Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфогенез и иммуно-гистохимические особенности опухолевой трансформации слизистой оболочки желудка при аденоме и аденокарциноме

На правах рукописи

Ванхальский Алексей Владимирович

ПАТОМОРФОГЕНЕЗ И ИММУНО-ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОПУХОЛЕВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ АДЕНОМЕ И АДЕНОКАРЦИНОМЕ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН (Новосибирск) и на кафедре онкологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Аутеншлюс Александр Исаевич

доктор медицинских наук,

профессор Фурсов Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

Майбородин Игорь Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовой клетки ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Жукова Наталья Анатольевна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории фармакологических исследований ФГБУН Новосибирский институт органической химии имени I ГН.Ворожцова СО РАН.

Ведущая организация:

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы (Новосибирск).

Защита состоится: «_» _ 2015 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Молодых Ольга Павловна

РОССИЙСКАЯ

I"^лио^е^а^БЩАЯ характеристика работы

2015

Актуальпость темы. Рак желудка является одной из самых важных социально-экономических проблем и характеризуется высокой смертностью в течение первого года после установления диагноза, что свидетельствует о его поздней выявляемое™. В России в 75% случаев рак желудка выявляется в III - IV стадиях, что обусловливает неудовлетворительные результаты лечения и негативный прогноз. Только в 10% случаев рак желудка выявляется при эндоскопии на более ранних стадиях заболевания (Поддубный Б.К. и др., 2011; Bertuccio P. et al., 2009).

Наиболее распространенным является спорадический рак, на долю которого приходится не менее 90% всех случаев. Некоторые авторы считают, что механизм этого новообразования представлен рядом последовательных состояний, таких как поверхностный гастрит, хронический атрофический гастрит, полная метаплазия, неполная метаплазия, аденома, преинвазивная карцинома и инвазивный рак (McColl К.Е. et al., 2007). Эта цепь событий получила название каскад Корреа (Соггеа Р., 1988). Маркерами постепенного перехода от атрофического гастрита к метаплазии и аденоме могут служить соотношение сывороточных концентраций пепсиногена 1 и II (Li P. et al., 2013), а также тип муцина, содержащегося в клетках антральных желез (Vernygorodskyi S., 2013). Таким образом, у больных на фоне хронического атрофического гастрита создаются условия для возникновения аденомы и рака желудка (Осадчук A.M. и др., 2007).

При атрофическом гастрите, представляющем собой хронический процесс, инфильтрация слизистой оболочки вызывает нарушение пролиферации и апоптоза эпителиальных клеток, что в дальнейшем приводит к возникновению метаплазии и дисплазии слизистой оболочки (Маев И.В. и др., 2006; Chen S. et al., 2011). Отличительным признаком аденомы желудка, относящейся к облигатному предраку, является наличие дисплазии железистого эпителия (Аруин Л.И. и др., 1998).

Большую роль в развитии патологических процессов в слизистой оболочке желудка играют иммунокомпетентные клетки и секретируемые ими цитокины. Многие авторы отмечают неоднозначную роль как про-воспалительных, так и противовоспалительных цитокинов в патогенезе опухолевых процессов (Szkaradkiewicz A. et al., 2010; Jing Liang et al., 2011). Известно также, что аутоантитела к цитокинам участвуют в регуляции их биологической активности; образуя иммунные комплексы с цитокинами, аутоантитела могут приводить к нейтрализации специфических функций цитокинов за счет предотвращения соединения их с рецептором, могуг увеличивать время циркуляции и пролонгировать действие цитокинов, а в некоторых случаях - усиливать биологические эффекты цитокинов (Воушап О. et al., 2006; Watanabe М. et al., 2010).

Изучение цитокинпродуцирующего потенциала иммунокомпетентных клеток крови при опухолевой трансформации слизистой оболочки желудка

является актуальной проблемой, решение которой даст возможность выявить особенности продукции иммунокомпетентными клетками (ИКК) медиаторов воспаления при канцерогенезе в слизистой оболочке желудка.

Цель исследования: изучить роль цитокинпродуцирующих клеток крови и изменений уровня антител к фактору некроза опухолей а в пато-мофрогенезе дисрегенераторных процессов и опухолевой трансформации слизистой оболочки желудка.

Задачи исследования:

1. Определить концентрации пепсиногена I (PG1) и пепсиногена II (PGII) в сыворотке крови у здоровых индивидов и у больных с аденомами, гиперпластическими полипами и аденокарциномами желудка.

2. Определить концентрации цитокинов 1L-Ip, IL-IRa, TNFa, IL-2, IL-6, IL-8, IL-IO, IL-17, IL-18, MCP-l.VEGF и IFNy всупернатанте клеток периферической крови при влиянии на них in vitro поликлональных активаторов иммунокомпетентных клеток и концентрации rex же цитокинов в сыворотке крови у здоровых лиц и у больных с аденомами, гиперпластическими полипами и аденокарциномами желудка.

3. Определить в сыворотке крови концентрацию цитокина IL-18BP, регулирующего биологический эффект IL-18, и уровни аутоангител к фактору некроза опухоли ('ЖFa) у больных с аденокарциномами желудка.

4. Изучить патологогистологические параметры желудка и пролифера-тивную активность железистых эпителиоцитов (по Ki-67) при аденомах, гиперпластических полипах и аденокарциномах.

5. Изучить корреляционные связи между показателями цитокинпроду-цирующей функции клеток крови, уровнем антител к TNFa, выраженностью атрофии слизистой оболочки желудка и пролиферапгивной активности эпителиоцитов у пациентов с аденомами, гиперпластическими полипами и аденокарциномами желудка и патологогистологическими характеристиками, наличием или отсутствием метастазов.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что у больных с аденомами желудка концентрация пепсиногена I в сыворотке крови и величина отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II были статистически значимо более низкими по сравнению со здоровыми лицами. У больных с гиперпластическими полипами показатели соотношения PGI/PGII находились в пределах нормативных значений, что свидетельствовало об отсутствии атрофичсских изменений слизистой оболочки и об ее нормальной функциональной активности.

Впервые установлено, что индекс влияния поликлональных активаторов ИКК на продукцию клетками крови IFNy, обладающего антипро-лиферативным действием, у пациентов с аденомами слизистой оболочки желудка находился на более высоком уровне по сравнению с пациентами с гиперпластическими полипами.

Впервые показано, что у больных с аденомами содержание пепсиногена I в сыворотке крови находится в обратной корреляционной связи с

процентом Кл-67-позитивных эпителиоцитов, который также находится в обратной корреляционной связи с индексом влияния поликлональных активаторов (ИВПА) 1НЧу - цитокином, обладающим антипролифера-тивным действием.

Впервые показано, что у больных с аденомами желудка по сравнению со здоровыми происходит повышение индекса влияния поликлональных активаторов ИКК на продукцию клетками крови рецепторного антагониста 1И, что приводит к незавершенности воспаления и его торпидному течению, а в совокупности с повышением индекса влияния поликлональных активаторов ИКК на продукцию клетками крови 1Ь-18, стимулирующего пролиферативные процессы, - способствует возникновению диерегене-раторных изменений в эпителии желудка.

Впервые показано, что у пациентов с аденокарциномой желудка отмечается прямая корреляционная связь между способностью клеток крови к продукции [Ь-1Яа под влиянием поликлональных активаторов ИКК и количеством пораженных метастазами регионарных лимфоузлов, и обратная - между продукцией клетками крови 1Ь-2 под влиянием поликлональных активаторов ИКК и количеством низкодифференцировапных клеток в опухоли.

Впервые показано, что у пациентов с аденокарциномой желудка существует прямая корреляционная связь между содержанием пепсиногена II в сыворотке крови и патогистологическими параметрами, свидетельствующими о более высокой степени злокачественности опухоли.

Впервые показано, что у пациентов с аденокарциномой желудка существует обратная корреляционная связь между содержанием аутоантител класса А к Т»Ра в сыворотке крови и количеством пораженных метастазами регионарных лимфоузлов.

Теоретическое и практическое значение. Полученные данные, характеризующие цитокинпродуцирующий потенциал клеток крови и факторы регуляции биологических эффектов цитокинов у больных с аденомами и раком желудка создают основу для разрабогки новых подходов в диагностике опухолей желудка и прогнозировании злокачественной трансформации, в частности, показатели ИВПА на продукцию клетками крови 1Ь-1 Яа, II ,-18, ТЫЬ'а, IРЫу, уровни АТ класса А в сыворотке крови к тара, концентрации в сыворотке крови пепсиногенов I и II, 1Ь-1Яа, II.-18 могут быть использованы в качестве критериев степени дисплазии у больных с аденомами желудка.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс и научную работу кафедры онкологии Новосибирского государственного медицинского университета, в практику Научно-исследовательского института биологии и биофизики СО РАМН (г. Новосибирск). Благодаря применению стандартизованных наборов реагентов для культивирования и поликлональной активации клеток и определения цитокинов в супернатантах клеток цельной крови появилась

возможность сравнивать результаты изучения цитокинпродуцирующей функции клеток, полученные в различных лабораториях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У пациентов с аденомами желудка концентрация пепсиногена 1 в сыворотке крови и величина отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II были статистически значимо более низкими по сравнению со здоровыми лицами, что соответствует развитию атрофии слизистой оболочки желудка и подтверждено данными биопсии. При аденомах желудка концентрация пепсиногена I находилась в обратной корреляционной связи с процентом Кл-67-позитивныхэпителиоцитов, а при аденокарциномах установлены прямые корреляционные связи между концентрацией пепсиногена II и патологогистологическими параметрами, характеризующими степень тяжести опухолевой прогрессии, и обратные - между отношением уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II и количеством сосудов с опухолевыми эмболами, а также количеством опухолевых клеток с митозами.

2. У пациентов с аденомами отмечены более высокие значения ИВПА ТЫБа, ИВПА 1ЫЯа, ИВПА 1Ь-18 и ИВПА №N7 по сравнению с группой больных с аденокарциномами. Значение ИВПА II,-18 находилось в прямой корреляционной связи со степенью дисплазии при аденомах. При сравнении показателей больных с аденомами желудка с показателями пациентов с гиперпластическими полипами желудка достоверные различия по ИВПА отмечались только по продукции клетками крови 1ГЫу. У пациентов с аде-нокарциномой желудка выявлены обратные корреляционные связи между уровнем АТ класса А к ТЫ1;а и количеством пораженных метастазами регионарных лимфоузлов и между ИВПА 11.-2 и содержанием в опухоли низкодифференцированных клеток.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на: XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология -практическому здравоохранению» (Москва, 2012); семинаре Ф1 БУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН (Новосибирск, 2014); расширенном заседании кафедры онкологии Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2014).

Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 7 работ - все в научных рецензируемых журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК для публикаций результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 8 таблицами. Указатель использованной литературы содержит 242 источника, из которых 14 отечественных и 228 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследована периферическая кровь 101 пациента, из них 32 больных были с аденомами желудка на фоне хронического атрофического гастрита, 15 больных с гиперпластическими полипами (группа пациентов, не имевших потенциала злокачественной трансформации), 24 больных с аденокарциномами желудка. Кровь забирали до проведения оперативного вмешательства. У этих же больных был получен операционный и биопсийный материал. В качестве контрольной группы исследовали периферическую кровь 30 условно здоровых лиц без злокачественных и доброкачественных новообразований в анамнезе и без обострения хронических воспалительных заболеваний.

Группа пациентов с гиперпластическими полипами была группой сравнения. Гиперпластические полипы представляли образования с про-лифсрирующим желудочным эпителием. Причиной их возникновения могут быть аутоиммунный гастрит или гастрит, вызванный Н. pylori (Jain R., Chetty R., 2009). Кроме того, гиперпластические полипы встречаются при синдроме Пейтца-Егерса, синдроме ювенильного полипоза и синдроме Кронкайта-Канада (Jin J.S. et al., 2012).

Из 24 больных раком желудка женщин было 10 (42%) в возрасте от 50 до 71 года, мужчин - 14 в возрасте от 52 до 76 лет (58%); средний возраст пациентов с раком желудка составил 62,3 года.

Для оценки стадии опухолевого процесса у пациентов с раком желудка использовалась международная классификация TNM (6-е издание, 2002). Распределение пациентов с аденокарциномой слизистой оболочки желудка по стадиям приведено в табл. 1.

При патоморфологическом исследовании у всех пациентов опухоли были представлены аденокарциномами различной степени дифферен-цировки: 5 (20,8%) высокодифференцированные, 13 (54,2%) умеренно дифференцированные и 6 (25%) низкодифференцированные.

Из 32 пациентов с аденомами желудка женщин было 24 (75%) в возрасте от 49 до 80 лет, мужчин - 8 (25%) в возрасте от 51 до 71 года; средний возраст пациентов с аденомами составил 61,9 лет.

Из 15 пациентов с гиперпластическими полипами желудка женщин было 13 (86,7%) в возрасте от 48 до 73 лет, мужчин-2 (13,3%) в возрасте от 48 до 59 лет; средний возраст пациентов с полипами составил 59,5 лет.

В контрольной группе было 15 женщин (50%) в возрасте от 47 до 74 лет и 15 мужчин (50%) в возрасте от 41 до 76 лет; средний возраст составил 59,3 лет.

Обследованные пациенты находились на лечении в хирургических отделениях Новосибирского областного онкологического диспансера. Все пациенты дали письменное согласие на участие в проводимом исследовании. Формы согласия и информации для пациента были разработаны этическим комитетом ФГБУ НИИ МББ СО РАМН.

Таблица 1. Характеристика пациентов с аденокарциномами желудка по стадиям процесса

Стадия 1-IV Стадия TNM Количество пациентов % от общего числа

IA Т,М0Мг> 1 4,2

1В T^NoH, 1 4,2

II T2aN,Mo 1 4,2

TjNQM,, 6 25

I1IA WMn 5 20,7

T4N0Mn 1 4,2

IIIB T,N7M„ 1 4,2

T4N2M0 2 8,3

IV T4N-,Mn 2 8,3

T,N,Mo 1 4,2

TXNXM, 3 12,5

Одна часть крови, взятой натощак из кубитальной вены пациента в объеме 10 мл, использована для определения цитокинпродуцирующего потенциала клеток in vitro, а другая - для определения цитокинов в сыворотке. Содержание пепсиногенов I и II в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест», и выражали в мкг/л.

Определение цитокинпродуцирующего потенциала клеток крови с использованием поликлонального активатора ИКК, в состав которого входят ФГА в концентрации 4 мкг/мл, конконавалин А в концентрации 4 мкг/мл и липополисахарид в концентрации 2 мкг/мл, проводили согласно инструкции с помощью стандартизованного набора «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест».

В сыворотке крови и в полученных супернатантах клеток крови определяли содержание IL-lp, IL-lRa, TNFa, IL-2, IL-6,1L-8, IL-10, IL-17, IL-18, MCP-1 ,VEGF и IFNy с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест». Определение содержания связывающего IL-18 белка - IL-18BP проводили с помощью набора фирмы R&D Systems. Индекс влияния поликлональных активаторов (ИВПА) ИКК на продукцию цитокинов клетками крови высчитывали по формуле: ИВПА = А/Б, где А - уровень стимулированной поликлональными активаторами ИКК продукции цито-кина, Б - уровень спонтанной продукции цитокина. Учитывали только те цитокины в сыворотке и в супернатантах клеток крови, уровни которых превышали нижний предел чувствительности используемых наборов реагентов.

Определение аутоантител классов G, М, А и субклассов Gl, G2, G3, G4 к TNFa проводили по технологии, разработанной в лаборатории фи-

зико-химической индикации иммунных процессов НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, с соблюдением всех необходимых технологических приемов (Аутеншлюс А.И. и др., 2003). Уровни аутоан-тител классов в, М, А и субклассов 01, 02, вЗ, С4 к ТОТа определяли в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа.

При иммобилизации ТЫРа лунках полистеролового планшета для иммуноферментного анализа концентрация цитокинов составила 40 мкг/мл в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия. Иммобилизация цитокинов осуществлялась пассивной сорбцией. После этого, для предотвращения неспецифической сорбции, лунки планшета обрабатывали 1,5% раствором бычьего сывороточного альбумина (фракция V), затем вносили образцы сывороток указанных выше пациентов. Использовали вторичные моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидазой хрена, производства ООО «Полигност», Санкт-Петербург. Уровни антител определяли по коэффициенту (К), который представлял собой отношение оптической плотности продукта реакции опытной сыворотки к оптической плотности продукта реакции контрольной сыворотки, последняя представляла собой лабораторный пул образцов здоровых лиц. Коэффициент К выражали в условных единицах.

Методы патоморфологнческого анализа. Образцы желудка (операционный и биопсийсный материал) фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали для заключения в парафин по стандартным методикам. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Патогистологическую картину аденом желудка характеризовали по следующим признакам, которым была дана балльная оценка:

- выраженность дисплазии: дисплазия легкой степени - 1 балл, умеренной степени - 2 балла и тяжелая дисплазия - 3 балла;

- наличие, тип и выраженность кишечной метаплазии: отсутствует метаплазия - 1 балл, присутствует полная метаплазия до 1/3 желез - 2 балла, от 1/3 до 2/3 желез - 3 балла, более 2/3 желез - 4 балла; неполная метаплазия до 1 /3 желез - 5 баллов, от 1 /3 до 2/3 желез - 6 баллов и более 2/3 желез - 7 баллов;

- наличие митозов в поле зрения: отсутствие митозов -1 балл, 1-2 митоза - 2 балла, 3-4 митоза - 3 балла, 5 и более митозов - 4 балла; оценка митозов проводилась в десяти полях зрения (Аруин Л.И. и др., 1998);

- наличие патологических митозов в поле зрения: отсутствуют патологические митозы - 1 балл, 1 - 2 патологических митоза - 2 балла, 3-4 патологических митоза - 3 балла, 5 и более патологических митозов - 4 балла, оценка которых также проводилась в десяти полях зрения (Аруин Л.И. и др., 1998);

Патогистологическую картину аденокарцином желудка характеризовали по следующим признакам, которым также была дана балльная оценка:

- наличие сосудов с опухолевыми эмболами: сосуды с опухолевыми эмболами отсутствуют - 1 балл, единичные сосуды с опухолевыми эм-

болами- 2 балла, много сосудов с опухолевыми эмболами - 3 балла. При верификации опухолевых клеток учитывали следующие морфологические критерии: размер клетки, форма ядра, структура хроматина, цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое соотношение, наличие митозов, в том числе патологических, наличие клеточного полиморфизма и т.п.;

- митозы в поле зрения: отсутствуют - 1 балл, 1-3-2 балла, 3-5 митозов - 3 балла, 6 и более митозов - 4 балла, оцениваемые в 10 полях зрения (Аруин Л.И. и др., 1998);

- патологические митозы в поле зрения: отсутствуют - 1 балл, 1 - 3 митоза - 2 балла, 4 и более патологических митозов - 3 балла, оцениваемые в 10 полях зрения (Аруин Л.И. и др., 1998);

- клеточные элементы различной степени дифференцировки: высоко-дифференцированные (ВД), умереннодифференцированные (УД) и низ-кодифференцированные (НД) в процентах в опухолевой ткани. Для этого с помощью морфометрической сетки с 121 рабочими точками-узлами, вставленной в окуляр микроскопа, при увеличении 20 х 1,5 х 10 = ЗООх методом случайного наложения сетки на опухолевую ткань определяли количество точек, попавших на высоко-, умеренно- и низкодифференци-рованные опухолевые клетки. В каждом случае подсчитывали 10 полей зрения и для каждой категории клеток подсчитывали среднее арифметическое значение, выраженное в процентах (Автандилов Г.Г., 1990).

При оценке принадлежности опухолевых клеток к ВД, УД или НД элементам учитывали степень выраженности клеточного полиморфизма, ядсрно-цитоплазматичсское соотношение, наличие митозов, в том числе патологических, способность к струюурообразованию (формированию желез), сохранение функций клеток (слизеобразование). ВД клетки характеризовались приближенной к нормальным клеткам формой, преобладанием цитоплазмы над ядром, способностью строить железы и продуцировать слизь. НД клетки характеризовались неправильной формой, выраженным полиморфизмом, преобладанием ядра над цитоплазмой, отсутствием способности к формированию структур, диффузным ростом, наличием большого количества митозов, в том числе и патологических. УД клетки занимали промежуточное положение между ВД и НД клетками по выраженности вышеуказанных признаков;

- вариант гистологической дифференцировки опухоли: низкодиффе-ренцированная аденокарцинома-3 балла, умереинодифференцированная аденокарцинома - 2 балла, высокодифференцированная адснокарцинома - 1 балл. При определении этого параметра ориентировались на соотношение высоко-, умеренно- и низкодифференцированного компопенов в структурах опухолевой ткани;

- степень васкуляризации: слабая (сосуды занимают 1/3 поля зрения) - 1 балл, умеренная (сосуды занимают 1/2 поля зрения)-2 балла, выраженная (сосуды занимают не менее 2/3 поля зрения) - 3 балла, оцениваемая в 10 полях зрения;

- глубина инвазии опухоли: в пределах слизистой - 1 балл, подсли-зистого слоя - 2 балла, начальных мышечных слоев - 3 балла, средних мышечных слоев - 4 балла, глубоких мышечных слоев - 5 баллов, всех слоев, включая серозную оболочку, - 6 баллов;

- количество регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами: нет - 1 балл, один - 2 балла, два - 3 балла, три - 4 балла и т. д.

Балльная оценка патогистологической картины позволила выявить корреляционные связи между цитокинпродуцирующей функцией клеток организма и патогистологическими параметрами опухолей.

Иммуногистохимическое исследование срезов выполняли на удаленных новообразованиях у 24 пациентов с аденомами желудка, из которых 8 (33,3%) мужчин и 16 женщин (66,7%), у 8 пациентов с гиперпластическими полипами желудка (все женщины), а также на резецированных опухолях у 7 пациентов с адснокарциномой желудка, из которых 6 (85,7%) мужчин и 1 женщина (14,3%). Использовали полимерные системы детекции с применением моноклональных кроличьих антител к Ki-67 (Clone SP6, Cat.№ CRM 325 А,В,С В IOC ARE MEDICAL, USA) в разведении 1:100 (Репа L.L.etal., 1998).

Оценку экспрессии Ki-67 осуществляли путем подсчета процента окрашенных ядер на 1 ООО клеток при увеличении в 400 раз в 10 полях зрения (Клинышкова Т.В. и др., 2010). При наличии менее 20% окрашенных опухолевых клеток пролиферативную активность считали низкой, а при наличии - более 20% окрашенных клеток опухоли - высокой (Simpson J.F., 2000).

Статистическую обработку данных выполняли с использованием методов непараметрического анализа. Сравнение изучаемых показателей проводили с помощью критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок и критериев Крускалла-Уоллиса и Данна при более чем двух независимых выборок. Кроме того, использовали двусторонний точный критерий Фишера. Результаты, в том числе и количество наблюдений (п), представлены в таблицах. Показатели выражены в виде медианы - Ме и процентилей - 25 и 75. Различия между группами считали статистически значимыми при р < 0,05 (Реброва О.Ю., 2002). Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (г). Для статистической обработки данных применяли программу Statistica 6.0. Критерий Данна вычисляли по соответствующей формуле (Гланц С., 1999) с использованием программы Microsoft Office Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровни пепсиногенов в сыворотке крови у больных с аденомами и аденокарциномами слизистой оболочки желудка. Исследование показало, что у больных с аденомами концентрация пепсиногена I в сыворотке крови и величина отношения концентрации пепсиногена I к концентрации

Таблица 2. Уровни пенснногенов в сыворотке крови и величины отношения уровня пепсиногена 1 к уровню пепсиногена II у больных и здоровых лиц

Группы пациентов Пепсиноген I (норма 30-130 мкг/л) Пепсиноген И (норма 4-22 мкг/л) Пепсиноген 1 / пепсиноген II (норма 3-20)

Ме (25; 75 процента™)

1. Больные с аденомами желудка, п=32 39,2 (23,5; 65,9) Р1-5 <0,01 16.3 (11,0; 20,3) 2,1 (1,6; 3,1) Р 1-з <0,01

2. Больные с адено-карциномами желудка, п=24 70,3 (21,4; 111,3) 12,5 (9,0; 22,1) 4,1 (1,9; 6,1)

3. Условно здоровые лица, п^ЗО 100,3 (86,5; 128,0) 16,8 (13,5; 21,8) 7,2 (3,9; 9,0)

Таблица 3. Корреляционные связи между уровнями пепсиногенов в сыворотке крови, величинами отношения пепсиноген I / пепсиноген II и процентом К1-67 позитивных клеток у больных с аденомами желудка

Показатель Процент К>67 позитивных эпителиоцитов аденом

Уровень пепсиногена 1 г -0,671

Р 0,006

Уровень пепсиногена II г -0,550

р 0,034

Соотношение пепсиноген 1 / пепсиноген 11 г -0,590

р 0,021

пепсиногена II были статистически значимо более низкими по сравнению со здоровыми лицами (табл. 2), что отражало атрофию слизистой оболочки желудка у этих пациентов.

При этом концентрация пепсиногена I находилась в обратной корреляционной связи с процентом Кл-67 позитивных эпителиоцитов аденом (г = - 0,529; р = 0,029) - показателем, отражающим их пролиферативную активность (табл. 3), что согласуется с известными сведениями об усилении пролиферации при атрофии (Маклпеп .КМ. е1 а!., 2003). Однако при аденокарциномах, в отличие от аденом, концентрация пепсиногенов в сыворотке крови и величина их соотношения не отличались от здоровых индивидов, что, возможно, связано с выработкой пепсиногенов клетками опухоли (КотэЫ N. е1 а!., 1995).

Выявлены прямые корреляционные связи между концентрацией пепсиногена II и теми патогистологическими параметрами, которые характеризуют степень тяжести опухолевой прогрессии: количеством сосудов

Таблица 4. Корреляционные связи между уровнем пепсиногена II, величинами отношения пепсиноген I / пепснноген 11 и патогистологнческими параметрами опухолей у больных с аденокарциномами желудка

Показатель Уровень пепсиногена II Соотношение пепсиноген I / пепсиноген 11

Количество сосудов с опухолевыми эмболами г 0,424 -0,488

р 0,044 0,018

Количество клеток опухоли с митозами г 0,435 -0,598

р 0,038 0,003

Количество клеток опухоли с патологическими митозами г 0,461

р 0,027

Содержание в опухоли низко-дифференцированных клеток г 0,596

р 0,003

Содержание в опухоли высоко-дифференцированных клеток г -0,450

р 0,031

Вариант гистологической диф-ференцировки опухоли г 0,637

р 0,001

с опухолевыми эмболами, количеством опухолевых клеток с митозами, патологическими митозами и относительным содержанием в опухоли низкодифференцированных клеток, обусловливающих ее злокачественность, и, кроме этого - обратные корреляционные связи между отношением уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II и количеством сосудов с опухолевыми эмболами, а также количеством опухолевых клеток с митозами (табл. 4).

Влияние ноликлональных активаторов ИКК на цитокинпродуци-рующую функцию клеток периферической крови у больных с аденокарциномами, аденомами и гиперпластическими полипами желудка.

Изучение влияния поликлональных активаторов ИКК на цигокинпроду-цирующую функцию клеток периферической крови показало, что только больные с аденокарциномами отличались от здоровых лиц статистически значимо более низкой величиной ИВПА (табл. 5).

Кроме того, больные этой группы характеризовались и более низкими значениями ИВПА ТОТа, ИВПА 1Ь-1Ка, ИВПА 1Ь-18 и того же ИВПА №N7 по сравнению с группой больных с аденомами. У последних величина ИВПА ^N7 находилась в обратной корреляционной связи с относительным содержанием К1-67 позитивных эпителиоцитов (г = - 0,508; р ~ 0,019), что согласуется с известными сведениями о том, что ^N7 обладает антипролиферативным действием (ТакаЬавЫ У. еЬ а1., 2008). Установлена прямая корреляционная связь между величиной ИВПА 1Ь-18 и степенью дисплазии аденом (г = 0,380; р =т 0,032), что объясняется его стимулирующим влиянием на пролиферацию клеток и, посредством чего этот цитокин

Таблица 5. Индексы влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками периферической крови больных с аденомами, адено-карциномами и здоровых лиц

Показатели Исследуемые группы

Больные с аденомами (п =- 32) Больные с аденокар-циномами (п - 24) Здоровые лица (п =30)

Медиана (25; 75 процентили)

ИВПА TNFa 126,88 (71,58; 296,55) Р«.?<0,05 71,04(17,86; 122,95) 87,60 (44,31; 118,46)

ИВПА IL-1(3 31,56(17,24; 47,33) 26,22 (14,40; 41,27) 26,88(15,66; 43,73)

ИВПА IL-1 Ra 12,72(10,04; 18,19) р,_2<0,01 8,20 (6,00; 11,50) 8,97 (7,28; 17,55)

ИВПА IL-2 11,68 (5,53; 16,73) 9,93 (4,43; 15,47) 13,90 (8,73; 19,25)

ИВПА IL-6 48,92(25,30; 151,33) 39,54(18,95; 121,55) 52,96 (25,13; 140,27)

ИВПА IL-8 11,67(6,17; 20,36) 8,80 (4,57; 24,24) 10,94 (5,09; 22,77)

ИВПА IL-10 25,21 (14,35; 84,96) 29,24(11,49; 105,16) 23,17(13,06; 47,22)

ИВПА IL-17 12,23 (7,68; 25,20) 19,33 (8,73; 31,38) 16,68(8,27; 24,60)

ИВПА IL-18 1,50 (1,28; 1,74) Pl-2<0,01 1,28 (1,09; 1,41) 1,39(1,24; 1,48)

ИВПА IL-18BP 1,01 (0,87; 1,33) 0,98 (0,86; 1,05) 1,05 (0,89; 1,18)

ИВПА IFNy 476,80 (271,35;741,75) р,.2 <0,01 195,25 (79,15;426,65) р2.з<0,05 402,28 (267,50;620,30)

ИВПА IL-1P '' ИВПА lL-IRa 2,48 (1,39; 3,45) 2,52(1,09; 5,37) 3,14(1,84; 4,30)

ИВПА 1L-187 ИВПА IL-18BP 1,46(1,16; 1,97) 1,30(1,08; 1,57) 1,41(1,15; 1,54)

участвуюет в формировании диспластических изменений (Park S. et al., 2007; Fortin C.F. et al., 2009).

При сравнении показателей больных с аденомами желудка с показателями пациентов с гиперпластическими полипами достоверные различия по ИВПА отмечались только по продукции клетками крови IFNy, которая у последних находилась па более низком уровне, чем у больных с аденомами желудка, что косвенно указывало на более высокую пролиферативную активность клеток слизистой оболочки желудка больных с гиперпластическими полипами (табл. 6), что рассматривается как ответ на повреждение слизистой оболочки, сопровождаемой гиперрегенерацией (Abraham S.C. et al., 2001). Кроме этого, показатели соотношения PGI/PGII у больных с гиперпластическими полипами находились в пределах нормативных значений, что свидетельствовало об отсутствии атрофических изменений слизистой оболочки и нормальной ее функциональной активности.

У пациентов с аденомами желудка обратная корреляционная связь между показателем соотношения ИВПА IL-1 / ИВПА IL-1 Ra и количеством

Таблица 6. Индексы влияния поликлональных активаторов ИКК на клетки периферической крови у больных с аденомами и гиперпластическими полипами

Показатель Аденомы (п=32) Гиперпластические полипы (п-15)

Медиана (25, 75 процентили)

ИВПА TNFa 126,88 (71,58;296,55) 102,02 (36,05;200,00)

ИВПА IL-1P 31,56 (17,24;47,33) 21,16 (12,17;52,19)

ИВПА IL-IRa 12,72 (10,04; 18,19) 12,11 (4,92; 17,87)

ИВПА IL-2 11,68 (5,53;16,73) 12,50 (4,33; 14,45)

ИВПА IL-6 48,92 (25,30;151,33) 31,18 (17,46;619,61)

ИВПА IL-8 11,67 (6,17;20,36) 8,75 (4,13;42,40)

ИВПА IL-10 25,21 (14,35;84,96) 24,11 (10,14;81,58)

ИВПА IL-17 12,23 (7,68;25,20) 20,20 (10,95;31,35)

ИВПА IL-18 1,50 (1,28; 1,74) 1,38 (1,16; 1,57)

ИВПА 1L-18BP 1,01 (0,87;1,33) 1,01 (0,88;1,20)

ИВПА IFNy 476,80 (271,35;741,75) 163,20(104,40;487,80)" р < 0,05

ИВПAIL-13 / ИВПА1Ь-1 Ra 2,48 (1,39;3,45) 3,68 (0,94;6,81)

ИВПА1Ь-18 / ИВПА1Ь-18ВР 1,46 (1,16; 1,97) 1,25 (1,04; 1,51)

PGI (норма 30-130 мкг/л) 39,22 (23,53;65,93) 85,36 (39,73; 111,02)* р < 0,01

PGII (норма 4-22 мкг/л) 16,25 (11,00;20,28) 13,08 (10,43;21,64)

PGI/PGII (норма 3-20) 2,10 (1,60;3,10) 4,57 (3,00;9,40) р < 0,001

клеток с патологическими митозами (г = -0,364; р = 0,041) свидетельствовала о том, что при усилении дисрегенераторного процесса в эпителии слизистой оболочки желудка снижается потенциальная способность клеток к продукции ключевого провоспалительного цитокина, запускающего иммунный ответ, и возрастает способность к продукции 1Ь-1Яа, ингибирующего его действие (ТЪогпЬеггу Ы.А., МоНпеаих 8.М., 1995). При таких условиях может возрастать вероятность ускользания трансформированных клеток от элиминации и, как следствие, может повышаться риск возникновения злокачественных новообразований.

При уже возникших аденокарциномах 1Ь-1 Яа может быть причастен к несостоятельности иммунного ответа по отношению к опухоли и генерализации злокачественного новообразования, о чем можно судить по прямой корреляционной связи между ИВГ1А II,-1 Яа и количеством пораженных метастазами регионарных лимфоузлов (г = 0,495; р = 0,016). Обратная корреляционная связь между ИВПА1Ь-2 и содержанием в опухоли низкодифференцированных клеток (г = -0,437; р = 0,037) отражает одно из проявлений иммуносупрессии при более злокачественных опухолях

- снижение способности к продукции цитокина, стимулирующего цито-токсические субпопуляции лимфоцитов. Это может быть обусловлено тем, что опухоль и ее микроокружение продуцируют факторы, подавляющие иммунный ответ, например 1Ь-10, источником которого могут быть регу-ляторные Т-клетки, а этот цитокин, в свою очередь, способен направлять дифференцировку Т-хелнеров в сторону тех же регуляторных Т-клеток (Ярилин Л.А., Донецкова А.Д., 2006).

Кроме того, при аденомах была выявлена обратная корреляционная связь между отношением уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II и ИВПА 1Ь-18 (г = -0,391; р = 0,044), которую можно объяснить сопряженностью атрофии с дисплазией, с которой был, в свою очередь, взаимосвязан ИВПА 1Ъ-18.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при аденомах желудка по мере увеличения степени атрофии слизистой, показателем которой является снижение величины отношения уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II, повышается способность им-мунокомпетентных клеток под влиянием поликлональных активаторов продуцировать 1Ь-18, который, как известно, стимулирует пролиферацию клеток, в том числе и атипических (Рагк 8., СЬеоп 8., СЬо О., 2007). Это подтверждается прямой корреляционной связью между ИВПА 1Ь-18 и степенью дисплазии, а как уже было сказано выше, при возрастании последней повышается и пролиферативная акгивность клеток, которой может способствовать снижение продукции ^N7, обладающего антипролифера-тивным действием. Об этом же свидетельствует обратная корреляционная связь между содержанием Кь67 позитивных клеток и ИВ11А НПМу.

Как уже указывалось выше, преобладание продукции 1Ь-1 Яа над продукцией 11^-1Р при аденомах создает условия для выживания атипических клеток, о чем можно судить по обратной корреляционной связи между величиной соотношения ИВПА 1Ь-10 / ИВПА 1Ь-1Яа и количеством клеток с патологическими митозами, а при аденокарциномах продукция иммунокомпетентными клетками 11.-111а способствует прогрессирова-нию злокачественного новообразования, о чем можно судить по прямой корреляционной связи между ИВПА 1Ь-1Яа и количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами.

Концентрация ТОТа и №N7 у больных с аденокарциномами желудка. Уровни антител к Т]ЧЁа в сыворотке крови у больных с аденокарциномами желудка. Известно, что антитела (АТ) к цитокинам могут нейтрализовать их биологическую активность, служить их переносчиками и модулировать функции иммунокомпетентных клеток (РЬе1ап .Ш. е1 а1„ 2008).

Нами установлено, что у больных с аденокарциномами желудка в сыворотке крови присутствовали антитела класса в (Ме = 4,0; Ь = 2,6; Н = 4,8), класса М(Ме = 2,0; Ь= 1,2; Н = 2,3) и класса А (Ме = 1,0; Ь = 0,6; Н= 1,5) к ТО Ра (табл. 7).

Таблица 7. Концентрация Т1МРа и №N7 и уровни антител к Т№а у пациентов с аденокарциномами желудка

Показатели Ме 25 процентиль 75 процентиль

Т№'а (пг/мл) 4,0 2,6 4,8

АТ класса в к ТТ^а (К - условные единицы) 1,0 0,8 1,5

АТ класса М к ТИРа (К - условные единицы) 2,0 1,2 2,3

АТ класса А к ТОТа (К - условные единицы) 1,0 0,6 1,5

ТРЫу (пг/мл) 5,0 5,0 8,0

Таблица 8. Корреляционные связи между уровнями антител класса А к Т^а, концентрацией в сыворотке крови и патогистологическими

параметрами аденокарцином желудка

Показатели Количество пораженных метастазами лимфоузлов Вариант гистологической дифференцировки (в баллах) Содержание вы-сокодифференци-рованных клеток

АТ класса А к TNFa (К - в условных единицах) г = - 0,702; р = 0,01

Концентрация IFNy (пг/мл) г = 0,362; р = 0,02 г =--0,342; р - 0,03

Выявлены корреляционные связи только между содержанием lFNy, а также уровнями AT к TNFa и патогистологическими параметрами аденокарцином желудка (табл. 8), которые можно объяснить, исходя из известных эффектов указанных цитокинов. Например, проопухолевое действие TNFa реализуется, в частности, за счет его способности привлекать в очаг опухолевого роста макрофаги, продуцирующие факторы, стимулирующие васкуляризацию, такие как VEGF, и металлопротеина-зы, модифицирующие внеклеточный матрикс, что облегчает миграцию клеток неоплазмы и приводит к метастазированию опухоли (Zins К. et а1„ 2007).

Обратные корреляционные связи между уровнем AT класса А к TNFa при аденокарциномах желудка и количеством регионарных лимфоузлов с метастазами свидетельствуют о том, что AT этого класса могут инги-бировагь прометастатическое действие TNFa. Что же касается lFNy, то, несмотря на ряд противоопухолевых эффектов, он способен вызывать активацию макрофагов, выработку ими TNFa и этим стимулировать опухолевую прогрессию (Yan L. et al., 2006). Поэтому прямую корреляционную связь между концентрацией IFNy в сыворотке крови при аденокарциномах желудка и вариантом гистологической дифференцировки, балл которого

возрастает от высоко- до низкодифференцированной опухоли, а также обратную корреляционную связь между уровнем этого цитокина в сыворотке крови и содержанием высокодифференцированных клеток можно объяснить опосредованным через TNFa ингибированием дифференци-ровки, а также способностью IFNy отбирать наиболее злокачественные клоны клеток, нечувствительные к его антипролиферативному действию (Ма Y.M. etal., 2009). Результаты проведенного исследования необходимо учитывать при разработке цитокинотерапии опухолей.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антитела;

ИВ - индекс влияния;

ИКК - иммунокомпетентные клетки;

ИВПА - индекс влияния поликлональных активаторов

ФГА - фитогемагглютинин

EGFR (epidermal growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста;

IL-18ВР (IL-18 binding protein) - белок, связывающий интерлейкин-18;

PG - пепсиноген;

VEGF (Vascular endothelial growth factor) - фактор роста эндотелия сосудов.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с аденомами желудка концентрация пепсиногена I в сыворотке крови и величина отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II статистически значимо более низкие по сравнению со здоровыми лицами, что свидетельствует о развитии аденом на фоне атрофии слизистой оболочки желудка.

2. При аденомах желудка концентрация пепсиногена I находится в обратной корреляционной связи с процентом Ki-67-позитивныхэпителиоци-тов. При аденокарциномах желудка существуют прямые корреляционные связи между концентрацией пепсиногена II и патологогистологическими параметрами, характеризующими степень тяжести опухолевой прогрессии, и обратные - между отношением уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена И и количеством сосудов с опухолевыми эмболами.

3. У больных с гиперпластическими полипами желудка показатели соотношения концентраций пепсиноген I/пепсиноген II существенно не отличаются от нормативных значений, что свидетельствует об отсутствии атрофических изменений слизистой оболочки желудка и ее нормальной функциональной активности.

4. При аденомах желудка по мере увеличения степени атрофии слизистой оболочки, показателем которой является снижение величины

отношения уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II, повышается способность иммунокомпетентных клеток под влиянием поликлональных активаторов продуцировать IL-18, который стимулирует пролиферацию клеток, в том числе и атипических. Способность продуцировать lFNy у пациентов с гиперпластическими полипами желудка ниже, чем у пациентов с аденомами желудка, что, учитывая антипролиферативный эффект этого цитокина, является индикатором повышенной пролиферации эпи-телиоцитов при гиперпластических полипах.

5. У пациентов с аденомами желудка способность клеток крови продуцировать TNFa, IL-18 и IFNy под влиянием поликлональных активаторов ИКК выше, чем у больных с аденокарциномами. У пациентов с аденокарциномами снижение продукции цитокинов, обладающих как пролиферативным, так и ангипролиферативным эффектами, свидетельствует о радикальных изменениях цитокинпродуцирующего потенциала иммунокомпетентных клеток при сформировавшемся злокачественном новообразовании.

6. У пациентов с аденокарциномой желудка выявлена обратная корреляционная связь между уровнем аутоантител класса А к TNFa и количеством пораженных метастазами регионарных лимфоузлов, что свидетельствует о способности антител оказывать влияние на биологические эффекты TNFa.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ванхальский A.B., Соснина A.B., Аутеншлюс А.И., Фурсов С.А., Михайлова Е.С., Лыков А.П., Вараксин H.A., Морозов Д.В. Цитокиновый профиль пациентов с полипами желудка // Цитокины и воспаление. -

2010. - Т. 9, №3.-С. 63.

2. Ванхальский A.B., Соспина A.B., Михайлова Е.С., Аутеншлюс А.И., Фурсов С.А., Морозов Д.В., Вараксин H.A. Цитокины сыворотки крови и влияние поликлональных активаторов на цитокин-продуцирующую функцию клеток крови больных с аденоматозными полипами желудка // Российский аллергологический журнал. - 2011. - № 4, вып. 1. - С. 64-65.

3. Ванхальский A.B., Соснина A.B., Михайлова Е.С., Аутеншлюс А.И., Фурсов С.А., Морозов Д.В., Вараксин H.A. Уровни TNFa и аутоантител к TNFa у больных с аденоматозными полипами и аденокарциномами желудка // Вестник уральской медицинской академической науки. -

2011. - № 2/1, (35). - С. 113-114.

4. Ванхальский A.B., Великая Н.В., Михайлова Е.С., Лыков A.1L, Морозов Д.В., Вараксин H.A., Фурсов С.А., Соснина A.B., Аутеншлюс А.И. Цитокинпродуцирующий потенциал клеток крови больных с адснокар-

циномами желудка и толстой кишки в предоперационный период // Российский аллергологический журнал. - 2012. - № 1, выо. 1. - С. 70-71.

5. Великая Н.В., Ванхальский A.B., Михайлова Е.С., Морозов Д.В., Вараксин H.A., Фурсов С.А., Соснина A.B., Аутеншлюс А.И. Антитела к TNFa и IFNy при аденокарциномах желудочно-кишечного тракта // Российский аллергологический журнал. - 2012. - № 1, вып. 1. - С. 73-74.

6. Соснина A.B., Сорокина H.H., Аутеншлюс А.И.. Морозов Д.В., Исакова Н.Б., Ванхальский A.B., Фурсов С. А. Взаимосвязь уровней пепси-ногенов в сыворотке крови с патогистологическими параметрами аденом и аденокарцином желудка // Клиническая лабораторная диагностика. -2013.-№2.-С. 21-23.

7. Соснина A.B., Ванхальский A.B., Аутеншлюс А.И., Михайлова Е.С., Морозов Д.В., Исакова Н.Б., Сорокина H.H., Вараксин H.A. Пепсиногены сыворотки и цитокиннродуцирующая функция клеток периферической крови больных с аденомами и аденокарциномами желудка // Цитокины и воспаление. — 2013. — Т. 12, № 1-2. - С. 83-87.

Соискатель

А.В.Ванхальский

Подписано в печать 10.11.2014. Формат 60x84/16. Гарнигура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Зак. № 34. Отпечатано в типографии ОАО «НИИсистем» Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

15-679

2014250432

2014250432