Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование применения биоактивных наноматериалов при раневом процессе (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

4848408

ВЕНГЕРОВИЧ Николай Григорьевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ БИОАКТИВНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ ПРИ РАНЕВОМ ПРОЦЕССЕ

(экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2011

2 ИЮН 2011

4848408

Работа выполнена в ФГОВОУ В ПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Попов Владислав Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Митрейкин Владимир Филиппович доктор медицинских наук профессор Николаев Валентин Иванович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская госз'дарсгвенная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 14 июня 2011 года в часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.03 при ФГУВОУ «Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова» МО РФ по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6. ^

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОВОУ ВПО «Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова»

Автореферат разослан « {? » мая 2011 г.

« С

Учёный секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Дергунов Анатолий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Лечение ран остаётся одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой, гнойной хирургии и ком бустиологни. Общее число пострадавших и больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями от общего числа больных хирургического профиля составляет 30-35% (Лещенко И.Г., 2003). Наиболее часто такие процессы наблюдаются при механической травме, в том числе при огнестрельных ранениях, вызванных снарядами с высокой кинетической энергией, а также при термической и электротравме (Попов В.А., 2003; Никитин С.Р., 2004). Данные виды патологии отличаются длительными сроками заживления ран, высокой частотой неблагоприятных исходов в виде генерализации патологического процесса, инвалиди-зации, стойкого ограничения трудоспособности (Толстых М.П., 2002).

Особое внимание обращает на себя постоянно наблюдающийся рост анти-биотикорезистентности микроорганизмов и увеличение частоты гнойно-септических осложнений раневого процесса (Парамонов Б.А., 2000). При этом ассортимент и доступность отечественных перевязочных средств, многокомпонентно воздействующих на раневой процесс, остаются недостаточными (Горюнов C.B., 2004).

В настоящее время в мировой литературе всё большее внимание уделяется перспективам развития нанотехнологий. Материалы, полученные с использованием нанотехнологий, могут найти и уже находят применение в различных областях научного знания, в том числе и медицине (Baishaw D.M., 2005). Поскольку вещество в виде ншючастиц обладает свойствами, часто радикально отличными от их аналогов в виде макроскопических дисперсий или сплошных фаз, наноматериалы представляют собой уникальный класс веществ, на основе которых возможно создание новых фармакологически активных препаратов (Пиотровский Л.Б., 2006).

Объектами нанотехнологий могут быть непосредственно низкоразмерные объекты - наноэлементы с характерными размерами как минимум по одному измерению (наночастицы, нанолорошки, нанотрубки, нановодокна, наноплён-ки), отдельные элементы устройств и систем. При этом под устройствами или системами, изготовленными с использованием нанотехнологий, понимаются такие, в которых даже один компонент является объектом нанотехнологий.

Наноматериалы - разновидность продукции в виде материалов, содержащих структурные элементы с нанометровыми размерами, наличие которых обеспечивает существенное улучшение или появление качественно новых механических, химических, физических, биологических и других свойств, связанных с проявлением наномасштабных факторов.

В литературе описано множество биологически активных эффектов различных нанопрепаратов: антибактериальный (Медведева С. А., 2002), иммуно-модулирующий (Меджидова С.А., 2002; LinY.L., 2000), антаоксидантный (ТолстыхМ П., 2000; Тюнин М.А., 2009) и другие.

При этом, как правило, большинство наноматериалов и нанобиокомпози-тов изучены недостаточно; не установлены, в частности, общие биологические

эффекты и возможная токсичность при их использовании на живых объектах, оптимальные концентрации и пр.

Отмеченные обстоятельства определяют необходимость комплексного исследования ряда наноматериалов и разработки нанобиокомпозитов, обладающих широким спектром биологической активности и возможностью оптимизировать, в частности, динамику раневого процесса.

Цель исследования: экспериментальное изучение сорбционных, антимикробных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и других свойств наноматериалов, обладающих биологической активностью, и разработка на их основе наноструктурных сорбирующих биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.

Задачи исследования:

1) разработать гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида и исследовать его сорбционную активность в сравнении с нано-гель-плёнкой целлюлозы Асе(оЬас1ег хуНпиш;

2) изучить антиоксидантную активность водных растворов кластера фул-лерен С<;о/Тшееп 80;

3) исследовать морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов и иммунологические показатели крови при парентеральном введении кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80;

4) исследовать антимикробную активность в лабораторных условиях и в эксперименте на гнойных ранах, а также биосовместимость ряда биоактивных наноматериалов в сравнении с известными антисептиками;

5) обосновать с патогенетических позиций применение комплекса лекарственных препаратов, включающего наноматериалы, и его иммобилизацию на раневых покрытиях;

6) на основе изученных наноматериалов разработать биоактивные раневые покрытия, способные оказывать комплексное оптимизирующее воздействие на раневой процесс, предупреждать его осложнённое течение, и изучить в эксперименте на животных их эффективность на модели гранулирующих ран при глубоких ожогах.

Научная новизна исследования. Разработан гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида, изучены его физико-химические, сорбционные свойства и биосовместимость. Разработана тканевая хлопчатобумажная основа, предотвращающая фрагментацию гидрогелевого абсорбента и позволяющая извлекать его из раны единым блоком.

Оптимизирован синтез целлюлозы АсеЮЬа^ег хуНпиш и изучена её сорб-ционная способность в различных средах. Установлено оптимальное время насыщения бактериальной целлюлозы лекарственными препаратами и определён срок перевязок при использовании её в качестве матрицы-основы для раневых покрытий,

В эксперименте на животных показана биосовместимость разработанного гидрогелевого сорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы.

Путём определения антирадикальной активности и супероксидпродуци-рующей активности тканевых макрофагов выявлены антиоксидантные свойства кластера фуллерен Сб</Гшееп 80.

При парентеральном введении кластера фуллерен СбоЛЧуееп 80 на фоне обширных глубоких ожогов установлена его иммуномодулирующая способность.

Исследование общерезорбгивных свойств кластера фуллерен Сбо/Тшееп 80 показало, что морфологические изменения в тканях внутренних органов при его внутрибрюшинном введении отсутствуют.

Определена антисептическая активность: неорганно-органических нано-биокомпозитов, содержащих металлы - серебро, золото, платину и железо, стабилизированных природным полисахаридом - арабиногалактаном; комплекса полившшлпирролидон-нано-Бе0; коллоидных растворов (нанокластеров) серебра, цинка и меди; а также разработанного при нашем участии модифицированного катапола. Установлено, что наиболее выраженными антисептическими свойствами по отношению ко ясем исследуемым референтным и контрольным штаммам микроорганизмов обладают аргентарабиногалактан и модифицированный катапол (определены их оптимальные антимикробные концентрации). Эффективность этих препаратов подтверждена в эксперименте на гнойных ранах.

Экспериментальным путём установлен наиболее эффективный химический состав разработанного модифицированного катапола (приоритетная справка на изобретение «Антисептический комплекс» - №2010109156 от 11.02.2010).

С патогенетических позиций определён комплекс лекарственных средств для абсорбции на раневых покрытиях, включающий наноматериалы, воздействующие на основные звенья патогенеза раневого процесса.

Разработаны биоактивные наноструктурные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антисептической, антиоксидантной, антиферментной активностью, способные оказывать комплексное воздействие на основные звенья патогенеза раневого процесса как в первой, так и во второй его фазах:

1) трёхслойное гидрогелевое раневое покрытие, наиболее эффективное при раневом процессе с выраженной экссудацией (патент на полезную модель № 73198, БИ № 14, 2008; патент на изобретение № 2372944, БИ № 32, 2009) и

2) раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки целлюлозы АсешЬайег ху-1тшп (приоритетная справка на изобретение «Раневое покрытие с лечебным действием» - № 2010133389 от 09.08.2010). Экспериментально установлена эффективность их местного применения при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Теоретическая и практическая ценность. Выявленная сорбционная активность и биосовместимость гидрогелевого абсорбента на основе акриловой кислоты и акриламида, а также перфорированных нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы позволяет рекомендовать их применение в качестве сорбентов при раневом процессе и в качестве матрицы-носителя биоактивных компонентов.

Исследование антирадикальной активности кластера фуллерен С«Д\уееп 30 и его влияния на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов показало целесообразность абсорбции данного кластера в качестве антиоксидантного препарата на раневых покрытиях.

При исследовании иммунологических показателей крови на фоне обширных глубоких ожогов после внутрибрюшинного введения кластера фуллерен СбоЯЧуееп 80 установлена его иммуномодулирующая активность, способствующая оптимизации раневого процесса.

При морфологических исследованиях внутренних органов после парентерального введения кластера фуллерен С6о/Т\уееп 80 выявлено отсутствие острой токсичности данного препарата.

Проведённые сравнительные исследования антимикробной активности ряда нанопрепаратов выявили целесообразность местного применения серебра, стабилизированного арабиногалактаном, и модифицированного катапола в качестве антисептических средств при раневом процессе на этапах медицинской эвакуации.

Разработаны первые отечественные наноструктурные биоактивные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антиоксидантной, антисептической и антиферментной активностью, местное применение которых оптимизирует раневой процесс, предотвращает его осложнённое течение и сокращает сроки заживления гнойных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов. Раневые покрытия могут быть рекомендованы для местного лечения неин-фицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных, огнестрельных, гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах, пролежней и трофических язв.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фулл ерен С«> в составе кластера с Т\уееп 80 проявляет антиоксидантную активность, максимально выраженную в водных растворах с содержанием фул-лерена С60 0,05-0,1%.

2. Парентеральное введение фуллерена Сбо в составе кластера с Т\уееп 80 не проявляет острой токсичности, а при внутрибрюшинном введении на фоне глубоких ожогов вызывает иммуномодулирующий эффект.

3. Раствор серебра, стабилизированный арабиногалактаном, и модифицированный катапол обладают выраженной антимикробной активностью в отношении основных госпитальных штаммов микроорганизмов в концентрациях 2,5% и 1,5% соответственно.

4. Биоактивные наноструктурные раневые покрытия на основе акриламид-ного гидрогеля и нано-гель-плёнок целлюлозы АсекЛэайег хуПпит с иммобилизованными в их составе кластером фуллерен Сво/Ту/ееп 80, обладающего анти-оксидантным и иммунотропными свойствами, антисептическим препаратом (диоксидин или серебро, стабилизированное арабиногалактаном, или модифицированный катапол), некролитическим (мочевина или террилитин), антиферментным и гемостатическим (е-аминокапроновая кислота) препаратами являются эффективным средством местного лечения инфицированных, гнойных ран

и гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах. Их применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран на 17,5%.

Реализация работы. По теме исследования опубликовано 28 печатных работ. Получен патент на полезную модель «Гидрогелевое покрытие для лечения ран» (№ 73198, БИ № 14, 2008), патент на изобретение: «Покрытие для лечения ран» (№ 2372944, БИ № 32, 2009), получены приоритетные справки по заявкам на изобретения: «Антисептический комплекс» (№2010109156 от 11.02.2010) и «Раневое покрытие с лечебным действием» (№2010133389 от 09.08.2010). Зарегистрировано 16 рационализаторских предложений. Результаты исследований внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской работе кафедры патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (ВМедА).

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования изложены в докладах на Итоговых конференциях Военно-научного общества курсантов и слушателей ВМедА 2008, 2009, 2010 (I место на конкурсе научных работ) годов, на научно-практической конференции в честь 71-летия со дня основания IV факультета ВМедА (2009), Международных научно-практических конференциях «XXXVIII и XXXIX недели науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Изобретатели и инновационная политика России» - I место в секции медицина и биология (Санкт-Петербург, 2010).

Результаты работы представлены в виде постерных докладов на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2007); Конференции Политехнического симпозиума «Молодые учёные - промышленности СевероЗападного региона» (Санкт-Петербург, 2007); 2-ом Санкт-Петербургском Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение» (Ташкент, 2008); Х1П Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции. (Промышленные инновации)» (Санкт-Петербург, 2008); Международных Салонах промышленной собственности -«Архимед 2009» (Серебряная медаль), «Архимед 2010»; X Московском Международном Салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2010).

Объём и структура работы. Материалы диссертационного исследования представлены на 151 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных лабораторных и экспериментальных исследований (3, 4 и 5 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 201 источник, из них 128 отечественных и 73 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Лабораторные исследования. В лабораторных условиях на базе кафедры синтетических каучуков и элемзнтоорганических соединений Санкт-Петербургского Технологического института разработан гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида со сшивающим агентом персульфатом аммония, изучена его сорбционная активность в сравнении с нано-гель-плёнками бактериальной целлюлозы.

Разработка тканевой основы для гидрогелевого раневого покрытия осуществлена на базе кафедры трикотажного производства Санкт-Петербургского государственного университета технологии и дизайна.

Оптимизация синтеза нано-гель -плёнки целлюлозы Acetobacter xylinum (НГП ЦАХ), исследование её сорбционных свойств, разработка раневого покрытия на основе бактериальной целлюлозы выполнены на базе Института высокомолекулярных соединений Российской академии наук (ИВС РАН) и кафедры микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета.

Микробиологические исследования. Сравнительная оценка антимикробной активности нано-антисептиков проведена на базе кафедры микробиологии ВМедА. Изучение антимикробной активности неорганно-органических нано-биокомпозитов, содержащих металлы: серебро (с установлением оптимальной концентрации), золото, платину и железо, стабилизированных арабиногалакта-ном, комплексов поливинилпирролидон-нано-Se0 и поливинилпирролидон-нано-Ag0, коллоидных растворов серебра, цинка и меди, а также кластера Сбо/поливинилпирролидон (ПВП) и водной дисперсии шунгитового углерода -проводили в соответствии с методикой «Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар» путём сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов определённых концентраций.

Исследование проводили на контрольных (референтных) штаммах микроорганизмов Enterobacteriaceae - Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp. - S. aureus, а для сравнительной оценки эффективности антимикробного действия различных концентраций аргентарабиногалактана - на ассоциации референтных штаммов микроорганизмов.

Чувствительность микроорганизмов к двум новым формам модифицированного катапола (с акриловой и метакриловой кислотами), разработанного при нашем участии в ИВС РАН, и препаратам, показавшим наилучшие результаты при исследовании на референтных штаммах (1% раствор диоксидина, 2,5% раствор аргентарабиногалактана, 2,5% раствор катапола), определяли, придерживаясь методики, изложенной в "Testing for antibacterial activity and efficacy on textile product". Исследование проведено на госпитальных штаммах, полученных из клиники военно-полевой хирургии (ВПХ) ВМедА: S. aureus, P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii (модифицированный каталол) и S. aureus, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и ассоциации из этих микроорганизмов (остальные препараты).

Биохимические исследован]«. Антиоксидантную активность водного раствора кластера фуллерен Сбо/Tween 80 исследовали на кафедрах патологической и нормальной физиологам совместно с Тюниным М.А. и Антоненко-войЕ.В. методом определения антирадикальной активности с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФГТГ) (Арутюнян A.B., 2002). Суперок-сидпродуцирующую способность тканевых макрофагов исследовали там же методом хемилюминесценции с помощью регистрации спонтанной хемилюми-несценции (XJIcn) клеток, определяя уровень продукции фагоцитами реактивных форм кислорода, прежде всего, супероксидного анион-радикала (СЬ*)- В эксперименте использовали альвеолярные и перитонеальные макрофаги. По интенсивности наработки Ог* оценивали степень активности клетки и её функциональный потенциал при применении препарата (таблица 1).

Иммунологические исследования. Условную норму отрабатывали на 10 белых крысах-самцах линии Wistar. После моделирования обширного глубокого ожога на спине 30 крыс (таблица 1), внутрибрюшинно 15 вводили 0,5 мл 0,05% раствора фуллерена Сео в составе мастера с Tvveen 80 (опыт), 15-0,5 мл 0,9% раствора NaCl. Кровь забирали путём декапитации на 3 и 8 сутки (8 и 7 животных из каждой группы соответственно). Иммунологические исследования проводили, руководствуясь «Методическими материалами по экспериментальному и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств» (1984). Для изучения клеточного звена иммунитета использовали реакцию торможения миграции лейкоцитов (PTMJI) с митогенами. В качестве последних применяли фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А). Состояние механизмов неспецифической защиты организма оценивали по показателям фагоцитоза, лизосомально-катионного теста (JIKT), теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Морфологические исследования. Морфологические методы использовали (совместно с Зайцевой О.Б. на кафедре патологической анатомии ВМедА) для определения морфофункциональ.ных изменений в тканях внутренних органов в следующих опытах: 1) исследование биосовместимости при местной аппликации на условно-асептических ранах гидрогелевого абсорбента и НГП ЦАХ, 2) влияние парентерального введения кластера фуллерен Cei/Tween 80, 3) влияние местной аппликации биоактивных наноструктурных раневых покрытий при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Для оценки общерезорбтивного действия кластера фуллерен Сбо/Tween 80 и гистоморфологических изменений при парентеральном введении (внутрибрюшинно 0,25 и 0,5 мл 0,05% раствора фуллерена С,)0) у всех животных на момент выведения из опыта производили забор тканей сердца, лёгких, печени, селезёнки, почек и тонкой кишки с брыжейкой.

Морфологический материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заключали в парафин, серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, азур П-эозином (для определения степени дифференцировки соединительной ткани), орсеином. Препараты изучали методом световой микроскопии.

Экспериментальные исследования. Общее количество животных, использованных в экспериментальной части работы, составило 216 крыс-самцов линии \Vistar массой 180-230 г, полученных из питомника РАМН «Раполово». Содержание экспериментов на животных представлено в таблице 1.

Таблица 1

Экспериментальные исследования, выполненные в работе

Цель исследования и характер оперативного вмешательства Количество животных

Влияние кластера Сб</Г\уееп 80 на супероксиданионпродуци-рующую активность тканевых макрофагов 20 крыс

Определение биосовместимости разработанного гидрогеле-вош акриламидного абсорбента и НГП ЦАХ 22 крысы

Морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов при парентеральном (внутрибрюшинном) введении кластера C6o/TweeIl 80 30 крыс

Определение иммуномодулирующей активности кластера Сбо/Тшеел 80 при моделировании обширных глубоких ожогов 40 крыс

Определение эффективности аргентарабиногалактана и модифицированного катапола в эксперименте на гнойных ранах 24 крысы

Исследование эффективности биоактивных раневых покрытий на основе: - гидрогелевого абсорбента; - целлюлозы Асе1оЬас1ег хуНпиш 40 крыс 40 крыс

Эксперименты на крысах выполняли под эфирным наркозом (полуоткрытый контур). Крыс выводили из опыта путём декапитации или передозировкой эфирного наркоза. После операций животные находились под динамическим наблюдением в условиях вивария. Содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных» (1980) и с приказом МО РФ от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Результаты экспериментов оценивали по клиническому течению послеоперационного периода (активность, поведение, отношение к пище, мочеотделение, состояние послеоперационной раны).

Глубокие ожоги у животных моделировали с помощью специального устройства. В качестве обжигающей поверхности использовали медные пластины размерами 1x1 см и 2x2 см с температурой нагрева 180°С. Ожог наносили контактным способом в течение 15 секунд.

Для проверки биосовместимости гидрогелевый абсорбент и НГП ЦАХ были применены в эксперименте на модели кожно-плоскостных условно асептических ран на спине крыс. Одну рану покрывали акриламидным гидрогелем, а другую - НГП ЦАХ, Перевязки с повторной аппликацией сорбентов выполняли

через день. Критериями эффективности служили скорость заживления и гисто-морфологическая картина ран на 7-е сутки.

Определение эффективности антимикробной активности 1,5% раствора модифицированного катапола и 2,5% раствора аргентарабиногалактана, предварительно сорбированных НГП ЦАХ, определяли при раневом процессе, придерживаясь «Методики полуколичественного определения микробной обсеме-нённостыо жидких клинических материалов» (Добрынин В.М., 1999).

Гнойную рану моделировали путём нанесения на спине крыс под эфирным наркозом двух ожогов площадью 1 см2 каждый. Через двое суток под наркозом выполняли некрэктомию ожогового струпа Обе раны заражали путём нанесения на их поверхность суспензии госпитального штамма S. aureus, выделенного из ран пострадавших и больных, находившихся на лечении в клинике ВПХ ВМедА. Материалом микробиологического исследования являлся гной, выделяющийся из раны. После забора материала производили аппликацию на раны НГП ЦАХ с предварительно сорбированными исследуемыми антисептиками. Критерием эффективности применения исследуемых антисептиков являлось снижение показателя ориентировочной микробной обсеменённости ран.

Исследование эффективности разработанных наноструктурных биоактивных раневых покрытий при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов выполнено на 80 крысах. Через сутки после моделирования ожога под эфирным наркозом выполняли некрэктомию ожогового струпа и аппликацию раневых покрытий с фиксацией их тканевым лейкопластырем «Микропор». Перевязки выполняли через день. Критериями эффективности служили скорость заживления ран, сроки полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 7,10, 14 и 20-е сутки. Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом (Попова Л.Н., 1990).

Методы статистической обработки данных. Все количественные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке (Юнкеров В.И., 2002). Статистическую значимость различий в сравниваемых выборках оценивали при помощи t-критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при р<0,05 (Автадинов Г.Г., 1990).

Накопление базы данных и её информационно-аналитическую переработку, вычислительные операции и графическое изображение результатов исследований осуществляли на компьютере с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2010 для Windows 7.

Результаты проведённых исследований

При местном лечении ран необходимо решить следующие задачи: подавление инфекции в ране (антисептики), нормализация местного гомеостаза (антиоксидантные и антиферментные препараты, поддержание нейтрального рН), активация отторжения некротических тканей (некролитические препараты), сорбция продуктов микробного и тканевого распада (дренирующие сорбенты). Комбинация средств подобной направленности и применение их в комплексе с использованием новых наноструктурных материалов и лекарственных препаратов, по нашему мнению, может способствовать синергетическому эф-

фекту, потенцированию лечебного воздействия и, как следствие, оптимизации раневого процесса, предупреждению его возможных осложнений и сокращению сроков заживления ран.

1. Разработка абсорбирующих матриц для наноструктурных биоактивных раневых покрытий

При разработке раневых покрытий важной задачей является возможность абсорбции ими биоактивных компонентов. ГГо опубликованным данным и нашим наблюдениям, наиболее эффективными: вульнеросорбентами являются гидрогелевые и гидроколлоидные материалы.

При разработке гидрогелевого абсорбента на основе акриловой кислоты и акриламида со сшивающим агентом персульфатом аммония был получен супервлагоабсорбент. Дня нейтрализации местного тканевого ацидоза в гидро-гелевый абсорбент вводили раствор бикарбоната натрия, позволяющего поддерживать показатель рН в пределах '7,0-7,5.

Сорбционная способность гидрогелевого акриламидного абсорбента была исследована в различных средах, одновременно проведена сравнительная её оценка со сходным по химической структуре гидрогелем «Апполо» и дренирующим сорбентом «Диовином». Разработанный гидрогелевый абсорбент отличается эластичностью в связи с его фиксацией на тканевой основе и влагосо-держанием 75%. Установлено, что гидрогелевый акриламвдный абсорбент обладает более высокой сорбционной активностью в биологических средах по сравнению с гидрогелем «Апполо» и «Диовином», что может позволить в течение длительного времени осуществлять сорбцию раневого отделяемого, предупредить его застой в полости раны и возможное последующее нагноение.

При применении акриламвдного абсорбента в эксперименте на модели кожно-плоскостных условно асептических ран на спине крыс клинически воспалительно-дегенеративных явлений в ране в послеоперационном периоде не отмечено. Исследуемый сорбент активно впитывал раневое отделяемое, не фрагментировался. По данным гистоморфологических исследований, на 7-е сутки выявлена классическая картина неосложнённого регенеративного процесса, что позволило сделать вывод о биосовместимости и биоинертности гидрогелевого акриламидного абсорбента.

Для установления времени насыщения НГП ЦАХ лекарственными препаратами и оценки сорбционной способности, кинетика сорбции отжатых гель-плёнок была определна во времени по массе в различных средах: растворах лекарственных препаратов - 1% раствор мочевины, 1% раствор диоксидина, 2,5% раствор аргентарабиногалактана; биологических средах - плевральный экссудат, желчь, свежезаготовленная донорская кровь, раствор аминокислот («Ами-ноплазмаль Е»); других средах - дистиллированная вода, физиологический раствор. Анализ полученных результатов позволип установить, что для достижения максимальной концентрации сорбированного НГП лекарственного препарата экспозиция дегидратированной гель-плёнки должна составлять 24 часа, т.к. в течение этого времени образец плёнки, сорбирующей воду, имеет массу 2,50±0,11 г, которая далее практически не меняется, а масса лекарственных

препаратов через 24 часа составляет 2,25±0,22 г. При этом основное количество препаратов сорбируется в первые 120 минут. Таким образом, наиболее оптимальным временем для насыщения НГП бактериальной целлюлозы лекарственным препаратом составляет 120 минут. Оставшаяся сорбционная ёмкость при аппликации НГП на раны обеспечивает сорбцию раневого отделяемого. Установлено, что масса биологических сред через 24 часа от начала сорбции составила 2,24±0,26 г н далее оставалась на этом уровне. Таким образом, патологическое отделяемое из раны может максимально сорбироваться НГП ЦАХ на протяжении суток, что определяет сроки перевязок. При применении НГП ЦАХ в эксперименте на модели кожно-плоскостных условно асептических ран на спине крыс клинически и морфологически выявлена картина, аналогичная таковой при применении акрил-амидного гидрогеля, что позволило сделать вывод о биосовместимости и биоинертности плёнок бактериальной целлюлозы.

Сравнительная оценка сорбцнонной способности акриламидного гидроге-левого абсорбента, на основе акриловой кислоты и акриламида со сшивающим агентом персульфатом аммония и дегидратированной НГП ЦАХ проведена в различных биологических средах (таблица 2).

Таблица 2

Сравнительная оценка сорбционной способности акриламидного абсорбента и дегидратированной НГП ЦАХ (г/г; Х±о)

Абсорбируемые вещества Вид сорбента

Акриламидный гидрогелевый абсорбент Дегидратированная НГП ЦАХ

Дистиллированная вода 319,8±4,04 76,50±2,18

Физиологический раствор 89,4±2,92 56,8±2,59

Раствор аминокислот 39,7±3,27 69,6±3,51 г/г

Плевральный экссудат 40,5±2,74 68,0±2,2 г/г

Установлено, что гидрогелевый акриламидный абсорбент обладает меньшей сорбционной способностью в биологических средах в сравнении с дегидратированной ЦАХ. Это преимущество является относительным, т.к. на ранах нецелесообразно применять сухие плёнки ЦАХ, не содержащие лекарственные препараты. В связи с этим нами проведена сравнительная оценка гидрогелевого акриламидного абсорбента и НГП ЦАХ, содержащей дистиллированную воду после 120 минут экспозиции, что может соответствовать содержанию в ней лекарственных препаратов.

Анализ результатов выполненной работы позволил установить, что в качестве несущей сорбирующей матрицы для биоактивных раневых покрытий на обильно экссудатирующих ранах целесообразно применять гидрогелевый акриламидный абсорбент. На ранах с умеренно выраженной экссудацией можно рекомендовать раневое покрытие на основе НГП ЦАХ, учитывая возмож-

ность более лёгкой абсорбцией на ней необходимых лекарственных препаратов и их последующей десорбции в рану.

2. Биоактивные свойства кластера фуллерена

Антиоксидантная активность. Наиболее изученными в отношении антиок-сидантных свойств являются химически модифицированные производные фуллерена и его коллоидные растворы, например, кластер фуллерена СыуТГВП (Тюнин М.А., 2009). В то же время, использование ПВП в лекарственных композициях нежелательно (Кио Т.Т., 1997). В связи с этим для установления возможности местного применения при раневом процессе нами исследована антиоксидантная активность кластера фуллерен С6о/Т\уееп 80.

С целью определения антирадикальной активности были исследованы водные растворы кластера фуллерен Сбо/Т\\'ееп 80 с 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04% и 0,05% концентрацией фуллерена С(>0 в сравнении с аналогичными концентрациями кластера фуллерен Сзд/ПВП. В ходе эксперимента (по показателю оптической плотности оценивали уровень радикалов) было установлено, что оба кластера фуллерена Сбо обладают антиоксидантной активностью, возрастающей пропорционально увеличению их концентрации в растворе (таблица 3). При этом было показано, что антирадикальная активность значительно выше у кластера фуллерен СбоЯЧуееп 80 в сравнении с С(,о/ПВП и контролем.

Таблица 3

Антирадикальная активность кластеров фуллерена С.60 с Tween 80 и ПВП

Фуллере-новый кластер Антирадикальная активность (Х±о), выраженная в оптической плотности растворов в зависимости от концентрации фуллерена Ceo Контроль (вода)

0,01% 0,02% 0,03% 0,04% 0,05% 0,550 ±0,05

C6(/Tween 80 0,416 +0,013* 0,343 ±0,017* 0,189 ±0,03 Г* 0,074 ±0,016** 0,043 ±0,005**

С6о/ПВП 0,493 ±0,038 . 0,467 ±0,016* 0,396 ±0,019* 0,192 ** ±0,030 0,107 ** ±0,012

Примечание: - различия с показателем соответствующего раствора достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем; - различия с показателем соответствующего раствора достоверны при р<0,005 по сравнению с контролем.

Следующим этапом исследования антиоксидантных свойств кластера фуллерен Сво/Тшееп 80 стало изучение его влияния на супероксидпродуцирующую активность тканевых макрофагов. Нами исследовано влияние водных растворов кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80 с содержанием С» в концентрации 0,02%, 0,05%, 0,1%. Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы, показатели спонтанной хемилюминесценции в присутствии кластера фуллерен С6(/Г\¥ееп 80 были ниже, по сравнению с контролем (100%), что свидетельствует об уменьшении уровня супероксида в среде макрофагов.

Таблица 4

Влияние кластера фуллерена С60/Т\уееп 80 на спонтанную хемилюминесценцию (ХЛсп) перитонеальных макрофагов (Х±а)

Концентрация фуллерена в составе кластера Сво/Тшееп 80 ХЛСП перитонеальных макрофагов Б (% от контроля) ХЛСП альвеолярных макрофагов Б (% от контроля)

0,1% 26,44±1,92* 58,36±4,34*

0,05% 29,11^2,27* 62,48±3,71 *

0,02% 88,50±6,45 65,30±3,50

и—-щ--,-,-.---

Примечание: - различия с показателем соответствующего раствора достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, изучение ангирадикальной активности с использованием ДФПГ и влияния на супероксидпродуцирующую активность тканевых макрофагов кластера фуллерен Сда/Тшееп 80 показало, что кластер фуллерен Сбо/Т\уееп 80 проявляет антиоксидантную активность. Антирадикальная активность растворов фуллерена С60/Тшееп 80 с содержанием фуллерена Сбо0,01-0,05% возрастает пропорционально увеличению его концентрации. В результате исследования влияния кластера фуллерен Сс,о/Т\уееп 80 на супероксидпродуцирующую активность тканевых макрофагов установлено, что он обладает антирадикальной активностью, снижая уровень продукции супероксида макрофагами. При этом выраженность супероксиддисмутирующего действия препарата имеет дозозависимый характер и в наибольшей мере проявляется при использовании растворов с содержанием фуллерена С6о 0,05 и 0,1%.

Иммунологические сдвиги в организме животных с глубокими ожогами при парентеральном введении кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80. В опубликованных работах описаны иммунологические свойства фуллерена Сбо, проявляющего некоторую иммунотропную активность. Однако, экспериментальных данных, подтверждающих это свойство, в литературе не найдено. Данные обстоятельство определило необходимость изучения иммунологических показателей при моделировании обширных глубоких ожогов после внутрибрюшин-ного введения кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80, В эксперименте на животных нами были определены нормальные показатели иммунитета (условная норма): РТМЛ с митогенами - клеточное звено иммунитета, показатели фагоцитоза (фагоцитарный показатель - ФП, фагоцитарное число - ФЧ, показатель завершенности фагоцитоза - ПЗФ), ЖТ, НСТ-тест, - отражающие состояние неспецифической защиты организма (таблица 5). При моделировании глубоких обширных термических ожогов на спине крыс определяли аналогичные показатели на третьи и восьмые сутки.

Установлено, что ожог у крыс сопровождался достоверными изменениями в показателях иммунной системы животных (таблица 5). При этом отмечены признаки развития вторичного иммунодефицита, заключающиеся в снижении фагоцитарной активности нейтрофилов, снижении функциональной активности

Т-лимфоцитов, повышении активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов, что характерно для термических ожогов.

Иммунотропное действие кластера фуллерен СбоЯлуееп 80 исследовали на третьи и восьмые сутки после обширного термического ожога у животных, которым сразу после моделирования ожога внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,05% раствора фуллерена в составе кластера с Tween 80). Контролем служили крысы с термическим ожогом, получавшие эквивалентный объём физиологического раствора. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние кластера фуллерен С6о/Т\уееп 80 на иммунологические показатели у крыс при моделировании обширного глубокого термического ожога (Х±а)

Показатель Группа животных

Условная норма Термический ожог (контроль) Термический ожог при введении С«/Г\уееп 80 (3 сутки)

РТМЛ с КонА, % 76,80±15,80 106,67±10,21 85,00±10,86*

РТМЛ с ФГА, % 74,60±12,62 95,75±13,24 82,0±7,58*

ФП,% 80,80±8,07 42,50±6,45 62,20±3,42*

ФЧ 9,67±3,15 13,63±3,87 10,60±2,37

ПЗФ, % 26,20±3,49 31,45±1,73 31,52±6,43

ЛКТ, усл.ед. 0,156±0,05 0,265±0,03 0,20±0,04*

НСТ-тест 0,85±0,09 0,б6±0,0б 0,69±0,04

Примечание: - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем.

Установлено, что парентеральное однократное введение в ранний срок при термическом ожоге у крыс кластера фуллерен СвоЛЧуееп 80 оказывает выраженное иммунотропное действие, вследствие чего изученные иммунологические показатели приближались к значениям, характерным для интактных животных. Иммунологические показатели бьши исследованы также на 8-е сутки, но в связи с однократным введением кластера фуллерен Сда/Т\уееп 80 оказались не достоверными. Результаты проведённых исследований являются дополнительным основанием целесообразности применения фуллеренов при раневом процессе в составе комплексной патогенетически обоснованной терапии.

Морфофункциональные изменения во внутренних органах животных при внутрибрюшинном введении кластера фуллерен СеоПЧуееп 80. Исследование общерезорбтивных (общетоксических) свойств различных водорастворимых форм фуллерена С«> является важной задачей в изучении их влияния на биологические системы.

Общерезорбтивные свойства кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80 были определены с помощью гистоморфологического исследования тканей после внутри-

брюшинного введения 0,25 и 0,5 мл 10% раствора, что соответствовало 0,05% содержанию фуллерена Сбо в сравнении с 10% раствором Tween 80. Животные были разделены на 4 группы: внутрибрюшинное введение 0,25 и 0,5 мл 10% раствора кластера фуллерен Ceo/Tween 80 (опыт), а также 0,25 и 0,5 мл 10% раствора Tween 80 (контроль).

При вскрытии большинства животных опытных и контрольных групп на 4-е и 9-е сутки отличий в макроскопической картине внутренних органов не обнаружено. Относительная масса органов во всех группах достоверных различий не имела.

Внутрибрюшинное введение 10% растворов кластера фуллерен С 6( Л'we en 80 и Tween 80 вызывало схожие изменения в тканях внутренних органов, которые характеризовались формированием незначительных дистрофических явлений, редкими и незначительными нарушениями микроциркуляции. От дозы и от сроков изменения не зависят. Менее выраженные изменения во всех исследованных органах при введении кластера фуллерен Сбо/Tween 80, вероятно, связаны с антиоксидантной и иммунотропной активностью фуллерена Сбо-

По данным Тюнина М.А. и Зайцевой О.Б. под действием кластера фуллерен Сбо/ПВП при подобных исследованиях происходило формирование дистрофических явлений и нарушений микроциркуляции. Отсутствие таких изменений при введении кластера фуллерен Cet/Tween 80 подтверждает возможность и безопасность его включения в состав комплекса лекарственных препаратов для абсорбции на раневых покрытиях с целью воздействия на одно из основных звеньев патогенеза раневого процесса.

Таким образом, установлено, что фуллерен Ceo в комплексе с Tween 80 проявляет выраженные антиоксидантные и иммунотропные свойства, не оказывая при этом повреждающего воздействия на ткани внутренних органов. Применение кластера фуллерен С «/Гween 80 при раневом процессе должно способствовать стабилизации собственной системы антиоксидантной защиты и тормозить развитие свободнорадикального перекисного окисления липидов, клеточных и капиллярных мембран, предотвращая повреждение клеток и тканей, ограничивая распространение воспалительных изменений и вторичного некроза тканей, усиливая фагоцитарную активность макрофагов и повышение неспецифического иммунитета.

3. Сравнительная характеристика антимикробной активности наночастиц металлов, традиционных и новых антисептиков

Следующим этапом исследований был выбор антисептичесого препарата для абсорбции на раневых покрытиях. В литературе последних лет наблюдается увеличение числа публикаций, посвященных наноматериалам, где, в частности, особое внимание уделяется наноразмерным частицам металлов и неметаллов в силу их биоактивных свойств.

На первом этапе исследования была изучена антимикробная активность наночастиц металлов и новых препаратов в лабораторных условиях на референтных штаммах (S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa): неорганно-органические нанобиокомпозиты, содержащие металлы - серебро, золото, платину и железо,

стабилизированные природным водорастворимым полимером арабиногалакта-ном; нанокластеры серебра, цинка и меди, стабилизация которых была осуществлена путём адсорбции наночастицами положительно заряженных ионов металлов; комплексы ПВП-нано-Ag0 (повиаргол) и ПВП-нано-Se0 (селенопол), представляющие собой наночастицы нуль-валентного серебра и селена, стабилизированные ПВП; кластер фуллерен Сбо/ПВП и водная дисперсия шунгитово-го углерода. Для сравнения антисептической активности были использованы известные антисептики с широким спектром антимикробного действия - диок-сидин и катапол.

Установлено, что в отношении всех использованных штаммов микроорганизмов наиболее эффективными оказались растворы: 0,5-3% диоксидина, 2,5% катапола, 2,5% серебра, стабилизированного арабиногалактаном и 0,15% коллоидный раствор серебра. Высокоэффективными по отношению к штаммам Е. coli и S. aureus оказались также 0,5% растворы селенопола, 2,5% повиаргола и 2,15% коллоидный раствор Zn°. Отсутствие антимикробной активности выявлено у исследуемых растворов: железа, золота, платины, стабилизированных арабиногалактаном, а также у кластера фуллерен Сбо/ПВП и водной дисперсии шунгитового углерода, что исключает их применение в качестве антисептического компонента для раневых покрытий.

На втором этапе исследования определяли чувствительность микроорганизмов к двум формам модифицированным катапола (МК-А), разработанного при нашем участии в ИБС РАН, с определением их оптимальной антимикробной концентрации на госпитальных штаммах, составившей 1,5%.

На третьем этапе была установлена оптимальная антимикробная концентрация серебра, стабилизированного природным полисахаридом арабиногалактаном, составившая 2,5%;

С целью окончательного выбора наиболее эффективных препаратов и выявления возможной антибиотикорезистентности на 4-м этапе нами исследованы растворы, проявившие максимальную антимикробную активность в предыдущих исследованиях (растворы диоксидина, катапола, серебра, стабилизированного арабиногалактаном, и МК-А). Установлено, что в отношении всех исследованных госпитальных штаммов, а также ассоциации этих микроорганизмов наиболее эффективными оказались образцы, содержащие растворы МК-А и диоксидина, обладающие мощным антибактериальным действием (рисунок 1). Серебро, стабилизированное арабиногалактаном, оказалось малоэффективным по отношению к К. pneumonia и к синегнойной палочке. Тем не менее, считаем возможным его включение в состав раневых покрытий, т.к. оно обладает не только антимикробным действием, но и другими биологически активными свойствами.

На 5-м этапе эффективность применения новых антисептиков была исследована при раневом процессе в эксперименте на гнойных ранах. Установлено, что под их действием микробная обсеменённость уже в первые сутки снижается ниже критического уровня. При этом отмечено более раннее очищение,

уменьшение воспалительных явлений в ране и окружающих её тканях, ускорение краевой эпителизации, подтверждающие оптимизацию раневого процесса.

! (i 50 i " • j

1С 40 I .............................................................. ,, »Диоксидин 1% ^

I | зо I J&- -:jfc-- -.........||l..........Аргентарабимо-

i I I in ' ■ Jt §§&■ Шш галактак 2,5%

\Ъ 2 \ ШШ ШШ г Катапол 2,5%

1 а 10 ! Ш 1|1Й.....ЖЩ -

• J 0 ¡.ШШм.. ЯтШу^ ШтШ-Vx -.mk-AI^

| К. pneumoniae S. aureus P.aeruginosa Ассоциаций

j Госпитальный штамм _ _

Рисунок 1 - Антимикробное действие антисептиков, сорбированных нано-гель-плёнкой целлюлозы Acetobacter xylinum, на госпитальные штаммы микроорганизмов по зонам задержки роста, мм

4. Патогенетическое обоснование комплекса лекарственных препаратов для иммобилизации его на раневых покрытиях

На основе проведённых исследований для воздействия на основные звенья патогенеза раневого процесса нами с патогенетических позиций обоснован комплекс лекарственных препаратов, который должна содержать матрица-носитель современного раневого покрытия: 1) антиоксидантный компонент •кластер фуллерен C6o/Tween 80 с 0,1% содержанием С60 2) антимикробный компонент - один из эффективных антисептиков, подавляющих как первичную «уличную», так и госпитальную микрофлору; 3) гемостатический и антиферментный препарат, 4) некролитический препарат. Иммобилизация такого комплекса лекарственных препаратов должна способствовать предупреждению осложнений и сокращению сроков заживления ран.

5, Разработка и применение в эксперименте биоактивных раневых покрытий на основе наноматериалов

Для лечения ран различной этиологии разработано два наноструктурных раневых покрытия. Первое - трёхслойное гидрогелевое биоактивное фулле-рен-содержащее. В качестве верхнего слоя использовали абсорбент - акрил-амидный гидрогель с нейтральным рН и абсорбционной ёмкостью в биологических жидкостях ~ 40 г/г, нанесённый на пористую хлопчатобумажную основу (средний слой), выполняющую каркасную функцию, и нижний, прилежащий к ране - биодеградирующий слой, включающий комплекс биоактивных ингредиентов разнонаправленного действия (рисунок 2).

Второе раневое покрытие разработано на основе нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы (рисунок 3),

Эффективность разработанных раневых покрытий на основе наноматериалов была исследована при местном лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов в эксперименте на 80 крысах.

А Б

Рисунок 2 - Общая схема (А) и внешний вид (Б) гидрогелевого трёхслойного

раневого покрытия

як

ншш11

Рисунок 3 - Общий вид наноструктурного раневого покрытия на основе нано-гель-плёнки целлюлозы Асеи>Ьас1ег хуУпшп

Планиметрическое исследование показало, что под влиянием трёхслойного гидрогелевого раневого покрытия в опытной группе срок полного заживления ран составил 16 суток, в контрольной группе 20 суток. Под влиянием биоактивного раневого покрытия на основе бактериальной целлюлозы срок полного заживления ран составил 17 суток, в контрольной серии 20 суток (рисунок 4).

Рисунок 4 - Динамика уменьшения площади раневого дефекта глубоких ожогов на фоне применения гидрогелевого трёхслойного раневого покрытия (А) и на фоне применения биоактивного раневого покрытия на основе бактериальной

целлюлозы (Б)

Подводя общий итог исследования эффективности разработанных нано-структурных раневых покрытий, необходимо отметить, что данные средства местного лечения ран, обладающие сорбционной, антибактериальной, анти-

ферментной, иммунотропной и антиоксидантной активностью, способны оказывать комплексное воздействие на раневой процесс, неосложнённое течение которого во многом определяет оптимизацию его дальнейшего хода.

По результатам исследования можно рекомендовать на ранах с обильной экссудацией трёхслойное гидрогелевое раневое покрытие, в то время как на ранах с незначительной продукцией раневого отделяемого наиболее эффективно биоактивное покрытие на основе бактериальной целлюлозы. Раневое покрытие на основе нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum также возможно насыщать заранее различными заготовленными ингредиентами с лечебным эффектом (экспозиция - 120 минут) для достижения наиболее оптимального воздействия с учётом особенностей течения раневого процесса.

Экспериментальные исследования эффективности наноструктурных биоактивных раневых покрытий показали, что их применение при местном лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов предупреждает осложненное течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран, в среднем, на 17,5% (рисунок 5).

Р ■

HIlflMlIlillIllHliHlIllM hmImpIiimIhhIiinIiim1

А Б

Рисунок 5 - Общий вид гранулирующих ран на 12 сутки с применением раневого покрытия на основе бактериальной целлюлозы (А) и покрытием не содержащего комплекс лекарственных препаратов (Б)

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая абсорбционная активность в биологических средах и биосовместимость наноструктурных гидрогелевого акриламидного абсорбента и нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum, которые целесообразно использовать в качестве матрицы биоактивных раневых покрытий.

2. Установлено, что водорастворимый кластер фуллерен Ceo/Tween 80 обладает антиоксидантной активностью, показатели которой максимальны в водных растворах с 0,05-0,1% содержанием фуллерена Сбо.

3. Парентеральное (внутрибрюшинное) однократное введение в ранний срок при термическом ожоге кластера фуллерен Ceo/Tween 80 оказывает выраженное иммунотропное действие, что является дополнительным основанием целесообразности местного применения кластера фуллерен Ceo/Tween 80 при раневом процессе.

Парентеральное (внутрибрюшинное) введение кластера фуллерен Ceo/Tween 80 у здоровых животных в отличие от кластера фуллерен С,)0/ПВП не вызывает дистрофических изменений и реакция со стороны тканевых макрофагов во внутренних органах. Отсутствие таких изменений подтверждает

возможность и безопасность его включения в состав комплекса лекарственных препаратов для абсорбции на раневых покрытиях.

4. Сравнительная оценка антимикробной активности нанобиокомпозитов в отношении госпитальных штаммов микроорганизмов (S. aureus, P. aeruginosa, Е. coli), включающих стабилизированные арабиногалактаном металлы - серебро, золото, платину и железо, коллоидные растворы нанокластеров серебра, цинка и меди, комплекс ПВП-нано-Ag0 (повиаргол) и ПВП-нано-Se0 (селено-пол) показала, что наиболее перспективными для иммобилизации на матрице раневых покрытий оказались: 2,5% раствор аргентарабиногалактана, 1,5% раствор модифицированного катапола и 1% раствор диоксидина. В эксперименте на животных данные антисептики снижали микробную обсеменённость ран ниже критического уровня уже в первые сутки, что способствовало оптимизации раневого процесса.

5. Для иммобилизации на сорбционной матрице-основе раневых покрытий целесообразно применение комплекса лекарственных препаратов, воздействующих на основные звенья патогенеза раневого процесса: 1) 2,5% раствор аргентарабиногалактана или 1,5% раствор модифицированного катапола или 1% раствор диоксидина (антисептический компонент); 2) кластер 0,1% фуллерена Сбо/Tween 80 (антиоксидантный компонент); 3) е-аминокапроновая кислота (антиферментный и гемостатический компонент); 4) 10% раствор мочевины или 4 мл (200 протеолитических единиц) раствора террилитина (некролитический компонент).

6. Разработаны наноструктурные биоактивные сорбирующие раневые покрытия на основе гидрогелевого акриламидного абсорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы с иммобилизацией на них указанных выше комплекса лекарственных препаратов, местное применение которых оптимизирует раневой процесс и сокращает сроки заживления инфицированных и гнойных ран, а также гранулирующих ран после глубоких ожогов, в среднем, на 17,5%. Указанные раневые покрытия отличаются пластичностью, легко моделируются на ранах со сложным рельефом, не фрагментируются, не адгезируются к раневой поверхности и краям раны, легко удаляются при перевязках. Учитывая различия в сорбционной активности, трёхслойное гидрогелевое акриламидное раневое покрытие рекомендуется применять на обильно экссудатирующих ранах, а раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы - на умеренно экссудатирующих ранах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. К применению рекомендованы два биоактивных наноструктурных сорбирующих раневых покрытия: на основе акриламидного гидрогеля и нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы.

Оба покрытия отличаются биосовместимостью, газо-, водо- и паропрони-цаемостью, пластичностью и хорошей адаптацией к неровному рельефу раневой поверхности, обладают выраженной активностью в биологических средах,

не фрагментируются в ранах и легко извлекаются пре перевязке единым блоком.

2. На обоих раневых покрытиях абсорбирован комплекс лекарственных нанобиокомпозитов и других препаратов, синергично воздействующих на основные звенья патогенеза раневого процесса и способствующих его оптимизации:

- водорастворимый 0,05-1,0% раствор кластера фуллерен C<,o/Tween 80 -антиоксидантный, иммунотропный препарат;

- раствор е-аминокапроновой кислоты (антиферментный и гемостатический препарат);

- аргентарабиногалактан или модифицированный катапол - наноантисептики, эффективно подавляющие «уличную» (первичную) и госпитальную микрофлору, а также её ассоциации;

- 10% раствор мочевины или 4 мл (200 протеолитических единиц) раствора террилитина (некролитический препарат).

3. Биоактивные раневые покрытия разных размеров, герметично упакованы в двойную полиэтиленовую упаковку и стерилизованы гамма-облучением (ГОСТРИСО 11737-2-2003 - 2,5 Мрад, ОАО «Медполимер», Санкт-Петербург).

4. В связи с различной сорбционной активностью раневые покрытия на основе акриламидного гидрогеля рекомендуется применять на обильно экссуда-тирующих ранах, раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы - на умеренно экссудатирующих ранах.

5. Применение указанных биоактивных сорбирующих раневых покрытий показано при лечении ран, связанных с тяжёлой механической травмой, огнестрельных ранениях, гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах, при длительно незаживающих ранах, пролежнях и трофических язвах.

6. Раневые покрытия могут быть применены при механической травме и огнестрельных ранениях на этапе первой врачебной помощи после обеспечения временного гемостаза и туалета кожных покровов, окружающих рану. Раневое покрытие фиксируется на ране: бинтовой повязкой.

7. На этапе квалифицированной хирургической помощи аппликацию раневого покрытия осуществляют после первичной хирургической обработки и обеспечения местного окончательного гемостаза. С учётом сорбционных возможностей перевязку и смену раневого покрытия рекомендуется проводить через сутки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Макин, Д.Н. Сорбирующие биоактивные раневые покрытия / Д.Н. Макин, М.В. Успенская, В.А. Попов, М.А. Тюнин, Н.Г. Венгерович, Н.В. Сиротинкин // Материалы всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и инновации в технических университетах». - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2007. - С. 188.

2. Макин, Д.Н. Гелеобразующий акрилатный раневой сорбент / Д.Н. Макин, Н.Г. Венгеровнч // Материалы конференций Политехнического симпозиума 2007 года «Молодые учёные - промышленности Северо-Западного региона». -СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2007. - С. 97-98.

3. Попов, В.А. Эффективность применения фуллерена Сбо для лечения ран различной этиологии / В.А. Попов, М. А. Тюнин, Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин, H.H. Зыбина, Е.В. Антоненкова, Л.Б. Пиотровский // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2008, - № 3, прил. 2. - С. 487-488.

4. Венгерович, Н.Г. Гидрогелевое фуллерен-содержащее покрытие для лечения ран / Н.Г. Венгерович // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА,

2008.-С. 230-231.

5. Венгерович, Н.Г. Гидрогелевый абсорбент и возможности его применения в хирургии / Н.Г. Венгерович // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2008. - С. 231-232.

6. Венгерович, Н.Г. Гидрогелевый акрилатный абсорбент / Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин, В. А. Попов, М.В. Успенская // Сборник изобретений и рационализаторских предложений: «Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике». - СПб.: ВМедА, 2008. - С. 31.

7. Венгерович, Н.Г. Абсорбент акрилатный мелкодисперсный / Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин, В.А. Попов, М.В. Успенская // Сборник изобретений и рационализаторских предложений: «Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике». - СПб.: ВМедА, 2008. - С. 31-32.

8. Венгерович, Н.Г. Фуллерен-содержащее раневое покрытие / Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин, В.А. Попов, М.В. Успенская // Сборник изобретений и рационализаторских предложений: «Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике». - СПб.: ВМедА, 2008. - С. 32.

9. Венгерович, Н.Г. Применение ряда биоактивных препаратов, сорбированных нано-гель-плёнкой целлюлозы Acetobacter xylinum при раневом процессе // Н.Г. Венгерович, А.К. Хрипунов, H.H. Рожков, В.А. Андреев, A.A. Ткачен-ко, В.А. Попов // Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение: тезисы пленарных докл. межд. конф. - Ташкент, 2008. -С. 66-69.

10. Венгерович, Н.Г. Биологическая активность фуллеренов и их применение при раневом процессе / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, М.А. Тюнин, Д.Н. Макин, М.В. Успенская // Журн. Асклепион - 2008. № 1-4. С. 28-31.

11. Макин, Д.Н. Применение фуллеренов в биоактивных раневых покрытиях / Д.Н. Макин, Н.Г. Венгерович, М.А. Тюнин, М.В. Успенская, В.А. Попов // Журн. Научно-технический вестник Санкт-Петербургского

государственного университета информационных технологий, механики и оптики - 2008. Вып. 47. - С. 78-83.

12. Венгерович, Н.Г. Местное применение раствора аргентарабиногалактана для лечения внутрибольничных инфекций / Н.Г. Венгерович, Ю.О. Коньшаков // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 279-280.

13. Коньшаков, Ю.О. Обоснование выбора антибактериальных препаратов для лечения госитальной инфекции / Ю.О. Коньшаков, Н.Г. Венгерович // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 290-291.

14. Венгерович, Н.Г. Патофизиологическое обоснование сорбции комплекса лекарственных препаратов бактериальной целлюлозы / Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXVin неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во, Политехнического университета, 2009. - С. 35-36.

15. Венгерович, Н.Г. Сравнительная оценка антибактериальной активности новых антисептиков, сорбированных бактериальной целлюлозой / Н.Г. Венгерович, В.А. Андреев, В.А. Попов, А.К. Хрипунов //Материалы межд. научно-практической конф. «XXXVIH неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во, Политехнического университета, 2009. - С. 36-37.

16. Венгерович, Н.Г. Ультраструктура целлюлозы Acetobacter xylinum, и перспективы её применения как основы раневого покрытия / Н.Г. Венгерович, Ю.О. Коньшаков, В.В. Клечковская, H.A. Архипова, A.A. Ткаченко, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXVIII неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во, Политехнического университета, 2009.-С. 38-39.

17. Kutikov, P.N. Investigate of dyes and biologic fluids sorbing by Acetobacter xylinum nano-gel film / P.N. Kutikov, E.I. Sysoev, N.G. Vengerovich, R.Yu. Smys-lov, A.K. Khripunov // Modern problems of polymer science - Materials 5th Saint-Petersburg Scientists Conference - SPb, 2009. - P. 71.

18. Венгерович, Н.Г. Способ фиксации раневых покрытий при операциях на мелких лабораторных животных / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов // Инновационная деятельность в ВС РФ: Труды всеармейской научно-практической конф. -СПб.: ВАС, 2010.-С. 154.

19. Венгерович, Н.Г. Покрытие для лечения ран, содержащее водную дисперсию шунгитового углерода / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Инновационная деятельность в ВС РФ: Труды всеармейской научно-практической конф. - СПб.: ВАС, 2010. - С. 154-155.

20. Венгерович, Н.Г. Покрытие для ран, содержащее коллоидные растворы нанокластеров Ag°, Zn°, Cu0 / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Инновационная деятельность в ВС РФ: Труды всеармейской научно-практической конф. -СПб.: ВАС, 2010. -С, 155-156.

21. Антоненкова, Е.В. Влияние производного фуллерена См на интенсивность окислительно-восстановительных процессов в макрофагах / Е.В. Анто-

ненкова, В, А. Попов, Н.Г. Венгерович // Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества имени И.П. Павлова-Калуга, 2010. - С. 31-32.

22. Белевитин, А.Б. Нанобиотехнологический подход к лечению ран /

A.Б. Белевитин, В.Н. Цыган, В.А. Попов, Н.Г. Венгерович // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2010, -№ 1 (29), прил. - С. 20-21.

23. Венгерович, Н.Г. Разработка современных антисептических препаратов / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В. А, Андреев // Материалы научной конф. с международным участием «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее». -СПб.: ВМедА, 2010. - С. 65-66.

24. Венгерович, Н.Г. Раневые покрытия на основе наноматериалов / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов // Материалы научной конф. с международным участием «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее». - СПб.: ВМедА, 2010. - С, 66.

25. Венгерович, Н.Г. Антиоксидантная активность комплекса фуллерен Сбо/Твин 80 / Н.Г. Венгерович, Е.В. Антоненкова, В.А. Попов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXIX неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во, Политехнического университета, 2010. - С. 42-43.

26. Венгерович, Н.Г. Нанобиотехнологии оптимизации раневого процесса / Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, В.А. Андреев, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXIX неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во, Политехнического университета, 2010. - С. 43-45.

27. Венгерович, Н.Г. Биологическая активность нанобнокомпоштов фуллерена Сво / Н.Г. Венгерович, М.А. Тюнин, Е.В. Антоненкова, Ю.О. Коньшаков, A.B. Болехан, О.Б. Зайцева, А.Н. Стуков, М.Н. Бояркин,

B.А. Попов // Медлайн.РУ (Medline.Ru) (элею-ронный журнал) - 2011. -Том 12.-С. 161-177.

28. Венгерович, Н.Г. Применения биоактивных наноматериалов при раневом процессе / Н.Г. Венгерович, Е.В. Антоненкова, В.А. Андреев, О.Б, Зайцева, А.К. Хрипунов, В.А. Попов // Вестник Российской Военно-медицинской академии- 2011, — JVs 1 (33).-С. 162-168.

Рационализаторские предложения:

1. Рац. предложение № 10535/4. Гидрогелевый акрилатный абсорбент / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, Д.Н. Макин, М.А. Тюнин: опубл. 18.07.2007 г.

2. Рац. предложение № 10536/4. Абсорбент акрилатный мелкодисперсный / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, Д.Н. Макин, М.А. Тюнин: опубл. 18.07.2007 г.

3. Рац. предложение № 10537/4. Биоактивное раневое покрытие на основе акрилатного гидрогеля / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, Д.Н. Макин, М.А. Тюнин: опубл. 18.07.2007 г.

4. Рац. предложение № 10534/4. Фуллерен-содержащее раневое покрытие / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, Д.Н. Макин, М.А. Тюнин: опубл. 18.07.2007 г.

5. Рац. предложение № 10678/6. Комбинированное биоактивное раневое покрытие / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, Д.Н. Макин, М.А. Тюнин: опубл. 07.11.2007 г.

6. Рац. предложение № 10984/1. Тканевая основа для раневого покрытия / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов: опубл. 09.01.2008 г.

7. Рад. предложение № 11107/5. Покрытие для лечения ран / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В.А. Андреев: опубл. 25.07.2008 г.

8. Рац. предложение № 11108/5. Антимикробное покрытие для лечения ран / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В.А. Андреев: опубл. 25.07.2008 г.

9. Рац. предложение № 11109/5. Покрытие для лечения ран, содержащее водную дисперсию шунгитового углерода / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, H.H. Рожкова: опубл. 25.07.2008 г.

10. Рац. предложение Л® 11110/5. Способ фиксации раневых покрытий при проведении операций на мелких лабораторных животных / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов: опубл. 25.07.2008 г.

11. Рац. предложением 12093/3. Способ обработки ран струёй антисептического комплекса / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В.А. Андреев: опубл. 28.06.2010 г.

12. Рац. предложение № 12094/3. Устройство для перфорации нано-гель плёнок бактериальной целлюлозы / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов: опубл. 28.06.2010 г.

13. Рац. предложение № 12095/3. Нано-антисептик аргентарабиногалактан / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В.А. Андреев: опубл. 28.06.2010 г.

14. Рац. предложение № 12096/3. Раневое покрытие на основе нано-гель плёнки бактериальной целлюлозы / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов: опубл. 28.06.2010 г.

15. Рац. предложение № 12097/3. Комплекс лекарственных препаратов для оптимизации раневого процесса / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов: опубл. 28.06.2010 г.

16. Рац. предложение № 12098/3. Способ применения модифицированного катапола / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, В.А. Андреев: опубл. 28.06.2010 г.

Список изобретений:

1. Пат. № 73198 Российская Федерация, МПК8 A61F 13/00. Гидрогелевое покрытие для лечения ран / В.А. Попов, Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин и др.; опубл. 20.05.2008, БИ№ 14.

2. Пат. № 2372944 Российская Федерация, МПК8 A61L15/00. Покрытие для лечения ран / В.А. Попов, Н.Г. Венгерович, Д.Н. Макин и др.; опубл. 20.11.2010, БИ№ 32.

3. Заявка на получение патента на изобретение, приоритетная справка №2010109156, МПК А61К31/14. Антисептический комплекс / О.В.Назарова, Н.Г. Венгерович, В.А. Попов и др.; опубл. 11.02.2010.

4. Заявка на получение патента на изобретение, приоритетная справка №2010133389, МПК А61 LI5/00. Раневое покрытие с лечебным действием / Н.Г. Венгерович, В.А. Попов, А.К. Хрипунов и др.; опубл. 09.08.2010.

Работа выполнена в рамках темы НИР кафедры патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова: «Биологическая активность фуллеренов и патофизиологическое обоснование их применения при хирургической патологии», шифр «Фуллерен», УМА.03.12.01.0810/0259, утверждена приказом начальника академии №219 от 23.05.2008 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВМедА - Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

ВПХ - военно-полевая хирургия

ДФПГ - 1Д-дифенил-2-пикрилгидразил

ИВС - институт высокомолекулярных соединений

Кон А - конканавалин А

ЛКТ - лизосомально-катионный тест

МК-А - модифицированный катапол с акриловой кислотой

НГП - нано-гель-плёнка

НСТ-тест - тест нитросинего тетразолия

ПВП - Ы-полившшлпирролидон

ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза

РАН - Российская академия наук

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

ФГА - фитогемагглютинин

ФП — фагоцитарный показатель

ФЧ — фагоцитарное число

ХДд, - спонтанная хемилюминесценция

ЦАХ - целлюлоза АсеюЬайег хуНпиш

Подписано в печать 05.05.11

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Формат 60x84/1 б Заказ № 33 7

Типография ВМА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, б.

Актуальность. Лечение ран остаётся одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой, гнойной хирургии и комбустиологии. Общее число пострадавших и больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями от общего числа больных хирургического профиля составляет 30-35% [41, 52, 111]. Наиболее часто такие процессы наблюдаются при механической травме, в том числе, при огнестрельных ранениях, вызванных снарядами с высокой кинетической энергией, а также при термической и электротравме [72, 91]. Данные виды патологии отличаются длительными сроками заживления ран, высокой частотой неблагоприятных исходов в виде генерализации патологического процесса, инвалидизации, стойкого ограничения трудоспособности [110, 113].

Особое внимание обращает на себя постоянно наблюдающийся рост анти-биотикорезистентности микроорганизмов и увеличение частоты гнойно-септических осложнений раневого процесса [78]. При этом ассортимент и доступность отечественных перевязочных средств, многокомпонентно воздействующих на раневой процесс, остаются недостаточными [28].

В настоящее время в мировой литературе всё большее внимание уделяется перспективам развития нанотехнологий. Материалы, полученные с использованием нанотехнологий, могут найти и уже находят применение в различных областях научного знания, в том числе и медицине [6, 129, 133]. Поскольку вещество в виде наночастиц обладает свойствами, часто радикально отличными от их аналогов в виде макроскопических дисперсий или сплошных фаз, наноматериалы представляют собой уникальный класс веществ, на основе которых возможно создание новых фармакологически активных препаратов [113].

Термин «нанотехиологии» введён в практику федеральных нормативных документов РФ с марта 2002 года [47]. Нанотехиологии это совокупность технологических методов и приёмов, используемых при изучении, проектировании, производстве и применении структур, устройств и систем, интеграции и взаимодействия составляющих их отдельных наномасштабных элементов (с размерами порядка 100 нм и меньше). Объектами нанотехнологий могут быть непосредственно низкоразмерные объекты — наноэлементы с характерными размерами как минимум по одному измерению (наночастицы, нанопорошки, нанотрубки, нановолокна, наноплёнки), отдельные элементы устройств и систем. При этом под устройствами или системами, изготовленными с использованием нанотехнологий, понимаются такие, в которых даже один компонент является объектом нанотехнологий.

Наноматериалы - разновидность продукции в виде материалов, содержащих структурные элементы с нанометровыми размерами, наличие которых обеспечивает существенное улучшение или появление качественно новых механических, химических, физических, биологических и других свойств, связанных с проявлением наномасштабных факторов.

В литературе описано множество биологически активных эффектов различных нанопрепаратов: антибактериальный [59, 84], иммуномодулирующий [60, 168], антиоксидантный [107, 113] и другие.

При этом, как правило, большинство наноматериалов и нанобиокомпози-тов изучены недостаточно: не установлены, в частности, общебиологические эффекты и возможная токсичность при их использовании на живых объектах, оптимальные концентрации и пр.

Отмеченные обстоятельства определяют необходимость комплексного исследования ряда наноматериалов и разработки нанобиокомпозитов, обладающих широким спектром биологической активности и возможностью оптимизировать, в частности, динамику раневого процесса.

Цель исследования: экспериментальное изучение сорбционных, антимикробных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и других свойств наноматериалов, обладающих биологической активностью, и разработка на их основе наноструктурных сорбирующих биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.

Задачи исследования:

1) разработать гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида и исследовать его сорбциониую активность в сравнении с нано-гель-плёнкой целлюлозы АсеШЬа^ег ху1ишт;

2) изучить антиоксидантную активность водных растворов кластера фул-лерен C6o/Tween 80;

3) исследовать морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов и иммунологические показатели крови при парентеральном введении кластера фуллерен Сбо/Тдуееп 80;

4) исследовать антимикробную активность в лабораторных условиях и в эксперименте на гнойных ранах, а также биосовместимость ряда биоактивных наноматериалов в сравнении с известными антисептиками;

5) обосновать с патогенетических позиций применение комплекса лекарственных препаратов, включающего наноматериалы, и его иммобилизацию на раневых покрытиях;

6) на основе изученных наноматериалов разработать биоактивные раневые покрытия, способные оказывать комплексное оптимизирующее воздействие на раневой процесс, предупреждать его осложнённое течение, и изучить в эксперименте на животных их эффективность на модели гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Научная новизна.

Разработан гидрогелевый абсорбент на основе акриловой кислоты и акриламида, изучены его физико-химические, сорбционные свойства и биосовместимость. Разработана тканевая хлопчатобумажная основа, предотвращающая фрагментацию гидрогелевого абсорбента и позволяющая извлекать его из раны единым блоком.

Оптимизирован синтез целлюлозы Асе1:оЬас1ег ху1тшп и изучена её сорб-ционная способность в различных средах. Установлено оптимальное время насыщения бактериальной целлюлозы лекарственными препаратами и определён срок перевязок при использовании её в качестве матрицы-основы для раневых покрытий.

В эксперименте на животных показана биосовместимость разработанного гидрогелевого сорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы.

Путём определения антирадикальной активности и супероксидпродуци-рующей активности тканевых макрофагов выявлены антиоксидантные свойства кластера фуллерен Сб0/Т\уееп 80.

При парентеральном введении кластера фуллерен Сбо/Тдуееп 80 на фоне обширных глубоких ожогов установлена его иммуномодулирующая способность.

Исследование общерезорбтивных свойств кластера фуллерен Сбо/Тдуееп 80 показало, что морфологические изменения в тканях внутренних органов при его внутрибрюшинном введении отсутствуют.

Определена антисептическая активность: неорганно-органических нано-биокомпозитов, содержащих металлы - серебро, золото, платину и железо, стабилизированных природным полисахаридом — арабиногалактаном; комплекса поливинилпирролидон-нано-Бе°; коллоидных растворов (нанокласте-ров) серебра, цинка и меди; а также разработанного при нашем участии модифицированного катапола. Установлено, что наиболее выраженными антисептическими свойствами по отношению ко всем исследуемым референтным и контрольным штаммам микроорганизмов обладают аргентарабиногалактан и модифицированный катапол (определены их оптимальные антимикробные концентрации). Эффективность этих препаратов подтверждена в эксперименте на гнойных ранах.

Экспериментальным путём установлен наиболее эффективный химический состав разработанного модифицированного катапола (заявка на изобретение № 2010109156 от 11.02.2010).

С патогенетических позиций определён комплекс лекарственных средств для абсорбции на раневых покрытиях, включающий наноматериалы воздействующие на основные звенья патогенеза раневого процесса.

Разработаны биоактивные наноструктурные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антисептической, антиоксидантной, антиферментной активностью, способные оказывать комплексное воздействие на основные звенья патогенеза раневого процесса как в первой, так и во второй его фазах:

1) трёхслойное гидрогелевое раневое покрытие, наиболее эффективное при раневом процессе с выраженной экссудацией (патент на полезную модель № 73198, БИ № 14, 2008, патент на изобретение № 2372944, БИ № 32, 2009) и

2) раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки целлюлозы Асе1оЬас1ег ху-Нпшп (заявка на изобретение № 2010133389 от 09.08.2010). Экспериментально установлена эффективность их местного применения при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Теоретическая и практическая ценность.

Выявленная сорбционная активность и биосовместимость гидрогелевого абсорбента на основе акриловой кислоты и акриламида, а также перфорированных нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы позволяют рекомендовать их применение в качестве сорбентов при раневом процессе и в качестве матрицы-носителя биоактивных компонентов.

Исследование антирадикальной активности кластера фуллерен Сбо/Т^уееп 80 и его влияния на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов показало целесообразность абсорбции данного кластера в качестве антиоксидантного препарата на раневых покрытиях.

При исследовании иммунологических показателей крови на фоне обширных глубоких ожогов после внутрибрюшинного введения кластера фуллерен Сбо/Т\уееп 80 установлена его иммуномодулирующая активность, способствующая оптимизации раневого процесса.

При морфологических исследованиях внутренних органов после парентерального введения кластера фуллерен Сбо/Т^/ееп 80 выявлено отсутствие острой токсичности данного препарата.

Проведённые сравнительные исследования антимикробной активности ряда нанопрепаратов выявили целесообразность местного применения серебра, стабилизированного арабиногалактаном, и модифицированного катапола в качестве антисептических средств при раневом процессе на этапах медицинской эвакуации.

Разработаны первые отечественные наноструктурные биоактивные раневые покрытия, обладающие высокой сорбционной, антиоксидантной, антисептической и антиферментной активностью, местное применение которых оптимизирует раневой процесс, предотвращает его осложнённое течение и сокращает сроки заживления гнойных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов. Раневые покрытия могут быть рекомендованы для местного лечения неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных, огнестрельных, гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах, пролежней и трофических язв.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фуллерен Сбо в составе кластера с Т\уееп 80 проявляет антиоксидантную активность, максимально выраженную в водных растворах с содержанием фуллерена С6о 0,05-0,1%.

2. Парентеральное введение фуллерена Сбо в составе комплекса с Тууееп 80 не проявляет острой токсичности, а при внутрибрюшинном введении на фоне глубоких ожогов вызывает иммуномодулирующий эффект.

3. Раствор серебра, стабилизированный арабиногалактаном, и модифицированный катапол обладают выраженной антимикробной активностью в отношении основных госпитальных штаммов микроорганизмов в концентрациях 2,5% и 1,5% соответственно.

4. Биоактивные наноструктурные раневые покрытия на основе акриламидного гидрогеля и нано-гель-плёнок целлюлозы АсеШЬас^ег ху1ишт с иммобилизованными в их составе кластером фуллерен Сбо/Т\уееп 80, обладающего ан-тиоксидантным и иммунотропными свойствами, антисептическим препаратом (диоксидин или серебро, стабилизироваьшое арабиногалактаном, или модифицированный катапол), некролитическим (мочевина или террилитин), антиферментным и гемостатическим (в-аминокапроновая кислота) препаратами являются эффективным средством местного лечения инфицированных, гнойных ран и гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах. Их применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран на 17,5%.

Реализация работы. По теме исследования опубликовано 28 печатных работ. Получен патент на полезную модель «Гидрогелевое покрытие для лечения ран» (№ 73198, БИ № 14, 2008), патент на изобретение: «Покрытие для лечения ран» (№ 2372944, БИ № 32, 2009), поданы заявки для получения патентов на изобретения: «Антисептический комплекс» (приоритетная справка №2010109156 от 11.02.2010) и «Раневое покрытие с лечебным действием» (приоритетная справка № 2010133389 от 09.08.2010). Зарегистрировано 16 рационализаторских предложений. Результаты исследований внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской работе кафедры патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования изложены в докладах на Итоговых конференциях Военно-научного общества курсантов и слушателей Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 2008, 2009, 2010 (I место на конкурсе научных работ) годов, на научно-практической конференции в честь 71-летия со дня основания IV факультета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (2009), Международных научно-практических конференциях «XXXVIII и XXXIX недели науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Изобретатели и инновационная политика России» - I место в секции медицина и биология (Санкт-Петербург, 2010).

Результаты работы представлены в виде постерных докладов на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2007); Конференции Политехнического симпозиума «Молодые учёные — промышленности СевероЗападного региона» (Санкт-Петербург, 2007); 2-ом Санкт-Петербургском Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение» (Ташкент, 2008); XIII Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции. (Промышленные инновации)» (Санкт-Петербург, 2008); Международных Салонах промышленной собственности - «Архимед 2009» (Серебряная медаль), «Архимед 2010»; X Московском Международном Салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2010).

Объём и структура диссертации. Материалы диссертационного исследования представлены на 151 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных лабораторных и экспериментальных исследований (3, 4 и 5 главы), выполненных на 216 крысах, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 201 источник, из них 128 отечественных и 73 иностранных авторов.

выводы

1. Установлена высокая абсорбционная активность в биологических средах и биосовместимость наноструктурных гидрогелевого акриламидного абсорбента и нано-гель-плёнок целлюлозы Acetobacter xylinum, которые, целесообразно использовать в качестве матрицы биоактивных раневых покрытий.

2. Установлено, что водорастворимый кластер фуллерен Сбо/Tween 80 обладает антиоксидантной активностью, показатели которой максимальны в водных растворах с 0,05-0,1% содержанием фуллерена Сбо

3. Парентеральное (внутрибрюшинное) однократное введение в ранний срок при термическом ожоге кластера фуллерен C6o/Tween 80 оказывает выраженное иммунотропное действие, что является дополнительным основанием целесообразности местного применения кластера фуллерен Cöo/Tween 80 при раневом процессе.

Парентеральное (внутрибрюшинное) введение кластера фуллерен Сбо/Tween 80 у здоровых животных в отличие от кластера фуллерен Сбо/ПВП не вызывает дистрофических изменений и реакции со стороны тканевых макрофагов во внутренних органах. Отсутствие таких изменений подтверждает возможность и безопасность его включения в состав комплекса лекарственных препаратов для абсорбции на раневых покрытиях.

4. Сравнительная оценка антимикробной активности нанобиокомпозитов в отношении госпитальных штаммов микроорганизмов (S. aureus, P. aeruginosa, Е. coli) и нанобиокомпозитов, включающих стабилизированные арабиногалак-таном металлы - серебро, золото, платину и железо, коллоидные растворы на-нокластеров серебра, цинка и меди, комплекс ПВП-нано-Ag0 (повиаргол) и ПВП-нано-Se0 (селенопол) показала, что наиболее перспективными для иммобилизации на матрице раневых покрытий оказались: 2,5% раствор аргентара-биногалактана, 1,5% раствор модифицированного катапола и 1% раствор диок-сидина. В эксперименте на животных данные антисептики снижали микробную обсеменённость ран ниже критического уровня уже в первые сутки, что способствовало оптимизации раневого процесса.

5. Для иммобилизации на сорбционной матрице-основе раневых покрытий целесообразно применение комплекса лекарственных препаратов, воздействующих на основные звенья патогенеза раневого процесса: 1) 2,5% раствор ар-гентарабиногалактана или 1,5% раствор модифицированного катапола или 1% раствор диоксидина (антисептический компонент); 2) кластер 0,1% фуллерена СбоЯЧуееп 80 (антиоксидантный компонент); 3) е-аминокапроновая кислота (антиферментный и гемостатический компонент); 4) 10% раствор мочевины или 4 мл (200 протеолитических единиц) раствора террилитина (некролитиче-ский компонент).

6. Разработаны наноструктурные биоактивные сорбирующие раневые покрытия на основе гидрогелевого акриламидного абсорбента и нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы с иммобилизацией на них указанных выше комплекса лекарственных препаратов, местное применение которых оптимизирует раневой процесс и сокращает сроки заживления инфицированных и гнойных ран, а также гранулирующих ран после глубоких ожогов, в среднем, на 17,5%. Указанные раневые покрытия отличаются пластичностью, легко моделируются на ранах со сложным рельефом, не фрагментируются, не адгезируются к раневой поверхности и краям раны, легко удаляются при перевязках. Учитывая различия в сорбционной активности, трёхслойное гидрогелевое акриламидное раневое покрытие рекомендуется применять на обильно экссудатирующих ранах, а раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы - на умеренно экссудатирующих ранах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.К применению рекомендованы два биоактивных нано структурных сорбирующих раневых покрытия: на основе акриламидного гидрогеля и нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы.

Оба покрытия отличаются биосовместимостью, газо-, водо- и паропрони-цаемостью, пластичностью и хорошей адаптацией к неровному рельефу раневой поверхности, обладают выраженной активностью в биологических средах, не фрагментируются в ранах и легко извлекаются пре перевязке единым блоком.

2. На обоих раневых покрытиях абсорбирован комплекс лекарственных нанобиокомпозитов и других препаратов, синергично воздействующих на основные звенья патогенеза раневого процесса и способствующих его оптимизации:

- водорастворимый 0,05-1,0% раствор кластера фуллерен С6о/Т\уееп 80 -антиоксидантный, иммунотропный препарат;

- раствор 8-аминокапроновой кислоты (антиферментный и гемостатический препарат);

- аргентарабиногалактан или модифицированный катапол — наноантисептики, эффективно подавляющие «уличную» (первичную) и госпитальную микрофлору, а также её ассоциации;

- 10% раствор мочевины или 4 мл (200 протеолитических единиц) раствора террилитина (некролитический препарат).

3. Биоактивные раневые покрытия разных размеров, герметично упакованы в двойную полиэтиленовую упаковку и стерилизованы гамма-облучением (ГОСТРИСО 11737-2-2003 - 2,5 Мрад, ОАО «Медполимер», Санкт-Петербург).

4. В связи с различной сорбционной активностью раневые покрытия на основе акриламидного гидрогеля рекомендуется применять на обильно экссудатирующих раиах, раневое покрытие на основе нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы — на умеренно экссудатирующих ранах.

5. Применение указанных биоактивных сорбирующих раневых покрытий показано при лечении ран, связанных с тяжёлой механической травмой, огнестрельных ранениях, гранулирующих ран после некрэктомии при глубоких ожогах, при длительно незаживающих ранах, пролежнях и трофических язвах.

6. Раневые покрытия могут быть применены при механической травме и огнестрельных ранениях на этапе первой врачебной помощи после обеспечения временного гемостаза и туалета кожных покровов, окружающих рану. Раневое покрытие фиксируется на ране бинтовой повязкой.

7. На этапе квалифицированной хирургической помощи аппликацию раневого покрытия осуществляют после первичной хирургической обработки и обеспечения местного окончательного гемостаза. С учётом сорбционных возможностей перевязку и смену раневого покрытия рекомендуется проводить через сутки.