Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Состояние сперматогенеза и антиспермальный аутоиммунный ответ после кратковременной повторной ишемии семенника у крыс

Актуальность темы. В то время как причины бесплодия у женщин исследованы довольно подробно, в отношении мужского бесплодия успехов намного меньше. Но жизнь заставляет обратить на мужское бесплодие не менее пристальное внимание-/ чем на женское. Как пишет И.Ф. Юнда (1989), анализ показывает, что в 45% случаев причиной бездетного брака является бесплодие у мужчин. Аналитические исследования публикаций за период с 1938 по 1991 год выявили, что количественные и. качественные показатели спермы у мужчин неуклонно ухудшаются (Limet J., 1995). Причины для ряда вариантов мужского бесплодия- известны, другие медики относят к "факторам неясной этиологии". А.Ф. Астраханцев и Н.М. Крупнов (1996) указывают на то, что- исследование изменений, наступающих в яичках при гемодинамических нарушениях, в настоящее время представляет большой практический интерес.

Одним из факторов патогенеза мужского бесплодия могут быть ишемические повреждения, связанные с нарушением кровоснабжения яичек. На это указывают прежде всего клинические данные (в частности, Порудоминский И.М., 1964, 1968,- Homonnai Z.T. et al., 1980; Бреслер В.М. и др., 1985; Люлько A.B. и др., 1985 и др.). Клиницистами отмечены различные причины расстройства кровообращения, способные вызывать повреждение яичек и приводить к их атрофии. Это варикоцеле, паховые грыжи, перекруты семенного канатика, рубцовые изменения ткани после операций грыжесечения или вазэктомии (Neuman К., 19&Q; Koontz A.R., 1965; Порудоминский И.М., 1968; Грицуляк Б.В., 1978, 1985; Курносов A.B., 1979; Bartsch G. et al., 19-80; Homonnai Z.T. et al., 1980; Тшктпнскяй

0. JI. и др., 1983; Kalnes R. et al., 1984; Люлько A.B. и др., 1985) . В частности, как указывают Ю.А. Нестеренко и Б.А. Ярыг-ин (1990) , огромное количество ежегодно производимых паховых грыжесечений вызывает необходимость уточнения причин и частоты бесплодия после таких операций. Для теоретического уточнения возможных причин мужского бесплодия необходимы экспериментальные исследования последствий ишемии для сперматогенеза, которые проводятся на лабораторных животных.

Во многих работах и на различных животных экспериментально была доказана возможность развития атрофия семенника после длительной непрерывной ишемии (Oettle A.G., Harrison R.G., 1952; Smith G.I., 1955т Bernstorf E.G., 1957; Мельман Е.П. и др., 1969; Райцина С.С., 1970; Грицуляк В.В., Шутка Б.В., 1976; Инау-ри A.A., 1980). Кроме того, было обнаружено, что даже кратковременная ишемия семенника способна вызывать заметные повреждения семенных канальцев и нарушение сперматогенеза в ишемизированном семеннике (Oettle A.G., Harrison R.G., 1952; Steinberger Е., Tjioe n.J., 1969; Tjioe E>. J., Steinberger E., 197 0; Горба тюк Д.Л., Баширов M.B., 1974; Грицуляк Б.В., 1974, 1985; Гоциридзе O.A. и др., 197 9; Мельман Е.П. и др., 1979,- Наращин В.М., 1984) .

Кратковременной ишемией в своем исследовании мы называем ишемию длительностью менее- 1 часа.

Однако в случае кратковременной ишемии исследователи столкнулись с неоднозначными результатами. Наблюдения разных авторов зачастую совершенно не совпадают и даже противоречат друг другу. Достаточно сравнить экспериментальные работы, проведенные на крысах Oettle A.G., Harrison R.G. (1952), Steinberger E., Tjioe

D.J. (1969), Паращин В.M. (1984а, 19846). Описание нарушений сперматогенеза после кратковременной ишемии выглядит по-разному в разных работах, хотя отдельные детали повторяются. Новые исследования в этой области остаются по-прежнему актуальными.

Спорным также остается вопрос о самом механизме повреждения яичек у человека и семенников у животных после их ишемии. С одной стороны, существуют представления о высокой чувствительности сперматогенного эпителия к гипоксии. Тогда ишемические повреждения можно было бы объяснить прямым гипоксическим действием ишемии при недостаточном кровоснабжении. С другой стороны, существуют многочисленные данные об аутоиммунном характере повреждения семенников при различных воздействиях (см.г Райцина С.С., 1970, 1983; Ендолов В.В., 1984). С позиций аутоиммунных повреждений семенников следует принимать &о внимание-, что в процессы нарушения сперматогенеза после ишемии могут вовлекаться иммунные механизмы. Это положение, в свою очередь, само нуждается в экспериментальном исследовании.

До сих пор не решен даже такой важный для практики вопрос, как определение критического срока ишемии, после которого последствия ишемии становятся необратимыми или возникает стойкое нарушение сперматогенеза. Это затрудняет выбор порогового времени ипгемического воздействия на семенник как в медицинской или сельскохозяйственной практике, так и в экспериментальном исследовании. В качестве допустимого срока ишемии различные авторы называют следующие интервалы времени: 4 часа (Smith G.I., 1955); 90 минут (Steinberger Е., Tjioe D.J., 1969); 30 минут (Горбатюк Д.Л., 1980); 20-25 минут (Гоциридзе O.A. и др., 1979). А вот

В.М. Паращин (1984) предложила учитывать при операциях чувствительность тестикулярной ткани к ишемии при сверхкраткой длительности воздействия - 3-5 минут.

Как оказалось, совершенно недостаточно освещен в научной литературе вопрос о влиянии на сперматогенез повторной кратковременной ишемии семенника. Между тем, имеются данные, что рецидив паховой грыжи встречается у каждого четвертого больного (Sparsf B.N., Halse Gh., 19^3), и что опасность развития атрофии яичка при оперировании повторных грыж возрастает (Koontz A.R., 1965}. О том, что повторная гипоксия яичка довольно часто встречается в клинической практике, пишут Kamarad V. and Vseticka J. (1981), а также A.B. Люлько с соавторами (1985). Таким образом., исследование последствий повторной ишемии и ее влияния на сперматогенез имеет практическое- значение- и представляет интерес для клиники.

Повторяющаяся ишемия семенника представляет собой особую экспериментальную модель в изучении нарушений сперматогенеза. Вторичное воздействие может послужить тем дополнительным стимулом, который способен сделать патологические процессы более явными и очевидными. Это явление приобретает особую важность, если предположить, что в процессе повреждения участвуют аутоиммунные механизмы. В этом случае вторичная антигенная стимуляция, которая, по нашему предположению, вызывается при повторном ишемиче-ском воздействии за счет прямого повреждающего действия гипоксии, может провоцировать развитие вторичного иммунного ответа. Особый интерес этот факт представляет в свете концепции аутоиммунного повреждения семенника при различных воздействиях, которую развивала С.С. Райцина (1970, 1974, 1980, 1983, 19856). Если исходить из представлений об аутоиммунном характере посттравматических повреждений семенника, то при повторяющейся ишемии семенника можно ожидать более выраженных повреждений, чем при однократной ишемии семенника такой же суммарной длительности. В наших исследованиях впервые было сформулировано это предположение (см.: Sazonov Ч.Р., 1989).

Таким образам, при всей очевидности отрицательного действия ишемии на семенник, картина постишемических нарушений сперматогенеза и ее патогенез после повторной ишемии ясны далеко не окончательно. Особенно нуждается в дополнительных исследованиях возможное воздействие односторонней ишемии семенника на парный неишемизированный орган. Поскольку сперматогенез обеспечивается работой двух семенников, кажется вполне логичным допустить, что нарушение сперматогенеза в одном семеннике может компенсироваться работой интактного контралатерального органа. Однако если это не так, и повреждения после односторонней ишемии могут нарушать процесс сперматогенеза в целом, то это может привести к необратимому снижению фертильности. В этом случае требуется особенно бережное обращение даже с одним семенником на случай возможных общих ишемических последствий. Представляет большой интерес сравнение результатов однократного и повторного воздействия ишемии на семенник при ишемии краткой длительности (менее 1 часа). Если существуют принципиальные отличия в повреждающем действии на сперматогенез однократной и повторяющейся ишемии семенника, то к случаям повторной ишемии потребуется особый подход в клинической практике. Исследование механизма воздействия острой однократной и повторной ишемии на сперматогенез важно, в частности, для: лечения последствий ущемления семенного канатика у человека.

Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение состояния сперматогенеза в ишемизированном и контрала-теральном неишемизированном семеннике у крыс после односторонней 40-минутной ишемии семенника, как однократной, так и повторной, а также исследование клеточных антиспермальных аутоиммунных реакций на фоне постишемических структурных нарушений сперматогенеза .

Задачи исследования:

1. Изучить влияние односторонней ишемии семенника длительностью 40 минут на массу ишемизированного органа при многократном повторении ишемии.

2. Оценить состояние сперматогенеза в ишемизированном семеннике после однократной ишемии.

3. Оценить состояние сперматогенеза в неишемизированном контрала-теральном семеннике после однократной ишемии.

4. Исследовать состояние сперматогенеза после двукратной ишемии в ишемизированном семеннике.

5. Исследовать состояние сперматогенеза после двукратной ишемии в контралатеральном неишемизированном семеннике.

6. Исследовать состояние клеточного иммунитета в реакции торможения прилипания макрофагов после двукратной ишемии.

7. Изучить поведение перитонеальных клеток в присутствии тестику-лярных антигенов в условиях in vivo после двукратной ишемии.

Научная новизна исследования. В доступной нам литературе не обнаружено работ по исследованию влияния повторной кратковременной ишемии (длительностью менее 60 минут) на сперматогенез в обоих семенниках. В данном исследовании впервые изучено действие повторной односторонней ишемии длительностью 40 минут на оба семенника. Впервые показано развитие процесса очагового повреждения сперматогенного эпителия семенных канальцев после повторной ишемии длительностью 40 минут в обоих семенниках. Впервые доказано участие аутоиммунных реакций клеточного типа в механизмах постишемических повреждений сперматогенного эпителия с помощью реакций торможения прилипания перитонеальных макрофагов, взятых у животных, подвергнутых ишемии семенника. Впервые исследовалась миграционная активность перитонеальных клеток в условиях in vivo в присутствии тестикулярных антигенов в специально разработанной камере, защищенной авторским свидетельством (Сазонов В.Ф., Ендо-лов В.В., 19-82, а.с. № 10115-33 СССР) . Показано усиление миграционной активности перитонеальных клеток в присутствии тестикулярных антигенов после ишемии семенника.

Теоретическая и практическая значимость. В работе уточняются теоретические представления о нарушении сперматогенеза после повторного ущемления семенного канатика и о патогенезе атрофии семенника. Рассматриваются последствия повторной ишемии семенника краткой длительности для состояния сперматогенеза. Практическая значимость работы заключается в том, что знание характера влияния повторной ишемии на сперматогенез способствует выбору оптимальной тактики лечения больных с ущемлением семенного канатика и с ишемизированным яичком.

Фактические данные и выводы работы могут найти применение в иммунологии репродукции человека и животных, в андрологии при установлении причин снижения фертильности и в профилактике мужского бесплодия, в хирургии при оперативном вмешательстве по поводу пахово-мошоночных грыж, перекрутов семенного канатика, водянок яичка, варикоцеле и в послеоперационном лечении, а также при обучении студентов вузов соответствующих специальностей.

Основные положения диссертации-, выносимые на защиту г

1. Кратковременная ишемия семенника длительностью 40 минут при повторяющихся воздействиях вызывает в ишемизированном семеннике развитие патологического процесса, приводящего к очаговому повреждению сперматогенного эпителия и к атрофии органа.

2. Повторная односторонняя ишемия семенника длительностью 4 0 минут способна вызывать структурные нарушения сперматогенеза как в ишемизированном, так и в контралатеральном неишемизированном семеннике.

3. В патологический процесс повреждения семенников при односторонней многократной ишемии вовлекаются иммунокомпетентные клетки.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 9-м Всесоюзном съезде Анатомов, гистологов и эмбриологов (Минск, 1981), на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунология репродукции" (Киев, 1987), на 7-м Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Варна, Болгария, 28-31 мая 1988), на Международной встрече по репродуктивной иммунологии (Puszczykowo-Niwka, Poland, May 22-25, 1989), на межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 10 ноября 1999). Доклад на 7-м Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Варна, Болгария, 28-31 мая 1988) отмечен Дипло

168 ВЫВОДЫ

Многократная односторонняя ишемия семенника длительностью 40 минут у крыс сопровождается атрофией ишемизированного органа и очаговыми повреждениями сперматогенного эпителия семенных канальцев как в ишемизированном, так и в контралатеральном семеннике. Наблюдается- прогрессирующая- атрофии- ишемизированного органа, выраженная в достоверном (р<0,05) уменьшении его массы по сравнению- с контролем и с контралатеральным семенником при сроках наблюдения от 7 суток до 100 суток после первого воздействия. Степень атрофии у разных животных одной серии варьирует в широких пределах от 10% до 60%.

Б ответ на повторную ишемию в контралатеральном неишемизирован-ном семеннике наблюдаются нарушения сперматогенеза, сходные по своему характеру с нарушениями а., ишемизированном- семеннике, но более легкой степени.

После двукратной ишемии наблюдаются патологические изменения в сперматогенном эпителии на ультаструктурном уровне как в ишеми-зированпых, так и в контралатералных семенниках. Обнаруживаются также нарушения в структурах гемато-тестикулярного барьера. Б контралатеральном семеннике в ответ на повторную ишемию- парного органа, так же как и в ишемизированном семеннике, появляются периваскулярные- гранулоцитарно-лимфоидные- инфильтраты, что характерно для аутоиммунного орхита.

Повторная ишемия семенника у крыс- вместе с нарушениями сперматогенеза сопровождается развитием клеточного аутоиммунного ответа на тестикулярные антигены. В реакции торможения прилипания нери-тонеальных макрофагов в пластиковых лунках позитивный ответ на спермальные антигены достигает 91+10 % против 3±2% в контрольной группе (р<0,001).

6. После многократной ишемии аутоиммунный ответ на тестикулярные антигены в реакции торможения прилипания перитонеальных макрофагов в стеклянных пробирках увеличивается и составляет 3 6±13-% против 25+6% в контрольной группе (р<0,05).

7. При обогащении взвеси макрофагов лимфоцитами из регионарного пахового лимфоузла в реакции торможения прилипания макрофагов к стеклу позитивный ответ усиливается у ишемизированных животные на 10-20% (р<0,01) и не изменяется в контрольной группе, что свидетельствует о сенсибилизации лимфоцитов к тестикулярным антигенам после ишемии семенника.

8 . Ишемия семенника приводит к- антигенспецифическому повышению миграционной активности перитонеальных клеток. Площадь миграции перитонеальных клеток в специальных агаровых камерах, содержащих тестикулярные антигены и имплантированных в брюшную полость крыс, после ишемии семенника увеличивается в 5 раз по сравнению с контролем без ишемии (р<0,001).

9. Полученные данные о структурных нарушениях з контралатеральных семенниках, появление периваскулярных лимфоидных инфильтратов в обоих семенниках и позитивные ответы в иммунологических клеточных тестах на тестикулярные антигены свидетельствуют о вовлечении механизмов аутоиммунного- ответа клеточного типа в патогенез нарушения структуры семенников после ишемии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе доказано, что кратковременная ишемия длительностью 40 минут вызывает явные нарушения сперматогенеза при повторении ишемического воздействия. Патологический процесс охватывает оба семенника. Ишемизированный семенник атрофируется, что выражается в прогрессирующей после ишемии потере массы по сравнению с контрала-теральным. Сперматогенез страдает в обоих семенниках, в большей степени, конечно, в ишемизированном. Состояние сперматогенеза охарактеризовано количественно в виде процентного соотношения семенных канальцев с повреждениями разной тяжести. Типичная картина качественных изменений представлена на светооптических и электронно-микроскопических фотографиях срезов семенника. Для нарушений сперматогенеза типично разрыхление сперматогенного эпителия, отслоение круглых сперматид от пахитенных сперматоцитов, появление пустот в базальном отделе семенных канальцев и слущивание незрелых форм половых клеток в просвет канальцев. В обоих семенниках появляются деформированные семенные канальцы и лимфоцитарные инфильтраты. Общая картина повреждений сходна в обоих семенниках, но в контрала-теральном она менее выражена.

Доказано, что в патологический процесс постишемических повреждений семенников вовлекаются иммунокомпетентные клетки. Получены позитивные клеточные иммунные ответы на тестикулярные антигены в двух модификациях реакции торможения прилипания перитонеальных макрофагов. Кроме того, наблюдался феномен усиления ответа в данной реакции при обогащении взвеси макрофагов лимфоцитами из пахового лимфоузла. У контрольных неишемизированных животных лимфоциты не усиливали реакцию. В специальных опытах с агаровыми камерами, имплантируемыми в брюпгную полость крыс, т. е. в условиях in vivo,

167 было доказано специфическое усиление миграции перитонеальных клеток в присутствии тестикулярных антигенов. Т.е. был продемонстрирован феномен положительного хемотаксиса на тестикулярные антигены, который резко усиливался после ишемии семенника. Эта модель доказывает вовлеченность активно мигрирующих иммунокомпетентных клеток в процессы повреждения:.семенников.после их ишемии.

Таким образом, доказано усиление повреждающего действия ишемии на сперматогенез при ее повторении, повреждающее действие ишемии на контралатеральный интактный семенник и участие в патогенезе лостишемичес:кого нарушения сперматогенеза реакций клеточного анти-спермального аутоиммунитета.