Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетические основы лизосомотропизма и система мононуклеарных фагоцитов при развитии хронических патологических процессов

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

КУРУНОВ Юрий Николаевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЛИЗОСОМОТРОПИЗМА И СИСТЕМА МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

14.00.16 — патологическая физиология 14.00.26 — фтизиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

НОВОСИБИРСК 1996

Работа выполнена в Новосибирском научно-исследовательском институте туберкулеза МЗМП РФ и Новосибирском медицинском институте.

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН Заслуженный врач РСФСР

доктор медицинских наук, профессор И.Г.УРСОВ Член-корреспондент СО АНВШ

доктор медицинских наук, профессор В.А.ШКУРУПИЙ

Официальные оппоненты: Заслуженный дяетель науки России

доктор медицинских наук, профессор Г.И.НЕПОМНЯЩИХ доктор медицинских наук, профессор А.В.ЕФРЕМОВ доктор медицинских наук, профессор М.А.ВЛАДИМИРСКИЙ

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН

Защита диссертации состоится " ХЗ" _1996 г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 001.40.01

в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8-383-2-32-31-56, факс 8-383-2-32-43-39).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.

Автореферат разослан ". _1996 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.40.01

доктор биологических наук ЕЛЛУШНИКОВА

Актуальность проблемы

Данные эпидемиологической статистики свидетельствуют о четкой корреляции частоты наиболее распространенных заболеваний человека с прогрессирующим ухудшением экологической обстановки в мире, что обусловлено очевидным снижением естественной резистентности (ЕР) организма, в реализации которой одна из ключевых позиций принадлежит макрофагам.

Актуальной задачей современной медицины является развитие новых подходов в терапии хронических заболеваний, предполагающих патофизиологически обоснованную разработку медикаментозных средств и принципов лечения, направленных на повышение ЕР организма путем использования этиопатогенетических средств с преимущественной адресацией к клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Центральная позиция СМФ в процессах гомеостатирования базируется на эволюционно сформированных механизмах утилизации биологических повреждающих агентов на уровне вакуолярного аппарата макрофага. При этом важное значение приобретает завершенность фагоцитоза объектов белкового происхождения, где недостаточность СМФ как количественного, так и функционального генеза является основой возникновения целого ряда хронических патологических состояний, к которым, в первую очередь, следует отнести рак и специфические воспалительные процессы с внутриклеточной персистенцией возбудителя. В частности, это относится к проблеме борьбы с туберкулезом (Хоменко А.Т.,1990; Урсов И.Г.,1995). Общим приоритетным направлением в борьбе с туберкулезом и раком является разработка новых этиопатогенетических подходов в химиотерапии этих заболеваний, основанных на комплексировании высокоэффективных эти-отропных агентов с препаратами, обладающими выраженной способностью к повышению ЕР организма. Правомерность разработки единой стратегии лечения этих различных по этиологии заболеваний проистекает из общности дефектов гомеостатической системы естественной резистентности, реализуемых, главным образом, на уровне СМФ.

Избирательная кумуляция различных веществ в соответствующих компартментах вакуолярного аппарата, сопряженная с изменением функционального статуса клетки и реактивности организма в целом, послужила основанием для формирования концепции лизосомотропизма (йе Соте С. ег а1.,1974). Возросший интерес к проблеме лизосомотропизма вызван постоянно увеличивающимся арсеналом полимерных лекарственных препаратов, терапевтическая эффективность которых во многом определяется их лизосомотропностью. Проблема негативных

эффектов лизосомотропизма, сформулированная в свое время Де Дювом (1974), наиболее актуальна в последние годы в связи с созданием нового класса комплексных лекарственных препаратов и с резко возросшей потребностью в синтетических плазмозамещающих препаратах и гемотрансфузионной терапии (Шкурупий В.А., 1994).

Обязательность участия макрофага в осуществлении ЕР и клиринговых процессах (Маянский Д.Н., 1982; Ломакин М. С., 1990) предопределяет возможность модификации функционального состояния этой гомеостатирущей системы посредством индуцированных лизосо-мотропными препаратами (ЛТП) изменений статуса фагоцитов. В этой связи, особый интерес представляют ЛТП, обладающие иммуномодули-рующими свойствами. Наряду с этим, способность ЛТП к избирательной кумуляции в клетках СМФ является очевидной предпосылкой к использованию лизосомотропных форм лекарственных препаратов зтиопа-тогенетического плана. Создание их может быть основано на комп-лексировании высокоактивного этиотропного компонента с лизосомот-ропным носителем, способным доставлять действующее начало в микроокружение внутриклеточно персистирующего возбудителя заболевания, повышая при этом функциональную активность инфицированного макрофага и всей системы в целом.

Цель исследования.

Целью исследования является изучение эффектов модификации функционального состояния клеток СМФ лизосомотропными препаратами и патофизиологическое обоснование принципов разработки лизосомотропных лекарственных средств и схем их применения в этиопатогене-тической терапии заболеваний с доминирующей ролью макрофагов.

Задачи исследования:

1. Определить возможные механизмы модуляции естественной резистентности на модели модификации роста экспериментальных опухолей лизосомотропными препаратами.

2. Оценить эффекты применения новых лизосомотропных лекарственных форм при опухолевом росте и хроническом специфическом инфекционном процессе.

3. Изучить особенности развития туберкулезного гранулематоз-ного процесса при различных режимах применения лизосомотропного препарата.

4. Определить возможные последствия применения лизосомотропных форм лекарственных препаратов.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате исследования эффектов применения вакцины БЦЖ в качестве лизосомотропного противоопухолевого фактора показано, что:

- при соблюдении соответствующих условий'использования стандартных элементов экспериментальной модели (штамм опухоли и вакцины) воспроизведен весь спектр модуляции противоопухолевой резистентности;

начальный этап модуляции противоопухолевой резистентности детерминирован модификацией воспалительного процесса в микроокружении опухолевого трансплантата стресс-реакцией на введение ОК и ЛТП;

- противоопухолевый эффект вакцины при трансплантации ОК в смеси с БЦЖ детерминирован массивным лизисом ОК активированными эффекторами гранулематозкого воспаления и, как следствие, снижением количества трансплантированных жизнеспособных клеток, дающих начало опухолевому росту (перевивочная доза), и формированием более выраженного противоопухолевого иммунитета;

- отвлечение эффекторов ЕР в район введения БЦЖ незадолго до трансплантации ОК в отдаленное место сопровождается выраженной стимуляцией опухолевого роста, не уступающей по интенсивности действию классических иммунодепрессантов;

- стимуляция опухолевого роста на данной модели не связана с индукцией вакциной Т-лимфоцитов-супрессоров иммунного ответа, а обусловлена перераспределением и модификацией кондиционирования эффекторов ЕР. Как следствие этих процессов происходит ослабление воспалительной реакции на опухолевый трансплантат, что проявляется в сохранении перевивочной дозы ОК и снижении интенсивности формирования противоопухолевого иммунитета;

- подавление синтеза одного из ключевых медиаторов с1ощ-ре-гуляции процесса активации эффекторов ЕР простагландина Е2 ингибиторами циклооксигеназы существенно потенцирует противоопухолевый эффект БЦЖ при введении ее в смеси с ОК;

- "секвестрация" в микроциркуляторном русле легких активированных эффекторов циркулирующего пула ЕР,' являясь компонентом стресс-реакции на воспаление, носит неспецифический защитный характер, детерминирующий противоопухолевую и противоинфекционную

резистентность, что подтверждено снижением метастазирования ОК в легкие и ослаблением выраженности специфического поражения легочной ткани при значительном увеличении продолжительность жизни зараженных туберкулезом животных.

Впервые разработана технология получения и определена терапевтическая эффективность лиофилизированной липосомальной формы противоопухолевых гормоноцитостатиков и основных противотуберкулезных препаратов в эксперименте.

В результате скринингового определения эффективности полученных липосомальных форм противотуберкулезных препаратов разработан высокоэффективный патогенетически обоснованный метод их применения при ультразвуковой ингаляционной терапии экспериментального туберкулеза.

Патогенетически обоснована необходимость разработки нового класса лизосомотропных противотуберкулезных препаратов с заданными свойствами, которая реализована в конкретной технологии получения пролонгированной формы изониазида в виде комплекса действующего начала с лизосомотропной декстрановой матрицей.

На основании результатов исследований, проведенных на модели лечения хронического генерализованного туберкулезного процесса полученным лизосомотропным комплексным препаратом изониазида, дано патогенетическое обоснование возможных механизмов модификации гранулематозного процесса, проявляющейся в ускоренном снижении количества и размеров гранулем и степени фиброзирования тканей органов на фоне существенного снижения гепатотоксичноети предложенной полипотентной лекарственной формы изониазида.

Обоснована необходимость и разработаны принципы создания пролонгированных препаратов на базе биодеградабильной лизосомотропной матрицы для лечения гранулематозных заболеваний.

Научно-практическая значимость полученных результатов подтверждена решениями о выдаче патентов по базовым аспектам проблемы: 1. Способ подавления индуцированного аллотрансплантационного иммунитета. // Решение о выдаче патента по заявке 93004277/14 (004513) от 18.10.95. Авторы: Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова Н.А., Яковченко Н. Н.. 2. Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса в эксперименте. // Решение о выдаче патента по заявке 93015116/14 (014612) от 30.10.95). Авторы: Шкурупий В.А.. Курунов Ю.Н., Чернова Т. Г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Начальная фаза модификации противоопухолевой резистентности лизосомотропными препаратами адьювантного типа определяется состоянием циркулирующего пула эффекторов ЕР, детерминируемым, в свою очередь, местом и стадией развития воспалительных реакций на трансплантированную опухоль и на введение адьюванта.

- Использование лизосомотропных комплексных и липосомальных форм химиопрепаратов является перспективным направлением в повышении эффективности этиопатогенетической терапии туберкулеза и рака.

- Потенцирование антимикобактериальной активности коньюгиро-ванного с лизосомотропным декстраном изониазида обусловлено созданием более высоких концентраций действующего начала в непосредственном микроокружении фагоцитированного макрофагом возбудителя и активацией энергопластических процессов в эффекторах гра-нулематозного воспаления.

- Высокая эффективность интесмиттирующих режимов применения разработанных лизосомотропных форм противотуберкулезных препаратов обусловлена модификацией процесса патологического симбиоза персисгирующих форм возбудителя заболевания и макрофага.

Апробация работы Материалы диссертации были доложены или представлены на 8-ом Всесоюзном съезде фтизиатров (Москва,1973); Всесоюзном симпозиуме "Иммунология опухолей" (Киев, 1975); 1У-ой научной конференции по проблемам клинической иммунодиагностики " Теоретическая иммунология - практическому здравоохранению" (Таллин, 1978); Всесоюзном симпозиуме "Фагоцитоз и иммунитет" (Москва, 1983); 4-ом Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишенев, 1989); 1-ом Всесоюзном съезде иммунологов (Москва, 1989); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. " (Москва, 1991); Всесоюзном симпозиуме с международным участием " Патогенез хронического воспаления." (Новосибирск, 1991); научной конференции " Механизмы патологических реакций." Новокузнецк, 1991); Х1-ом Всесоюзном съезде фтизиатров (С-Петер-бург, 1992); 1-ом съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); 3-ем Национальном конгрессе по болезням органов дыхания' ((^Петербург. 1992); 4-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1994); II (XII)-ом съезде врачей-фтизиатров (Саратов, 1994); Научной конференции "Проблемы экспериментальной и

клинической лимфологии." (Новосибирск,1994); Научной конференции "Современные проблемы фтизиатрии и пульмонологии в Сибири" (Томск. 1994); 5-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995); научной конференции "Актуальные вопросы современной медицины" (Новосибирск, 1995); научной конференции "Актуальные вопросы патофизиологии лимфатической системы" (Новосибирск, 1995); научной конференции "70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза" (Новосибирск, 1995).

Работа выполнялась в Новосибирском НИИ туберкулеза МЗиМП РФ и на базах лаборатории генетики рака Института цитологии и генетики СО РАН, кафедры патологической анатомии и центральной научно-исследовательской лаборатории Новосибирского медицинского института. Исследования по модификации противоопухолевой резистентности вакциной БЦЖ, химиотерапии рака и туберкулеза с применением липосомальных форм хкмиопрепаратов выполнена в совместных экспериментах с сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН В.И. Калединым, H.A. Поповой и В.П. Николиным,с сотрудниками Института биоорганической химии СО РАН В.М. Будкер и Т.Г. Вахруше-вой. Разработка технологии получения комплексного препарата изо-ниазида и изучение особенностей гранулематозного процесса на модели химиотерапии хронического туберкулеза реализованы автором совместно с сотрудниками кафедры патологической анатомии Новосибирского медицинского института Т.Г. Черновой и П. Н. Филимоновым под руководством профессора В.А. Шкурупия и с сотрудником ЦНИЛ медицинского института С.А. Архиповым.

По теме диссертации опубликовано 62 научных работ, 2 из них в зарубежных изданиях, подано 3 заявки на изобретение, на две из которых выданы патенты.

Материалы и методы

Эксперименты по определению влияния ингибиторов циклооксиге-назы на противоопухолевый эффект БЦЖ выполнены на 205-и 3-4-месячных мышах линий А/НеЛ (А/Не), CC57BR/MV (CC57BR) и СВА Lac Sto (СБА), С57В1/6, BALB/c, DD, СЗН/Не и их гибридах первого поколения из вивария Института цитологии и генетики СО АН СССР. Мыши получали натуральный корм и воду ad llbidura. Умерщвление животных и все оперативные вмешательства проводили под эфирным наркозом.

Эксперименты проведены с использованием линейнонеспецифической карциномы Кребс-2 (Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР) и линейноспецифических опухолей из лаборатории генетики рака Института цитологии и генетики СО РАН: аденокарциномы легкого (АЛ) и гепатомы 29 (гистологически - гепатокарцинома). Обе опухоли возникли спонтанно у мышей линии А/Не и СБА, соответственно. Штаммы АЛ и гепатомы 29 поддерживали в асцитной форме на мышах линии А/Не и СБА. а карциномы Кребс-2 - на мышах СС57Вй. Спустя 10 - 14 суток после перевивки опухолей мышей умерщвляли путем дислокации шейных позвонков; задние конечности освобождали от кожи, отсекали и взвешивали. По разнице массы конечности с опухолью и контрлатеральной конечности определяли массу опухоли на весах ВЛТК2 с точностью взвешивания до ± 0,1 г. Результаты оценивали по прививаемости опухолей и торможению их роста по сравнению с контролем; достоверность различий между средними значениями этих показателей у мышей разных групп оценивали по методу х2 (агс-з!п-преобразование Фишера) и с помощью I критерия Стьюдента - соответственно.

Эксперименты по изучению лекарственного патоморфоза хронического диссеминированного туберкулеза выполнены совместно с П.Н. Филимоновым на мышах-самцах (СВАхС57В1/6)Р1 2-х месячного возраста. массой тела 19-20 г.

Диссеминированньгй туберкулез моделировали внутрибрюшинным заражением животных вакциной БЦЖ (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток). Каждому животному!вводили 0,5 мг вакцины. Одна группа мышей (10 особей) служила интактным контролем. Мыши опытной серии через 2 мес после заражения были разделены на 3 группы. Первая группа -нелеченные - служила контролем. Мышей второй группы через 2 мес. после заражения начинали лечить в интермиттирующем режиме (2 раза в неделю) (Урсов И.Г.,1993) внутрибрюшинными инъекциями изониази-да в дозе 15 мг/кг массы тела (Машковский М.Д.,1993). Мышей третьей опытной группы в те же периоды и в том же режиме начинали лечить комплексным лизосомотропным препаратом изониазида (КПИ) на декстрановой матрице. Лечение продолжали в течение 6 месяцев. Органы для исследования забирали через 1, 3, 4, 5, 6 мес от начала лечения.

Синтез КПИ осуществляли по методике К.П.Хомякова и др.(1965) в модификации Ю.Н.Курунова в биохимической лаборатории ЦНИЛ НМИ

(зав. лабораторией - к.б.н. А. Б. Пупышев). В качестве источника декстрана использовали коммерческий плазмозамещающий препарат "реополиглюкин" с ММ 30-40 кД, в качестве действующего начала -коммерческий препарат изониазида.

Объектами исследования служили печень и легкие. Для гистологического исследования образцы органов обрабатывали по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969; Волкова О.В., Елецкий Ю. К., 1971).

Для морфометрического исследования гистологические срезы печени окрашивали по методу ван-Гизона (Меркулов Г.А., 1969).

Для гистологических исследований легких образцы получали из левого легкого (тотально) и правого (средние и нижние отделы). Срезы импрегнировали серебром для выявления аргирофильных волокон по методике Гордона и Свита (Пирс Э., 1969).

Препараты легких подвергали морфометрическому изучению с использованием окулярной сетки из 214 квадратов (Автандилов Г.Г.. 1990). Подсчитывали суммарную объемную плотность аргирофильных волокон в легких.

Для исследования в электронном микроскопе брали образцы печени из правой доли и легкого из верхней дож правого легкого и фиксировали в 1% водном растворе четырехокиси осмия. Ультратонкие срезы контрастировали водными растворами уранилацетата и цитрата свинца (Reynolds E.R., 1963) и просматривали в электронных микроскопах JEM-100/ASID/SEGZ.

Морфометрические исследования выполняли в соответствии с рекомендациями (Автандилов Г.Г., 1973, 1980, 1990; ВейбельЭ.Р., 1970, 1979). При статистической обработке результатов морфометрии использовали методы регрессионного, корреляционного и дисперсионного анализов. Различия между сравниваемыми величинами считали достоверными при Р<0,05.

Эксперимент по определению терапевтической эффективности ли-посомальной формы гормоноцитостатиков выполнен на 435 мышах линий А/Не, CC57BR, DD/He и СБА вивария Института цитологии и генетики СО АН СССР. Использованы штаммы опухолей ГА-1, аденокарцинома легких (АЛ), гепатома No 29. Для перевивки экспериментальным животным опухолевые клетки отмывали от асцитической жидкости, суспендировали в физиологическом растворе в концентрации 1*106 -1*107 клеток/мл и по 0.1 мл суспензии трансплантировали в мышцы

бедра.

Через 1-2 недели после перевивки животных взвешивали и лечили, вводя препараты однократно. Кортифен и тестифенон были получены от докт. Г. К. Герасимовой (ВОНЦ АМН СССР). Препарата растворяли в оливковом масле (кортифен - 4 мг/мл, тестифенон - 12 -15 мг/мл) и вводили подкожно по О,5 - 1,0 мл на 100 г массы тела мышей.

Липосомы готовили из лецитина и холестерина (Харьковское предприятие по производству бактериальных препаратов, СССР). К спиртовохлороформному раствору липидов (40 мг лецитина и 6 мг холестерина в 1 мл) добавляли гормоноцитостатики из расчета 6 мг препарата на 1 мл раствора и смесь выпаривали под вакуумом. Высушенную пленку гидратировали в 5%-ном растворе маннита (Днепропетровское предприятие по производству бактериальных препаратов. СССР), диспергировали ультразвуком на установке УЗДН-ПЧ. 2 (СССР) (5 мин при частоте 22 кГц) и полученные липосомы переносили в ампулы. Последние помещали на ночь в кельвинатор ( - 70°С), после чего лиофильно высушивали, заполняли аргоном, запаивали и хранили до использования в бытовом холодильнике. Перед употреблением лио-филизат регидратировали в исходном объеме воды, разбавляли физиологическим раствором до необходимой концентрации препаратов и вводили мышам внутривенно по 1 мл на 30 г массы тела либо подкожно в объеме 1 мл на 100 г массы тела. Все операции по приготовлению липосом и манипуляции при введении их животным проводили в асептических условиях.

Через 7-10 дней после лечения мышей умерщвляли, задние конечности освобождали от кожи, отсекали и взвешивали, и по разнице между массой ноги с опухолью и контралатеральной ноги определяли массу опухоли. О токсическом действии препаратов судили по снижению массы тела леченых ими мышей к моменту забоя, которое определяли в процентах от исходной (до лечения).

Результаты исследования и их обсуждение

1.1. Отсутствие Т-супрессорного компонента стимуляции опухолевого роста.

Стимуляция роста опухолевых трансплантатов карциномы Кребс-2 при контрлатеральном введении БЦЖ оказалась равноценной как у ин-тактных, так и у предобработанных циклофосфамидом (ЦФ) животных,

при сохранившейся способности к торможению опухолевого роста при

введении вакцины в смеси с опухолевыми клетками (табл.1).

Таблица 1. Модификация опухолевого роста при контрлатеральном введении лизосомотропных препаратов интактным и предобработанным

циклофосфамидом мышам.

N экс- Линия пери- и пол мента мышей

Масса

Воздействие опухолей, г р

(X + Бх)

1. Контроль 0.54 + 0.06 — —

2. БЦЖ к/л 0.74 + 0.05 <0. 01

! 3. ЦФ 0.49 + 0.05 — —

4. ЦФ + БЦЖ к/л 0.76 + 0.08 <0.001

1. Контроль 0.38 + 0.06 — —

2. Смесь БЦЖ-ОК 0.13 + 0.02 <0. 001

3. БЦЖ К/л 0.55 + 0.04 <0. 05

4. Г Крахмал в/бр 0.68 + 0.04 <0. 001

1 5. ЦФ 0.46 + 0.06 — __

6. ЦФ + Смесь БЦЖ-ОК 0.12 + 0.03 <0. 001

7. ЦФ + БЦЖ к/л 0.58 + 0.04 >0. .05

8. ЦФ + Крахмал в/бр 0.64 + 0.06 <0. 05

I СВА самки

II СЗНА самки

Примечание: В 1-м эксперименте интактным (гр. 1,2) и предобработанным (гр.3,4) циклофосфамидом ( 80 мг/кг внутрибрюшинно за 9 дней до перевивки опухоли) мышам-самкам СВА в мышцу правого бедра трансплантировали по 100 тысяч клеток карциномы Кребс-2; мышам 2 и 4 групп за 30 минут до трансплантации опухолевых клеток в мышцу левого бедра (контрлатерально - к/л) ввели по 0,5 мг БЦЖ. Во 2.-м эксперименте интактным (гр.1,3,4) и предобработанным ЦФ (гр.5,7.8), как и в 1-м эксперименте, мышам-самкам линии СЗНА в мышцу правого бедра трансплантировали по 100 тысяч клеток карциномы Кребс-2: мышам 2 и 6 групп ту же дозу ОК ввели в смеси с 0.5 мг БЦЖ; мышам 3 и 7_групп за 30 минут до трансплантации ОК в мыш-

групп за^ЗО ми-сус-

цу левого бедра ввели по 0.5 мг БЦЖ; мышам 4 и нут до трансплантации ОК ввели внутрибрюшинно по 0.8"мл 3% пензии гидролизованного крахмала.

предобработанных спленоцитов от

Восстановление пула предшественников Тэ у ЦФ мышей путем в/в переноса им смеси тимоцитов и интактных сингенных доноров не повлияло на степень стимуляции опухолевого роста - прирост опухолевой массы у "восстановленных" и контрольных животных при контрлатеральном введении вакцины БЦЖ и ОК составил 45,7% и 55.1%, соответственно (Р>0.05).

Таким образом, представленные данные позволяют исключить участие Тэ в стимуляции опухолевого роста, индуцированной контрлатеральным введением вакцины БЦЖ на использованной модели.

1.2. Отвлечение эффекторов ЕР как возможный механизм стимуляции опухолевого роста

Стимулирующий эффект при контрлатеральном введении ВЦЖ и ОК может быть обусловлен более благоприятными условиями для имплантации и роста опухоли, создающимися в месте ее трансплантации за счет отвлечения на иньекцию микобактерий макрофагов и других эф-фекторных клеток, осуществляющих фагоцитоз и неспецифический лизис трансплантированных ОК у непредобработанных вакциной животных. В пользу этого предположения свидетельствуют результаты экспериментов по стимуляции роста внутримышечных трансплантатов карциномы Кребс-2 при отдаленном введении целого ряда различающихся по физико-химическим и биологическим свойствам ПА (табл.2).

Таблица 2. Стимуляция роста трансплантатов карциномы Кребс-2 при отдаленном введении чужеродных агентов.

N экс- Линия Доза пери- и пол ОК мента мышей

Воздействие

Масса опухолей X ± Бх,

СЗНА самки

СВА самцы

1,2x10"

1x10

ВАЬВ/с 2x10 самцы

Контроль ВЦЖ к/л Крахмал в/бр

Контроль Зимозан к/л Зимозан в/бр

Контроль БЦЖ к/л ДС в/бр

0,38 ± 0,06 0,55 ± 0,04 <0,05 0,68 ± 0.04 <0,01

0,41 ± 0,12 0,83 ± 0,09 1.27 ± 0,11

<0,001 <0,001

0,55 ± 0,04

0,80 ± 0,06 <0,01

0,71 ± 0,04 <0,05

Примечание: Крахмал в/бр - 1 мл 3% суспензии гидролизованно-го картофельного крахмала внутрибрюшинно за 1-1.5 ч до внутримышечной трансплантации ОК в бедро; БЦЖ к/л - 0.5 мг БЦЖ в 0.1 мл физраствора за 1-1.5 часа до трансплантации ОК в контрлатеральное бедро; ДС в/бр - декстран сульфат (ММ 500 ООО) - 200 мг/кг в 0,5 мл физраствора внутрибрюшинно за 1-1.5 часа до трансплантации ОК, О,5 мг зимозана вводили вводили в/бр в 0,2 мл, в/м - в 0,1 мл.

Кроме указанных ПА, стимуляцию роста карциномы Кребс-2 при аналогичных способах введения индуцируют вазелиновое масло, суперна-тант вакцины БЦЖ, различные концентрации (от 1 до 10%) раствора фармакопейного препарата желатиноля, суспензия туши и др.(Ка1есПп V.!. а1., 1977).

Р

2

3

1.3. Зависимость стимуляции опухолевого роста от времени контрлатерального введения ЛТП.

Общим свойством использованных в предыдущем разделе агентов является способность к аттракции фагоцитов в район их локализации. Мы обнаружили, что полученные результаты (рис.1) в принципе не отличаются от многочисленных данных литературы по изучению этого процесса с использованием широкого спектра провоспалитель-ных агентов.

лимфоциты ■ нейтрофилы —<«— макрофаге

Рис.1. Динамика клеточного состава перитонеального экссудата на внутрибрюшинное введение крахмала.

Примечание: самцам линии СВА внутрибрюшинно ввели по 0,5 мл 10% раствора гидролизованного крахмала и в указанное время собирали и анализировали клеточный состав перитонеального экссудата.

Нами зарегистрирована двухэтапность выхода клеточных элементов в брюшную полость с максимумами на 2-й час и на 3 сутки после инъекции аттрактанта. При этом в первые 90 минут после иньекции крахмала отмечено интенсивное поступление нейтрофилов в брюшную полость - содержание которых в воспалительном экссудате возросло с 0 до 41% с постепенным снижением к концу первых суток. Дальнейшее формирование перитонеального экссудата происходит за счет макрофагов, которые к моменту достижения второго максимума (3 сутки) составляют более 90% всей популяции.

Стимуляция роста опухолевых трансплантатов отмечается лишь в случае введения ПА за 1-2 часа до трансплантации опухоли. При увеличении этого интервала до 24 часов и более стимуляции роста опухолей не отмечено (табл.3).

Таблица 3. Масса опухолевых трансплантатов у мышей в зависимости от времени предварительного введения ЛТП.

N экс- Воздейст- Интервал Масса опухоли (г), Р перимента вие времени X ± Бх

1. Контроль 0.21 ± 0.025

1* БЦЖ К/Л 2.-2 часа 0.56 ± 0.041 <0.001

3. -24 часа 0.23+0.028 >0.05

4. -48 часов 0.25 ± 0.022 >0.05

1. Контроль 0.33 ± 0.035 >0.05

2* БЦЖ К/Л 2. - 1 час 0.59 ± 0.054 <0.001

3. -72 часа 0.33 ± 0.035 >0.05

1. Контроль 0.59 ± 0.046

2.-2 часа 0.91 ± 0.054 <0.001 Крахмал 3. - 1 сутки 0.74 ± 0.053 >0.05

3** в/бр 4.-2 суток 0.69 ± 0.036 >0.05

5.-3 суток 0.64 ± 0.046 >0.05

6.-7 суток 0.56 ± 0.028 >0.05

7. -14 суток 0.57 ± 0.054 >0.05

Примечание: 1* и 2* - мышам-самкам ВАЬВ/с за 2, 24. 48 и 72 часа до трансплантации 150 тысяч клеток карциномы Кребс-2 в контрлатеральное бедро введено по 0,5 мг вакцины БЦЖ. 3** - мышам линии С57В1 за 1.5 часа или за 1, 2, 3, 7 и 14 суток до внутримышечной трансплантации 200 тысяч клеток карциномы Кребс-2 внутриб-рюшинно введено по 0.8 мл 4% суспензии гидролизованного крахмала. Учет результатов проведен на 10 день после трансплантации ОК.

Таким образом, опухолесэмулирующий .эффект при определенных условиях введения свойственен целому ряду веществ, различающихся по физико-химическим и биологическим характеристикам. Общим свойством, объединяющим использованные агенты, является их способность индуцировать воспаление. При этом, стимуляция опухолевого роста наблюдается при введении ПА незадолго до трансплантации ОК, т.е. приживление опухолевого трансплантата в этом случае происходит на фоне воспалительной реакции на ПА.

1.4. Определение роли глюкортикоидного компонента стресса в феномене стимуляции опухолевого роста.

В раннюю фазу воспаления при асептическом перитоните, наряду со снижением мононуклеаров в перитонеальном экссудате (рис.1), повышался уровень глюкокортикоидов и резко колебалось количество нейтрофилов в крови (рис. 2).

Развитие в организме двух различающихся по фазе и интенсивности воспалительных процессов, имеющих в силу неспецифичности

общие зффекторные и регуляторные механизмы, сопровождается, вероятно, не только конкуренцией за зффекторные клетки, но и интерференцией регуляторных сигналов (Здродовский П.Ф.,1966), что может проявиться в модификации развития воспалительного процесса и последующего формирования ПОИ.

1 3 2 25 ¡Г 35 время ыосяе введения ОК (час)

-«•— лейкоциты "■ 11-ОКС

Рис.2. Динамика содержания 11-ОКС и лейкоцитов крови после внутрибрюшинной трансплантации карциномы Кребс-2 (X ± 5х).

Примечание: мышам СБА внутриорюшинно перевито по 10 млн клеток карциномы Кребс-2 и в указанное время определяли содержание 11-ОКС в сыворотке крови и общее количество леикоцитов крови.

Проведено исследование с целью определения роли глюкокорти-коидов стрессорного генеза в связи дополнительным очагом воспаления на различных этапах воспалительной реакции на опухолевый трансплантат в обнаруженном ранее феномене стимуляции опухолевого роста. При предварительном введении зимозана во все исследованные сроки (за исключением -20 мин) отмечена стимуляция роста опухолевых трансплантатов (табл.4).

Скорость роста опухолей при перевивке высокой дозой ОК, лимитируется не столько механизмами противоопухолевой резистентности, сколько условиями кровоснабжения, питания, а также скоростью васкуляризации новообразованной ткани. В этой связи стимулирующий рост опухолей эффект ЛТП наиболее наглядно проявляется при использовании низких перевивочных доз ОК. Так, в 1-ом эксперименте (табл.4) стимуляция опухолевого роста при введении зимозана за 90 минут до перевивки 70 ООО ОК составила 210%, а при перевивке 110 ООО ОК во 2-ом эксперименте при тех же условиях - лишь 122.5%.

При этом наблюдается фазовый характер стимуляции с максимумами в

пределах -(420-270) минут и -(60-150) минут.

Таблица 4. Масса опухолевых трансплантатов у мышей в зависимости от времени предварительного введения ЛТП.

N эксперимента, Груп- Время вве- Масса опухолей линия 'И пол мышей, па дения зимо- (г) Р

доза ОК зана (мин) X £ Sx

1. -390 0.33 ± 0.02 >0.05

1 2. -330 0.43 + 0.05 >0.05 С57В1/6, самцы 3. -270 0.51 £ 0.06 <0.01

70 ООО в 0,1 мл B/M 4. -210 0.46+0.04 <0.05

5. -150 0.37 ± 0.04 >0.05

6. -90 0.56 ± 0.06 <0.001

7. контроль 0.27 ± 0.03

1. -1440 0.90 ± 0.09 >0.05

2. -420 0.96 ± 0.04 <0.05

2 3. -240 0.94 ± 0.06 >0.05 С57В1/6, самцы 4. -150 1.01 ± 0.06 <0.01

110 ООО в 0,1 мл в/м 5. -90 0.Э8 ± 0.07 <0.05

6. -20 0.79 ± 0.09 >0.05

7. контроль 0.80 £ 0.05

Примечание: Для индукции воспаления использован зимозан. Препарат использовали в дозе 0,5 мг в 0,1 мл на' мышь.

Из процессов, происходящих в интересующий нас интервал времени (0-6 часов после внутрибрюшинного введения ЛТП) отмечено резкое снижение содержания в воспалительном экссудате макрофагов и лимфоцитов при значительном увеличении количества нейтрофилов. Подобные "ножницы" в "показателях динамики клеточного состава крови принято считать типичным признаком реакции на стрессорное воздействие, а также на введение глюкокортикоидов (Горизонтов П.Д., 1973; Маянский Д.Н.,1992).

Рассматривая развитие воспалительной реакции на ЛТП как стрессорный фактор, характеризующийся повышением уровня глюкокортикоидов, сопоставлен эффект в/бр введения солюкортефа (5 мг/кг) и зимозана в одинаковые интервалы времени относительно трансплантации опухоли (табл.5).

Глюкокортикоидный компонент стрессорного эффекта дополнительного очага воспаления моделировали путем в/бр введения глюко-кортикоидного препарата солюкортефа в различные сроки относительно трансплантации клеток карциномы Кребс-2. Полученные результаты свидетельствуют о правомочности предположения об участии глюко-кортикоидного компонента стрессорного эффекта воспаления в стиму-

ляции опухолевого роста. При этом выявляются критические временные точки, в течение которых возможно осуществление процессов, сопровождающихся стимуляцией опухолевого роста.

Таблица 5. Масса трансплантатов карциномы Кребс-2 при введении солюкортефа и зимозана в различное время относительно перевивки опухолевых клеток.

N экс- Линия Доза Груп- Время вве- Масса опухолей пери- и пол ОК па дения препа- (г) Р

мента мышей рата (мин) X ± Бх

СОЛЮКОРТЕФ

1. -180 0,56 ± 0.04 >0.05

1 СБА 80 тыс. 2. -60 0,84 ± 0.06 <0.01 самцы ОК 3. -10 0,68 ± 0.04 >0.05

4. контроль 0,52 ± 0.03 ---

3 И М 0 3 А Н

1. -180 1,14 ± 0.07 >0.05

2 СВА 112 ТЫС. 2. -60 1,30 ± 0.10 <0.01 самцы ОК 3. -20 0,91 ± 0.10 >0.05

4. контроль 0,92 ± 0.05 —

Максимальная стимуляция опухолевого роста, постоянно воспроизводимая при использовании испытанных нами ЛТП, отмечается при предварительном воздействии за 1-1,5 часа до перевивки опухоли. В это же время регистрируется максимальное содержание глюкокортико-идов в крови после различных антигенных воздействий (Корнева Е. А., Шхинек Э.К., 1988).

Внутрибрюшинное введение экзогенного глюкокортикоида сопровождается стимуляцией опухолевого роста также лишь при соблюдении определенных интервалов времени между иньекцией гормона и трансплантацией ОК. Следовательно, процесс, определяющий характер роста опухоли, реализуется вскоре после трансплантации ОК. Трансплантация опухоли на пике развития ранней стадии воспалительной реакции на ЛТП, характеризуется, в случае последующей отдаленной трансплантации опухоли, пониженной интенсивностью лизиса ОК и, как следствие, "стимуляцией" опухолевого роста.

, Была предпринята попытка определить возможность объяснения стимуляции опухолевого роста как следствие сохранения перевивоч-ной дозы ОК в результате модификации интенсивности воспалительного процесса в микроокружении опухолевого трансплантата предшествующей воспалительной реакцией на отдаленное введение ЛТП.

В перитонеальном экссудате определяли количество ОК в раз-

личные сроки после внутрибрюшинного введения интактным и предоб-работанным внутримышечным введением за 1.5 часа до трансплантации 10 млн клеток карциномы Кребс-2 одного из ЛТП мышам линии СВА. Как следует из полученных результатов (рис.3), предшествующее внутрибрюшинной трансплантации 0К развитие воспалительной реакции на внутримышечное введение ПА сопровождается достоверным снижением гибели трансплантированных ОК ("сохранение перевивочной дозы") и выраженной стимуляцией роста опухоли.

Рис.3. Содержание опухолевых клеток в перитонеальном экссудате после внутрибрюшинной трансплантации интактным и предобраоо-танным ЛТП мышам 10 млн клеток карциномы Кребс-2 (X ± Зх).

Примечание: Самцам линии СВА за 1.5 часа до внутрибрюшиннои трансплантации 10 млн клеток карциномы Кребс-2 в мышцу правого бедра вводили по 0.2 мл физраствора - контроль, или тот же объем 10% раствора желатиноля - опыт. В указанные периоды времени животных умерщвляли под легким эфирным наркозом, брюшную полость промывали физиологическим раствором и определяли общее количество опухолевых клеток.

Ингибиция неспецифического лизиса ОК вскоре после их трансплантации на фоне предшествующего очага воспаления на введение ЛТП сопровождается нарушениями формирования противоопухолевого иммунитета (рис.4).

Более того, обнаруженный феномен стимуляции опухолевого роста имеет место и у мышей с выраженным противоопухолевым иммунитетом в случае перевивки им разрешающей дозы ОК вскоре после введения провоспалительного агента (рис.5).

Рис. 4. Масса трансплантатов карциномы Кребс-2 у мышей, пре-добработанных за 1,5 часа до иммунизации внутрибрвшинным введением крахмала (X ± Бх).

05 0.45 0.4 СЕ 0.35

1

§> 0.25 -о

§ 02

§ 015 ОД 0.05

Рис. 5. Масса опухолей у иммунных мышей, предобработанных внутримышечным введением 10% раствора желатиноля за 1,5 часа до трансплантации разрешающей дозы карциномы Кребс-2 (X ± Бх)

Примечание к рис.4 и 5:

1 - масса опухолей у контрольных животных.

2 - масса опухолей у иммунных мышей.

3 - (рис.4) - масса опухолей у мышей, предобработанных внутри брюшинным введением 3% суспензии крахмала за 1; 5 часа до иммунизации, которую осуществляли введением 800 тыс клеток карциномы кребс-2 в подушечку лапки с последующей ампутацией ее через 24 часа. Разрешающую дозу опухолевых клеток (500 тыс) вводили на 8 день после ампутации.

3 - (рис.5) - масса опухолей у иммунных мышей, предобработанных внутримышечным введением 0,2 мл 10% суспензии желатиноля

за 1.5 часа до трансплантации разрешающей дозы (800 тыс) клеток карциномы Кребс-2.Иммунизацию мышей осуществляли.посредством введения в подушечку лапки 1,5 млн клеток карциномы Кребс-2 с последующей через 24 часа ампутацией опухолесодержащей лапки.

1.5. Определение влияния индометацина на противоопухолевый эффект вакцины БЦЖ, введенной в смеси с опухолевыми клетками.

Успешная прививаемость экспериментальных опухолей детерминируется гиперпродукцией ПГЕ-2.

Подавление синтеза ПГЕ-2 индометацином позволяет существенно усилить ингибицию опухолевого роста при трансплантации ОК в смеси с БЦЖ (рис.6).

Рис.6. Влияние различных схем применения индометацина и вакцины БЦЖ на рост некоторых опухолей (X ± Бх).

Примечание:

контроль - введение одних опухолевых клеток (ОК);

ИМ - ОК трансплантировали мышам, получавшим с водой индоме-тацин (ИМ);

БЦЖ - ОК трансплантировали в смеси с БЦЖ интактным мышам;

ИМ+БЦЖ - ОК трансплантировали в смеси с БЦЖ мышам, получавшим ИМ с водой.

1 - самцы линии СС57В1?; 100 тыс клеток карциномы Кребс-2 внутримышечно.

2 - самцы линии А/Не; О,1 мл 10% суспензии клеток аденокар-циномы легких (АЛ) внутримышечно.

3 - самцы линии СВА; 0.1 мл 10% суспензии клеток гепатомы N29 внутримышечно.

При этом замедление опухолевого роста отмечено и при использовании опухолевых штаммов, проявляющих обнаруженную ранее реф-

рактерность к этой манипуляции (введение в смеси с БЦЖ) в обычных условиях (опухоль 29).

Анализ результатов определения противоопухолевой резистентности вакцинированных БЦЖ животных свидетельствует о четкой детерминированности опухолевого роста состоянием эффекторов ЕР, регламентируемым, в свою очередь, интенсивностью воспалительной реакции на микобактериальную инфекцию.

1.6. Определение возможности стимуляции опухолевого роста у ииммунодепрессированных животных.

Участие эффекторов ЕР в процессах, опосредующих стимуляцию опухолевого роста, подтверждается воспроизводимостью феномена стимуляции у иммунодепрессированных животных.

Из данных, представленных в табл. 6, видно, что облучение мышей дозой 400 И в сочетании с гидрокортизоном или без него приводило к существенной стимуляции роста трансплантируемой им опухоли; введение на этом фоне крахмала не вызывало дальнейшего усиления опухолевого роста.

Таблица 6 . Влияние крахмала и иммунодепрессии, вызванной облучением и гидрокортизоном (ГК), на рост трансплантатов карциномы Кребс-2 у мышеи-самок (СЗН X С57ВЬ)Е! и СЗНГ при перевивке дозой 100 тыс. опухолевых клеток.

Группа Количество Воздействие Масса опухолей

мышей (X ± Бх), г Р

1 10 Контроль 0,28 ± 0,03

2 10 Крахмал 0,94 ± 0,07 Р^н < 0,001

3 И 400 И + 1 мг ГК 1.35 ± 0,11

4 10 400 И + 1 мг ГК +

крахмал 1,40 ± 0,09 Р3-4 >0,5

1 10 Контроль 0,27 ± 0,06

2 10 Крахмал 0,97 ± 0,07 Pi-2 < 0,001

3 10 200 R 1,00 ± О, 11

4 9 200 R + крахмал 1,51 ± 0,13 Р3-4 < 0,01

5 10 400 R 1,66 ± 0,13

6 7 400 R + крахмал 1,60 ±0,18 Р5.6 >0,5

Облучение мышей дозой 200 И тоже ускоряло рост опухоли, хотя и менее значительно, чем облучение дозой 400 И. Однако, введение крахмала в этом случае привело к дополнительной стимуляции роста опухоли ( в полтора раза по сравнению с одним облучением).

Скорость роста опухолей у иммунизированных животных при перевивке высокой дозой опухолевых клеток, лимитируется условиями

кровоснабжения, питания. По-видимому, в условиях наших экспериментов у мышей, облученных 400 И. скорость роста опухолей была максимальной и не могла быть более увеличена. Поэтому стимулирующее действие крахмала в данном случае могло не проявиться, если оно реализуется и через неиммунологические механизмы.

Чтобы снять лимитирующее влияние трофических факторов, в следующем эксперименте (табл. 7) перевивочную дозу снизили со 100 тыс. до 30 тыс. опухолевых клеток.

Таблица 7. Влияние облучения и крахмала на рост трансплантатов карциномы Кребс-2 у мышей самцов (СЗН х С57Вь)р! при перевивке дозой 30 тыс. опухолевых клеток.

Группа Количество Воздействие Масса опухолей

мышей (X ± Бх). г Р

1 13 Контроль 0,03 ± 0,02

2 15 Крахмал 0,38 ± 0,07 Р х _ г < 0,001

3 13 450 Р. 1,01 ± 0,07

4 15 450 Л + крахмал 1,51 ± 0.13 Рз-4 < 0.05

Оказалось, что в этом случае стимуляция роста опухоли под влиянием крахмала наблюдалась не только у нормальных животных, но и у животных, обученных дозой 450 К.

Поскольку облучение такой дозой вызывает у мышей достаточно глубокую иммунодепрессию, можно считать; что усиление роста трансплантатов карциномы Кребс-2 при отвлечении нефиксированных макрофагов, по крайней мере частично, осуществляется за счет неиммунологических влияний.

1.7. Влияния эффекторов естественной резистентности на процессы метастазирования ОК в микроциркуляторное русло легких.

Одной из компонент системного ответа является межорганное перераспределение эффекторов ЕР в ответ на стрессор, наиболее ярким проявлением которого является "секвестрация лейкоцитов в легких", реализуемая в формировании мощного маргинального пула эффекторов ЕР в микроциркуляторных отделах печени, легких, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы.

Феномен перераспределения эффекторов ЕР воспроизводили в процессе индукции асептического перитонита путем внутрибрюшинной иньекцш 10% раствора фармакопейного препарата желатиноля. Внут-

ривенное введение 80. тыс ОК гепатомы 29 через 30 минут после инъекции желатиноля сопровождалось значительным снижением числа развившихся в легких к 20 дню метастазов опухоли (47.7 ± 7.7), по сравнению с этим показателем у контрольных животных (105.0 ± 6.8; р<0.001), которым для "выравнивания" handling-эффе.кта вводили в аналогичных условиях физиологический раствор. Воспроизводимость полученных результатов с использованием ряда других ПА свидетельствует о неспецифичности этого процесса с высокой вероятностью участия в его реализации эффекторов ЕР в зоне формирования маргинального пула в микроциркуляторном русле легких.•

2. Результаты определения терапевтической эффективности лизосомотропных форм химиопрепаратов.

2.1. Терапевтическая эффективность включенных в липосомы противоопухолевых гормоноцитостатиков.

Недостаточно высокая избирательность действия химиопрепаратов на ОК обусловливает их общую токсичность и является главным обстоятельством, снижающим эффективность химиотерапии злокачественных опухолей. Одним из путей её повышения является обеспечение направленной доставки химиопрепаратов в опухоль. Перспективным, на наш взгляд, способом может явиться использование гормоноцитостатиков в липосомах. Локализация в липидной фазе липосом делает их доступными для гормональных рецепторов опухолевых клеток.

Показано, что разработанные нами две формы липосомальных гормоноцитостатиков при внутривенном введении превосходят их свободные формы по ингибирующему влиянию на рост солидных опухолей экспериментальных животных. Отмеченный факт повышенной эффективности липосомальной формы кортифена (табл.8) в отношении гормоно-зависимых штаммов опухолей свидетельствует о перспективности предлагаемого подхода к химиотерапии опухолей и диктует необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

3. Лизосомотропные препараты в лечении туберкулеза.

3.1. Изучение влияния модификации функционального состояния эффекторов естественной резистентности на развитие гематогенно-диссеминировнного туберкулеза.

Вероятность формирования очагов отсева в результате обостре-

ния хронического туберкулезного процесса или реактивации первичного очага "дремлющей" инфекции вследствие лимфогематогенной дис-семинации при равноценности остальных условий изначально в значительной степени определяется состоянием циркулирующего пула эффекторов ЕР.

Таблица 8. Общетоксическое и противоопухолевое действие кортифена

в липосомах (КЛ) и свободного кортифена (СК) у мышей с шечными трансплантатами перевиваемых опухолей

внутримы-

Груп- - Лекарственная форма. Коли- Потеря Масса опухолей

па доза и способ чество массы (X ± Бх)

введения препарата мышей* тела (%) (г)

Серия 1 (мыши- -самки А/Не, опухоль - ГА-1)

1 Контроль (нелеченные) И 4,0 1,85 ± 0,141

2 СК 20 мг/кг п/к 9 16,7 0,59 ± 0,121***

3 КЛ 20 мг/кг в/в 12(3) 18,2 0,49 ± 0,051***

Серия 2 (мыши-самцы А/Не, опухоль - ГА-1)

1 Контроль 12 0 0,88 ± 0,080

2 СК 20 мг/кг п/к 13 9,5 0,33 ± 0, 049***

3 КЛ 18 мг/кг в/в 12 10,3 0,25 ± 0.029***

4 КЛ 18 мг/кг п/к 13 8,2 0.33 ± 0.039***

Серия 3 (мыши самцы СС57ВК, опухоль - Кребс-2)

1 Контроль И 0 1,73 ± 0,096

2 СК 20 МГ/КГ П/К И 13,7 0,95 ± 0,083***

3 КЛ 18 МГ/КГ в/в 8 (3) НУ 0,43 ± 0,110***

4 КЛ 18 МГ/КГ п/к И 13,7 1,00 ± 0,144***

Серия 4 (мыши- -самки А/Не, опухоль - АЛ)

1 Контроль 14 8,0 0,63 ± 0.053

2 СК 20 МГ/КГ п/к 14 12,0 0,42 ± 0, 030***

3 КЛ 15 МГ/КГ в/в 14 12,5 0,44 ± 0, 037**

4 КЛ 20 МГ/КГ в/в 14 14,8 0.33 ± 0,038***

Серия 5 (мыши- -самки А/Не', опухоль - АЛ)

1 Контроль 9 ' 8,0 0,51 ± 0, 035

2 СК 20 МГ/КГ П/К 9 11,5 0,28 ± 0,024***

3 КЛ 20 мг/кг п/к 9 12,5 0,20 ± 0, 041***

Серия 6 (мыш- -самки СБА, опухоль - - гепатома 29)

1 Контроль 12 0 2,09 ± 0,093

2 СК 20 мг/кг п/к 12 5,7 1,38 ± 0,079***

3 КЛ 18 мг/кг в/в 12 5,5 - 1,37 ± 0,063***

4 КЛ 18 мг/кг П/К 12 3,0 1,44 ± 0, 075***

Примечание: * - в скобках указано количество мышей, погибших от токсического действия препарата: а/к - подкожно; в/в - внутривенно. НУ - не учтено. Звездочками-•отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (** - Р<0,01; *** - Р<0,001).

В случае несостоятельности защитных механизмов ЕР на этом этапе происходит усиленная миграция примированных моноцитов маргинального пула в периваскулярньй очаг поражения с последующей дифференцировкой их в мононуклеары формируемой гранулемы.

На модели преимущественно легочного туберкулезного процесса обнаружено, что индукция асептического воспаления при иньекции 10% раствора желатиноля в мышцу бедра за 1,5 часа до внутривенного введения вирулентных микобактерий штамма Воу1пиэ-8 резко меняет характер и динамику развития экспериментального туберкулеза. У животных контрольной группы (с введением физраствора) средняя продолжительность жизни составила 19,6 ±0,8 дня. Этот показатель в опытной группе животных, инфицированных на фоне асептического воспаления, составил 55,6 ± 5.8 дня (р<0.001).

Важность обнаруженного феномена заключается, на наш взгляд, в том, что последствия развития неспецифической адаптационной реакции на лечебное (особенно, хирургическое) вмешательство зачастую не учитывается при анализе полученного результата, который полностью относят на счет использованного агента или проведенной процедуры.

3.2. Эффективность липосомальной формы противотуберкулезных препаратов при лечении экспериментального туберкулеза.

Развитие хронического инфекционного процесса, как патологической формы симбиоза, базируется на перманентной адаптации партнеров к сосуществованию в условиях зачастую противонаправленной деятельности их адаптационных механизмов (Давыдовский И.В., 1969). Сказанное правомерно и для хронических заболеваний опухолевой и паразитарной природы.

Смещение характерного для этих процессов состояния "устойчивого неравновесия" в пользу макроорганизма наиболее реально при проведении этиопатогенетической терапии специфическим этиотропным препаратом при одновременном повышении резистентности организма соответствующими коррегирующими агентами. Наиболее перспективны в этом плане комплексные лекарственные соединения, в которых одно или несколько действующих начал комплексированы с лизосомотропным носителем. При этом, наряду с лизосомотропностью, носитель должен обладать максимальной степенью биосовместимости, способностью к избирательной доставке лекарства в очаг поражения и повышению функциональной активности эффекторов иммунобиологической резис-

тентности. Немаловажным свойством носителя является его пригодность в качестве субстрата энергопластических процессов в фагоците, интенсивность которых зачастую регламентируется дефицитом источников энергии. Перечисленным требованиям соответствуют нейтральные декстраны и фосфатидилхолиновые липосомы. Первые являются источником глюкозы, а вторые - фосфатидилхолина, как основного компонента биологических мембран.

3.2.1. Определение эффективности липосомальных форм противотуберкулезных препаратов при внутривенном лечении туберкулеза.

Изучив сравнительную терапевтическую эффективность некоторых противотуберкулезных препаратов и их липосомальных лекарственных форм при внутривенном лечении зараженных вирулентной культурой микобактерий туберкулеза мышей, мы не обнаружили преимуществ ли-посомальной лекарственной формы при данном методе лечения. Исключение составили комплексы изониазида с декстраном и изониазида со стрептомицином, лизосомотропные формы которого оказались более эффективными, чем исходные соединения.

3.2.2. Результаты определения эффективности липосомальных форм противотуберкулезных препаратов при ультразвуковой ингаляционной

терапии туберкулеза.

Доминирующая роль лимфоидного компонента в патогенезе туберкулеза предопределяет целесообразность применения лизосомотропных лекарственных форм при лечении данного заболевания. Придание низкомолекулярным противотуберкулезным препаратам корпускулярных свойств путем включения их в липосомы увеличивает тропность лекарственной формы к лимфоидной ткани. Лимфотропность же препарата, в свою очередь, строго регламентируется способом введения. В этой связи, при ингаляционном введении липосомальных форм противотуберкулезных препаратов наиболее полно реализуются основные положительные свойства липосом (депонирование, пролонгация, протекция к инактивирующим агентам) и частично решается проблема легочной адресации лекарственного препарата.

Для проверки высказанного предположения проведена оценка эффективности ультразвуковой ингаляционной терапии с использованием липосомальных форм комплекса противотуберкулезных препаратов. Зараженные туберкулезом мыши были рандомно разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. Лечение осуществляли в течение двух недель по следующим схемам: а) ежедневно, кроме субботы и воскресенья - 10

ингаляций на курс; б) в интермиттирующем режиме два раза в неделю с промежутками между ингаляциями в три дня - 4 ингаляции на курс. Животных 1-ой группы ингалировали ежедневно водным раствором АБП (свАБП-5); мышей з-ой группы- в том "же режиме с использованием липосомальной формы (липАБП-5); 2 группа '- ингаляции водного раствора АБП два раза в неделю (свАБП-2); 4 группа - ингаляции липосомальной формы АБП также дважды в неделю (липАБП-2). Неле-ченные животные составили контрольную 5-ю группу.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой эффективности ультразвуковой ингаляционной терапии лимфотроп-ной лекарственной формы комплекса химиопрепаратов, включенных в фосфатидилхолиновые липосомы (табл.9).

Таблица 9. Средняя продолжительность жизни мышей при различных режимах ингаляционной химиотерапии.

Группа Режим лечения Средняя продолжительность жизни (X ± Бх), дни. Р

1. свАБП-5 68,7 ± 3,34 Р1 < 0,01

2. свАБП-2 20,3 + 0,66 Р? \ / 0,05

3. липАБП-5 81,5 + 1,32 Р.г -4 < 0,001

4. липАБП-2 67,1 + 1,56 Р1 -4 > 0,05

5. контроль 19,8 ± 0,51 ---

Высокая бактерицидность липосомальной формы противотуберкулезных препаратов может быть опосредована созданием высоких концентраций действующего начала на внутриклеточном уровне в силу лизосомотропности липосом (табл. 10).

Таблица 10. Содержание рифампицина (Р^Р) и изониазида (1ЫН) в легочной ткани (мкг/г) после ультразвуковых ингаляций свободной (св) и липосомальной (лип) форм АБП.

Форма Время после ингаляций (часы)

АБП 0,25 3 6 24

1. свйКР 1,16 + 0,16 0,13 + 0,12 0,10 + 0,09 О

2. липИРР 1,95 + 0,06 1,67 ± 0,09 1,18 + 0,13 0,26 ±0,14

-г <0,05 < 0,001 < 0,001 > 0,05

1. свШН 1,15 ± 0,11 0,58 + 0,11 0,42 ± 0,13 0,33 ±0.01

2. липШН 0.61 ± 0,07 0,40 + 0,06 0.77 ± 0,06 0,50 + 0,05

?!-г <0,05 >0,05 _ <0,05 < 0,05

Замедленное выведение рифампицина из легочной ткани при использовании липосомальной формы является указанием на внутрикле-

точную локализацию препарата в лимфатической системе легких и в альвеолярных макрофагах. При использовании же водного раствора рифампицина его содержание в легочной ткани быстро падает (через 1,5 часа концентрация препарата составила менее 10% от зарегистрированной через 15 минут после ингаляций).

Максимальная эффективность сравниваемых режимов химиотерапии зарегистрирована при ежедневных ингаляциях АБП в липосомах (гр.3). Средняя продолжительность жизни мышей в этой группе была значительно выше, чем при использовании водорастворимой лекарственной формы в том же режиме (Р <0,01). Несмотря на снижение лекарственной нагрузки в 2,5 раза при интермиттирующем введении ли-посомальной формы (гр.4), эффективность данного режима терапии оказалась равной таковой при ежедневном использовании водорастворимой формы (гр.1) и была ниже лишь на 22% от максимально достигнутой (гр.З).

4. Лизосомотропная лекарственная форма комплексного соединения

изониазида с декстраном 4.1. Обоснование требований к создаваемой лекарственной форме.

Согласно доминирующей точке зрения персистенция микобактерий туберкулеза обусловлена незавершенностью фагоцитоза в фазе слияния содержащей возбудителя фагосомы с лизосомами, что и приводит к формированию гранулем. Однако это образование со скудными мик-роциркуляторными структурами и большим количеством отграничивающих возбудителя мембран затрудняет возможности медикаментозного лечения и диктует необходимость использования антибактериальных препаратов с малой молекулярной массой. Последнее свойство позволяет им хорошо преодолевать цитоплазматические мембраны, но по той же причине препараты быстро выводятся из тканей, что обусловливает использование больших доз и неизбежные осложнения. Все вышесказанное в полной мере относится к одному из основных противотуберкулезных препаратов - изониазиду.

Более приемлемым был бы лекарственный препарат, обладающий антмикобактериальными эффектами изониазида и свойством избирательно захватываться макрофагами (местом персистенции возбудителя). лизосомотропностью, способностью модулировать функциональное состояние макрофагов, пролонгированностью. В этой связи представляются перспективными средства в виде комплексных соединений антибактериального препарата и пролонгирующей лизосомотропной мат-

рицы, активно захватываемой макрофагами.

Данные об очевидном лизосомотропизме декстрана (Короленко Т.А.,1984), его способность стимулировать пластические процессы в макрофагах (Шкурпий В. А., 1982,1986), широкое использование в качестве плазмозаменителя в медицинской практике явились основными аргументами в пользу декстрана при выборе матрицы для синтеза ли-зосомотропной лекарственной формы изониазида. В связи с этим была разработана технология получения комплексного соединения изониазида с декстраном (решение о выдаче патента по заявке 93015116/14 (014612) от 30.10.95).

4.2 Результаты исследования фармакокинетики изониазида и коньюгата изониазида с декстраном.

Для изучения фармакокинетики полученного соединения использовали меченые тритием изониазид и декстран, а также два образца комплексного препарата изониазида (КПИ) с включением трития в молекулу декстрана или изониазида (рис.7).

время после введения препарата (час)

— хр-комп ■ лег-комп ■ >" печ-комп —в— кр—св —и— лег-св —и— печ—св

Рис. 7. Фармакокинетика КПИ и свободного изониазида (X ± Бх).

Примечание: мышам линии ВАЬВ/с вводили внутривенно в 0.5 мл реополиглюкина меченный тритием изониазид или КПИ (из расчета 165 тСи на 1 г массы тела, принятые за 100%) и в указанные временные точки определяли радиоактивность гемолизатов и гомогенатов внутренних органов.

Содержание радиоактивной метки через 9 часов после внутривенного введения свободного изониазида определялось во всех исследованных органах лишь в следовых количествах.

Клиренс крови при введении КПИ был значительно замедленным

- 19% введенной дозы радиоактивности зарегистрировано в крови на 5 сутки исследования. Длительная персистенция КПИ в изученных органах в концентрациях, превышающих его содержание в кровеносном русле, свидетельствует об избирательной кумуляции полученного соединения.

4.3. Результаты определения терапевтической эффективности комплексного препарата изониазида.

Для определения средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей заражали введением в латеральную вену хвоста по 0,1 мг двухнедельной культуры микобактерий штамма Воу1пиз-8 в 0,5 мл физиологического раствора. Лечение начинали через 10 дней после заражения на фоне макроскопически регистрируемых специфических изменений внутренних органов. Индекс патологических изменений легочной ткани (Першин Г.Н., Макеева 0.0.,1953) к этому времени составил 2,3. Внутривенное введение препаратов осуществляли в иктермитти-рующем режиме через 3 дня на четвертый (Урсов И. Г. ,1937). Животным контрольной группы в те же сроки внутривенно вводили равные объемы физиологического раствора (гр. 1) или 2% раствор декстрана с ММ 40 кДа (группа 2). Мышей 3-ей группы лечили раствором изониазида (И) в дозе 30 мг/кг массы тела, а 4-ой - КПИ в в равной по И дозе (рпс.8).

Рис.8. Средняя продолжительность жизни зараженных туберкулезом мышей при использовании различных средств лечения (Х±Бх). Примечание: 1 - физиологический раствор: 2-2% раствор декстрана; 3 - изониазид; 4 - комплекс изониазида с декстраном (КПИ).

Лечение животных КПИ (группа 4) на 33% увеличило среднюю

продолжительность жизни животных в сравнении с этим показателем в гр.З, леченных И (Р<0,001) и на 50% по сравнению с нелеченными. Использование 2% раствора декстрана (гр. 2) не отразилось на продолжительности жизни зараженных мышей по сравнению с контролем (гр.1).

4.4. Результаты определения антимикобактери&льной активности

КПИ in vitro

Сравнительное исследование антимикобактериальной активности И и КПИ in vitro проводили путем определения внеклеточной и внутриклеточной гибели микобактерий, которые выражали индексом гибели микобактерий (ИГМ) по формуле: ИГМ (%).= количество погибших ми-кобактерий/(количество погибших микобактерий + количество живых микобактерий) х 100.

Содержащую макрофаги суспензию клеток получали из перитоне-альной полости интактных трехмесячных мшей линии BALB/c по методу Стюарт и др. (Stuart et а!.. 1978). К сформированному монослою полуторачасовой культуры перитонеальных макрофагов (МФ) добавляли суспендированные в полной среде 199 живые микобактерии штамма БЦЖ (1 стандартную ампулу БЦЖ разводили в 8 мл среды) и культивировали в течение 1 часа. Затем среду с неседиментировавшими микобак-териями осторожно заменяли свежей, содержащей только 10% сыворотки эмбрионов коров - гр. 1 ( контроль) или дополнительно: 7 мкг/мл изониазида - гр. 2. 25 мкг/мл комплекса изониазида на декстрано-вой матрице - гр.З, смесь изониазида с декстраном в соотношении 1:7 - гр. 4 или 22 мкг/мл декстрана - гр.5. Полученные образцы культуры МФ с микобактериями инкубировали в стандартных условиях в течение 24-х часов. Жизнеспособность и степень повреждения микобактерий оценивали флуоресцентным методом с использованием акридинового оранжевого (Smith & Rommel, 1977).

В исследованиях in vitro установлено, что через 1 сутки культивирования в среде, содержащей КПИ, на 10% возрастает количество погибших микобактерий в МФ по сравнению с культурой МФ, в которой использовали чистый И (табл. 11).

Смесь декстрана с чистым изониазидом не обладала таким выраженным действием. Количество погибших микобактерий, расположенных внутриклеточно, было сходным как при использовании чистого изониазида, так и его смеси с декстраном.

Эти данные дают основание предполагать, что модифицированный в

процессе синтеза декстран в диальдегиддекстран обладает в связи с поликатионными свойствами способностью увеличивать частоту фаго-сомо-лизосомальных слияний.

Таблица 11. Результаты определения (в %) индекса гибели микобактерий (Х±Бх).:

Объект, в котором подсчи- Использованный препарат

вали погиб- Контроль ----------------------------------

шие микобак- Йзониазид Комплексный препарат

терии (И) изониазида (КПИ;

В макрофагах,

(1-ая группа) 33,1 ± 1,4 42,9 ± 1,6* 52,7 ± 1,5** Вне макрофагов,

(П-ая группа) 28.1 ± 1,8® 40,9 ± 1,3* 36.8 ± 1,1***

Примечание: * - достоверные отличия между 1 и 2 в группах I и II; **- достоверные отличия между 1 и. 3, 2 и 3 в группах I и II; - достоверные отличия величин в сходных условиях культивирования между I и II группами.

4.5. Особенности развития гранулематозного процесса при

использовании комплексного препарата изониазида в химиотерапии

хронического туберкулеза в эксперименте.

Вследствие относительной скоротечности событий и наличия ка-зеозного компонента в сформированных гранулемах на использованной ранее модели гематогенно-диссеминированного туберкулеза не реально проследить все нюансы модификации гранулематозного процесса, индуцированной исследуемым препаратом при различных режимах химиотерапии.

4.5.1. Результаты определения гепатотоксичности комплексного препарата изониазида.

Увеличение частоты токсических реакций в процессе длительной (до 1 года и более) специфической противотуберкулезной терапии рассматривается как один из основных недостатков используемых медикаментозных средств. Поскольку большинство из "туберкулостати-ков" является антиметаболитами, токсический эффект препаратов проявляется и на уровне эффекторов ЕР, что, вероятно, является одной из причин развития вторичного иммунодефицита у данной категории пациентов. В этой связи, снижение общетоксического действия

вновь созданных противотуберкулезных препаратов является одним из приоритетных условий для их применения в клинике.

Одним из подходов к проблеме снижения токсических последствий химиотерапии туберкулеза является снижение курсовой дозы препаратов при интермиттирующих режимах лечения (Урсов И.Г.. 1982,1987,1993).

Проведено сравнительное определение гепатотоксичности И и КПИ на модели 3-х месячной ежедневной и интермиттирующей (2 раза в неделю) химиотерапии хронического туберкулеза мышей, индуцированного внутрибрюшинным введением вакцины БЦЖ (табл.12).

Таблица 12. Результаты морфометрического исследования суммарной площади дистрофически измененых гепатоцитов (Х+Бх).

Условия эксперимента Продолжительность лечения через месяц после заражения БЦЖ (в месяцах)

1 2 3

1. Нелеченные живот- ные (контроль) 2. Изониазид е/дневно 3. Изониазид 2 раза в неделю 4. КПИ ежедневно 5. КПИ 2 раза в неделю 6. Декстран е/дневно • 7. Декстран 2 раза в неделю 6.04. ± 0.25 46.80 ± 6.42 36.01 ± 5.12 32.32 ± 5.88 18.88 ± 3.27* 6.01 ± 0.25 5.92 ±0.24 18.00 ± 2.11 54.16 ± 7.35 40.72 ± 4.34 39.32 ± 3.20 19.60 ± 2.91* 18.21 ± 2.27 18.14 ± 2.26 20.68 ± 2.54 58.32 ± 8.85 42.72 ± 4.32 40.32 ± 3.24 22.68 ± 2.74 21.13 ± 2.79 20.89 ± 2.57

Примечание: площадь дистрофически и некротически измененных гепатоцитов дана в % от площади среза печени; * Р<0.05, относительно группы мышей, леченных в конкретный период наблюдения.

Лечение начато через месяц после в/бр инфицирования мышей линии ВАЬВ/с 0,5 мг лиофилизированной вакцины БЦЖ.

В группе животных, леченных КПИ в интермиттирущем режиме, частота и выраженность вакуолярной дистрофии гепатоцитов была наименьшей, что обусловлено поступлением изониазида с декстраном в составе пиносом и медленным освобождением изониазида после гидролиза матрицы в пинолизосомах. Поэтому образование токсичных метаболитов было "растянуто" во времени.

Наличие "светлых промежутков" между инъекциями препарата в 2-3 дня является немаловажным фактором посттоксической репарации вследствие активации энергопластических процессов под влиянием

кумулируемого в фагоцитах декстрана (Шкурупий В.А., 1982). Кроме того, как известно, в регенерирующих гепатоцитах содержание ци-тохрома Р-450 меньше, чем в активно функционирующих, что может быть также одним из факторов, детерминирующих снижение концентрации токсических метаболитов. Это свидетельствует о преимуществах лизосомотропной формы данного препарата.

4.5.2. Изучение особенностей лекарственного патоморфоза хронического генерализованного туберкулеза при использовании пролонгироанной формы изониазида в интермиттирующем режиме.

При естественном развитии вакцинного процесса во внутренних органах мышей формировались типичные для этого инфекта гранулемы, свидетельствующие о генерализации хронического туберкулезного воспаления на персистирующий возбудитель.

В качестве терапевтических агентов использованы И и КПИ. Векторнаправленная характеристика различных типов гранулем (Некрасова Т.П., Кондратьева О.Н.. 1993) в печени у леченных и контрольных животных в течение 8 месяцев наблюдения не различалась: уменьшение численной плотности зпителиодноклеточных гранулем ре-ципрокно связано с увеличением значений этого показателя для мак-рофагальных и фиброзирующихся гранулем (г=-0,99. р<0,001 - в первом случае и г=-0,88, р<0,01 - во втором).

На клеточном уровне у нелеченных животных этот процесс проявился в снижении количества клеток макрофагального типа (особенно эпителиоидных клеток) при реципрокном увеличении количества фиб-робластов. В группе животных, леченных КПИ на протяжении всего эксперимента, зарегистрировано максимальное содержание ЭК, что, судя по результатам дисперсионного анализа, обусловлено эффектом декстрановой матрицы КПИ.

Реципрокное снижение количества фибробластов и степени фиб-розирования гранулем в этой группе мышей позволяет предполагать возможную опосредованность процесса тем же фактором.

Отмечено ускорение дифференцирования мононуклеарных фагоцитов в гранулемах леченных животных, о чем свидетельствовало значительное повышение уровня пластических процессов (по данным анализа ультраструктур). Наряду с этим наблюдалось увеличение объема вакуолярного аппарата и доли вторичных лизосом в эпителиоидных клетках типа А.

Через 8 месяцев после заражения среди всех органелл эпители-

оидных клеток гранулем печени у нелеченных мышей преобладали вторичные лизосомы, занимающие до 40% объема цитоплазмы.

Снижение в 1,7 раза объемной плотности вторичных лизосом в ЭК гранулем печени леченных И животных, сопряженое с более выраженными процессами фиброзирования, обусловлено, возможно, снижением лизиса коллагена лизосомальными ферментами на фоне относительного преобладания процессов его синтеза.

Это обстоятельство, на наш взгляд, обусловлено лизосомотро-пизмом декстрановой матрицы КПИ. Самый низкий уровень фиброзирования в печени леченных КПИ животных опосредован, вероятно, кол-лагенолитической активностью лизосомального аппарата ЭК, обусловленной. в свою очередь, потенциацией энергопластических процессов декстраном.

0 более высокой эффективности лечения КПИ свидетельствует 4-х кратное снижение численной плотности гранулем печени относительно аналогичного показателя в контрольной группе и 2-хкратное - относительно группы леченных И мышей (рис.9).

ЕВД БЦЖ ВВП Изоыиазид КТО КПИ

Рис.9. Динамика численности гранулем в печени (на 1 мм2 среза печени)

Процесс склерозирования, оцениваемый по объемной плотности соединительной ткани в печени, у нелеченных животных нарастал к концу наблюдения. В группе животных, леченных И, этот показатель к 9-му месяцу после заражения (.6 месяцев терапии) оказался в два раза ниже, чем в контроле. Эффект 6-и месячного лечения животных КПИ проявился в 5-и кратном снижении степени склерозировния пече-

ни относительно этого показателя у нелеченных мышей.

Во все периоды наблюдения максимальная объемная плотность аргирофильных волокон отмечена в группе леченных И мышей, а минимальная - при использовании КПИ. Детерминированность этих различий, как следует из результатов математического анализа (Р=75,4, р<0,0001), обусловлена матрицей КПИ.

Реципрокное уменьшение содержания коллагена в межальвеолярных перегородках относительно остальной легочной ткани свидетельствует о перераспределении коллагена в результате лечения обеими формами противотуберкулезных препаратов.

Выводы

1. Модуляция противоопухолевой резистентности лизосомотроп-ными препаратами адьювантного типа на ранней стадии развития опухолевого процесса детерминирована комплексом взаимосвязанных местных и системных воспалительных реакций, имеющих неспецкфкчес-кий адаптивный характер. При использовании стандартных элементов экспериментальной модели (штамм опухоли и вакцины БЦЖ) воспроизведен весь спектр модуляции противоопухолевой резистентности.

2. Стимуляция опухолевого роста может быть детерминирована снижением воспалительной реакции на опухолевый трансплантат вследствие индуцированного иммуномодулятором перераспределения и модификации кондиционирования эффекторов естественной резистентности, что проявляется в сохранении количества трансплантированных опухолевых клеток и в снижении интенсивности формирования противоопухолевого иммунитета.

3. Потенцирование процесса активации эффекторов естественной резистентности лизосомотропными иммуномодуляторами при использовании антипростагландиновых препаратов (индометацина) сопровождается повышением противоопухолевой резистентности.

4. Перераспределение эффекторов естественной резистентности в "приграничные" с внешней средой органы, как компонент стресс-реакции на воспаление, носит неспецифический защитный характер. Транзиторная активация маргинального пула эффекторов естественной резистентности является существенным фактором снижения частоты опухолевых метастазов и локального повышения антибактериальной (противотуберкулезной) резистентности.

5. Высокая терапевтическая активность полученных по предло-

женной технологии липосомальных форм противоопухолевых гормоноци-тостатиков и противотуберкулезных химиопрепаратов обусловлена ли-зосомотропными свойствами использованных носителей.

6. Высокая эффективность использования липосомальных форм противотуберкулезных препаратов в виде ультразвуковых ингаляций свидетельствует о перспективности данного метода лечения легочных форм туберкулеза.

7. Повышение естественной резистентности организма при использовании в составе комплексного противотуберкулезного препарата лизосомотропной матрицы с заданными свойствами свидетельствует о принципиальной возможности создания антибактериальных препаратов с высокой терапевтической эффективностью:

а) основными из опосредованных лизосомотропной матрицей механизмов достижения вышеуказанных эффектов являются создание более высоких концентраций действующего начала в непосредственном микроокружении фагоцитированного макрофагом возбудителя и активация энергопластических процессов в эффекторах гранулематозного воспаления;

б) существенное снижение гепатотоксичности химиопрепарата (типа изониазкда) возможно путем изменения его фармакодинамики за счет комплексирования с лизосомотропным носителем (типа декстра-на);

в) снижение степени фиброзирования пораженных органов свидетельствует о благоприятном развитии лекарственного патоморфоза хронического генерализованного туберкулезного процесса при использовании разработанных лизосомотропных форм противотуберкулезных препаратов в интермиттирующем режиме.

8. Полученные данные указывают на возможность проявления негативных эффектов лизосомотропных лекарственных препаратов, что необходимо учитывать при их разработке и применении:

а) использование лизосомотропных препаратов, в том числе и в качестве лекарственных средств, сопряжено с увеличением доли вторичных (с более лабильной мембраной) лизосом и высокой вероятностью проявления деструктивных, провоспалительных эффектов;

б) провоспалительные эффекты лизосомотропных препаратов на определенной стадии развития адаптационного синдрома на их введение могут реализоваться снижением естественной (противоопухолевой и противотуберкулезной) резистентности организма.

Список основных опубликованных работ по теме диссертации

1. Урсов И.Г., Теньковская Т.Г., Ковалевский Г.В., Курунов Ю.Н. Стимулирующий и угнетающий эффект предшествующей сенсибилизации туберкулином у вакцинированных БЦЖ и/или инфицированных детей при повторении пробы Манту через 72 часа. // Сб. 8 Всесоюзный съезд фтизиатров. 1973. Москва. Тез. докл., 1973. - С. 345.

2. Каледин В. И., Ковалевский Г. В., Матиенко Н. А., Курунов Ю.Н. Влияние вакцины БЦЖ на рост опухоли Кребс-2. //Вопросы онкологии. - 1974. - Т. XX. - С. 70-75.

3. Волкова А.И., Ганькина Л.К.. Каледин В.И., Курунов Ю.Н. Противоопухолевое действие вакцины БЦЖ на рост опухолей в зависимости от их иммуногенности и места введения вакцины. //Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Иммунология опухолей". Киев, 1975. - С. 54-55.

4. Курунов Ю.Н., Каледин В.И. Влияние вакцины БЦЖ на рост экспериментальных рецидивов карциномы Кребс-2 у мышей. //Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Иммунология опухолей". Киев, 1975.

- С. 160-161.

5. Каледин В. И., Курунов Ю. Н., Волкова А. И. Влияние специфической иммунизации и вакцины БЦЖ на рост асцитной опухоли Кребс-2 у мышей. //Вопросы онкологии, 1976. - Т.XXII, N 4. - С.60-64.

6. Каледин В.И., Курунов Ю.Н. Ингибирующее действие вакцины БЦЖ на послеоперационные метастазы перевиваемой гепатомы мышей. //Вопросы онкологии, 1976. - Т.XXII,N4. - С.103-104.

7. Kaledln V.l., Kurunov Y.W., Serova I.A.// Inhibition and stimulation of the growth of Krebs-2 carcinoma by BCG vaccine. // J. Natl. Cancer Inst.-1977.-Vol. 58.-No. 5.- P. 1271-1277.

8. Курунов Ю.Н., Каледин В. И.. Матиенко H.A., Николин В. П. Чувствительность мышей к вакцине БЦШ как инфекту в зависимости от их генотипа и наличия вируса Биттнера. // Проблемы туберкулеза. -1977. - N 12. - С.71-74.

9. Каледин В. И., Курунов Ю.Н. О влиянии БЦЖ на рост карциномы Кребс-2. //Вопросы онкологии. - 1977. - Т.XXIII. - N8. - С. 60-63.

10. Курунов Ю.Н., Каледин В. И., Матиенко H.A., Николин В. П. Экспериментальное изучение условий применения вакцины БЦЖ при иммунотерапии злокачественных опухолей. / Теоретическая иммунология

- практическому здравоохранению. Тез. докл. IY научной конферен-

ции по проблемам клинической иммунодиагностики. Таллин, 1978. -С. 201-202.

11. Kaledin V.l., Kurunov Y.N., Matienko N. A., Nikolin V.P.// Stimulation of tumor growth in mice by high doses of BCG.// J.Natl.Cancer Inst.-1978.- Vol.61.- No.6.- P.1393-1396.

12. Каледин В.И., Матиенко H.A., Николин В.П., Курунов D.H.. Грунтенко Е.Г. Наличие неиммунологического компонента в стимуляции опухолевого роста при отвлечении нефиксированных макрофагов. //Известия СО АН СССР. - 1979. - Вып.I. - N5. - С.134-137.

13. Матиенко H.A., Курунов Ю.Н., Николин В.П. Влияние генотипа к носительства вируса Биттнера на чувствительность мышей к вакцине БЦЖ как инфекту. //Тез. докл. ВОГиС, 1979. - С.132-133.

14. УрсовИ.Г., Кононенко В. Г.. Кузина Л.Н., Савелова С. А., Курунов Ю.Н., Болганова М.Н., Боровинская Т.А., Перелевко Л.П. Интермиттирущая внутривенная химиотерапия впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких./Методические рекомендации для областей Западной Сибири. Новосибирск, 1979. 12 с.

15. Курунов Ю.Н., Кононенко В.Г., Пантелеева А.Г., Пирогов .В.И., Лисиченко Г.М., Краснов В.А. Экспериментальное обоснование интермиттирущей внутривенной химиотерапии туберкулеза. / Сб. Успехи интермиттирующей химиотерапии открытых форм туберкулеза. На-УЧН. труды НГМИ, 1982. - T.III. - С. 57-64.

16. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Матиенко H.A., Николин В.П., Будкер В.Г., Вахрушева Т.Г., Пантелеева А.Г. Изучение эффективности антибактериальных препаратов, заключенных в липосомы, при лечении экспериментального туберкулеза. // Проблемы туберкулеза. - 1982. - N10. - С. 54-57.

17. Каледин В. И., Курунов Ю. Н., Матиенко H.A., Николин В. П. Снижение иммунного ответа на опухоль при отвлечении нефиксированных макрофагов у мышей. // Фагоцитоз и иммунитет. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума. Москва, 1983. - С. 105-106.

18. Пантелеева А.Г., Курунов Ю.Н. Ефремов В.Н. Гистохимические показатели изменений печени при различных режимах химиотерапии туберкулеза в эксперименте. // Морфологические аспекты защитных механизмов при туберкулезе и неспецифической патологии легких. Тр. ЦНИИ туберкулеза. М., 1985. - T. XII. - С. 43-46.

19. Курунов Ю.Н., Каледин В.И. Независимая от Т-супрессоров стимуляция опухолевого роста вакциной БЦЖ. / Тез. докл. 4-го Все-

союзн. съезда патофизиологов. Кишенев, 1989.-С.838.

20. Курунов Ю.Н., Каледин В.И.. Матиенко H.A. Усиление индо-метацином противоопухолевого эффекта БЦЖ. / Тез. докл. 1-го Все-союзн. съезда иммунологов. М.. 1989. - Т. 2. - С. 75.

21. Курунов Ю.Н.. Каледин В.И. Влияние индометацина и вакцины БЦК на рост перевиваемых опухолей у мышей. // Эксперим. онкология, 1990. - Т. 12. - N6. - С. 57-59.

22. Каледин В.И.. Курунов Ю.Н.. Семенова Л.А. Липосомы как перспективная лекарственная форма для липофильных противоопухолевых гормонов. //БЮЛЛ. СО АМН СССР. 1989. - N6. - с.

23. Курунов Ю.Н.. Белкин А.Д., Каледин В.И.// Стимуляция роста опухоли Кребс-2 вакциной БЦЖ: возможные механизмы феномена. //В сб.: Механизмы патологических реакций. Новокузнецк, 1991.- С. 213-215.

24. Курунов Ю.Н., Каледин В.И.. Попова H.A., Пантелеева А.Г. Эффективность изониазида, иммобилизированного нэ микрогранулах сефадекса, при лечении легочной формы туберкулеза у мышей. //Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. конф., Москва, 1991. -С. 268-269.

25. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова H.A., Пантелеева А.Г. Изучение эффективности липосомальной формы рифампицина при лечении экспериментального туберкулеза мышей. // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. конф., Москва, 1991. - С. 359-361.

26. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Чернова Т.Г. Терапевтическая эффективность коньюгированного с декстраном изониазида. // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. конф., Москва, 1991. - С.733-735.

27. Шкурупий В.А., , Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. Морфофункцио-нальные аспекты патогенеза туберкулезной гранулемы и патогенетического лечения хронического специфического воспаления в эксперименте. // Патогенез хронического воспаления. Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума с международным участием. Новосибирск, 1991. -С. 54-57.

28. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. Морфологические изменения в печени мышей при лечении экспериментального туберкулеза декстран-ассоциированным изониазидом. // Экологическая патология и ее коррекция. Тез. докл., Чита, 1991. - С.224-225.

29. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова H.A., Пантелеева А.Г. Эффективность липосомальной формы рифампицина при лечении экспериментального туберкулеза мышей. // Проблемы туберкулеза, 1992. -NN1-2. - С. 13-15.

30. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова H.A., Пантелеева А.Г. Эффективность микрокорпускулярной формы изониазида при внутривенном лечении туберкулеза легких у мышей. // XI Всесоюзн. съезд фтизиатров. С-Петербург. Тез.докл.,1992. - С.43.

31. Курунов Ю.Н., Попова H.A., Каледин В.И. Отвлечение макрофагов - ведущее звено в стимуляции опухолевого роста. / I съезд иммунологов России. Новосибирск, 1992. Тез.докл., - С.264.

32. Курунов Ю.Н.. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Голодникова O.A., Пантелеева А.Г., Яковченко H.H. Терапевтическая эффективность коньюгата изониазид-декстран при химиотерапии туберкулеза в эксперименте. // 3-ий Национальный конгресс по болезням органов дыхания. С-Петербург, 1992. Тез. докл.. 1992. - С. 958.

33. Архипов С. А., Шкурупий В. А.. Курунов Ю. Н., Чернова Т. Г., Видякин A.B. Результаты изучения лечебного эффекта комплексного противотуберкулезного препарата на декстрановой матрице в эксперименте. // 3-ий Национальный конгресс по болезням органов дыхания. С-Петербург, 1992. Тез. докл., 1992. - С. 932.

34. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г.. Курунов Ю.Н. Изменение гранулемы при лечении туберкулеза пролонгированной формой изониазида в эксперименте. // Проблемы туберкулеза, 1993, - N1. - С.38-41.

35. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. Ультраструктура эпителиоидных клеток в динамике формирования туберкулезной гранулемы. // Проблемы туберкулеза, 1994, - N1. - С.40-43.

36. Курунов Ю.Н., Шкурупий В.А., Краснов В.А., Яковченко H.H., Чернова Т.Г., Петренко Т.И. Лизосомотропные лекарственные формы в химиотерапии туберкулеза. // 4-ый Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Москва, 1994. Тез.докл.,1994, Реферат N 224.

37. Яковченко H.H., Курунов Ю.Н., Фролова О.И., Шаталова Н.Д. Фармакокинетика ингалированного в липосомах рифампицина. // 4-ый Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Москва, 1994. Тез. докл., 1994. Реферат N 250.

38. Курунов Ю.Н.. Шкурупий В.А., Яковченко Н.Н., Филимонов П.Н. Эффективность липосомальной формы противотуберкулезных пре-

паратов при ингаляционной терапии экспериментального туберкулеза. // II (XII) съезд врачей-фтизиатров. Саратов, 1994. Тез.докл., 1994. - С. 282.

39. Шкурупий В. А., Курунов Ю. Н.. Яковченко Н. Н., Чернова Т.Г. Лизосомотропные лекарственные формы противотуберкулезных препаратов в химиотерапии экспериментального туберкулеза. //II (XII) съезд врачей-фтизиатров. Саратов, 1994. Тез.докл., 1994.

- С. 295-296.

40. Курунов Ю.Н., Яковченко H.H.. Петренко Т. И., Свистельник A.B., Шаталова Н.Д., Фролова О.И., Филимонов П.Н. Липосомы - лим-фотропная лекарственная форма в химиотерапии экспериментального туберкулеза. //Проблемы экспериментальной и клинической лимфоло-гии. Тез. докл. научн.конф., Новосибирск, 1994. - С. 67.

41. Курунов Ю.Н., Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Яковченко H.H. Морфологические критерии эффективности противотуберкулезной химиотерапии в эксперименте. //"Современные проблемы фтизиатрии и пульмонологии в Сибири". Тез.докл.научн.конф., Томск, 1994.

- С. 33-34.

42. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Чернова Т.Г., Яковченко H.H. Динамика эпителиоидноклеточной реакции в процессе формирования туберкулезной гранулемы. //"Современные проблемы фтизиатрии и пульмонологии в Сибири".Тез. докл.науч. конф.. Томск, 1994. - С. 70-72.

43. Курунов Ю.Н., Урсов И. Г., Краснов В. А., Петренко Т. И.. Яковченко Н.Н., Свистельник А. В., Филимонов П.Н. Эффективность липосомальной лекарственной формы антибактериальных препаратов в ингаляционной терапии экспериментального туберкулеза. // Проблемы туберкулеза, 1995, N 1. - С.38-40.

44. Петренко Т. И., Урсов И. Г., Курунов Ю.Н., Бородин Ю. И., Сидорова Л.Д. Лимфогенное поступление в малый круг кровообращения перорально вводимого в обычной и липосомальной формах рифампици-на. // Проблемы туберкулеза, 1995, N 3. - С. 53-54.

45. Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Шкурупий В.А., Яковченко H.H., Свистельник А.В., Петренко Т.И.. Филимонов П.Н. Лимфотроп-ная терапия туберкулеза легких //Пульмонология: (приложение). Сборник-резюме 5-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва, 1995. Реферат N 436.

46. Курунов Ю. Н., Яковченко Н.Н., Свистельник А.В., Петренко Т.И., Филимонов П.Н. Эффективность различных способов введения

липосомальной формы рифампицина при химиотерапии экспериментального туберкулеза. //Пульмонология: (приложение). Сборник-резюме 5-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва, 1996. Реферат N 437.

47. Урсов И.Г., Петренко Т.И., Краснов В.А., Курунов Ю.Н., Боровинская Т. А. Способы усиления этиотропной терапии острых пневмоний и туберкулеза легких. //Пульмонология: (приложение). Сборник-резюме 5-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва, 1995. Резюме N 1173.

48. Свистельник А.В., Филимонов П.Н., Курунов Ю.Н.. Краснов В.А., Шкурупий В. А. Липосомальные формы противотуберкулезных препаратов в лимфотропной терапии туберкулеза. //"Актуальные вопросы современной медицины". Новосибирск, 1995. - С.270-274.

49. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. Патогенетический подход в медикаментозном лечении некоторых форм туберкулеза. //"Актуальные вопросы современной медицины". Новосибирск, 1995.

- С. 264-266.

50. Курунов Ю.Н. Значимость воспалительного компонента в противоопухолевой резистентности. // Тезисы докладов научной сессии НМИ, Новосибирск, 1995. - С. 27.

51. Курунов Ю.Н., Шкурупий В. А. Лизосомотропные лекарственные формы в этиоиатогенетической терапии хронических заболеваний. //Тезисы докладов научной сессии сотрудников НМИ, Новосибирск, 1995. - С. 28.

52. Курунов Ю.Н., Яковченко H.H., Петренко Т.И., Свистельник A.B. Лимфотропная терапия экспериментального туберкулеза. // Тезисы докладов научной сессии сотрудников НМИ, Новосибирск, 1995.

- С.49-52.

53. Филимонов П.Н., Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н. Сравнительная морфометрия ультраструктур фибробластов легких и гранулемы печени при лечении хронического диссеминированного туберкулеза // Тезисы доклада научной сессии сотрудников НМИ, Новосибирск, 1995.

- С.39. (Труды НМИ).

54. Филимонов П.Н., Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н. Морфологические изменения в гранулемах при лечении хронического диссеминированного туберкулеза комплексным препаратов изониазида. //Тезисы докладов научной сессии сотрудников НМИ, Новосибирск, 1995. - С. 40. (Труды НМИ).

55. Краснов В.А., Курунов D.H., Свистельник A.B., Параскун И.В., Филимонов П.Н. Липосомальные формы противотуберкулезных препаратов экспериментального туберкулеза. //Тезисы докладов научной сессии сотрудников НМИ, Новосибирск, 1995. - С.145. (Труды НМИ).

56. Курунов Ю.Н., Яковченко Н.Н., Петренко Т.И., Свистельник A.B. Лимфотропная химиотерапия экспериментального туберкулеза. //"Актуальные вопросы патофизиологии лимфатической системы", Новосибирск, 1995. - С.49-52. (Труды Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН).

57. Петренко Т.И., Курунов Ю.Н. Лимфогенное поступление в малый круг кровообращения перорально введенной липофильной лекарственной формы рифампицина. //"Актуальные вопросы патофизиологии лимфатической системы". Новосибирск, 1995, - С. 17-20. (Труды Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН).

58. Курунов Ю.Н., УрсовИ.Г., Краснов В. А., Шкурупий В. А.. Свистельник А.В., Филимонов П.Н., Чернова Т.Г. Лизосомотропные препараты в этиопатогенетической терапии туберкулеза. // "70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза". Новосибирск, 1995. - С.283-285.

59. Курунов Ю.Н., Краснов В.А.. Свистельник А.В., Пантелеева А.Г., Яковченко Н. Н. Морфологические и биохимические аспекты развития пневмосклероза при различных режимах аэрозольной химиотерапии экспериментального туберкулеза. // " 70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза. Новосибирск, 1995. - С. 289-292.

60. Шкурупий В. А., Курунов Ю.Н., Филимонов П.Н., Панасенко С.Г. Особенности структурных преобразований в гранулемах при лечении хронического диссеминированного туберкулеза комплексным ли-зосомотропным препаратом изониазида. //"70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза. Новосибирск, 1995. -С.292-293.

61. Петренко Т. И., Курунов D.H., УрсовИ.Г., Шаталова Н. Д. Лимфогенное поступление в малый круг кровообращения перорально вводимого рифампицина. //" 70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза. Новосибирск, 1995. - С. 294-296.

62. Белкин А.Д.. Курунов Ю.Н. Влияние свободного и включенно-

го в липосош изоникотиноилгидразондиальдегид-декстрана на фагоцитоз микобактерий штамма БЦЖ. // "70 лет противотуберкулезной службе Новосибирской области. 50 лет Новосибирскому НИИ туберкулеза. Новосибирск. 1995. - С. 296-299.

Соискатель Ю.Н. Курунов

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Д декстран

ДС декстран сульфат

ЕР естественная резистентность

И изониазид

КПИ комплексный препарат изониазида

ЛТП лизосомотропный препарат

Мф макрофаг

ОК опухолевые клетки

ПА провоспалительные агенты

ПГ Е2 простагландин Е2

ПОИ противоопухолевый иммунитет

СМФ система мононуклеарных фагоцитов

СТ соединительная ткань

Тб Т-лимфоциты-супрессоры

ЦФ циклофосфамид

ЭК эпителиоидная клетка