Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Патогенетическое обоснование иммуноцитохимического исследования хеликобактера в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом

На правах рукописи

ООоОиооэ.

А

// Мазурова

Янина Яновна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ХЕЛИКОБАКТЕРА В РОТОВОЙ ПОЛОСТИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 ДЕК 2011

Санкт-Петербург - 2011

005006391

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России

Научные руководители: доктор биологических наук профессор

КРАВЦОВ Вячеслав Юрьевич доктор медицинских наук КОБИАШВИЛИ Малхаз Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

ЖИРКОВ Анатолий Михайлович доктор медицинских наук профессор ВОЙТИЦКИЙ Анатолий Николаевич

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится «28» декабря 2011 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан ноября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. К настоящему времени установлено, что между воспалительными поражениями полости рта и заболеваниями внутренних органов желудочно-кишечного тракта существуют определенные патогенетические связи. По данным ряда исследователей хронический генерализованный пародонтит часто сочетается с кислотозависимыми заболеваниями желудка (Ни W. et al., 2002; Anand P.S et al., 2006; Островская Л.Ю., 2008;), хотя высказываются и противоположные мнения (Czesnikiewicz-Guzik М. et al., 2005). Вместе с тем, патофизиологический механизм связи между этими двумя заболеваниями окончательно не установлен.

Одним из главных этиологических и патогенетических факторов в развитии кислотозависимых заболеваний верхних отделов ЖКТ бесспорно является хеликобактерная инфекция. С другой стороны, ведущим фактором в развитие пародонтита является агрессия в ротовой полости в основном грамотрицательной микрофлоры, к которой относится и Helicobacter pylori{HP). Таким образом, вполне допустимо предполагать, что связь между пародонтитом и кислотозависимыми заболеваниями, ассоциированными с хеликобактериозом, может быть опосредована самим хеликобактером.

Колонизация слизистой оболочки желудка вегетирующими бактериальными клетками HP играет существенную роль в развитии заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки. Вместе с тем хеликобактер обнаруживается не только в желудке, но и в других отделах ЖКТ. Многочисленными исследованиями, выполненными генодиагностическим, культуральным, уреазным и бактериоскопическим методами показано присутствие хеликобактера в ротовой полости (Ogunbodede Е. et al., 2002; Nasrolahei М. et al., 2003; Umeda M. et al., 2003; Al-Hawajri A. et al., 2004; Czesnikiewicz-Guzik M. et al., 2005; Chisazi M. et al., 2006;). Ротовая полость рассматривается как ворота и естественный резервуар хеликобактерной инфекции (Honda К. et al., 2001; Al-Hawajri A. et al., 2004; Chumpitaz С. et al., 2006).

К настоящему времени выполнены обследования пациентов с НР-ассоциированными кислотозависимыми заболеваниями на предмет сопутствующих у них заболеваний пародонта. Показано, что для пациентов с кислотозависимыми заболеваниями и с сопутствующими заболеваниями пародонта эрадикационная антихеликобактерная терапия должна быть пролонгирована и дополнена санацией ротовой полости (Островская Л.Ю., 2008). Неэффективная эрадикация может быть связана с реинфицированием хеликобактером, сохранившимся в ротовой полости (Gebara et al., 2006). Таким образом, практически востребованными становятся методы выявления хеликобактера в ротовой полости, которые поспособствуют оптимизации курса антихеликобактерной терапии, а также позволят прогнозировать эффективность эрадикации.

Наиболее оптимальным и самым применяемым для выявления хеликобактера в ротовой полости в настоящее время считается метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) (Теошап et al., 2007), а сведения о прямых бактериоскопических наблюдениях хеликобактера в ротовой полости крайне скудны. Бактериальные клетки хеликобактера в ротовой полости можно визуализировать с помощью специфических к клеточной стенки антигенам. На этом принципе основан иммуноцитохимический метод, с помощью которого можно выявлять и спиралевидные, и кокковые формы хеликобактера (Ashton-Кау М. et al., 1996)

Установлено, что хеликобактер проявляет кокко-бациллярный диморфизм в результате трансформации из бациллярных (спиралевидных) форм в кокковые и наоборот (Benaissa М. et al., 1996; She F. et al., 2003). Вместе с тем, вопросы о том, в каком виде (бациллярном или кокковом) хеликобактер находятся в ротовой полости, а также возможно ли обсеменение слизистой оболочки ротовой полости спиралевидными формами хеликобактера, как это имеет место при хеликобактериозах в слизистой оболочке желудка остаются открытыми.

Несмотря на усилившийся в последние годы интерес к исследованиям пародонта у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями, обратно направленные исследования пациентов с основным диагнозом хронический генерализованный пародонтит, на предмет сопутствующих у них НР-ассоциированных кислотозависимых заболеваний практически не проводились.

Патогенная активность бактериальной флоры в ротовой полости при пародонтите во многом может зависеть от факторов местного иммунитета. Одним из таких ключевых факторов является провоспалительный цитокин интерлейкин-ip. Установлено, что интерлейкин-lp в ротовой полости имеет широко направленные биологические активности, включая регуляцию пролиферации фибробластов, усиление иммунного ответа и стимуляцию костной резорбции, что имеет самое прямое отношение к патогенезу заболеваний пародонта (Jandinski J. et al., 1991).

Цель исследования. Определить диагностическую значимость иммуноцитохимического исследования хеликобактера в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом.

Задачи исследования:

1. Определить частоты встречаемости хеликобактера в слизистой оболочке желудка и в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом. Оценить патофизиологическую взаимосвязь между пародонтитом и HP-ассоциированными кислотозависимыми заболеваниями желудка, посредником которой является хеликобактер

2. С учетом бациллярно-кокковой трансформации определить варианты обсемененности ротовой полости спиралевидными и кокковыми формами

хеликобактера при хроническом генерализованном пародонтите и при НР-ассоциированных кислотозависимымых заболеваний.

3. Определить диагностическую значимость (чувствительность, специфичность и эффективность) неинвазивного иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера в ротовой полости.

4. Определить патогенетическую роль интерлейкина-1р у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом, ассоциированным с хеликобактерной инфекцией.

Научная новизна.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование хеликобактера одновременно в ротовой полости и в желудке. Показано, что пациенты с пародонтитом характеризуются повышенной частотой обнаружения хеликобактера в ротовой полости.

Впервые определены чувствительность и специфичность неинвазивного иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера в ротовой полости.

Впервые продемонстрирована колонизация слизистой ротовой полости спиралевидными бактериальными клетками хеликобактера.

Впервые проведенных иммуноцитохимических исследований в мазках с поверхности зубодесневой бороздки установлен резко повышенный уровень интерлейкина-1р в эпителии десен при хроническом генерализованном пародонтите.

Показано, что при хроническом генерализованном пародонтите колонизация слизистой зубодесневой бороздки спиралевидными формами хеликобактера сопровождается повышением уровня интерлейкина-1р в эпителии десен.

Теоретическая и практическая значимость.

Проведенные иммуноцитохимические исследования указывают на принадлежность хеликобактера к группе «пародонтогенных микробных агрессоров». Ротовая полость может быть первым местом колонизации хеликобактера, а лишь затем инфицируется слизистая оболочка желудка. Теоретически значимым представляется обнаружение орального варианта хеликобактериоза.

Обоснованы рекомендации по использованию иммуноцитохимического метода в мазках слизистых ротовой полости для определения хеликобактера и уровня цитокинов при заболеваниях пародонта. Такое исследование можно проводить параллельно с цитологическими диагностическими тестами без ограничения сроков пробоподготовки.

При лечении тяжелых хронических генерализованных пародонтитов, с присутствием хеликобактера в ротовой полости обосновано проведение фиброгастродуоденоскопического исследования с взятием гастробиоптатов. В случае обнаружения в них хеликобактера показано проведение сочетанной

антихеликобактерной эрадикационной терапии в сочетании с лечением тяжелого генерализованного пародонтита.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неинвазивный иммуноцитохимический метод выявления хеликобактера в ротовой полости обладает высокой диагностической эффективностью. В слизистой оболочке желудка спиралевидные формы хеликобактера в значительной степени преобладают над кокковыми формами, в то время как в ротовой полости значительно чаще обнаруживаются кокковые формы хеликобактера.

2. У пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом хеликобактер в ротовой полости встречается чаще, чем у клинически здоровых лиц и у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями. Однако пациенты с хроническим пародонтитом и пациенты с кислотозависимыми заболеваниями не различаются по частоте выявления у них в слизистой оболочке желудка спиралевидных и кокковых форм хеликобактера.

3. С помощью иммуноцитохимического метода выявляется резко повышенный уровень содержания интерлейкина-lß в эпителии десен у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом. При хроническом генерализованном пародонтите уровень интерлейкина-lß в эпителии десен зависит от присутствия хеликобактеров спиралевидных форм.

Личный вклад автора. Автором составлен дизайн исследования и лично проведен сбор материалов для лабораторных исследований от 180 больных с хроническим генерализованным пародонтитом и с кислотозависими заболеваниями. Автором самостоятельно выполнены иммуноцитохимические исследования интерлейкина-lß и значительная часть иммуноцитохимического исследования хеликобактера в ротовой полости, проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы клинической цитоморфологии» (Санкт-Петербург, 2007), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения пародонта» (Санкт-Петербург, 2009), на 10-м Юбилейном СлавяноБалтийском форуме «Гастро-2008» (С.-Петербург, 2008), на 2-м Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (С.-Петербург, 1-4 июля) и на 4th Medical Biotech Forum (International Experts Symposium (Dalian, China, 2009), на международной научно-практической конференции «Многопрофильная клиника XXI века: передовые

медицинские технологии», посвященной 20-летию ФГБУ ВЦЭРМ им. A.M. Никифорова МЧС России (С.-Петербург, 2011), на научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва. 2011), на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы челюстно-лицевой хирургии и стоматологии» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 10 научных работ, из них 3 - публикации (статьи) в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобразования и науки РФ, и 7 тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 116 источников, из них 25 — отечественных и 91 — зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Изначально был использован целенаправленный отбор больных, проходивших лечение в ряде клиник г. Санк-Петербурга и здоровых доноров в период с 2004 — 2010 гг. Всего было обследовано 236 человек. Иммуноцитохимические исследования хеликтобактера проводили в трех группах пациентов. Группу 1 составили 61 человек с диагнозом хронический генерализованный пародонтит (с глубиной десневого кармана более 4 мм, абсцедирующей формой пародонтита и третьей степенью подвижности зубов). Пациенты этой группы были обследованы иммуноцитохимическим методом на предмет хеликобактера в гастробиоптатах антралыюго отдела желудка и в эксфолиатах (соскобах) с поверхности зубодесневой бороздки, а также у них были проведены иммуноцитохимические исследования интерлейкина-1(3 в слизистой ротовой полости. Группу 2 составили 70 человек с различными вариантами течения хронического гастрита. Пациенты Группы 2 были обследованы иммуноцитохимическим методом на предмет хеликобактера в гастробиоптатах антралыюго отдела желудка и в соскобах с поверхности зубодесневой бороздки. Группу 3 составили 105 лиц без заболевания пародонта. Эта группа была обследована иммуноцитохимическим методом на предмет хеликобактера и интерлейкина-ip в соскобах с поверхности зубодесневой бороздки.

Цитологические мазки из ротовой полости получали с поверхности зубодесневой бороздки с помощью стерильной одноразовой щетки для браш-биопсий. В полученных таким образом цитологических мазках всегда присутствовали зубной налет и эпителий десен. Для получения цитологических мазков слизистой оболочки желудка использовали гастробиоптаты, полученные при выполнении фиброэзофагогастродуоденоскопии с прицельной многократной биопсией. Гастробиоптаты отпечатывали на обезжиренные предметные стекла тонким слоем. Полученные цитологические мазки фиксировали и затем окрашивали иммуноцитохимическим методом или рутинными методами. Взятие мазков из ротовой полости и получение мазков-отпечатков из гастробиоптатов у всех обследованных пациентов осуществлялось в один день.

Метод иммуноцитохимического окрашивания Helicobacter pylori. Цитологические мазки, фиксированные смесью спирт: ацетон в соотношении 1:1 в течение 10 мин, высушивали на воздухе и гидрофобным карандашом (DakoCytomation) обводили информативное поле для иммуноцитохимического анализа. Далее инактивировали эндогенную пероксидазу в 1% растворе азида натрия (Merck) в течение 15 мин. Промывали в двух сменах бидистиллированной воды и оставляли на 5 мин. в Трис-NaCl буфере (pH 7,6). По окончании этой процедуры наносили поликлональные кроличьи антитела (NCL-HPp, Novocastra), направленных против антигенов клеточной стенки Helicobacter pylori, и инкубировали препараты в течение получаса при +37 °С. Антитела раскапывали пипеткой только в информативную область, обведённую карандашом, и размазывались тонким слоем по её поверхности. По завершении мечения первыми антителами препараты проводили в двух сменах буфера по 5 мин. и наносили свиные биотинилированные антитела (DakoCytomation), направленные против кроличьих антител. Со вторыми антителами препараты инкубировали в течение 10 мин. при комнатной температуре. Для снижения уровня неспецифического фона в иммуноцитохимическом методе окрашивания цитологических мазков в отличие от иммуногистохимического окрашивания срезов тканей перед проявкой субстратом препараты промывали буфером в течение 1 часа. Следующим этапом иммуноцитохимической процедуры, которому предшествовала отмывка препаратов в двух сменах буфера, являлось нанесение на 2 мин. при комнатной температуре системы визуализации, состоящей из растворимого комплекса — авидин и биотинилированная пероксидаза хрена (DakoCytomation). В качестве субстрата для проявления иммуноцитохимической реакции использовали 3,3'-диаминобензидин (ДАБ) в формате от фирмы Novocastra. Затем препараты докрашивали гематоксилином. При использовании в качестве первых антител поликлональных кроличьих от фирмы "DakoCytomation" результат иммуноцитохимической верификации Н. pylori инфекции полностью соответствовал результату, когда вариантом первых антител являлись поликлональные кроличьи от фирмы "Novocastra".

Анализ препаратов осуществлялся с использованием иммерсионного объектива (хЮО) на микроскопе Leica DM 4000 В. Для определения хеликобактера в мазках с поверхности зубодесневой бороздки просматривали по 300 полей зрения. Положительный результат инфицирования бактериальными клетками хеликобактера регистрировался, если на 300 полей зрения обнаруживалось не менее пяти бактериальных клеток с видоспецифичными антигенами хеликобактера.

Метод иммуноцитохимического окрашивания интерлейкина-lß. Иммуноцитохимическое окрашивание интерлейкина-lß в мазках с зубодесневой бороздки в нашем исследовании проводилось одновременно в группе пациентов с пародонтитом (Группа 1) и в группе сравнения (Группа 4). Для этого накопленные в архиве фиксированные, но неокрашенные мазки еще раз фиксировали смесью спирт:ацетон в соотношении 1:1 в течение 10 мин и высушивали на воздухе. Важно отметить, что этот и все последующие этапы окрашивания для выявления интерлейкина-lß проводились практически одномоментно на всех 85 предметных стеклах (на 61 - Группа 1 и на 24 -Группа 4).

Для визуализации создаваемого интерлейкином-1 ß фона в платах плоского эпителия слизистых десен мы использовали моноклональные мышиные антитела, произведенные ОАО «Цитокин» (НИИ особо чистых препаратов Роспотребнадзора, Санкт-Петербург).

После повторной дофиксации и высушивания с помощью гидрофобного карандаша и круглого лекала ограничивали ареал диаметром 1 см, внутри которого проводили окрашивание. Все растворы антител и системы визуализации наносили в этот ограниченный ареал строго в одинаковых объемах. Таким образом, мы соблюдали одинаковые стандартные условия для последующего фотометрического измерения плотности искомого антигена интерлейкина-lß в слизистых оболочках ротовой полости у пациентов с пародонтитом и в контрольной группе сравнения.

Эндогенную пероксидазу в мазках инактивировали 1% раствором азида натрия (Merck) в течение 10 мин. затем промывали в двух сменах бидистиллированной воды и оставляли на 5 мин. в Трис-NaCl буфере (pH 7,6). Растворы антител вносили микродозатором в объеме по 50 ц1, только в информативную область, обведённую гидрофобным карандашом, и распределялись тонким слоем по её поверхности. Концентрация рабочего раствора первых антител соответствовала 0,01 mg/ml.

Инкубация с первыми моноклональными мышиными антителами к интерлейкину-lß длилась в течение 30 мин. при +37 °С.

После мечения первыми антителами препараты проводили в двух сменах буфера по 5 мин. и наносили лошадиные анти-мышиные/анти-кроличьи биотинилированные антитела (R.T.U. VECTASTAIN UNIVERSAL ABC RIT). Со вторыми антителами препараты инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Перед проявкой субстратом препараты промывали в буфере 1 час.

Завершающим этапом иммуноцитохимического окрашивания для выявления интерлейкина-lß было нанесение на 3 мин. при комнатной температуре системы визуализации, состоящей из растворимого комплекса — авидина и биотинилированной пероксидазы хрена (VECTASTAIN UNIVERSAL ABC KIT, USA). Для проявки использовали 3,3'-диаминобензидин (ДАБ) (DakoCytomation). Препараты докрашивали гематоксилином Майера.

Микроскопирование полученных препаратов проводили на малом увеличении с использованием объектива (х20, Leica DM 4000 В). В мазке от каждого обследуемого делали по 3 снимка с помощью цифровой фотокамеры при одинаковой интенсивности проходящего света и настройке конденсора. Для микрофотографирования целенаправленно выбирали только те поля зрения, которые были представлены монослоем плоского эпителия слизистой оболочки.

Полученный видеоархив использовали в дальнейшем для количественной оценки содержания интерлейкина-lß в слизистых оболочках ротовой полости морфометрическим методом.

Морфометрическое измерение количества интерлейкина-lß в слизистых оболочках ротовой полости. Для оценки интенсивности окрашивания после иммуноцитохимических процедур с применением антител к интерлейкину-lß были проведены морфометрические исследования. Очевидно, что чем выше плотность выявленного антигена (концентрация интерлейкина-lß в слизистых), тем более интенсивным должно быть окрашивание пластов эпителия в исследуемых нами мазках. Для оценки интенсивности специфического окрашивания мы измеряли оптическую плотность в условных единицах. Для этого использовалась система компьютерного анализа микроскопических изображений Leica DFC 320 R2 и лицензионной программф ВидеоТест Морфология 4.0.

У каждого обследованного определение оптической плотности проводилось в девяти оцифрованных участках иммуноцитохимически окрашенных мазков, по которым выводилось среднее значение в условных единицах. Отметим, что в каждом кадре для расчета оптической плотности учитывалось влияние на результат значения фона

Определение чувствительности, специфичности и эффективности метода проводили по стандартным расчетам (Долгов, Шевченко, 2005):

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуноцитохимическое исследование хеликобактера показало, что после проведенной иммуноцитохимической реакции в цитологических мазках хеликобактеры (спиралевидные, U-образные и кокковые формы) окрашивались диаминобензидином в цвета от светло-коричневого до темно-коричневого. В слизистой оболочке желудка размеры спиралевидных форм бактериальных клеток хеликобактера варьировали от 3 до 5 мкм в длину и составляли около

0.5 мкм в поперечнике. Хеликобактеры спиралевидных форм в препаратах, окрашенных иммуноцитохимическим методом, выглядят практически также как и бактериальные клетки хеликобактера, в рутинно окрашенных препаратах (рис 1). Как правило, в желудке обнаруживались преимущественно бактериальные клетки хеликобактера спиралевидных форм. Но наряду с ними, хотя и значительно реже, встречались кокковые формы хеликобактера. Кокковые формы имели размеры от 0,5 до 1 мкм в диаметре, идеально округлую форму и окрашивались равномерно, иногда с несколько большей интенсивностью, чем спиралевидные формы хеликобактера.

Рис. 1. Типичные поля зрения с преобладанием вегетирующих спиралевидных форм Helicobacter pylori. Хеликобактериоз слизистой оболочки желудка. Гастробиоптат, мазки- отпечатки. Иммуноцитохимическое окрашивание.

Хеликобактеры в ротовой полости, при использовании в качестве субстрата ДАБ проявлялись, как и в мазках из гастробиоптатов, тёмно-коричневым цветом с чёткими контурами. В подавляющем большинстве случаев в исследованных образцах из ротовой полости бактериальные клетки с антигенами хеликобактера выглядели как кокки и U- образные бактерии. Они ничем не отличались от кокковых и U-форм, обнаруживаемых в слизистой оболочке желудка. Однако наряду с тем, у 14 из 61 обследованных пациентов Группы 1 (хронический генерализованный пародонтит) и у 6 из 70 пациентов Группы 2 (хронический гастрит) в ротовой полости удалось выявить хеликобактеры спиралевидных форм со жгутиками. Очень важно отметить, что в мазках из полости рта, взятых от пациентов Группы 2 (хронический гастрит) мы ни в одном из 70 случаев не обнаружили такой обильной обсемененности хеликобактером, как при хеликобактериозе в слизистой оболочке желудка. Напротив, у 5 из 61 пациентов Группы 1 (хронический генерализованный пародонтит) мы наблюдали обсемененность эпителия десен бактериальными

клетками хеликобактера аналогично тому, как это имеет место в слизистой оболочке желудка (рис. 1). Частота встречаемости таких случаев составила 8,2%

Рис. 2. Мазок-соскоб с поверхности зубодесневой бороздки. Хеликобактериоз слизистой ротовой полости. Иммуноцитохимическое окрашивание. Увеличение ЮООх.

Частоты выявления хеликобактера в слизистых желудка и ротовой полости

Специфичность, чувствительность и эффективность неиивазивного иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера в ротовой полости. Одной из главных задач диссертационного исследования была разработка прямого бактериоскопического метода выявления хеликобактера. К уже существующим неинвазивным методам выявления хеликобактера может добавиться не эндоскопический, но в отличие от всех неинвазивных методов, прямой бактериоскопический метод выявления хеликобактера в ротовой полости.

Для анализа совпадений результатов выявления хеликобактера в ротовой полости и в желудке мы объединили в одну когорту пациентов с кислотозависимыми заболеваниями и пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом. Таким образом, объединенная когорта составила 131 человека.

Варианты обнаружения хеликобактера в ротовой полости и в желудке представлены в таблице 1.

Таблица 1. Частоты совпадений инвазивного (в гастробиоптатов желудка) и неинвазивного (в мазках с поверхности зубодесневой бороздки) иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера

Варианты обнаружения хеликобактера п +/- (%)

Желудок + Полость рта + 67 51,0 ±4,4

Желудок - Полость рта - 43 33,0 ±4,1

Желудок + Полость рта - 2 1,5 ±0,9

Желудок - Полость рта + 19 14,5 ±3,1

Вариант «Желудок + Полость рта +». Хеликобактер обнаруживается и в желудке, и в ротовой полости. Этот вариант самый распространенный, встречается в 51,0%±4,4% случаев полных положительных совпадений.

Вариант «Желудок - Полость рта - ». Хеликобактер не обнаруживается ни в желудке, ни в ротовой полости. Такой вариант случаев полных отрицательных совпадений встречается реже, — 33,0%±4,1%

Вариант «Желудок + Полость рта - ». Хеликобактер обнаруживается в желудке, а в ротовой полости — нет. Этот вариант имел место только в двух из ста тридцати одного случая. Он статистически незначим и частота его составила 1,5%±0,9% (ошибка среднего значения превышает половину его величины). Вероятнее всего, он обусловлен методическими погрешностями.

Вариант «Желудок - Полость рта +». Хеликобактер не обнаруживается в желудке, но в ротовой полости он присутствует. Частота встречаемости таких событий достоверна (р<0,05) и достигает 14,5%±3,1%. Очень важно, на наш взгляд отметить, что с вариантом «Желудок - Полость рта +» встречались и такие пациенты, у которых в ротовой полости присутствовали не только кокковые, но и вегетирующие спиралевидные хеликобактеры.

Таким образом, результаты иммуноцитохимических исследований хеликобактера в желудке и в ротовой полости полностью совпали у 110 из 131 пациентов, или в 84,0% ± 3,2% случаев. В остальных случаях хеликобактер был выявлен (или же наоборот не выявлен) в одной из двух исследованных локализаций.

Если принимать бактериоскопический метод выявления хеликобактера в гастробиоптатах, полученных в ходе эндоскопических исследований, за «золотой стандарт», рассмотрим, насколько неинвазивный метод иммуноцитохимического выявления хеликобактера в ротовой полости оценивается по шкале чувствительности и специфичности, принятой для клинико-лабораторной диагностики.

Для вычисления чувствительности, специфичности и эффективности теста неинвазивного орального иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера применялись формулы, приведенные в подразделе 2.6. главы «Материалы и методы». Еще раз напомним, как мы проводили расчет. Были определены следующие случаи (из всех 131 случаев):

ИП — истинно положительные, т.е. НР-позитивные в желудке и НР-позитивные в ротовой полости;

ЛО — ложно отрицательные, т.е. НР-позитивные в желудке, но НР-негативные в ротовой полости;

ЛП — ложно положительные, т.е. НР-негативные в желудке,но НР-позитивные в ротовой полости;

ИО — истинно отрицательные, т.е. НР-негативные в желудке и НР-негативные в ротовой полости;

Б — больные, т.е. НР-позитивные в желудке,

НБ — не больные НР-негативные в желудке.

Согласно нашим полученным результатам и правилам вычисления (Долгов В.В., Шевченко О.П., 2005) истинно положительными (ИП) оказались 67 случаев, ложно отрицательными (ЛО) — 2, ложно положительными (ЛП) — 19 и истинно отрицательными (ИО) = 43. Данные для расчета приведены в таблице 2.

Таблица 2. Расчетные параметры для вычисления чувствительности, специфичности и эффективности теста для неинвазивного орального иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера.

Группа обследуемых Результаты исследований Всего

положительные отрицательные

Больные (Б) 67 (ИП) 2 (ЛО) 69 (ИП + ЛО)

Небольные (НБ) 19 (ЛП) 43 (ИО) 62 (ЛП + ИО)

Таким образом, мы имеем:

Диагностическая чувствительность ДЧ = —— х 100% = — х 100% = 97%

Б 69

ИО 43

Диагностическая специфичность ДС = —- х 100% = — х 100% = 70%

НБ 62

Диагностическая эффективность теста

-ИП + ИО-х = 43 + 67 х]00% = 84%

ИП + ЛО + ЛП + ИО 67 + 2 + 19 + 43

Можно сделать заключение, о том, что неинвазивный вариант иммуноцитохимического метода выявления хеликобактера в ротовой полости

совпадает на 84,0%±3,2% с результатами выявления хеликобактера тем же методом в гастробиоптатах, полученных в ходе эндоскопических исследований.

Частота выявления хеликобактера иммуноцитохимическим методом составила 52,7%±4,4% в СОЖ антрума и 65.6%±4,1% — в мазках из ротовой полости. Различия между локализациями по частоте встречаемости НР для данной когорты оказались достоверными (р<0,05). Таким образом, можно заключить, что в ротовой полости хеликобактер встречается достоверно чаще, чем желудке. И, следовательно, мы вправе предполагать существование орального варианта хеликобактериоза.

Частоты выявления хеликобактера в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом, у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями и у здоровых доноров. На рисунке 3 приведены значения частот выявления хеликобактера в мазках с зубодесневой бороздки в Группе 1 (хронический генерализованный пародонтит), в Группе 2 (кислотозависимые заболевания) и в Группе 3 (здоровые доноры). Чаще всего хеликобактер встречается у пациентов с пародонтитом (Группа 1).

100

а я о.

11 о в

а 3

5 о

Й в,

щ о

X (О

5 ;= 5 в 5 "=

О) о

м |1 II-

3 «

Н X о я н а

и П я я

|Г г

75

50

25

о -Ц

74,6±5,5

60,0±5,9

48,6 ±4,9

4

?

Группа 3 (N=105)

Группа 2

(N=70)

Группа 1

(N=61)

Рис. 3. Частоты встречаемости хеликобактера в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (Группа 1), у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями (Группа 2) и у лиц без заболеваний пародонта (Группа 3).

При этом 74,6% пациентов с пародонтитом имеют хеликобактер в ротовой полости. С наименьшей частотой (48,6%) хеликобактер встречается в группе

здоровых доноров (Группа 3). В группе сравнения (Группа 2) пациентов с кислотозависимыми заболеваниями частота втречаемости хеликобактера составляет 60%.

Различия по показателю «частота встречаемости хеликобактера в ротовой полости» между всеми представленными группами оказались достоверными (р<0,05, во всех случаях).

Таким образом, представленные выше результаты указывают на повышенную частоту встречаемости хеликобактера в ротовой полости у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом.

Частоты выявления хеликобактера в слизистой оболочке желудка у пациентов с хроническим пародонтитом и у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями. Средняя частота встречаемости хеликобактера в гастробиоптатах в группе пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом составила 57,9%, а в группе с кислотозависимыми заболеваниями — 58,6% (рис. 4). Очевидно, что различия по исследуемому показателю между этими группами отсутствуют (р>0,05).

100

к 5 X

Р

а

50

25

!

|

_ 1

58,6±5,9 57.9±6,6

т ~г !

1

_

_

_

1

_ 1

Группа 2

(N=70)

Группа 1 (N=61)

Рис. 4. Частоты встречаемости хеликобактера в гастробиоптатах (%) у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (Группа 1) и у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями (Группа 2).

Таким образом, ожидаемой повышенной частоты встречаемости хеликобактера в желудке у пациентов с хроническим генерализованным

пародонтитом мы не выявили. В Группе 3 лиц без заболевания пародонта ФГДС исследования не проводились.

По характеру и степени кокковой обсемененности в СОЖ пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом также ничем не отличаются от пациентов с кислотозависимыми заболеваниями (хроническим гастритом).

Иммуноцитохимическое исследование интерлейкина-1р в ротовой полости. После проведенного иммуноцитохимическоого окрашивания с применением первых моноклональных антител к интерлейкину-1(3 браш-мазков с поверхности зубодесневой бороздки мы наблюдали случаи с отсутствием окрашивания, так и окрашивание материала хромогеном (ДАБом) в цвета от бежевого до коричневого. Важно, на наш взгляд, отметить, что положительный результат иммуноцитохимической реакции был выявлен только в пластах эпителиоцитов. На рис. 5, представлены варианты с отсутствием цвета после иммуноцитохимического окрашивания, с бежевым фоном и коричневым фоном, вероятно свидетельствующим о различной высокой внутриклеточной концентрации интерлейкина-1 р в эпителии слизистой оболочки десен.

Объектом фотометрических исследований были пласты эпителия, в которых мы и определяли величину показателя «оптическая плотность внутриклеточной концентрации интерлейкина-1р» с использованием пакета программ ВидеоТест Морфология 4.0.

На рисунке 6 представлено распределение пациентов по значению оптической плотности в группах: больных с пародонтитом (Группа 1) и контрольная группа лиц без заболеваний пародонта (Группа 3). Оказалось, что в эпителии зубодесневой бороздки у лиц со здоровым пародонтом в половине случаев интерлейкин-1р выявлен не был. Лица группы сравнения с нулевым показателем «оптическая плотность выявленного антигена (интерлейкин-1р)» составили модальный класс. Максимальное значение в контрольной группе без пародонтита достигло 0,04 условных единиц. Стоит отметить, что показатели оптической плотности у всех остальных здоровых доноров не превысили 0,01 условных единиц. Среднее значение показателя «оптическая плотность выявленного антигена (интерлейкин-1р)» в контрольной группе 3 составило 0,0036 условных единиц.

Совсем иные, резко повышенные значения оптической плотности выявленного антигена интерлейкина-1р, были получены в группе пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (Группа 1). Практически у всех, за исключением трех пациентов из этой группы выявлялся интерлейкин-1р в эпителии зубодесневой бороздки. Максимальное значение достигало 0,27 условных единиц, а среднее значение составило 0,0344 условных единиц оптической плотности. Среднее значение показателя «оптическая плотность выявленного антигена (интерлейкин-1Р)» в группе пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом было почти в 10 раз больше, чем в контрольной группе лиц без заболеваний пародонта, — 0,0344 и 0,0036, соответственно. 11-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни выявил высоко

достоверные различия (р < 0,001) по показателю «оптическая плотность выявленного антигена (интерлейкин-1р)» между обследованными группами.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом имеют повышенным уровень содержания цитокина интерлейкина-1р в эпителии зубодесневой бороздки десен.

Оказалось, что в контрольной Группе 3 случаи с присутствием спиралевидных форм хеликобактера в ротовой полости выявлены вообще не были. В этой же группе верхняя граница спонтанного фонового уровня интерлейкина-1р фактически не превышала 0,01 у.е. Наряду с тем, очень важно отметить, что у 14 пациентов Группы 1 (отмечены на рисунке 6 незакрашенными квадратами), у которых были обнаружены спиралевидные формы хеликобактера, у 12 уровень интерлейкина-ф намного превышал фоновый уровень (т.е. 0,01 у.е.).

Поскольку признак «степень обсемененности хеликобактером» в нашем случае (слизистой зубодесневой бороздки) оказался не количественным и даже не полуколичественным с возможностью оценки на «+», «++» и «+++», как это регламентировано для слизистой оболочки желудка (Аруин Л.И., 1997), то мы не имели возможности провести корреляционный анализ между показателями «уровень содержания иитерлейкина-1 р» и «степень обсемененности хеликобактером» в слизистой зубодесневой бороздки. Однако мы смогли адекватно использовать критерий знаков, который и выявил достоверное увеличение уровня интерлейкина-1р в эпителиоцитах зубодесневой бороздки при инфицировании спиралевидными формами НР (р < 0,01). Стало очевидным, что при хроническом генерализованном пародонтите, сопровождающемся обсемененностью ротовой полости спиралевидными вегетирующими формами хеликобактером, наблюдается резко повышенный уровень интерлейкина-1р в эпителиоцитах зубодесневой бороздки. Учитывая, что интерлейкин-1р является основным медиатором воспаления в тканях пародонта, мы вправе сделать вывод о «пародонтогенной агрессии» хеликобактера и его принадлежности к группе «пародонтогенных бактерий».

В разделе «Клинические случаи из практических наблюдений» приведены примеры конкретных клинических случаев наблюдений за пациентами, обратившихся с жалобами на пародонтит к врачу-пародонтологу и после приема у этого специалиста добровольно согласившихся на консультацию гастроэнтеролога, а затем и на эндоскопическое обследование. В случае назначения гастроэнтерологом проведения курса антихеликобактерной эрадикационной терапии по стандартной схеме приема антибиотиков мы проводили в плановом порядке хирургическое лечение пародонта на фоне проводимого эрадикационного курса.

Рис.5. Содержание интерлейкин-1 (3 в пластах плоского эпителия в зависимости от опт. плотности. Иммуноцитохимическое окрашивание. Увеличение х20.

Опт плотность,

усл. единицы

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

Рис. 6. Распределения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (Группа 1) и лиц без заболеваний пародонта (Группа 3) по показателю «оптическая плотность выявленного антигена (интерлейкин-1(3)».

Вместе с ним мы усиливали антихеликобактерные эрадикационные мероприятия дополнительной санацией ротовой полости препаратом местного антибактериального действия - хлоргексидином.

У 7-ми пациентов была проконтролирована эффективность курса антихеликобактерной антибиотикотерапии через полтора после завершения. При проведённых контрольных исследований у всех пациентов хеликобактер не был обнаружен ни в полости рта, ни в желудке. У них же отсутствовали и клинические признаки пародонтита.

ВЫВОДЫ

1. У больных с хроническим генерализованным пародонтитом отмечается повышенная частота обнаружения хеликобактера в ротовой полости. По данным иммуноцитохимического исследования частота выявления хеликобактера в ротовой полости у клинически здоровых людей составляет — 48,6±4,4%, у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями — 60,0±5,9%, у больных с хроническим генерализованным пародонтитом — 74,6±5,5%

2. В соскобах с поверхности зубодесневой бороздки обнаруживаются, как правило, кокковые формы хеликобактера. Колонизация ротовой полости

Группа 1 Группа 3

спиралевидными бактериальными клетками хеликобактера встречается при хроническом генерализованом пародонтите (в 8,2% случаев).

3. Для выявления хеликобактера в ротовой полости неинвазивный иммуноцитохимический метод имеет высокую значимость по параметрам чувствительность (97%), специфичность (70%) и диагностическая эффективность (84%).

4. Пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом отличаются от здоровых доноров высокодостовсрным (р < 0,001) повышенным уровнем содержания цитокина интерлейкина-1р в эпителии зубодесневой бороздки десен.

5. При хроническом генерализованном пародонтите, сопровождающемся обсемененностью ротовой полости спиралевидными формами хеликобактера, наблюдается резкое повышение уровня интерлейкина-1р в эпителиоцитах зубодесневой бороздки, что указывает на пародонтогенную агрессию хеликобактера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования предназначены для использования в медицинских учреждениях специалистами в области пародонтологии, гастроэнтерологии и клинической лабораторной диагностики.

1. Рекомендуется использование иммуноцитохимического метода в цитологических мазках слизистой оболочки ротовой полости для определения уровня цитокинов при заболеваниях пародонта. Такое исследование можно проводить параллельно с цитопатологическими диагностическими тестами без ограничения сроков пробоподготовки.

2. При лечении тяжелых форм хронического генерализованного пародонтита, сопровождающегося колонизацией ротовой полости вегетирующими бактериальными клетками хеликобактера, рекомендовано обязательное ФГДС обследование. И, в случае обнаружения НР-ассоциированных заболеваний, лечение пародонтита проводить одновременно с курсом антихеликобактерной эрадикационной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Мазурова Я.Я. Бациллярные и кокковые формы Helicobacter pylori в слизистых ротовой полости и антрума желудка (иммуноцитохимическое исследование) / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, Ю.А. Грухин, С.Н. Прошин, И.А. Михайлова, Т.В. Суровцева, М.Г. Кобиашвили // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, № 2. - С.5-9.

2. Мазурова Я.Я. Бациллярно-кокковая трансформация Helicobacter pylori в желудочно-кишечном тракте и её значение в распространении хеликобактерной инфекции / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, Ю.А. Грухин, Т.В. Суровцева, А.Е. Носов, С.Н. Прошин, И.А. Михайлова, М.Г. Кобиашвили // Медико-биологические и социально-психологические последствия чрезвычайных ситуаций. - 2008. - № 3. - С.5-9.

3. Мазурова Я.Я. Иммуноцитохимическое исследование Helicobacter pylori в слизистых ротовой полости, желудка и прямой кишки / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, Ю.А. Грухин, М.Г. Кобиашвили, С.С. Алексанин // Медицинский академический журнал. - 2009. - Т. 9, № 2,- С.79-84.

Статьи, тезисы докладов

4. Мазурова Я.Я. Варианты обсемененности Helicobacter pylori слизистой оболочки полости рта и желудка у больных хроническим парадонтитом / Я.Я. Мазурова, М.Г. Кобиашвили, В.Ю. Кравцов, И.А. Михайлова, С.Н. Прошин, К.А. Мазуров // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008. - Т. 18, № 5. - С.25.

5. Мазурова Я.Я. Кокко-бациллярный диморфизм Helicobacter pylori и значение кокковых форм в распространение хеликобактерной инфекции / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, Ю.А. Грухин, С.Н. Прошин, И.А. Михайлова, А.Е. Носов, Д.М. Носов, М.Г. Кобиашвили // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - №3(23) прил. 2, ч. 2. - С.352.

6. Мазурова Я.Я. Ассоциативная связь Helicobacter pylori и грибов рода Candida у больных генерализованным парадонтитом / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, М.Г. Кобиашвили, A.M. Ковалевский, Ю.А. Грухин, Т.В. Суровцева, И.А. Михайлова, С.Н. Прошин // Вестник Российской военно-медицинской академии. -2009. -№1(25) прил. 1, ч.1 - С. 276.

7. Мазурова Я.Я. Иммуноцитохимические исследования Helicobacter pylori в слизистых ротовой полости, желудка и прямой кишки / Я.Я. Мазурова, В.Ю. Кравцов, Ю.А. Грухин, И.А. Михайлова, A.B. Одинцов, Е.В. Одинцов // В сб. тез. Всероссийской конф. с междунар. участием, научные чтения, посвященные памяти O.K. Хмельницкого и 25-летию курса цитологии каф. патологической

анатомии СПб МАПО. «Современные проблемы клинической цитоморфологии». СПб., 2007 - С. 57-58.

8. Mazurova la.Ia. Immunocytochemical study of Helicobacter pylori / Ia.Ia. Mazurova, V. Iu. Kravtsov, Iu.A. Grukhin, T.V. Sourovtseva, M.G. Kobiashvili, S.S. Aleksanin // 2009 4th Medical Biotech Forum (International Experts Symposium). Dalian, China, 2009,- P.353.

9. Мазурова Я.Я. Специфичность, чувствительность и эффективность неинвазивного иммуноцитохимического метода выявления H.Pylori в ротовой полости / Я.Я. Мазурова, Ю.А. Грухин, В.Ю. Кравцов // Многопрофильная клиника XXI века. Передовые медицинские технологии: тезисы Межд. науч.-прак. конф. / под ред. Алексанина С.С. - СПб.: Из-во «Человек и его здоровье», 2011.-С. 130.

10. Мазурова Я.Я. Helicobacter pylori и Candida у больных с генерализованным пародонтитом / Я.Я. Мазурова, A.M. Ковалевский, В.Ю. Кравцов, И.А. Михайлова, М.Г. Кобиашвили // В сб. тез. Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы челюстно-лицевой хирургии и стоматологии». - СПб., 2011. - С. 79.

Подписано в печать 25.11.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 8418Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76