Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологические закономерности организации паренхимы семенников при нарушении внегипоталамической регуляции

На правах рукописи

дг^іг

СЛЕСАРЕВА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ПАРЕНХИМЫ СЕМЕННИКОВ ПРИ НАРУШЕНИИ ВНЕГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

14.03.02 — патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

005533100 19 СЕН 2013

Ульяновск, 2013

005533100

Работа выполнена на кафедре морфологии в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки РФ.

Официальные оппоненты:

Кактурский Лев Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент Российской академии медицинских наук, ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, директор.

Федорина Татьяна Александровна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, кафедра общей и клинической патологии: патологическая анатомия, патологическая физиология, заведующая кафедрой.

Мозеров Сергей Алексеевич — доктор медицинских наук, профессор Обнинского института атомной энергетики - филиала федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», кафедра морфологии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения РФ.

Защита состоится « 10 » октября 2013 года в «11» часов «00» минут на заседании диссертационного совета Д 212.278.06 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, Набережная реки Свияги, 106, корп. 1, аудитория 703

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке УлГУ, с авторефератом — на сайте http: //vak.ed.gov.ru

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Управление научных исследований УлГУ

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Хайруллин Радик Магзинурович

М.А. Визе-Хрипунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Научные проблемы охраны репродуктивного здоровья являются приоритетными в отечественной медицинской науке и здравоохранении. Система оказания помощи мужчинам с патологией репродуктивной системы в настоящее время находится в стадии своего становления, что диктует актуальность и востребованность фундаментальных исследований, посвященных этому вопросу.

Репродуктивная функция у человека и большинства млекопитающих скоординирована с уровнем освещенности окружающей среды. Изменение естественного фоторежима и искусственное продление его световой фазы, свойственное современному образу жизни, приводит к различным патологическим реакциям, включая сердечно-сосудистые, онкологические заболевания, психические расстройства (Баркова Э.Н., 2002; Арушанян Э.Б., 2002; Анисимов В.Н., 2007). Достоверные сведения о влиянии светового режима на функционирование мужской репродуктивной системы в течение суток отсутствуют. Наименее изученными при этом остаются регуляторные механизмы циклической организации сперматогенеза и патоморфологические изменения, возникающие в гонадах при их нарушениях.

Как следует из имеющихся к настоящему времени работ, наиболее вероятным синхронизатором активности гонад с фазами фотопериода является эпифиз, продуцирующий мелатонин и группу биологически активных пептидов. Данные о влиянии эпифиза на репродуктивную систему носят односторонний характер и отражают преимущественно роль эпифиза в формировании репродуктивной функции в онтогенезе и ее сезонных изменениях у животных (Goldman B.D., 1991). Участие эпифиза в регуляции суточного ритма уровня гипофизарных гормонов и тестостерона в крови (Bonnefond С. et al., 1989; Esquifino A.I. et al,, 1998), позволяют предполагать

наличие суточного ритма морфологической организации семенников, однако какие-либо данные подтверждающие этот факт отсутствуют.

Помимо эндокринной, нервная система также участвует в регуляции репродуктивной функции. Известно о значительных нарушениях морфологии гонад при травмах спинного мозга и периферических проводников (Spinal cord injury..., 2011). Однако данные о хронопатологии мужских гонад при нарушении периферической иннервации практически отсутствуют.

Таким образом, изменения пространственно-временной организации семенников при нарушении эпифизарной и нервной регуляции является актуальной проблемой эксперментальной морфологии. Решение этой проблемы представляет значительный практический интерес для разработки подходов и методов фармакологической коррекции патологии сперматогенеза, обусловленной нарушениями его нейро-эндокринной регуляции.

Настоящее исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, госконтракт №П1056 Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 г».

Цель исследования: установить закономерности патоморфологических проявлений в паренхиме семенников при нарушениях эпифизарной и нервной регуляции.

Задачи исследования:

1) исследовать пространственно-временную организацию паренхимы семенников и ритм активности ферментов-индукторов апоптоза половых клеток у интактных белых крыс;

2) выявить патоморфологические изменения пространственно-временной организации паренхимы семенников белых крыс после эпифизэктомии;

3) изучить патоморфологические изменения пространственно-временной организации паренхимы семенников белых крыс после односторонней денервации.

4) выявить компенсаторные возможности паренхимы семенников эпифизэктомированных белых крыс на фоне введения биологически активных пептидов эпифиза;

5) исследовать компенсаторные возможности паренхимы семенников эпифизэктомированных белых крыс на фоне введения мелатонина.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование суточной структуры мужских гонад в норме и в условиях нарушения эпифизарной и периферической нервной регуляции. Дана развернутая морфологическая характеристика суточной структуры паренхимы семенников, выражающаяся в наличии суточного ритма пролиферации и дифференцировки созревающих половых клеток и коррелятивно связанной с ним суточной активности эндокринной ткани семенников. Впервые показано наличие циркадианного ритма активности ферментов-индукторов апоптоза созревающих половых клеток - прокаспазы 3 и полимеразы 1 поли(АДФ-рибозы) - ПАРП-1. Выявлены и описаны патоморфологические изменения в герминативной и эндокринной ткани семенников, возникающие после эпифизэктомии. Показан рост уровня активности ферментов - индукторов апоптоза (прокаспазы 3 и ПАРП-1) в сперматогенных клетках после эпифизэктомии. Определено участие пептидов эпифиза в восстановлении циркадианной структуры паренхимы семенников. Доказано отсутствие прямого регуляторного воздействия нервной системы на формирование циркадианных ритмов морфологической структуры паренхимы семенников. Выявлен значительный рост активности ферментов - индукторов апоптоза и ферментов, участвующих в репарации ДНК созревающих сперматогенных клеток, возникающий после односторонней денервации семенника.

Научно-практическая значимость работы. Выполненное исследование носит преимущественно фундаментальный характер и посвящено изучению патоморфологических изменений в суточной структуре семенников при нарушении некоторых звеньев гуморальной и нервной регуляции. Результаты настоящей работы формируют теоретические представления о пространственно-временной структуре паренхимы мужских гонад и показывают роль эпифиза в ее формировании. Разработанный метод эпифизэктомии у мелких лабораторных животных может быть применен в различных хронобиологических исследованиях. Доказанное участие олигопептидов эпифиза в формировании суточных ритмов пролиферации и дифференцировки мужских половых клеток и активности эндокринной ткани семенника указывает на необходимость разработки фармацевтических препаратов на основе эпиталамина с целью коррекции возникающих нарушений сперматогенной функции при десинхронозах. Отсутствие эффекта восстановления хроноструктуры паренхимы семенников от однократного в течение суток введения мелатонина обосновывает необходимость поиска пролонгированных форм введения мелатонина. Результаты исследования могут быть внедрены в учебный процесс при преподавании дисциплин «Патологическая анатомия» и «Гистология, эмбриология, цитология» в разделах «Патоморфология эндокринной системы», «Патоморфология мужской половой системы», «Компенсаторные процессы», «Эндокринная система», «Периферическая нервная система», «Мужская половая система».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эпифизэктомия приводит к нарушению пространственно-временной организации паренхимы и рассогласованию активности эндокринной и герминативной ткани в семенниках.

2. Денервация семенника угнетает пролиферативную активность сперматогенной ткани, стимулирует апоптоз и функциональную

активность клеток Лейдига, не нарушая суточного ритма их организации.

3. Введение олигопептидов эпифиза, в отличие от введения мелатонина, компенсирует патоморфологические изменения в пространственно-временной организации паренхимы семенников после эпифизэктомии.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования представлены на Втором международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (Москва, 2004); 5 общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); 7 International Congress of Vertebrate Morphology (Florida, 2004); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» (Белгород, 2006); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (Ульяновск, 2005); Шестой Международной конференции «Математическое моделирование физических, технических, экономических, социальных систем и процессов» (Ульяновск, 2005), Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008), Международной конференции «Инновационные технологии в гуманитарных науках» (Ульяновск, 2009), III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009), Международной конференции «Физиология развития человека» (Москва, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Экологическая физиология и медицина: наука, образование, здоровье населения» (Ульяновск, 2012); IV съезде Российского общества патологоанатомов (Белгород, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ, в том числе 13 в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 1 монография.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 207 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 306 работ, в том числе 119 отечественных и 187 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 93 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Материал исследования. Опыты выполнены на самцах беспородных белых крыс массой 160-200г (табл.1). Адаптация к режиму содержания и освещения составила 20 дней (освещение с 6 до 18 ч). По истечении адаптационного периода крысы были разделены на пять экспериментальных групп (табл. 1). Экспериментальные группы №2 - 5 были сформированы после оперативных вмешательств. Схема эксперимента была разработана, руководствуясь основными принципами доказательной медицины.

Таблица 1.

Группы экспериментальных животных

№ эксперимента Экспериментальная группа Количество животных

1. Интактные животные 90

2. Эпифизэктомированные животные 90

3. Эпифизэктомированные животные с последующим введением эпиталамина 90

4. Эпифизэктомированные животные с последующим введением мелатонина 90

5. Животные после денервации правого семенника 24

Опираясь на данные литературы, в схему эксперимента не были включены группы ложнооперированных, эпифизэктомированных животных с введением физиологического раствора, а также интактных животных, которым вводили биологически активные вещества эпифиза (Хавинсон В.Х., 2001; Перцов С.С., 2006). Все эксперименты, уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики» и Директивой №63 от 22.09.10г. Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований».

Для изучения компенсаторных возможностей паренхимы семенников после эпифизэктомии, эпифизэктомированным животным ежедневно с 26-го по 41-й день после удаления эпифиза во время смены фоторежима со световой фазы на темновую подкожно вводили эпиталамин (2,5мг/кг), следующей группе - мелатонин (10мг/кг). Выбор доз основывался на данных литературы (Арушанян Э.Б., 1991; Индирякова O.A., 1997; Anisimov V.N., 2000). Декапитацию животных производили под эфирным наркозом на 40 -41-й день после эпифизэктомии через каждые три часа (по 6 животных в каждой временной точке) в течение двух суток, что обеспечивало исследование функциональной активности семенников на протяжении двух периодов циркадианного ритма. С целью изучения патоморфологических изменений в суточной структуре паренхимы гонад после денервации декапитацию проводили под эфирным наркозом на 30 - 31 сутки после денервации в 13® и 1— (по 6 животных в каждой временной точке), что позволило изучить морфологию денервированных семенников в светлое и темное время суток на протяжении двух периодов циркадианного ритма. Методика эпифизэктомии. Моделирование эпифизарной недостаточности осуществлялось путем удаления железы и введения в организм её биологически активных веществ. Эпифизэктомия проводилась по оригинальной методике. Операционный столик для лабораторных животных жестко фиксировал голову за ушные проходы и верхнюю челюсть (рис. 1 А).

В области оперативного доступа удаляли шерстный покров, а освобожденную поверхность дезинфицировали этиловым спиртом. По средней линии головы производили разрез кожи длинной 1,5 см. Обнажали крышу черепа и в межтеменной кости на расстоянии 4 мм каудальнее от пересечения сагиттального и теменно-межтеменного швов высверливали отверстие диаметром 3 мм (рис. 1Б). Эпифиз удаляли путем резекции участка теменных костей с подлежащей железой специально изготовленными для этого кусачками. Контролировали удаление эпифиза визуально (рис. 1 Б). Удаленный эпифиз имел округлую форму диаметром около 1 мм. Часть эпифизов фиксировали в формалине (6 часов) и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм после депарафинирования окрашивали гематоксилин-эозином. Факт удаления эпифиза подтверждался гистологически.

А Б

Рисунок 1. А - фиксация головы животного за наружные слуховые проходы; Б - операционное поле с удаленным эпифизом на костном лоскуте

Возникающее из-за повреждения венозного синуса кровотечение останавливали ватным тампоном. С целью предотвращения сращения дермы с тканью мозга на отверстие в кости накладывали стерильную вощеную бумагу, рану ушивали. Выживаемость животных после операции составила 69%. Эпифизэктомированных животных продолжали содержать при фиксированном режиме освещения в течение 40 суток. Животных в неудовлетвотрительном состоянии, выражающемся в нарушении

координации движений, нарушениях функций кишечника, с воспалением операционной раны, в эксперименте в дальнейшем не использовали. Методика денервации семенников. Денервация осуществлялась путем перерезки поверхностного и глубокого семенниковых нервов, сопровождающих семенной канатик по методике, предложенной В.В. Невструевой (1978). После эфирного наркоза животное фиксировалось на операционном столике. В области нижней трети живота выстригали шерстный покров, освобожденную кожную поверхность дезинфицировали этиловым спиртом. Доступ в брюшную полость осуществляли разрезом передней брюшной стенки длиной 1,5 см. В область разреза пинцетом выводили правый семенной канатик и под увеличением удаляли с него циркулярный участок адвентиции совместно с семенниковыми нервами, разделяя артерию и вены, сопровождающие семявыносящий проток. Целостность сосудов при операции не нарушалась. При этом семенник не извлекали из мошонки, в связи с чем, механической травматизации органа не было. Рану ушивали. Левый семенник оставался интактным. Выживаемость животных после операции денервации составила 100%. В течение последующего месяца оперированные животные продолжали содержаться в условиях режима фиксированного освещения.

Методики изучения паренхимы семенников. Использовали следующие методики: стандартные гистологические методы фиксации и проводки тканей; гистохимическое окрашивание; иммуногистохимическое окрашивание; микроскопическое исследование; морфометрия; статистические методы обработки результатов и методы математического анализа. У выделенных семенников с двух сторон срезали соединительнотканную капсулу и фиксировали в забуференном формалине, в дальнейшем заключали в парафин. На ротационном микротоме МПС-2 изготавливали поперечные срезы толщиной 5-6 мкм. Для морфологического определения стадий сперматогенного цикла, выявления и учета фигур митоза, морфометрической оценки активности эндокринной ткани после

депарафинирования срезы окрашивали реакцией с Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция), ядра клеток доокрашивали гематоксилином Майера (табл.2). Об уровне апоптоза созревающих сперматогенных клеток судили по активности ферментов, участвующих в индукции апоптоза (прокаспаза 3) и в посттрансляционной репарации ДНК (ПАРП-1). Белки-ферменты выявлялись иммуногистохимически на парафиновых срезах. Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После депарафинирования и регидратации срезов проводили демаскировку антигенов нагреванием образцов в ЮмМ цитратном буфере на водяной бане. Применяли моноклональные антитела: procaspace 3 и PARP-1 (р 116/25) фирмы Epitomics (США). Использовали рекомендованные рабочие разведения антител - 1:500 для procaspace 3 и 1:50 для PARP-1 (pi 16/25). Визуализацию результатов проводили с помощью NovoLink Polymer Detection System (DAB-chromogen). Срезы докрашивали гематоксилином Майера. Оценка качества окрашивания проводилась сравнением с внутренним контролем для каждого из антигенов (сравнение с гландулоцитами семенника). Морфологическую оценку активности ферментов проводили, используя показатель оптической плотности окрашивания меченных клеток (программа денситофотометрии Мекос-С1). Для микроскопирования применяли микроскоп Axiostar Plus (Carl Zeiss) при увеличении хЮОО (окуляр х10, объектив xlOO). Измерения производились с помощью медицинской компьютерной видеосистемы, состоящей из микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss), цифровой фотокамеры Nikon COOLPIX 995, персонального компьютера Pentium-IV и программы автообработки изображений Mecos С-1. Для всех параметров при статистической обработке вариационных рядов вычислялись значения средней арифметической взвешенной (М), ошибки средней арифметической взвешенной (т). Достоверность различий между показателями оценивалась t-критерием Фишера-Стьюдента. Уровень значимости различий был принят р<0,05. Для оценки наличия ритма применяли регрессионный анализ методом наимень-

Таблица 2.

Основные исследуемые параметры паренхимы семенников у интаьстных и опытных животных_

№ Основные исследуемые Кол-во Объекты исследования

п/п параметры парамет Интакгиые Эиифю- Опифтжг. Эпифизэкт. Самцы белых Всего

ров у самцы эктомирован самцы белых самцы белых крыс, после измерении

одного ослых крыс пью самцы крыс после крыс после денервашш

животн белых крыс введения введения правого

ого эпиталамина мелатонина семенника

1. Масса семенника (г) 1 90 90 90 90 24 384

2. Толщина ГШС (мкм) 400 36 ООО 36 000 36 ООО 36 000 9 600 1S3 600

3. МИ сперматогопий промежуточною тина и типа Б (%») 100 9 000 9 000 9000 9 000 2 400 3S400

4. Частота встречаемости этапов сперматогенеза (%о) 300 27000 27 000 27 000 27 000 7 200 115200

5. Количество активных клеток Лсйдига (па 1000 кл. иптерстиция) 1000 90 000 90 ООО 90 000 90 000 24 000 384 000

6. Суммарная площадь сечения ядер активных клеток Лсйдига (кв. мкм.) 1000 90 000 90 000 90 000 90 000 24 000 384 000

7. Оптическая плотность ядер спсрматид 7-8 этапов развития (опт.ел) 100 9 000 9 000 2 400 20 400

8. Оптическая плотность цитоплазмы снсрматонитон па этапе метафазы I делепия созревания (опт.сд) 100 9 000 9 000 2 400 20 400

9. Количество сустснтоиитов в извитом канальце 10 900 900 900 900 240 3 840

10 11лощадь иптерстиция (кн.мкм) 1 . 90 90 90 90 24 384

Итого 271 OSO 271 0S0 2S3 OSO 2.13 OSO 72 288 1120 608

ших квадратов и спектрального анализа. Алгоритмы для выявления циркадианных ритмов и компьютерные программы используемых методов разработаны на кафедрах прикладной математики и теоретической физики Ульяновского государственного университета. Для определения параметров суточных ритмов течения сперматогенеза использовали графически-параметрический метод (Романов Ю.А. и др., 1979; Тимофеев A.B., 1983; Слесарев С.М., 2009). Применение методов математического анализа и графически параметрического метоза позволило в значительной степени объективизировать полученные результаты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфофункциональная организация семенников в течение суток у интактных белых крыс.

В исследовании определялась структура ритмической организации активности семенников у полиэстричных животных на примере крыс. Выбор крыс как объекта исследования обоснован тем что, как и у человека, у данных животных отсутствуют значимые сезонные колебания репродуктивной активности. Рассматриваемый вид является полиэстричным, и изучение морфологии гонад может проводиться независимо от сезона года.

Площадь интерстиция семенников интактных животных составляла 9,5% от общей площади поперечного среза семенника и в течение суток не имела достоверных колебаний. Во всех извитых семенных канальцах наблюдался активный сперматогенез (рис.2). Оценивая клеточные типы, их взаимное сочетание и расположение, в каждом извитом канальце определяли стадию сперматогенного цикла. Циркадианные ритмы сперматогенеза мы определяли, опираясь на изучение суточной динамики ключевых этапов формирования мужских половых клеток, начиная от деления сперматогоний промежуточного типа и заключая этапом спермиации.

Рисунок 2. Извитые семенные канальцы (1) и интерстициальная ткань(2) семенников интактных животных. ШИК-реакция и доокраска ядер гематоксилином, х 400.

На каждом из определяемых этапов был выявлен циркадианный ритм активности (деление сперматогоний промежуточного типа (рис. 3), деление сперматогоний типа Б, мейоз, спермиация), однако активные фазы и акрофазы выявленных ритмов имели различные положения относительно 24-часовой шкалы (табл.3). Первое из изучаемых событий - пролиферация сперматогоний промежуточного типа - имело акрофазу в темное время суток — 4ч (6ч во вторые сутки эксперимента) (рис.3), для следующей за ней пролиферацией сперматогоний типа Б пик активности приходился на ранние утренние часы каждых суток эксперимента (9ч), то есть данные события проходят последовательно (табл.3).

Регуляция пролиферации сперматогоний у взрослых животных осуществляется в основном ФСГ гипофиза, который действует как фактор жизнеспособности делящихся сперматогоний и митоген (Meachem S. et al., 2001), а также имеет циркадианный ритм секреции (Дедов И.И., 1992; Garcia-Bonacho М. et al., 2000; Effect of interferon-gamma treatment on 24-hour variations..., 2005). Максимальная концентрация ФСГ в плазме крови наблюдается в темное время суток. Таким образом, циркадианная

ритмичность выделения регуляторного фактора устанавливает и зависимый от него ритм пролиферации дифференцирующихся сперматогоний.

МИ 160

X,

150 140

130 120 110

100

18 21 24 3 6 9 12 15 18 21 24 3 6 9 12

Рисунок 3. Суточная динамика митотической активности сперматогоний промежуточного типа интактных белых крыс (здесь и далее - серым цветом обозначено темное время суток, белым - светлое время суток).

Таблица 3

Параметры суточного ритма течения некоторых этапов сперматогенеза интактных животных

Этап сперматогенеза Период ритма (ч) Амплитуда (К») Активная фаза (ч) Акрофаза (ч сут).

1 сутки II сутки I сутки II сутки

Пролиферация сперматогоний промежут. типа 20 38,12 20-5 18-7 4 6

Пролиферация сперматогоний типа Б 24; 8 43,75 5-12 7-12 9 9

Мейоз 24; 8 33,3 18-4зи 1730-4 24 24

Спермиация 23 50,62 6-16 4зи-12 12 12

Более поздние этапы развития мужских половых клеток - мейоз и спермиация у интактных животных также характеризовались циркадианной ритмичностью течения (табл.3, рис. 4).

А Б

Рисунок 4. Мейоз сперматоцитов (А) и спермиация (Б) в активную фазу циркадианного ритма у интактных животных. ШИК-реакция с доокрашиванием ядер гематоксилином, х 400.

Акрофаза мейотического деления наблюдалась в 24 ч каждых суток (середина темного времени эксперимента), что также коррелирует с максимальным уровнем содержания основного регуляторного фактора мейотического деления, тестостерона, в плазме крови (Jeyakumar М. et al., 1995; The endocrine regulation of spermatogenesis..., 1996). Наличие циркадианной ритмичности начальных этапов сперматогенеза (пролиферация сперматогоний, мейоз) позволяет сохранить суточную ритмичность и последующим этапам, в частности, этапу спермиации. Акрофазы спермиации приходились на 12 ч (светлое время) каждых суток эксперимента, когда отмечается наименьший уровень содержания тестостерона в крови крыс.

Таким образом, нами установлено, что циркадианная ритмичность процесса сперматогенеза складывается из взаимозависимых последовательно текущих этапов размножения, созревания и формирования половых клеток, каждый из которых обнаруживает циркадианный ритм активности. Процесс пролиферации и дифференцировки половых клеток сопровождается удалением части клеток на каждой стадии созревания сперматозоидов (Rucker Е.В. et al., 2000). Несомненно, такой процесс как апоптоз, который сопровождается синтезом белков de novo и имеет многочисленные

регуляторные механизмы, должен быть согласован с общей ритмической структурой процесса. В связи с этим естественно предполагать наличие циркадианного ритма и апоптоза созревающих половых клеток. В качестве маркера апоптоза нами определялся уровень экспрессии прокаспазы 3 в цитоплазме сперматогенных клеток на разных стадиях созревания (рис.5).

Было установлено повышение уровня экспрессии прокаспазы 3 как в сперматоцитах, так и в сперматидах в темновую фазу фотопериода (табл.4). Известно, что при стимуляции ткани каким-либо митогеном, ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которое сопровождается активацией апоптоза (Трипептид неоген усиливает апоптоз..., 2000; Маянский H.A., 2002). В случае сперматогенеза повышение уровня пролиферативных процессов в темновую фазу эксперимента (активные фазы пролиферации дифференцирующихся сперматогоний и мейоза), приводит к тому, что уровень содержания ферментов-индукторов апоптоза также повышается в темновую фазу цикла. Помимо концентрации прокаспазы 3 в спематогенных клетках нами определялась удельная оптическая плотность иммуногистохимического комплекса PARP-1 — первичные AT(PARP-l) - DAB-chromogen (рис.5, табл.4).

• т

жм Д: ^-'Л

4) ' % й

г;

А Б

Рисунок 5. Сперматогенная и эндокринная ткань семенников интактных животных. Иммуногистохимическое окрашивание на прокаспазу 3 - А и РА Я Г'-1 (р116/25) - Б, доокрашивание гематоксилином. Увеличение х400.

Независимо от пути, по которому протекает апоптоз, его конечным итогом является разрушение ДНК с последующей активацией ПАРП-1 (Ккагауа М. е1 а1., 2004). В целом у интактных животных, динамика активности ПАРП-1 соответствовала изменениям уровня каспазы-3 в снерматоцитах и сперматидах при спермиации и на этапе мейоза (табл.4). Также определялись достоверные различия экспрессии данного фермента в темновую и световую фазу в течение двух суток эксперимента, что свидетельствует о циркадианном ритме его активности. Повышение уровня ПАРП-1 наблюдалось в темное время эксперимента, как и рост пролиферативной активности сперматогоний и сперматоцитов.

Таблица 4

Суточная динамика оптической плотности комплексов белок-АТ в

сперматогениых клетках интактных белых крыс (М±т), опт.ед.

Этап развития половых клеток Прокаспаза 3 (опт.ед.) РА11Р-1 (опт.ед.)

Светлое время Темное время Светлое время Темное время

Ядра сперматид 78 этапов развития 0,257±0,031* 0,417±0,037* 0,399±0,025* 0,567±0,018*

Цитоплазма сперматоцитов на этапе мейоза 0,103±0,022* 0,290±0,026* 0,172±0,036* 0,398±0,029*

Примечание: * - р<0,001 при сравнении значений, полученных в светлое и темное время.

Таким образом, у интактных животных наблюдался циркадианный ритм течения сперматогенеза, складывающийся из ритмичных процессов пролиферации, апоптоза и дифференцировки созревающих половых клеток. Выявленный ритм обнаруживал зависимость от свето-темнового цикла. Так, процессы размножения клеток и активация ферментов, участвующих в апоптозе сперматогениых клеток, наиболее активно происходили в темную фазу суток, а процесс спермиации наблюдался преимущественно в светлую фазу суток. Наличие циркадианного ритма процесса созревания мужских половых клеток предполагает и существование суточных ритмов активности эндокринной ткани семенника, что подтверждается циркадианным ритмом

концентрации в крови гонадотропных гормонов гипофиза и тестостерона (А glucocorticoid sensitive ..., 2009; Bribiescas R.G., Hill K.R., 2010).

Руководствуясь функциональной активностью, мы сочли целесообразным выделить две субпопуляции перитубулярных эндокриноцитов. Первая субпопуляция - это неактивные клетки, включающие в себя малодифференцированные элементы и инволютивные формы, утратившие способность к синтезу андрогенов. Вторая подгруппа включает активные клетки, которые могут отличаться уровнем своей функциональной активности.

Исследование количества активных перитубулярных эндокриноцитов показало, что их число превышает количество неактивных элементов практически вдвое (рис.6), а суточная динамика характеризуется циркадианным ритмом. Средние значения количества активных клеток Лейдига в ночное время превышали данные значения в дневное время (786,2±3,5 и 757,34±2,93 эндокриноцитов соответственно, р<0,001). Графически-параметрический анализ показал, что активные фазы выявленного ритма приходились на ночное время суток (рис.7). Сглаженная кривая имела вид синусоиды, профили которой повторялись на протяжении двух суток эксперимента.

Активная фаза в первые сутки эксперимента занимала промежуток времени с 21 ч до 4 ч, во вторые - с 19 ч до 5 ч. Акрофаза ритма в первые и вторые сутки приходилась также на темное время суток (24 ч и 3 ч соответственно). Амплитуда колебаний составила 67,24 единицы (8,3%). Методом спектрального анализа был определен ритм с периодом около 22 ч. (рис.7).

^ 820 I 800

І 780 І 760 І 740 I 720 700

Рисунок 6. Островок эндокринной ткани семенников интактных белых крыс. 1 - высокоактивные клетки Лейдига, 2 — малоактивные клетки Лейдига, 3 -кровеносные сосуды. Окраска ШИК-реакцией с доокрашиванием гематоксилином. Увеличение хбОО.

4 -р 3,5 -3 2,5

I 2

" 1.5

Рисунок 7. Суточная динамика количества активных клеток Лейдига интактных белых крыс и результаты ее спектрального анализа (здесь и далее: а - зона циркадианных ритмов, б - зона ультрадианных ритмов).

Однако суточное изменение уровня тестостерона в крови может быть обусловлено не только увеличением количества активных клеток Лейдига за счет «функционального резерва» из числа неактивных эндокриноцитов, но и ростом уровня функционального напряжения в субпопуляции самих активных клеток. С целью проверки данного предположения нами определялась суммарная площадь сечения ядер в субпопуляциях высоко- и малоактивных клеток Лейдига. Суммарная площадь сечения ядер активных

I |

гландулоцитов характеризовалась циркадианным ритмом колебаний, с ростом показателей в темное время суток. Среднесуточное значение суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига составило 15201,3±361,4 мкм2. Суточная динамика данного показателя характеризовалась циркадианным ритмом с периодом около 23 ч (метод спектрального анализа). Среднее значение суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига в ночное время достоверно превышало это значение в дневное время (16447,8±316,3 мкм2 и 14202,3±261,7 мкм2, р<0,05). Сглаженная кривая характеризовалась синусоидальными колебаниями. Акрофаза в первые сутки эксперимента приходилась на 3 ч, во вторые - на 21 ч. Амплитуда колебаний показателя активности эндокриноцитов составила 4682,6 единицы (26%), что свидетельствует о значительных суммарных изменениях размеров гландулоцитов в течение суток (рис.8).

время, ч

Рисунок 8 Суточная динамика суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига интактных белых крыс и ее спектральный анализ.

Отметим, что активные фазы выявленного циркадианного ритма динамики суммарной площади сечения ядер активных эндокриноцитов приходились на темное время суток, совпадая по времени с увеличением количества активных клеток Лейдига в семеннике. Этот механизм позволяет формировать циркадианный ритм содержания тестостерона в крови, который необходим для нормального ритмичного осуществления репродуктивной функции у полиэстричных животных. Таким образом, активность

эндокринной ткани семенников интактных животных характеризуется циркадианным ритмом, который складывается из изменения количества активных клеток в течение суток и корелирующего с ним изменения уровня их функционального напряжения. Вероятно, часть малоактивных и неактивных клеток Лейдига, содержащих небольшое количество рецепторов ЛГ, включаются в продукцию тестостерона только при пиковом выделении лютеинизирующего гормона, что проявляется увеличеним количества активных клеток Лейдига в течение некоторого времени суток.

Обобщая изложенное, можно заключить, что морфофункциональная активность мужских гонад характеризуется циркадианным ритмом. Морфологически суточные ритмы выявляются как в извитых семенных канальцах в виде циркадианных ритмов этапов размножения, созревания и формирования сперматогенных клеток, так и в интерстиции семенников, проявляясь циркадианным ритмом активности клеток Лейдига. Процесс апоптоза части созревающих половых клеток также подвержен суточным колебаниям. Все выявленные ритмы характеризуются зависимостью от свето-темнового цикла и, по сути, являются проявлением адаптации организма к существованию в условиях постоянной ритмичной смены дня и ночи.

Морфофункциональная организация мужских гонад белых крыс после эпифизэктомин.

После эпифизэктомин общая организация гонад самцов белых крыс не обнаружила каких-либо видимых изменений. Масса правого семенника составляла в среднем 1,55±0,04 г., масса левого семенника - 1,56±0,04 г., на протяжении суток она сохраняла монотонную динамику. По сравнению с контрольными интактными животными масса семенников не имела достоверных различий (р>0,05), хотя определялась тенденция к незначительному увеличению массы гонад. Площадь, занимаемая интерстицием в гонадах после удаления эпифиза, составляла 8,6±3,3%. По

сравнению с интактными животными достоверного изменения соотношения площадей: извитые канальцы/интерстиций не наблюдалось. Во всех канальцах сохранялся активный сперматогенез. Количественое отношение и взаимное расположение сперматогенных клеток не отличалось от группы интактных животных (рис.9).

Рисунок 9. Паренхима семенников после эпифизэктомии. Отмечается активный сперматогенез во всех извитых канальцах. Окраска ШИК-реакцией с доокрашиванием гематоксилином. Увеличение х400.

Однако, после эпифизэктомии наблюдался достоверный рост митотической активности сперматогоний промежуточного типа (на 9,4%) и типа Б (на 13,7%) по сравнению с интактными животными (табл.5). При анализе суточной динамики митотического индекса сперматогоний изученных типов у эпифизэктомированных животных отмечалось отсутствие колебаний, связанных со свето-темновым циклом (рис. 10).

Несмотря на повышенную митотическую активность сперматогоний, масса семенников после эпифизэктомии не изменилась. По свидетельству Э. Рузен-Ранге (1980), количество возможно образовавшихся сперматозоидов из одной стволовой сперматогонии для данного вида животных всегда постоянно и не зависит от каких-либо регуляторных влияний. Число образующихся сперматозоидов определяется количеством делений стволовой сперматогонии в процессе дифференцировки. Однако оно всегда ниже, чем

можно предположить путем простого умножения. Данное снижение обеспечивается апоптозом, которому подвергается часть дифференцирующихся половых клеток, благодаря чему в организме достигается биологическое равновесие между процессами пролиферации сперматогоний и выходом зрелых сперматозоидов (Астраханцев А.Ф., 1996). Вероятно, после эпифизэктомии происходит как увеличение пролиферативной активности сперматогоний, так и повышение процента дегенерирующих клеток, что в целом не отражается на массе органа.

Таблица 5

Митотический индекс сперматогоний белых крыс (%о) (М±т)_

Группа животных Сперматогонии промежуточного типа Сперматогонии типа Б

Интактные 139,66±2,51* 120,28±3,26*

Эпифизэктомированные 154,13±3,32* 139,45+3,68*

Эпифизэктомированные с последующим введением эпиталамина 149,13±3,47 134,55±6,98

Эпифизэктомированные с последующим введением мелатонина 153,87±3,52* 148,24±3,55*

Животные, после денервации семенника 84,06±3,25* 63,45±1,2*

Примечание: * - р<0,05 - при попарном сравнении значений между группами интактных и экспериментальных животных

С целью подтверждения данного предположения нами проведен сравнительный анализ уровня содержания некоторых ферментов в извитых семенных канальцах, участвующих в процессах апоптоза созревающих половых клеток (прокаспаза-3, РАКР-1) у интактных и опытных животных. После эпифизэктомии произошло достоверное повышение уровня синтеза данных ферментов с утратой различий экспрессии в темное и светлое время суток (рис.11, табл.6). Данный факт свидетельствует о том, что с ростом пролиферативной активности сперматогоний после эпифизэктомии, увеличивается и количество «поломок» в структуре ДНК, а соответственно и большее количество созревающих половых клеток удаляется из дальнейшей дифференцировки.

9 12 15 18 21 24 3 6 9 12 время,ч

Рисунок 10. Суточная динамика митотической активности сперматогоний промежуточного типа эпифизэктомированных белых крыс.

А Б

Рисунок 11. Извитые семенные канальцы эпифизэктомированных животных. Иммуногистохимическое окрашивание на прокаспазу 3- а и PARP-1 (pi 16/25) - б, доокрашивание гематоксилином. Увеличение х400.

Высказанные положения согласуются с общепринятым понятием об апоптозе, как фундаментальном биологическом процессе, занимающем ведущее место в поддержании гомеостаза и сохранении клеточного баланса в многоклеточном организме. Хорошо известны свойства одного из гормонов эпифиза - мелатонина, как протектора ДНК и сильного антиоксиданта (А comparison of the action of amifostine and melatonin..., 2005; Melatonin protects against..., 2007). Вероятно, в отсутствие биоактивных веществ эпифиза и при повышении пролиферации сперматогоний уровень нарушений в структуре

ДНК созревающих половых клеток значительно увеличивается, что приводит к активации белков-ферментов, запускающих программу апоптоза.

Таблица 6

Суточная динамика оптической плотности комплексов белок-АТ в сперматогенных клетках эпифпзэктомпрованных белых крыс (М±т), опт.ед.

Этап развития PARP-1 Прокаспаза 3

сперматогенных Светлое Темное Светлое Темное

клеток время время время время

Ядра сперматид 7-8 этапов развития 0,615±0,027 0,603±0,018 0,428±0,052 0,467±0,071

Цитоплазма сперматоцитов на 0,384±0,042 0,440±0,056 0,183±0,031 0,243±0,058

этапе мейоза

Наряду с исчезновением суточного ритма пролиферативной активности сперматогоний после эпифизэктомии отмечено его нарушение на последующих этапах сперматогенеза — мейоза и спермиации (табл.7). То есть эпифизэктомия приводит к утрате всех суточных ритмов, выявленных в сперматогенной ткани семенника, не увеличивая при этом на количество производимых сперматозоидов.

Таблица 7

Суточная динамика течения некоторых этапов сперматогенеза эпифпзэктомпрованных животных

Этап сперматогенеза Период (Ч) Амплиту да (%о) Активная фаза (ч) Акрофаза (ч).

I сутки II сутки I сутки II сутки

Пролиферация сперматогоний промежут. типа 8,9 44 22-1; 7- 9зо 1330-1630 22-12 15 12

Пролиферация сперматогоний типа Б 17 59,25 18-23; 414 24-9 18; 12 6

Мейоз - 31,63 9-15 19-2; 7-12 12 21; 9

Спермиация - 53 21; 4-10; 13-17 19-12 21; 6; 15 21

Активность эндокринной ткани семенников после удаления эпифиза также утратила суточную ритмичность. Суточная динамика количества

активных гландулоцитов после эпифизэктомии в отличие от интактных животных характеризовалась кривой с незначительными колебаниями, которые не имели взаимосвязи со свето-темновым циклом (рис.12). Средние показатели в темное и светлое время суток не имели достоверных различий (777,26+2,39 и 770,71±5,91 соответственно, р>0,05). Вместе с тем, средние значения соотношения активные/неактивные клетки Лейдига и суммарной площади сечения ядер активных эндокриноцитов достоверно не отличались от значений, полученных у интактных животных. Данные факты согласуются с изучением активности других ферментных систем после эпифизэктомии (Effect ofpinealectomy..., 1997).

Рисунок 12. Суточная динамика количества активных клеток Лейдига эпифизэктомированных белых крыс и ее спектральный анализ.

Таким образом, нарушение регуляторной функции эпифиза приводит к рассогласованию активности герминативной и эндокринной ткани семенников со свето-темновым циклом и утрате циркадианной ритмичности, что влечет за собой снижение адаптивных возможностей гонад. Еще одним важным эффектом нарушения функции эпифиза следует отметить рост пролиферативной активности сперматогоний с синхронным увеличением количества сперматоцитов и сперматид, имеющих дефекты в структуре ДНК и удаляющихся из семенных канальцев путем апоптоза.

Влияние олигопептидов эпифиза на морфофункциональную организацию семенников белых крыс после эпифизэктомии.

Множественность пептидов эпифиза, а также дистантность их действия и функциональная специфичность свидетельствуют о проявлении пептидами свойств гормонов (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х, 1995; Хавинсон В.Х. и др., 1998). Мы использовали комплексный препарат - эпиталамин, представляющий собой безмелатониновый экстракт из эпифизов крупного рогатого скота. Введение эпиталамина эпифизэктомированным животным осуществлялось в 18 ч ежесуточно — перед сменой фазы фоторежима со световой на темновую, что моделировало активность эпифиза в темное время суток. Ежесуточное введение эпиталамина эпифизэктомированным белым крысам не привело к видимым морфологическим изменениям паренхимы семенников. Масса правого семенника составляла в среднем 1,44±0,03 г., масса левого - 1,46±0,05 г., на протяжении суток динамика массы была практически монотонной. Не имелось достоверных различий в массе семенников между группами интактных, эпифизэктомированных животных и эпифизэктомированных животных, после введения эпиталамина. Площадь, занимаемая интерстицием в гонадах эпифизэктомированных самцов крыс после введения эпиталамина составила 9,11±2,75%, что достоверно не отличалось от площади интерстиция у интактных животных. Во всех извитых семенных канальцах сохранялся активный сперматогенез (рис.13).

После введения эпиталамина наблюдалось значительное угнетение пролиферативной активности сперматогоний изученных типов, которое продолжалось всю темновую фазу (9-12 ч после инъекции эпиталамина) (рис.14). С началом световой фазы митотическая активность сперматогоний начинала расти (рис.15) и превышала значения как эпифизэктомированных, так и интактных животных. В среднем, отмечалось более высокое среднесуточное значение митотического индекса в этой экспериментальной группе по сравнению с интактными животными (табл.5).

ЕЙР

•'^л*^ / - г л * * -ф, л. ■ ' '

»

'-Vі

Рисунок 13. Паренхима семенников эпифизэктомированных белых крыс после введения эпиталамина. Окраска ШИК-реакцией с доокрашиванием гематоксилином. Увеличение х400.

спектральная частота

Рисунок 14. Суточная динамика митотической активности сперматогоний промежуточного типа и ее спектральный анализ у эпифизэктомированных белых крыс после введения эпиталамина.

В обсуждаемой экспериментальной группе циркадианный ритм был сформирован благодаря только введению олигопептидов эпифиза, в кровотоке этих животных отсутствовал эпифизарный мелатонин. Вероятно, отсутствие в кровотоке мелатонина у эпифизэктомированных животных не позволило только введением олигопептидов привести уровень митотической активности сперматогоний к значениям, определяемым у интактных животных. Аналогичная тенденция наблюдалась и на последующих этапах сперматогенеза в данной экспериментальной группе.

Рисунок 15. Извитые семенные канальцы эпифизэктомированных животных после введения эпиталамина (временная точка - 12 ч., световая фаза): 1 -митотическое деление сперматогоний промежуточного типа. Окрашивание: ШИК-реакция, с доокраской ядер гематоксилином, увеличение х 400.

Введение эпиталамина однократно в течение суток позволило сформировать циркадианные ритмы частоты встречаемости мейотического деления сперматоцитов и спермиации (табл.8).

Таблица 8

Суточная динамика некоторых этапов сперматогенеза эпифизэктомированных животных после введения эпиталамина

Этап сперматогенеза Период (ч) Амплитуда (%о) Активная фаза (ч) Акрофаза (ч).

I сутки II сутки I сутки II сутки

Пролиферация сперматогоний промежут. типа 20 36,69 5-18 5-12 12 12

Пролиферация сперматогоний типа Б 24 71 9-18 6-12 9 12

Мейоз 26,3; 9 28,97 22-5 1-7 3 6

Спермиация 23; 9,5 54,94 24-5 22-5 3 24

Большое количество олигопептидов, синтезируемых эпифизом, позволяет предполагать их органную или тканевую специфичность, а кроме того возможно предположить и разнонаправленное действие на различные мишени. Сведения о ритмичности синтеза и секреции олигопептидов эпифиза до настоящего времени достаточно скудны. У. коЬе и соавт. (1995)

показали, что один из пептидов эпифиза - аргинин-вазотоцин синтезируется с циркадианной ритмичностью с максимумом выработки в дневное время. В тоже время, ряд авторов полагает, что мелатонин может выступать в роли регулятора синтеза и секреции олигопептидов эпифиза и, соответственно, время их бисинтеза совпадает (Hastings M.N., 1986; Ром-Богуславская Е.С. и др., 1998). Показано, что мелатонин и другие метаболиты серотонина изменяют проницаемость клеточных мембран пинеалоцитов для синтезированных в них олигопептидов, и тем самым облегчают их попадание в кровоток (Pevet Р., 1991). Вводя эпифизэктомированным животным комплекс олигопептидов во время смены световой фазы фоторежима на темновую, мы не имеем возможности создания физиологических соотношений этих биоактивных веществ в крови, а следовательно, возможна ситуация отсутствия их в кровотоке к концу темновой фазы фотопериода или разнонаправленного действия на компоненты семенников.

Анализ активности эндокринной ткани семенников эпифизэктомированных белых крыс, получавших инъекции эпиталамина, также показал формирование циркадианного ритма, с увеличением показателей преимущественно в темновую фазу фотопериода. Данные факты свидетельствуют о биоритмогенном эффекте олигопептидов эпифиза.

После введения эпифизэктомированным животным эпиталамина среднесуточное соотношение количества активных и неактивных клеток Лейдига сохранялось на уровне такового у интактных животных (745,55±7,31 активных клеток Лейдига на 1000 изученных). Изучая суточную динамику количества активных клеток Лейдига, выявлено восстановление циркадианного ритма. Сглаженная кривая суточной динамики количества активных гландулоцитов приобрела характер синусоиды (рис. 16). Активная фаза в каждые сутки опыта наблюдалась сразу после введения пептидов эпифиза и занимала темное время суток (18-2ч в первые сутки, 19-5ч во вторые). Акрофаза приходилась на 24 ч первых суток и 21ч вторых суток эксперимента. Амплитуда колебаний составила 97,24 единицы. Ночное

количество активных клеток Лейдига (764,83±8,42) превышало данное значение в дневное время (726,32±7,02) (р<0,001). Спектральный анализ показал наличие ритма с периодом 23 ч.

время, ч

Рисунок 16. Суточная динамика количества активных клеток Лейдига и ее спектральный анализ у эпифизэктомированных белых крыс после введения эпиталамина.

Подавление активности эндокринной ткани семенников введением эпиталамина в нашем исследовании только спустя 9-12 часов после инъекции позволяет предположить опосредованное влияние олигопептидов эпифиза на клетки Лейдига посредством модуляции активности гипоталамуса и регуляции синтеза гонадотропных гормонов гипофиза. Регулируя суточную ритмичность эндокринной функции семенников, олигопептиды эпифиза обуславливают существование циркадианного ритма секреции тестостерона. Последний, в свою очередь, участвует в формировании циркадианного ритма сперматогенеза. Это является одним из условий адаптации семенников к суточной фотопериодичности.

Морфофункциональная организация мужских гонад

эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина.

После введения мелатонина эпифизэктомированным самцам белых крыс однократно в течение суток на протяжении двух недель общая организация семенников морфологически не отличалась от интактных и

эпифизэктомированных животных. Масса правого семенника составляла в среднем 1,36±0,06 г., масса левого семенника - 1,40±0,07 г. и на протяжении всего времени исследования сохраняла монотонную динамику.

Площадь, занимаемая интерстицием, составила 9,84±3,14% от общей площади поперечного сечения семенника. По сравнению с интактными животными и другими экспериментальными группами животных достоверного изменения соотношения семенные канальцы/интерстиций не наблюдалось. Во всех извитых семенных канальцах сохранялся активный сперматогенез (рис.17).

Введение мелатонина по предложенной схеме не обеспечило восстановления суточного ритма пролиферативной активности сперматогоний изученных типов (рис.18). Частота встречаемости последующих этапов сперматогенеза - мейоза и спермиации также не имела взаимосвязи со свето-темновым циклом (табл.9).

Косвенно, данная экспериментальная группа послужила контролем введения эпиталамина и сняла вопрос формирования ритма под воздействием болевого стресса от инъекций. Введение мелатонина эпифизэктомированным животным не повлияло на среднесуточное количество активных клеток Лейдига (760,47±4,89). Суточная динамика, как и в группе эпифизэктомированных животных, характеризовалась кривой без определенной взаимосвязи со свето-темновым циклом (рис.19). Абсолютная амплитуда колебаний составила 58,16 единиц, что превышало значения у интактных и эпифизэктомированных животных. Средние показатели в темное и светлое время суток не имели достоверных различий (752,92+9,19 и 763,17±5,73 соответственно, р>0,05). Метод спектрального анализа не выявил периодичеких колебаний количества активных гландулоцитов в течение суток (рис.19). Суточная динамика суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига в группе эпифизэктомированных животных, получающих ежесуточно мелатонин, также не имела циркадианной ритмичности.

Рис.17. Извитые семенные канальцы на стадии спермиации у эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина. Окрашивание: ШИК-реакция, с доокраской ядер гематоксилином, увеличение х 400.

Рисунок 18. Суточная динамика митотической активности сперматогоний промежуточного типа и ее спектральный анализ у эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина.

Таблица 9

Суточная динамика некоторых этапов сперматогенеза эпифизэктомированных животных после введения мелатонина_

Этап сперматогенеза Период (Ч) Амплиту да (%о) Активная фаза (ч) Акрофаза (ч).

I сутки II сутки I сутки II сутки

Пролиферация сперматогоний пр. типа - 38,32 22-11; 1330-1800 23-1; 430 -7;11-12 24; 15 24; 6; 12

Пролиферация сперматогоний типа Б 17 47 18-23; 511; 13-18 23-3 21; 9; 15 24

Мейоз 15,8 21,65 19-4 - 21 -

Спермиация 6 74,09 18-20; 2-11;14-17 23-3; 812 24 9

Рисунок 19. Суточная динамика колличества активных клеток Лейдига и ее спектральный анализ у эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина.

Отмеченное выше отсутствие эффекта однократного введения мелатонина на формирование циркадианного ритма пролиферации может рассматриваться как обоснование необходимости разработки форм и способов обеспечения пролонгированного действия мелатонина. А выявленный хрономодулирующий эффект олигопептидов эпифиза позволяет показать необходимость изучения их взаимодействия в формировании циркадианных ритмов различных функций.

Морфофункциональная организация семенников белых крыс после односторонней денервации.

Нарушение периферической иннервации семенников привело к патологическим процессам в некоторых извитых семенных канальцах, не изменяя при этом веса гонад. В нашем эксперименте мы не прибегали к экстирпации ганглиев чревного сплетения, что позволило сохранить нормальную иннервацию тканей мошонки и исключить влияние отека окружающих тканей на состояние сперматогенной и эндокринной ткани семенников. Видимые значительные нарушения сперматогенеза обнаруживались в 11% извитых семенных канальцев, где отсутствовали некоторые этапы созревания половых клеток. В некоторых канальцах определялось запустевание (рис.20, 21).

Рисунок 20. Паренхима семенников после денервации. Определяется запустевание некоторых семенных канальцев (1), снижение толщины эпителио-сперматогенного слоя и расширение некоторых кровеносных сосудов (2).Окрашивание гематоксилин-эозин, увеличение х160.

Рисунок 21. Запустевание части извитых семенных канальцев после денервации семенника. Окрашивание: ШИК-реакция, доокрашивание ядер гематоксилином, увеличение х400.

Сходные нарушения сперматогенеза отмечали в своих исследованиях Y.G. Gong и соавт. (2006). В денервированных семенниках в канальцах без визуальных нарушений сперматогенеза определялось снижение уровня митотического индекса сперматогоний изученных типов, однако суточная ритмичность сохранялась с преобладанием пролиферативной активности, как и у интактных животных, в темновую фазу фотопериода (табл.10).

Таблица 10.

Митотический индекс сперматогоний белых крыс

после денервации семенника (%о) (М±ш)_

Фаза фотопериода Правый (денерви семенник рованый) Левый семенник (интактный)

Сперматогонии промежуточного типа Сперматогонии типа Б Сперматогонии промежуточного типа Сперматогони и типа Б

Темное время 93,44±3,07* 59,63±1,02* 139,15±2,56 108,57±3,46*

Светлое время 74,67±2,43* 67,31±1,14* 128,25±2,8 131,17±4,32*

Мезор 84,06±3,25 63,45±1,2 133,7±2,71 119,85±3,89

Примечание: * - различия достоверны при сравнении значений попарно в темное и светлое время суток, р<0,05

Последующие этапы сперматогенеза — мейоз и спермиация также сохраняли циркадианный ритм активности (табл.11). Гландулоциты семенника после утраты регуляторных влияний со стороны нервной системы так же сохранили циркадианный ритм активности, однако их общая функциональная активность была достоверно выше, чем у интактных и эпифизэктомированных животных (рис. 22, табл.12).

Таблица 11.

Частота встречаемости некоторых этапов сперматогенеза после денервации семенника у белых крыс (%о) (М±ш)_

Фаза фотопериода Правый семенник (денервированый) Левый семенник (интактный)

Частота встречаемости мейотического деления Частота встречаемости спермиации Частота встречаемости мейотического деления Частота встречаемости спермиации

Темное время 56,72±2,56* 175,36±4,11* 57,88±3,01* 177,13±4,21*

Светлое время 47,26±1,98* 191,16±3,26* 48,16±2,05* 195,73±4,28*

Мезор 51,99±4,13 183,26±4,27 53,02±3,76 186,43±4,37

Примечание: * - различия достоверны при сравнении значений попарно в темное и светлое время суток, р<0,05

Рисунок 22. Увеличение активности гландулоцитов семенника после денервации. 1 - активные клетки Лейдига, 2 - неактивные элементы интерстиция. Окраска ШИК-реакцией с доокрашиванием гематоксилином. Увеличение хбОО.

Таблица 12

Средние значения количества активных клеток Лейдига интактных и опытных животных (М±ш, мкм2)

Группы животн ых Интактные животные Эпифизэктомированные животные Животные после денервации семенника

Темное время 786,2±3,5* 777,26+2,39 889,56+7,18**

Светлое время 757,34±2,93* 770,71+5,91 826,34+9,27**

Мезор 771,68+7,61* 772,11±2,83 857,95+9,11"

Примечание: * - различия достоверны при сравнении значений в темное и светлое время суток, р<0,001; ** - различия достоверны при сравнении значений в темное и светлое время суток, р<0,05; * - различия достоверны между интактными животными и животными после денервации семенника, р<0,001.

Среднесуточное значение суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига после денервации составило 29567,21±367,98 мкм2. Среднее значение суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига в ночное время достоверно превышало это значение в дневное время (33287,34±498,45 мкм2 и 25897,5±501,53 мкм2, р<0,05) (рис. 23). Исследованиями Zhu B.C. и соавт. (2000), Chow S.H. и соавт. (2000) показано,

что денервация одного семенника в течение месяца не изменяет уровня ЛГ и ФСГ в крови.

| 35000 г

8 30000 25000 20000 15000 10000 5000 О

Рисунок 23. Динамика суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига в темное и светлое время суток у групп интактных и опытных животных.

Таким образом, имеющихся суточных колебаний гуморальных факторов в этом случае оказывается достаточно для сохранения суточного ритма митотической активности сперматогоний и последующих этапов сперматогенеза, несмотря на снижающуюся амплитуду ритма. По свидетельству Welsh М. и соавторов (2010) значительное влияние на микроциркуляцию крови в яичках оказывают андрогены, вырабатываемые клетками Лейдига. Воздействуя на рецепторы на гладкомышечных клетках артериол, тестостерон и его производные регулируют их просвет и соответственно ёмкость микроциркуляторного русла семенника, частично компенсируя патологические проявления денервации органа.

Изучая уровень активности ферментов — индукторов апоптоза в денервированных семенниках (прокаспаза 3, PARP-1), выявили значительное увеличение уровня их экспрессии в данной экспериментальной группе при сохранении тенденции циркадианного ритма экспрессии изучаемых ферментов (табл. 13, рис. 24). Рост экспрессии прокаспазы 3 и PARP-1 после денервации семенника по сравнению с интактными животными составил 1,8 - 2 раза. Сохранялась тенденция различия между дневным и ночным уровнем

синтеза как РАЯР-1 (р116/25), так и прокаспазы 3, то есть при денервации циркадианный ритм продукции данных белков сохранялся. Таким образом, после денервации наблюдается рост повреждений ДНК, с чем связано и увеличение активности РА11Р-1 в сперматоцитах и сперматидах, а также активация каспазозависимого пути апоптоза. Наличие циркадианного ритма пролиферации сперматогоний в денервированных семенниках позволяет сохранить и суточный ритм экспрессии ферментов-индукторов апоптоза. Известно, что денервация приводит к изменению кровоснабжения органа. В семеннике это влечет за собой нарушение гематотестикулярного барьера, которое проявляется в изменении клеток Сертоли и утраты ими связи со сперматогенными клетками. Однако эти нарушения развиваются в течение длительного периода времени и зависят от исходных условий кровоснабжения. В то же время, наличие эндокринных механизмов регуляции суточных ритмов — биологически активных веществ эпифиза -позволяет сохранить их даже в органе с нарушенной иннервацией. Наблюдаемое в эксперименте увеличение активности эндокринной ткани семенников, вероятно связано с паракринными взаимодействиями -снижением выработки ингибина клетками Сертоли в канальцах с нарушенным сперматогенезом и снижением продуктивности сперматогенеза.

Таблица 13

Суточная динамика оптической плотности комплексов белок-АТ в сперматогенных клетках денервированных семенников белых крыс __(М±т), опт.ед. _

Этап развития сперматогенных клеток РАЯР-1 Прокаспаза 3

Светлое время Темное время Светлое время Темное время

Ядра сперматид 7-8 этапов развития 0,732±0,056 0,886±0,041 0,521±0,05 0,673±0,057

Цитоплазма сперматоцитов на этапе мейоза 0,456±0,038 0,553±0,034 0,304±0,026* 0,412±0,021*

Примечание: * - различия достоверны при сравнении значений в темное и светлое время суток, р<0,05

* *

¿"а, «яцКг # А« ' '

Л ; I

А Б

Рисунок 24. Извитые семенные канальцы животных после денервации семенника. Иммуногистохимическое окрашивание на РАММ (р 116/25) - А и прокаспазу 3 - Б, доокрашивание гематоксилином. Увеличение х400.

Таким образом, полученные результаты показали, что периферическая денервация не полностью нарушает течение сперматогенеза и активность гландулоцитов семенников. Не оказывая влияние на наличие суточной ритмичности активности гонад, патология периферической иннервации, тонко нарушая проницаемость стенки извитых семенных канальцев и функцию клеток Лейдига снижает мужскую фертильность.

Анализируя результаты, полученные в нашем исследовании можно заключить, что активность мужских гонад полиэстричных животных характеризуется циркадианной ритмичностью, которая складывается из суточного ритма размножения и созревания половых клеток и суточного ритма активности клеток Лейдига, обеспечивающих циркадианную продукцию половых стероидов. В регуляции любой функции организма принимают участие, как минимум, две системы - нервная и эндокринная. Роль нервной системы в обеспечении формирования циркадианного ритма активности гонад заключается в регуляции активности ферментных систем эпифиза посредством модуляции активности супрахиазматических ядер гипоталамуса. Прямое влияние нервной системы на формирование суточного ритма активности гонад отсутствует. В данном случае, периферическая

нервная система обеспечивает нормальные трофические отношения между структурными компонентами гонад.

Влияние эндокринной системы на регуляцию ритмической организации мужской репродуктивной функции представляет собой многоуровневую систему, в основе которой лежит регуляция размножения и дифференцировки половых клеток. На основании собственных исследований и принимая во внимание данные литературы, можно заключить, что формирование циркадианного ритма активности гонад обеспечивается участием следующих структур (рис.25): 1) супрахиазматические ядра гипоталамуса, получая информацию о ритмически изменяющемся уровне освещенности окружающей среды, посредством нервных волокон, модулируют активность ферментных систем эпифиза; 2) эпифиз, продуцируя биологически активные вещества - мелатонин и олигопептиды, подавляет секрецию гипоталамусом, и как следствие, гипофизом релизинг-фактора и гонадотропных гормонов; 3) отсутствие в кровотоке гонадотропных гормонов гипофиза и, вероятно, прямое ингибиторное влияние олигопептидов и мелатонина на структуры гонад подавляют в темное время активность герминативной и эндокринной ткани семенников.

Патология эпифиза, связанная с отсутствием в кровотоке его биоактивных веществ, приводит к утрате циркадианной ритмичности активности гонад и рассогласованию созревания половых клеток, активности эндокринной ткани семенников со свето-темновым циклом. Не смотря на рост пролиферативной активности сперматогоний, эпифизарная недостаточность снижает продуктивность сперматогенеза, увеличивая количество поломок в структуре ДНК созревающих половых клеток. По-видимому, отсутствие в кровотоке мелатонина и его метаболитов, которые обладают выраженными антиоксидантными свойствами, приводит к росту повреждающего действия свободных радикалов на ДНК половых клеток.

Действие биоактивных веществ эпифиза на мужские гонады может быть опосредовано центральными эндокринными железами - гипоталамусом

и гипофизом, а также осуществляться непосредственным воздействием на герминативную и эндокринную ткань семенников. Влияние биологически активных веществ эпифиза на продукцию тканевых регуляторов пролиферации показано для некоторых обновляющихся тканей (Арав В.И. и соавт., 2008). В последнем случае, действие мелатонина и пептидов эпифиза осуществляется на уровне клеток Лейдига и сустентоцитов извитых семенных канальцев, модуляция активности которых приводит к формированию циркадианных ритмов пролиферации и дифференцировки половых клеток.

Рисунок 25. Схема эндокринной регуляции циркадианного ритма активности мужских гонад у полиэстричных животных.

Продукция эпифизом мелатонина носит ярко выраженный циркадианный характер. Его концентрация в крови достигает максимального уровня к середине ночи, что приводит к подавлению синтеза и секреции гонадотропных гормонов гипофиза и тестостерона и соответсвует пассивной фазе выявленных ритмов. Множественность пептидов эпифиза и доказанное наличие среди них как минимум одного антигонадотропного фактора, позволяет рассматривать олигопептиды, наряду с мелатонином, как регуляторы активности мужских гонад. Это подтверждается формированием ритмов активности семенников у эпифизэктомированных белых крыс посредством введения только олигопептидов без присутствия в кровотоке эпифизарного мелатонина.

Таким образом, нарушение циркадианной ритмичности активности мужских гонад в результате эпифизэктомии снижает адаптивные возможности организма. В первую очередь, это проявляется в нарушении суточного ритма синтеза и секреции тестостерона, который помимо регуляции репродуктивной функции является регуляторным звеном и других физиологических функций. Вторым отрицательным моментом отсутствия биоактивных веществ эпифиза в кровотоке можно отметить рост пролиферативной активности сперматогоний и повышение уровня структурных нарушений в наследственном материале созревающих половых клеток. Введение олигопептидов эпифиза в отсутствие мелатонина позволяет сформировать суточный ритм активности семенников, однако полного восстановления пространственно-временной организации гонад не происходит, так как сохраняется повышенная пролиферативная активность сперматогоний. Денервация семенника приводит к общему угнетению процесса сперматогенеза, компенсаторной гипертрофии клеток Лейдига, значительному росту экспрессии ферментов-индукторов апоптоза, в тоже время циркадианные ритмы активности гонад сохраняются.

выводы

1. Пространственно-временная организация паренхимы семенников характеризуется циркадианными ритмами пролиферации, апоптоза, дифференцировки созревающих половых клеток и активности гландулоцитов семенников.

2. Эпифизэктомия приводит к росту пролиферативной активности сперматогоний промежуточного типа на 9,4% и типа Б на 13,7%, исчезновению суточного ритма организации паренхимы семенников, рассогласованию активности гландулоцитов со свето-темновым циклом и росту экспрессии белков — индукторов апоптоза прокаспазы 3 (на 25%) и РАЯР-1 (на 32%).

3. Денервация семенника в течение 30 дней не приводит к полной утрате циркадианных ритмов пространственно-временной организации паренхимы гонад, снижая амплитуду колебаний выявленных ритмов и вызывая общее угнетение процесса сперматогенеза и компенсаторную гипертрофию клеток Лейдига

4. Олигопептиды эпифиза, вводимые эпифизэктомированным животным (однократно в начале темнового периода суток, на протяжении 14 дней), восстанавливают циркадианные ритмы пространственно-временной структуры паренхимы семенников, сохраняя повышенный уровень пролиферации сперматогоний.

5. Мелатонин, вводимый эпифизэктомированным животным (однократно в начале темнового периода суток, на протяжении 14 дней), не восстанавливает утраченные циркадианные ритмы функционирования мужских гонад и не приводит к компенсации нарушений хроноструктуры паренхимы семенников.

6. Наиболее общим морфологическим проявлением нарушения внегипоталамической эпифизарной и нервной регуляции структурно-функциональной организации паренхимы семенников является активация процессов апоптоза сперматогенных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленные в настоящем исследовании хрономодулирующие свойства олигопептидов эпифиза позволяют использовать их как основу для создания фармакологических препаратов, предназначенных для коррекции хронопатологии мужской репродуктивной системы.

2. Для оценки нарушений в структуре ДНК созревающих половых клеток целесообразно использование иммуноморфологических методов с количественной оценкой экспрессии ферментов ПАРП-1 и прокаспазы 3.

3. Разработанный метод эпифизэктомии мелких лабораторных животных рекомендуется использовать в экспериментальной лабораторной практике по определению свойств и оценке фармакологических эффектов олигопептидов эпифиза.

4. В качестве одного из факторов нарушения мужской фертильности следует рассматривать возникновение десинхроноза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

В журналах списка ВАК

1. Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарева Е.В. Влияние пептидов эпифиза на суточную динамику пролиферации сперматогоний белых крыс// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. — Том 137., №6., С.678-682.

2. Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарева Е.В. Роль пептидов эпифиза в формировании циркадианного ритма миготической активности сперматогоний /АГезисы 5 общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. — Морфологические ведомости. -2004. -№1-2, - с.38-39.

3. Слесарева Е.В., Галныкина H.H., Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарев С.М. Пептиды эпифиза в формировании циркадианного ритма сперматогенеза //Морфологические ведомости.-2005.-№.3-4.-С.91-94.

4. Слесарева Е.В., Арав В.И., Галныкина H.H. Эиифизарная регуляция суточной активности эндокринной ткани семенников белых крыс// Морфология.-2006,-Вып.4.-Том 129.-С 114.

5. Арав В.И., Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Сыч В.Ф. Биоактивные вещества эпифиза в регуляции сперматогенеза // Вестник новых медицинских технологий. - 2006. - T.XIII, №1. -С.112-114.

6. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. Попытка формирования циркадианного ритма пролиферации соматических и половых клеток путем введения мелатонина. // Морфологические ведомости. "С 2007. - №3-4. С.60-61.

7. Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. Метод экстирпации эпифиза у белых крыс// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Том 146., №9., С.358-360.

8. Слесарева Е.В., В.И. Арав, Слесарев С.М. Эиифизарная регуляция циркадианного ритма// Материалы Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации». - Оренбург, 2008 -Морфология. Т. 134, Ks5.-C.92.

9. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Хайруллин P.M. Суточная структура морфофункциональной организации эндокринной ткани семенников при нарушении эпифизарной регуляции //Морфологические ведомости. - 2009. - №3-4,- С.96-99.

10. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Хайруллин P.M. Сравнительные эффекты денервации и эпифизэктомии на циркадианный ритм активности сперматогенной и эндокринной ткани семенников// Морфологические ведомости. - 2011. - №2,- С.62-66.

11. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Ляпейкова О.В. Состояние микроциркуляторного русла семенников крыс после эпифизэктомии// Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №3; url: www.science-education.ru/103-6391

12. Слесарева Е.В., Слесарев С М., Арав В.И., Ляпейкова О.В., Гальчин A.B. Циркадианный ритм апоптоза сперматогенных клеток интактных белых крыс и его нарушения после эпифизэктомии // Современные проблемы науки и образования.-2013. -№ 1; URL: wvvw.science-education.ru/107-8251

13. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Ляпейкова О.В., Гречнев A.C. Влияние денервации семенника на экспрессию ферментов-индукторов апоптоза в сперматогенных клетках// Фундаментальные исследования. — 2013. - №5. — 139-142.

Монография

14. Arav V.l., Slesareva E.V., Slesarev S M. Pineal Gland and Circadian Rhythm regulation/Progress in Circadian Rhythm Research / Nova Science Publishers, 2008. - 367 p.

Публикации в других изданиях:

15. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Циркадианный ритм сперматогенеза и его эпифизарная регуляция //Материалы второго международного симпозиума "Проблемы ритмов в естествознании". Москва, - 2004. - с.40-43.

16. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации// Материалы второго международного симпозиума "Проблемы ритмов в естествознании" Москва, - 2004. - с.44-46.

17. Arav V.l., Sych V.F., Slesareva E.V. Biorhythmical Organization of Spermatogenesis // 7 International Congress of Vertebrate Morphology. - J. of Morphology.- 2004,-№3. -VoI.274-275.

18. Галныкина H.H., Слесарева E.B., Арав В.И. Биоритмы активности эндокриноцитов семенников белых крыс// Ученые записки Ульяновского государственного университета. Серия «Биология». - 2006. - Вып.1 (10).- С.16-19

19. Галныкина H.H., Слесарева Е.В., Арав В.И. Суточная активность эндокринной ткани семенников белых крыс// Материалы Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» - Белгород, 2006.-С.41.

20. Слесарева Е.В., Арав В.И., Галныкина H.H., Фролов A.B. Биологически активные вещества эпифиза в регуляции пролиферации сперматогоний//Материалы Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» - Ульяновск, 2005.-С.106.-107.

21. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Сравнение эффективности введения мелатонина и олигопептидов эпифиза на формирование циркадианного ритма пролиферации сперматогоний //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека», 24-28 сентября 2007г, г. Ульяновск. - С.227-228.

22. Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. Эпифизарная регуляция временной организации пролиферации// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». - Том V Новое в морфологии живых организмов (норма и патология). Ульяновск, 2008. -С.6-8.

23. Слесарева Е.В., Слесарев С М., Арав В.И. Перспективы использования биологически активных пептидов эпифиза в качестве хрономодулирующего средства при нарушениях циркадианного биоритма пролиферации// Материалы межрегиональной научно-практической юбилейной конференции «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации», 6-7 февраля 2008 г., г. Воронеж, С.410-412.

24. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. Временная организация пролиферации соматических и половых клеток и ее эпифизарная регуляция // Материалы 4 международной научно-практической конференции «Составляющие научно-технического прогресса». Тамбов, 2008. С.114-115.

25. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. Изменение временной организации пролиферации соматических и половых клеток после эпифизэктомии// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные

вопросы ветеринарной медицины, биологии и экологии», 26-28 мая 2009 г. Ульяновск.-С.108-109.

26. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации соматических и половых клеток// Труды международной конференции «Инновационные технологии в гуманитарных науках». - Ульяновск, 2009. - С.91-92.

27. Арав В.И., Слесарева Е.В., Слесарев С.М. Роль олигопептидов эпифиза в формировании циркадианных биоритмов// Материалы международной конференции «Физиология развития человека», секция 2 «Физиология развития нейроэндокринной системы», Москва, 22-24 июня 2009 г.- М.: Вердана, 2009. -С.138-139.

28. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. Нарушения суточного ритма активности клеток Лейдига семенника при патологии эпифиза// Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов (26-30 мая 2009). Т.2. - Самара, 2009. - С.464-465.

29. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Модификация оперативного подхода при удалении эпифиза у белых крыс// Труды 4-ой международной конференции «Инновационные технологии в гуманитарных науках». Ульяновск, 2010. -С.244-245.

30. Слесарева Е.В., Санников И.А., Слесарев С.М., Арав В.И. Выявление скрытых периодичностей сперматогенеза// Материалы международной научной конференции «Наука и образование: фундаментальные основы, технологии, инновации». - Оренбург, 2010. - С.263-265.

31. Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. Оперативное удаление эпифиза у мелких лабораторных животных// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Ульяновск, 2010. -С.315-318.

32. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. Эпифизарная регуляция активности эндокринной ткани семенников// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Ульяновск, 2010. - С.447-450.

33. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Хайруллин P.M., Денисова О.Ф. Нервная и эндокринная регуляция суточной активности эндокринной ткани семенников// Материалы IV Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». -Ульяновск, 2011. - С.248-250.

34. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Денисова О.Ф. Нервная система в регуляции суточной активности мужских гонад // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2011. - №2. - С.144-146.

35. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Ляпейкова О.В., Гречнев А.Е. Регуляция суточного ритма течения сперматогенеза у белых крыс// Ульяновский медико-биологический журнал. - 2012. - №4. - С.69-73.

36. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Денисова О.Ф., Ляпейкова О.В. Адаптивные возможности мужских гонад при нарушении эпифизарной и нервной регуляции// Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Экологическая физиология и медицина: наука, образование, здоровье населения». - Ульяновск, 2012. - С. 191-194.

37. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И., Хайруллин P.M. Применение методов математического анализа с целью диагностики хронопатологии мужских гонад// Материалы IV съезда Российского общества патологоанатомов (4-7 июня 2013). - Белгород, 2013. - С.326-327.

Отпечатано в "Типографии Облучинского" (ИП Облучинский Ю.Н., 432063, г. Ульяновск, ул. Гончарова, 11а; тел. (8422) 42-12-83), ИНН 732300008161. Тираж 100 экземпляров. Заказ № 082906. Дата выхода 29.08.2013 г.