве кольцевидного неактивного типа (табл. 5). В JIM мы отмечали статистически значимый, но невыраженный рост количества AgNOR до 5,3±0,2, из них гранул нуклеолярного кластера было 67,7%, а кариоплазматического - 32,3%. Ддрышки были чаще кольцевидного типа, хотя встречали и нуклеолонемные. В JIMC отмечали скачкообразный значимый рост количества аргирофильных гранул до 22,1 ±2,1, из них гранул Нкл было 49,1%, а КПкл - 50,9%, а основным типом ядрышек становились нуклеолонемные.

В зависимости от гистологического типа JIM были выявлены некоторые колебания AgNOR. Простая и клеточные JIM характеризовались значимо большими показателями AgNOR с преобладанием Нкл гранул над КПкл. Значимый рост числа белков был отмечен в митотически активной и атипических типах JIM до 7,3 гранул с увеличением числа нуклеоляр-ных гранул (р<0,05,). Кривая модальности распределения становилась сглаженной, встречались популяции клеток с выраженным разбросом от 2 гранул до 14, а пик был отмечен в диапазоне 6-7 гранул.

При J1MC также были выявлены колебания в количестве AgNOR. Количество AgNOR веретеноклеточной JIMC составило 19,8±0,7. Около 50% ядрышек при этом были нуклеолонемными. Эпителиоидная JIMC практически не отличалась по среднему количеству гранул - 21,8±1,2, р=0,2. Количество нуклеолонемных ядрышек при этом значимо не отличалось от веретеноклеточной миомы (около 50%). Наибольшим количеством AgNOR характеризовалась JIMC с большим количеством многоядерных клеток: 30,5±4,1, при этом график модальности был уницентричным с диапазоном клеток от 15 гранул до 120 (см. табл. 5). В отличие от предыдущих форм JIMC данная форма характеризовалась преобладанием кариоплазматических форм AgNOR.

Дифференциально-диагностическая значимость маркера была высокой и составила t^221,2 при г=0,8 для средних величин при р=0,0002. Дифференциально-диагностическую значимость на относительно высоком

уровне проявляло количество белков Нкл (г=0,73, t=176,5), КПкл (г=0,66, t=145,3).

Сопоставление количества аргирофильных белков с рядом биомолекулярных маркеров при JIM выявило ряд интересных корреляций. При JIM увеличение числа AgNOR сопровождалось сонаправленным уменьшением активности ЩФ, уменьшением активности СДГ, увеличением ПМЦР, ростом МДМ-параметров ядер опухолевых клеток, ростом экспрессии Ki-67 и BrdU-метки, гиперэкспрессией Вс1-2 и резким снижением экспрессии р53, усилением гиразной активности и ядерной транслокацией белка HSP70 (г=0,38-0,69, р<0,05). При J1MC также был выявлен ряд корреляций количества аргирофильных белков с биомолекулярными показателями. При росте количества AgNOR происходило сонаправленное уменьшение продукции ВКМ, снижение активности СДГ, уменьшение ПМЦР, увеличение плоидности ядер клеток саркомы, увеличение экспрессии Ki-67 и BrdU-метки, увеличение активности белка р53 и гиразной активности. Для высоких показателей AgNOR был характерен негативный рецепторный статус опухоли (г=0,36-0,47, р<0,05).

Анализ кривых общей выживаемости больных с различным содержанием AgNOR выявил достоверные различия в показателях между случаями с количеством белков в ядрах JIMC до пороговой величины в 22,1 гранулу и более порогового показателя. Так у больных JIMC с превышением пороговых показателей содержания аргирофильных белков 10-летняя выживаемость была 7,7%±4,2 против 68,2%±5,7 в случаях недостижения порогового показателя. Таким образом, высокий уровень содержания AgNOR ядер клеток ЛМС следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости независимо от кластера аргирофильных белков.

Экспрессия белков регуляторов клеточного цикла HM, JIM и ЛМС

тела матки (по данным экспрессии Ю-67, BrdU, BCL-2 и р53)

Пролиферативная активность (Ki-67 и BrdU-метка). При поиске взаимосвязи экспрессии Ki-67 и BrdU с рядом важных клинико-морфоло-гических параметров при J1MC была выявлена высокая экспрессия Ki-67 и BrdU, ассоциированная с менопаузальным возрастом больной ЛМС, массивным опухолевым одиночным узлом, степенью злокачественности G3, стадией процесса II по критериям FIGO (г=0,39-0,41, р<0,05); высокая степень корреляции ПА была выявлена с рецидивированием (г=0,52) с увеличением риска при высокой активности. При ЛМ было выявлено, что высокая степень экспрессии белков ассоциировалась с репродуктивным возрастом, субмукозной локализацией, одиночным узлом (г=0,38-0,64, р<0,05).

В НМ ПЗ уровень экспрессии Ki-67 составил 0,5±0,09% (табл. 6). Случаев с негативной реакцией к BrdU в НМ ПЗ было подавляющее

Исследуемый объект Экспрессия Ki-67, BrdU

Активность (%) Количество клеток с гиперэкспрессией белка(%)

Ki-67 BrdU Ki-67 BrdU

Неизмененный миометрий 0,5±0,09* 0,1±0,0Г 11,8±1,9* 0

Лейомиома БДУ 2,6±0,3* 0,5±0,08* 30,6±1,3* 0

Лейомиосаркома БДУ 16,6±1,3* 6,3±0.5* 42,2±1,6* 30,5±4,2

Примечание:' - р<0,05 в группах НМ от JIM и ЛМС по активности Ki-67 и BrdU.

большинство - 97,4± 1,1%, что коррелировало с низкой ПА. Вместе с тем, в случаях с позитивной реакцией клеток в S-фазе митотического цикла в НМ ПЗ было не более 0,1 %±0,01. Пропорциональное количество клеток в Gl-2 фазе и S-фазе было 83,9%: 16,1%. Практически все позитивные случаи характеризовались низкой выраженностью реакции. ПА значимо возрастала в JTM до 2,6%. В JIM независимо от гистологического типа количество негативных случаев к BrdU снижалось до 30,2±4,9%, а клеток в S-фазе митотического цикла становилось значимо больше: 0,5±0,08%, что вполне объяснялось невысокой ПА. Пропорциональное количество клеток в G1-2 фазе и S-фазе было 83,9%: 16,1%, что практически не отличалось от НМ ПЗ. Случаев с низкой активностью становилось значимо меньше относительно НМ: 66,7±11,4%, а практически около трети случаев были с умеренной реакцией. Случаев с выраженной степенью не было отмечено совсем. В JIMC происходил дальнейший значимый рост активности Ki-67 до 16,6±1,3%, а случаев с негативной реакцией было 43 (21,7%). В случаях с позитивной реакцией количество клеток с гиперэкспрессией белка значимо велико и составило 30,5±4,2%, р<0,05 (см. табл. 6). JIMC характеризовалась значимым ростом клеток в фазе синтеза ДНК: 6,3±0,6%. Пропорциональное количество клеток в Gl-2 фазе и S-фазе изменялось в сторону смещения S-фракции клеток и составило 72,5%:27,5%. Случаев JIMC с низкой активностью BrdU было около трети (30,5%±4,2), а основная часть случаев характеризовалась умеренной либо выраженной степенью реакции.

Дифференциально-диагностическая значимость экспрессии Ki-67 была достаточно высокой и составила t= 184,4 при г=0,75 и р=0,0002, а дифференциально-диагностическая значимость BrdU-метки была также достаточно высокой и составила t=90,8 при г=0,59 и р=0,002. Рост активности белков носил линейный характер от JIM к JIMC.

При ЛМ экспрессия Ki-67 в случаях ЛМ митотически активной и атипической была значимо выше. При JIMC значимо большая степень экспрессии белка была выявлена в случае веретеноклеточной ЛМС (24,6±2,5%), а при эпителиоидной и с большим количеством многоядерных

клеток экспрессия белка была значимо ниже и не превысила 17,9%±1,9. Вместе с тем в случаях сарком с большим количеством многоядерных клеток количество клеток с гиперэкспрессией Кь67 было выше ЛМС эпителиодных и веретеноклеточных и составило 54,5±3,8 и 45,7±2,2% соответственно (р<0,05). Возможно, данная зависимость обусловлена тем, что в случае сарком с большим количеством многоядерных клеток большая часть позитивных к К¡-67 клеток (60,2±23,2%) находились в 02 фазе цикла, а не в в 1, когда экспрессия белка еще находилась в минимальном количестве. При веретеноклеточной саркоме активность была выше, но количество клеток в С1 было значимо ниже - 45,7±2,2%.

Сопоставление активности экспрессии Кь67 и ВгсШ-метки с рядом биомолекулярных маркеров при ЛМ показал ряд интересных взаимосвязей. Высокий уровень экспрессии белков коррелировал с высокой степенью продукции ВКМ, высокой активностью ЩФ и ПМЦР, большим количеством А§М(Ж (г=0,3 8-0,86, р<0,05). При ЛМС высокая активность белков ПА ассоциировалась со снижением синтетической функции клеток саркомы, низкой ПМЦР, но высокими показателями МДМ-параметров ядер клеток и гиперэкспрессией AgNOR (г=0,38-0,44, р<0,05).

Анализ кривых общей выживаемости больных с различными уровнями экспрессии Кл-67 и ВгсЮ-метки выявил достоверные различия в показателях между случаями с индексом Кь67 ЛМС до 16,6% и более порогового показателя и ВгсШ-мсткой до 6,3% и более. Общая выживаемость была почти в 4 раза ниже у пациентов с превышением пороговых показателей Кл-67 и ВгсЮ. Немаловажное влияние оказывала и степень экспрессии. Высокие уровни индекса пролиферации ЛМС следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Экспрессия белков-регуляторов апоптоза (Вс1-2 и р53). При поиске взаимосвязи экспрессии Вс1-2 и р53 с рядом важных клинико-морфологи-ческих параметров было выявлено, что при ЛМС высокий уровень Вс1-2 ассоциировался с репродуктивным возрастом больных ЛМС, малым размером неоплазии (до 7 см), более, чем одним опухолевым узлом и стадией заболевания I относительно II (г=0,39-0,7, р<0,05). Высокий уровень р53 ассоциировался с менопаузальным возрастом больных ЛМС, высокой степенью злокачественности и стадией процесса I. В то же время активность Вс1-2 не была связана с риском развития рецидива и метастаза ЛМС. Активность же р53 напрямую была связана с риском рецидивирования (при росте активности р53). При ЛМ высокая степень экспрессии белков ассоциировалась с размером ЛМ более 3,5 см., клинически быстрым ростом образования, одиночным узлом в теле матки и высокой митотической активностью ЛМ (г=0,39-0,67, р<0,05). В то же время гиперэкспрессия р53 сочеталась с сохранной репродуктивной функцией больных ЛМ, большим размером образования и быстрым ростом (г=0,41-0,47, р<0,05).

Случаев с негативной реакцией к Вс1-2 в миометрии ПЗ было порядка 15,3%. Активность в позитивных случаях независимо от степени

составила 60,4%, чаще реакция была диффузной с несколько большей выраженностью впериваскулярных зонах. Случаев с неяркой позитивной реакцией «+» было 59,7±3,3%, с реакцией «++» было 35,2±3,2%, а случаев с выраженной реакцией к BcJ-2 было порядка 5,1 ±1,4%. Несомненно, что наличие антиапоптотического белка в клетках миометрия являлось генетически и конституционально закрепленным механизмом защиты от физиологического апоптоза соматических клеток.

Экспрессии белка супрессора опухолей в перитуморозном НМ ИГХ способом выявить не удалось, вероятно, ввиду его ничтожно малого количества. Это являлось закономерным, так как в норме амплификации гена Тр53 и, соответственно, продукции белка wmp53 не должно быть в количестве, определяемом ИГХ способом.

В JIM случаев с негативной реакцией к Вс1-2 было 4,3±2,9%. Активность в позитивных случаях независимо от степени составила 70,6±3,1 %, что было значимо больше, чем в миоцитах ПЗ. Случаев с неяркой позитивной реакцией «+» и с выраженной реакцией «+++» к Вс1-2 было по 25,8±4,5%, с реакцией «++» было 48,4±5,2%. Вероятно, активность белка значимо возрастала в миомах в результате нарушения в процессах естественной гибели и развивающейся им моргал изации клеток в условиях опухолевого роста. В JIM случаев с негативной реакцией к р53 было 83,8%. Вместе с тем, активность белка в позитивных случаях составила 4,4±0,9%, а степень экспрессии в подавляющем большинстве случаев (88,9%) была низкой.

В JIMC случаев с негативной реакцией к Вс1-2 было 23,7±4,2%. Активность в позитивных случаях независимо от степени была значимо выше, чем в НМ и JIM и составила 78,3±2,2% (р<0,05). Случаев с неяркой позитивной реакцией «+» было значимо меньше, чем в НМ и JIM (17,6±3%), а случаев с выраженной экспрессией белка было значимо больше-45,2±4%. Вероятно, дальнейший рост активности белка с более интенсивной экспрессией в JIMC возникал в результате критических нарушений в процессах естественной гибели и развивающейся иммортализации клеток в условиях злокачественного опухолевого роста. JIMC в 46,9% случаев была негативна относительно р53. Вместе с тем в случае позитивной реакции мы отмечали значимый рост активности белка до 11,3±1,8% и появлением практически 20% случаев с гиперэкспрессией белка. Вероятно, рост активности и степени экспрессии белка возникал в результате активации системы каспазозависимого пути апоптоза в клетках JIM и JIMC. JIMC с большим количеством многоядерных клеток характеризовалась относительно большей степенью экспрессии Вс1-2 и р53 нежели другие типы.

Дифференциально-диагностическая значимость экспрессии Вс1-2 и р53 была невысокой и составила t=32,8 при г=0,22 и р=0,02. Вместе с тем рост активности р53 от JIM до JIMC носил линейный характер. Сопоставление активности экспрессии Вс1-2 и р53 с рядом биомолекулярных маркеров при JIM показал ряд интересных взаимосвязей. Высокий уровень

0,0 -'-'-4---■- 0,0

О 1000 2000 3000 4000 О 1000 2000 3000 4000

Дни Дни

Рис. 2. График кумулятивной выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от активности р53 в клетках ЛМС (а), график кумулятивной выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от активности Вс1-2 в клетках ЛМС (б).

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

экспрессии Bcl-2 при ЛМ ассоциировался с низкой продукцией ВКМ, высокой ПМЦР, большим количеством AgNOR, гиперэкспрессией Ki-67 и BrdU, позитивным рецепторным статусом ЛМ (г=0,36-0,57, р<0,05). Высокий уровень экспрессии р53 ассоциировался с высокой активностью ЩФ, высокой ПМЦР, небольшим количеством AgNOR, низкой BrdU-меткой и гиразной активностью (г=0,39-0,4, р<0,05).

При ЛМС высокий уровень экспрессии Bcl-2 был связан с низкой степенью продукции ВКМ, низкой BrdU-меткой и низкой гиразной активностью, позитивным рецепторным статусом (г=0,36-0,54, р<0,05). Гиперэкспрессия р53 ЛМС была связана с низкой активностью ЩФ, высокой Г1МЦР, высокими МДМ-параметрами, гиперэкспрессией AgNOR, низкой BrdU-меткой, высокой активностью Topo Па и отсутствием ядерной транслокации HSP70 (г=0,39-0,4, р<0,05).

Анализ кривых общей выживаемости больных с различной экспрессией Вс!-2 выявил достоверные различия в показателях между случаями с позитивным (независимо от уровня) и негативным статусом Bcl-2. Общая 10-летняя выживаемости у пациентов с негативным статусом экспрессии Bcl-2 была 20±10,3%, а в случае позитивного статуса - 54,2±5,8%. Таким образом, негативный Bcl-2 статус клеток ЛМС следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

В противовес позитивности экспрессии для прогноза при гиперэкспрессии р53 10-летняя выживаемость была хуже практически в 8 раз (80±7,3% и 0), что позволяло считать наличие экспрессии р53 (и/или гиперэкспрессии) в клетках ЛМС необходимо считать этот параметр неблагоприятным фактором прогноза при ЛМС (рис. 2).

Экспрессии фермента-гиразы Topoisomerase Па. При анализе взаимосвязи высокой степени активности фермента-гиразы с рядом кли-

Исследуемый объект Экспрессия TopoIIa

Отрицательно Активность (М±ш)

Неизмененный миометрий 91,1%±8,4* 0,8%±0,05

Лейомиома БДУ 51,2%±3,8* 3,5%±0,7

Лейомиосаркома БДУ 5,1%±1,2* 21,8%±1,8

Примечание: * - р<0,05 в группах JTM и JIMC относительно НМ.

нико-морфологических параметров при JIM было выявлено, что только клинически быстрая скорость роста образования ассоциировалась с гиперэкспрессией (г=0,39). В то же время при JIMC высокий уровень активности Topo IIa был ассоциирован с менопаузальным возрастом больных JIMC, массивным опухолевым узлом, множественными узлами в теле матки, высокой степени злокачественности (G3), стадией процесса II по критериям FIGO (г=0,37 - 0,77). При росте активности фермента риск рецидивирования резко возрастал: г=0,40, р=0,003.

Практически в 91 % случаев в НМ активности Topo IIa не наблюдалось (табл. 7). Средний уровень активности фермента составил 0,8%±0,05, а степень экспрессии в 100% была слабой. В JIM случаев с негативной реакцией на фермент-гиразу было значимо меньше - 51,2±3,8%. Средний уровень экспрессии при этом был значимо выше, чем в НМ: 3,5±0,7%, степень экспрессии белка при этом практически в 85% была либо слабой, либо умеренной. J1MC в отличие от НМ и JIM характеризовалась позитивной экспрессией в 95% случаев с значимо более высокой активностью: 21,8%±1,8 при которой практически 80% случаев были с высокой либо умеренной степенью активности белка. Скачкообразное увеличение активности в ЛМС логично объяснялось ростом IIA, сопровождающейся в условиях злокачественного роста множественными топологическими нарушениями в процессе митотического цикла, требующими возрастающей активности фермента-гиразы.

При различных вариантах JIM значимых отличий выявлено не было. При анализе активности и степени экспрессии Topo IIa в JIMC различного гистологического типа было обнаружено, что статистически значимой разницы между различными вариантами опухоли в активности фермента не было, а диапазон был в пределах средних для саркомы цифр от 19,2% при верстеноклеточной саркоме, до 27,5% при эпителиоидной. В то же время, случаев с высокой степенью экспрессии белка было значимо больше при эпителиоидной ЛМС и с большим числом многоядерных клеток относительно веретеноклеточной.

Дифференциально-диагностическая значимость экспрессии фермента Topo IIa была достаточно высокой и составила t=66,8 при г=0,43 и р=0,03. Кроме того, рост активности гиразы от ЛМ до ЛМС носил линейный характер.

1,0 0.9 0.8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0.0

-более 21.8%

----менее 21.8%

1000 2000 3000 4000 Дни

Рис. 3. График кумулятивной выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от активности Topoisomerase IIa в клетках ЛМС.

Анализ корреляций экспрессии Topoisomerase IIa в клетках ЛМ показал ограниченное число взаимосвязей. Для гиперэкспрессии фермента были характерны небольшое количество AgNOR, относительно высокий уровень экспрессии Ki-67 и BrdU-метки с низкой активностью р53

При ЛМС гиперэкспрессия фермента ассоциирована с низкой синтетической функцией клеток саркомы, высокой метаболической активностью, большой площадью ядер опухолевых клеток, амплификацией рибосомальных белков, высокой экспрессией К1-67 и В^и-меткой, низким уровнем экспрессии Вс1-2 и, в противоположность, гиперэкспрессией р53, ядерной траснлокацией Н8Р70 и негативным рецепторным статусом

Анализ кривых общей выживаемости больных с различной экспрессией Topoisomerase На выявил достоверные различия в показателях между случаями с допороговым уровнем экспрессии фермента (21,8%) и при превышении этого показателя. Общая 10-летняя выживаемость больных ЛМС с гиперэкспрессией белка была 10%±5,4 против 57,1%±6,2 при низком уровне (рис. 3). Экспрессию гиразы в клетках ЛМС, превышающую 21,8%, следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Экспрессия молекулярного шаперона Н8Р70. По нашим данным, белок теплового шока 70 в миометрии ПЗ экспрессировался в 86,2% случаев, в 13,8% случаев белок не выявляли. Преимущественным типом расположения его в клетке было ядерно-цитоплазматическое (52,6±3,4%), в трети случаев белок локализовался в цитоплазме, а ядерно-ядрышковой реакции, ядерной или смешанных форм не было обнаружено ни в одном случае (табл. 8). Вместе с тем в случаях с позитивной реакцией ядерная транслокация была выявлена практически в 50% случаев. Тем не менее,

(г=0,38-0,77).

(г=0,38 - 0,69, р<0,05).

Характеристика реакции Неизмененный миометрий Лейомиома Лейомиосаркома

Тип Негатив 13,8%±2,1 — 6,2%±1,7

Цитоплазма Э3,6%±2,9 12,8%±3,4 10,8%+2,2

Я/Ц 52,6%±3,4 61,8%±5 36,9%±3,4

Ядро — — 3,1%±0,9

Я/Я — 25,4%±4,1 41,5%±3,6

Смешанная — — 1,6%±0,5

Транслокация Негатив 49,8%±3,1 12,8%±3,4 15,3%±2,5

Полная 1,1%±0,6* 25,5%±4,1* 38,5%t3,4*

Частично 49,1%±3 61,7%±5 46,2%±3,7

Примечание: * - р<0,05 в группах полной транслокации НМ от JIM и JIMC.

полная транслокация белка в ядро была вьгявлена всего в 1,1% случаев, частичная транслокация была обнаружена в 49,1% случаев.

Вероятно, наличие экспрессии HSP70 в НМ с относительно высокими цифрами частичной транслокации могло служить индикатором процессов напряженности в балансе апоптоз/антиапоптоз с возможным последующим блокированием каспазо зависимого пути апоптоза, опосредованным молекулярным шапероном 70. В JIM случаев с отсутствием экспрессии белка не было отмечено. Тип локализации белка в клетке был преимущественно ядерно-цитоплазматический 61,8±5%, что практически соответствовало миометрию ПЗ. В то же время, практически в 25,4±4,1% случаев была выявлена ядерно-ядрышковая локализация белка, которая в миометрии не встречалась вовсе. Цитоплазматическая реакция HSP70 была выявлена в 12,8±3,4%.

Знание функциональных характеристик белка позволяет предположить, что появление ядерной транслокации в JIM в отличие от НМ могло приводить к антиапоптотическому процессу и дальнейшей прогрессии опухоли.

ЛМС характеризовалась широким спектром типов экспрессии HSP70. В 6,2±1,7% случаев экспрессии белка не наблюдали, в 3,1 ±0,9% белок локализовался только в ядре. Чисто цитоплазматическая локализация была выявлена в 10,8±2,2%. Основная масса случаев характеризовалась наличием ядерно-цитоплазматической реакции (36,9±3,4% случаев) и ядерно-ядрышковой локализацией белка - 41,5±3,6% случаев. Полная транслокация белка в ядро в отличие от миометрия ПЗ и JIM встречалась значимо чаще и составила 38,5±3,4%. Частота ядерно-ядрышковой локализации белка и ядерной транслокации была значимо выше, чем в JIM и перитуморозном миометрии, что говорило о потере равновесия гомеостаза апоптотических белков и логично вытекающим последствием в виде блокирования апоптоза при ЛМС. Частота встречаемости ядерной транслокации белка практически не зависела от гистологического типа

JIM и JIMC. Дифференциально-диагностическая значимость экспрессии белка и его транслокации в ядро не обладала какой-либо значимостью.

Ядерная транслокация белка в клетках JIM ассоциировалась с суб-мукозной и интрамуральной локализацией опухоли, одиночным узлом в теле маггки, высокой митотической активностью (г=0,36-38). При J1MC ядерная транслокация белка коррелировала с размером саркомы более 7 см. занимающим более 2 анатомических отдела матки, множественностью узлов в теле матки, степенью злокачественности G3 и II стадией процесса (г=0,33 - 0,47, р<0,05).

Ядерная транслокация HSP70 являлась достаточно автономным параметром и не коррелировала с большинством биомолекулярных показателей при JIM. Вместе с тем было выявлено, что транслокация чаще ассоциировалась с низкой продукцией ВКМ, высокой активностью ЛДГ, преобладанием нуклеолярного кластера аргирофильных белков в ядре и относительно высоким индексом K.i-67 (г=0,36 - 0,49, р<0,05).

При JIMC ассоциации с ядерной транслокацией белка носили еще более ограниченный характер и коррелировали с высокой активностью Topo IIa и позитивным рецепторным статусом опухоли (г=0,39, р<0,05).

Анализ 10-летней выживаемости в зависимости от локализации HSP70 в клетках JIMC выявил неблагоприятное воздействие на прогноз ядерной транслокации: прогноз ухудшался практически в 4 раза при полной ядерной транслокации белка (15,4±5,7% против 75± 12% при отсутствии транслокации). Наличие ядерной транслокации в клетках JIMC следует считать прогностически неблагоприятным фактором 10-летней выживаемости.

Рецепторпый статус (по уровню экспрессии РП и РЭ а). При JIMC взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами была определена для РП и РЭ в равной пропорции. Позитивный рецепторный статус был характерен для больных репродуктивного возраста, небольшого размера JIMC, низкой степени злокачественности (Gl), стадии процесса I (г=0,39 - 0,56; р<0,05). Позитивный РП статус опухоли нашел отражение в риске развития рецидивов: при негативном рецепторном статусе рецидив развивался в 30,8%±10,4, а при безрецидивном варианте течения практически 55% случаев были с позитивным РП статусом. Была выявлена слабая положительная корреляция позитивности РП и фактора рецидивирования (г=0,36; р=0,01). Сопоставление рецепторного статуса JIM с клинико-морфологическими параметрами выявило ряд интересных взаимосвязей. Ассоциация клинико-морфологических параметров с позитивным статусом в большей степени была характерна для РЭ, чем для РЭ. Позитивный РЭ-статус был характерен для репродуктивного возраста, опухоли менее 3,5 см., клинически медленного роста, субмукозной локализацией и для одиночного узла (г=0,38 - 0,68; р<0,05).

Анализ рецепторного статуса и характера экспрессии РП и РЭ в НМ Г13, JIM и JIMC без уточнения гистологического типа показал, что НМ в 77,8±2,5% случаев был позитивен относительно РП и в 30,7±2,8% отно-

Гистологический тип JIM Рецепторный статус

Позитивность РП Позитивность РЭ Коэкспрессия

Неизмененный миометрий 77,8%±2,5* 30,7%±2,8* 85,4%±5,3*

Лейомиома БДУ 93,5%±2,5 73,6%±4,6 69,5%±5,9*

Лейомиосаркома БДУ 50%±3,5* 21,2%±2,9* 39,1%±4,2*

Примечание: * - значимые различия при р<0,05 в группе НМ от JIM и JIMC.

сительно РЭ (табл. 9). JIM значимо чаще была позитивна в отношении РП (93,5±2,5%) и еще более-относительно РЭ (73,6±4,6%). В JIMC случаев позитивных к РП было значимо меньше, чем в НМ и ДМ - 50±3,5%. Такая же тенденция была отмечена и при позитивности относительно РЭ — всего в 21,2±2,9% случаев выявляли позитивный рецепторный статус. Кроме того, в случаях, позитивных относительно рецепторов половых гормонов, коэкспрессия РП и РЭ в НМ ПЗ была отмечена в 85,4±5,3%. В JIM коэкспрессия была отмечена значимо реже - в 69,5±5,9% случаев, а в JIMC случаев с коэкспрессией рецепторов было еще меньше - 39,1 ±4,2% (табл. 9).

JIM в зависимости от гистологического типа имела свои особенности экспрессии рецепторов. Позитивность относительно РП была стабильно высока и варьировала в диапазоне от 83,3 до 100%, а значимых отличий выявлено не было. В то же время РЭ выявляли значимо реже, а диапазон позитивности был в пределах от 20 до 79,2%. Атипическая JIM характеризовалась значимо низкой позитивностью к РЭ: всего в 20±8,9% случаев РЭ выявляли в миомах такого типа относительно остальных.

JIMC тела матки в зависимости от гистологической структуры имела некоторые особенности относительно позитивности к РП и РЭ. Веретеноклеточная и эпителиоидная типы сарком не имели отличий ни в количестве позитивных случаев к РП, ни к РЭ (порядка 50% - рецепция прогестерона и 50% - эстрогена). В то же время вариант саркомы с большим числом многоядерных клеток значимо отличался от 2-х предыдущих типов: количество позитивных случаев к РП было 38,4±8,1%, а количество случаев с позитивной рецепцией к РЭ: 30,7±7,3%. Вместе с тем коэкспрессия рецепторов в зависимости от гистологического типа значимо не отличалась.

Дифференциально-диагностическая значимость экспрессии рецепторов прогестерона и эстрогена обладали достаточно высокой статистической значимостью с показателями г=0,48 и t=79,7 для РП и г=0,43 и t=76,9 для РЭ.

При сопоставлении рецепторного статуса с биомолекулярными параметрами клеток JIM и JIMC возможно было говорить, что и РП и РЭ были взаимосвязаны в равной пропорции. Было выявлено, что позитивный рецепторный статус JIM ассоциировался с высокой продукцией ВКМ,

низкой ПМЦР, невысокими МДМ параметрами, высокой экспрессией Кл-67 и В^и-меткой, низкими значениями Вс1-2 (г=0,42 - 0,52; р<0,05). Позитивный рецепторный статус клеток ЛМС был ассоциирован с избыточной продукцией ВКМ, низкой метаболической активностью с преобладанием аэробного пути, относительно высокой ПМЦР, низкими МДМ-параметрами, небольшим количеством А§Г4СЖ, относительно низким уровнем экспрессии Кь67 и В^Ц-метки, гиперэкспрессией Вс1-2, низким уровнем экспрессии фермента-гиразы и отсутствием ядерной транслокации белка НЯР70.

Анализ кривых выживаемости в зависимости от рецепторного статуса показал, что при позитивной реакции на РП и РЭ прогноз был значимо благоприятнее, чем при негативном статусе практически в 3-5 раз, причем при РП-негативном статусе прогноз был значимо неблагоприятней, чем при РЭ-негативном статусе. Таким образом, негативный рецепторный статус ЛМС следует считать неблагоприятным фактором прогноза.

Моделирование индивидуального прогноза

Общая выживаемость. Анализ выживаемости и взаимосвязь кли-нико-морфологических и биомолекулярных параметров с прогнозом является одним из важнейших показателей для формирования групп риска и наблюдения при злокачественных образованиях в целом и при ЛМС в частности.

Наши исследования показали, что 1-годичная выживаемость при ЛМС тела матки независимо от различных параметров составила 56,1±4,7%. В дальнейшем происходило ежегодное снижение выживаемости порядка на 4 - 5%, и, к моменту 5-летнего контроля, выживаемость составила 46,5%±7,1. Общая 10-летняя выживаемость при ЛМС тела матки не превысила 37,5±10,1% (рис. 4).

Степень злокачественности и прогноз. Анализ выживаемости больных ЛМС тела матки в зависимости от степени злокачественности по системе критериев, предложенной РЫСЬСС, показал, что при низкой степени злокачественности 1 -годичная выживаемость больных составила 86,6±3,5%, при а выживаемость аналогичного промежутка времени была значимо ниже: 58.8±6.8%, а при вЗ выживаемость была крайне низкой и составила 5,3±2,6%, причем до 5 лет не дожила ни одна заболевшая. 10-летняя выживаемость при в1 составила 81,3±5,6%, а при в2 была значимо меньше - 30±8,3% (£=42,5; р=0,0000) (рис. 5).

Гистологический тип и прогноз. Веретеноклеточная ЛМС характеризовалась достаточно стабильным умеренным прогнозом, и 10-летняя выживаемость составила 66,7±6,4%. Эпителиоидная ЛМС во временном диапазоне 1 -годичной выживаемости не отличалась значимо от веретено-клеточной, но 10-летняя выживаемость была значимо хуже (33,4±12,5%). В то же время наиболее худшим прогнозом характеризовалась ЛМС с

1,2 1.1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

Дни

Рис. 4. График общей кумулятивной 10-летней выживаемости по Каплан-Мейеру.

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

0 1000 2000 3000 4000

Дни

Рис. 5. График кумулятивной выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от степени злокачественности ГЫСЬСС.

большим числом многоядерных клеток, при которой годичная выживаемость не превысила 15,4±5,7%, а 10-летняя - 9,1±5% (х2=26,6; р=0,002).

Рецидивирование и прогноз. В группе с развитием рецидива опухоли до 10 лет не дожила ни одна больная, а 5-летняя выживаемость составила 22,2±12,7%. В то же время, в группе без рецидивирования процесса 5-летняя выживаемость была значимо выше и составила 75±6,3%, а до 10 лет дожило 54,2± 14,4% (^=28,7; р=0,000002).

Моделирование индивидуального прогнозирования исхода заболевания на основании многофакторного регрессионного анализа по Коксу. Для решения вопросов комбинированного (клинико-патомор-фологического и биомолекулярного) моделирования индивидуализации выживаемости больных ЛМС следовало решить роль и место в многофакторном анализе всех критериев в зависимости от статистической значимости и параметра у2 Ъ.

Исходя из многофакторного регрессионного анализа по Коксу, прогностическими статистическими независимыми факторами при значении

Таблица 10. Клинико-морфологические и биомолекулярные маркеры в индивидуализации прогноза при ЛМС (по данным многофакторного анализа независимых критериев прогноза)

Маркер Признак Баллы

AgNOR общее До 22,1 гранулы 0

Более 22,1 гранулы 9

AgNOR Нкл До 10,8 гранулы 0

Более 10,8 гранулы 9

Тип ядрышек кольцевидные 0

нуклеолонемные 9

Плоидность ядер До 9,4с 0

Более 9,4с 9

Topo lia интенсивность +,++ 0

+++ 3

Brdlí активность До 6,3% 0

Более 6,3% 3

CD31 ПЗ До 62,4 в 2мкм2 0

Более 62,4 в 2мкм2 9

Зрелость сосудов опухоли Преобладание зрелого ангиогенеза 0

Преобладание незрелого ангиогенеза 3

HSP70 тип реакции Цито плазматический, ядерно-цито плазматический 0

Ядерно-ядрышковый 3

Степень злокачественности по FNCLCC 0

С2 2

ОЗ 3

X2 более 35 в порядке убывания стали (табл. 10): плоидность клеток ЛМС (Х2 82,4); CD31 перитуморозной зоны (х2 73,4); количество AgNOR общее (Х2 59,9); количество AgNOR Нкл (х2 55,9); количество клеток в S-фазе цикла (BrdU-метка) (х2 48,9); степень злокачественности по FNCLCC (х2 42,5); зрелость сосудов опухоли (х2 38,8); тип реакции шаперона HSP70 (х2 3 8,8); степень экспрессии Topoisomerasella (х2 3 5,1); количество ядрьппек в ядрах нуклеолонемного типа (х2 39,5). Остальные критерии (развитие рецидива или метастаза, стадия по FIGO, возраст, размер опухоли, гисто-тип опухоли, ВКМ, ЩФ сосудов, тип ядрышек, площадь ядер, экспрессия Ki-67, р53, Вс1-2, BrdU-метка, ПМЦР опухоли были тесно связаны друг с другом и в многофакгорных математических системах индивидуализации прогноза при показателях до значения х2 до 5,6 не имели, хотя в анализе однофакторном они был вполне воспроизводимы.

В связи со степенью влияния критериев на выживаемость для основных параметров по аналогии с монофакторным анализом была введена

балльная система оценки, где меньшему значению (допороговому) как показателю благоприятного прогноза присваивался 0, а при превышении порогового значения цифры были поделены согласно значимости критерия X2 на две группы (см. табл. 10): 1) более 55,9 балла (максимальное количество баллов 9); 2) от 39 до 55 баллов (максимальное количество баллов 3). В дальнейшем высчитывали общий суммарный балл для каждого случая индивидуально. Для выделения отдельных групп риска в просчете регрессионного анализа по Коксу и для возможности рандомизации было выделено 3 диапазона баллов просчета: I - от 0 до 15 баллов; II - от 16 до 30 баллов; III - более 31 балла.

Анализ кривых у больных трех групп показал значимое различие 10-летней выживаемости во всех трех группах: в группе I отличие было относительно высоко и составило 90,3±3,1%, а до 10 лет дожило 82,3±5,3%. В группе II прогноз был значимо неблагоприятным, но относительно высоким: годичная выживаемость была 42,8±7,6%, а до 10 лет дожила практически только 1/5 часть больных (20±10,6%). Наихудший прогноз был в группе III, в которой до 10 лет дожило всего 5,1±3,4% (р<0,05 во всех группах).

Таким образом, анализ значимости по группам в рамках регрессионного анализа Кокса выявил значение х213 8,5, что было значимо выше всех представленных параметров и явилось предиктором прогноза. Исходя из этого, многофакгорный анализ с включением всего 10 морфологических параметров в оценке индивидуального прогноза показал высокую статистическую значимость и может стать основой моделирования индивидуального прогноза в комбинированной клинико-морфологической и биомолекулярной модели выживаемости у больных JIMC тела матки.

Дифференциальная диагностика JIM и JIMC, алгоритмизация решения с использованием клинических и биомолекулярных параметров. Одним из клинико-морфологических критериев, который в совокупности с патоморфологическими может быть значимым, стал количественный: при JIMC в 75% превалировал одиночный опухолевый узел. Основополагающим в вопросах дифференциальной диагностики JIM и JIMC являются морфологические методики с применением биомолекулярных маркеров. Для решения поставленной задачи провели анализ маркеров, которые либо тенденционно, либо прямо увеличивались от неизмененного миометрия к миоме различного строения и далее к лейомиосаркоме с градацией G1.

Исходя из полученных данных, стало возможным выделить всего лишь несколько параметров, при которых были выявлены ступенчатые изменения в виде увеличения либо уменьшения параметров, которые должны лечь в основу дифференциально-диагностического алгоритма: 1) митотическая активность (промилле, значимость и уровень надежности г=0,64, t=107); 2) ядрышки нуклеолонемного типа (абсолютное количество на 200 клеток, значимость и уровень надежности г=0,67, t=l 45,9); 3) метаболическая активность и профиль (абсолютное число гранул формазана с

Таблица 11. Алгоритм диф< юренциальной диагностики JIM и JIM С тела матки

Критерий Тип опухоли

Гиперплазия гпадкомышечная ЛМ лыси

Митотическая активность До 0,5%о 2%о-5%о 5%о-10%о

0 баллов 1-2 балл 2-3 балла

Ядрышки нуклеоло-немного типа До 0,1 0,1-0,2 >0,4

0 баллов 1 балл 2 балл

Метаболическая активность и профиль До 30 35-85 >85 с инверсией

0 баллов 1-2 балл 3 балла

АцТЯСЖ До 4 4-9 >10

0 баллов 1-2 балл 3 балла

Кл-67 До 3% 3-5,5% >6-10%

0 баллов I балл 2 балла

ВгсЮ До 0,2% 0,2%-0,7% >0,7%

0 баллов 1-2 балл 2 балла

р53 До 1,5% 1,5%-3% >4%

0 баллов 1 -2 балл 3 балла

Торсшотегазс Па До 1,5% 1,5%-3% >3%

0 баллов 1 -2 балл 2 балла

Сумма баллов 0 7-14 15 и более

соответствующим субстратом, значимость и уровень надежности г=0,84, t=207,3); 4) активность AgNOR (абсолютное число гранул серебра на 200 ядер обоих типов кластеров, значимость и уровень надежности г=0,8, t=221,2); 5) активность Ki-67 (процент, значимость и уровень надежности r=0,75, t=184,4); 6) BrdU-метка (процент, значимость и уровень надежности r=0,59, t=90,8); 7) активность р53 (процент, значимость и уровень надежности г=0,17, t=8,1); 8) активность Topoisomerase Па (процент, значимость и уровень надежности r=0,43, t=66,8).

Для уточнения типа опухоли по принципу лейомиома/лейомиосаркома с использованием всех изученных критериев был использован цифровой алгоритм исследования, который не учитывал тип миомы, но при определенной сумме баллов позволял точно высказаться в пользу злокачественности процесса.

Поскольку принцип постановки диагноза носил комплексный характер, количество суммы баллов от 7 до 14 возможно было считать JIM без уточнения гистологического типа (табл. 11). Мы можем также предположить, что изменения с суммой баллов до 7 с большей долей вероятности носили характер гиперпластических и не были связаны с нарушением пролиферации, апоптоза, изменений митохондриального метаболизма.

Такие случаи, возможно, были процессами, предшествующими процессам истинной опухоли. Случаи JIM с ростом количества баллов до 14 включительно, а, соответственно, и критическим ростом IIA, МА, изменением апоптотической функции и реаранжировкой рибосомальных генов можно было считать JIM, близкой по этим значениям к JIMC, что, вероятно, требует особого наблюдения этой категории больных.

Итак, применение комплекса исследований молекулярно-биологиче-ских характеристик позволило отойти от формализованной диагностики JIM и позволило выделить случаи с критическими изменениями опухолевых клеток с характеристикой глубоких нарушений в клетках JIM, требующих только радикального способа лечения.

ВЫВОДЫ

1. Кпинико-морфофункциональные характеристики лейомиомы тела матки были взаимосвязаны с репродуктивной функцией больных. Метаболическая активность клеток лейомиомы, количество AgNOR эндотелия сосудов и ядер клеток опухоли, морфоденситометрические параметры (плоидность и площадь ядер), пролиферативная активность (Ki-67 и BrdU-метка), экспрессия р53 и экспрессия РЭ клетками опухоли значимо выше при сохранной репродуктивной функции относительно периода менопаузы (г=0,36-0,7; р<0,05).

2. Размер лейомиомы взаимосвязан с активностью ЩФ сосудов (выше - в опухолях более 3,5 см, г=0,75; р=0,02), ПМЦР образования (выше - в опухолях более 3,5 см, г=0,7; р=0,004), количеством AgNOR эндотелия сосудов и ядер клеток опухоли (больше - в опухолях более 3,5 см, г=0,7; р=0,0001), плоидностью и площадью ядер клеток опухоли (рост в опухолях более 3,5 см, г=0,36; р=0,002), экспрессией Вс1-2 (уменьшение в опухолях более 3,5 см, г=0,79; р=0,004), экспрессией р53 (выше - в опухолях более 3,5 см, г=0,49; р=0,05), позитивным РЭ статусом (уменьшение в опухолях более 3,5 см, 1=0,75; р=0,0001).

3. Наиболее часто выявляли лейомиому интрамуральной локализации (63,1 ±5%), реже субмукозной (21,7±4,2%) и субсерозной локализации 15,2±3,7%. Клинико-морфофункциональные характеристики лейомиомы связаны с локализацией опухоли: выраженный фиброз характерен для субсерозных образований (г=0,49; р=0,001), высокая метаболическая активность и инверсия метаболического профиля с высокой активностью ЛДГ характерна для субмукозных образований (г=0,49; р=0,005), низкая активность трансмембранного фермента ЩФ характерна для субсерозной и интрамуральной опухоли (i=0,78; р=0,00002), высокая ПМЦР характерна для субмукозных и интрамуральных образований (г=0,7; р=0,001), высокая экспрессия Ki-67 и BrdU-метка характерны для субмукозных образований (г=0,84; р=0,003), позитивный РЭ статус характерен для субсерозных и субмукозных образований (г=0,38; р=0,01).

4. Количество лейомиом было взаимосвязано с морфофункдиональ-ными характеристиками образования. Одиночный опухолевый узел в теле матки относительно множественной миомы характеризовался большим количеством AgNOR в ядрах клеток опухоли (г=0,84; р=0,00002), высокой экспрессией Ki-67 и BrdU-меткой (г=0,65; р=0,03), высокой ПМЦР (t=0,78; р=0,0004), высокой экспрессией Вс1-2 (г=0,67; р=0,001), более частой ядерной транслокацией HSP70 в одиночных узлах (г=0,36; р=0,05), позитивным РП и РЭ статусом (i=0,48; р=0,01) и низкой активностью ЩФ сосудов относительно одиночной опухоли (г=0,7; р=0,001).

5. Клинически быстрым ростом характеризовались 61,2% случаев лейомиом. Скорость роста была взаимосвязана с морфофункциональными характеристиками опухоли. Быстрорастущие опухоли характеризовались относительно высокой активностью ЩФ сосудов (г=0,36; р=0,04), высокими показателями плоидности и площади ядер лейомиомы (г=0,43; р=0,009), высокой ПМЦР (г=0,5; р=0,007), относительно большим количеством AgNOR ядер клеток опухоли (г=0,47; р=0,006), высоким индексом клеток в S-фазе клеточного цикла (i=0,46; р=0,00002), высокой экспрессией Вс1-2 и р53 (1=0,39-0,46; р<0,05), ростом экспрессии TopoIIa (г=0,39; р=0,04) и низкой экспрессией РЭ клетками опухоли (г=0,39; р=0,0009).

6. Лейомиосаркому тела матки в репродуктивный период выявляли в 43,9±5,2% случаев. Клинико-морфофункциональные характеристики саркомы были взаимосвязаны с репродуктивной функцией больных. Активность ЩФ сосудов, ПМЦР опухоли, количество AgNOR эндотелия сосудов и ядер опухолевых клеток, экспрессия Ki-67 и BrdU-метка, экспрессия р53 и TopoIIa клеток опухоли были значимо выше в период менопаузы (г=0,36-0,49; р<0,05). Экспрессия Bcl-2 и РП были ниже в период менопаузы относительно периода сохранной репродуктивной функции (г=0,39; р=0,04).

7. Размер лейомиосаркомы был взаимосвязан с общей метаболической активностью (НАДН2 выше в опухолях более 7 см., i=0,38; р=0,001), ПМЦР (выше - в опухолях до 7 см, г=0,46; р=0,000008), количеством AgNOR кариоплазматического кластера (выше - в опухолях до 7 см, г=0,36; р=0,04), экспрессией Вс1-2 (выше - в опухолях до 7 см, г=0,39; р=0,01), полной ядерной транслокацией HSP70 (чаще - в опухолях более 7 см, г=0,46; р=0,009), рецепторным статусом (РЭ чаще выявляются в опухолях до 7 см, г=0,44; р=0,001).

8. Лейомиосаркому интрамуральной локализации выявляли в 51,5±3,5% случаев, реже диагностировали саркому субмукозной (16,7±2,6%) и субсерозной локализации (6,1%±2,8). Опухоль с массивным характером роста выявляли в 25,7±3,1 %. Локализация опухоли коррелировала с некоторыми морфофункциональными характеристиками: ПМЦР выше в субмукозных лейомиосаркомах (г=0,36; р=0,001), МДМ параметры выше в массивных опухолевых узлах (г=0,36; р=0,03), экспрессия Ki-67, Topo Иа и BrdU-метка выше в массивных узлах (г=0,37-0,42; р<0,05), полная ядерная транслокация HSP70 чаще выявляется в массивных узлах (г=0,31; р=0,05).

9. Одиночные лейомиосаркомы выявляли в 89,4±2,2% случаев, а множественные - в 10,6±2,1%. Количество опухолевых узлов было взаимосвязано с морфофункциональными характеристиками опухоли: для одиночного узла характерен позитивный рецегггорный статус, высокая метаболическая активность опухолевых клеток, гиперэкспрессия Ki-67 и высокая BrdU-метка, чем при множественной саркоме (i=0,42-0,64; р<0,05). Для множественной лейомиосаромы тела матки характерны высокий уровень активности ЩФ сосудов, ПМЦР опухоли, плоидности и количества AgNOR ядер опухолевых клеток, гиперэкспрессия Topo IIa, полная ядерная транслокация HSP70 и снижение экспрессии Вс1-2 (г=0,38-0,7; р<0,05).

10. Морфофункциональные характеристики лейомисаркомы были взаимосвязаны со стадией заболевания. По мере роста стадии заболевания от I к II уменьшался фиброз опухоли, уменьшалась экспрессия р53 и снижалась экспрессия РП клетками опухоли (г=0,35-0,42; р<0,05). ПМЦР саркомы, количество AgNOR эндотелия сосудов и ядер клеток опухоли, активность ЩФ сосудов, МДМ параметры, экспрессия Ki-67, Brdu-метка, экспрессия Topo IIa и частота полной транслокации HSP70 возрастали конкордантно стадии процесса (г=0,46-0,49; р<0,05).

11. Степень злокачественности лейомиосаркомы была взаимосвязана с морфофункциональными характеристиками опухоли. При увеличении степени злокачественности происходил сонаправленный рост метаболической активности с преобладанием анаэробного пути метаболизма клеток саркомы (г=0,56; р=0,0001), плоидности и площади ядер клеток, количества AgNOR в ядрах клеток опухоли, экспрессии р53, Ki-67, BrdU-метки и Topo IIa с увеличением частоты ядерной транслокации HSP70 (г=0,37-0,41; р<0,05). Рост степени злокачественности был сопряжен с сонаправленным уменьшением ПМЦР саркомы, экспрессии Вс1-2 и экспрессии РП и РЭ (г=0,42-0,56; р<0,05).

12. Основными высокоспецифичными маркерами дифференциальной диагностики лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки низкой степени злокачественности являются морфофункциональные характеристики, объединенные в общий алгоритм исследования. Для лейомиомы характерны: МА до 9%о (г=0,56; р=0,003), количество ядрышек нуклеолонемного типа до 0,3 (г=0,67; р=0,04), активность НАДН2 до 85 гранулы формазана без инверсии метаболического профиля (г=0,84; р=0,0001), число AgNOR до 10 гранул кариоплазматического и нуклеолярного кластеров (г=0,73; р=0,003), экспрессия Ki-67 до 10% (г=0,75; р=0,003), экспрессия р53 до 4% (г=0,43; р=0,05), число клеток в S-фазе цикла до 0,7% (г=0,59; р=0,01), активность Topoisomerase IIa до 3% (г=0,43; р=0,002). Лейомиому с пограничными показателями следует считать пролиферирующей с нарушениями процессов дифференцировки.

13. Рецидивирующее течение лейомиосаркомы с развитием местного рецидива и метастазирования в лимфоузлы и легкие выявляется в 19,7%±6,3 случаев лейомиосаркомы I-II стадии по критериям FIGO.

Клинически значимыми фактором риска развития рецидива и метаста-зирования являются: стадия процесса и массивный одиночный узел, занимающий более 1 гистоанатомической области тела матки (г=0,35, г=0,58; р=0,004, р=0,0002 соотв.). Факторами морфофункциональными, сопряженными с высокой частотой развития рецидива и метастазиравания лейомиосаркомы, являются: высокая активность ЩФ эндотелия сосудов опухоли (г=0,35; р=0,05), высокая ГТМЦР опухоли (75,2±5,3 на 2,1 мм2, г=0,37; р=0,02), высокие показатели накопления И ДНК и сдвигом гистограммы плоидности вправо в клетках опухоли (12,2±1,2, г=0,38; р=0,03), большое количество и кариоплазматическая реаранжировка AgNOR ядер клеток опухоли (30,3±2,1, 17,6±1,5, г=0,41-0,44; р=0,01-0,009), высокая экспрессия Ki-67 (32,3±4,3г=0,54; р=0,002) и BrdU-метка 6,5±1,3 (г=0,39; р=0,04), высокая экспрессия р53 (20,8%±3,2) без конкордатной экспрессии Вс1-2 (г-0,36; р=0,03), высокая экспрессия Topolla (35,3%±7,9, г=0,40; р=0,02), негативный РП статус образования (г=0,36; р=0,01).

14. В 19,7% случаев выявляли лейомиосаркому, характеризующуюся большим количеством многоядерных клеток в структуре опухоли, занимающих не менее 10% от общего объема неоплазии. Лейомиосаркома с большим количеством многоядерных клеток характеризовалась значимо отличными от других гистологических типов опухоли клинико-морфо-функциональными характеристиками в виде значимо неблагоприятного прогноза, слабовыраженного фиброза, высокой экспрессии Ki-67, BrdU-меткой, анеуплоидными значениями содержания ДНК ядер, высокой метаболической активностью и инверсией метаболического профиля с преобладанием анаэробного пути метаболизма, большим количеством AgNOR ядер клеток, гиперэкспрессией р53, высокой экспрессией Topolla, низким рецептор - позитивным статусом.

15. Общая 10-летняя выживаемость при ЛМС тела матки I - II стадии составила37,5± 10,1%, безрецидивная 31,1±5,6%, медиана-6,3 года. Неблагоприятными факторами 10-летней выживаемости при лейомиосаркоме тела матки при монофакгорном анализе являются: возраст больных старше 70 лет и менопауза (х2=35,9; р=0,003); стадия заболевания по FIGOII и более (х2=33,7; р=0,001); рецидивирующее течение заболевания (Z=-4,6; р=0,0003); размер неоплазии более 7 см. (Z=-4,8; р=0,05); степень злокачественности G3 по критериям FNCLCC (х2=63,5; р=0,02); гистологический тип с большим количеством многоядерных клеток (%2=17,3; р=0,02); продукция ВКМ низкой степени (х2=26,8; р=0,04); высокая активность трансмембранного фермента ЩФ эндотелия сосудов (х2=12,4; р=0,003); количество AgNOR ядер клеток опухоли более 21.1 (Z=5,4; р=0,002); количество кольцевидного типа ядрышек до 0.9, а нуклеолонемного - более 1,2 (Z=l,l; р=0,00001); площадь ядер опухоли более 85.2 мкм2 (Z=3,l; р=0,0001); плоидность ядер саркомы с высокой степенью анеуплоидии более 9,4с (Z—7,3; р=0,0003); гиперэкспрессия Ki-67 более 16.9% (Z=-3,6; р=0,00001); BrdU-метка более 6.3% (Z=-4,5; р=0,001); уровень экспрессии

Bcl-2 менее 78.3% (x2=37,2; p=0,0001); отсутствие коэкспрессии белков BcI-2 и р53 в одной опухоли (х2=17,2; р=0,0001); гиперэкспрессия Topolla более 21.8% (Z=0,9; р=0,00001); негативный рецепторный статус опухоли (Z=-4,1 ; р=0,00004); ПМЦР перитуморозной зоны более 62.4 в 2 мм2 (Z=5,8; р=0,000001); незрелый тип сосудов опухоли (Z=3,8; р=0,00002); полная ядерная транслокация HSP70 (х2=57,7; р=0,05).

16. Индивидуальное прогнозирование выживаемости с формированием групп различной степени риска по неблагоприятному исходу включает критерии, имеющие ранг независимых при многофакторном регрессионном анализе: плоидность клеток неоплазии (х2=82,4; р=0,00003), ПМЦР перитуморозной ткани (х2=73,4; р=0,00000), активность аргирофильных белков области ядрышковых организаторов обоих типов кластеров (х2=59,9; р=0,02), количество клеток в S-фазе митотического цикла (х2=48,9; р=0,00001), степень злокачественности по критериям FNCLCC (¿2=42,5; р=0,0001), зрелость сосудов опухоли (х2=38,8; р=0,00002), тип реакции шаперона HSP70 (х2=38,2; р=0,00000), активность гиразы Topoisomerase IIa (х2=48,9; р=0,00003). Предиктором прогноза следует считать показатель плоидности опухолевых клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Авдалян A.M., Зорькин В.Т., Климачева Т.Б., Самуйленкова О.В., Мищенко Е.В., Морфофункци-ональная характеристика ядрышковых организаторов клеток гладкомышечных новообразований матки // Сибирский онкологический журнал.

- 2006. - Приложение № 3 (19). - С. 86.

2. Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Авдалян A.M., Бобров И.П., Зорькин В.Т., Климачева Т.Б. Возможности применения компьютерного анализатора изображения в дифференциальной диагностике гладкомышечных опухолей тела матки // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - Приложение № 3 (19). - С. 113-114.

3. Мищенко Е.В., Климачева Т.Б., Авдалян A.M., Климачев В.В., Бобров И.П., Лазарев А.Ф. К вопросу о гладкомышечной дисплазии в различных типах лейомиом // Материалы конференции Международный конгресс «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии». -Москва, 2006.-С. 136-137.

4. Бобров И.П., Климачев В.В. Авдалян A.M., Мищенко Е.В., Климачева Т.Б., Лазарев А.Ф. Морфофункциональная характеристика ядрышковых организаторов клеток неизмененного миометрия и гладкомышечных опухолей тела матки // Материалы конференции Международный конгресс «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии».

- Москва, 2006. - С. 76-77.

5. Авдалян А.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Гладкомы-шечная дисплазия в различных типах лейомиом тела матки // Материалы ÍV съезда онкологов и радиологов СНГ. - Баку, 2006. - С. 34.

6. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Амплификация ядрышковых организаторов в клетках неизмененного миометрия и в гладкомышечных опухолях матки // Материалы II съезда Российского общества патологоанатомов. - Москва, 2006. - С. 330.

7. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Зорькин В.Т., Мищенко Е.В., Климачева Т.Б., Лазарев А.Ф. Метаболическая активность гладкомышечных клеток при различных вариантах лейомиом тела матки по данным исследования НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ // Вопросы онкологии.

- 2007. - Приложение № 1. - С. 4 -5.

8. Бобров И.П., Климачев В.В., Авдалян A.M., Мищенко Е.В., Климачева Т.Б., Лазарев А.Ф. Морфофункциональная характеристика ядрышковых организаторов клеток гладкомышечных новообразований матки: клинико-морфологические параллели, дифференциальная диагностика // Вопросы онкологии. - 2007. - Приложение № 1. - С. 12.

9. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Гистохимический анализ гладкомышечных клеток лейомиомы матки и неизмененного миометрия // Материалы конференции «Современные проблемы клинической цитологии». Всероссийская конференции с международным участием памяти О.К.Хмельницкого. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 37-38.

10. Бобров И.П., Авдалян A.M., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Определение активности рибосомальных генов методом серебрения при лейомио-мах матки: клинико-морфологические сопоставления // Материалы конференции «Современные проблемы клинической цитологии» Всероссийская конференции с международным участием памяти О.К.Хмельницкого.

- Санкт-Петербург, 2007. - С. 40.

11. Климачев В.В., Авдалян A.M., Лазарев А.Ф., Бобров И.П., Самуй-ленкова О.В., Мищенко Е.В. Диагностическая значимость экспрессии белка Ki-67 в гладкомышечных опухолях тела матки // Материалы конференции XI Российский онкологический конгресс с международным участием. Москва. -20-22 ноября 2007. - С.ЗЗО

12. Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Климачева Т.Б., Са-муйленкова О.В., Мищенко Е.В. Состояние аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов в ядрах клеток лейомиомы различного строения и лейомиосаркомы // Материалы конференции «XI Российский онкологический конгресс с международным участием». - Москва, 2007. -С. 332.

13. Авдалян А.М, Бобров И.П., Климачев В.В., Самуйленкова О.В., Лазарев А.Ф. Особенности строения микроциркуляторного русла и активность рибосомальных генов при лсйомиомах матки // Материалы конференции Профилактика и лечение злокачественных новообразований в

современных условиях. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. - Барнаул, 2007. - С. 57.

14. Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Мищенко Е.В. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ, рибосомальных белков и развитие микроциркулярного русла в гладкомышечных опухолях матки: клинико-морфологические параллели и дифференциальная диагностика // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - № 5 (29). - С. 41-45.

15. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Коадап-тация ферментных систем и уровня кровоснабжения в гладкомышечных опухолях тела матки. // Вопросы онкологии. - 2008. - №5. - С. 606-610.

16. Бобров И.П., Авдалян A.M., Лазарев А.Ф.,Климачев В.В., Клима-чева Т.Б., Мищенко Е.В. Морфофункциональная характеристика белков областей ядрышковых организаторов при гладкомышечных опухолях матки // Архив патологии. - 2008. - № 3. - С. 18-23.

17. Авдалян А.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Концепция гладкомышечной дисплазии в процессе канцерогенеза в неэпителиальных опухолях тела матки // Вопросы онкологии. - 2008. - Приложение №2.-С. 12.

18. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Состояние микроциркуляторнош русла в гладкомышечных опухолях тела матки // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. - Ташкент, 2008. — С. 55.

19. Avdalyan A.M., Lazarev A.F., Bobrov I.P., Klimatchev V.V. Activity of topoisomerase II in leiomyosarcoma uteri is one of probable ways of development of neoplastic process // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск, 2008. - С. 32-33.

20. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Морфофункциональная характеристика гладкомышечных новообразований маггки по амплификации ядрышковых организаторов // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. - Ташкент, 2008. - С. 64.

21. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Дифференциально - диагностическое и прогностическое значение исследования активности ядрышкового аппарата клеточного ядра при предраковых заболеваниях и опухолевом росте // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. - Барнаул, 2008. - С. 89.

22. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Дифференциально - диагностическое и прогностическое значение исследование нуклеологенеза при предраковых заболеваниях и опухолевом росте // Материалы Всероссийской научно-практической патологоанатомической конференции. - Миасс, 2008. - С. 46.

23. Avdalyan A.M., Lazarev A.F., Bobrov I.P., Klimatchev V.V. Peculiarities of metabolic activity of leiomyosarcoma uteri by the level of NADPH-dependent enzymes content // European Journal of cancer supplements. - 2008. - Vol.5. - № 4. - P. 1175-1176.

24. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Прогностическое значимость системы регуляции апоптоза при лейомиосаркоме тела матки по данным амплификации генов р53 и BCL-2 // Материалы конференции XII Российский онкологический конгресс. -Москва, 2008.-С. 198.

25. Бобров И.П., Авдалян A.M.,, Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Экспрессия аргирофильных белков области ядрышковых организаторов - как один из морфологических критериев прогноза при лейомиосаркоме тела матки // Материалы конференции XII Российский онкологический конгресс. - Москва, 2008. - С. 176.

26. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Чечулин М.Н. Связь экспрессии рецепторов к прогестерону и эстрогену а и активность аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в гладкомышечных опухолях тела матки // Архив патологии. - 2009. - № 4. - С. 50-54.

27. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Стабилизирующее действие рецепторов половых гормонов на пролиферативную активность и состояние системы апоптоза при злокачественных гладкомышечных опухолях тела матки // Вопросы онкологии. - 2009. - Приложение № 2. - С. 12.

28. Бобров И.П. Авдалян A.M., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Прогностическое значение исследования ядрышковых организаторов при раке желудка и лейомиосаркоме тела матки // Вопросы онкологии. -2009. - Приложение № 2. - С. 14.

29. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Иммуногистохимическое исследование клеток, синтезирующих ДНК (s — фракция) вдоброкачественных и злокачественных гладкомышечных опухолей тела матки по данных бромдезоксиуридиновой метки // Материалы Всероссийской конференции с международным участием Научные чтения памяти O.K. Хмельницкого. - Санкт - Петербург, 2009. - С. 4

30. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Значение некоторых молекулярно—биологических параметров в дифференциальной диагностике лейомиом с неясном злокачественном потенциалом и лей-омиосарком тела матки и их прогностическая значимость. // Материалы Всероссийского съезда патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии». Самара - 28-30 мая 2009. - с.51-53.

31. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Активность Topoisomerasell клеток лейомиосаркомы тела матки - как один из важных критериев выбора комбинированного лечения // Материалы конференции XIII Российский онкологический конгресс с международным участием. - Москва, 2009. - С. 360-361

32. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Экспрессия рецепторов прогестерона и эстрогена в гладкомышечных клетках лейомиосаркомы тела матки как один из важных критериев 10-летней вы-

живаемости. // Материалы конференции XIII Российский онкологический конгресс с международным участием. - Москва, 2009. - С. 362-363.

33. Авдалян A.M., БобровИ.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Иммуногистохимическое исследование клеток, синтезирующих ДНК (S-фракция) в доброкачественных и злокачественных гладкомышечных опухолях тела матки по данным бромдезоксиуридиновой метки // Материалы конференции Научные чтения памяти O.K. Хмельницкого. - Санкт-Петербург, 2009. - С.48.

34. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев А.Ф. Значение некоторых молекулярно-биологических параметров в дифференциальной диагностике лейомиом с неясном злокачественном потенциалом и лейомиосарком тела матки и их прогностическая значимость // Материалы конференции Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные вопросы патологической анатомии».

- Самара, 2009. - С. 54.

35. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Чечулин М.Н., Лазарев

A.Ф. Иммуногистохимическое исследование активности TopoIIa и бромо-дезоксиуридиновая метка — новое слово в диагностике и прогнозировании течения лейомиосаркомы тела матки // Сибирский онкологический журнал.

- 2009. - Приложение № 2. - С. 11 -12.

36. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Ангиоге-нез опухоли и перитуморозной зоны: все ли вопросы решены? // Вопросы онкологии. - 2010. - Приложение № 2. - С. 10.

37. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Мищенко Е.В. Лейомиосаркоматела матки: некоторые молекулярно-биологические критерии прогноза // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 1 (37). - С. 45-49.

38. Авдалян А.М, Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Экспрессия рецепторов половых гормонов и активность аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в клетках неизмененного миометрия и лейомиоме тела матки // Морфология. - 2010. - № 2. - С. 23-29.

39. Бобров И.П., Авдалян A.M., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд

B.Я., Долгатов А.Ю., Самуйленкова О.В., Ковригин М.В., Кобяков Д.С. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах II Архив патологии. — 2010. — № 3. -С. 35-37.

40. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Кру-глова Н.М. Прогностическое значение исследования плотности сосудов микроциркуляторного русла в опухоли и перитуморозной зоне по данным выявления белка CD31 и количества аргирофильных белков области ядрышкового организатора (AgNOR) в эндотелии при лейомиосаркоме тела матки // Фундаментальные исследования. - 2010. - № 5. - С. 12-20.

41. Кобяков Д.С., Бобров И.П., Авдалян A.M., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов в адено-

мах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки // Архив патологии. - 2010. - № 4. - С. 16-20.

42. Бобров И.П., Авдалян A.M., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Брюханов В.М., Дорошенко B.C., Гервальд В.Я., Долгаггов А.Ю., Ковригин М.В. Модифицированный метод выявления аргирофильных белков области ядрышкового организатора // Морфология. - 2010. - № 2. - С. 26-28.

43. Мищенко Е.В., Григорьева Е.Е., Климачев В.В., Климачева Т.Б., Авдалян А. М. Клинико-морфологические особенности клеточной лейомиомы тела матки II Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - №6. - С. 62-66.

44. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Опухолевый ангиогенез как прогностический маркер при операбельной лейомиосаркоме тела матки // Материалы конференции Российской научно-практической конференции с международным участием. - Барнаул, 2010.-С. 43.

45. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Активность Topoisomerase Пб и уровень пролиферативной активности по степени бромдезоксиуридиновой (Brdu) метки в лейомиосаркоме тела матки // Архив патологии. - 2011. - № 1. — С. 24-29.

46. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Чечулин М.Н. Прогностическая значимость определения степени злокачественности по системе FNCLCC и экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла при лейомиосаркоме тела матки // Российский онкологический журнал. - 2011. - № 1. - С. 17-20.

47. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Экспрессия рецепторов половых гормонов в лейомиоме с неясным злокачественным потенциалом и лейомиосаркоме тела матки: дифференциальная диагностика, прогностическая значимость // Вопросы онкологии. - 2011. - № 6. - С. 26-30.

48. Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Индивидуальный прогноз при лейомиосаркоме тела матки I и II стадии (по критериям FIGO): комбинированная биомолекулярная и клинико-морфологическая модель 10-летней выживаемости // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - № 5 (47). - С. 29-34.

49. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Круглова Н.М. Гиразная активность (по уровню Topoisomerase Нб) и количество клеток в S-фазе клеточного цикла (по данным бромдезоксиуридиновой (BrdU) метки) в лейомиосаркоме тела матки // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 3. - С. 28-35.

50. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Круглова Н.М. Лейомиосаркоматела матки с большим количеством многоядерных клеток: клинико - морфологические и биомолекулярные характеристики, прогноз и проблемы классификации // Фундаментальные исследования. -2011.-№6.-С. 13-17.

51. Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Авдалян A.M., Лубенников В.А. Тучные клетки и опухолевый рост // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - № 4 (46). - С. 59-63.

52. Авдалян A.M., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Экспрессия рецепторов половых гормонов в лейомиоме с неясным злокачественным потенциалом и лейомиосаркоме тела матки: дифференциальная диагностика, прогностическая значимость // Вопросы онкологии. -2011. -№ 6. - С. 742-747.

53. Авдалян А.М, Лазарев А.Ф., Круглова Н.М. Молекулярно-биоло-гические параметры и прогноз лейомиосаркомы тела матки с большим количеством многоядерных клеток// Российский онкологический журнал. - 2012. - № 1. - С. 23-28.

54. Avdalyan A., Lazarev A., Bobrov I., Klimatchev V. Prognostic Value of Microvessel Density in Tumor and Peritumoral Area as Evaluated by CD31 Protein Expression and Argyrophilic Nucleolar Organizer Region Count in Endothelial Cells in Uterine Leiomyosarcoma // Sarcoma. - Volume 2012, Article ID 594512,12 pages doi: 10.1155/2012/594512

55. Авдалян A. M., Круглова H.M., Лазарев А.Ф. Молекулярно-биоло-гические параметры и прогноз лейомиосаркомы тела матки с большим количеством многоядерных клеток// Онкология. Журнал им. П.А.Герцепа. - 2012. - № 1. - С. 24-27.

56. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян A.M., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих JI.M. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией плоско клеточного рака легкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 7. - С. 93-97.

Соискатель

А.М.Авдалян

Подписано в печать 14.06.2013. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 62. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

13-11298

2013074461

2013074461