Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование антиатеросклеротической терапии в эксперименте

На правах рукописи

Карагодин Василий Петрович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

12 ДЕК 2013

005543692

Москва-2013

005543692

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН и НИИ атеросклероза Инновационного центра «Сколково»

Научные консультанты: Александр Николаевич Орехов

доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией клеточных механизмов атерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Юрий Вениаминович Бобрышев

доктор биологических наук, профессор ведущий научный сотрудник лабораторией клеточных механизмов атерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты: Малышев Игорь Юрьевич

Доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Заведующий кафедрой патологической физиологии

Орлов Сергей Николаевич

Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова». Заведующий лабораторией физико-химии биомембран

Максименко Александр Васильевич

Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации». Руководитель лаборатории биохимической инженерии Института экспериментальной кардиологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН

Защита состоится 26 декабря 2013 г. в 14:00 на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, Д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан « 26 » ноября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук - Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Атеросклероз и его клинические проявления занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности в России. На основании эпидемиологических исследований выявлена группа факторов риска атеросклероза. Уровень холестерина в крови, артериальное давление, курение, образ жизни - модифицируемые факторы риска. Возраст, пол и семейный анамнез относятся к немодифицируемым факторам риска ИБС и атеросклероза. Воздействие на факторы риска является как способом первичной профилактики атеросклероза, так и непрямым лечением (Информационный бюллетень ВОЗ, 2011, №317).

Существует представление о прямом лечении атеросклероза, то есть таком воздействии на сосудистую стенку, которое предотвращает возникновение и про-грессирование атеросклеротических поражений в артериях человека, а в идеале -вызывает регрессию атеросклероза. Подходы к прямому лечению атеросклероза находятся в стадии разработки, и в настоящее время не существует лекарств, в полной мере обладающих прямым антиатеросклеротическим действием. Кроме того, отсутствует система единых взглядов на патофизиологические процессы формирования атеросклеротических поражений.

Тем не менее, общепризнанно, что ведущим признаком атеросклероза является накопление липидов, главным образом свободного холестерина и его эфиров, в сосудистой стенке ((ЬШЬу Р е1 а1., 2010; 2011; БоЬреПо в & СавЫаго Б, 2012). Источником накапливающихся липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП). При этом для проявления атерогенного эффекта необходима химическая модификация липопротеидных частиц, поскольку нативные ЛНП в большинстве случаев не вызывают накопления холестерина в клетках сосудистой стенки.

Патогенетический подход к профилактике и лечению атеросклероза определяется необходимостью устранения основной причины заболевания, а именно предотвращением накопления внутриклеточных липидов или удаления их избытка. Вариантов достижения этой цели может быть много. В настоящей работе мы остановились на четырех из них, что объясняется современными представлениями о молекулярно-

клеточных механизмах атеросклероза. Согласно этим представлениям, важную роль

3

в возникновении и развитии атеросклеротического поражения играют модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), процессы воспаления в сосудистой стенке, половые гормоны и липопротеиды высокой плотности (ЛВП).

1. Обнаруженная in vivo подфракция циркулирующих модифицированных ЛНП, способная вызывать накопление липидов в клетках интимы аорты человека, формируется за счет десиалирования. Наибольшую атерогенность проявляют мелкие плотные десиалированные цмЛНП (Orekhov AN et al., 1991).

2. Не вызывает сомнения связь между инициирующими событиями атерогене-за и вовлечением в этот процесс воспаления и клеточного иммунитета. Основанием для таких взглядов являются результаты исследований, подчеркивающих роль им-мунокомпетентных клеток в атеросклеротических поражениях, а также присутствие в крови и сосудистой стенке аутоантител против ЛНП (Ridker РМ et al., 2012).

3. Многочисленные данные позволяют заключить, что женские половые гормоны (эстрогены) являются эффективным естественным фактором защиты сосудов от атерогенеза (Böhma В et al., 2009). Преобладающей формой защитного действия эстрогенов является их влияние непосредственно на стенки сосудов, тогда как влияние эстрогенов на липопротеидный профиль крови обеспечивает лишь 25-40% защиты.

4. Наконец, способность липопротеидов высокой плотности (ЛВП) препятствовать развитию атеросклеротических поражений была убедительно документирована в лабораторных исследованиях (Waksman R et al., 2010). Данные эпидемиологических исследований указывают на возможность применения ЛВП-терапии для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний (Nissen SE et al., 2003).

Существенным препятствием для повышения эффективности терапии атеросклероза, в том числе на ранних стадиях его развития, является отсутствие современных патофизиологических моделей и цельного алгоритма поиска и создания лекарственных и нелекарственных средств прямого антиатеросклеротического действия.

Клеточный культуральный тест представляется нам наиболее адекватным способом моделирования ранних процессов атерогенеза. Он позволяет дать оценку анти-атерогенного потенциала лекарственных кандидатов и провести серийные испытания, необходимые для потокового скрининга фармакологически активных веществ.

Тем не менее, широкое использование синтетических лекарственных средств с целью профилактики атеросклероза на ранних его стадиях является проблематичным в силу наличия узких показаний для их назначения, побочного действия и высокой стоимости лечения. Для ранней профилактики и лечения атеросклероза целесообразно использование нелекарственных и лекарственных препаратов природного происхождения (ШШ), поскольку многие из них не оказывают побочного действия при достаточной терапевтической эффективности, привлекательны по ценовой доступности, что обепечивает возможность длительного или даже пожизненного применения. Кроме того, препараты природного происхождения часто обладают более широким спектром эффектов, чем лекарственные препараты, оказывая влияние на ряд звеньев развития атеросклероза и осуществляя, параллельно с прямым антиатеросклеротическим эффектом, непрямое антиатеросклеротическое воздействие (Frank J. et al., 2009; Lu N. et al., 2009; Tinahones et al., 2009).

Целью данной работы является исследование клеточных и молекулярных механизмов развития атеросклероза и создание на основе накопленных знаний 111Ш, обладающих высоким антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.

Из этого следует, что для достижения цели работы необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить отдельные аспекты атерогенеза человека:

- механизмы возникновения атерогенности ЛНП;

- влияние эстрогенов на клеточные проявления атеросклероза;

- участие ЛВП в обратном транспорте холестерина;

- роль иммуно-воспалительных клеток в атерогенезе.

2. Разработать следующие модели для создания ППП, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом:

- модель для выявления антиатерогенной активности ППП, основанную на подавлении атерогенной модификации липопротеидов;

- клеточную модель для поиска богатых фитоэстрогенами ППП из растительного сырья, обладающего антиатеросклеротической активностью;

- клеточную модель для создания ППП, потенциально пригодных для ЛВП-

терапии;

- клеточную модель для выявления антиатеросклеротической активности ППП, основанную на определении клеточных показателей иммуно-воспалительных реакций (экспрессии цитокинов).

3. С использованием разработанных моделей выявить натуральные продукты, пригодные для получения 111111, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом и разработать рецептуру таких ППП.

4. Апробировать универсальный алгоритм НИР, направленных на исследование, разработку и создание антиатеросклеротических препаратов.

5. Разработать рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики.

Научная новизна исследования. Все приведенные в работе данные получены впервые и опубликованы в высокорейтинговых отечественных и зарубежных научных изданиях. Разработанные подходы, методики и продукты являются инновационными и соответствуют современному мировому уровню.

Уточнена роль транс-сиалидазы в патогенезе атеросклероза - изучена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы.

Изучено влияние женских и мужских половых гормонов на патогенез атеросклероза, в частности, на внутриклеточное накопление холестерина в клетках сосудов, инициированное какими-либо факторами.

Получены данные, подтверждающие, что путь оттока холестерина, использующий ароА-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов in vivo.

Проведено морфологическое исследование связи между накоплением липидов в клетках артериальной интимы и антигенпрезентирующей активностью этих клеток.

Дано экспериментальное обоснование профилактического и лечебного применения ряда растительных объектов при развитии атеросклероза. Проведена оценка эффективности этих объектов с использованием моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило установить различные механизмы их действия и предложить алгоритм поиска наиболее перспективных ППП.

Инновационный характер потенциальных продуктов для антиатеросклеротиче-ской терапии определяется следующими особенностями: направленностью на процесс накопления холестерина в артериальной сосудистой стенке; плейотропным механизмом действия; патентоспособной рецептурой и технологией получения ППП.

Научно-практическая значимость. Получено экспериментальное подтверждение фармакологической эффективности (антиатерогенное и антиатеросклеро-тическое действие) ряда растительных объектов.

Экспериментально обоснована целесообразность применения указанных растительных объектов в составе моно- и комплексных препаратов для терапии ате-рослероза.

Созданы клеточные и ферментативные модели, которые целесообразно применять для оценки антиатеросклеротической активности растительного сырья для создания препаратов, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.

Разработаны и утверждены в РМАПО методические рекомендации «Биологически активная добавка к пище «Алликор»: ингредиентный состав, биологические эффекты, рекомендации по применению».

По результатам работы получен патент № 2484841 от 20 июня 2013 г. «Способ профилактики атеросклероза, основанный на подавлении атерогенной модификации липопротеидов». Подана заявка на выдачу патента: «Способ профилактики атеросклероза, основанный на оттоке холестерина из клеток сосудистой стенки».

Положения, выносимые на защиту

1. Уточнены патофизиологические механизмы, которые реализуются в возникновении и развитии атеросклеротического поражения с участием транс-сиалидазы, процессов воспаления в сосудистой стенке, половых гормонов и липопротеидов высокой плотности (ЛВП).

2. Представленные в работе клеточные модели позволяют адекватно воспроизводить важнейшие проявления атерогенеза и могут использоваться для создания эффективных препаратов природного происхождения с целью терапевтического воздействия на течение атеросклероза.

3. Транс-сиалидазная активность и ее подавление является перспективной

мишенью для действия антиатеросклеротических средств. Метод определения транс-сиалидазной активности применен в ферментативной модели (тест-системе) для оценки эффективности и исследования механизмов антиатеросклеротического действия ППП.

4. Первичная культура макрофагов человека служит основой для клеточной модели с целью поиска источника фитоэстрогенов как альтернативы заместительной гормональной терапии для менопазуальных женщин.

5. Для создания препаратов ЛВП-терапии, вызывающих отток холестерина, целесообразно использовать первичные культуры субэндотелиальных клеток интимы аорты человека, полученные из атеросклеротических поражений.

6. Обнаруженная связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в атерогенез воспаления и клеточного иммунитета позволяет рассматривать антицитокиновые средства как потенциальные антиатеросклеротические препараты. Для оценки противовоспалительных свойств таких препаратов может использоваться модель с измерением экспрессии провоспалительных молекул накопление липидов в культивируемых интимальных клетках аорты человека.

Реализация результатов работы. Разработаны рецептуры четырех препаратов и лабораторные регламенты получения этих препаратов.

Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов. Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики. Вся нормативная документация передана для производства ППП компании ООО «ИНАТ-Фарма».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции по биологически активным добавкам к пище, Красноярск, 20-22 июня 2001; 8-й научно-практической конференции по биологически активным добавкам РАЕН «Эффективность применения БАД в различных областях медицины», Москва, 21-23 мая 2002; X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: парафармацевтики, нутрицевтики, космецевти-ки» 2 декабря 2003, Москва; на 10-й научно-практической конференции «Эффек-

тивность применения БАД в практической медицине» в рамках международной выставки 3дравоохранение-2003, декабрь 2003, Москва; научно-практической конференции «Человек и здоровье: применение биокорректоров», Москва, 22-23 ноября 2004; 17th International Conference on Environmental Bioindicators, Moscow, 18-22 May 2009; Международных научно-практических телеконференциях в 2010-2012 гг., Томск; 9-й Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» 22-23 апреля 2010, Санкт-Петербург, Россия; XVI International Symposium on Atherosclerosis, 25-29 march 2012, Sedney, Australia; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions, May 1-3, 2013, The Dolphin Hotel, Lake Buena Vista, Florida, USA; Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis: Possible Role of Stem cells and Osteoblasts. Cell Science & Stem Cell Research, 12-14 Nov 2012, San Antonio, USA и др.

Личное участие автора в выполнении исследования. Исследования выполнены на базе НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и НИИ Атеросклероза Инновационного центра «Сколково». Автором был произведен обширный анализ отечественных и зарубежных работ по теме диссертации, планирование экспериментов. Автор явился инициатором и исполнителем основных разделов работы, что выразилось в руководстве и выполнении патофизиологических, биохимических, фармакологических исследований, проведении оценки эффективности препаратов и изучении их механизмов действия.

Публикации по теме диссертации. По результатам диссертационных исследований опубликовано 27 работ в отечественных и международных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК. Общее количество публикаций по теме диссертации, включая тезисы научных конференций, составляет 44. Автором также выпущены три монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав полученных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы (450 источников), иллюстрируется таблицами и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Водные экстракты исследуемых натуральных продуктов получали с помощью ИФБ (Gebhardt, 1995). Навеску сухой травы заливали кипящей водой и настаивали в закрытой емкости в течение 1 ч при комнатной температуре. Очистку экстракта от неполярных соединений проводили трижды равным объемом хлороформа Настой фильтровали через бумажные фильтры 0,1 мм и хранили до употребления в холодильнике при 4°С не более 6 ч. В экспериментах ex vivo добровольцы получали также перо-рально настои растений и препараты растительного происхождения в форме порошка. Цитотоксичность препаратов контролировали по морфологии культивируемых клеток, включению нейтрального красного и содержанию клеточного белка.

Взятие крови, получение лейкоцитов и сыворотки крови проводили стандартными методами с участием здоровых доноров. Для получения моноцитов использовались как методы градиентного центрифугирования (Adams D.O., 1979), так и с помощью магнитной сепарации (Грачев А.Н. и др., 2010). Для выделения липопро-теидов к плазме крови добавляли твердую соль NaBr и после ультрацентрифугирования отбирали зоны флотировавших градиенте концентрации NaBr липопротеидов очень низкой, промежуточной и низкой плотности.

Результаты некоторых исследований, включенные в настоящую работу, получены также при изучении тканевых сегментов артерий человека.

Биохимические методы исследования

Измерение экспрессии молекулы гистосовместимости II типа (HLA-DR), молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и интерлейкина-1 (IL-1) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a) проводили методом иммуноферментного анализа.

Определение содержания внутриклеточного холестерина проводили ферментативным методом с помощью наборов Boehringer Mannheim.

Измерение клеточного белка проводили по Лоури, определение внутриклеточных липидов методом тонкослойной хроматографии. Определение пролифе-ративной активности клеток и синтеза коллагена проводили с помощью радии-зотопного анализа.

Морфологические методы исследования

Для иммуноцитохимического типирования клеток в первичной культуре были использованы методы одинарного и двойного иммуноцитохимического выявления различных антигенов. Количество гематогенных клеток определяли, используя коктейль антител против СБ 14 и СБЬС антигенов. Оседлые клетки определяли как количество неокрашенных клеток на препаратах, где были выявлены гематогенные клетки. Гладкомышечные клетки идентифицировали по экспрессии гладкомышечного а-актина. Перицитоподобные клетки идентифицировали по положительному окрашиванию антителами ЗС5 против антигена о-сиалоганглиозида и антителами 2А7 против высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена Фагоцитирующие клетки идентифицировали по экспрессии макрофагального антигена СБ68.

В зависимости от свойств используемых первичных антител, иммунную окраску осуществляли либо на криостатных срезах, либо на срезах, полученных из тканевых образцов, заключенных в парафин. Иммуногистохимический анализ осуществляли, используя как рутинный иммунопероксидазный метод анализа, так и многоступенчатые методы с использованием разнообразных коммерческих китов. При выполнении двойного иммуногистохимического окрашивания использовали комбинации различных вторичных антител и комбинации различных субстратов.

Помимо иммуноцитохимических методов, были использованы электронная микроскопия, методы культуры клеток, проточная цитометрия и другие методы, подробно изложенные в диссертации.

Экспериментальные модели

Ферментативная модель для определения сиалидазной активности и поиска агентов, препятствующих атерогенной модификации ЛНП

Получение липопротеид-дефицитной плазмы, выделение сиалидазы из липо-протеид-дефицитной плазмы крови методом аффинной хроматографии, мечение сиаловой кислоты, входящей в состав фетуина, тритием, получение агарозного геля, ковалентно связанного с фетуином, меченым тритием по сиаловой кислоте, получение десиалированного фетуина и трансферина методом кислотного гидролиза проводили с помощью методов, описанных в работе (Тертов и др., 1996).

Модель in vitro - определение активности сиалидазы с использованием в качестве субстрата [3Н]-меченого фетуина, трансферина, липопротеидов - ковалентно связанных с агарозой. После инкубации фермента, донора и акцептора сиаловой кислоты измеряли уровень радиоактивности на жидкостно-сцинтилляционном счетчике 1215 Rack-Beta (LKB, Швеция). В модели ex vivo влияние на активность сиалидазы оценивалось в лабораторно-клинических исследованиях при измерении сиалидазной активности в крови после приема исследуемого агента (натурального продукта). Добровольцы принимали однократную дозу натурального продукта, после чего у них забирали кровь через 4 и 8 ч для получения сыворотки. Сиалидазную активность в сыворотке взятой крови сравнивали с активностью фермента в крови, взятой до приема продукта.

Клеточная модель интимы аорты для оценки накопления холестерина, оттока холестерина и образования цитокинов

Клетки, полученные из непораженных и атеросклеротических (пораженных) участков интимы аорты человека, культивировали раздельно и использовали в экспериментах различных типов, что позволяло в дальнейшем использовать две клеточные модели, различающиеся по своим свойствам.

Первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для воспроизведения процессов атерогенеза на клеточном уровне и оценки антиатерогенных свойств исследуемых веществ. Антиатерогенным действием называли эффекты, препятствующие основным проявлениям атерогенеза на клеточном уровне, и, прежде всего, накоплению внутриклеточного холестерина.

Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ. Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем.

Накопление холестерина — модель in vitro

Культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для определения атерогенности сыворотки крови (ее способности вызывать накопление внутриклеточного холестерина), для воспроизведения ос-

12

новных проявлений атеросклероза (липоидоза, пролиферации и фиброза) на клеточном уровне, для оценки антиатерогенного действия модифицированных ЛНП и исследуемых веществ in vitro (прямое подавление клеточных проявлений атеросклероза).

Модель ex vivo

В модели ex vivo также использовали первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты. Данную модель использовали для оценки антиатерогенного потенциала различных веществ (а также их активных метаболитов) после усвоения, распределения и биотрансформации в организме человека, то есть для получения специфических фармакодина-мических характеристик. В скрининговых и пилотных исследованиях с использованием модели ex vivo принимали участие здоровые добровольцы, не имеющие признаков клинических проявлений атеросклероза или системных воспалительных заболеваний, у которых, тем не менее, при первичном обследовании в модели in vitro была выявлена атерогенность сыворотки крови — способность сыворотки крови вызывать накопление липидов в культивируемых клетках. У участников исследования брали кровь непосредственно перед приемом исследуемого вещества, а также через различные интервалы времени после его приема внутрь.

Расчет атерогенного эффекта (oijeHKa атерогенности сыворотки крови)

После определения содержания общего холестерина и белка вычисляли соотношение холестерин/белок в каждой пробе. Атерогенный эффект исследуемых сывороток определяли по содержанию холестерина в опытных культурах и выражали в процентах от содержания внутриклеточного холестерина в контроле. Сыворотка крови пациента, вызывавшая статистически достоверное накопление внутриклеточного холестерина, рассматривалась как атерогенная.

Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта) в модели in vitro.

Для изучения антиатеросклеротического действия исследуемых веществ использовали первичную культуру субэндотелиальных клеток из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека. Использование этого подхода не предусматривает искусственной нагрузки культивируемых клеток холестерином.

В инкубационную среду добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях. Обычно использовали логарифмический диапазон концентраций исследуемого вещества. Содержание внутриклеточного холестерина в контрольных клетках, инкубированных без добавления исследуемого вещества, принимали за 100%. Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ определяли как их способность статистически достоверно снижать исходно высокое содержание внутриклеточного холестерина.

Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта) в модели ex vivo.

У добровольцев брали кровь (для получения сыворотки) непосредственно перед приемом исследуемого вещества, а также через соответствующие интервалы времени после его приема внутрь (обычно через 2, 4 и 6 часов при скрининго-вых исследованиях и при оценке краткосрочного действия, а также через 4, 8, 12 и 24 часа при оценке длительности эффекта).

Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ в модели ex vivo определяли как их способность статистически достоверно снижать содержание холестерина в культивируемых атеросклеротических клетках.

Измерение экспрессии цитокинов (in vitro, ex vivo)

Для стимуляции экспрессии маркеров воспаления в культивируемых клетках в день эксперимента культуральную среду заменяли на свежую среду и к ней добавляли бактериальный липополисахарид, а также исследуемый агент в концентрации (in vitro). При оценке провоспалительного потенциала сыворотки крови человека вместо агента добавляли исследуемую сыворотку в концентрации 10% (ex vivo). Далее проводили измерение экспрессии молекулы гистосовместимости II типа (HLA-DR), молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), интерлейкина-1 (IL-1) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a).

Клеточная модель моноцитов-макрофагов для оценки накопления и оттока холестерина

Анализ накопления холестерина в моноцитах и макрофагах in vitro.

К клеткам добавляли ЛНП (атерогенные липопротеиды низкой плотности, выделенные из крови больных атеросклерозом) в концентрации 100 мкг/мл по

14

белку (в ряде экспериментов - одновременно с исследуемым агентом, например, гормоном). В качестве контроля использовали клетки, которые продолжали культивировать в среде без добавления ЛНП. Липиды экстрагировали с использованием смеси гексан-изопропанол 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом и нормировали на количество клеточного белка, определяемого по методу Лоури.

Анализ накопления холестерина в моноцитах и макрофагах ex vivo.

Применялась стимуляция накопления внутриклеточного холестерина. В день эксперимента культуральную среду заменяли на свежую среду и к ней добавляли исследуемую сыворотку в концентрации 10%. Контрольные клетки инкубировали в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. По окончании эксперимента клетки фиксировали смесью гексана и изопропанола в соотношении 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом и нормировали на количество клеточного белка.

Методика in vitro для изучения оттока холестерина из культивируемых макрофагов.

Макрофаги были нагружены меченым холестерином путем инкубации в течение 48 час [3Н]холестерин-олеат-ацетил-ЛНП. По сравнению с ненагруженными макрофагами, содержание эфиров холестерина в пенистых клетках возросло в 30-34 раза Помимо радиоизотопного метода определения оттока холестерина, в качестве альтернативы применялся высокочувствительный метод определения холестерина.

Методика ex vivo для изучения оттока холестерина из культивируемых макрофагов.

Существенным отличием от методики in vitro было то, что в культуру клеток добавляли не агенты (фармакологические вещества), а сывороку крови больных, принимавших различные препараты. Оценивалось влияние препарата на отток холестерина.

Статистическая обработка данных

Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием пакета SPSS версии 12.0 (SPSS Inc., CHIA). Графическую обработку данных проводили с использованием пакета SigmaPlot версии 7.0 (SPSS Inc., США). Достоверными

считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза Для оценки связи

15

клинико-биохимических показателей и их изменений использовали корреляционный анализ по Пирсону с поправкой Бонферрони и регрессионный анализ. В окончательном виде данные для непрерывных величин представляли в виде среднего арифметического значения с указанием стандартной ошибки. Для статистической обработки данных использовали пакет статистических программ SPSS 10.0.1. Различия считали статистически значимыми при вероятности безошибочного прогноза более 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Десиалирующая модификация липопротеидов низкой плотности как фактор атерогенности и поиск эффективных антиатерогенных ПИП

При десиалировании ЛНП в плазме сиаловая кислота переносится на плазменные гликоконъюгаты - акцепторы, а не остается в свободном виде. Для характеристики этой активности и использования полученных данных при разработке клеточных моделей нами была изучена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы. На начальной стадии этих экспериментов была экспериментально подтверждена патогенетическая важность транс-сиалидазы за счет ее способности повышать атерогенность ЛНП в культуре клеток.

Для понимания механизмов действия транс-сиалидазы, переносящей с ЛНП сиаловую кислоту на акцепторы плазмы крови, необходимо было изучить субстратную и акцепторную специфичность транс-сиалидазы и использовать эти результаты при создании ферментативной модели.

Показана высокая способность ЛНП быть донором сиаловой кислоты (по сравнению с фетуином и трансферином). Различные гликоконьюгаты компонентов крови также могут служить донором сиаловой кислоты в ходе ферментативной реакции. Было продемонстрировано, что а2-6 - связанная сиаловая кислота отщепляется и переносится сиалидазой значительно эффективнее, чем ее а2-3 изомер.

В ходе изучения акцепторной (субстратной) специфичности транс-сиалидазы плазмы крови человека было установлено, что в процессе ферментативной реакции сиаловая кислота наиболее активно переносится нативный (но не искусствен-

но десиалированный) фетуин, а также на гликопротеиды, липопротеиды, ганглио-зиды, гликоконъюгаты крови.

Полученные данные позволили не только уточнить роль транс-сиалидазы в патогенезе атеросклероза, но и перейти к созданию модельной системы, где этот фермент играет центральную роль.

Метод определения сиалидазной активности был применен в целях разработки ферментативной модели (тест-системы) для оценки эффективности и исследования механизмов антиатеросклеротического действия фармакологических веществ. На основании исследования субстратной специфичности фермента для модели был выбран [3Н]-меченый фетуин. Этот выбор объясняется относительной простотой изготовления субстрата, его стабильностью, хорошей воспроизводимостью результатов. Акцептором в ферментативной системе служил десиалированный фетуин.

Для разработки ППП были изготовлены экспериментальные образцы на основе растительного сырья в количестве 14 и проведены исследования влияния стандартизированных водных экстрактов различных растений на сиалидазную активность. Установлено, что экстракты ряда натуральных продуктов подавляют активность транс-сиалидазы, выделенной из крови человека, в модели in vitro. Эффекты ex vivo были нестабильными и у большинства добровольцев не воспроизводились. Исключение составил корень солодки.

На рисунке 1 приведены результаты исследований на 5 добровольцах. Можно видеть, что сиалидазная активность у всех добровольцев существенно снижалась или исчезала после приема солодки. На основании этих данных корень солодки был отобран для создания средства, препятствующего атерогенной модификации ЛНП в крови.

Рисунок 1. Индивидуальные изменения активности транс-сиалидазы после приема солодки, относительно исходного уровня (100%)

Время,час

Для этого было необходимо разработать рецептуру БАД (фитопрепарата), в состав которого войдут оптимальные или наиболее эффективные компоненты (комбинации компонентов), а также вспомогательные средства, обеспечивающие, в том числе, пролонгированность действия БАД (фитопрепаратов). Кроме того, следовало разработать лабораторный регламент получения препарата, а также произвести экспериментальную партию и осуществить исследовательские испытания по нормативным показателям СанПиН. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлении исследовательских испытаний приведены в Приложении к диссертации. Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 1.

Таблица 1. Рег^птура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище (фитопрепарату) «Средство, препятствующее атерогенной модификации ЛНП в крови»

Компоненты Содержание, % Масса, мг

Солодка 57 200

Лактоза 36 125

Поливинилпирролидон 5 18

Стеарат кальция 2 7

Итого 100 350

Как известно, именно с «мишени», т. е. с понимания механизма развития заболевания и способности им управлять, начинается создание лекарственных препаратов

на современном рынке. В нашем случае, очевидно, такой мишенью является сиалида-за, а компоненты активного начала, действующего на мишень, содержатся в солодке.

Отметим в этой связи, что корень солодки - лекарственное растение, не запрещенное для использования при производстве БАД. Активное начало корня солодки - интересные с фармакологической точки зрения флавоноиды (3-4%) и три-терпеновые сапонины (около 20%).

Влияние половых гормонов на атерогенез, ППП как альтернатива заместительной гормональной терапии

Предварительным этапом этой части работы стало уточнение влияния женских и мужских половых гормонов на патогенез атеросклероза, в частности, на внутриклеточное накопление холестерина в клетках сосудов, инициированное действием модифицированных ЛНП на моноциты/макрофаги с учетом тендерного происхождения последних. Также был проведен анализ влияния половых гормонов in vitro на аккумуляцию холестерина макрофагами, дифференцированными из выделенных моноцитов периферической крови доноров-мужчин и женщин.

Анализ содержания холестерина в макрофагах и моноцитах после их инкубации с ЛНП показал, что половые гормоны могут влиять на аккумуляцию холестерина в клетках.

Полученные данные подтвердили способность эстрогена (эстрадиола) (рисунок 2) и андрогена (дигидротестостерона) действовать однонаправленно на аккумуляцию холестерина в моноцитах-макрофагах. Представленные результаты характеризуют также факторы (моноциты или макрофаги, половые различия), влияющие на это действие.

Результаты проведенных испытаний свидетельствуют о торможении развития атеросклероза под действием половых гормонов и позволяют считать первичную культуру моноцитов-макрофагов человека подходящей основой клеточной модели для разработки альтернативы заместительной гормональной терапии для менопазуальных женщин.

ОМ 1ИОИ 10-9 М 10-6 М 107 м Концентрация гормона

10-10М 1<М м 10-8 М 1&7М Концентрация гормона

Рисунок 2. Влияние эстрадиола на накопление внутриклеточного холестерина

Атерогенность сыворотки крови, то есть индуцированное этой сывороткой накопление внутриклеточного холестерина, полученной от 19 пациентов, было измерено как в первичной культуре клеток, выделенных из нормальных участков интимы аорты человека, так и в культуре моноцитов-макрофагов крови человека. Были получены сравнимые показатели, и коэффициент корреляции между двумя способами измерений составил 0,9 (р=0,01). Таким образом, мы установили, что культуру моноцитов-макрофагов крови человека целесообразно использовать при измерениях атерогенных свойств сыворотки крови с учетом относительной простоты по сравнению культурой клеток аорты.

На основании полученных данных была доработана технология клеточной модели для поиска препаратов, обладающих антиатеросклеротической активностью.

Во-первых, из всех испытанных клеточных параметров, связанных с атеросклерозом, был оставлен только общий холестерин. Этот параметр изменялся од-нонаправленно с другими параметрами под воздействием различных агентов.

Во-вторых, в качестве клеточной культуры были использованы первичные культуры моноцитов, выделенных из крови человека. Использование этих клеток упрощает процедуру выделения, укорачивает сроки культивирования и снижает стоимость анализа.

Далее были выявлены биологически активные компоненты, обладающие эс-

трогеноподобной активностью и идентифицированы растения, являющиеся есте-

20

ственными источниками данных компонентов. В рамках исследований был проведен скрининг растительных объектов, обогащенных фитоэстрогенами.

В качестве примера в таблице 2 приведены результаты испытаний антиате-рогенного действия однократного приема танина из виноградных семян на атеро-генность сыворотки крови. Добровольцы однократно принимали в дозе 250 мг. Кровь брали до приема танина (время «0») и через 2, 4 и б часов после приема. Из образцов крови готовили сыворотку, и образцы сыворотки добавляли в первичную культуру непораженных клеток.

Интегральная оценка антиатерогенного эффекта показала, что в среднем через 2, 4 и 6 часов после однократного приема танина из виноградных семян атеро-генность сыворотки крови снизилась на 67±6%, 66±5% и 71±6% (все - р<0,05).

На основании полученных данных был сделан вывод, что танин из виноградных семян, хмель, чеснок, зеленый чай - обладают выраженными, длительными эффектами и пригодны для создания препаратов на основе фитоэстрогенов, выполняющих роль альтернативы заместительной гормональной терапии.

Таблица 2. Оценка антиатерогенного эффекта танина из виноградных семян (250 мг) в модели ex vivo в первичной культуре моноцитов крови человека

Эксперимент Время после Содержание внутриклеточ- Накопление холесте-

приема, ч ного холестерина, мкг/мг рина, % от контроля

Контроль 49,4±3,3 100+7

0 69,б±3,2 141±6*

Доброволец № 1 2 49,7±2,3 101+5#

4 50,0+3,2 10116#

6 52,6+1,2 106+2#

Контроль 49,2±1,1 100±2

0 64,5±2,8 13216*

Доброволец № 2 2 60,6+2,9 12316

4 56,5+2,3 11515

6 51,3+4,7 10419

Контроль 51,3+1,9 10014

Доброволец № 3 0 68,4±3,5 13317*

2 50,0±2,4 9715 #

4 54,8±1,5 107+3 #

Эксперимент Время после Содержание внутриклеточ- Накопление холесте-

приема, ч ного холестерина, мкг/мг рина, % от контроля

6 54,5±1,2 10б±2 #

Контроль 52,4±0,8 100±2

0 68,8±1,8 131+3 *

Доброволец № 4 2 58,8±1,4 112±3#

4 58,3±1,4 111±3#

6 54,1 ±2,2 103±4 #

Примечания

1 * - достоверное накопление холестерина, р<0,05;

2 # - достоверное снижение атерогенности сыворотки крови, р<0,05.

Для этого необходимо было разработать рецептуру БАД (фитопрепарата). Кроме того, следовало разработать лабораторный регламент получения препарата, а также произвести экспериментальную партию и осуществить исследовательские испытания по нормативным показателям СанПиН. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлени-ии исследовательских испытаний приведены в Приложении к диссертации. Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 3.

Таблица 3. Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище (фитопрепарату) «Антиатеросклеротическое средство, обогащенное фитоэкстрагенами, предназначенное для женщин после менопаузы»

Наименование ингредиента Масса, мг Содержание, %

Шишки хмеля обыкновенного 160 33,97

Чай зеленый байховый листовой 115 24,42

Чеснок гранулированный сушеный 100 21,23

Экстракт виноградной косточки 40 8,49

Бета-каротин 0,5 0,11

Витамин С 30 6,37

Витамин Е (50%) 6,6 1,40

Стеариновая кислота 12,4 2,63

Поливинилпирролидон 6,5 1,38

ИТОГО: 471 100

С позиции лекарство-мишень следует отметить, что мишенью обнаруженных нами эффективных фитоэстрогенов являются, по-видимому, рецепторы гормонов. О компонентах растений, действующих на эти мишени, известно следующее. Хмель содержит фитоэстроген 8-пренилнарингенин. В чесноке наиболее изученные лигнаны (энтеродиол и энтеролактон) являются фитоэстрогенами и антиокси-дантами. Фитоэстрогены содержатся и в зеленом чае. Основные фитоэстрогены винограда относятся к классу флавоноидов. Это танин, катехин, эпикатехин, квер-цетин, кампферол, лютеин и некоторые другие. При производстве БАД разрешено использовать для рецептуры предлагаемые нами танин из виноградных семян, хмель, чеснок, зеленый чай.

Действие ЛВП на обратный транспорт холестерина и разработка эффективных ППП

Поскольку патогенетические механизмы атеросклероза включают особенности функционирования белков, участвующих в оттоке холестерина, и знание этих механизмов может быть использовано при разработке клеточных моделей, мы воспользовались новым методом высокоэффективной трансфекции макрофагов (Sviridov D.D. et al., 2011) для избирательного усиления различных путей оттока холестерина, чтобы исследовать вклад путей, использующих как акцептор апоА-1, в сопоставлении с теми путями, которые используют в качестве акцептора ЛВП, в суммарный экспорт холестерина из макрофагов in vitro и in vivo.

Когда апоВ-обедненная плазма крови человека была использована в качестве акцептора, оверэкспрессия АВСА1 или АВСА1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 стимулировала отток холестерина на 30 и 40%, соответственно, в то же время оверэкспрессия кавеолина-1 или кавеолина-1 + SR- В1 не влияла на уровень оттока холестерина (рисунок 3).

Мы предполагаем, что увеличение оттока холестерина в основном происходит за счет оттока на обезлипиженый апоА-1. Наши данные указывают на то, что уровень оттока холестерина из макрофагов может быть повышен за счет манипулирования клеточными путями, ответственными за отток на апоА-1.

Можно заключить, что путь оттока холестерина, использующий ароА-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов. Ключевым элементом этого пути, по-видимому, является белок АВСА1, а белки CYP27A1, PLTP и SR-B1 играют вспомогательную роль.

Рисунок 3. Оверэкспрессия различных генов и отток холестерина в плазме крови человека Примечания

1 - RAW264.7 клетки были трансфи-цированы указанными генами. Клетки были помечены [3Н]холестерином.

2 - Отток холестерина был выражен как доля [3Н]холестерина, перенесенного с клеток в среду.

3 - Приведены средние значения четырех экспериментов ±D SEM.

4 - * р <0,05 по сравнению с ложно-трансфицированными клетками

Таким образом, проведенные эксперименты еще раз подтвердили сложность процесса удаления избытка холестерина из клеток сосудистой стенки, участие в специфичных путях оттока большого числа транспортеров и регуляторов. С учетом цели нашей работы, следовало предложить такую клеточную модель, которая охватывала бы все или большинство этих участников и позволяла измерять некий интегральный параметр, характеризующий эффективность оттока холестерина и ее изменение в присутствии фармакологических агентов.

В серии проведенных экспериментов были предприняты попытки использования обеих клеточных моделей - культуры моноциты-макрофаги и культуры клеток аорты человека. Более подходящей оказалась методика культивирования клеток, выделенных из аутопсийного материала аорты человека Клетки выделяли из субэндотелиального слоя интимы, поскольку именно в этом слое возникает и развивается атеросклеротическое поражение. Клетки выделяли из жировых атеро-склеротических поражений. Использование этого подхода не предусматривает, в

отличие от моноцитов-макрофагов, искусственной нагрузки культивируемых кле-

24

я 4

s о.

4>

3

о "* <и

с

О

* 2

к о

I

Р

ток холестерином. Состав и содержание внутриклеточных липидов полностью соответствуют составу и содержанию липидов в клетках, популирующих атероскле-ротическое поражение сосудистой стенки человека.

На разработанных клеточных моделях оттока холестерина в вариантах in vitro и ex vivo были испытаны известные антиангинальные лекарственные средства. Это были гиполипидемические препараты, используемые для снижения уровня холестерина в крови, относящиеся к различным классам фармакологических веществ.

Среди них был ловастатин, относящийся к классу статинов, а также липо-стабил, содержащий липиды натурального происхождения. Были также испытаны ингибиторы ацил-КоА-холестерина-ацилтрансфераза (АХАТ) - фермента, принимающего участие в накоплении холестерина в клетках сосудистой стенки. Было обнаружено, что только липостабил достоверно снижал содержание холестерина в клетках, культивируемых из атеросклеротических поражений аорты человека, то есть вызывал обратный транспорт холестерина. Ни статин, ни ингибиторы АХАТ не способствовали обратному транспорту холестерина из атеросклеротических клеток. Полученные данные являются примером того, что снижение холестерина в крови не обязательно сопровождается снижением холестерина в сосудистой стенке.

Для разработки препаратов, способствующих оттоку холестерина из клеток сосудистой стенки, был проведен информационный поиск наиболее перспективных натуральных продуктов и изготовлены экспериментальные образцы в количестве 8. На моделях на основе культуры клеток интимы аорты изучались как анти-атерогенный эффект, то есть подавление атерогенности (накопление холестерина), так и антиатеросклеротическое действие (отток холестерина) этих объектов.

Из таблицы 4 видно, что слабый в антиатерогенном отношении лук оказался весьма эффективным антиатеросклеротическим продуктом, вызывающим на модели ex vivo снижение содержания холестерина в культивируемых атеросклеротических клетках.

Таблица 4. Антиатерогенное и антиатеросклеротическое действие натуральных препаратов

Растительный препарат и его источник Антиатероген-ный эффект, % Антиатероскле-ротический эффект, %

Листья солянки холмовой (Salsola collina) 11,3±0,5 8,8±0,2

Порошок луковицы лука (Allium сера) 21,2±0,4* 20,6±0,4*

Порошок сока свеклы (Beta vulgaris) 31,6±0,5* 16,7±0,6*

Порошок спирулины (Spirulina platensis) 51,5±0,4* 10,2±0,4

Экстракт хвои сосны (Pinus sylvestris) 52,5±0,2* 5,4±0,3

Порошок корня солодки (Glycyrrhiza glabra) 55,3±0,3* 17,3±0,5*

Проростки пшеницы (Triticum vulgaris) 69,8±0,6* 15,5±0,4*

Порошок луковицы чеснока (Allium sativum) 77,5±0,7* 11,9±0,5

* - достоверное увеличение показателей по сравнению с контролем, р<0,05.

С другой стороны, эффективный в антиатерогенном отношении чеснок оказался довольно слабым антиатеросклеротическим натуральным продуктом, то есть не вызывал существенного оттока холестерина из культивируемых клеток, снижая содержание эфиров холестерина на 21,9±0,5%. В этой связи представляется целесообразным использовать лук в качестве растительного сырья для разработки и создания препарата, способствующего обратному транспорту холестерина.

Для этого было была разработана рецептура БАД (фитопрепарата), состав которого вошли оптимальные количества порошка лука, а также вспомогательные средства, обеспечивающие, в том числе, пролонгированность действия БАД (фитопрепаратов). Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 5. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлениии исследовательских испытаний представлены в Приложении.

Таблица 5. Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище «Средство, способствующее оттоку холестерина из клеток сосудистой стенки»

Наименование ингредиента Содержание, % Масса, мг

Лук сушеный 68,19 300

Стеариновая кислота 5,45 24

Лактоза 20,68 91

Поливинилпирролидон 5,68 25

Итого 100 440

Некоторые из известных средств повышения ЛВП (статины, фибраты, ниа-цин, реконструированные ЛВП, пептиды-миметики ароА-1, ингибиторы СЕТР, агонисты X рецептора печени) имеют механизм действия, легче поддающийся интерпретации в рамках концепции лекарство-мишень. Однако они вызывают ряд критических замечаний, тогда как предлагаемый нами препарат на основе натурального продукта не только позволяет избежать многих из перечисленных сложностей, но и дает эффект повышения уровня ОТХ, соизмеримый с эффективностью указанных выше лекарств.

Роль иммунокомпетентных клеток в атерогенезе и поиск эффективных иммунокоррегирующих ППП

Согласно предварительным данным, триггером воспаления при атеросклерозе могут быть провоспалительные цитокины, индуцируемые накоплением ли-пидов в клетках сосудистой стенки. В этой связи мы предприняли попытку подтвердить, что накопление внутриклеточных липидов способно привести к экспрессии молекул, связанных с представлением антигенов. Для этого требовалось провести морфологические исследования связи между накоплением липидов в клетках артериальной интимы и антигенпрезентирующей активностью этих клеток.

В частности, мы сочли целесообразным изучить степень корреляции между отложением липидов, содержанием иммуно-воспалительных клеток и экспрессией молекул НЬА-1Ж главного комплекса гистосовместимости класса II в диффузном

утолщении интимы (ДУИ). Наряду с анализом корреляции между отложением ли-пидов, содержанием иммуно-воспалительных клеток и экспрессией НЬА-Б11 в ДУИ, мы также изучили корреляцию между отложением липидов и содержанием иммуно-воспалительных клеток при сравнении прилюминальных и примедиаль-ных субслоев интимы.

Мы установили, что между общим количеством липидов, обнаруженных с помощью окрашивания, и количеством эфиров холестерина, свободным холестерином и фосфолипидами существует положительная корреляция (0,72-0,95). Положительная корреляция существовала и между вне- и внутриклеточными липи-дами и количеством свободного холестерина, эфиров холестерина и фосфолипидами (0,68-0,95). Не обнаружено значимой корреляции между количеством триг-лицеридов, идентифицированных химическим способом, и количеством липидов, определенных морфометрически после окрашивания.

Последовательные криостатные срезы тканей ДУИ были подвергнуты дальнейшему анализу для поиска корреляции между липидами, окрашенньми масляным красным О, и содержанием иммуно-воспалительных клеток, идентифицированных иммуногистохимически с помощью смеси антител анти-СВ14 и анти-СБ45. Общее отложение липидов достоверно коррелирует с суммарным количеством иммуно-воспалительных клеток (0,59).

Корреляция между общим отложением липидов и числом иммуно-воспалительных клеток была выше в прилюминальном субслое, чем в примеди-альном субслое интимы (0,69 и 0,28 соответственно). Число как внеклеточных, так и внутриклеточных липидов, идентифицированных окрашиванием, положительно коррелировало с общим числом иммуно-воспалительных клеток в интиме (0,58 и 0,51 соответственно). Коэффициенты корреляции между количеством иммуно-воспалительных клеток и вне- и внутриклеточными отложениями липидов в примедиальном субслое (0,28 и 0,18 соответственно) были заметно ниже, чем аналогичные параметры в прилюминальном субслое (0,70 и 0,48 соответственно). Не было обнаружено значимой корреляции между количеством иммуно-воспалительных клеток и внутриклеточным отложением липидов в примедиальном субслое (0,18). Напротив, в прилюминальном субслое коэффи-

28

циент корреляции между внутриклеточным содержанием липидов и числом иммуно-воспалительных клеток был значительно выше (0,48), чем это значение для примедиального субслоя.

Корреляция между содержанием липидов разных классов и количеством имму-но-воспалительных клеток в ДУИ была значимой с эфирами холестерина, свободным холестерином и фосфолипидами (0,82-0,97), но не с триглицеридами (таблица 6). Было также обнаружено, что экспрессия НЬА-ОЯ положительно коррелирует в образцах ткани ДУИ как с количеством иммуно-воспалительных клеток, так и с суммарными липидными отложениями (0,66 и 0,79 соответственно) (таблица 7).

Таблица 6. Корреляция между разными классами липидов и иммуноколтетентными клетками в ДУИ аорты

Иммуногистохими-ческий анализ Классы липидов

Триглицериды Эфиры холестерина Свободный холестерин Фосфолипиды

Содержание иммуно-компетентных клеток 0,20 0,82 0,82 0,97

N5 р = 0,024 р = 0,024 р <0,001

Таблица 7. Корреляции между экспрессией ПЬА-йК, содержанием иммунокомпе-тентных клеток и накоплением липидов в ДУИ

ИФА Содержание иммунокомпетентных клеток Общие липиды

Антиген НЬАЛЖ 0,66 0,79

р< 0,001 р < 0,001

Таким образом, на ранних стадиях атеросклероза вклад внутреннего прилю-минального субслоя в иммунные процессы является более выраженным, чем вклад внешнего примедиального мышечно-эластичного субслоя, однако и вклад примедиального субслоя в ранние стадии атеросклероза также может быть достаточно важен.

Для того, чтобы убедиться, что НЬА-ОЯ+ клетки интимы могут содержать апо-В (апо-В представляет собой характерный белок ЛНП, которые являются ключевыми элементами в инициации и прогрессировании атеросклероза), мы использовали конфокальную микроскопию, которая показала, что, хотя подав-

ляющее большинство экспрессирующих НЬА-БЯ интимных клеток не содержало апо-В, встречались некоторые редкие клетки, содержащие апо-В. В последних клетках апо-В был локализован преимущественно в перинуклеарной цитоплазме (рисунок 4).

Рисунок 4. Аро-В (красный, показано стрелками) в перинуклеарной цитоплазме НЬЛ-ИЯ + клеток, идентифицированный с помощью иммунофлуоресг/ентного анализа, в сочетании с конфокальной микроскопией Примечания

1 - Антиген НЬА-ОЯ был окрашен ИТС, а апо-В был визуализирован с использованием антител к апо-В, конъюгированными с А1еха 633; ядро окрашивали использованием бромистого этидия.

2 - Шкала = 10 мкм

Морфологические исследования, результаты которых приведены выше, выявили связь между накоплением липидов в клетках артериальной интимы и анти-генпрезентирующей активностью клеток. Мы предположили, что именно накопление внутриклеточных липидов стимулирует представление антигенов.

Для проверки этого предположения из непораженных участков интимы аорты человека были выделены жизнеспособные клетки путем ферментативного диспергирования внеклеточного матрикса.

Клетки были посажены в культуру и через 5 дней культивирования в первичную культуру интимальных клеток были добавлены нативные и множественно модифицированные липопротеиды низкой плотности, Нативные (немодифициро-ванные) ЛНП не вызывали накопления внутриклеточных липидов, не влияли на экспрессию НЬА-БЯ и не влияли на уровень экспрессии провоспалительных ци-токинов ЮТ-а и ГГ.-1, которые наряду с презентацией антигенов играют ключевую роль в клеточном иммунитете.

Множественно модифицированные атерогенные ЛВП, циркулирующие в крови больных с подтвержденным атеросклерозом, вызывали существенное нако-

30

пление липидов в культивируемых интимальных клетках аорты человека. Известно, что именно модифицированные ЛНП, но не нативные ЛНП обладают атеро-генными свойствами, вызывая накопление липидов в клетках артериальной стенки, являясь, тем самым, триггером атерогенеза. Накопление внутриклеточных липидов, вызванное атерогенными модифицированными ЛНП, значимо увеличивало экспрессию НЬАЛЖ (таблица 8). Параллельно увеличивалась экспрессия провос-палительных цитокинов ТОТ-а и 1Ь-1.

Таблица 8. Влияние множественно модифицированных ЛНП на накопление внутриклеточных липидов и экспрессию шшунокомпетентных молекул

Накопление внутриклеточных липидов, % от контроля Экспрессия, % от контроля

HLA-DR TNF-a IL-1

Контроль 100±3 100±12 100±2 100±12

Модифицированные ЛПНП 201±27* 167±6* 142±4* 156±4*

* - достоверное увеличение показателей по сравнению с контролем, р<0,05.

Мы обнаружили положительную корреляцию с высокой степенью статистической значимости между накоплением внутриклеточных липидов и экспрессией HLA-DR, TNF-a и IL-1. Таким образом, экспериментами на первичной культуре интимальных клеток аорты мы установили, что именно накопление липидов в клетках артериальной стенки стимулирует представление антигенов и, возможно, активизирует другие механизмы клеточного иммунитета.

Обнаруженная связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в атерогенез воспаления и клеточного иммунитета является научным заделом, позволяющим рассматривать антицитокиновые средства как потенциальные антиатеросклеротические лекарственные препараты.

В модели in vitro изучали влияние на противовоспалительную активность 31 лекарственного растения.

В опытах на модели ex vivo принимали участие здоровые добровольцы, не имеющие признаков клинических проявлений атеросклероза или системных воспалительных заболеваний, у которых, тем не менее, при первичном обследовании

31

была выявлена атерогенность сыворотки крови - способность сыворотки крови вызывать накопление липидов в культивируемых клетках. У добровольцев брали кровь непосредственно до приема настоя лекарственных трав, а также через соответствующие интервалы времени после приема настоя внутрь.

Сыворотка крови была использована в дальнейшем для определения влияния настоя лекарственной травы на атерогенные и провоспалительные свойства сыворотки крови.

На основе полученных данных была получена интегральная оценка противовоспалительного эффекта лекарственных трав и их комбинаций. В конечном счете, были получены данные по ингредиентному составу разрабатываемого натурального противовоспалительного препарата. Данный препарат должен содержать следующие растительные объекты: цветки календулы обыкновенной, плоды бузины черной и траву фиалки трехцветной. Противовоспалительная эффективность этой комбинации составляет 88% от эффективности диклофенака, одного из самых мощных нестероидных противовоспалительных средств, применяемых в современной медицине. Цветки календулы обыкновенной, плоды бузины черной и трава фиалки трехцветной были отобраны для создания противовоспалительных препаратов.

Для этого была разработана рецептура БАД (фитопрепарата), всостав которого вошли оптимальные количества указанных растений, а также вспомогательные средства, обеспечивающие, в том числе, пролонгированность действия БАД (фитопрепаратов). Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 9. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлении исследовательских испытаний представлены в Приложении.

Таблица 9. Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище (фитопрепарату) «Противовоспалительное антицитокиновое средство, обладающее прямым антиатеросклеротическим действием»

Наименование ингредиента Содержание, % Масса, мг

Цветки бузины черной 21,0 145

Цветки календулы 21,0 145

Фиалка трехцветная 21,0 145

Лактоза 24,0 39

Стеариновая кислота 7,8 6

Поливинилпирролидон 5,2 20

Итого 100 500

С позиции лекарство-мишень отметим, что мишенью обнаруженных нами эффективных противовоспалительных растительных объектов являются, видимо, имму-но-воспалительные клетки в целом и провоспалительные цитокины в частности. О компонентах растений, действующих, вероятно, на эти мишени, известно следующее.

Календула обыкновенная содержит каротиноиды - до 3% (3-каротин, лико-пин, люткеин, виолаксантин, цитроксантин, неоликопин, хризантемаксантин, фла-воксантин, рубиксантин); флавоноиды (до 4%), сапонины, фитонциды, эфирные масла, горькие и дубильные вещества, смолы (около 3,5%). Бузина черная содержит флавоноиды, фитостеролы, кислоту салициловую. Трава фиалки трехцветной содержит флавоновый гликозид виолакверцетин и антоциановые гликозиды -дельфинидин, пеонидин, виоланин (состоящий из дельфинидина, глюкозы, рамно-зы и оксикоричной кислоты).

ВЫВОДЫ

1. Установлена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы, переносящей с ЛНП сиаловую кислоту на акцепторы плазмы крови (гликопротеи-ды и гликолипиды).

2. Разработана ферментативная модель ex vivo на основе оценки транс-сиалидазной активности. Модель использована для создания антиатерогенного натурального препарата, подавляющего активности транс-сиалидазы, то есть препятствующего атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности.

3. Выявлена способность эстрогена (эстрадиола) и андрогена (дигидротесто-стерона) подавлять накопление холестерина в моноцитах-макрофагах, то есть препятствовать развитию атерогенеза на клеточном уровне.

4. Разработана клеточная модель для оценки антиатерогенной активности натуральных продуктов, обогащенных фитоэстрогенами. Модель использована для

создания антиатерогенного натурального препарата, обогащенного фитоэстроге-нами, предназначенного для женщин в период пери- и постменопаузы.

5. Вклад каналов, использующих апоА-1, определен как основной в суммарном экспорте холестерина из макрофагов в сопоставлении с каналами, использующими в качестве акцептора ЛВП плазмы крови.

6. Учитывая большое разнообразие факторов, влияющих на обратный транспорт холестерина, а также их возможных комбинаций, разработана и создана клеточная модель, позволяющая оценивать интегральный показатель - суммарное снижение уровня холестерина в клетке. Созданная клеточная модель была использована для разработки натурального препарата, вызывающего снижение холестерина в клетках жирового атеросклеротического поражения, то есть способствующего регрессии атеросклероза на клеточном уровне.

7. Выявлена высокая степень положительной корреляции между отложением липидов, содержанием иммуно-воспалительных клеток и экспрессией молекул НЬА-

главного комплекса гистосовместимости класса П в диффузном утолщении интимы. Обнаружено, что накопление внутриклеточных липидов, вызванное атероген-ными модифицированными ЛИП, значимо увеличивает как экспрессию НЬА-ОЯ, так и экспрессию провоспалительных цитокинов ТОТ-а и 1Ь-1.

8. Разработана и создана клеточная модель для оценки секреции про- и противовоспалительных молекулярных регуляторов и маркеров. Созданная модель использована для создания антиатерогенного противовоспалительного натурального препарата, способствующего подавлению воспалительных реакций, выявляемых даже при самых ранних атеросклеротических изменениях в сосудистой стенке.

9. Разработанные натуральные препараты прошли испытания по тестированию физико-химических свойств и показателей химической и микробиологической безопасности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рассматривать изученные в диссертации модели в качестве эффективного инструмента для поиска и создания новых препаратов природного происхождения антиатеросклеротического действия.

2. Все научно-технические разработки передать для производства ППП компании ООО «ИНАТ-Фарма».

3. Использовать данные, касающиеся изученных аспектов патогенеза атен-росклероза, в учебном процессе на кафедрах медико-биологического профиля биологических и медицинских факультетов ВУЗов и Институтов усовершенствования врачей, а также в работе научно-исследовательских институтов, занимающихся проблемами сердечно-сосудистой патологии человека.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и зарубежных научных журналах

1. Карагодин В.П.. Черткоева З.А., Глазер В.М., Костромина Н.В., Полякова О.В., Котелевцев C.B. Анализ генетической безопасности биологически активных добавок, получаемых из растительного и животного сырья // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. - 2007. - Т. 112.-№ 1.-С. 194-199.

2. Букринский М.И., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П.. Собенин И.А., Сазонова М.А., Коренная В.В., Орехова В.А., Иванова М.М., Мясоедова В.А., Мельниченко A.A., Савинкова И.Г., Орехов А.Н. Повреждение механизма обратного транспорта холестерина, вызванное вирусом иммунодефицита человека: роль АВ-CAl-зависимого пути // Бюлл. МОИП. - 2009. - Т. 114. - С. 297-301.

3. Грачев А.Н., Карагодин В.П.. Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Рудимов E.H., Орехова Е.А., Хренов М.О., Авхачева Н.В., Мубаракшина Э.К., Кжышков-ская Ю.Г., Орехов А.Н. Выделение моноцитов из крови человека с помощью магнитной сепарации для последующего использования в клеточной тест-системе // Бюлл. МОИП. - 2010. - Т. 115. - С. 117-119.

4. Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П.. Ковалевская Ж.И., Мясоедова В.А., Шапырина Е.В., Салямов В.И., Каргаполова Ю.М., Галактионова Д.Ю., Мельниченко A.A., Орехов А.Н. Численность клеток и клеточная пролиферация в интиме различных артерий человека // Цитология. - 2011. - №53(10). - С. 59-69.

5. Букринский М.И., Карагодин В.П.. Свиридов Д.Д., Орехов А.Н. Вирусная инфекция и метаболизм холестерина в макрофагах // Сибирский медицинский журнал. - Т. 26. - 2011. - №1. - С. 9-14.

6. Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Меркулова Д.М., Собенин И.А., Меркулов Ю.А., Мухамедова Н.М., Мартиросян Д.М., Карагодин В.П.. Орехов А.Н. Новый биомаркер в ранней диагностике цереброваскулярной патологии: диффузное интимо-медиальное утолщение сонных артерий // Биомедицинский журнал Медлайн.ру. - 2011. - №11. - Т. 12. - С.998-1007.

7. Орехов А.Н., Собенин И.А., Орехова В.А., Мельниченко A.A., Мясоедова В.А., Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П. Клеточные модели для поиска веществ, способствующих обратному транспорту холестерина II Биомедицинский журнал Медлайн.ру. -2011.-№10.-Т.1.-С. 1134-1146.

8. Собенин И.А., Карагодин В.П.. Мельниченко A.A., Орехов А.Н. Иммунный холестерин в крови - прогностическая ценность // Биомедицинский журнал Медлайн.ру. - 2011. - №10. - Т.12. - С. 1147-1155.

9. Собенин И.А., Сурнин С.А., Карагодин В.П.. Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Чупракова О.В., Кожевникова Ю.А., Ковалевская JI.O., Орехов А.Н. Вариабельность показателя толщины интимо-медиального слоя общих сонных артерий в московской городской популяции среди лиц без клинических проявлений атеросклероза // Терапевтический архив. - 2011. - Т. 83. - № 12. - С.58-62.

10. Собенин И.А., Сурнин С.А., Карагодин В.П.. Прянишников В.В., Орехов А.Н. Опыт применения пребиотика пролонгированного действия Алликор // Здравоохранение Российской Федерации. - 2011. — № 3. - С.28-31.

11. Феоктистов A.C., Орехова Е.А., Мясоедова В.А., Смутова В.А., Собенин И.А., Карагодин В.П.. Пшежецкий A.B., Орехов А.Н. Роль сиаловой кислоты в проявлении атерогенных свойств липопротеидами низкой плотности // Биомедицинский журнал Медлайн.ру. - 2011. - №11. - Т. 12. - С. 1098-1117.

12. Feoktistov Alexander S., Karagodin Vasiliy P.. Sobenin Igor A., Suprun Igor V., Alexandra A. Melnichenko, and Alexander N. Orekhov. The Interaction of Plasma Sia-lylated and Desialylated Lipoproteins with Collagen from the Intima and Media of Unin-volved and Atherosclerotic Human Aorta // Journal of Lipids. 2011. - Vol.9. - P.8.

13. Собенин И.А., Карагодин В.П.. Мельниченко A.A., Орехов А.Н. Холестерин циркулирующих иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. — №3. - С. 99103.

14. Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П., Мойсенович М.М., Гаврилин М.А., Мельниченко A.A., Орехова В.А., Бородачёв E.H., Собенин И.А., Орехов А.Н. Клеточные сети интимы аорты и гомеостаз кровеносных сосудов // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2012,- Т. 13. - С. 408-432.

15. Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П.. Орехов А.Н. Дендритные клетки и их роль в иммунных процессах атерогенеза// Цитология. - 2012. -№54 (11). - С. 3-15.

16. Жуковский Н.С., Собенин И.А., Карагодин В.П.. Ковалев Л.И., Мясо-едова В.А., Банфи К., Шишкин С.С., Орехов А.Н. Изменения протеомного профиля интимы и медии аорты человека при атеросклерозе // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. -0 №12 (4). - С.82-87.

17. Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Орехова В. А., Собенин И. А., Мухаме-дова Н.М., Мартиросян Д.М., Карагодин В.П.. Орехов А.Н. Изучение толщины интимо-медиального слоя сонных артерий (ТИМ) как показателя естественного течения атеросклероза в московской популяции // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 2012. — № 3. — С.43—50.

18. Орехов А.Н., Собенин И.А., Орехова В.А., Мельниченко A.A., Мясоедова В.А., Мухамедова Н.М., Мартиросян Д.М., Пшежецкий A.B., Карагодин В.П. Клеточные тест-системы для выявления антиатеросклеротической активности фармакологических веществ и изучения механизмов их действия // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - № 1. - С. 33-39.

19. Bobryshev Yu.V., Karagodin V.P.. Kovalevskaya Zh.I., Myasoedova V.A., Shapyrina E.V., Salyamov V.l., Kargapolova Yu.M., Galaktionova D.Yu., Melnichenko A.A., and Orekhov A.N. The Number of Cells and the Cell Proliferation in Intima of Various Human Arteries // Cell and Tissue Biology. - 2012. - Vol. 6. - №1, P. 29-39.

20. Karagodin Vasilv P.. Sobenin Igor A., Andrianova Irina V., Ionova Victoriya GOrekhov Alexander N. Anti-Aggregatory and Fibrinolytic Effects of Time-Released Garlic Powder Tablets // Medical and Health Science Journal. - 2012. - Vol. 10. - P. 47-51.

37

21. Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П.. Мойсенович М.М., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Анализ воспалительных процессов в диффузном утолщении интимы аорты человека // Цитология. - 2013. - №55 (6). - С. 394-405.

22. Карагодин В.П. Биологически активные добавки к пище - товарная группа с неясной перспективой (часть 1) // Товаровед продовольственных товаров. -2013.-№3,-С. 15-20.

23. Карагодин В.П. Биологически активные добавки к пище - товарная группа с неясной перспективой (часть 2) // Товаровед продовольственных' товаров. -2013,-№4.-С. 5-13.

24. Карагодин В.П.. Жукова С.С. Биологически активные добавки к пище -товарная группа с неясной перспективой (часть 3) // Товаровед продовольственных товаров. - 2013. - №5. - С. 5-10.

25. Bobryshev Y.V., Karagodin V.P., Moisenovich М.М., Melnichenko A.A. and Orekhov A.N. Analysis of Inflammatory Processes in Diffuse Thickening of Human Aorta Intima // Cell and Tissue Biology. - 2013. - Vol. 7. - N. 5. - P. 439-449.

26. Bobryshev Yu.V., Karagodin V.P.. Orekhov A.N. Dendritic cells and their role in immune reactions of atherosclerosis // Cell and Tissue Biology. - 2013. - Vol.7(3) .-P. 113-125.

27. Sobenin I.A., Karagodin V.P.. Melnichenko A.C., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Diagnostic and prognostic value of low density lipoprotein-containing circulating immune complexes in atherosclerosis // Clin. Immunol. - 2013. - V. 33(2). - P. 489-495.

Статьи в иных рецензируемых научных журналах

28. Карагодин В.П.. Черткоева З.А. Возможность использования биотестирования для предварительной оценки эффективности БАД // Рынок БАД. — 2006. -№5 (31).-С. 34-35

29. Мельниченко А.А., Аксенов Д.В., Ярославов А.А., Карагодин В.П.. Со-бенин И.А., Орехов А.Н. Плюроники подавляют ассоциацию липопротеидов низкой плотности // Патогенез. - 2011. - № 3. - С.47-50.

30. Букринский М.И., Карагодин В.П.. Свиридов Д.Д., Орехов А.Н. Изучение эффекта Nef-трансфекции клеток на структуру липидного рафта и обмен холестерина II Патогенез. - 2011. - № 4. - С.46-52.

38

31. Собенин И.А., Феоктистов A.C., Капагодин В.П.. Пшежецкий A.B., Орехов А.Н. Липопротеиды низкой плотности в атерогенезе - значение сиаловой кислоты // Патогенез. - 2011. - №2. - С. 48-54.

32. Грачев А.Н., Капагодин В.П.. Агафонова М.В., Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Рудимов E.H., Мельниченко A.A., Орехов А.Н. Использование парамагнитных наночастиц для получения чистых культур макрофагов // Патогенез. -2012. - №4. - С.46-50.

33. Орехов А.Н., Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Капагодин В.П.. Мельниченко A.A., Мясоедова В.А., Орехова В.А., Собенин И.А. Исследование противовоспалительного эффекта липопротеидов высокой плотности // Патогенез. -2012. - № 6. - С.43-48.

34. Капагодин В.П.. Орехова В.А., Мельниченко A.A., Орехов А.Н. ЛВП-терапия - терапевтические подходы к коррекции дисфункций липопротеидов высокой плотности // Патогенез. - 2013. - № 1. - С.38—45.

Тезисы докладов на конференциях

35. Karagodin V.P.. Sobenin I.A., Orekhov A.N., Kubatiev A.A. Serum athero-genicity measurement as a Potential Bioindicator for the Assessment of environmental effects // Тез. докладов на XVII Междун. конф. «Биоиндикаторы в окружающей среде». - М., 2009.

36. Бобрышев Ю.В., Капагодин В.П.. Ковалевская Ж.И., Шапырина Е.В., Каргаполова Ю.М., Галактионова Д.Ю., Салямов В.И., Орехов А.Н. Клеточные механизмы атеросклероза: врожденный иммунитет и воспаление // Фундаментальные науки и практика. - 2010. - №1(4). - С.140-148.

37. Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Капагодин В.П.. Орехова В.А., Мясоедова В.А., Мельниченко A.A., Собенин А.И., Орехов А.Н. Липопротеиды высокой плотности: терапевтические подходы (ЛВП-терапия) // Фундаментальные науки и практика. - 2010. -№1(4). -С. 116-126.

38. Мясоедова В.А., Капагодин В.П., Нейфельд И.В., Силина Т.С, Гитинова X. М., Тиханина О.В., Мартиросян Д.М., Курмачева H.A., Орехов А.Н. Механизмы

половых различий при атеросклерозе // Фундаментальные науки и практика. -2010.-№1(4).-С. 51-58.

39. Орехов А.Н., Карагодин В.П., Мельниченко A.A., Кириченко Т.В., Сму-това В.А., Чернова У.В., Сафонова В.М., Калабушев С.Н., Пшежецкий A.B. Сиало-мика и атеросклероз // Фундаментальные науки и практика - 2010. - №1(4). - С.59-65.

40. Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П.. Ковалевская Ж.И., Шапырина Е.В., Каргаполова Ю.М., Галактионова Д.Ю., Салямов В.И., Орехов А.Н. Пролиферация клеток при различных типах поражения сонных и коронарных артерий // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. - 3(1). - С. 80-83.

41. Карагодин В.П.. Собенин И.А., Мухамедова Н.М., Мельниченко A.A., Смутова В.А., Орехова В.А., Мясоедова В.А., Никифоров Н.Г., Сюсина М.А., Горшкова Т.Н., Бордачев E.H., Ромкина А.Ю., Орехов А.Н. Белок переноса фос-фолипидов увеличивает отток клеточного холестерина и фосфолипидов, вызванный аполипопротеинами липопротеидов высокой плотности // Современный мир, природа и человек. - 2011. - №2(1). - С.38-45.

42. Кжышковская Ю.Г., Грачев А.Н., Карагодин В.П.. Орехова В.А., Мельниченко A.A., Орехов А.Н. Роль хемокинов в регуляции воспаления и инициации опухолей // Мат-лы VI Междун. телеконференции «Фундаментальные науки и практика». - Томск, 2011. - Т.7. - С. 13-17.

43. Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П.. Мельниченко A.A., Мясоедова В.А., Орехова В.А., Собенин И.А., Орехов А.Н. Липопротеиды высокой плотности подавляют воспалительную реакцию моноцитов // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. - №3(1). - С.64—68.

44. Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П.. Мельниченко A.A., Мясоедова В.А., Орехова В.А., Собенин И.А., Орехов А.Н. Исследование влияния белков, потенциально вовлеченных в отток холестерина, на экспорт холестерина из макрофагов // Проблемы и перспективы современной науки. — 2011. - 3(1). - С.68-73.

45. Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Орехова В.А., Собенин И.А., Карагодин В.П.. Орехов А.Н. Изучение показателя толщины интимо-медиального слоя сонных артерий (ТИМ) как показателя естественного течения атеросклероза в

40

московской популяции // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. -3(1).-С. 96-98.

46. Орехов А.Н., Собенин И.А., Орехова В.А., Мельниченко A.A., Мясоедо-ва В.А., Мухамедова Н.М., Свиридов Д.Д., Карагодии В.П. Клеточные модели для поиска веществ, способствующих обратному транспорту холестерина // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. - 3(1). - С. 98-103.

47. Сурнин С.А., Собенин А.И., Карагодчн В.П.. Орехов А.Н. Индуцирующая роль вирусов острых респираторных вирусных инфекций в прогрессии атеро-склеротического процесса // Проблемы и перспективы современной науки. — 2011. — 3(1). - С.57-58.

48. Сурнин С.А., Собенин И.А., Карагодии В.П.. Орехов А.Н. Массовая апробация эффективности пребиотика «Алликор» в отношении показателей заболеваемости острыми респираторными вирусными инфекциями у детей // Проблемы и перспективы современной науки: Межвузовский сборник науч. тр. участников 4-й междун. телеконф. "Фундаментальные науки и практика" / Томск, гос. ун-т, Сибир. гос. мед. ун-т. - Томск, 2011. - Т. 3, № 1. - С. 78-79.

49. Сурнин С.А., Собенин И.А., Карагодии В.П.. Орехов А.Н. Результаты апробации пребиотика «Алликор» в условиях оздоровительной программы по профилактике респираторных и сердечнососудистых заболеваний // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. - 3(1). - С.76-78.

50. Грачев А.Н., Кжышковска Ю.Г., Карагодчн В.П.. Эдельман Е., Гаври-лин М.А., Орехов А. Н. СС-Хемокины и регуляция иммунных клеток в норме и патологии // Актуальные проблемы современной науки: Сб. науч. тр. VII Междун. телеконференции, 2012. - С. 45-50.

51. Orekhov A., Karagodin V.. Sobenin I., Melnichenko A., Gratchev A., Feoktistov A., Nikiforov N., Borodachev E., Orekhova V., Gavrilin M. The diagnostic and prognostic value of low density lipoprotein-containing circulating immune complexes in atherosclerosis // XVI International Symposium on Atherosclerosis. -Sedney, Australia. - 2012. - P.74.

52. Karagodin Vasilii P., Orekhov Alexander N., Bobryshev Yuri V., Sobenin Igor A. Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis: Possible Role of Stem cells and Osteoblasts // Cell Science & Stem Cell Research. - Hilton San Antonio, 2012. - P. 29.

53. Nikiforov N., Karagodin V.P.. Orekhov A.N., Melnichenko A.A., Sobenin I. A. Expression of TNFalfa and CCL18 is increased as a result of cholesterol accumulation in macrophages // Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions. - 2013. - №5. - P. 122.

Патент

Патент № 2484841 от 20 июня 2013 г. «Средство для профилактики и лечения атеросклероза, подавляющее атерогенную модификацию липопротеидов».

Монографии

1. Карагодин В.. Собенин И., Орехов А. Протеомика атерогенеза. — Germany: LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012.-242 с.

2. Карагодин В.П. Качество и безопасность биологически активных добавок к пище. - Germany: LAP LAMBERT Academic Publishing, 2013. - 152 с.

3. Карагодин В.. Орехов А. Терапия атеросклероза на основе препаратов природного происхождения. - Germany: PALMARIUM Academic Publishing, 2013.-318 с.

Vasily Petrovich KARAGODIN

PATHOGENETIC APPROACHES TO TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS BASED ON DRUGS OF NATURAL ORIGIN

Atherosclerosis and vascular disorders which result from atherosclerosis represent one of the major problems in the modern medicine and public health. Despite the enormous investments in investigation of atherosclerosis that have been made, the mechanisms that initiate the development of this disease and changes in the cells in affected arteries remain not well understood. The initial aim of the present thesis was to elucidate the structural and functional aspects of the development of atherosclerosis in humans.

This work showed that the processes taking place in early atherosclerosis stages are different in various intima sublayers. We decline to believe that the juxtalumenal layer is the «area» for initiation of immune processes whereas in juxtamedial sublayer lipids are kept inside degrading elastic fibers. Disruption of elastic fibers in intima depth may be the most early and important event in generation of fiber-free focal zones where lipid-necrotic locus will be finally formed.

Later we studied anti-atherosclerotic and anti-cytokine activity of natural substances in primary culture of blood-derived macrophages. It was shown that the dietary supplements, based on elder berries, calendula and violet flowers possessed anti-inflammatory activity compared with the effect of Diclofenac. At the same time it suppressed the intracellular cholesterol accumulation in cultured cells as well as garlic powder tablets Allicor did. Thus, performed combination possesses double mechanism of action (anti-atherosclerotic and anti-cytokine) and may be considered as the effective basis for the development of novel clinical implications for long-term atherosclerosis prevention and treatment.

Using models developed we identified natural products suitable to produce anti-atherosclerotic therapeutic action and drugs potential. We also developed formulations of the new natural drugs. The results of the analysis and developmens that are provided in the thesis give a comprehensive picture of the cellular mechanisms of therosclerosis. Natural products which have been developed by research were effective and were tested on physical and chemical properties and chemical and microbiological safety.

Подписано в печать: 26.11.13

Объем: 1,9 п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 177 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru