Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Эндокринные клетки прямой кишки человека при эпиталиальных опухолях ректо-сигмоидного отдела

РГ6 од

Л г, «Г1 Г

I с Ли Г им

На правах рукописи

ТРЕТЬЯКОВА

Мария Сергеевна

ЭНДОКРИННЫЕ КЛЕТКИ ПРЯМОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ РЕКТО-СИГМОИДНОГО ОТДЕЛА

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург, 1996

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И.Мечникова

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Б.С.Сережин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.Л.Белянин

доктор медицинских наук, профессор М.Г.Рыбакова

Ведущее учреждение: НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова РАМН

Защита диссертации состоится "06 " _1996 г.

в _часов на заседании диссертационного совета Д 074. 16. 04 при Санкт-

Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул.Салтыкова - Щедрина, 41)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии

Автореферат разослан "■¿^ " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

<2

А.В.Соболев

Актуальность проблемы.

Проблема взаимосвязи АПУД-системы и опухолевого роста многогранна. Гормоны и биогенные амнны апудоцитов оказывают активирующее или ингибирующее влияние на клеточную пролиферацию и дифференцировку (Gledhill А. et а!., 1986; Ito Н. et al 1986; Кветной И.М., 1981, 1985); установлена гормонозависимость биологического поведения большинства опухолей, в том числе толстой кишки (Берштейн Л.М., Рыбак Е.П., Дильман В.М., 1987).

Желудочно-кишечный тракт содержит апудоцитов больше, чем вместе взятые железы внутренней секреции (Яглов В.В., 1989). Изучаются топографические, количественные, структурно-функциональные особенности апудоцитов поджелудочной железы, желудка и тонкой кишки, что нашло отражение в формировании концепции о гастро-энтеро-панкреатической (ГЭП) системе (Fujita Т., 1973; Шахламов В.А., Макарь В.И., 1985; Пузырев A.A., Иванова В.Ф., 1992). В толстой кишке количественные и качественные особенности апудоцитов в условиях нормы изучены недостаточно. Это положение относится и к прямой кишке, которая лидирует по количеству эндокринных элементов среди всех отделов толстой кишки (Lluis Е., Thompson J.S., 1988). Работы по изучению апудоцитов при опухолевом росте в толстой кишке единичны (Дерижанова И.С. ,1978, 1995); исследования реакции апудоцитов и их морфо-функциональной характеристики в окружающей опухоль (переходной) слизистой отсутствуют.

Опыт клинической колопроктологии и онкологии свидетельствует о том, что целый ряд особенностей как нормальных, так и опухолевых процессов толстой кишки не может быть объяснен без учета способности апудоцитов продуцировать различные биологически активные вещества. В этой связи представляет интерес изучение реакции и степень участия апудоцитарного дифферона толстой кишки в опухолевом росте, определение зависимости между количеством, ультраструктурой и видом гормонального продукта апудоцитов в паренхиме опухоли и окружающей её ткани, и степенью дифференцировки опухоли.

Направление данного исследования восполняет имеющийся пробел в изучении сравнительной топографической и морфо-функциональной характеристики апудоцитов толстой, и в частности, прямой кишки в условиях нормы, на различных этапах морфогенеза добро- и злокачественных эпителиальных новообразований и в слизистой за пределами границ раковой опухоли. Такое направление имеет прямое отношение к теоретической проблеме взаимоотношений эпителиального и апудоцитарного дифферонов в норме и при опухолевом росте, открывая дополнительные пути решения вопросов опухолевой прогрессии, малигнизации, ранней диагностики, прогноза и лечения новообразований.

Цсль исследования.

Сравнительное и комплексное изучение морфо-функциональной организации эндокринного аппарата прямой кишки человека в норме и при эпителиальных опухолях различной биологической сущности.

Задачи исследования.

1. Изучить гистотопографию апудоцитов прямой кишки человека в норме и закономерности количественного и качественного их изменения в онтогенезе.

2. Уточнить основные ультраструктурные типы эндокринных клеток прямой кишки в норме и идентифицировать гормональные продукты специфической функции.

3. Дать развернутую морфо-функциональную характеристику апудоцитов при аденомах ректо-сигмоидного отдела на основе морфометрического, гистохимического, нммуногистохимического и электронномикроскопического исследования эпителия прямой кишки.

4. Провести комплексное исследование апудоцитов при аденокарциномах ректо-сигмоидного отдела, подробно изучить их в ткани опухоли и в окружающей слизистой оболочке прямой кишки.

5. Дать сравнительную характеристику эндокринного аппарата прямой кишки при доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолях в зависимости от клинико-морфологнческой формы и уровня их дифференцировки.

Научная новизна.

Получены новые факты о возрастной дифференцировке, гистотопографии, количественном распределении и ультраструктуре апудоцитов.

Впервые дана подробная структурно-функциональная характеристика апудоцитарного дифферона при аденомах и аденокарциномах прямой кишки.

Установлена корреляция между степенью дифференцировки, гистологической формой, стадией прогрессии опухолей различной биологической сущности и выраженностью изменений эндокринного аппарата.

Подтверждена взаимосвязь эпителиоклеточного и апудоцитарного дифферонов, определена и установлена последовательность этих взаимоотношений при доброкачественных и злокачественных эпителиальных новообразованиях ректо-сигмоидного отдела;

Впервые дана характеристика эндокринных клеток в фоновой слизистой и показано значение АПУД-снстемы в "опухолевом поле" как маркера прогрессии опухолевого роста.

Положения, выносимые на защиту диссертации.

- Апудоцитарный дифферон прямой кишки в своем становлении и развитии опережает эпителиоклеточный, что позволяет предположить участие гормональных продуктов апудоцитов в регуляции механизмов эмбрионального гистогенеза.

- Эндокринный аппарат в норме характеризуется стабильностью структуры, количества апудоцитов и численного соотношения 4 основных клеточных типов: ЕС, Д1, Д и Ь.

Выраженность морфо-функциональных изменений апудо-цитарного дифферона при аденомах зависит от наличия в них ворсинчатых структур и степени дисплазии эпителия.

Наиболее значительные количественные и качественные изменения эндокринного аппарата отмечаются в малигнизированных аденомах и аденокарциномах.

Имеется обратно пропорциональная зависимость между количеством апудоцитов в паренхиме опухолей и фоновой слизистой, свидетельствующая о высокой компенсаторной возможности эндокринного аппарата прямой кишки.

Практическое значение.

Представлена развернутая морфо-функциональная характеристика апудоцитов в эпителии слизистой оболочки прямой кишки в норме на разных этапах эмбрионального и постэмбрионального периодов онтогенеза, при добро- и злокачественных эпителиальных новообразованиях органа.

Установлена зависимость между частотой встречаемости, количеством и соотношением различных типов эндокринных клеток в ткани опухоли и за её пределами, степенью пролиферативной активности и стадией прогрессии опухоли.

Дана количественная н качественная характеристика апудоцитар-ного дифферона в фоновой слизистой на разных этапах морфогенеза аденом и аденокарцином, позволяющая объективно оценить биологический потенциал новообразований.

Предложен комплекс методов и получены дополнительные критерии для решения вопросов биологической сущности, диагностики, прогноза эпителиальных опухолей толстой кишки.

Апробация работы.

Фрагменты работы были представлены на Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы медицины", посвященной 50-летию РАМН (Москва, 1994г.), на I Съезде Международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1995г.), на региональных и городских научно-практических конференциях (Санкт-Петербург, 1993,1994,1995,1996гг.), на заседании ассоциации патологоанатомов г.Санкт-Петербурга (1996г.).

Внедрение в практику полупенных результатов.

По материалам диссертации имеется 12 публикаций. Теоретические и практические положения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах патологической анатомии, гистологии и биологин Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова и в практической работе патоморфологического отделения больницы Петра Великого г.Санкт-Петербурга.

Структура диссертации.

Работа состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов , списка литературы, включающего 93 отечественных и 175 иностранных источника. Диссертация изложена на /Л? страницах, из них машинописного текста 95 страниц ; содержит 4 таблицы^фотомонтажей, составленных из микрофотографий и электроннограмм, 7 рисунков.

Материалы и методы.

Исследован биопсийный, операционный и секционный материал 120 наблюдений. Изучена: нормальная слизистая оболочка плодов и взрослых людей различного возраста, доброкачественные. и злокачественные эпителиальные опухоли ректо-сигмоидного отдела. Нормальную слизистую оболочку плодов изучали на секционном материале, взрослых людей - на биопснйном материале. Биопсия производилась на расстоянии 12-16 см от ануса. При полипах и раках, изученных на биопсийном и операционном материале, исследовали: 1) ткань опухоли, 2) слизистую оболочку по краю опухоли (край) и 3) фоновую слизистую оболочку на расстоянии 3-5см от края опухоли (фон). Эпителиальные опухоли отбирали из архива больницы Петра Великого (период 1975-1995гг.) и рубрифицировали в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей кишечника № 15 ( Морсон Б.К., Собин Л.Г., 1980), а также с учетом рекомендаций по патологоанатомической диагностике опухолей (ред. Н.А.Краевский и соавт.).

Материал изучен методами свеювой и электронной микроскопии, гистохимии, иммуногистохимии и морфометрии.

Для светооптического изучения материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуфереиного формалина с последующей заливкой в парафин. Изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм. Для обзорного исследования срезы окрашивали гематоксилином-эозином. Аргирофильные клетки выявляли по методам Гримелиуса (Grimelius L., 1968; Grimelius, Wilander, 1980) и Паскуаля (Pascual J.S.F., 1976). Аргентаффинные серотонин-содержащие (энтерохромафиниые) ЕС-

клетки выявляли по методу Массон-Гамперля в модификации I.Singh (1964). Нейтральные мукополисахариды (гликопротеиды) выявляли ШИК-реакцией. Окраску альциановым синим при рН 0,5 и 2,5 использовали для выявления сульфатированных и несульфатированных кислых гликозаминогликанов.

Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗУЧЕННОГО МАТЕРИАЛА.

Исследованный объект Характеристика Число

наблюде-

ний

1 2 3

Нормальная слизистая - 8-11 недель 2

оболочка прямой кишки - 12-15 недель 2

плодов - 16-19 недель 2

- 20-23 недель 3

- 24-27 недель 2

28-31 недель 3

>31 недель 1

Нормальная прямая - 35-50 лет 3

кишка взрослых - 51-70 лет 7

Слизистая оболочка с 1. Тубулярные аденомы

доброкачественными -слабо выраженная дисплазия 5

опухолями ректо- - умеренная дисплазия 5

сигмоидного отдела - выраженная дисплазия 5

2. Тубулярно-ворсинчатые

-слабо выраженная дисплазия 5

- умеренная дисплазия 5

- выраженная дисплазия 5

3. Ворсинчатые аденомы

-слабо выраженная дисплазия 5

- умеренная дисплазия 5

- выраженная дисплазия 5

4. Малигнизированные

тубулярно-виллезные аденомы 5

Слизистая оболочка со 1. Аденокарциномы

злокачественными - высокодифференцированные 10

опухолями ректо- -умер, дифференцированные 10

сигмоидного отдела - низкодифференцированные 10

2. Коллоидные раки

-высокодифференцированные 10

- умер.дифференцированные 5

Всего: 120

Слизеобразование оценивали по 4-х бальной системе: отсутствие реакции - 0 баллов, слабо выраженная реакция - 1 балл, умеренная - 2, выраженная - 3 и резко положительная реакция - 4 балла.

Иммуногистохимическое исследование проводили с помощью пероксидазно-антипероксидазного (ПАП) метода по L.A.Sternberger (1979) и авидин-биотинового комплекса, выборочно выявляя активность гистамина, маркеров широкого профиля нейроэндокринной дифференцировки (хромогранин А, синаптофизин, нейрон-специфическая энолаза), а также биогенных аминов и пептидных гормонов (серотонин, соматостатин, энтероглюкагон). Приносим благодарность морфологическому отделу НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова за предоставленную возможность выполнения иммуноморфологического исследования.

Для электронномикроскопического исследования кусочки слизистой оболочки фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида на 0,1 м фосфатном буфере с последующей обработкой 1% раствором четырехокиси осмия. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в смесь эпон-аралдит. Контрастирование ткани проводили в кусочках насыщенным раствором уранил-ацетата и на срезах - цитратом свинца (Reynolds, 1963). Срезы толщиной 40-60 нм, полученные на ультратоме ЛКБ-3, изучали в электронном микроскопе JEM-1 OOS.

Морфометрическне исследования проведены на световых препаратах и электронных микрофотографиях. Подсчет эндокринных клеток проводили на препаратах, окрашенных по Гримелиусу и по Массону-Гамперлю на микроскопе БИОЛАМ-70 (ок.7х,об.90х), с использованием окулярной морфометрической сетки. Количество апудоцитов выражали на 1 кв. мм площади слизистой оболочки. На электронных микрофотографиях измеряли диаметр секреторных гранул в 5-10 апудоцитах каждого типа. Полученное значение переводили в истинное по общепринятой формуле:

Ди = Дф х 10й/ М, где Ди - истинный диаметр гранулы на микрофотографии в нм, Дф - диаметр секреторных гранул на микрофотографиях в нм, М - увеличение электронной микрофотографии. При осуществлении ультраструктурных морфометрических измерений учитывали методологические требования, предъявляемые к этому виду анализа (Г.Г.Автандилов, 1990; Г.Ф.Лакин, 1990). Цифровой материал подвергался статистической обработке с использованием t-кригерия Стыодента, различия считали достоверными при Р<0,05, проводился трехфакторный дисперсионный анализ данных с использованием пакета прикладных программ - STATGRAF.

Результаты исследования.

Исследование эпителия прямой кишки на различных этапах внутриутробного развития позволило выявить определенную взаимосвязь между появлением, количеством и ультраструктурой апудоцитов, а также становлением и развитием эпителиоклеточного днфферона. Эндокринные клетки прямой кишки выявляются на светооптическом уровне уже в первой изученной группе - на 8 неделе эмбриогенеза. Это подтверждается литературными данными ультраструктурного (Lluis F., Thompson J. С., 1988) и иммуногистохимического исследований (Bryant M.G. et al., 1982; Buchan A.M.J., Polak J.M., 1980). Эндокринные клетки располагаются диффузно по всей длине вертикальной оси анастомозирующих ворсинок и крипт, характерных для раннего эмбриогенеза. Широко варьирующие по форме и размерам апудоциты резко контрастируют с недифференцированными клетками эпителия. В дальнейшем количество эндокриноцитов увеличивается, в основном за счет аргентаффинных клеток, и достигает максимума к 20-23 неделям онтогенеза. К этому периоду меняется и строение эпителия: преобладающими структурами становятся крипты, в которых отчетливо видны бокаловидные клетки, количество ворсин постепенно убывает. К третьему триместру беременности достигаются стабильные численные и структурные показатели апудоцитарного дифферона, соответствующие взрослому организму, что подтверждается данным других авторов (Facer Р. et al., 1989; Milla P.J. et al., 1988; Bryant M.G. et al., 1982). К этому времени эпителий имеет уже вполне сформированный вид, что согласуется с описанными в литературе этапами возрастной дифференцировки (Бархина Т.Г., Шахламов В.А., 1985).

Более ранняя дифференцировка апудоцитов подтверждается результатами ультраструктурного исследования. Начиная с 8 недель внутриутробного развития выявляются апудоциты, которые относятся к ЕС- и Д-типам благодаря наличию характерных по строению и размерам секреторных гранул, несмотря на наличие большого количества незрелых мономорфных эндокринных гранул. Д1- и L-клетки определяются с 12 недели беременности и характеризуются высоким уровнем дифференцировки. На поздних сроках эмбриогенеза L- и Д-клетки выявляются реже, чем ЕС- и Д1-апудоциты. Наши данные не подтверждают мнения о том, что L- и Д-клетки встречаются очень часто (Lluis F., Thompson J.С., 1988; Itzev D. et al., 1988), a соотношение EC- и L-клеток составляет 1:1 (Sjolund К. et al., 1983). Это положение справедливо лишь для раннего периода эмбриогенеза. Соотношение частоты встречаемости основных ультраструктурных типов на разных сроках эмбриогенеза подтверждают результаты целого ряда исследователей (Lehy Т., Cristina M.L., 1979; Bryant M.G. et al., 1982; Facer P. et al., 1989). Определенные для каждого периода эмбриогенеза количественные и качественные показатели при

Таблица 2

Количество аргирофильных и аргентаффинных апудоцитов прямой кишки человека на разных этапах эмбриогенеза. (Х±Бх)

Срок развития, недели Аргирофильные клетки на 1 кв.мм площади слизистой оболочки Доля аргентаффинных клеток, %

8-11 164±9,3 36

12-15 270±9,7 54

16-19 340±17,5 67

20-23 402±11,7 85

24-27 361±7,5 70

28-31 252±5,5 75

>31 260±2,4 69

отсутствии достоверных индивидуальных колебаний численности аргирофильных и аргентаффинных апудоцитов прямой кишки позволяют считать, что характеристика апудоцитарного дифферона может служить одним из критериев для определения возраста плода.

Таким образом, эндокринный аппарат прямой кишки в своем становлении и развитии опережает эпителиоклеточный дифферон, что позволяет предположить участие биогенных аминов и пептидных гормонов апудоцитов в регуляции механизмов эмбрионального гистогенеза. Это подтверждается преобладанием на ранних этапах внутриутробного развития ЕС-, Ь- и Д-клеток, которые, как известно, продуцируют серотонин, энтероглюкагон и соматостатин, оказывающие влияние на клеточную пролиферацию и дифференцировку. В дальнейшем количественный и качественный состав эндокринного аппарата закономерно изменяется с соответствии с этапом возрастной дифференцировки, коррелируя с морфо-функциональным состоянием эпителия.

При изучении эндокринного аппарата взрослых людей в норме установлен ряд особенностей типового характера. Апудоциты выявляются постоянно и характеризуются различным количеством и строением по длине крипт: в основании их больше всего и они имеют округлую, треугольную, трапециевидную форму. В средних отделах они одиночные, вытянутые, каплевидной, веретеновидной и грушевидной формы, с длинным цитоплазматическим отростком.

В количественном отношении апудоцитарный дифферон характеризуется высокой стабильностью показателей, что противоречит данным о заметных индивидуальных колебаниях числа

апудоцктов (GledhíII A. et al., 1986). Количество аргирофильных апудоцитов эпителия прямой кишки составило в среднем 300 клеток на 1 кв. мм площади слизистой. Эта цифра отражает численность всей эндокринноклеточной популяции, исключая Д-клетки, не обладающих аргирофильными свойствами. На основе комплексного гистохимического, иммуноморфологического и электронно-микроскопического исследования выделены 4 основных типа апудоцитов и определено их численное соотношение. Доминирующими являются серотонин-содержащие ЕС-клетки, составляющие около 60% апудоцитарного дифферона. Среди них преобладают апудоциты "открытого" типа, апикальный конец которых достигает просвета железы, а нижний полюс лежит на базальной мембране. На втором месте по частоте стоят аргирофильные Д1-клетки, составляющие 1520%. Количество Д- и L-клеток приблизительно равное и каждый цитотип составляет около 8-10% от всей популяции эндокринных клеток. Оставшиеся 5% апудоцитов приходятся, очевидно, на редкие N-и Р-типы, продуцирущие нейротензик и бомбезин соответственно (R.Buffa et al., 1978). Наши данные соответствуют результатам ряда авторов (Cristina M.L. et al., 1978; Lluis F., Thompson J.S., 1988; Аруин Л.И. и др., 1987), но не подтверждают мнения Sjolund К. et al. (1983).

В ультраструктурном отношении апудоциты прямой кишки характеризуются некоторыми особенностями. Самые многочисленные ЕС-клетки содержат полиморфные, электронно плотные эндокринные гранулы, окруженные гладкой непрерывной мембраной. Размер ЕС-гранул прямой кишки меньше, чем в ЕС-клетках других локализаций: 163±6,3 нм у взрослых и 176±13,7 нм у плодов.

Д1-апудоциты, представляющие гетерогенную в функциональном отношении группу (Solcia Е. et al., 1981), имеют округлые гранулы варьирующей электронной плотности и размеров от 150 до 216 нм (крупнее, чем в других органах). По форме Д1-клетки прямой кишки бывают самыми разнообразными, а у эмбрионов они нередко формируют длинные цитоплазматические отростки.

L-клетки содержат очень немногочисленные, круглые, как бы "штампованные" секреторные гранулы высокой электронной плотности. Между мембраной и осмиофильным содержимым отчетливо виден просвет. По литературным данным L-клетки имеют самые крупные эндокринные гранулы размером до 400 нм (Ferreira M.N. et al., 1971, Яглов В.В., Ломоносова Г.А.,1985), однако в прямой кишке L-гранулы намного меньше (184-205 нм). В L-апудоцитах нередко обнаруживается эндоплазматическая сеть и пластинчатый комплекс.

Д-клетки содержат крупные овальные секреторные гранулы низкой электронной плотности с нечеткой окружающей мембраной; размеры эндокринных гранул плодов составляют 292±18 нм, взрослых 231 нм; органеллы немногочисленны, но часто обнаруживаются миелиноподобные тельца, а цитоплазма имеет зоны разряжения.

Для всех апудоцитов прямой кишки человека в норме независимо от типа характерно гомогенное содержимое ядра, умеренное количество органоидов общего значения, зрелые, типовые по строению эндокринные гранулы без признаков выведения секрета и хорошо развитые межклеточные соединения в виде простых контактов по типу замка, пальцевидных выростов и десмосом. Такое строение свидетельствует о высокой степени дифференцировки и специализации апудоцитов, находящихся в состоянии функционального покоя.

Полученные данные о количественных, топографических, морфо-функциональных особенностях апудоцитарного дифферона на разных этапах эмбриогенеза и в разных возрастных группах послужили основой для последующего изучения взаимоотношений апудоцитарного и эпителиоклеточного дифферонов при опухолевом росте. Проведенное сравнительное комплексное исследование эндокринного аппарата прямой кишки при аденомах и аденокарциномах ректо-сигмоидного отдела не имеет аналогов.

Изучение апудоцитов в составе аденом весьма поверхностно и сводится к положению "аргирофильные и аргентаффинные клетки могут встречаться в аденомах в качестве одного из компонентов и количество их обычно невелико" (Никонов A.A., 1983). Нами установлено, что в аденомах структура, количество, распределение и морфо-функциональные особенности эндокринных клеток зависят от гистологической формы опухоли и степени дисплазии. Количество и частота встречаемости апудоцитов в ткани опухоли наибольшее в тубулярных аденомах, наименьшее - в ворсинчатых, а тубулярно-ворсинчатые занимают промежуточное положение. По-видимому, это объясняется преимущественной локализацией эндокринных клеток в железистых структурах; в ворсинках аденом апудоциты обнаруживаются крайне редко. В аденомах со слабой степенью дисплазии эндокринных клеток намного больше и определяются они чаще, чем в аденомах с умеренной и выраженной дисплазией. Аналогичные данные о зависимости между количеством апудоцитов, частотой их обнаружения и степенью атипии установлены при изучении аденом желудка (Gibbs N.M., 1967; Watanabe Н., 1972).

Абсолютная численность апудоцитов в аденомах и краевой слизистой в несколько раз ниже нормальных показателей. Во всех изученных аденомах, как и в норме, доминирующей клеточной популяцией являются ЕС-клетки. При нарастании дисплазии наблюдается статистически достоверное увеличение относительной численности серотонин-содержащих клеток в опухоли и крае на 20-30% по сравнению с нормой.

В аденомах меняются не только количественные, но и качественные показатели апудоцитов. Изменения гистотопографии эндокринных клеток в ткани аденом заключается в их

преимущественном расположении у основания или ножки полипа, в глубоких отделах желез. Характер распределения апудоцитов в аденомах меняется с диффузного на очаговый. Изменение тинкториальных свойств, выражающееся в снижение способности апудоцитов импрегнироваться солями серебра или окрашиваться иммунными сыворотками, тесно связано с изменениями их ультраструктуры. Апудоциты в аденомах находятся в состоянии

Таблица 3

Количество аргирофильных и аргентаффинных апудоцитов прямой кишки человека при аденомах и аденокарциномах ректо-сигмоидного

отдела.

Группа Опухоль Край Фон Иммун

наблюдений Grim. М-Н Grim. М-Н Grim. М-Н гнетох.

Туб. полип I 147±5.8 65% 171±7 70% 281±11 76% -

Туб. полип И 33±2.1 67% 137±4 67% 308±13 79% -

Туб. полип III 27±3.4 79% 69±4.5 81% - - -

Туб. ворс. I 173±8.5 61% 219±18 69% - - -

Туб. ворс. II 59±11 77% 108±9 71% 312±6.5 62% -

Туб. ворс. III 41±4.7 83% - - 322±18 94% NSE

Ворс.полип I 23±6.5 54% 93±7.2 63% 276±21 72% -

Ворс.полип II 14±3.2 50% 43±6.3 66% 259±12 71% -

Ворс.полип III 0 0 - - 236±9 95% NSE

Малигн.полип 69±16 80% 223±22 67% 471±11 91% NSE,Chr

В/д адеиокарц. 60±4.5 51% 157±8 66% 537±17 30% Сст.Гис, Cep,NSE

У/д аденокарц. 6±1.25 57% 88±4.2 76% 230±14 60% NSE,Syn Chr

Н/д аденокарц. 30±6.3 73% 95±10 84% 196±15 80% NSE,Syn Chr

В/д колл. рак 5±1.3 50% 387±8 73% 703±17 35% NSE

У/д колл. рак 7±1.8 - 141±8 67% 426±16 59% Chr

Примечание: Grim - реакция Гримелиуса для выявления количества аргирофильных клеток в опухоли, крае и фоне (цифрами указаны среднее арифметическое и средняя ошибка средней арифметической) ; М-Н - реакция Массона-Гамперля для выявления аргентаффинных клеток (указаны в относительных величинах); 0 - отсутствие клеток; "-" -реакция не проводилась; Сет - соматостатин; Гие -гистамин; Сер - серотонин; NSE - нейрон-специфическая энолаза; Chr - хромогранин A; Syn - синаптофизин.

повышенной секреторной активности: уменьшается количество эндокринных гранул за счет внутрицитоплазматического растворения и диффузии их содержимого за пределы цитоплазматической мембраны, экзоцитоза гранул. Число определяемых эндокринных клеток снижается вследствии их дегрануляцин, частичной деструкции и десквамации в просвет кишки.

В аденомах в отличие от возрастной нормы нередко обнаруживаются "смешанные" эндо-эндокринные клетки, постоянным компонентом которых являются неаргирофильные Д-гранулы. Это тоже может обуславливать снижение способности апудоцитов импрегни-роваться серебром при окраске по Гримелиусу.

При электронномикроскопическом исследовании аденом установлен ряд ульграсгруктурных особенностей, свойственных ранним этапам опухолевой трансформации. К ним относятся: большое число недифференцированных клеток, имеющих крупное ядро с гетерохроматином и несколькими ядрышками, многочисленные свободные рибосомы, гладкую, лишенную инвагинаций цитоплазматическую мембрану с апикально расположенными десмосомами. При нарастании признаков дисплазии число таких маркировочных клеток увеличивается. Проведенное сравнительное изучение эпителия и апудоцитов на тех же электронограммах свидетельствует, что апудоциты характеризуются строением, свойственным физиологической норме с повышенным выведением секреторного содержимого и не имеют описанных в эпителии признаков ультраструктурной атипии. Следует подчеркнуть, что количественные и качественные изменения апудоцитов с тенденцией к дегрануляции, деградации и уменьшению числа клеток нарастают при прогрессии опухолевой трансформации от тубулярных к ворсинчатым аденомам, достигая максимальной выраженности в малигнизированных аденомах. По совокупности морфо-функциональных изменений эндокринного аппарата малигнизированные аденомы аналогичны аденокарциномам.

Апудоциты в ткани раковых опухолей изучены в большей степени, чем в аденомах, но результаты исследований разных авторов противоречивы. По литературным данным апудоциты в паренхиме раков обнаруживаются в 2% (Gibbs N.M., 1967), в 30,9% аденокарцином, независимо от их строения (Ito Н., Hata J., Oda N. et al., 1986), в 35% (Дейнеко Г.М., 1985), в 75% (Jansson D. и соавт., 1988) и даже в 81,6% опухолей (Белоус Т.А. и др., 1995). Между тем, наличие или отсутствие апудоцитов в ткани опухоли существенно влияет на течение опухолевого процесса, хирургическую тактику и прогноз. Считают, что аденокарциномы с наличием апудоцитов более агрессивны (Jansson D. et aL, 1988); при неблагоприятном прогнозе дифференцированные эндокринные клетки встречаются в

аденокарциномах в 2,5-5 раз чаще, чем при опухолях с хорошим прогнозом (Черкес В.А., 1993). Есть мнение о том, что не существует статистически достоверной корреляции стадии, формы опухоли с эндокринным компонентом и прогноза (Ьарег1оза в. е1 а1., 1994).

По нашим данным содержание эндокринных клеток в паренхиме аденокарциномы зависит от её гистологического строения, наличия метастазов и высоты дифференцировки, тогда как размеры опухоли, пол или возраст больных не влияют на изменения апудоцитарного дифферона. В высокодифференцированных аденокарциномах апудоциты обнаружены в 80% случаев, а в умеренно- и низкодифференцированных в 50-60% наблюдений; в высоко- и умерениодиффереицированных коллоидных раках - в 40% и 20% случаев. При наличии метастазов апудоциты в паренхиме раков не обнаруживаются. \Vatanabe Н. (1972) описал аналогичные закономерности содержания апудоцитов в малигнизированных аденомах желудка.

Количество эндокринных клеток в паренхиме раков было максимальным в высокодифференцированных темноклеточных аденокарциномах (60 клеток на кв. мм) и минимальным в муцинозных высокодифференцированных аденокарциномах (5 кл/кв. мм). Корреляция между числом апудоцитов и степенью дифференцировки опухоли не установлена. Однако относительная численность ЕС-аргентаффинных клеток по мере нарастания признаков атипии раковой опухоли достоверно увеличивалась. Эндокринные клетки в ткани высокодифференцированных аденокарцином располагаются регулярно, одиночно, среди тесно лежащих опухолевых клеток и ориентированы к просвету железистых структур. В низкодифференцированных аденокарциномах преобладает гнездное беспорядочное расположение апудоцитов среди криброзных и солидных структур. В коллоидных раках одиночные апудоциты встречаются только в участках наименее выраженной коллоидизацни. То есть, эндокринные клетки в аденокарциномах могут быть единичными или множественными, располагаться диффузно или очагово, а численность их обычно невелика, что согласуется с литературными данными (Никонов А.А., 1983; ЬареНова в. е1 а!., 1994; Дерижанова И.С. и Пасечник Д.Г., 1990).

Электронномикроскопическим исследованием установлено, что для малигнизированных аденом и аденокарцином характерен широкий спектр морфо-функциональных типов апудоцитов. В них помимо 4 основных типов впервые идентифицированы Р-клетки со слабой аргирофильностью. В условиях опухолевой патологии возможна значительная гетерогенность "смешанных" эндо-эндокринных клеток. Нами выделены 5 их типов: с Д и Д1, ЕС и Д, Д и Ь, Д1 и Ь, Д1 и Р гранулами, что имеет прямое отношение к решению вопроса о возможности различных направлений дифференцировки апудоцитов в условиях опухолевого роста. В паренхиме раков нередко встречаются

так называемые "агранулярные" клетки, содержащие в среднем 3-8 нетипируемых гранул, а также эндокринные клетки с незрелыми мономорфными гранулами, напоминающими по строению эмбриональные. Оба эти типа апудоцитов, очевидно, относятся к малодифференцированным формам клеток.

Таким образом, апудоцитарный дифферон при опухолевом росте сочетает признаки обновления, различной степени и направленности дифференцировки, повышенной секреторной активности и деструкции. Ультраструктурных признаков, указывающих на опухолевую трансформацию апудоцитов, не обнаружено. Очевидно, описанные нами формы являются результатом дисбаланса процессов пролиферации, дифференцировки и гибели апудоцитов в условиях опухолевого роста.

В краевой слизистой апудоциты встречаются в 100% случаев. Морфо-функциональная характеристика эндокринных клеток краевой слизистой не имеет принципиального различия с зоной роста опухоли, только в последнем случае изменения более выражены.

При изучении морфогенеза рака представляет самостоятельный интерес морфо-функциональная характеристика апудоцитов макроскопически нормальной фоновой слизистой, имеющей все признаки "переходной" слизистой (Filipe M.I., 1979, 1'984). "Переходная" слизистая характеризуется гипер- и дисплазией эпителия, удлинением, расширением и ветвлением крипт, а также преобладанием в бокаловидных клетках сиаломуцинов вместо обычных сульфомуцинов (Allen D.C. et al., 1988; Greaves P. et al., 1980). Трактовка этих изменений спорна: многие авторы расценивают "переходную" слизистую как предрак (McFadden D.E. et al., 1985; Lee Y-S., 1988; Rodrigez T. et al., 1987; Wolmark N., 1987), другие считают эти изменения реакцией на опухоль и не видят оснований, чтобы расценивать её как маркер малигнизацни (Bogomoletz W.V., 1986; Franzin., 1983; Connolly N.S. et al., 1988).

Несмотря на большое количество морфо-функциональных исследований эпителиальных и бокаловидных клеток "переходной" слизистой, очень немногие изучают третью группу клеток -эндокринные (Biankin A.V., 1995), а данные, полученные учеными, противоречивы. Soga и соавторы (1970) отмечали гиперплазию апудоцитов в "переходной" слизистой только в 20% наблюдений раков. Дерижанова И.С. (1978) наблюдала увеличение числа ЕС-клеток "переходной" слизистой в 6 раз по сравнению с нормой, но только над стенозирующими опухолями.

Фоновая слизистая тубулярных и тубулярно-ворсинчатых аденом по количеству апудоцитов не отличается от нормальной, но апудоциты в ней распределены неравномерно по длине крипт с преимущественной локализацией в глубоких отделах. Достоверные изменения эндокринного аппарата в фоновой слизистой отмечаются только в

группах ворсинчатых полипов с выраженной дисплазией. При малигнизации аденом фоновая слизистая характеризуется скачкообразным возрастанием численности апудоцитов, количество которых более чем в 1,5 раза превышает норму. Изменяется и топография апудоцитов. Они располагаются очагово, группами по 1015 крупных клеток в основании крипт. Основная масса эндокринных клеток локализуется вокруг гиперплазированных лимфоидных фолликулов. В фоновой слизистой высокодифференцированных темноклеточных и муцинозных аденокарцином число эндокринных клеток в 2-2,5 раза превышает нормальное. Снижение степени дифференцировки аденокарцином, дающих распространенные метастазы, коррелирует с уменьшением количества апудоцитов в фоновой слизистой. В фоновой слизистой сохраняется тенденция к увеличению относительного количества ЕС-клеток при снижении степени дифференцировки опухоли.

При ультраструктурном исследовании фоновой слизистой выявляются те же типы клеток, что и в аденомах с аналогичными изменениями секреторной активности. Основываясь на этом наблюдении, можно считать, что в фоновой слизистой возникают диспластические изменения эпителия с вторичными, реактивными изменениями апудоцитарного дифферона.

Представляет теоретический и практический интерес вопрос о взаимоотношении и сравнительной оценке слизеобразования и морфо-функциональной характеристики апудоцитарного дифферона в опухоли, крае и фоне в связи с тем, что показатели слизеобразования рассматриваются как критерии оценки опухолевого роста.

При изучении слизеобразования в опухоли и крае были замечены две закономерности. Нарастание признаков атипии сопровождалось снижением количества внутриклеточной и увеличением количества внеклеточной слизи, что подтверждается ультраструктурным исследованием. По мере опухолевой прогрессии наблюдается достоверное снижение нейтральных и кислых мукополисахаридов во всех изученных группах, кроме коллоидных раков.

Слизеобразование фоновой слизистой отличалось от нормы достоверным снижением количества нейтральных мукополисахаридов по мере опухолевой прогрессии и увеличением количества кислых мукополисахаридов, особенно несульфатированных. От аденом без и с признаками малигнизации к аденокарциномам возрастающей степенью атипии в фоновой слизистой отмечается постепенное снижение гликопротеидов при одновременном нарастании количества гликозаминогликанов. Достоверного преобладания сиаломуцинов над сульфомуцинами установить не удалось, вопреки данным большинства исследователей.

При сравнении качественных и количественных показателей слизеобразования и апудоцитарного дифферона в этих же наблюдениях

обнаружены существенные различия между непостоянством признаков слизеобразования и стабильностью объективных показателей изменений эндокринных клеток, подчиняющихся определенным закономерностям. Эти изменения эндокринного аппарата коррелируют с биологической сущностью, этапом прогрессии опухолевого роста и дифференцировкой опухоли. Тот факт, что при снижении количества апудоцитов в опухоли в большинстве случаев наблюдается повышение их количества в фоновой слизистой, свидетельствует, очевидно, о больших компенсаторных возможностях апудоцитарного дифферона, поддерживающего уровень гормональной продукции на постоянном уровне. Эта закономерность не определяется только в группах умеренно- и низкодифференцированных раков, что, по-видимому, связано с истощением компенсаторных возможностей эндокринных клеток. Можно сделать предположение, что для каждого патологического состояния имеется своя специфическая картина изменений количественных и качественных показателей эндокринного аппарата, адекватная силе повреждающего фактора.

Морфо-функциональный статус эндокринного аппарата является своеобразным универсальным маркером каждого этапа опухолевой прогрессии и может быть использован в качестве одного из надежных, объективных диагностических критериев. В связи с этим положением изученные формы опухолевого роста рационально расположить по степени изменений апудоцитарного дифферона в определенной последовательности: тубулярные, тубулярно-ворсинчатые,

ворсинчатые, малигнизированные аденомы, темноклеточные и муцинозные аденокарциномы, причем малигнизированные полипы по всем параметрам ближе к аденокарциномам, чем к аденомам.

Проведенная сравнительная оценка результатов использования гистохимического, иммуноморфологического и электронномикроско-пического методов свидетельствует о необходимости комплексного исследования АПУД-системы толстой кишки. Однако следует отметить некоторые направления приоритетного выбора и взаимозаменяемости использованных методов. Для морфометрического исследования наиболее рациональным является метод Гримелиуса в сравнении с методом Паскуаля. Для уточнения гормонального профиля можно рекомендовать метод Массона-Гамперля и иммуногистохимические реакции со специфическими сыворотками. При изучении апудоцитов в паренхиме раков наилучшие результаты дает применение нейроэндокринных маркеров широкого профиля, в частности хромогранина А. Антисыворотки к синаптофизину и нейронспецифической энолазе менее чувствительны, а последняя дает диффузное окрашивание, затрудняющее количественную оценку апудоцитарного дифферона. При необходимости изучения морфо-функционального состояния эндокринных клеток и определения уровня

дифференцировкн оптимальные результаты достигаются при электронномикроскопическом исследовании.

ВЫВОДЫ.

1. У плодов апудоциты впервые идентифицируются на 8 неделе беременности, когда эпителиальный пласт еще индифферентен. Становление эндокринного аппарата на всех этапах внутриутробного развития опережает формирование эпителиальных структур и к 25-28 неделям качественный и количественный состав апудоцитов стабилизируется, достигая взрослых показателей.

2. В нормальном эпителии прямой кишки человека на основании ультраструктуры и размеров секреторных гранул выявлены 4 типа эндокринных клеток: ЕС, Д1, Д и Ь тип. Иммуногистохимически в них обнаружены серотонин, соматостатин и энтероглюкагон. Количественное содержание различных типов апудоцитов постоянно на протяжении онтогенеза без достоверных индивидуальных колебаний численности. При стабильных количественных соотношениях доминирующей клеточной популяцией являются ЕС-клетки (62%), вторые по частоте Д1-клетки (15-20%), численность Д- и Ь-клеток равна и составляет по 8-10% каждого типа. В ультраструктурном отношении все апудоциты являются высокодифференцированными клетками, находящимися в состоянии функционального покоя.

3. В аденомах имеется четкая корреляция между частотой обнаружения и количеством апудоцитов, гистологическим типом и степенью дисплазии эпителия. С большей частотой и в большем количестве апудоциты обнаруживаются в аденомах со слабо выраженной дисплазией, преимущественно тубулярного строения. В краевой слизистой оболочке аденом апудоциты определяются в 100% случаев с количественными закономерностями, аналогичными ткани аденом. Достоверное снижение числа апудоцитов отмечается лишь в фоновой слизистой ворсинчатых аденом.

4. В аденомах выявляются кроме 4 основных ультраструктурных типов апудоцитов "смешанные" эндо-эндокринные клетки с Д и Ь, Д1 и Ъ гранулами. Апудоциты характеризуются повышенной секреторной активностью, выраженность которой зависит от гистологической формы и степени дифференцировки опухоли. Наибольшие морфо-функциональные изменения эндокринных клеток отмечены в группах ворсинчатых аденом, наименьшие - в группах тубулярных аденом, а тубулярно-ворсинчатые занимают промежуточное положение.

5. В аденокарциномах частота обнаружения и количество апудоцитов коррелирует с гистологическим типом и стадией прогрессии опухоли. В темноклеточных аденокарциномах апудоциты определяются чаще и в большем количестве, чем в муцинозных. При наличии метастазов апудоциты в паренхиме раков не обнаруживаются. В аденокарциномах кроме 5 основных типов клеток (ЕС, Д1, Д, Ь и Р)

выявляется большое число "смешанных" эндо-эндокринных клеток. Электронно-микроскопическим исследованием установлена активация процессов созревания, дифференцировки, секреции и гибели апудоцитов, обнаружены малодифференцированные "агранулярные" и дифференцирующиеся клетки. Ультраструктурные признаки опухолевой трансформации апудоцитов отсутствуют.

6. Для краевой и фоновой слизистой оболочки малигнизированных аденом и высокодифференцированных аденокарцином характерно выраженное скачкообразное увеличение количества эндокринных клеток (в 1,5-2 раза по сравнению с нормой), для слизистой умеренно-и низкодифференцированных аденокарцином - гипоплазия эндокринного аппарата. Апудоциты фоновой слизистой характеризуются аналогичными ультраструктурными изменениями, что и апудоциты в ткани аденом. Снижение степени дифференцировки аденом и аденокарцином сопровождается возрастанием относительного числа серотонин-содержащих ЕС-клеток в среднем на 20-30% в опухоли, крае и фоне.

7. Существует обратно пропорциональная зависимость между количеством эндокринных клеток в ткани опухоли и фоновой слизистой, свидетельствующая о высокой компенсаторной возможности эндокринного аппарата. Изменение количественных и качественных показателей апудоцитарного дифферона адекватно отражает степень атипических изменений различных клинико-морфологических форм опухолей, которые в связи с этим можно расположить в определенной последовательности: губулярные, тубулярно-ворсинчатые, ворсинчатые, малигнизированные аденомы, темноклеточные и муцинозные аденокарциномы. Малигнизированные полипы по изученным параметрам ближе к аденокарциномам, чем к аденомам.

8. Топографические, количественные, морфо-функциональные показатели апудоцитов свидетельствуют, что состояние апудоцитарного дифферона является универсальным, объективным маркером опухолевой прогрессии. Изменение характеристик эндокринного аппарата прямой кишки может служить дополнительным критерием при дифференциальной диагностике эпителиальных опухолей различной биологической сущности.

Практические рекомендации.

1. Морфо-функциональная характеристика апудоцитарного дифферона адекватно отражает этапы морфогенеза опухолей ректо-сигмоидного отдела и может быть использована в патологоанатомической практике для определения биологического потенциала аденом, а также в качестве дополнительного диагностического критерия малигнизации и стадии опухолевой прогрессии.

2. Сравнительный анализ слизеобразования и апудоцитарного дифферона переходной слизистой позволяет считать, что изменение функции слизеобразования менее информативно в плане изучения опухолевого роста.

3. Статистически достоверное изменение соотношения аргирофильных и аргентаффинных апудоцитов в опухолях и фоновой слизистой объективно отражает степень дифференцировки новообразований. При количественной оценке эндокринного аппарата рекомендуется применение методов импрегнации серебром по Гримелиусу и Массону-Гамперлю.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Третьякова М.С. Содержание эндокринных клеток в эпителии толстой кишки белых крыс в норме и эксперименте // Программа XXXIV конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр и лабораторий Ленинградских ВУЗов и НИИ, BMA. - Л.,1991. - с.21.

2. Третьякова М.С. Количественный анализ эндокриноцитов толстой кишки крыс при введении различных иммунодепрессантов // Прогр. XXXV конфер. студ. и аспир. морфол. каф. и лабор. Лен. ВУЗов и НИИ, BMA. - Л.,1992. - с.19-20.

3. Третьякова М.С. Сравнительный анализ эндокринного аппарата слизистой оболочки прямой кишки крысы и человека // Прогр. XXXVI конфер. студ. и аспир. морфол. каф. и лабор. Лен. ВУЗов и НИИ, BMA. -Л.,1993. - с.19.

4. Миронова В.А., Третьякова М.С. Морфологическая оценка состояния слизистой оболочки отключенного участка прямой кишки человека // В кн.: "Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе", BMA. - Л.,1993. - с.35.

5. Третьякова М.С. Количественная характеристика эндокринного аппарата прямой кишки человека при воспалении // В кн.: "Актуальные вопросы профилактической и клинической медицины", СПбГСГМИ. -СПб.,1994. - с.70.

6. Третьякова М.С., Кудряшова С.О. Воздействие азатиоприна на эндокринный аппарат толстой кишки белых крыс в различные периоды онтогенеза // Прогр. XXXVII конфер. студ. и аспир. морфол. каф. и лабор. Лен. ВУЗов и НИИ, BMA. - СПб., 1994. - с.23-24.

7. Третьякова М.С. Эндокринный аппарат прямой кишки человека при различных функциональных состояниях органа // В кн.: "Актуальные вопросы медицины" (Тезисы Всероссийской конференции),РАМН. - М.,1994. - с. 147.

8. Третьякова М.С., Курцер Г.М. Опыт применения дисперсионного анализа в онкоморфологии // В сб. "Проблемы оптимизации образа жизни и здоровья человека". - СПб., 1995. - с. 186187.

9. Третьякова М.С., Сережин Б.С. Апудоциты прямой кишки при опухолевом процессе // Сб. тезисов I Съезда Международного союза ассоциаций патологоанатомов. - М.,1995. - с. 161-162.

10. Третьякова М.С., Кудряшова С.О. Сравнительная оценка влияния азатиоприна на эндокриноциты толстой кишки крыс в эмбриогенезе и постнатальном периоде // Прогр. XXXIX науч. конфер. студ. и аспир. медВУЗов и НИИ, BMA. - СПб., 1996. - с. 12.

11. Третьякова М.С., Храмцов А.И. Направление диагностики низкодифференцированных беспигментных меланом прямой кишки //

. Сб. тезисов "Актуальные вопросы современной медицины", СПбСГМА. - СПб.,1996. - с. 157.

12. Третьякова М.С., Кребс Н.Е. Слизеобразование толстой кишки и опухолевый рост // Сб. тезисов "Актуальные вопросы современной медицины", СПбСГМА. - СПб.,1996. - с. 156.