Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование применения сурфактант-антибактериальной терапии при лечении воспалительных процессов в легких

На правах рукописи

Биркун Алексей Алексеевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ СУРФАКТАНТ-АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ЛЕГКИХ

14.03.03 — патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 з МАЙ 2015

005568606

Краснодар — 2015

005568606

Работа выполнена в Медицинской академии им. С. И. Георгиевского федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского».

Официальные оппоненты:

Овсянников Виктор Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра патологической физиологии, заведующий кафедрой.

Рогова Людмила Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра патологической физиологии, заведующая кафедрой.

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « 26 » мая 2015 г. в 10.00 ч. на заседании диссертационного совета Д208.038.02 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России) (350063, Краснодар, ул. Седина, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России и в сети «Интернет» на официальном сайте университета http://www.ksma.ru

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кубышкин Анатолий Владимирович

Автореферат разослан «Я: /»

Учёный секретарь диссертационного совета Д208.038.02,

доктор медицинских наук, доцент

Лапина Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Проблема лечения воспалительных заболеваний бронхолегочной системы приобретает все большую актуальность в связи с увеличением антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов, которая развивается, в частности, вследствие недостаточно эффективной противомикробной терапии [Kiffer and Pignatari, 2011; Porras-Gomez et al., 2012]. Несмотря на достижения современной медицинской науки, особенно высокими показателями смертности характеризуются внутрибольничные формы инфекции органов дыхания, включая госпитальную пневмонию (ГП) [ATS, 2005; Barbier et al., 2013].

Одним из наиболее распространенных возбудителей госпитальной инфекции органов дыхания является синегнойная палочка, Pseudomonas aeruginosa, которая обладает повышенным уровнем резистентности к антибактериальным, в том числе, антисинегнойным препаратам [Fatima et al., 2012; Porras-Gómez et al., 2012; Биркун, 2012; Erdem et al., 2014]. Установлено, что ГП, вызванная Р. aeruginosa, характеризуется более высокими показателями смертности по сравнению с пневмонией другой бактериальной этиологии [Masterton et al., 2008]. В то же время ГП удерживает одну из лидирующих позиций в структуре внутрибольничной заболеваемости и смертности [ATS, 2005; Blanquer et al., 2011]. Развитие ГП продлевает срок пребывания пациента в стационаре на 7-9 суток, что сопровождается увеличением расходов, связанных с лечением, более чем на 40000$ на одного пациента [ATS, 2005]. При общей распространенности в пределах 0,5-1,0% ГП характеризуется самыми высокими показателями смертности среди всех форм нозокомиалыюй инфекции [Masterton et al., 2008; Barbier et al., 2013].

Учитывая значимость и актуальность проблемы, существует постоянная необходимость в разработке новых и совершенствовании существующих методов лечения ГП, включая повышение эффективности антибактериальной терапии, результативность которой, в свою очередь, зависит от формирования достаточной концентрации антибиотика в очаге инфекции [Baldwin et al., 1992; Rouby et al., 2012].

Легочный сурфактант, представляющий собой липопротеиновый комплекс, который синтезируется альвеолоцитами, уменьшает поверхностное натяжение на границе фаз воздух-жидкость, что обеспечивает нормальную альвеолярную вентиляцию и газообмен, а также предупреждает коллабирование альвеол [Willson and Notter, 2011; Zhang et al., 2013]. Известно, что сурфактант, снижая поверхностное натяжение, способствует более равномерному периферическому распределению жидкости в респираторной ткани. В этой связи экзогенный (т. е. полученный из легких животных-продуцентов) сурфактант может использоваться как средство доставки лекарственных препаратов в периферические отделы легких у пациентов с различными заболеваниями органов дыхания [Vermehren et al., 2006]. Ряд исследований характеризует экзогенный сурфактант как перспективное средство доставки антибиотиков в дистальный отдел дыхательных путей [van't Veen et al., 1999; Haitsma et al., 2001; Stichtenoth et al., 2010], однако эти работы немногочисленны и ограничиваются изучением взаимодействия нескольких антибактериальных препаратов и сурфактанта в основном in vitro, тогда как комплексная оценка эффектов комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии in vivo в сравнении с другими схемами терапии до сих пор не проводилась.

Цель исследования - экспериментальное патогенетическое обоснование сочетанного эндотрахеального применения антибиотика и экзогенного сурфактанта при лечении воспалительных процессов в легких.

Задачи исследования

1. Изучить взаимное влияние антибиотиков и сурфактанта на поверхностную активность и антибактериальные свойства препаратов в исследованиях in vitro.

2. Оценить влияние комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии на качественные и количественные показатели бактериального обсеменения при экспериментальном остром воспалительном процессе в легких.

3. Изучить изменения поверхностной активности бронхоальвеолярного смыва (БАС) после эндотрахеального введения комбинации сурфактанта с антибиотиком при экспериментальном остром бактериальном воспалительном процессе в легких.

4. Оценить локальные и системные изменения лейкоцитарного ответа, а также профиля неспецифических протеиназ и их ингибиторов под влиянием комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии при экспериментальном остром бактериальном воспалительном процессе в легких.

5. Провести качественную и количественную морфологическую оценку изменений в легких и анализ эффективности оксигенации после воздействия комбинацией сурфактанта и антибиотика при экспериментальном бактериальном воспалительном процессе.

Научная новизна полученных результатов. На основании результатов микробиологического и физико-химического исследований взаимодействия сурфактанта и ряда антибактериальных препаратов in vitro впервые разработан и предложен для доклинических испытаний метод сочетанного применения экзогенного сурфактанта и антибиотиков при лечении острого бактериального воспалительного процесса в легких.

Впервые экспериментально обоснована целесообразность применения комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии и выполнена комплексная экспериментальная оценка эффективности нового метода лечения воспалительных заболеваний органов дыхания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования позволили оценить эффективность и обосновать целесообразность применения сурфактанта в качестве средства, способствующего более эффективному использованию антибактериальных препаратов при лечении воспалительных процессов в легких.

Полученные результаты могут послужить основой для дальнейшего внедрения указанного метода в клиническую практику с целью лечения ГП, а также для изучения сурфактанта в качестве средства, повышающего эффективность применения других лекарственных препаратов. В частности, могут быть изучены новые комбинации препаратов экзогенного сурфактанта и различных антибактериальных средств.

Кроме того, на основании полученных результатов можно рекомендовать исследованную комбинацию экзогенного сурфактанта и антибиотика при других видах госпитальной инфекции, протекающих с повреждением органов дыхания.

Методология и методы исследования. В работе использовались методы экспериментального моделирования воспалительного процесса в легких, микробиологические методы (оценка чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений, посев материала на питательные среды с

качественной и количественной бактериологической оценкой), физико-химические методы (оценка динамики силы поверхностного натяжения с помощью модифицированного метода Pattie), биохимические методы (изучение профиля неспецифических прогеиназ и их ингибиторов, анализ показателей оксигенации артериальной крови), морфологические методы (патогистологическое исследование легких и цитологическое исследование лейкоцитов крови и бронхоальвеолярного смыва), статистические методы. Объект исследования - экспериментальные животные (крысы линии Wistar), у которых вызывали острые воспалительные изменения в легких посредством эндотрахеального введения бактериальной суспензии {Р. aeruginosa). Предмет исследования - эффекты использования комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии при лечении воспалительных процессов в легких.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди изученных комбинаций сурфакганта и антибиотиков оптимальной для испытаний при экспериментальном остром воспалительном процессе в легких у лабораторных животных является комбинация препарата Сузакрин (экзогенный сурфактант) с амикацином (антибиотик) - их смешивание in vitro не приводит к снижению поверхностно-активных свойств и противомикробной активности препаратов.

2. При острой пневмонии, вызванной Р. aeruginosa, интратрахеальное введение смеси сурфактант-амикацин обеспечивает существенное снижение бактериальной контаминации дыхательных путей, ограничение бактериемии, препятствует подавлению поверхностной активности БАС, обеспечивает генерализованное и локальное торможение нейтрофилоцитарного компонента воспаления, снижение протеолитической активности и возрастание активности ингибиторов протеиназ, а также уменьшение морфологических проявлений острой пневмонии, не оказывая существенного влияния на оксигенацию артериальной крови.

3. Комбинированная терапия сурфактантом и амикацином обладает существенно большей эффективностью по сравнению с монотерапией этими препаратами, что свидетельствует о целесообразности применения экзогенного легочного сурфактанта в качестве средства доставки антибиотиков, вводимых интратрахеальным путем, при лечении воспалительных процессов в легких.

Степень достоверности. О достоверности полученных результатов и обоснованности выводов свидетельствуют личное участие соискателя в получении и анализе экспериментальных данных, корректная постановка опытов с использованием необходимых контрольных групп, большое количество наблюдений, применение современных методов исследования и адекватной статистической оценки полученных данных.

Апробация результатов. Материалы диссертации представлены и обсуждались в рамках: Открытой научно-практической конференции «Человек и микроорганизмы -параллельные миры» (Симферополь, 2012), Drug Delivery to the Lungs 23 Conference (Edinburgh, 2012), 1-го Евразийского съезда патофизиологов «Патологическая физиология: современное состояние, проблемы и перспективы» (Алматы, 2013), European Respiratory Society Annual Congress (Barcelona, 2013), 7th International Congress of Pathophysiology (Rabat, 2014), Научно-практической конференции с участием международных специалистов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической патофизиологии» (Винница, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них: 6 - статьи в специализированных журналах и сборниках, 3 из которых -моноавторские, 3 - в соавторстве; 4 - материалы зарубежных конференций. Одна статья опубликована в зарубежном издании.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов и заключение, выводы, список литературы. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 12 рисунками. Библиографический перечень содержит 211 наименований работ (55 отечественных и 156 зарубежных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены в два этапа. На первом этапе выполнена оценка взаимного влияния препарата натурального легочного сурфактанта свиньи и ряда антибактериальных препаратов in vitro, включая оценку влияния антибиотиков на поверхностную активность сурфактанта и влияние сурфактанта на противомикробные свойства антибиотиков, и определена оптимальная комбинация сурфактант-антибиотик для дальнейших исследований in vivo. Задача второго этапа состояла в оценке эффектов выбранного сочетания сурфактант-антибиотик при моделировании острого воспаления в легких у лабораторных животных.

В исследовании использован препарат экзогенного сурфактанта Сузакрин (Докфарм, Украина) - эмульсия очищенных фосфолипидов сурфактанта, полученных из гомогенатов легочной ткани свиньи, в физиологическом растворе. Препарат содержит сурфаетант-ассоциированные белки В и С, но лишен белков сурфактанта А и D.

В экспериментах in vitro использовали антибактериальные препараты амикацин (Амицил, Киевмедпрепарат, Украина), колистиметат натрия (Коломицин Инъекция, Forest Laboratories UK Ltd., Великобритания) и цефепим (Cefepime HCl, Nectar Lifesciences Ltd., Индия).

В опытах in vivo использовали 119 взрослых самцов крыс линии Wistar, которые были разделены на 10 групп (таблица 1) в зависимости от характера субстанции, введенной в трахею пункционным методом (взвесь P. aeruginosa, штамм АТСС27853 или физиологический раствор), и вида терапевтического воздействия путем эндотрахеальной инсталляции через 6 часов после инициации воспаления в легких.

Дозы сурфактанта и антибиотика для эндотрахеального введения рассчитывали на основе максимальных суточных доз, рекомендованных для взрослых пациентов, а именно: 10 мг/кг и 15 мг/кг для препаратов Сузакрин и Амицил, соответственно.

Оценку динамики силы поверхностного натяжения сурфактанта, антибиотиков и экспериментальных смесей in vitro выполняли при помощи модифицированного метода Pattle [Pattle et al., 1979]. Для этого пробы подвергали вспениванию, а висячие капли полученной пены изучали в проходящем свете при помощи микроскопа, оснащенного фотокамерой. Фотографирование в каждой капле по одному полю зрения, равномерно заполненному пузырьками, выполнялось при увеличении 200" в автоматическом режиме в течение 20 мин, с интервалом 30 сек. Полученные снимки (всего 1230 кадров) анализировали при помощи программного продукта Olympus DP-Soft 3.11. На всех снимках каждой повторности отслеживали изменения 20 произвольно выбранных пузырьков. Диаметр пузырьков (мкм) измеряли только в

первом и последнем (сделанном спустя 20 мин) снимках. Всего проведено 1200 измерений пузырьков. Для каждой повторности рассчитывали индекс стабильности (ИС) по формуле:

ИС--

IX

где с!х - результат последнего измерения в серии (41-й снимок), а с1у - результат первого измерения (1-й снимок).

Оценку динамики силы поверхностного натяжения БАС у лабораторных животных осуществляли с помощью модифицированного метода РаИ1е (см. выше). Всего были выполнены 4797 снимков и проведены 4680 измерений пузырьков.

Таблица 1

Название группы Введение Терапевти- Время Время п

взвеси ческое терапев- забоя

P. aerugi- воздействие тического (ч)

nosa воздействия (ч)

интактные нет без терапии - 0 6

неинфицированные/физраствор нет физраствор 6 24 18

неинфицнрованные/ сурфактант нет сурфактант 6 24 12

неинфицированные/амикацин нет амикацин 6 24 16

неинфицированные/сурфактант-амикацин нет сурфактант-амикацин 6 24 11

инфицированные/без терапии да без терапии - 6 11

инфицированные/физраствор да физраствор 6 24 12

инфицированные/сурфактант да сурфактант 6 24 11

инфицированные/амикацин да амикацин 6 24 11

инфицированные/сурфактант- да сурфактант- 6 24 11

амикацин амикацин

Примечание: п — количество животных в группе.

При оценке чувствительности бактерий к антибиотикам, сурфактанту и экспериментальным смесям in vitro использовали музейные штаммы Staphylococcus aureus (штамм АТСС25923), Klebsiella pneumoniae (штамм 3534/51) и P. aeruginosa (штамм АТСС27853). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) исследуемых субстанций определяли методом серийных разведений [Биргер, 1982] в бульоне Хоттингера. Максимальная исследуемая концентрация для амикацина и цефепима составляла 1000 мкг/мл, для колистиметата натрия - 320 мкг/мл, для сурфактанта в смесях с антибиотиками — 700 мкг/мл (в смеси с амикацином и колистиметатом натрия) и 350 мкг/мл (в смеси с цефепимом). После переноса материала из пробирок с прозрачным бульоном на мясо-пептонный агар и инкубации в течение 24 часов при температуре 37°С определяли минимальную бактерицидную концентрацию (МБК).

Посев БАС проводили по методу Gould [Gould, 1965]. Посевы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С. Затем подсчитывали число колоний в каждом секторе посева и по таблице определяли число колониеобразующих единиц в 1 мл образца. Для выделения гемокультуры 1 мл крови вносили в 30 мл сахарного бульона,

инкубировали 24 часа при температуре 37°С, а затем штрихом высевали на соответствующие питательные среды.

Активность протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и БАС исследовали с использованием энзиматических методов [Кубышкин и соавт., 2010]. Для измерений трипсиноподобной активности (ТПА), эластазоподобной активности (ЭПА), антитриптической активности (ATA) и активности кислотостабильных ингибиторов (КСИ) применяли спектрофотометр «BioMate5» (Thermo Spectronic, В еликобритания).

Измерение показателей оксигенации артериальной крови осуществляли при помощи анализатора EasyStat (Medica Corporation, США). Для каждой пробы крови были определены сатурация гемоглобина кислородом (Sa02), парциальное давление кислорода и концентрация кислорода в артериальной крови.

С целью патогистологической оценки проб легочной ткани методом световой микроскопии использовали микроскоп Olympus СХ41, оснащенный цифровой фотокамерой Olympus C-5050Z. Ключевые морфологические показатели оценивали полуколичественным методом в баллах в зависимости от выраженности изменений (0 - отсутствуют, 1 - слабые; 2 - умеренные; 3 - сильные). Исследование ультраструктурных изменений выполняли с помощью электронного микроскопа ПЭМ-125К (Selmi, Украина).

Для морфометрического анализа снимков, полученных при электронной микроскопии, использовали программный продукт ImageJ 1.48. Степень заполнения секреторных вакуолей альвеолоцитов II типа осмиофильным материалом пластинчатых телец определяли путем деления числа пикселей цифрового изображения, попадающих на осмиофильный материал, на общее число пикселей, соответствующих внутреннему пространству секреторной вакуоли [Новиков, 2012].

Цитологическая оценка включала дифференциальный подсчет лейкоцитов методом световой микроскопии в мазках крови и БАС, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали не менее 100 клеток в мазке крови и 50 клеток в мазке БАС с последующим выведением процентного количества нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов и лимфоцитов. Дополнительно вычисляли отношение гранулоцитов к агранулоцитам и нейтрофилов к лимфоцитам.

Полученные цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики с определением средних арифметических значений (М), стандартной ошибки (т) и уровня значимости различий (р) с помощью /-критерия Стьюдента. Уровень вероятности различий р<0,05 рассматривался как статистически значимый. Статистические расчеты выполняли с помощью программного пакета Microsoft Excel.

Результаты исследования и обсуждение

Взаимное влияние экзогенного сурфактанта и антибиотиков in vitro

Оценка влияния антибиотиков на поверхностную активность сурфактанта показала, что при добавлении амикацина к эмульсии сурфактанта способность последнего снижать поверхностное натяжение жидкости существенно не ослаблялась: экспериментальная смесь Сузакрин-амикацин характеризовалась по сравнению с контролем (таблица 2) меньшим диаметром пузырьков как в начале, так и в конце опыта (р<0,001), а также значительно меньшей склонностью к сокращению размера пузырьков при 20-минутной экспозиции (р<0,001). При этом ИС не претерпевал существенных изменений (р> 0,05), оставаясь на свойственном сурфактанту высоком уровне.

Таблица 2

Показатели поверхностной активности экспериментальных смесей, включающих Сузакрин и антибиотики

Показатели поверхностной активности Сузакрин + физраствор (контроль) Сузакрин + колистиме-тат натрия Сузакрин + амикацин Сузакрин + цефепим

Диаметр пузырьков, М ± т (п), мкм

(а) в начале опыта 77,98 ± 2,03 (100) 83,23 ± 3,23 (100) 56,04 ± 2,01 (100) 86,55 ±2,17 (100)

(б) в конце опыта (через 20 мин) 67,35 ± 1,56 (100) 53,52 ±3,14 (100) 51,45 ±2,12 (100) 70,20 ± 1,86 (100)

разница между (а) и (б) 10,62 ± 1,18 (100) 29,71 ±2,23 (100) 4,59 ± 0,62 (100) 16,34 ± 1,33 (100)

Индекс стабильности (ИС) 0,76 ±0,04 (5) 0,49 ± 0,06 (5) 0,85 ± 0,05 (5) 0,67 ±0,04 (5)

Комбинация Сузакрин-цефепим также сохраняла высокую поверхностную активность по показателю ИС (р>0,05), но отличалась от контроля большим диаметром пузырьков в начале опыта (р<0,01) и несколько более выраженным, или ускоренным уменьшением их размера (р<0,01).

В то же время, при смешивании эмульсии сурфактанта с раствором колистиметата натрия зарегистрировано явное подавление поверхностной активности: между комбинацией Сузакрин-колистиметат натрия и контролем отсутствовала статистически существенная разница в первоначальном размере пузырьков (р>0,05), но в конце опыта пузырьки экспериментальной смеси значительно уступали в диаметре пузырькам сурфактанта (р<0,001). Соответственно, и тенденция к уменьшению размера пузырьков была более выраженной при добавлении антибиотика (р<0,001). В данных условиях опыта отмечалось значимое снижение ИС как по сравнению с контролем (р<0,01), так и по отношению к исходным препарату сурфактанта (р<0,001) и раствору колистиметата натрия (р<0,05).

Результаты оценки влияния сурфактанта на противомикробные свойства антибиотиков свидетельствуют, что при смешивании в одном объеме исследованный препарат сурфактанта либо не изменяет показатели противомикробной активности антибактериальных препаратов (в частности, амикацин полностью сохраняет свои свойства), либо оказывает слабое или умеренное влияние (таблица 3). Это влияние препарата Сузакрин в случае цефепима проявляется в тенденции к ослаблению бактерицидного действия, а в случае колистиметата натрия - к увеличению бакгериостатаческой активности по отношению к S. aureus и P. aeruginosa.

Таким образом, этап in vitro позволил определить оптимальный антибиотик для сочетанного применения с сурфактантом - амикацин. Смешивание амикацина с сурфактантом в одном объеме не оказывало существенного влияния на поверхностно-активные свойства сурфактанта и не приводило к снижению противомикробной активности амикацина, тогда как сочетания сурфактанта с цефепимом или колистиметатом натрия характеризовались негативным влиянием на поверхностную или антибактериальную активность.

Таблица 3

Бактериостатическне и бактерицидные свойства растворов антибиотиков и _экспериментальных комбинаций сурфактанг-антибиотик_

Антибиотики и комбинации сурфактант-антибиотик Показатели МПК и МБК (мкг/мл)

5. aureus К. pneumoniae P. aeruginosa

МПК МБК МПК МБК МПК МБК

амикацин 3,9 3,9 1,9 1,9 3,9 3,9

амикацин + сурфактант 3,9 3,9 1,9 1,9 3,9 3,9

цефепим <0,49 1,9 > 1000 > 1000 3,9 500

цефепим + сурфактант <0,49 3,9 > 1000 > 1000 3,9(1,9) 1000

колистиметат натрия 80 80 20 160 20 160

колистиметат натрия + сурфактант 20 80 20 (10) 160 10 160

Примечание: в круглых скобках представлены дополнительные показатели МПК, если в повторностях были получены различные результаты.

Эффекты сочетанной сурфактант-антибактериальной терапии при экспериментальном остром воспалении в легких

Эндотрахеальное введение экспериментальной комбинации антибиотика с экзогенным сурфактантом характеризовалось комплексным многонаправленным вмешательством в развитие острой пневмонии, одновременно оказывающим воздействие на различные патогенетические звенья инфекционно-воспалительного процесса в легких (рисунок 1).

Рисунок 1 - Патогенетическая схема бактериального повреждения легких с нарушением функции эндогенного сурфактанта, и точки приложения комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии.

У крыс с экспериментальной пневмонией, которым интратрахеально вводили смесь амикацина с сурфактантом, интенсивность обсеменения БАС синегнойной палочкой была существенно меньше, чем у инфицированных животных, получавших чистый сурфактант (р<0,01) или физраствор (р<0,001). Отсутствие статистически значимых различий по всем бактериологическим показателям между крысами этой группы и животными, получавшими чистый амикацин, свидетельствует о сохранении противомикробной активности антибиотика после смешивания с сурфактантом свиньи и последующей совместной инсталляции обоих препаратов. Более того, самые низкие из всех сравниваемых групп показатели экстенсивности и интенсивности бактериального обсеменения (таблица 4, группа «сурфактант + амикацин») указывают на отчетливую тенденцию к увеличению антисинегнойных эффектов амикацина in vivo при введении вместе с сурфактантом.

Таблица 4

Обсемененность БАС и крови Р. aeruginosa у инфицированных крыс

Исследованный показатель Группа животных (введенный препарат)

без терапии физраствор сурфактант амикацин сурфактант + амикацин

Ра-позитивные крысы, кровь, % ± т (п) 36± 15 (") 58 ± 15 (12) 36 ± 15 (И) 36 ± 15 (П) 27 ± 14 (П)

Ра-позитивные крысы, БАС, % ± т (и) 91 ± 9 (П) 100 ±25 (12) 100 ± 27 (И) 82 ± 12 (П) 55 ± 16 (П)

Пределы концентраций Ра, БАС, КОЕ/мл 0500 000 1001 000 000 1001 000 000 0100 000 010 000

Средняя обсемененность Ра, БАС, 1о£ю± т (п) 3,47 ±0,38 (10) 4,52 ± 0,34 (12) 4,20 ±0,38 (П) 2,74 ±0,41 (9) 2,33 ± 0,33 (6)

Примечание: logl0 - десятичный логарифм средней геометрической; Ра ~ Р. aeruginosa; КОЕ/мл - колониеобразующие единицы в миллилитре.

Таким образом, у инфицированных крыс сочетанная сурфактант-антибактериальная терапия обеспечивала выраженное уменьшение бактериального обсеменения дыхательных путей и ограничение бактериемии. Поскольку in vitro исследованный препарат экзогенного сурфактанта не обладал собственным антибактериальным действием по отношению к P. aeruginosa и не потенцировал антисинегнойные эффекты амикацина при смешивании в одном объеме, по-видимому, выявленные положительные эффекты комбинированной терапии связаны с более эффективным распределением антибиотика в респираторном отделе легких.

Терапевтическое воздействие амикацином и комбинацией сурфактант-амикацин у животных с пневмонией характеризовалось значительным увеличением процентного содержания лимфоцитов при снижении доли нейтрофилов и уменьшении отношений гранулоциты/агранулоциты и нейтрофнлы/лимфоциты как в БАС, так и в крови (р<0,001, в сравнении с группой «физраствор», рисунок 2). В группе терапии чистым сурфактантом эти эффекты проявились в пробах БАС при меньшем уровне

вероятности различий (р<0,01 для доли нейтрофилов и отношения нейтрофилы/лимфоциты; р<0,05 для доли лимфоцитов и отношения гранулоциты/агранулоциты). У животных, получавших комбинированную терапию, были зарегистрированы самые низкие показатели содержания нейтрофилов в крови и БАС. По сравнению с группой терапии амикацином, группа комбинированного воздействия характеризовалась отсутствием существенных отличий от группы здоровых крыс по показателям доли нейтрофилов и отношения нейтрофилы/лимфоциты в крови.

0,00 »„„оные «рысы »кфицироыниыс/ инфицирование/ инфицкроюнны'/ инфициро«анные/ инфицированные/ без терапии фмэрялвор сурфактакт амикацин сурфдаетант-

амикацим

Рисунок 2 - Соотношение гранулоциты/агранулоциты в БАС и крови интактных и инфицированных крыс при различных экспериментальных воздействиях. *'14 5 - значения р, отражающие уровни статистической значимости различий по сравнению с группой интактных животных, крыс без терапии и группой животных, получавших физраствор, соответственно.

0,80 т

I

6

+' 0,70 -Í ¡ I 0,60 1

5 0,50 -i

6

i 0,40 -I

0

с;

1 0,30

а. «

Í 0,20

6 0,10

ШБАС

□ КрСБЬ

0,30

Результатом торможения нейтрофилоцитарного компонента воспаления явилось отчетливое снижение локальной и системной активности протеолитических ферментов и возрастание активности ингибиторов протеиназ: у животных, получавших комбинацию сурфактант-амикацин, происходило выраженное снижение ATA (/><0,01, в сравнении с группой «физраствор») и нарастание активности КСИ и ЭПА (/><0,001) в сыворотке, тогда как в БАС определялось значительное увеличение активности КСИ (р<0,05), снижение ЭПА (/><0,001), а также тенденция к росту ATA и снижению ТПА (рисунок 3). В отличие от группы сочетанного воздействия, в группах изолированной терапии сурфактантом и амикацином отсутствовало статистически значимое снижение ATA в сыворотке крови и существенное увеличение уровня КСИ в БАС. Кроме того, по данным сравнения с группой монотерапии антибиотиком, группа комбинированной сурфакгант-антибактериальной терапии характеризовалась существенно меньшей ATA (/><0,05) и большим уровнем КСИ (/><0,001) в сыворотке крови.

45 1 40 i-35 i

£

uT 30 . s: [ I

5 25

ac

< 20 <

15 | 10 i 5

0 ■

♦ 35,6

44,71

46,00

♦ 34,97

27,73

к

D,

к

A

3,39

□ ATA ■ КСИ ♦ ТПА ЭПА

33,53

■

£

25 •

I

20 I

15 S

С

инфицированные/ иифицированнь.*/ инфицированные/ инфицированные/ инфицированные/ 6« терапии фи*рвствор сурфвктвнг вмиквцин сурфвктвнт-вмиквцин

Рисунок 3 - Показатели активности протеиназ и их ингибиторов в БАС у инфицированных крыс, М±т.

В целом при экспериментальном остром воспалении легких, вызванном инокуляцией P. aeruginosa, среди всех испытанных вариантов терапевтического воздействия комбинированная сурфактант-антибактериальная терапия характеризовалась наиболее благоприятными изменениями лейкоцитарного ответа и профиля протеиназ-ингибиторной системы, а именно: генерализованным и локальным торможением гнойного (нейтрофилоцитарного) компонента, снижением локальной и системной протеолитической активности и возрастанием активности ингибиторов протеиназ.

Согласно результатам патоморфологической оценки, комбинированная терапия сурфактантом и антибиотиком характеризовалась значительным уменьшением признаков нарушения микроциркуляции по показателям перибронхиального (р<0,01, в сравнении с группой «физраствор») и периваскулярного отека (р<0,01) при полном отсутствии геморрагического компонента. Одновременно наблюдалась меньшая выраженность слущивания бронхиального эпителия (р<0,01). Важной особенностью этой группы животных было статистически значимое (в отличие от групп изолированной терапии сурфактантом и антибиотиком) уменьшение всех проявлений гнойного воспаления, включая присутствие гнойного материала в бронхах (р<0,001), деструкцию бронхиальной стенки (р<0,001), перибронхиальную инфильтрацию нейтрофилами (¿<0,01), накопление нейтрофилов в респираторной ткани (р<0,001) и образование микроабсцессов (/к0,05). При этом не наблюдались бактериальные кластеры и признаки гнойного васкулита. Вместе с тем определялось существенное усиление макрофагальной реакции по показателям накопления макрофагов в респираторной ткани (р<0,01) и в экссудате (р<0,001), а также очаговые склеротические изменения в виде осумкования микроабсцессов.

По сравнению с изолированным применением амикацина, сочетанное воздействие сурфактантом и антибиотиком характеризовалось значительно меньшей интенсивностью гнойного воспаления (гнойно-некротической деструкции

бронхиальных стенок, р<0,05; аккумуляции нейтрофилов в респираторной ткани, /?<0,05; накопления серозного экссудата в просвете альвеол, /?<0,01), отсутствием бактериальных кластеров (р<0,05) и большей выраженностью накопления макрофагов в респираторной ткани (р>0,05) и в экссудате (р<0,05).

Уменьшение интенсивности и модификация воспалительных изменений в респираторной ткани могут быть связаны с повышением эффективности антибактериальной терапии вследствие опосредованной сурфактантом улучшенной доставки амикацина в респираторный отдел легких, что обеспечивало более эффективное в сравнении с монотерапией антибиотиком снижение бактериального обсеменения легких и, как следствие, уменьшение мобилизации нейтрофильных гранулоцитов в кровоток и миграции их в очаг воспаления, а также сопряженное с этим более выраженное уменьшение локальной и системной активности протеолитических ферментов.

У животных с пневмонией, получавших комбинацию антибиотика с сурфактантом или чистый амикацин, не наблюдалось существенных изменений в показателях оксигенации артериальной крови по сравнению с интактными животными (таблица 5). Статистически значимое умеренное снижение БаОг (р<0,05) было выявлено у инфицированных крыс, которым вводили чистый сурфактант или физиологический раствор.

Таблица 5

Показатели оксигенации артериальной крови у интактных

Характер воздействия, срок забоя Сатурация гемоглобина кислородом (8а02), % ± т (п) Парциальное давление кислорода (Ра02), мм рт. ст., М±т(п) Концентрация кислорода (сЮг), мл/дл, М± т (п)

Интактные, 0 ч 99,12 ±0,13 (6) 135,50 ±8,49 (6) 16,57 ± 1,18 (6)

Физраствор, 24 ч 98,10 ±0,38 (11)* 122,45 ± 10,46 (П) 17,10 ±0,96 (11)

Сурфактант, 24 ч 97,98 ±0,51 (11)* 127,91 ±6,31 (И) 16,11 ±1,09 (П)

Амикацин, 24 ч 97,91 ±0.62 (И) 123,64 ± 10,42 (П) 15,74 ± 1,19 (И)

Сурфактант + амикацин, 24 ч 98,72 ± 0,29 (11) 146,27 ±6,90 (П) 16,80 ±0,90 (Н)

Примечание: * указывает на наличие статистически существенных различий в сравнении с группой интактных крыс.

Важной особенностью сочетанной сурфактант-антибактериальной терапии явилась способность корректировать нарушения функции сурфактантной системы. В отличие от монотерапии антибиотиком, эндотрахеальное введение экспериментальной комбинации сдерживало угнетение поверхностной активности БАС (рисунок 4): у животных, получавших смесь препаратов, индекс стабильности был выше (0,88 ± 0,05 (11), /КО,05), а разница диаметра пузырьков - меньше (2,52 ±

0,33 (220), /><0,001), чем у крыс, которым в трахею вводили чистый амикацин (0,61 ± 0,10 (11) и 7,09 ± 0,52 (220), соответственно).

г

ж

г

Е 6

Й , а га х ч

га

3"2

Разница диаметра пузырьков

- Индекс стабильности

:: I

''Щй! ш

л

1,2

Е

+1

0,8 5 X

I

0,6 |

ю га

ь

0,4 |

икпктныа «рисы нн+нчнрочк«».»/ инфацироаины!/ ин+кЧ»1>о«""!<»«/ «нфащдоиюы«/

6« тараним *параст»ор сурфактамт «микац-ч СУРфаКТ#НТ-

амичацни

Рисунок 4 - Поверхностно-активные свойства проб БАС у интактных и инфицированных животных.

Это преимущество сочетанного воздействия может быть связано, во-первых, с улучшенной доставкой антибиотика в очаг воспаления и, следовательно, ограничением инфекционно-воспалительных механизмов, ведущих к дисфункции системы эндогенного сурфактанта, во-вторых, с заместительными эффектами сурфактантной терапии, и, в-третьих, с поддержанием секреторной способности альвеолоцитов II типа на уровне, соответствующем таковому у интактных крыс.

О поддержании секреторной активности альвеолоцитов у животных с пневмонией, получавших комбинацию сурфактанта с антибиотиком, на уровне, свойственном здоровым крысам, свидетельствует тот факт, что животные из группы комбинированного воздействия существенно не отличались от интактных крыс по показателю заполнения секреторных вакуолей альвеолоцитов II типа сурфактант-содержащим осмиофильным материалом пластинчатых телец (0,437 ± 0,018 (63) и 0,448 ± 0,014 (102), соответственно, р>0,05), а также не уступали им по данным оценки поверхностно-активных свойств БАС (см. выше).

Описанные результаты в совокупности служат подтверждением эффективности и преимуществ сочетанной сурфактант-антибактериальной терапии в сравнении с изолированным эндотрахеальным введением антибиотика или сурфактанта при лечении острого воспаления в легких.

Полученные данные могут послужить основой для дальнейшего внедрения комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии в клиническую практику с целью лечения острой пневмонии и других видов госпитальной инфекции, протекающих с повреждением органов дыхания, а также для изучения сурфактанта в качестве средства, повышающего эффективность применения других лекарственных препаратов при введении их в дыхательные пути.

ВЫВОДЫ

1. Добавление к эмульсии сурфактанта терапевтических концентраций амикацина и цефепима не приводит к снижению поверхностной активности первого in vitro, тогда как добавление к сурфактанту терапевтической дозы колистиметата натрия сопровождается значительным снижением поверхностной активности обоих препаратов, что свидетельствует об их фармакологической несовместимости при смешивании в одном объеме.

2. Добавление эмульсии сурфактанта к амикацину не изменяет показатели высокой противомикробной активности последнего in vitro, тогда как смешивание сурфактанта с цефепимом и колистиметатом натрия проявляется в тенденции, соответственно, к ослаблению бактерицидной и увеличению бактериостатической активности по отношению к культурам S. aureus и P. aeruginosa.

3. Исследованиями in vitro установлено, что наиболее перспективной для испытаний при экспериментальной синегнойной инфекции легких является комбинация экзогенного сурфактанта (препарат Сузакрин) с амикацином (антибиотик из группы аминогликозидов).

4. У крыс с острой пневмонией, вызванной P. aeruginosa, интратрахеальная инсталляция смеси сурфактант-амикацин приводит к значительному снижению бактериальной контаминации дыхательных путей (в 1,94 раза; /?<0,001) и ограничению развития бактериемии (экстенсивность обсеменения на 31% ниже, чем в группе «физраствор»). Комбинация сурфактант-амикацин характеризуется большей выраженностью этих эффектов по сравнению с чистым амикацином.

5. Комбинированная терапия сурфактантом и амикацином сдерживает подавление поверхностной активности БАС у инфицированных крыс, тогда как интратрахеальное введение чистого амикацина усиливает угнетение показателей поверхностной активности.

6. При экспериментальном остром воспалении легких комбинированная сурфактант-антибактериальная терапия характеризуется более благоприятными лейкоцитарным ответом и профилем протеиназ-ингибиторной системы, чем терапия чистым амикацином и чистым сурфактантом. Это проявляется в локальном и генерализованном уменьшении нейтрофилоцитарного (гнойного) компонента воспаления (р<0,001 в сравнении с группой «физраствор»), снижении локальной и системной протеолитической активности (уменьшение ЭПА на 45% (р<0,001) в БАС и снижение ATA на 33% (р<0,01) в сыворотке) и возрастании активности ингибиторов протеиназ (увеличение активности КСИ на 50% (р<0,05) в БАС и на 115% (/КО,001) в сыворотке).

7. Сочетанное интратрахеальное введение сурфактанта и амикацина не оказывает существенного влияния на оксигенацию артериальной крови, но обеспечивает значительное торможение тканевых проявлений гнойной пневмонии и обладает морфологическими преимуществами по сравнению с раздельным применением этих препаратов.

8. Отсутствие отрицательного взаимодействия между экзогенным сурфактантом и амикацином, а также преимущества комбинированной терапии сурфактантом и амикацином по сравнению с монотерапией этими препаратами при лечении экспериментальной бактериальной пневмонии свидетельствуют о целесообразности использования экзогенного легочного сурфактанта в качестве средства, способного повышать эффективность данного антибиотика при введении в дыхательные пути для лечения воспалительных процессов в легких.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Биркун, А. А. 3-й. Влияние антибиотиков, активных в отношении полирезистентных возбудителей госпитальной пневмонии, на поверхностную активность экзогенного сурфактанта / А. А. Биркун 3-й // Патолопя. - 2011. - Т. 8, № 1. - С. 13-16.

2. Birkun, A. A. III. Efficacy of combined surfactant-amikacin therapy in experimental pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa / A. A. Birkun III, Y. L. Krivorutchenko, O. N. Postnikova et al. // Proceedings of the Drug Delivery to the Lungs 23 Conference; 2012 Dec 5-7; Edinburgh, Scotland. - 2012. - P. 330-332. *3. Биркун, A. A. 3-й. Оценка влияния экзогенного сурфактанта на антибактериальные свойства препаратов, активных в отношении полирезистентных возбудителей госпитальной пневмонии / А. А. Биркун 3-й, Ю. Л. Криворутченко, О. Н. Постникова и др. // Украшський бюфармацевтичний журнал. - 2012. - № 1-2. - С. 96-102.

4. Биркун, А. А. 3-й. О взаимном влиянии препаратов сурфактанта свиньи и колистиметата натрия / А. А. Биркун 3-й // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2012. - № 5-6. - С. 20-23.

5. Birkun, A. A. Surfactant-enforced treatment of Pseudomonas-induced pneumonia / A. A. Birkun // European Respiratory Journal. - 2013. - Vol. 42 (Suppl 57). - P734.

6. Birkun, A. A. III. Efficacy of combined surfactant-amikacin therapy in experimental pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa / A. A. Birkun III, Y. L. Krivorutchenko, O. N. Postnikova et al. // Abstracts from The Aerosol Society Drug Delivery to the Lungs 23 Edinburgh International Conference Centre Edinburgh, Scotland, UK December 5-7, 2012. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. - 2013. - Vol. 26. - P. A-5.

*7. Биркун, А. А. Микробиологическая и физико-химическая оценка эффективности комбинированной терапии препаратом экзогенного сурфактанта и амикацином при экспериментальной пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa / А. А. Биркун, Ю. JI. Криворутченко, О. Н. Постникова и др. // Експериментальна i юпшчна медицина.- 2013. -№ 1 (58). - С. 71-77.

8. Биркун, А. А. Оценка влияния комбинированной сурфактант-антибактериальной терапии на патогенез пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa / А. А. Биркун, А. В. Кубышкин // Вестник КазНМУ. - 2013. - № 5 (1). - С. 58-63.

9. Birkun, A. A. Exogenous pulmonary surfactant as a vehicle for antimicrobials: assessment of surfactant-antibacterial interactions in vitro / A. A. Birkun // Scientifica. - 2014. - Vol. 2014. Article ID 930318, 6 pages. doi:10.1155/2014/930318.

10. Birkun, A. A. Exogenous surfactant as a tool for antibiotic delivery: a potential way to improve therapy of pulmonary' infections / A. A. Birkun, A. V. Kubyshkin, V. V. Sherbak // Abstracts of the 7th International Congress of Pathophysiology; Faculty of Sciences, University Mohammed V, Rabat, Morocco; September 4-7, 2014. -2014.-P. 82.

* - работа опубликована в журнале, включенном в Перечень рецензируемых научных журналов Украины, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание учёной степени доктора и кандидата наук, и приравнена к работам в журналах, включенных в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук (Положение об особенностях присуждения ученых степеней и присвоения ученых званий лицам, признанным гражданами Российской Федерации в связи с принятием в Российскую Федерацию Республики Крым и образованием в составе Российской Федерации новых субъектов - республики Крым и

города федерального значения Севастополя, утверждённое постановлением Правительства Российской Федерации от 30.07.2014 г. №723).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

сЮ2 - концентрация кислорода в артериальной крови

М - среднее значение

ш - стандартная ошибка среднего

п - количество наблюдений

Р - уровень значимости различий

Ра02 - парциальное давление кислорода в артериальной крови

5а02 - сатурация гемоглобина кислородом в артериальной крови

АТА - антитриптическая активность

БАС - бронхоальвеолярный смыв

ГП - госпитальная пневмония

ИС — индекс стабильности

КСИ - кислотостабильные ингибиторы

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ТПА - трипсиноподобная активность

ЭПА — эластазоподобная активность

Биркун Алексеи Алексеевич

Патогенетическое обоснование применения сурфактант-антибактериальной терапии при лечении воспалительных процессов в легких

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук. Подписано в печать 25.03.2015 г. Бумага офсетная. Печать офсетная. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 57. Тираж 100 экз. Отпечатано ООО «Эльиньо» г. Симферополь, бульвар Ленина, 5,7.