Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование местного применения в биоактивных раневых покрытиях модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола) (экспериментальное иссле

На правах рукописи

КАСАНОВ Кирилл Николаевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ В БИОАКТИВНЫХ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЯХ МОДИФИЦИРОВАННОГО СЕРЕБРОМ МОНТМОРИЛЛОНИТА И ВОДОРАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ФУЛЛЕРЕНА См (ФУЛЛЕРЕНОЛА)

(экспериментальное исследование)

14.03.03 — патологическая физиология 14.01.17 — хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 9 ДЕК ¿1)13

Санкт-Петербург 2013

005544116

005544116

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Цыган Василий Николаевич доктор медицинских наук доцент Бадалов Вадим Измаилович

Официальные оппоненты:

Митрейкин Владимир Филиппович - доктор медицинских наук профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии

Сингаевский Андрей Борисович - доктор медицинских наук профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры факультетской хирургии имени И.И. Грекова

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Защита диссертации состоится «24» декабря 2013 года в 12:00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.03 на базе ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «22» ноября 2013 г.

Учёный секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Дергунов Анатолий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В практике врача любой хирургической специальности лечение ран различной этиологии является одним из ключевых направлений повседневной клинической деятельности (Зубарев П.Н, Кочетков A.B., 2011). Знание закономерностей течения раневого процесса, основных звеньев его патогенеза позволяет своевременно определить тактику ведения раны, предупредить развитие осложнений и, в конечном счете, сократить сроки заживления (Шанин В.Ю., 1998).

На сегодняшний день применение современных биоактивных раневых покрытий, представляющих собой отдельный класс средств местного лечения ран, позволило значительно оптимизировать оказание квалифицированной медицинской помощи (Абаев Ю.К., 2005). Высокая частота природных и техногенных катастроф, локальных вооруженных конфликтов, сопровождающихся возникновением тяжелой механической травмы, огнестрельных пулевых и минно-взрывных ранений определяет актуальность применения раневых покрытий для этой категории пострадавших (Быков И.Ю., Ефименко H.A., Гуманенко Е.К., 2009; Самохвалов И.М., Бадалов В.И., Головко К.П. с соавт., 2013; Хрупкин В.И., Самохвалов И.М., 1991).

Ведущими патогенетическими направлениями фармакологического воздействия раневых покрытий являются профилактика и борьба с раневой инфекцией, а также подавление каскада окислительных реакций, зачастую способствующих вторичной деструкции тканей (Лещенко И.Г., Галкин P.A., 2003; Попов В.А., 2013).

По данным многочисленных публикаций, наиболее перспективными для иммобилизации на раневые покрытия в качестве антимикробного компонента являются наноразмерные частицы серебра (AgNPs — Argentum Nano Particles), обеспечивающие дозированный и пролонгированный антимикробный эффект (Fong J., Wood F., 2006; Furno F. et al., 2004; Ip M., Lui S.L., Poon V.K., Lung I., 2006; Morones J.R., Elechiguerra J.L., Camacho A. et al., 2005; Rai M., Yadav A., Gade A., 2009; Taylor P.L., Ussher A.L., Burrell R.E., 2005).

По данным работ Тюнина M.А. (2009), Венгеровича Н.Г. (2011) и Попова В.А. с соавт. (2013) о биологической активности кластеров фуллерена Сбо на различных растворителях (ПВП, Tween 80, краун-эфире) установлены антиоксидантные, антирадикальные и иммуномодулирующие эффекты местного применения данного препарата. Иммобилизация водорастворимой формы фуллерена С6о (фуллеренола) на раневых покрытиях позволит, сохранив активные биологические свойства углеродных наночастиц, избежать нежелательного использования токсичных растворителей.

В свете вышесказанного, разработка и внедрение современных раневых покрытий, содержащих комплекс патогенетически обоснованных биоактивных препаратов, позволяющих оптимизировать течение раневого процесса, является актуальной задачей стоящей перед врачами-хирургами и производителями (Попов В.А., 2013; Цыган В.Н., 2013).

Цель исследования: патогенетическое обоснование и экспериментальное изучение эффективности местного применения модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена С6о (фуллеренола) при раневом процессе, а также разработка на их основе биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.

Задачи исследования:

1. Изучить химический состав и морфологию модифицированного серебром монтмориллонита, а также провести сравнительную оценку его антимикробной активности с традиционными антисептиками;

2. В эксперименте на животных изучить антиоксидантную активность водных растворов фуллеренола и исследовать морфофункционапьные изменения в тканях внутренних органов, метаболические сдвиги и реакцию системы кроветворения при его парентеральном (внутрибрюшинном) введении;

3. Обосновать с патогенетических позиций местное применение лечебного комплекса нанопрепаратов - модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена Сбо (фуллеренола), как антимикробного и антиоксидантного компонентов биоактивных раневых покрытий;

4. Разработать биосовместимые сорбирующие матрицы раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы Gluconacetobacter xylinus;

5. Разработать биоактивные раневые покрытия с антиоксидантным и пролонгированным антимикробным действием для лечения ран различной этиологии и оценить эффективность их местного применения на модели инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Научная новизна исследования. Впервые дано патогенетическое обоснование местного применения комплекса нанопрепаратов (модифицированного серебром монтмориллонита и фуллеренола) при раневом процессе. Иммобилизация указанного комплекса на полимерные матрицы, позволило получить современные биоактивные раневые покрытия для лечения ран различной этиологии. Разработаны полимерсиликатные композитные матрицы раневых покрытий на основе акриламидного гидрогеля и дезинтегрированной бактериальной целлюлозы (G. xylinus). В качестве наполнителя-модификатора полимерных матриц использовали слоистый силикат монтмориллонит (модифицированную серебром форму), что позволило значительно оптимизировать их механические свойства и сорбционную способность, а также за счет дозированного выхода активных ионов серебра обеспечить пролонгированное антимикробное действие покрытий.

На большом экспериментальном материале (160 крыс-самцов линии Wistar) продемонстрирована способность разработанных раневых покрытий подавлять рост бактериальной микрофлоры в инфицированной ране, а также доказана эффективность их местного применения для лечения инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Показано, что для ведения ран, характеризующихся обильной экссудацией наиболее оптимально подходит биоактивное раневое покрытие на основе гидрогелевого нанокомпозита. Биоактивное раневое покрытие на основе дезинтегрированной бактериальной целлюлозы эффективно для лечения инфицированных ран с умеренным количеством отделяемого.

Теоретическая н практическая значимость. С использованием широкого спектра высокотехнологичных лабораторных методов (электронной микроскопии, РФ- и EDS- спектрометрии) изучены химический состава и морфология модифицированного серебром монтмориллонита (Ag-MMT). По результатам микробиологического исследования установлена значимая в сравнении с традиционными антисептиками биоцидная активность Ag-MMT, обусловленная содержащимися в его структуре наночастицами серебра (AgNPs).

В серии экспериментов на животных (100 крыс-самцов линии Wistar) изучены биоактивные свойства водорастворимой формы фуллерена Сбо (фуллеренола). Путём определения супероксидпродуцирующей активности тканевых макрофагов выявлены антиоксидантные свойства фуллеренола, оптимально проявляющиеся в его водном растворе с концентрацией 0,01%. Исследование общерезорбтивных свойств фуллеренола показало отсутствие морфофункциональных изменений тканей внутренних органов, патологических сдвигов в системе кроветворения и метаболизме при его внутрибрюшинном введении, в той или иной степени характерных для водорастворимых кластеров фуллерена СаУПВП и Ca/Tween 80.

Разработаны биоактивные раневые покрытия, с высокой и умеренной сорбционной способностью, обладающие антиоксидантной и пролонгированной антимикробной активностью, местное применение которых оптимизирует раневой процесс, предотвращает его осложнённое течение и сокращает сроки заживления ран. Биоактивные раневые покрытия могут быть использованы при оказании медицинской помощи на догоспитальном и госпитальном этапах для местного лечения неогнестрельных и огнестрельных ран, ран при тяжелой механической травме, неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных и длительно незаживающих, гранулирующих ран после глубоких термических ожогов, в комплексном лечении трофических язв и пролежней.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированный монтмориллонит, за счет образования в его структуре наночастиц серебра, обладает выраженной биоцидной активностью в отношении референтных и госпитальных штаммов микроорганизмов, основных возбудителей раневой инфекции, при концентрации его высокодисперсной водной взвеси 0,05 г/мл. Введение монтмориллонита в качестве антимикробного наполнителя матриц раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита (2 мас.%) и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus (0,2 мас.%) позволяет получать значимый бактериостатический эффект in vitro, и поддерживать уровень бактериального обсеменения раны ниже Ю3(КОЕ) на протяжении 5-7 суток in vivo.

2. Водорастворимая форма фуллерена Ceo (фуллеренол) проявляет антиоксидантную активность, в водных растворах с 0,01%-м содержанием углеродных наночастиц. Парентеральное введение фуллеренола не проявляет острой токсичности, не влияет на морфофункциональное состояние внутренних органов, метаболизм и не вызывает патологической реакции системы кроветворения.

3. Биоактивные раневые покрытия на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus с иммобилизованными в их составе биоактивными компонентами (модифицированного серебром монтмориллонита и фуллеренола) являются эффективным средством местного лечения инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран при глубоких ожогах. Их применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран в среднем на 20%.

Реализация результатов исследования. Результаты исследований используются в научно-исследовательской работе кафедр патологической физиологии и военно-полевой хирургии, а также научно-исследовательской лаборатории военной хирургии ВМедА им. С.М. Кирова. Материалы исследования использованы при написании монографии «Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации» (2013).

Получен патент на изобретение: «Раневое покрытие с лечебным действием» (№ 2437681 от 09.08.2010 г.), получены приоритетные справки по заявкам на изобретения: «Биоактивное гидрогелевое раневое покрытие» (2013149052 от 06.11.2013) и «Сетчатое биоактивное раневое покрытие» (2013145823 от 15.10.2013).

Публикации. Основные материалы диссертационного исследования опубликованы в 30 печатных работах в виде научных статей, тезисов докладов и глав монографии, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования изложены в докладах на Итоговых конференциях Военно-научного общества курсантов и слущателей ВМедА 2008, 2009, 2010, 2011, 2012 (II место на конкурсе научных работ), 2013 годов, III Международной научной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), Международных научно-практических конференциях «XXXVIII, XXXIX, XL, XLI недели науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009, 2010, 2011, 2012), Всероссийском форуме «Изобретатели и инновационная политика России» (Санкт-Петербург, 2011), I и II Всероссийском конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012, 2013), VIII Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2012), I Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia) с международным участием (Москва, 2013).

Результаты работы представлены в виде постерных докладов на X Московском Международном Салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2010),

Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2012), Международной выставке-конференции «БИОИНДУСТРИЯ 2013» (Санкт-Петербург, 2013).

Личный вклад автора в получение результатов, выносимых на защиту, является определяющим. Автор принимал непосредственное участие в выполнении основного объема экспериментальных и лабораторных исследований, изложенных в диссертационной работе, с использованием микробиологических, биохимических и морфологических методов, а также анализ, статистическую обработку и оформление результатов в виде публикаций и научных докладов.

Связь с планом основных научных работ Военно-медицинской академии. Материалы диссертации легли в основу плановой НИР «Разработка на основе нанобиокомпонентов биоактивного раневого покрытия для лечения огнестрельных ран в лечебно-профилактических учреждениях Министерства обороны РФ», шифр «Покрытие», VMA.02.05.06.il 13/0167, по заказу ГВМУ МО РФ.

Объём и структура работы. Материалы диссертационного исследования представлены на 150 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 45 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 205 источник, из них 98 отечественных и 107 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Лабораторные исследования. Разработка, синтез и изучение химического состава модифицированного серебром монтмориллонита осуществлена в лабораторных условиях кафедры общей химии БелГУ (Белгород). Химический состав Ag-MMT определяли рентгенофлуоресцентным методом на спектрометре «ARL Optim'X». Морфологию образцов силиката изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа «SUPRA 55VP-32-49 с EDS-спектрометром».

Разработка гидрогелевой матрицы раневого покрытия на основе сополимера акриловой кислоты и акриламида, способов введения в ее состав природного и модифицированного ММТ, а так же сравнительное изучение сорбционной активности, механических свойств полученных нанокомпозитов выполнено в лабораторных условиях кафедры информационных технологий топливно-энергетического комплекса СпбИТМО (Санкт-Петербург).

Синтез, дезинтеграцию и исследование сорбционных свойств целлюлозы G. xylinus, а также получение на ее основе композитного сетчатого раневого покрытия выполнены на базе ИВС РАН (Санкт-Петербург).

Выход активного ионизированного серебра из матриц раневых покрытий устанавливали методом ионометрии. Изначально определяли значение pAg раствора (по аналогии с рН), с последующим пересчетом концентрации Ag+ в моль/мл.

Микробиологические исследования. Определение минимальной бактерицидной концентрации (МБК) Ag-MMT проводили чашечно-суспезионным методом. Критерием эффективности антисептика при этом служил коэффициент снижения числа тест-микроорганизмов - КреД (коэффициент редукции). Оптимальной считали эффективность антисептиков при Кред > 5 и подавлении роста не менее 99,99% колониеобразующих единиц (КОЕ) соответствующих микроорганизмов. Исследование проводили на контрольных (референтных) штаммах микроорганизмов Е. coli АТСС 25922, Р. aeruginosa АТСС 27853, S. aureus АТСС 29212 и MRS А.

Бактериостатическое действие разработанных матриц раневых покрытий, а также определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) Ag-MMT в их составе определяли с использованием указанных выше референтных и, дополнительно, госпитальных штаммах P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и MRSA, полученных в клинике военно-полевой хирургии ВМедА им. С.М. Кирова.

Способность разработанных матриц раневых покрытий подавлять рост микрофлоры в инфицированной ране определяли на модели инфицированной раны, воспроизведенной на 20 крысах. Критерием эффективности матриц в подавлении роста раневой микрофлоры являлось снижение показателя ориентировочной микробной обсемененности и макроскопическая картина ран.

Биохимические исследования. Супероксидпродуцирующую способность тканевых макрофагов исследовали методом хемилюминесценции с помощью регистрации спонтанной хемилюминесценции (ХЛсп) клеток, определяя уровень продукции фагоцитами реактивных форм кислорода, прежде всего, супероксидного анион-радикала (Ог*). В эксперименте использовали альвеолярные и перитонеальные макрофаги. По интенсивности наработки 02* оценивали степень активности клетки и её функциональный потенциал при применении препарата.

Биохимические и клеточные показатели крови у крыс определяли по стандартным методикам. Условную норму отрабатывали на 10 белых крысах-самцах линии Wistar. Экспериментальным группам внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,01% водного раствора фуллеренола. Кровь забирали путём каудальной ампутации в нижней трети хвоста на 4 и 9 сутки (по 10 животных в каждой группе). Полученные результаты сравнивали с данными референтных показателей крови у крыс линии Wistar представленными в «Diseases of the Wistar Rat» (1997).

Морфологические исследования. Морфологические методы использовали для определения морфофункциональных изменений в тканях внутренних органов животных при выполнении сравнительной оценки общерезорбтивного действия фуллеренола и других водорастворимых кластеров фуллерена Сбо при их парентеральном (внутрибрюшинном) введении. Для проведения гистоморфологических изменений у всех животных (п=30) на момент выведения из опыта производили забор тканей сердца, лёгких, печени, селезёнки, почек и тонкой кишки с брыжейкой. Препараты изучали методом световой микроскопии.

Экспериментальные исследования. Общее количество животных, использованных в экспериментальной части работы, составило 290 крыс-самцов линии \Vistar массой 180-230 г (таблица 1), полученных из питомника РАМН «Раполово».

Эксперименты на крысах выполняли под эфирным наркозом (полуоткрытый контур). Крыс выводили из опыта путём декапитации или передозировкой эфирного наркоза. После операций животные находились под динамическим наблюдением в условиях вивария. Содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных» (1980) и с приказом МО РФ от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Результаты экспериментов оценивали по клиническому течению послеоперационного периода (активность, поведение, отношение к пище, мочеотделение, состояние послеоперационной раны).

Таблица 1

Экспериментальные исследования, выполненные в работе_

Цель исследования и характер оперативного вмешательства Количество крыс (п=290)

Влияние водных растворов фуллеренола на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов 20

Определение биосовместимости разработанных матриц раневых покрытий 20

Морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов при парентеральном (внутрибрюшинном) введении фуллеренола 30

Влияние парентерального (внутрибрюшинного) введения водного раствора фуллеренола на биохимические и клеточные показатели крови у крыс 60

Способность разработанных раневых покрытий подавлять рост микрофлоры в инфицированной ране 40

Сравнительное исследование эффективности разработанных раневых покрытий и коммерческих аналогов при лечении - инфицированных кожно-плоскостных ран - гранулирующих ран после глубоких ожогов 60 60

Для проверки биосовместимости, разработанные матрицы раневых покрытий были применены для местной аппликации в эксперименте на 20 животных, у которых воспроизводили по 2 условно асептических кожно-плоскостных раны. Моделирование ран выполняли путем иссечения участков кожи и поверхностной фасции размерами 2,0x2,0 см на спине крыс. После подготовки (осушения и контроля гемостаза) поверхность ран покрывали

матрицами раневых покрытий размером 2,5x2,5 см, так, чтобы образец матрицы полностью перекрывал зону раневого дефекта и частично заходил на область здоровых тканей. Перевязки с повторной аппликацией матриц покрытий выполняли через день. Критериями эффективности служили скорость заживления и гистоморфологическая картина ран на 7-е сутки.

Сравнительное исследование эффективности разработанных раневых покрытий и коммерческих аналогов при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов выполнено на 120 крысах.

Глубокие ожоги у 60 животных моделировали с помощью специального устройства. В качестве обжигающей поверхности использовали медные пластины размерами 2x2 см с температурой нагрева 180°С. Ожог наносили контактным способом в течение 15 секунд. Через сутки после моделирования ожога под эфирным наркозом выполняли некрэктомию ожогового струпа и аппликацию раневых покрытий.

Для воспроизведения модели инфицированных кожно-плоскостных ран 60 животным под эфирным наркозом производили разрез кожи на спине до фасции длиной 4 см, затем отслаивали кожу для получения кожно-фасциального кармана. Раны обрабатывали 3% раствором перекиси водорода, осушали. Затем раны инфицировали путем внесения в полученный кожно-фасциальный карман суспензии бактериальной ассоциации контрольных референтных) штаммов Enterobacteriaceae - Е. coli АТСС 25922, Staphylococcus spp. - S. aureus АТСС 29212 (АТСС - American Type Cultures Collection). Суспензию изготовляли, используя чистую суточную культуру, выросшую на плотной питательной среде.

Критериями эффективности разработанных раневых покрытий служили скорость заживления, сроки полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 5, 10, 15 и 20-е сутки.

Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом по JI.H. Поповой. При контрольных измерениях на рану накладывали стерильную пленку целлофана и на нее наносили контуры раны. Рисунок переносили на миллиметровую бумагу и подсчитывали площадь.

Методы статистической обработки данных. Все количественные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке. Статистическую значимость различий в сравниваемых выборках оценивали при помощи t-критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при р<0,05 (Автадинов Г.Г., 1990).

Накопление базы данных и её информационно-аналитическую переработку, вычислительные операции и графическое изображение результатов исследований осуществляли на компьютере с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2010 для Windows 7.

Результаты и их обсуждение 1. Биоактивные свойства нанопрепаратов

Получение модифицированного серебром монтмориллонита. В

качестве исходного материала для получения Ag-MMT использовали монтмориллонит-содержащую глину Белгородского месторождения со следующим минералогическим составом: монтмориллонит, илеит, каолинит, кварц, мусковит, кальцит и полевые шпаты. Нативный ММТ данного месторождения является натрий-кальциевым (№-Са-ММТ), то есть в межпакетном пространстве силиката содержатся катионы и Са2

Синтез Ag-MMT производили методом химической обработки нативного силиката модифицирующим агентом - раствором А§>Юз. Для проведения дальнейших исследований образцы нативного и модифицированного ММТ измельчили на механической мельнице до получения порошкообразных фракций различной дисперсности (Э<0,25 мм и Б 0,5-0,25 мм).

Изучение химического состава и морфологии модифицированного серебром монтмориллонита. По результатам рентгенофлуоресцентной спектроскопии (РФС), представленным на рисунке 1, установлен химический состав нативного и модифицированного монтмориллонита. Установлено, что содержание серебра (в составе Ag20) в модифицированной форме достигает около 20,72% массы, а содержащийся в нативной форме натрий практически отсутствует, что объясняется процессом катионного обмена.

5 ¡о,

63,68

Прочие

6,7

Ыа-Са-ММТ Ад-ММТ

Рисунок 1 - Химический состав образцов нативного (Ыа-Са-ММТ) и модифицированного серебром монтмориллонита (Ag-MMT), %

По результатам электронной микроскопии образцов Ag-MMT отмечено, что образующиеся в процессе катионного обмена AgNPs локализуются как в межслоевом (межпакетном) пространстве алюмосиликата, так и на его поверхности. Указанная структурная особенность, обусловленная слоистой морфологией ММТ, препятствуют агрегации наночастиц и образованию малоактивных конгломератов. Установлено, что AgNPs имеют кубическую, призматическую и сфероидную форму. Размеры визуализирующихся наночастиц колеблется в пределах от 20 до 70 нм.

Сравнительная оценка антимикробной активности

модифицированного серебром монтмориллонита и традиционных антисептиков. По результатам оценки антимикробной активности, представленным на рисунке 2, определены минимальные бактерицидные концентрации (МБК) водных взвесей Ag-MMT различной дисперсности 0<0,25 мм и Э 0,5-0,25 мм. Критерием эффективности бактерицидного действия водных взвесей модифицированного ММТ считали показатели Кред > 5 и подавление роста КОЕ более 99,99%.

В частности установлено, что частицы с высокой дисперсностью (0<0,25 мм) проявляют оптимальную бактерицидную активность при концентрациях от 0,025 г/мл. Для частиц с низкой дисперсностью (О 0,5-0,25 мм) бактерицидный эффект обнаруживался при концентрациях более 0,05 г/мл. Выявленную закономерность можно объяснить более активным выходом активного ионизированного серебра (Ag+) в водной взвеси частиц более Ag-MMT высокой дисперсности.

0.01

Ei Е. coli

0,025 0 05 0,01 0,025 0,05

D< 0,25 мм D 0,5-0,25 мм

Концешрщия водной взвеси Ag-MMT. г;мл □ S. aureus ■ P. aeruginosa И MRSA

Рисунок 2 - Бактерицидное действие водных взвесей Ag-MMT с различной концентрацией и дисперсностью частиц

При анализе показателей Кред тест-штаммов микроорганизмов при применении водных взвесей Ag-MMT (D < 0,25 мм) и ряда традиционных антисептиков, представленных в таблице 2, установлено, что Ag-MMT обладал наиболее высокой антимикробной активностью в концентрации 0,05 г/мл. Значения Кред по отношению к штаммам Е. coli, P. aeruginosa практически равнялось lgN0. Аналогичные результаты бактерицидной активности получены для 1% раствора диоксидина, однако выявлено снижение его эффективности в отношении Е. coli и значимо низкое подавление роста MRSA.

Наименее эффективным оказался 5% раствор повиаргола, что, по-видимому, связано с отсутствием оптимального выхода активных ионов серебра в раствор вследствие образования оксидных пленок на поверхности, составляющего основу препарата диспергированного металлического серебра.

Сравнительная оценка биоцидной активности традиционных антисептиков и водных взвесей высокодисперсного (0<0,25 мм) модифицированного ММТ различной концентрации выявила значимую эффективность последних.

Таким образом, полученная форма модифицированного серебром монтмориллонита, является источником Ag+ и обладает выраженной антимикробной активностью. Для иммобилизации на раневые покрытия в качестве антимикробного компонента наиболее эффективным является использование А§-ММТ с дисперсностью частиц не более 0,25 мм и в минимальной концентрации 0,025 г/мл с пересчетом на массу матрицы-носителя и учетом ее сорбционной способности (набуханию) в водной среде.

Таблица 2

Показатели коэффициента редукции тест-штаммов микроорганизмов при применении водных взвесей Ag-MMT (О < 0,25 мм) и традиционных

антисептиков

Препарат Коэффициент редукции (Крея) в отношении соответствующего тест-штамма

Е. соН АТСС 25922 8. аигеиБ АТСС 29212 Р. аегидшоБа АТСС 27853 МИБА 474 ВПХ

Контроль 1йНо=8,87 Контроль 1й1Мо=9,38 Контроль 1яЫо=9,24 Контроль 1йН,=9,17

Диоксидин 1% 5,83 9,18 9,24 2,91

Катапол 0,5% 5,77 6,62 6,61 3,50

Повиаргол 5% 4,98 4,88 4,89 4,50

А§-ММТ 0,025 г/мл 6,32 7,34 7,58 6,98

А§-ММТ 0,05 г/мл 8,87 9,38 9,24 9,17

Антиоксидантная активность фуллеренола. Совместно с Е.В. Антоненковой изучено влияние 0,01%, 0,05% и 0,25% растворов фуллеренола (Сбо(ОН)п) на продукцию супероксидного аниона перитонеальными макрофагами. Результаты исследования свидетельствуют об антиоксидантной активности Сбо(ОН)п, возрастающей пропорционально уменьшению его концентрации в растворе.

Как видно из таблицы 3, показатели спонтанной хемилюминесценции макрофагов в присутствии 0,05% раствора Сбо(ОН)п снизились по сравнению с контролем в среднем на 1/3: до 62,43±5,98% (S) и до 68,51±17,34% (Атах), а после стимуляции зимозаном - на 5-10%: до 78,71±16,65% и 95,80±17,09% соответственно. При добавлении к клеткам 0,01% раствора Cf,o(OH)n их хемилюминесценция стала ещё менее интенсивной. Светосумма спонтанного свечения уменьшилась в среднем на 62% (до 37,47±5,53%), а его максимальная амплитуда - почти в 2 раза (до 49,87±14,73%). При той же концентрации препарата на фоне «кислородного взрыва» в среде стимулированных макрофагов, регистрируемые показатели снизились соответственно на 30% (до 67,39±15,94%) и на 17% (до 82,33±7,59%). В растворах с 0,25% содержанием С6о(ОН)„ хемилюминесцентные ответы достоверно не отличались от таковых в контроле.

Таблица 3

Влияние фуллеренола на люцигенинзависимую хемилюминесценцию

перитонеальных макрофагов (п=20)

Концентрация растворов фуллеренола XJIcn (п,=10) ХЛстим (п2=Ю)

S* Ашах S* Ашах

0,01% 37,47±5,53" 49,87±14,73" 67,39±15,94 82,33±7,59

0,05% 62,43±5,98" 68,51±17,34 78,71±16,65 95,80± 17,09

0,25% 106,33±19,16 85,26±15,93 89,41±19,01 119,84±15,57

Примечание: - в % от контроля (без препаратов), где величину данного показателя принимали за 100%; " - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем

На рисунке 3 представлены показатели интенсивности спонтанной и стимулированной зиманом люцигенинзависимой хемилюминесценции перитонеальных макрофагов под влиянием кластеров фуллерена С6о и С6о(ОН)„, используемых в эффективных концентрациях. Наиболее сильными ингибиторами свечения являются кластер Сбо/Tween 80 и Сбо(ОН)п. Данные препараты понижали уровень супероксида в пробе, по сравнению с контролем, в среднем на 60-70%.

Таким образом, установлено, что С6о(ОН)п наряду с другими водорастворимыми кластерами фуллерена С6о проявляет антиоксидантные свойства. Самый заметный антиоксидантный эффект определили при применении 0,01% раствора С6о(ОН)„, вызвавшего уменьшение спонтанной выработки «Ог макрофагами на 60%. Применение фуллеренола при раневом процессе будет способствовать стабилизации собственной системы антиоксидантной защиты, тормозить развитие свободнорадикального перекисного окисления липидов, клеточных и капиллярных мембран, предотвращая повреждение клеток и тканей, ограничивая распространение воспалительных изменений и вторичного некроза тканей, а за счет усиления фагоцитарной активности макрофагов, способствовать повышению неспецифического иммунитета.

ф

ss

5 ъ

3

■А

о

2 о

5

120

100

8«

60

40

t 20-

(уПВП C/lween80 сукрау.кфф СМ«Ж), 3% 0.05% 0,02% 0,01%

из ХЛсп

ХЛстим

Рисунок 3 - Сравнительный анализ интенсивности спонтанной и стимулированной люцигенинзависимой хемилюминесценции макрофагов под влиянием водорастворимых кластеров фуллерена С6о

Морфофункциональные изменения во внутренних органах животных при внутрибрюшинном введении водного раствора фуллеренола.

Общерезорбтивные свойства водного раствора С6о(ОН)п в сравнении с другими водорастворимыми кластерами фуллерена С6о были определены с помощью гистоморфологического исследования тканей 30 животных после внутрибрюшинного введения 1 мл их водных растворов. Животные были разделены на 3 группы: внутрибрюшинное введение препарата с выводом на 4-е и на 9-е сутки и без введения препаратов - контроль. При вскрытии животных опытных и контрольных групп отличий в макроскопической картине внутренних органов не обнаружено. Относительная масса органов во всех группах достоверных различий не имела.

По результатам исследования, установлено внутрибрюшинное введение 10%-го водного раствора С60(ОН)П не вызывает патологических изменений в тканях внутренних органов характерных в той или иной степени при введении водных кластеров фуллерена С60- Под действием внутрибрюшинного введения кластера фуллерена Сво/ПВП установлены дистрофические изменения тканей внутренних органов, сопровождающиеся нарушением микроциркуляции. Внугрибрюшинное введение кластера фуллерена Cso/Tween 80 вызывает сходные, хотя и менее выраженные, изменения. Аналогичные результаты при изучении общерезорбтивного действия водорастворимых кластеров фуллерена Q,o получены в исследованиях, выполненных Тюниным М.А. (2009) и Венгеровичем Н.Г. (2011).

Влияние внутрибрюшинного введения водного раствора фуллеренола на метаболические сдвиги и реакцию системы кроветворения. Для оценки состояния метаболических процессов и системы кроветворения в организме крыс после парентерального (внутрибрюшинного) введения 10%-го водного раствора С6о(ОН)п изучали изменение биохимических и клеточных показателей крови у 60 животных.

По результатам проведенных исследований не установлено достоверных различий рассматриваемых показателей между контролем и экспериментальными группами крыс, что говорит об отсутствии его патологического действия систему кроветворения и метаболизм испытуемых животных.

2. Патогенетическое обоснование иммобилизации комплекса нанопрепаратов при раневом процессе. На основании проведённых исследований, с целью комплексного воздействия на основные звенья патогенеза раневого процесса, а именно для коррекции процессов вторичной альтерации и развития раневой инфекции в первой фазе раневого процесса с патогенетических позиций обосновано применение комплекса антиоксидантного и антисептического препаратов.

Указанный комплекс включает в себя следующие компоненты на основе нанопрепаратов с лечебным биологическим действием:

- модифицированный серебром монтмориллонит (Ag-MMT) с дисперсностью частиц Б < 0,25 мм обладающего, за счет содержащихся в его структуре наноразмерных частиц серебра, антимикробным (бактерицидным и бактериостатическим) действием, а также выступающего в качестве наполнителя-модификатора полимерных матриц;

- водорастворимую форму фуллерена Сбо - фуллеренол (Сбо(ОН)п) в концентрации не более 0,01 %, с учетом разведения при набухании полимера и обильной раневой экссудации, обладающего антиоксидантной активностью.

Иммобилизация представленного комплекса биоактивных нанопрепаратов, по нашему мнению, за счет их синергетического действия, должно привести к потенцированию лечебного эффекта раневых покрытий, предотвращению осложненного течения раневого процесса и, как следствие, сокращению сроков заживления ран.

3. Разработка матриц биоактивных раневых покрытий

Синтез матриц раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы С1исоп-асе!оЬас1ег хуНпиэ. Синтез матриц раневых покрытий осуществляли в лабораторных условиях по стандартным методикам. Для оценки влияния массовой доли силикатного наполнителя на свойства композитных матриц введение ММТ в их состав осуществляли в различных концентрациях.

Исследование сорбционной способности разработанных матриц раневых покрытий и экстракции антимикробного компонента в лабораторных условиях. Раневой экссудат представляет собой коллоидный раствор компонентов плазмы (белков, электролитов), фрагментов клеток крови, раневой микрофлоры и некротизированных тканей. Для изучения сорбционной

способности разработанных матриц по отношению к раневому экссудату использованы моделирующие официнальные растворы.

По результатам исследования установлено, что введение силикатного наполнителя в состав композитных полимерных матриц на основе акриламидного гидрогеля и ДЦОХ значительно увеличивает сорбционную способность последних (таблица 4).

Увеличение сорбционной способности разработанных матриц пропорционально увеличению концентрации наполнителя. Набухание ГНК, содержащего 30 мас.% силикатного наполнителя более чем в 6 раз превосходит таковое для чистого гидрогелевого полимера. При анализе кинетики набухания ГНК в дистиллированной воде установлено, что наибольшая скорость абсорбции отмечается первые 10-12 часов. В дальнейшем набухания полимера практически не происходит.

Изучение возможности абсорбции разработанными композитными матрицами крупномолекулярных компонентов раневого экссудата, в частности альбумина, показало снижение концентрации последнего в растворе на 50— 100% для ГНК, на 10-70% для композитов на основе ДЦОХ. Уровень снижения концентрации зависел от доли силикатного наполнителя и времени экспозиции полимера в растворе.

Таблица 4

Сравнительная оценка сорбционной способности матриц раневых покрытий

на основе ДЦОХ и акриламидного гидрогеля (г/г; Х±о; п=40)

полимера Адсорбируемые"^^ вещества ДЦОХ (п,=10) Композит ДЦ6Х+ Ag-MMT (П2=Ю) Акриламидный гидрогель (п3=10) - ГНК (Ag-MMT 5 мас.%) (п4=10)

Дистиллированная вода 0,55±0,02 8,3±0,15 187,39±1,45 267,55±1,04

Физиологический раствор 0,26±0,01 6,0±0,23 73,02±0,43 96,23±0,76

5% раствор глюкозы 0,16±0,03 7,0±0,44 95,04±1,15 143,79±0,34

«Аминоплазмаль Гепа» 0,12±0,03 5,1±0,76 40,11±1,32 136,57±1,76

«Гемохес» 0,14±0,01 2,45±0,01 20,56±0,34 112,87±0,32

«Гелофузин» 0,25±0,02 1,0±0,02 25,43±0,56 104,07±1,33

10% раствор альбумина 0,75±0,24 3,8±0,04 10,9±0,23 127,43±0,45

При анализе кинетики выхода (экстракции) ионов серебра установлено, что при погружении монтмориллонит содержащих матриц раневых покрытий в раствор дистиллированной воды происходит выход Ag+ в минимальных количествах (от 7 до 54 ммоль/л). Концентрация выходящего ионизированного серебра напрямую зависит от исходного содержания монтмориллонита в матрице, а также от ее сорбционной способности.

4. Исследование биосовместимости разработанных матриц раневых покрытий в эксперименте на животных. Биосовместимость разработанных матриц раневых покрытий изучена экспериментально на 40 моделях кожно-плоскостных условно асептических ран. В послеоперационном периоде клинических признаков воспалительно-дегенеративных изменений в ранах не отмечено. Гидрогелевое и сетчатое покрытия активно поглощали раневое отделяемое, при этом пересыхания раневой поверхности не отмечено.

По данным гистоморфологического исследования выявлена классическая картина неосложненного регенеративного процесса, что позволило сделать вывод о биосовместимости и биоинертности разработанных матриц раневых покрытий. Раневые покрытия на основе ГНК и ДЦвХ в эксперименте на животных нетоксичны, не оказывают местно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия, обладают эластичностью, высокой степенью моделирования на ране, не фрагментируются, что облегчает уход за раной.

5. Экспериментальное изучение эффективности местного применения биоактивных раневых покрытий

Сравнительная оценка антимикробного действия разработанных биоактивных раневых покрытий и коммерческих аналогов. Для определения способности покрытий на основе ГНК и ДЦвХ подавлять рост бактериальной флоры на границе контакта с раневой поверхностью установлены показатели их бактериостатического действия, а также минимальная ингибирующая концентрация (МИК) Ag-MMT в составе полимерных матриц.

Значения МИК Ag-MMT в составе матриц раневых покрытий на основе ГНК и ДЦйХ, воздействующей на референтные щтаммы микроорганизмов установили на уровне 1 масс.% и 0,1 масс.% соответственно. Подавление роста госпитальных штаммов отмечено при минимальном содержании Ag-MMT в ГНК 2 масс.%, в ДЦйХ ОД масс.%. Полученные данные учтены при определении концентраций Ag-MMT при его иммобилизации в составе антимикробного компонента биоактивных раневых покрытий.

По результатам оценки способности разработанных матриц подавлять рост раневой микрофлоры установлено значимое снижение уровня бактериальной обсемененности инфицированных ран, а также возможность сравнительно длительного его поддержания ниже критического уровня (Ю3КОЕ) за счет пролонгированного антимикробного действия. Эффективное подавление раневой инфекции, являющейся ведущим патогенетическим звеном осложненного течения раневого процесса, должно способствовать сокращению сроков заживления ран.

Таким образом, можно сделать вывод, что иммобилизация Ag-MMT в качестве антимикробного компонента матриц биоактивных раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита в минимальной концентрации 2 мас.% и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus - 0,2 мас.% позволяет получать значимый бактериостатический эффект in vitro, и поддерживать уровень бактериального обсеменения раны ниже Ю3(КОЕ) на протяжении 5-7 суток in vivo.

Оценка эффективности местного применения разработанных биоактивных раневых покрытий при раневом процессе. В экспериментах для местного лечения ран использовали биоактивные раневые покрытия, содержащие комплекс нанопрепаратов, в концентрациях, обладающих эффективным лечебным действием с учетом их разведения при набухании матриц (таблица 5).

Таблица 5

Наименование компонента Содержание биоактивных компонентов, мас.%

ГНК ДЦОХ

АЙ-ММТ 2-5 0,2-1,0

Фуллеренол 1-2 0,01-0,02

Полимер остальное

Эффективность местного применения разработанных раневых покрытий оценивали на модели инфицированных кожно-плоскостных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов. Критериями оценки эффективности служили скорость заживления, сроки полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 5, 10, 15 и 20-е сутки. Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом. Результаты планиметрического исследования представлены в таблицах 6 и 7.

Сопоставление и статистическая обработка данных планиметрического исследования заживления гранулирующих ран после глубоких ожогов (таблица 6) показали, что темпы сокращения размеров ран в опытных сериях с применением разработанных раневых биоактивных покрытый заметно выше, чем в контрольной. Динамика уменьшения площади раневого дефекта к исходной в контрольной группе на 5-е сутки составила - 20,8%, на 10-е сутки -42,3%, на 15-е сутки - 68,1%, а срок полного заживления ран -20 суток. В опытной серии с применением раневого покрытия на основе ДЦОХ эти показатели составили: на 5-е сутки - 26,3%, на 10-е сутки - 59,7%, на 15-е сутки - 93,4%, срок полного заживления ран — 17 суток. Наиболее ранний срок полного заживления гранулирующих ран после глубоких ожогов - 16 суток, установлен при применении раневого покрытия на основе ГНК. В указанной опытной группе отмечены также наиболее высокие показатели скорости заживления ран.

При изучении данных планиметрического исследования заживления инфицированных кожно-плоскостных ран (таблица 7) также установлены более высокие темпы сокращения размеров ран в опытных сериях в сравнение с контрольной. Динамика уменьшения площади раневого дефекта к исходной в контрольной группе на 5-е сутки составила -29,4%, на 10-е сутки — 58,2%, на 15-е сутки — 95,3%, а срок полного заживления ран — 16 суток. В опытных сериях с применением раневых покрытий на основе ГНК и ДЦОХ сроки полного заживления ран составили 13 и 12 суток соответственно.

Оценка показателей скорости заживления ран выявила, что интенсификация течения раневого процесса на фоне применения разработанных биоактивных раневых покрытий отмечалась на протяжении всего времени их применения. Указанная закономерность характерна как при местном лечении инфицированных кожно-плоскостных ран, так и гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Таблица 6

Показатели планиметрического исследования гранулирующих ран после глубоких ожогов на фоне применения разработанных раневых покрытий, % __ (Х±о; п-60)_

Срок наблюдения Контроль (п,=20) Опыт

ГНК (п2=20) ДЦвХ (п3=20)

1 2 1 2 1 2

5 сутки 20,8±1,1 4,2±0,2 27,4±0,8* 5,5±0,Г 26,3±1,2* 5,3±0,2*

10 сутки 42,3±2,1 4,2±0,1 63,2±1,3* 6,3±0,3* 59,7±1,4* 5,9±0,4*

15 сутки 68,1±1,3 4,5±0,3 98,7±0,б" 6,6±0,6* 93,4±0,3* 6,2±0,3"

20 сутки 99,3±0,3 4,9±0,2 - - - -

Срок заживления 20,0±0,4 15,8±0,7* 17,0 ±0,4

Таблица 7

Показатели планиметрического исследования инфицированных кожно-плоскостных ран на фоне применения разработанных раневых покрытий, % __(Х±о; п=60)_

Срок наблюдения Контроль (п,=20) Опыт

ГНК (п2=20) ДЦйХ (пз=20)

1 2 " 1 2 1 2

5 сутки 29,4±1,4 5,8±0,4 43,4±0,2* 8,7±0,3* 46,2±1,4* 9,2±0,3*

10 сутки 58,2±0,4 5,8±0,6 89,5±2,1" 8,9±0,5* 94,3±0,4* 9,4±0,2'

15 сутки 95,3±0,3 6,3±0,3 - - - -

20 сутки _

Срок заживления 16,0±0,4 13,4±0,3* 12,0±0,6

Примечание к таблицам 6 и 7:

1 - уменьшение площади раневой поверхности в процентном отношении к начальным размерам раны

2 - скорость заживления (%/день)

* - различия с контролем достоверны при р<0,05

По результатам гистоморфологического исследований установлено, что при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов, характеризующихся интенсивной экссудацией, более эффективным оказалось биоактивное раневое

покрытие на основе гидрогелевого нанокомпозита (рисунок 4). При его применении сокращение сроков заживления ран составило около 22%, при применении покрытий на основе ДЦвХ — 17%.

Рисунок 4 - Общий вид гранулирующих ран после глубоких ожогов на 15 сутки после некрэктомии: А - контрольная группа, Б - опытная группа с

применением раневого покрытия на основе ГНК, В - опытная группа с применением раневого покрытия на основе ДЦОХ

При изучении эффективности разработанных раневых покрытий для лечения инфицированных кожно-плоскостных ран установлено, что при применении сетчатого покрытия на основе ДЦОХ сокращении сроков заживления составило 25%, покрытия на основе ГНК - 16%.

Подводя общий итог проведенного экспериментального исследования эффективности биоактивных раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита (ГНК) и дезинтегрированной целлюлозы в. хуНпив (ДЦОХ), необходимо отметить, что разработанные средства местного лечения ран, обладающие сорбционной, антимикробной, и антиоксидантной активностью, способны оказывать комплексное оптимизирующее воздействие на раневой процесс, предотвращая его осложнённое течение.

Экспериментальные исследования эффективности разработанных биоактивных раневых покрытий показали, что их местное применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов и инфицированных кожно-плоскостных ран в среднем на 20%.

ВЫВОДЫ

1. Изучение в лабораторных условиях химического состава и морфологии модифицированного серебром монтмориллонита позволило визуализировать, образующиеся в результате катионного обмена, наночастицы серебра кубической, призматической и сфероидной формы размерами от 20 до 70 нм, локализующиеся в межслоевом пространстве и на поверхности алюмосиликата. Оценка антимикробной активности модифицированного серебром монтмориллонита выявила значимое в сравнении с традиционными антисептиками (диоксидином, катаполом, повиарголом) биоцидное действие его высокодисперсной (0<0,25 мм) водной взвеси в отношении референтных и госпитальных штаммов микроорганизмов, при оптимальной концентрации от 0,05 г/мл.

2. Экспериментальное изучение супероксиданионпродуцирующей активности тканевых макрофагов позволило определить антиоксидантные свойства фуллеренола, максимально выраженные в его 0,01%-м водном растворе. При исследовании общерезорбтивного действия не установлено морфофункциональных изменений тканей внутренних органов, метаболических сдвигов и реакции системы кроветворения экспериментальных животных после парентерального (внутрибрюшинного) введения водного раствора фуллеренола, что позволило сделать вывод об отсутствии его острой токсичности.

3.По результатам полученных данных о биологических свойствах нанопрепаратов сформулировано патогенетическое обоснование местного применения модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена С6о (фуллеренола) в качестве антимикробного и антиоксидантного компонентов лечебного комплекса биоактивных раневых покрытий.

4.На основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus разработаны матрицы раневых покрытий обладающие сорбционной способностью по отношению к компонентам раневого экссудата. Дозированный характер антимикробного действия разработанных матриц, обусловлен экстракцией активных ионов серебра при набухании полимеров в минимальных количествах (от 7 до 54 ммоль/л), что позволяет заключить об отсутствии цитотоксического эффекта на рану. Биосовместимость и биоинертность разработанных матриц установлены по результатам макроскопической оценки и гистоморфологического исследования после их аппликации на модели кожно-плоскостных условно асептических ран.

5. Биоактивные раневые покрытия на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinum с иммобилизованными в их составе биоактивными компонентами, обладают антиоксидантным и пролонгированным антимикробным действием, проявляют значимый, в сравнении с коммерческими аналогами, бактериостатический эффект in vitro и позволяют поддерживать уровень бактериального обсеменения раны ниже Ю3(КОЕ) на протяжении 5-7 суток in vivo. Разработанные раневые покрытия являются эффективным средством местного лечения инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран после глубоких ожогов, применение которых предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран в среднем на 20%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Природный слоистый силикат монтмориллонит, являясь специфическим нанореактором, позволяет получать наноразмерные частицы металлов, в частности, серебра. В отличие от существующих физических и химических методов, требующих использования дорогостоящих реактивов и специальных технологических условий, в основе представленного в работе способа лежит, протекающий в межпакетном пространстве монтмориллонита процесс катионного обмена. Указанный способ может быть использован для синтеза и

дальнейшего изучения биологических свойств наночастиц металлов в свете их медицинского применения.

2. Высокодисперсная водная взвесь модифицированного серебром монтмориллонита обладает значимым в сравнении с традиционными антисептиками бактерицидным действием при оптимальной концентрации 0,05 г/мл, что позволяет рекомендовать его в качестве антимикробного препарата для профилактики и борьбы с раневой инфекцией, в том числе в качестве антимикробного компонента биоактивных раневых покрытий.

3. Иммобилизация монтмориллонита (нативного и модифицированного серебром) в качестве наполнителя-модификатора полимерных матриц раневых покрытий позволяет значимо улучшить их механические свойства (прочности на разрыв, относительного удлинения) и сорбционную способность по отношению к компонентам раневого экссудата.

4. Местное применение фуллеренола в качестве антиоксидантного препарата в виде 0,01%-го водного раствора или иммобилизованного на матрице биоактивного раневого покрытия предупреждает формирование вторичной альтерации, возникающей в результате активации свободнорадикальных процессов и развития окислительного стресса в воспалительной фазе раневого процесса, предотвращает увеличение объема повреждения за счет вторичнонекротизированных тканей и обеспечивает стимулирующее влияние на раневое заживление.

5. Для фармакокоррекции процессов вторичной альтерации в воспалительной фазе раневого процесса с патогенетических позиций целесообразно рекомендовать совместное применение биоактивных нанопрепаратов - модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена Сг,о (фуллеренола), обладающих антиоксидантной и антимикробной активностью, синергетическое действие которых на основные факторы осложненного течение раневого процесса позволит сократить сроки заживления ран.

6. Биоактивные раневые покрытия на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы в. хуНпшп с иммобилизованными в их составе нанопрепаратами, обеспечивающими антиоксидантное и пролонгированное антимикробное действие, могут быть использованы при оказании медицинской помощи на догоспитальном и госпитальном этапах для местного лечения неогнестрельных и огнестрельных ран, ран при тяжелой механической травме, неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных и длительно незаживающих, гранулирующих ран после глубоких термических ожогов, в комплексном лечении трофических язв и пролежней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Касанов, К.Н. Применение сорбентов в медицине / К.Н. Касанов // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 231-232.

2. Касанов, К.Н. Применение сорбционных материалов при иммунных патологиях / К.Н. Касанов // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2009.-С. 230-231.

3. Венгерович, Н.Г. Патофизиологическое обоснование сорбции комплекса лекарственных препаратов бактериальной целлюлозы / Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конференции «XXXVIII неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2009. - С. 35-36.

4. Касанов, К.Н. Разработка монтмориллонит-содержащей матрицы раневого покрытия на основе акрилового гидрогеля / К.Н. Касанов, В.А. Попов,

A.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXVIII неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2009. - С. 36-37.

5. Венгерович, Н.Г. Нанобиотехнологии оптимизации раневого процесса / Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, В.А. Андреев, В.А. Попов, А.К. Хрипунов // Материалы межд. научно-практической конф. «XXXIX неделя науки СПбГПУ». - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2010. - С. 43^15.

6. Попов, В.А. Вклад отечественных хирургов и патофизиологов в учение об огнестрельной ране: от Н.И. Пирогова до настоящего времени /

B.А. Попов, Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов // Труды научной конференции с международным участием, посвященная 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова: прошлое, настоящее, будущее — СПб.: ВМедА, 2010. — С. 87.

7. Венгерович, Н.Г. Антимикробная активность наночастиц металлов / Н.Г. Венгерович, В. А. Андреев, В.А. Попов, К.Н. Касанов, А.К. Хрипунов // Материалы Всероссийского форума «Изобретатели и инновационная политика России» ». - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2011. -

C. 255-256.

8. Касанов, К.Н. Антимикробная активность нано-гель-пленок целлюлозы Gluconacetobacter xylinus с серебром / К.Н. Касанов, А.К. Хрипунов, В.А. Андреев, Р.А. Евсеев, В.А. Попов // Материалы международной научно-практической конференции «XVI Неделя науки СПбГПУ» - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2011. - С. 42^14.

9. Касанов, К.Н. Исследование влияния гепарина и комплекса фуллерен С6о/ТВИН-80 на патогенез системной воспалительной реакции в эксперименте у крыс / К.Н. Касанов, Р.А. Евсеев, В.А. Попов // Материалы международной научно-практической конференции «XVI Неделя науки СПбГПУ» - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2011. - С. 46-47.

10. Касанов, К.Н. Разработка монтмориллонит содержащей матрицы биоактивного сорбирующего раневого покрытия / К.Н. Касанов, В.А. Попов, М. В. Успенская, В.А. Соловьев, Д.Н. Макин, А.И. Везенцев, Н.Ф. Пономарева, В.М. Мухин // Научные ведомости Белгородского государственного университета - 2011, - № 3 (98), вып. 14. - С. 168-178.

11. Khripunov, А.К. Gluconacetobacter xylinus cellulose as a perspective material for nanobiotechnology / A.K. Khripunov, R.Y. Smyslov, A.V. Severin, T.N.

Nekrasova, A.A. Tkachenko, N.G. Vengerovich, V.A. Andreev, E.V. Antonenkova, V.B. Zaitseva, K.N. Kasanov, V.A. Popov // Molecular Mobility and Order in Polymer Systems - Book of abstracts 7th International Symposium, - SPb, 2011. - P. 185.

12. Евсеев, P.A. Исследование влияния комплекса фуллерен С6о/ТВИН-80 на функциональное состояние печени у крыс / P.A. Евсеев, К.Н. Касанов, Е.В. Антоненкова, В.А. Попов // Материалы международной научно-практической конференции «XVI Неделя науки СПбГПУ» - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2011. — С. 48.

13. Андреев, В.А. Антибактериальная активность традиционных и наноантисептиков, перспектива их абсорбции на раневых покрытиях В.А. Андреев, В.А. Попов, А.К. Хрипунов, Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, В.Б. Сбойчаков // Вестник Российской Военно-медицинской академии — 2012, -№ 3 (39). - С. 168-173.

14. Касанов, К.Н. Гидрогелевая матрица раневого покрытия с пролонгированным антимикробным действием / К.Н. Касанов, В.А.Попов, М.В. Успенская, Ю.А. Игнатьева, P.A. Евсеев, В.А. Андреев // Материалы VIII Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» — СПб, 2012. - С.46.

15. Касанов, К.Н. Разработка матрицы раневого покрытия на основе слоистого нанокомпозита / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2012. - С. 252-253.

16. Наноантисептики в кн. Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации / под ред. В.А. Попова. - Спб.: СпецЛит, 2013. - С. 139-154

17. Сорбенты и биоактивные раневые покрытия в кн. Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации / под ред. В.А. Попова. - Спб.: СпецЛит, 2013.-С. 155-165.

18. Касанов, К.Н. Argentum nanoparticles: получение и иммобилизация в матрице антимикробных раневых покрытий / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. - С. 49.

19. Касанов, К.Н. Оценка антимикробной активности модифицированного серебром монтмориллонита / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. - С. 49-50.

20. Касанов, К.Н. Сравнительная оценка биологической активности водорастворимых форм кластеров фуллерена С6о и фуллеренола / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. - С. 50—51.

21. Касанов, К.Н. Вульнеросорбция как патогенетически обоснованный метод местного лечения ран различной этиологии / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. — СПб.: ВМедА, 2013. - С. 214—215.

22. Касанов, К.Н. Изучение влияния парентерального (внутрибрюшинного) введения водорастворимой формы фуллерена С6о (фуллеренола) на систему кроветворения у крыс / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. - С. 215.

23. Касанов, К.Н. Метаболические сдвиги у крыс при парентеральном (внутрибрюшинном) введении водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола) / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. -СПб.: ВМедА, 2013. - С. 216.

24. Касанов, К.Н. Патогенетическое обоснование иммобилизации комплекса нанобиопрепаратов на биоактивные раневые покрытия / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. -С. 216.

25. Касанов, К.Н. Современные биоактивные раневые покрытия: патофизиологическая классификация / К.Н. Касанов, P.A. Евсеев // Сборник научных работ итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии. - СПб.: ВМедА, 2013. - С. 217.

26. Касанов, К.Н. Получение новых полимерных нанокомпозитов для медицины / К.Н. Касанов, В.А.Попов, М.В. Успенская, Ю.А. Игнатьева // Сборник тезисов докладов конгресса молодых ученых, Выпуск 2. Труды молодых ученых. - СПб, 2012. - С.329.

27. Касанов, К.Н. Модифицированный серебром монтмориллонит: получение, антимикробная активность и медицинское применение в биоактивных раневых покрытиях / К.Н. Касанов, В.А. Попов, М. В. Успенская, Ю.А. Игнатьева, В.А. Везенцев, Н.Ф. Пономарева, В.М. Мухин // Научные ведомости Белгородского государственного университета -2013, № 18 (161), вып. 23. - С. 172-182.

28. Касанов, К.Н. Композитные матрицы раневых покрытий на основе дезинтегрированной целлюлозы Gluconacetobacter xylinus. Материалы I Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia) с международным участием. - Москва, 8-12 сентября 2013 - С. 258.

29. Цыган, В.Н. Патогенетическое обоснование применения биоактивных раневых покрытий на догоспитальном этапе медицинской помощи / В.Н. Цыган, В.И. Бадалов, К.Н. Касанов, A.B. Денисов, Р.А Евсеев II Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2013, №4. - С. 74-78.

30. Разработка на основе нанобиокомпонентов биоактивного раневого покрытия для лечения огнестрельных ран в лечебно-профилактических учреждениях Министерства обороны РФ: отчет о НИР / Касанов К.Н. с соавт. -СПб: ВМедА, 2013. - 1 Юс.

Список изобретений:

1. Пат. № 2437681 Российская Федерация, МПК A61L15/00. Раневое покрытие с лечебным действием / В.А. Попов, Н.Г. Венгерович, К.Н. Касанов, Д.Н. Макин и др.; опубл. 09.08.2010, Бюл. № 32.

2. Заявка на получение патента на изобретение, приоритетная справка №2013145823 от, МПК A61L 15/28, A61L 15/40. Сетчатое биоактивное раневое покрытие / К.Н. Касанов, В.А. Попов, Р.А. Евсеев и др.; опубл. 15.10.2013.

3. Заявка на получение патента на изобретение, приоритетная справка №2013149052, МПК A61L 15/22, A61L 15/40. Биоактивное гидрогелевое раневое покрытие / К.Н. Касанов, В.А. Попов, Р.А. Евсеев и др.; опубл. 06.11.2013.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БелГУ - Белгородский государственный национальный исследовательский университет

ГНК - гидрогелевый нанокомпозит

ДЦОХ - дезинтегрированная (бактериальная) целлюлоза Gluconacetobacter xylinus

ИВС РАН - Институт Высокомолекулярных Соединений Российской академии наук

Кред - коэффициент редукции

КОЕ - колониеобразующая единица

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МО РФ - Министерство обороны Российской Федерации

ПВП- N-поливинилпирролидон

РАМН - Российская академия медицинских наук

РФС - рентгенофлуоресцентная спектроскопия

СПбИТМО — Санкт-Петербургский национальный исследовательский

университет информационных технологий, механики и оптики

XJIcn - спонтанная хемилюминесценция

ХЛстим - стимулированная хемилюминесценция

Ag-MMT - модифицированный серебром монтмориллонит

AgNPs - ArgentumNanoParticles, наночастицы серебра

АТСС - American Type Cultures Collection

Сбо/ПВП - комплекс фуллерена С6о с N-поливинилпирролидоном Сбо(ОН)„ - фуллеренол

Ceo/Tween 80 - комплекс фуллерена См) с полисорбатом 80 (Твин 80) EDS - Energy-dispersive spectroscopy, энергодисперсионная спектроскопия ММТ - монтмориллонит

Na-Ca-MMT - натрий-кальциевый (нативный) монтмориллонит

MRSA - Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, метициллин-устойчивые

штаммы золотистого стафилококка

Подписано в печать 20.11.13 Формат 60х84'/]б Цифровая Печ. л. 1.5 Тираж 100 Заказ 39/11 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)