Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:"Патогенетические факторы модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких"

На правах рукописи

Шилько Татьяна Александровна

03

СЕ И 2009

Патогенетические факторы модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск-2009

003476310

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН Новицкий Вячеслав Викторович

доктор медицинских наук, профессор Уразова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович

доктор медицинских наук Потапов Алексей Валерьевич

доктор медицинских наук, профессор Салмина Алла Борисовна

Ведущая организация:

Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится « ХС » 2009 г. в /О часов на заседании дис-

сертационного совета при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан « » "<-</? М 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

х? , Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез остается серьезной и актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [Краснов В.А., 2008; Jeong Y.J., Lee K.S., 2008]. Изучение эпидемиологической ситуации за последние годы показало, что прогноз относительно ликвидации туберкулеза не оправдался. Данные Европейского регионального бюро ВОЗ свидетельствуют о том, что распространение туберкулеза приобрело угрожающие масштабы. Так, например, в России заболеваемость туберкулезом в 2007 г. достигала 83,2 случаев на 100 тыс. населения, а в Томской области в 2007 г. - 102,5, в 2008 г. - 101,4. Серьезную эпидемиологическую проблему представляют группы риска - лица с асоциальным поведением, иммигранты, наркоманы, дезадаптированные подростки, среди которых имеют широкое распространение лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, включая полирезистентные варианты инфекции. Прогрессирующее увеличение числа случаев заражения антибиотико-рефрактерными штаммами микобактерий, устойчивых к двум, трем и более туберку-лостатическим препаратам, является отрицательной тенденцией последних лет. Об этом свидетельствует рост частоты развития остропрогрессирующих форм лекарственно-резистентного туберкулеза с тяжелым клиническим течением и значительной распространенностью патологического процесса [Каминская Г.О. и соавт., 2006; Исакова Ж.Т. и соавт., 2007; Маркелов Ю.М., Дородная И.А., 2007; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Согласно современным представлениям, наиболее тяжелое течение туберкулеза отмечается при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа [Масленников A.A. и соавт., 2007]. Ведущая роль в обеспечении противотуберкулезной защиты организма, как известно, принадлежит тканевым и циркулирующим фагоцитам - альвеолярным макрофагам, моноцитам и полиморфно-ядерным нейтрофилам, а также индукторам иммунного воспаления - лимфоцитам. Между тем наиболее характерными признаками дизрегуляции иммунных процессов при туберкулезе, по данным ряда авторов, являются, прежде всего, нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов [Комогорова С.Э. и соавт., 2005; Пичугин A.B., 2005; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Установлено, что патогенез иммунной пшо- и анергии при инфекционном процессе во многом определен индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата иммунокомпетентных клеток и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. Основную функцию гомеостатической регуляции в организме выполняют система ДНК-репарации, обеспечивающая внутриклеточное восстановление генетических структур, и апоптоз, обусловливающий поддержание баланса между делением и гибелью клеток и элиминацию аберрантных клеточных форм

и инфицированных клеток. В то же время цитогенетические повреждения и дисфункция ДНК-репаративной системы могут служить своего рода индукторами апоптоза [Суханова ГЛ., Акбашева O.E., 2006; Camenisch U., Naegeli Н„ 2009].

Выяснение путей запуска и молекулярных механизмов дизрегуляции запрограммированной гибели отдельных клеток в многоклеточном организме является одной из нерешенных задач медико-биологических наук. Актуальность этой проблемы определяется тем, что срыв (угнетение или, наоборот, усиление) апоптозной программы в организме обусловливает развитие и прогрессирование ряда заболеваний, в том числе инфекционных. Так, например, установлено, что дефект Fas-индуцированного апоптоза моноцитов/макрофагов и стимуляция экспрессии на макрофагальных клетках ан-тиапоптозного гена bcl-2 при туберкулезе являются ключевыми факторами латентной микобактериальной инфекции [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa Т., 2007, 2008]. Вместе с тем многие вопросы относительно дизрегуляторных нарушений естественной гибели клеток и участия апоптоза в патогенезе иммунной дестабилизации при туберкулезном процессе остаются открытыми. До сих пор нет патогенетического обоснования роли перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и ионного дисбаланса в реализации апоптозных потенций иммуноцитов и формировании бактериальной иммунорезистентности при туберкулезе.

В свете изложенного представляется важным изучение молекулярно-биологических механизмов, определяющих развитие и характер течения туберкулезного процесса. Это, несомненно, расширит имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой для создания более совершенных методов диагностики и прогнозирования туберкулеза, выявления групп риска по развитию тяжелых прогрессирующих форм заболевания, а также для разработки более эффективных методов профилактики и коррекции иммунопатологических изменений, сопровождающих туберкулез и противотуберкулезные мероприятия.

Цель исследования: выявить общие закономерности и факторы модуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном туберкулезе легких до и в условиях противотуберкулезной химиотерапии. Задачи исследования:

1. Оценить уровень апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных 18-55 лет с распространенным деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией).

2. Оценить роль нарушений макро- и микроэлементного состава, цитогенетического

статуса, структурных свойств мембраны, перекисного окисления липидов в индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких.

3. Провести сравнительную оценку апоптоз-модулирующих факторов мононуклеар-ных лейкоцитов периферической крови у больных легочным туберкулезом (лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным, диссе-минированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией) и у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.

4. Установить патогенетические факторы индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови при отдельных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких до и в процессе противотуберкулезной полихимиотерапии.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных с различными клиническими формами (ин-фильтративный, диссеминированный, фиброзно-кавернозный, казеозная пневмония) распространенного деструктивного туберкулеза легких в связи с чувствительностью возбудителя к терапии до начала лечения и на фоне проведения противотуберкулезной химиотерапии. Установлено, что течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Н202-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации. При этом активность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов наиболее значительна при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии имеет наименее выраженный характер. Охарактеризована роль нарушений цитогенетиче-ского статуса, структурной организации мембраны и макро- и микроэлементного состава (Са2+, Ка+, Ре2+, Mg2+, А13+, Си2+, 2п2+, Мп2+) клеток и плазмы в модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких до и на фоне противотуберкулезной терапии. Установлены дифференциальные факторы индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Наиболее значимыми из них при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких оказались увеличение числа предуготовленных к апоптозу С095+-клеток, хромосомные аберрации на фоне подавления ДНК-репарации (как фактор апоптоза лимфоцитов), повышение текучести мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы (как фактор апоптоза моноцитов); при лекарственно-резистентном туберкулезе легких - нарушения липид-ного спектра мембраны и катионного состава внутриклеточной среды и плазмы. По

результатам исследования сделано предположение о том, что апоптоз мононуклеар-ных лейкоцитов крови может быть реализован по РаБ-опосредованному, а также (в связи с накоплением в клетках кальция) митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Показано, что спектр факторов активации апоптоза при туберкулезе легких существенно отличается от такового при хронической обструк-тивной болезни легких; при этом перекисное окисление липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких и не вызывает апоптогенного эффекта при множественной лекарственной резистентности. Установлено, что на фоне специфической противотуберкулезной терапии спектр апоптоз-стимулирующих факторов варьирует, выраженность составляющих его изменений (равно как и непосредственно уровень активации апоптоза) возрастает после интенсивного курса лечения, в то время как после завершения фазы поддерживающей терапии уровень гибели клеток проявляет тенденцию к нормализации.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания о роли апоптоза в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, факторах активации программированной гибели лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных туберкулезом легких. Результаты исследования могут служить основой новых методологических подходов к иммуно-коррекции, направленной на повышение жизнеспособности и регуляцию численности клеток крови, формирующих реакции доиммунного воспаления (моноциты) и адаптивного противотуберкулезного иммунитета (лимфоциты), а также быть использованы в качестве информативных критериев для оценки прогнозирования течения и исхода заболевания. Это позволит проводить своевременную профилактику осложнений легочного туберкулеза, в том числе вызванных иммунотоксическим действием применяемых в терапии туберкулеза фармакологических средств. Положения, выносимые на защиту:

1. Течение туберкулеза легких сопровождается активацией апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. Степень выраженности и спектр факторов индукции программированной гибели клеток зависят от клинической формы заболевания. При этом они наиболее значительны при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-резистентного туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии являются минимальными.

2. К общим факторам индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких относятся повышенное содержание холестерина и фасфатидилино-зитола в клеточной мембране в сочетании с уменьшением микровязкости ее ли-

пидного бислоя, а также увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, А13+ и (при снижении содержания в плазме) Си2+. При этом степень активности

апоптоза моноцитарных клеток в связи со стимуляцией эксцизионной ДНК-репарации ниже, чем уровень программированной гибели лимфоцитов.

3. При лекарственно-чувствительном туберкулезе, наряду с активацией перекисного окисления липидов, в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют гиперэкспрессия С095/Ра$ на фоне повышения количества хромосомных аберраций и подавления ДНК-репарации в клетках, а в числе факторов апоптоза моноцитов - повышение текучести мембраны и изменения внутриклеточной и плазменной концентрации макро- и микроэлементов (А13+, Си2+). При лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз лимфоцитов и моноцитов индуцируют нарушения липидного спектра мембраны (увеличение концентрации холестерина и легкоокисляемых фракций липидов) и катионного (Ре , М§2+, Си ) состава клеток и плазмы крови.

4. К факторам модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, отличающим специфическую (туберкулез) и неспецифическую (хроническая обструктивная болезнь) патологии легких, относятся сопровождающие течение туберкулезного воспаления хромосомные аберрации (обмены, разрывы), изменения активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

5. В условиях интенсивной противотуберкулезной терапии усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов обусловлено более выраженными (чем до лечения) перестройками их клеточной мембраны, повышением активности перекисного окисления липидов, а также (в направлении гибели лимфоцитов) числа хромосомных аберраций и концентрации макро- и микроэлементов (Бе2+, А13+, Си2+, в клетках и Са2+, в клетках и плазме). При этом после курса поддерживающей химиотерапии восстановление активности процессов липопероксидации и ДНК-репарации, структуры и катионного состава клеток и плазмы определяет тенденцию к нормализации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Томской области, 75-летию кафедры фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), Международной научной

конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), XIII Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Второй международной Германо-Российской конференции Форума им. Коха и Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilitation (Ганновер, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2003-2009).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление») и фтизиатрии (раздел «Иммунитет и аллергия при туберкулезе») на лечебном и педиатрическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Исследования проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (ГК №02.445.11.7419 «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы»; ГК №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма») и Совета по грантам при Президенте РФ (НШ-1051.2003.04 «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток крови при патологии»; НШ-4153.2006.7 «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы»).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 29 работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 96 таблицами. Библиографиче-

ский указатель включает 382 источника, из них 225 отечественных и 157 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 298 больных с распространенным деструктивным туберкулезом легких. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной противотуберкулезной больнице (гл. врач - Янова Г.В.) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. - Новосельцева О.И.), №2 (зав. отд. - Малиновская Т.З.), №3 (зав. отд. - Янов A.A.). На завершающем этапе лечения больные наблюдались на базе Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - Мишустин С.П.).

Клинический осмотр и обследование пациентов, сбор анамнеза, постановку диагноза и назначение соответствующих схем лечения осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулезной клинической больницы (чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., K.M.H. Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев A.C., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов A.A., Щегерцов Д.А.). Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких. Диагноз инфильтративного туберкулеза легких был выставлен 117 (39,26%) больным, диссеминированного - 103 (34,56%), фиброзно-кавернозного - 61 (20,47%), казеоз-ной пневмонии - 17 (5,71 %).

В ходе исследования все больные с туберкулезом легких были разделены на две основные группы в зависимости от чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам: в первую группу вошли 188 больных, выделяющих М. tuberculosis, чувствительные к основным противотуберкулезным препаратам, во вторую -110 больных, выделяющих М. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью (устойчивость к изониазиду, рифампицину и стрептомицину). Каждая группа дополнительно была разделена на подгруппы в зависимости от клинической формы заболевания. Для видовой идентификации и определения чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Лечение больных туберкулезом легких проводилось в соответствии со стандартными схемами противотуберкулезной химиотерапии, включающими в себя интенсивную и под держивающую фазы лечения.

Обследование больных туберкулезом легких проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии, после окончания курса интенсивной химиотерапии и после курса поддерживающей противотуберкулезной терапии.

Группы сравнения составили 17 здоровых мужчин и женщин в возрасте от 18 до 50 лет и 17 пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Все лица, входящие в группу здоровых доноров, прошли медицинский осмотр в МЛПМУ «Поликлиника №5» (главный врач - Коваленко С.И.). В анамнезе не было обнаружено хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций. Частота заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не превышала 3 раз в год.

Материалом исследования служила венозная кровь.

Определение общего количества лейкоцитов, абсолютного и относительного числа их отдельных морфологических форм проводили общепринятыми гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Выделение лимфоцитов и моноцитов периферической крови осуществляли на градиентах плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3 и 1,083 г/см3 соответственно) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Определение апоптотических лимфоцитов и моноцитов проводили методом люминесцентной фотометрии на основе индикации annexin V+ клеток («BD Biosciences», США). Апоптоз стимулировали путем добавления в клеточную суспензию Н202 с последующим культивированием клеток в течение 24 ч. Оценку экспрессии Fas/APO-1 (CD95+) на лимфоцитах периферической крови проводили методом иммунофлуоресценции с использованием набора моноклональных антител «Клонос-пектр» (МедБиоСпектр, Россия).

Активность УФО-индуцированной ДНК-репарации в лимфоцитах и моноцитах исследовали методом сцинтилляционной радиометрии. Обработку культур лимфоцитов крови и приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead et al. (1960). Для стимуляции клеточного деления использовали 0,01% раствор колхицина («Fluka», Швейцария). У каждого обследуемого анализировали не менее 100 метафазных пластинок, учитывая общее количество клеток с хромосомными нарушениями, количество аберраций хромосом (на клетку), количество клеток с изменением числа и нарушениями структуры хромосом.

Концентрацию железа, меди, марганца, цинка, магния, алюминия в лимфоцитах, моноцитах и плазме крови определяли методом эмиссионного спектрального анализа по спектру излучения атомов, а концентрацию натрия, калия и натрия - плазменно-фотометрическим методом, основанным на измерении интенсивности излучения атомов элементов, возбуждаемых в пламени [Кузяков Ю.Я. и соавт., 1990].

Оценку микровязкостных свойств плазматической мембраны мононуклеарных лейкоцитарных клеток крови осуществляли путем флуоресцентного зондирования с использованием флуоресцентного зонда пирен [Добрецов Г.Е., 1989]. Выделение плазматических мембран мононуклеарных лейкоцитов проводили путем разделения клеточных компартментов в двухфазной системе декстран (500 000)-ПЭГ 6000 [Финдлей Дж., Эванс С., 1991]. Изучение липидного спектра мембран мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли поэтапно с использованием метода тонкослойной хроматографии: выделение липидного экстракта [Folch J et al., 1957]; определение содержания общих фосфолипидов [Колб В.Г., 1982]; разделение основных классов фосфолипидов и нейтральных липидов [Жухоров JI.C., 1984]; определение процентного содержания фракций липидов; количественное определение фосфолипидов [Жухоров JI.C., 1984]; количественное определение холестерина [Кар-пшценко А.И, 2002]. Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов фирмы «Sigma» (США).

Исследование содержания ТБК-активных продуктов [Арутян A.B. и соавт., 2000] и диеновых конъюгатов [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983] в мононуклеарах периферической крови проводили методом спектральной фотометрии. Активность супероксиддисмутазы (адренохромовый методод) и каталазы (по убыли перекиси водорода) в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови определяли спектро-фотометрически [Арутян A.B. и соавт., 2000].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 12. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро-Вилка. Так как сформированные выборки не подчинялись нормальному закону распределения, то использовали непараметрические статистические критерии. Для определения достоверности различий при сравнении трех выборок и более применяли непараметрический аналог дисперсионного анализа -критерий Крускала-Уоллиса. Для множественных сравнений двух независимых выборок использовали критерий Данна. Для повторных измерений применяли критерий Фридмана. Для множественных сравнений двух зависимых выборок применяли критерий Даннета. Зависимости между переменными вычисляли с помощью коэффициента корреляции Спирмена R. Результаты представляли в виде выборочных средних (М), а также в виде медианы, верхнего (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Me (Q1-Q2)). Для выявления значимых факторов (р<0,005) в запуске программы программируемой клеточной гибели у больных туберкулезом легких был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся показатель спонтанного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Туберкулез развивается и протекает наиболее тяжело при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа, в первую очередь со стороны макрофагов и лимфоцитов [Сахарова И.Я. и соавт., 2003]. Исследования показателей клеточного иммунитета выявили, что течение туберкулезной инфекции ассоциировано с развитием синдрома вторичного иммунодефицита [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Сахно JI.B. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Комогорова Е.Э. и соавт., 2005]. Наличие иммуно-депрессии обусловливает нарастание частоты быстропрогрессирующих форм туберкулеза.

Проведенные нами исследования показали, что у больных туберкулезом легких (TJI) до начала химиотерапии имеются достоверные нарушения количественных показателей белой крови по сравнению с соответствующими значениями у здоровых доноров, проявляющиеся увеличением OKJ1 (исключение составили пациенты с казеозной пневмонией и инфильтративной формой лекарственно-чувствительного TJI), лимфоцитопенией и моноцитозом.

Основными механизмами, способствующими формированию лейкоцитоза, являются ускоренный выход лейкоцитов из костного мозга в кровь, стимуляция костномозгового кроветворения, выход клеток в циркуляцию из маргинального пула [Дыгай А.М., Клименко H.A., 1992; Ляшенко В.А., 1995; Фрейдлин И.С., 1995; Гольдберг Е.Д. и соавт., 1997; Кашкин К.П., 1998]. Выявленная нами при ТЛ лимфоцитопения могла быть связана с истощением пула ранних и гибелью циркулирующих лимфоци-тарных клеток [Черных Е.Р. и соавт., 2002; Сахно JI.B. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин A.B., 2005], в том числе в связи с прямым действием туберкулезных токсинов [Чернов А.П., и соавт., 1998; Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Свой вклад в развитие лимфоцитопении, вероятно, может вносить дисбаланс со стороны эндокринной системы [Баласанянц Г.С. и соавт., 2000; Мишин В.Ю., 2004].

Большинство заболеваний органов дыхания сопровождается общими клиническими симптомами, среди которых преобладают синдром интоксикации и бронхолегоч-ные нарушения. При этом оценка специфичности изменений, характерных для туберкулезного процесса, является необходимым условием дифференцированного подхода к углубленному изучению данной патологии, разработке прогностических ее критериев и лечебно-реабилитационных программ. В результате при сравнении гематологических параметров у больных ТЛ и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) было установлено, что моноцитоз и лимфоцитопения характеризуют развитие туберкулезной инфекции, но отсутствуют при неспецифическом воспалении легких.

Лимфоциты и циркулирующие моноциты являются одними из главных эффекторов противотуберкулезного иммунитета [Маянский А.Н., 2001; Каминская Г.О. и со-

авт., 2006]. Их численность в крови зависит от многих факторов, в том числе от активности апоптоза. Повышенная готовность лейкоцитов к апоптозу в настоящее время рассматривается в качестве одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа не только при туберкулезе, но и при других инфекциях бактериальной и иной природы [Уманский Ю.А., 1996]. В связи с этим важным представлялось провести комплексную оценку апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при ТЛ.

Проведенные исследования показали, что при разных формах TJI и у больных ХОБЛ отмечается сходная динамика изменений активности апоптоза мононуклеар-ных лейкоцитов. Так, у пациентов с ТЛ до начала лечения было выявлено увеличение количества annexin V-положительных лимфоцитов и моноцитов относительно соответствующих параметров у здоровых доноров и больных с обострением ХОБЛ (табл. 1). Кроме этого, было обнаружено, что содержание предуготовленных к апоптозу С095+-лимфоцитов при ТЛ превышает аналогичные значения у здоровых доноров и при ХОБЛ.

При оценке действия перекиси водорода, как неспецифического индуктора апоп-тотической гибели клеток, было установлено, что у больных ТЛ и ХОБЛ она опосредовала более выраженное, нежели у здоровых доноров, увеличение числа annexin V+ лимфоцитов и моноцитов in vitro по сравнению с уровнем спонтанной гибели клеток, не обработанных Н202, что служит дополнительным свидетельством повышенной предрасположенности мононуклеарных лейкоцитов к апоптозу. Показано, что основной тип повреждений, который индуцирует перекись водорода - однонитевые разрывы. В свою очередь, возникающие повреждения увеличивают экспрессию белка р53, что приводит к активации проапоптотических белков (Вах, Bcl-xs, Bfli), репрессии антиапоптотических факторов (Bcl-2, Bcl-xL) и апоптозу [Жукова О.Б. и соавт., 2006].

Среди ученых до сих пор нет единого мнения о механизмах индукции апоптоза при ТЛ. Неизвестно насколько они специфичны для данной патологии. Учитывая вышеизложенное, нами было проведено сравнительное исследование, позволяющее выявить наиболее значимые показатели в запуске программы клеточной гибели у больных ТЛ и ХОБЛ. Для решения поставленной задачи был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

Предполагается, что чрезмерная экспрессия Fas-антигена является следствием дисбаланса активационных сигналов, обусловливающего включение программы гибели клеток при их стимуляции [Салина Т.Б., Худзик Л.Б., 2001]. В частности, T. Hertoghe et al. (2000), A. Soruri et al. (2002) показали увеличение числа CD95+-Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Этот феномен был зафиксирован также и в других научных публикациях [Бойчук C.B. и соавт., 2003; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003;

Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин A.B., 2005]. Вместе с тем некоторыми исследователями было продемонстрировано, что механизм ассоциированного с TJI апоптоза опосредован подавлением bcl-2 [Klinger К. et al., 1997]. В последние годы появились данные о совместной роли CD95 и Ьс1-2-репрессии в индукции апоптоза [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa Т., 2007, 2008]. Роль CD95+ в запуске апоптоза подтверждается также результатами нашего исследования. Так, согласно данным ковариационного анализа, у больных с инфильтративным и диссеминированным ЛЧ TJI гиперэкспрессия CD95+ на лимфоцитах явилась значимым фактором, инициирующим их апопто-тическую гибель (табл. 2).

Таблица 1

Уровень апоптотических мононуклеаров в периферической крови у здоровых доноров, больных хронической обструктивной болезнью (ХОБЛ) _и туберкулезом легких до начала лечения (М)_

Группы обследованных лиц У ровень annexin V+ клеток (%)

Лимфоциты Р Моноциты Р

Здоровые доноры 17,33 - 13,78 -

Больные ХОБЛ 23,20 Pi =0,0070 19,80 р,=0,0014

Больные ЛЧ ТЛ Инфильтративная форма 34,78 pi=0,0003 P2=0,0003 29,67 Р!=0,0003 Р2=0,0003

Диссеминированная форма 27,33 pi =0,0004 р3=0,0054 29,89 Р1=0,0003 Р2=0,0006

Фиброзно-кавернозная форма 38,00 pi =0,0003 P2=0,0002 Р4=0,0010 32,44 р,=0,0003 Р2=0,0002

Казеозная пневмония 25,50 pi =0,0054 р3=0,0087 ps=0,0055 27,00 pi=0,0054 Р2=0,0133

Больные ЛУ ТЛ Инфильтративная форма 38,44 pi=0,0003 Р2=0,0002 35,89 Р1=0,0003 Р2=0,0006 Рб=0,0118

Диссеминированная форма 29,44 pi=0,0003 Р2=0,0127 рз=0,0023 32,44 Р1=0,0003 Р2=0,0002

Фиброзно-кавернозная форма 33,11 pi=0,0003 Р2=0,0005 рз=0,0104 р6=0,0118 32,44 Р1=0,0003 Р2=0,0002

Примечание. ЛЧ ТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУ ТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких; р! - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров; рг - по сравнению с аналогичными показателями у больных ХОБЛ; рз - по сравнению с показателями при инфильтрагивной форме; Р4- по сравнению с показателями при диссеминированной форме; р5- по сравнению с показателями при фиброзно-кавернозной форме; р6- по сравнению с показателями у больных ЛЧ ТЛ (для каждой формы и этапа исследования).

Таблица 2

Факторы, оказывающее влияние на апоптоз лимфоцитов

у больных туберкулезом легких до начала терапии_

Форма туберкулеза Показатель Р

Инфильтративная Число С095+- лимфоцитов р<0,00001

Число лимфоцитов с изменением количе- р<0,00001

ства хромосом

Число хроматидных разрывов р<0,00001

в лимфоцитах

Число хромосомных обменов р<0,00001

в лимфоцитах

ч [— ИС ДНК-репарации лимфоцитов р<0,00001

3* 1=; Содержание ТБК-а в лимфоцитах р<0,00001

4) Уровень меди в лимфоцитах р<0,00001

X л Диссеминированная Число С095+-лимфоцигов р<0,00001

а Уровень марганца в лимфоцитах р<0,00001

Уровень натрия в лимфоцитах р<0,00001

Фиброзно- Уровень натрия в лимфоцитах р<0,00001

кавернозная Уровень цинка в лимфоцитах р<0,00001

Содержание СФМ в мембране р<0,00001

мононуклеаров

Содержание ФС в мембране мононуклеаров р<0,00001

Казеозная пневмония - -

Инфильтративная ХС/ФЛ в мембране мононуклеаров крови р<0,00001

Уровень железа в лимфоцитах р=0,00001

Уровень натрия в лимфоцитах р=0,00002

ч н Уровень меди в лимфоцитах р=0,00004

Диссеминированная Содержания СФМ в мембране р<0,00001

ч мононуклеаров

3 я Содержание ФИ в мембране р<0,00001

1 мононуклеаров

Уровень меди в плазме р<0,00001

Уровень магния в плазме р<0,00001

Фиброзно- Микровязкость мембраны лимфоцитов р=0,00003

кавернозная Уровень марганца в плазме р<0,00001

Примечание. Здесь и далее ЛЧ ТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких, ЛУ ТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких; ИС - индекс стимуляции; ТБК-а - ТБК-активные продукты; ДК - диеновые конъюгаты; СОД - супероксиддисмутаза; СФМ - сфин-гомиелин; ФИ - фосфатидилинозигол; ФС - фосфатидилсерин; ЛФЛ - лизофосфолипиды.

Таким образом, течение ТЛ характеризуется увеличением содержания аппехт V- и С095-положительных лимфоцитов в крови, что имеет место при всех вариантах заболевания и, вероятно, служит одним из факторов лимфоцитопении. Однако несмотря на высокий уровень апоптоза моноцитов крови, при ТЛ, как показали полученные результаты, имеет место моноцитоз, что, вероятно, объясняется включением перераспределительного и продуктивного механизмов компенсации с замещением погибших моноцитов не только зрелыми (резервными), но и молодыми, функционально неполноценными формами клеток. При этом повышение содержания аппехт V-положительных мононуклеаров и С095+-лимфоцитов у пациентов с обострением ХОБЛ, аналогичное таковому при ТЛ, указывает на типовой характер нарушений апоптоза.

Одной из причин нерепарируемых повреждений ДНК является патология ДНК-восстановительных систем, что в итоге приводит клетку к апоптозу. В связи с этим были проведено исследование активности ДНК-репарации в мононуклеарных лейкоцитах и хромосомный анализ лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ.

У больных с инфильтративным и фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ ТЛ до начала терапии выявлялось достоверное снижение индекса стимуляции (ИС) ДНК-репарации в лимфоцитах относительно аналогичных показателей у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у пациентов с диссеминированной формой ТЛ, казеозной пневмонией (КП) и ХОБЛ данный показатель не отклонялся от нормы.

Эксцизионная репарация ДНК, как известно, обеспечивает защиту геномной ДНК от повреждений генотоксическими факторами [Василенко Н.Л., Невинский Г.А., 2003]. Инфильтративный туберкулез не возникает в интактных зонах легочной ткани, а развивается, как правило, в тех участках легких, которые способны ответить бурной гиперергической воспалительной реакцией на возбудитель. Центральным звеном им-мунопатогенеза инфильтративного туберкулеза легких является длительная циркуляция в организме сенсибилизированных к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитов [Хоменко А.Г., 1998]. Фиброзно-кавернозный ТЛ - наиболее неблагоприятная, прогрессирующая форма туберкулезной инфекции. Столь продолжительный контакт лимфоцитов с инфектогеном при инфильтративной форме и усугубляющаяся тяжесть процесса при фиброзно-кавернозном варианте ТЛ может служить, на наш взгляд, фактором «истощения» резервных ресурсов системы восстановления ДНК. При диссеминированном туберкулезе легких и КП патогенетическая роль лимфоцитов реализуется на более поздней стадии развития заболевания, в связи с чем клетки в меньшей степени подвергаются инфекционному повреждению [Норейко Б.В., 2003; Мишин В.Ю., 2004].

При анализе полученных данных обращало на себя внимание то, что снижение активности ДНК-репарации в лимфоцитах выявлялось при тех формах ТЛ, при которых регистрировалась значительная активация апоптоза, и напротив, нормальная величина ИС ДНК-репаративных процессов обнаруживалась при тех вариантах ТЛ, при которых увеличение числа апоптотических лимфоцитов было минимальным. Наиболее ярким примером служит КП: при этой форме ТЛ индекс стимуляции репарации ДНК не отличался от нормальных значений, в то время как уровень аппехш V-положительных лимфоцитов был наиболее низким. Данный факт подтверждает связь программированной клеточной гибели клеток с состоянием ДНК-репаративных процессов при ТЛ.

При анализе состояния ДНК-восстановительных процессов в моноцитах периферической крови только у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ регистрировалось снижение ИС относительно его значений у здоровых пациентов и больных ХОБЛ, в то время как в других группах исследования (за исключением больных с инфильтра-тивным ЛЧ ТЛ) он был выше нормы. У больных ХОБЛ изменений ИС ДНК-репарации моноцитов не регистрировалось.

Общеизвестно, что продукт тканевой трансформации моноцитов - макрофаги формируют «первую линию защиты» в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ), проникших в организм, участвуют в синтезе медиаторов и обладают цитотоксиче-ской активностью по отношению к МБТ [Маянский А.Н., 2001; Еремеев В.В., Майоров К.Б., 2002; Чучалин А.Г., 2004]. Таким образом, повышение активности системы ДНК-репарации в моноцитах, являющихся не только мишенью отрицательного воздействия МБТ, но и важным звеном в противотуберкулезном иммунитете, можно рассматривать как защитно-приспособительную реакцию, направленную на восстановление поврежденных участков цепи ДНК и, тем самым, повышение выживаемости клеток.

При этом результаты ковариационного анализа показали, что снижение активности ДНК-репаративных процессов имеет статистически достоверное значение в запуске программы апоптоза лимфоцитов крови у больных инфильтративным ЛЧ ТЛ до начала терапевтических мероприятий, в то время как активация ДНК-репарации, по всей видимости, оказывает протективный эффект в отношении апоптоза моноцитов у пациентов с диссеминированным ЛЧ ТЛ и инфильтративным ЛУ ТЛ (табл. 2, 3).

В отличие от ТЛ, в патогенезе ХОБЛ важная роль отводится нейтрофильным гра-нулоцитам. Полагают, что макрофаги регулируют воспаление при ХОБЛ за счет высвобождения хемокинов, которые привлекают в очаг воспаления, прежде всего, ней-трофилы и во вторую очередь - моноциты и Т-лимфоциты, высвобождающие факторы (протеазы), приводящие к разрушению эластина и последующему формированию

эмфиземы [Шмелев Е.И., 2007]. Таким образом, лимфоциты и моноциты играют второстепенную роль в патогенезе ХОБЛ. Вероятно, именно поэтому в них не происходит значимой активации ДНК-репарации.

Таблица 3

Факторы, оказывающее влияние на апоптоз моноцитов у больных туберкулезом легких до начала терапии

Форма туберкулеза Показатель Р

Больные ЛЧ ТЛ Инфильтративная Содержание магния в плазме р<0,00001

Содержание меди в плазме р<0,00001

Содержание ТБК-а в моноцитах р<0,00001

Микровязкость мембраны моноцитов р<0,00001

Диссеминированная ИС ДНК-репарации моноцитов р=0,00007

Содержание ТБК-а в моноцитах р=0,00065

Фиброзно-кавернозная Уровень алюминия в моноцитах р<0,00001

Уровень цинка в плазме р<0,00001

Казеозная пневмония - -

Больные ЛУ ТЛ Инфильтративная ИС ДНК-репарации моноцитов р<0,00001

Содержание марганца в плазме р=0,00001

Содержание цинка в плазме р=0,00004

Содержание ФЭА в мембране мононуклеаров р<0,00001

Содержание ФИ в мембране мононуклеаров р=0,00025

Диссеминированная Содержание меди в плазме р<0,00001

Содержание натрия в плазме р<0,00001

Отношение ХС/ФЛ в мембране мононуклеаров р<0,00001

Содержание ХС в мембране мононуклеаров р<0,00001

Фиброзно-кавернозная Содержание марганца в моноцитах р=0,00074

Содержание ФИ в мембране мононуклеаров р=0,00019

Примечание. Здесь и далее ФЭА - фосфатидилэтаноламин; ХС - холестерин; ХС/ФЛ - холе-стерин-фосфолипидное отношение.

При изучении метафазных пластинок лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ было обнаружено достоверное увеличение общего количества клеток с хромосомными нарушениями в сравнении с аналогичными показателями в группах сравнения. При этом увеличение общего количества клеток с хромосомными аберрациями происходило в основном за счет возрастания доли лимфоцитов с нарушениями структуры хромосом. У больных ХОБЛ также обнаруживалось увеличение числа клеток с аберрациями, но за счет изменения числа хромосом.

При анализе структурных аберраций хромосом в лимфоцитарных клетках у боль-mix легочным туберкулезом учитывались хромосомные разрывы и обмены (парные фрагменты, разрывы хромосом по центромере, кольцевые и дицентрические хромосомы), а также хроматидные разрывы и обмены (одиночные фрагменты и «кресты»).

Было зарегистрировано повышение содержания хромосомных разрывов в лимфоцитах у больных с инфильтративным JI4 и ЛУ ТЛ, а также с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ относительно группы здоровых доноров. Одновременно у всех обследуемых пациентов (за исключением больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) отмечалось достоверное повышение числа хромосомных обменов в клетках относительно такового в группах сравнения. У всех пациентов с ЛУ ТЛ, инфильтративным и фиброзно-кавернозным вариантами ЛЧ ТЛ отмечалось также увеличение частоты регистрации хроматидных разрывов в лимфоцитах в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ число хроматидных разрывов в клетках оказалось больше, чем при чувствительной к терапии его форме. В остальных группах обследованных данный показатель не отличался от нормальных значений.

Возрастание в клетке числа хроматидных разрывов и обменов при действии различного рода мутагенных факторов указывает на синтетический или постсинтетический периоды возникновения хромосомных нарушений, повышение же уровня хромосомных разрывов и обменов - на чувствительность к повреждающему воздействию Gi-фазы клеточного цикла [Плотникова H.H., 1992]. По всей видимости, М. tuberculosis посредством индукции образования токсических продуктов клеточного и тканевого распада, стимуляции секреции активных форм кислорода полиморфноя-дерными лейкоцитами, макрофагами и свободнорадикальных реакций [Каминская Г.О., 1996; Mitsuyama М., 1995] может вызывать возникновение нарушений в хромосомном аппарате лимфоцитов. Можно также сделать вывод о том, что при КП и дис-семинированном варианте ЛЧ ТЛ хромосомные аберрации лимфоцитов возникают преимущественно в Gi-фазе, при остальных формах ТЛ как в Gb так и S- и С2-фазах клеточного цикла.

Интересным представляется также тот факт, что уровень апоптоза лимфоцитов был максимальным при тех формах ТЛ, при которых отклонения параметров цитоге-нетического статуса являлись наиболее выраженными. Так, при инфильтративном и фиброзно-кавернозном ТЛ было зарегистрировано наибольшее количество лимфоцитов с хромосомными аберрациями, была пониженной активность ДНК-репарации и высоким уровень апоптотических лимфоцитов. При диссеминированном ТЛ и КП, напротив, было выявлено незначительное повышение числа клеток со структурными нарушениями хромосом, annexin-позитивных клеток и нормальный уровень ДНК-

репаративного синтеза. Кроме этого, при инфильтративном ЛУ ТЛ была отмечена положительная корреляционная связь между показателем спонтанного апоптоза лимфоцитов и количеством хромосомных (г=0,892; р=0,041) и хроматидных (г=0,892; р=0,041) обменов. Данный факт демонстрирует роль цитогенетических изменений в запуске апоптоза. При проведении ковариационного анализа также была подтверждена роль нарушений числа и структуры хромосом, количества хроматидных разрывов и хромосомных обменов в инициации апоптотической гибели лимфоцитов у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ (см. табл. 2).

Таким образом, ТЛ сопровождается угнетением эксцизионной ДНК-репарации и накоплением хромосомных аберраций в лимфоцитах. Наряду с этим в моноцитах регистрируется повышение индекса ДНК-репарации (за исключением больных с фиб-розно-кавернозным ЛЧ ТЛ). У пациентов с ХОБЛ, равно как и у больных ТЛ, уровень лимфоцитов с хромосомными нарушениями выше, чем у здоровых добровольцев, однако только за счет числовых аберраций хромосом при отсутствии выраженных отклонений со стороны активности ДНК-репаративных процессов, что указывает на специфический характер цитопатического действия возбудителя туберкулезной инфекции.

Известно, что при апоптозе мембрана иммуноцитов утрачивает ворсинчатость и образует пузыревидные вздутия, что возможно только в условиях повышенной текучести мембраны. В связи с этим нами была проведена оценка микровязкостных свойств цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов у больных ТЛ до начала химиотерапии и у пациентов с ХОБЛ в фазу обострения с использованием метода флуоресцентного зондирования.

В результате проведенных исследований были получены достоверные данные, позволяющие судить о нарушении микровязкости липидного бислоя мембраны моно-нуклеарных лейкоцитов у больных ТЛ и ХОБЛ. Так, проведенное спектрофлуоримет-рическое исследование цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов крови позволило установить достоверное увеличение коэффициентов эксимеризации пи-рена I470/I370 и I470/I390 при длинах волн возбуждающего света Q.) 285 нм и 340 нм во всех группах больных ТЛ до лечения (так же, как и у пациентов с ХОБЛ) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.

Зарегистрированное увеличение коэффициентов эксимеризации пирена у больных ТЛ показывает снижение микровязкости мембраны и/или увеличение ее гидрофобного объема как в зоне белок-липидных контактов, оцениваемой при длине волны возбуждающего света 285 нм, так и в общем липидном бислое (Х=340 нм) [Добрецов Г.Е., 1989; Дунаева А.Н. и соавт., 1990]. Повышение текучести мембраны мононук-леаров крови у пациентов с ТЛ, видимо, связано с модификацией ее фосфолипидного

спектра в сторону увеличения пула легкоокисляемых фракций липидов, характеризующихся высоким содержанием ненасыщенных жирнокислотных остатков [Кузьми-чева JI.B. и соавт., 2005].

Известно, что изменение микровязкости мембраны сопровождается перестройкой сети мембранных белков и приводит к повышению подвижности фосфолипидных молекул [Горошинская И.А. и соавт., 1999; Новицкий В.В. и соавт., 2005]. Данный факт играет важную роль в апоптозе. Одним из этапов реализации программы апоптоза является образование апоптотических телец. По всей видимости, без увеличения текучести мембраны изгибание плазматической мембраны и формирование апоптотических телец невозможно. Кроме этого, при снижении вязкости мембраны устраняется асимметрия фосфолипидов, характеризующаяся переходом фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю поверхность мембраны [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006]. Важная роль свойств мембраны в инициации клеточной гибели подтверждается данными ковариационного анализа, который показал статистически достоверную связь между микровязкостью мембраны и активностью апоптоза лимфоцитов (у больных фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ) и моноцитов (при инфильтративном ЛЧ ТЛ) (см. табл. 2, 3).

Наличие изменений показателей флуоресценции пирена в мембране лимфоцитов и моноцитов, а также достаточно похожая картина нарушений при ТЛ и ХОБЛ указывает на их типовой характер. Таким образом, изменения параметров флуоресценции липотропного зонда пирен в мембране лимфоцитов и моноцитов не являются специфичными для туберкулезного процесса, не зависят от вида клеток, формы заболевания, устойчивости возбудителя инфекции к действию химиопрепаратов и указывают на снижение микровязкости мембраны, необходимое для реализации апоптоза.

Основными и важнейшими компонентами клеточных мембран являются фосфо-липиды. Липиды мембран формируют среду для функционирования мембранных белков, принимающих в ней нативную конформацию [Хышиктуев Б.С. и соавт., 1999]. В связи с этим в настоящей работе было проведено исследование фосфолипид-ного спектра плазматической мембраны моноцитов и лимфоцитов у больных ТЛ.

В ходе исследований были получены фактические данные, подтверждающие наличие выраженной дезорганизации мембраны мононуклеарных клеток крови у больных ЛЧ ТЛ и ЛУ ТЛ. В частности, у больных ТЛ до начала терапевтических мероприятий показаны изменения абсолютного и процентного соотношения отдельных фракций фосфолипидов на фоне нормального их суммарного содержания. Так, у больных ТЛ было обнаружено снижение количества сфингомиелина (СФМ), фосфа-тидилхолина (ФХ) и повышение содержания фосфатидилинозитола (ФИ), фосфати-дилэтаноламина (ФЭА) в плазматической мембране мононуклеаров крови относи-

тельно аналогичных показателей у здоровых доноров. Данные изменения были наиболее выраженными при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ.

Изменения фосфолипидного состава мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных ХОБЛ в целом были аналогичны таковым при ТЛ, что свидетельствует об общности механизмов структурной модификации цитоплазматической мембраны при воспалении легких. Между тем в период обострения ХОБЛ отмечались достоверное снижение как абсолютного, так и процентного содержания холестерина (ХС) и тенденция к снижению отношения ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов. В отличие от больных ХОБЛ, у всех пациентов с ТЛ в мембране клеток имели место достоверное повышение процентного содержания ХС и снижение концентрации жирных кислот (ЖК) в сравнении со здоровыми добровольцами. Все формы ЛУ ТЛ и фиброзно-кавернозный ЛЧ ТЛ сопровождались дополнительным снижением содержания эфиров ХС (ЭХС) в плазматической мембране мононуклеаров крови. Абсолютное содержание ХС и ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов возрастало при всех вариантах ЛУ ТЛ, однако при ЛЧ ТЛ было в пределах нормы.

ФЭА играет важную роль в регуляции активности Са2+- и Mg2+-AT®a3bi [Рязанцева Н.В. и соавт., 2004]. Увеличение его содержания в мембране, возможно, является компенсаторной реакций, направленной на удаление кальция и магния из цитозоля. Между тем увеличение концентрации ФЭА, содержащего легкоокисляемые полиненасыщенные ЖК, может обусловливать активацию перекисного окисления мембранных липидов и повреждение клеток [Рязанцева Н.В. и соавт., 2004]. Таким образом, увеличение концентрации ФЭА в цитоплазматической мембране может стимулировать апоптоз, что подтверждается выявленной положительной корреляцией между содержанием ФЭА в мембране монононуклеаров и количеством annexin V-положительных лимфоцитов (г=0,914; р=0,001) у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ. Кроме этого, значение ФЭА в индукции апоптоза моноцитов у больных ин-фильтративным ЛУ ТЛ подтверждают результаты ковариационного анализа (см. табл. 3).

Одним из продуктов ферментативного синтеза СФМ является церамид, который рассматривается как критический компонент апоптоза [Рыжов C.B., Новиков В.В., 2002; Bieberich Е., 2008; Billich A., Baumruker Т., 2008]. Показано, что фактор некроза опухолей (ФНО) а, Fas-лиганд вызывают накопление церамида в клетках [Hannun Y.A., 2000; Jaffrhzou J.P. et al., 2002, 2004]. Под действием церамида происходят де-фосфорилирование молекулы антиапоптотического белка bcl-2, а также активация протеинкиназы, которая фосфорилирует проапоптотические белки [Мобейко А.А. и соавт., 2005]. Снижение содержания СФМ в мембране мононуклеарных лейкоцитов при ТЛ, вероятно, сопряжено с накоплением проапоптотического церамида, что кос-

венно подтверждается отрицательной корреляцией между содержанием annexin V-положительных моноцитов и уровнем СФМ в мононуклеарах крови у больных с дис-семинированным ЛУ ТЛ (г=-0,900; р=0,037), а также (по результатам ковариационного анализа) зависимостью апоптоза лимфоцитов от содержания СФМ в мембране мо-нонуклеаров у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ и диссеминированным ЛУ ТЛ (см. табл. 2).

ФИ используется для синтеза соответствующих производных, выступающих в роли звена пролиферации, вторичного мессенджера в кальций-зависимой внутриклеточной сигнализации [Кузьмичева Л.В. и соавт., 2005]. Влияние веществ, воздействующих на обмен фосфоинозитидов, с весьма большой долей вероятности приводит к накоплению Са2+ в цитозоле [Александров А.А., 2005] и программируемой клеточной гибели. По данным ковариационного анализа, накопление ФИ в мембране мононук-леаров оказывало существенное индуцирующее влияние на апоптоз лимфоцитов (при диссеминированном ЛУ ТЛ) и моноцитов (при инфильтративном и фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ) (см. табл. 2,3).

Таким образом, у больных ТЛ до терапевтических мероприятий (как и у пациентов с обострением ХОБЛ) отмечается перераспределение фосфолипидного состава мембраны лимфоцитов и моноцитов крови в сторону увеличения содержания фракций, богатых ненасыщенными ЖК. При этом известно, что увеличение содержания ХС в мембранах стабилизирует липидный бислой [Владимиров Ю.А., 1989; Ройт А.,2000; Catfield J., 2000; Graziani A. et al., 2006]. Следовательно, выявленное увеличение содержания ХС в мембране больных ТЛ должно обусловливать увеличение ее «жесткости», что не согласуется с полученными результатами, показывающими снижение микровязкости липидного бислоя при ТЛ. Известно, что ХС образует кластеры в комплексе с гликопротеинами, специфически активируя поглощение МБТ макрофагами, и в мембране, лишенной большей части холестериновой фракции, фагоцитоз является несостоятельным. При этом свободный ХС оказывает опосредованное влияние на фа-госомальную сборку покрывающего триптофан-аспарагин-содержащего белка (TACO), который предотвращает деградацию МБТ в фаголизосомах [Catfield Jh., 2000]. Очевидно, что входящие в макрофаги через обогащенные ХС мембранные домены клеток хозяина МБТ способны обеспечить себе последующую выживаемость в насыщенных ХС и покрытых TACO фагосомах. Высокий процент ХС в мембране фагосо-мы при этом является не только дополнительным защитным «панцирем» для находящихся внутри МБТ, но и, возможно, причиной, препятствующей слиянию фагосомы с лизосомой. Следовательно, достаточно высокий уровень свободного ХС в мембране моноцитов/макрофагов - основное условие для «благополучного» их инфицирования МБТ. Снижение содержания свободных ЖК и ЭХС в мембране мононуклеарных

клеток при TJI, вероятнее всего, является результатом увеличения процента холестериновой фракции. Это может быть связано с повышенной потребностью в синтезе эй-козаноидов, увеличение образования которых показано при туберкулезном процессе [Каминская Г.О., 1996].

Таким образом, все формы TJI до начала лечения характеризуются выраженными изменениями структуры и снижением микровязкости липидного компонента мембраны иммунокомпетентных клеток. Специфическим признаком туберкулезного процесса является повышенное содержание ХС в мембране клеток, наиболее выраженное при ЛУ ТЛ.

Одним из мощных факторов, повреждающих клеточные мембраны, является образование свободных радикалов в процессе перекисного окисления липидов (ПОЛ). Усиление ПОЛ приводит к деструкции липидного бислоя, нарушению функциональной активности мембраносвязанных ферментов, изменению проницаемости мембраны и функционального состояния рецепторного аппарата клетки [Завалишин И.А., 1999; Волчегорский И.А., 2004; Вострикова Е.А. и соавт., 2006; Голод Е.А, Кирпатов-ский В.И., 2006] и запуску апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006]. Особенно чувствительны к радикалам мембраны митохондрий и ядер. Через поврежденные мембраны митохондрий выходят AIF (апоптоз-индуцирующий фактор) и цитохром с, которые активируют каспазный каскад. Через поврежденную ядерную оболочку кас-пазы легче проникают в ядро и активируют в нем эндонуклеазы [Жукова О.Б. и соавт., 2006; Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006]. Учитывая апоптозиндуцирующую роль реакций свободнорадикального окисления, нами была проведена оценка активности ПОЛ и ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ) в мононуклеарах крови у больных ТЛ и пациентов с обострением ХОБЛ.

До начала терапии у больных ЛЧ ТЛ были выявлены признаки активации ПОЛ, проявляющиеся увеличением концентрации ТБК-активных продуктов (ТБК-а) в лимфоцитах и моноцитах, а также диеновых коныогатов (ДК) в моноцитарных клетках на фоне повышенной активности супероксиддисмутазы (СОД) и нормальной каталазной активности мононуклеарных лейкоцитов. Вместе с тем при ЛУ формах ТЛ изменений в изучаемых показателях, за исключением повышенной активности ферментов АОЗ в лимфоцитах при диссеминированном ЛУ ТЛ, не выявлялось.

ДК и ТБК-а являются продуктами ПОЛ, и их накопление доказывает увеличение активности ПОЛ. Активация ПОЛ при ЛЧ ТЛ сопровождает развитие реакций доим-мунного воспаления в ответ на вторжение инфектогена и уничтожение возбудителя в пределах системы «макрофаг - цитотоксический Т-лимфоцит». Следовательно, инфицирование лекарственно-чувствительными штаммами МБТ «не уходит» от надзора иммунной системы, чего нельзя отнести к устойчивым к химиопрепаратам штаммам

микобактерий. Отсутствие каких-либо изменений в уровне исследуемых продуктов ПОЛ при ЛУ ТЛ, по-видимому, еще одно доказательство способности лекарственно-устойчивых МБТ, обладающих эффективными механизмами ингибирования активных форм кислорода (АФК), «ускользать» от иммунного надзора [Маянский А.Н., 2001; Краснов В.А. и соавт., 2005].

СОД - фермент, превращающий в реакции дисмутации супероксидный анион-радикал в перекись водорода, далее разрушающуюся каталазой. Увеличение активности СОД у больных ЛЧ вариантами ТЛ и ХОБЛ, предположительно, является адаптивно-компенсаторной реакцией, направленной на удаление избытка супероксид-аниона, обладающего способностью вызывать радикальное окисление липидов не только возбудителя, но и собственных липидных комплексов и липидов клеточных мембран в частности [Краснов В.А. и соавт., 2005; Каминская и соавт., 2006].

Общеизвестно, что активация ПОЛ приводит к накоплению АФК, которые повреждают клетки и обусловливают их гибель. Высокореакционные АФК образуются во всех аэробных клетках, и нарушение баланса «АФК/антиоксиданты» служит причиной запуска в клетках летальной программы [Зенков Н.К., Ланкин Е.Б., 2001]. Это подтверждается положительной корреляцией между количеством аппехт V-положительных лимфоцитов и содержанием в лимфоцитах ТБК-а (г=0,948; р=0,049) у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ. Кроме этого, по данным ковариационного анализа повышенное содержание ТБК-а оказывало стимулирующее влияние на апоптотическую гибель лимфоцитов и моноцитов при инфильтративной форме ЛЧ ТЛ, а также моноцитарных клеток при диссеминированном ЛЧ ТЛ (см. табл. 2, 3).

Таким образом, в лимфоцитах и (особенно) моноцитах крови при ЛЧ ТЛ до начала противотуберкулезной химиотерапии активируется ПОЛ и усиливается активность СОД. При ЛУ ТЛ в лимфоцитах и моноцитах активность ПОЛ (как в связи с биологическими свойствами ЛУ МБТ, так и за счет компенсаторной активации ферментов АОЗ) сохраняется на уровне нормальных значений.

Исходя из полученных данных, при ЛЧ ТЛ высокий уровень ПОЛ в лимфоцитах может расцениваться как один из факторов индукции апоптоза данного типа клеток. Кроме этого, при диссеминированном варианте туберкулезной инфекции имел место минимальный уровень аппехш-положительных лимфоцитов в сочетании с более низким (ниже, чем при других формах ТЛ) содержанием в них ДК и значительно более высокой концентрацией СОД, что также подчеркивает важную роль продуктов ПОЛ и АОЗ в модуляции апоптоза.

Поддержание стабильного уровня внутриклеточных микроэлементов является важнейшим фактором клеточного гомеостаза. Учитывая специфическое влияние различных микроэлементов на регуляцию апоптоза, дисбаланс последних может

служить пусковым механизмом дизрегуляции апоптоза. Исходя из этого, нами было проведено изучение макро- и микроэлементного состава мононуклеарных лейкоцитов и плазмы крови у больных TJI.

В результате исследования у больных TJI (инфильтративным, диссеминирован-ным, фиброзно-кавернозным и КП) до лечения было зарегистрировано достоверное повышение содержания Na+, К+ и Са2+ в лимфоцитах периферической крови в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров и больных ХОБЛ. Кроме этого, у пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ регистрировалось увеличение концентрации магния и микроэлементов в лимфоцитах, а при аналогичной форме ЛУ ТЛ - увеличение уровня Ve2*, Cu2+, Zn2+ и Mg2+ в сравнении с аналогичными показателями в контроле. У больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ увеличивалась концентрация Zn2+, а с ЛУ ТЛ - уровень Fe2+, Cu2+ и Zn2+ относительно такового в обеих группах сравнения. В лимфоцитах у больных с фиброзно-кавернозной формой ТЛ концентрация Fe2+, Cu2+ и Zn2+ (независимо от лекарственной чувствительности М. tuberculosis) и Mg2+ (только при ЛЧ ТЛ) оказалась выше, чем у здоровых людей и больных ХОБЛ. У пациентов с КП снижался уровень Си2+ в лимфоцитах в сравнении со здоровыми донорами. Содержание остальных микроэлементов не отличалось от нормальных значений.

У всех обследованных больных ТЛ было также обнаружено увеличение концентрации Na+ и К+ в моноцитах относительно аналогичных параметров у больных ХОБЛ (исключение составила группа больных инфильтративным ЛУ ТЛ). Повышение уровня Са2+ в моноцитах было зарегистрировано практически при всех формах ТЛ (кроме больных с инфильтративной формой ЛЧ и ЛУ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями в группах сравнения. Помимо этого, изучение содержания элементного спектра моноцитов периферической крови позволило установить, что у больных с диссеминированным ЛЧ и ЛУ ТЛ регистрировалось повышение уровня всех изучаемых микроэлементов относительно такового у здоровых доноров и больных ХОБЛ. При инфильтративном варианте ТЛ также отмечалось увеличение концентрации Fe2+, Mg2+, А13+ (независимо от чувствительности возбудителя инфекции к химиопрепаратам) и Zn2+ (только при ЛУ ТЛ), Си2+, Мп2+ (только при ЛЧ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями у больных ХОБЛ. В то же время у пациентов с фиброзно-кавернозным ТЛ уровень Mg2+, А13+ (и при ЛЧ, и при ЛУ вариантах) и Си2+, Mn2+, Zn2+ (только при ЛУ ТЛ) оказался выше, чем у здоровых доноров и больных ХОБЛ. Кроме этого, у больных КП увеличивался уровень Mg2+ относительно такового у здоровых людей и больных ХОБЛ.

Установленные изменения макро- и микроэлементного состава мононуклеарных лейкоцитов крови при ТЛ, по всей видимости, могут служить, с одной стороны, про-

явлением активации апоптоза, с другой - включением защитных механизмов, препятствующих чрезмерной активации клеточной гибели.

Известно, что течение TJI сопровождается активацией процессов фагоцитоза, сво-боднорадикального окисления (СРО), что в условиях недостаточности антиоксидант-ных механизмов ведет к повреждению внутриклеточных структур токсичными радикалами и запуску программированной гибели клеток [Vanham G. et al„ 1997; Сахно JI.B. и соавт., 2004]. Вероятно, увеличение концентрации Са2+ и Mg2+ в клетках крови при ТЛ можно рассматривать в качестве одного из факторов патогенеза этого заболевания. Показано, в частности, что причиной запуска апоптоза, наряду с возрастанием в клетке экспрессии генов - индукторов апоптоза (или угнетением генов, ингиби-рующих апоптоз), является повышенное поступление внутрь клетки ионов кальция и магния. Кроме этого, большинство биологически активных веществ, активизирующих в клетке вторичные мессенджеры, приводит к увеличению в цитозоле клетки концентрации Са2+. Увеличение концентрации Са2+ и Mg2+ в цитоплазме ведет к активации Ca27Mg2+-3aBHCH\roii эндонуклеазы, Са2+-зависимой трансглутаминазы, а также опосредует повышение активности клеточных протеиназ [McConkey DJ.et al., 1989; Evan G. et al., 1994]. Таким образом, Ca2+ и Mg2+ играют важную роль в активации апоптоза.

При анализе концентрации Са2+ и Mg2* в лимфоцитах в связи с активностью апоптоза клеток данного типа обращал на себя внимание следующий факт: при диссеми-нированном ЛЧ ТЛ и КП внутриклеточный уровень кальция сохранялся нормальным; при этом уровень аппехш-положительных клеток был минимальным.

Натрий играет весьма важную роль в регуляции водного обмена. Выведение натрия из клеток осуществляется №+/К+-АТФазой, которая является мишенью АФК [Huang W.H. et al., 1992; Boldyrev A., Kurella E., 1996; Petrushanko I. et al., 2003]. Повышение уровня АФК приводит к обратимому ингибированию фермента [Булыгина и соавт., 2002]. Вызывая полимеризацию белков, окисление сульфгидрильных групп ферментов, эти продукты приводят в первую очередь к поражению мембран клеток и нарушению их проницаемости, а следовательно к накоплению Са2+ и Na+ в клетке [Суханова Г.А., Серебров В.Ю., 2000]. Данным фактом можно объяснить повышение концентрации Na+ в лимфоцитах крови при ТЛ. Так как активация ПОЛ была установлена только при ЛЧ ТЛ, это объясняет большую концентрацию ионов натрия в лимфоцитах при ЛЧ (нежели ЛУ) формах ТЛ. Интересно, что повышение уровня натрия в лимфоцитах при диссеминированном и фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ, а также инфильтративном ЛУ ТЛ по данным ковариационного анализа оказывало индуцирующее влияние на апоптоз лимфоцитов (см. табл. 2).

Калий - основной внутриклеточный катион, важнейшая биологическая роль которого заключается в создании трансмембранного потенциала. Известно, что церамид, являющийся медиатором реализации липидного пути апоптоза, приводит к накоплению ионов калия в клетке путем инактивации К+-каналов [Gulbins Е. et al., 2000]. Оказывается, что «отключение» К+-каналов, приводящее к деполяризации мембраны, служит обязательным условием реализации апоптоза [Рыжов C.B., Новиков В.В., 2002], в то время как нормальный потенциал мембраны или ее гиперполяризация обеспечивают пролиферативную активность клетки.

Железо - важный эссенциальный микроэлемент, катализирующий реакции, в которых генерируются свободные радикалы кислорода, нарушающие синтез ДНК, влияющие на активность ряда ферментов, вызывающих пероксидацию полиненасыщенных липидов клеточных мембран [Кудрин A.B., Скальный A.B., 2001; Поляк-Блажи M., 2002; Ермоленко В.М., Филатова H.H., 2004]. Потенциальная роль железа в повреждении клеток подтверждается наличием положительной корреляционной связи между концентрацией ионов железа в лимфоцитах и числом хроматидных обменов в лимфоцитарных клетках при инфильтративном ЛУ ТЛ (г=0,787; р=0,006), а также количеством хроматидных разрывов при инфильтративном ЛЧ ТЛ (г=0,974; р=0,004). Железо, потенцируя повреждение хромосом, опосредует апоптоз. На это указывает положительная корреляционная связь между внутриклеточной концентрацией железа и содержанием annexin V-положительных лимфоцитов в крови (r=0,808; р=0,042) у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ. Кроме этого, еще одним доказательством потенцирующей роли железа в отношении апоптоза могут являться результаты ковариационного анализа, которые указывают на существенный вклад повышенной внутриклеточной концентрации железа в индукцию апоптоза лимфоцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ (см. табл. 2).

Цинк и марганец - антиоксиданты, контролирующие активность окислительных процессов. Известно, что ионы цинка, являясь конкурентным антагонистом Ca2t и Mg2*, компонентом медь-цинковой СОД, способствуют торможению свободноради-кального оксиления и эндонуклеазной активности, стабилизируют спиральную структуру ДНК, блокируют транскрипционные факторы Fas, c-myc и стимулируют ген bcl-2, что способствует торможению эндонуклеаз и предупреждает апоптоз [Кудрин A.B., Скальный A.B., 2001]. По всей видимости, факт повышения концентрации Zn2+ и Мп2+ в мононуклеарах крови при ТЛ можно объяснить включением защитных механизмов, предотвращающих свободнорадикальное повреждение клеток и апоптоз им-муноцитов. В литературе приводятся также данные о способности Мп2+ стимулировать процессы клеточной репродукции, синтеза белков и ДНК, влиять на обмен фос-фолипидов клеточных мембран [Кудрин A.B., Скальный A.B., 2001]. Ковариацион-

ный анализ продемонстрировал, что на апоптоз лимфоцитов модулирующее (ингиби-рующее) влияние оказывают концентрация марганца у больных с диссеминирован-ным ЛЧ ТЛ и уровень цинка у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ, а на апоптоз моноцитов - содержание марганца при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (см. табл. 2,3).

Медь (равно как и 7л2+) входит в состав субъединиц цитозольной СОД, прерывающей свободнорадикальные процессы. Кроме этого, было установлено, что ионы меди, связываясь с ДНК, сами по себе приводят к ее одно- и двунитевым разрывам, что проявляется хромосомными аберрациями [Благой Ю.П., 1998]. Это подтверждается наличием положительной корреляционной связи между внутриклеточной концентрацией меди и числом хроматидных разрывов в лимфоцитарных клетках при ин-фильтративном (г=0,974; р=0,004), фиброзно-кавернозном (1=0,723; р=0,048) ЛЧ ТЛ и инфильтративном ЛУ ТЛ (г=0,827; р=0,042). В свою очередь, увеличение числа хромосомных аберраций под действием меди в лимфоцитарных клетках может служить пусковым фактором апоптотической гибели, на что указывает положительная корреляция между содержанием аппехш У-положительных лимфоцитов и концентрацией меди в лимфоцитарных клетках (г=0,846; р=0,041) у больных с диссеминированным ЛУ ТЛ. Аналогичные результаты были получены и при проведении ковариационного анализа, который показал индуцирующее влияние высокой внутриклеточной концентрации меди на апоптоз лимфоцитов при инфильтративном ЛЧ и ЛУ ТЛ (см. табл. 2).

Накопление ионов алюминия в клетках, по данным литературы, служит причиной выраженной интоксикации и нарушения процессов внутриклеточного обмена. Высокая способность алюминия образовывать токсические комплексные соединения обусловливает его роль в снижении активности внутриклеточных ферментов и их систем [Идз М., 1995]. Токсическая роль алюминия косвенно подтверждается положительной корреляцией между его концентрацией и количеством хроматидных разрывов в лимфоцитах (г=0,836; р=0,037) у больных КП, а также результатами ковариационного анализа, показавшего достоверную связь между апоптозом моноцитов и концентрацией алюминия в моноцитарных клетках у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (см. табл. 3).

Кроме этого, было проведено исследование элементного состава плазмы крови у больных ТЛ. Так, до начала терапевтических мероприятий у пациентов регистрировалось достоверное повышение концентрации натрия в плазме крови (за исключением группы больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров. Развитие гипокалиемии также устанавливалось у больных с инфильтративным и диссеминированным ЛУ ТЛ. Концентрация Са2+ в плазме крови у больных ТЛ до начала лечения была в пределах нормы. Кроме этого, во всех иссле-

дуемых группах больных ТЛ было выявлено снижение концентрации Ре2+ в плазме крови в сравнении с таковым у здоровых доноров. У больных с инфильтративным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ также снижался плазменный уровень меди и марганца, а у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и диссеминированным ЛУ ТЛ - только меди. У больных с диагнозом инфильтративного и диссеминированного ЛЧ ТЛ регистрировалось снижение уровня Си2+ в плазме только в сравнении с содержанием его у здоровых доноров. Вместе с тем у всех больных ТЛ фиксировалось снижение плазменной концентрации 7л2* и относительно таковой у здоровых людей.

Выявленное по итогам настоящего исследования снижение концентрации элементов в плазме, вероятно, связано с их перераспределением между вне- и внутриклеточной средой. На это указывает отрицательная корреляционная связь между концентрацией марганца (г=-0,840; р=0,036) у больных КП, а также уровнем кальция (г=-0,744; р=0,021) у больных диссеминированным ЛУ ТЛ в моноцитах и плазме. Интересные данные были получены при проведении ковариационного анализа. Так, на апоптоз лимфоцитов оказывали влияние низкая плазменная концентрация меди и магния при диссеминированном ЛУ ТЛ и пониженное содержание марганца в плазме при фиб-розно-кавернозном ЛУ ТЛ (см. табл. 2).

Химиотерапия является основным компонентом лечения больных ТЛ и заключается в применении лекарственных препаратов, подавляющих размножение МБТ (бак-териостатический эффект) или уничтожающих их в организме больного (бактерицидный эффект). Вместе с тем данные препараты обладают токсичностью. На фоне химиотерапии у больных ТЛ с побочными реакциями на противотуберкулезные препараты (ПТП) имеет место дисфункция внутриклеточных ферментных систем, опосредующая дистрофические изменения в клетках. Такие лимфоциты с выраженными нарушениями структуры и метаболизма, попадая с током крови в различные органы, но являясь малоактивными и нежизнеспособными, быстро и в большом количестве разрушаются, подвергаясь апоптозу [Мишин В.Ю. и соавт., 2004].

Проведенное нами изучение количественных показателей периферической крови у больных ТЛ после проведения курса интенсивной химиотерапии позволило установить, что у пациентов с инфильтративной ЛУ формой заболевания ОКЛ оказалось ниже, чем до начала лечения. В остальных группах достоверных изменений ОКЛ не регистрировалось. Кроме этого, у всех пациентов (кроме больных КП) отмечался абсолютный и относительный моноцитоз. При диссеминированном ЛЧ ТЛ повышалось абсолютное и относительное количество лимфоцитов в сравнении с таковым до начала лечения. В группах больных фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ ТЛ и при инфильт-ративном ЛУ ТЛ процентное содержание лимфоцитов оставалось на прежнем уровне.

После окончания специфической противотуберкулезной химиотерапии у пациентов всех групп наблюдения регистрировалась нормализация ОКЛ, абсолютного и относительного содержания мононуклеарных лейкоцитов. Исключением являлись больные с КП и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ, у которых, несмотря на восстановление ОКЛ, сохранялся моноцитоз.

Снижение ОКЛ у больных ТЛ после интенсивного курса лечения, очевидно, является результатом снижения бактериальной нагрузки на организм. Сохранение лимфо-цитопении при ТЛ, видимо, связано с угнетением лимфоцитопоэза под действием хи-миопрепаратов [Диденко Г.В. и соавт., 2003], а также с токсическим действием ПТП на циркулирующие лимфоциты и гибелью клеток [Ерохин В.В., 1998]. Сохраняющийся моноцитоз на фоне интенсивного этапа лечения ТЛ, возможно, являет собой следствие не только туберкулезной инфекции, но и высокого уровня распада бактериальных тел и цитолитического действия накапливающихся в организме токсинов (учитывая токсическое влияние ПТП на печень и другие органы) [Ерохин В.В., Зем-скова З.С., 2003].

Уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов крови (по количеству аппехш V-позитивных клеток) после проведения курса интенсивной противотуберкулезной химиотерапии у больных инфильтративным ЛЧ ТЛ (на 17 %), диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛЧ (на 43 и 14% соответственно) и ЛУ (на 33 и 18% соответственно) ТЛ достоверно увеличивался в сравнении с таковым до начала лечения. В остальных группах наблюдения достоверных изменений величины этого показателя по сравнению с периодом до химиотерапии выявлено не было.

При оценке апоптоза моноцитов после проведения интенсивного курса специфической противотуберкулезной терапии было показано, что уровень гибели данного типа клеток у пациентов с диагностированным диссеминированным ЛЧ и при ин-фильтративном ЛУ ТЛ достоверно не изменялся в сравнении с предыдущим этапом исследования, в то время как в других группах обследованных больных показатели апоптоза моноцитов оказались достоверно более высокими, чем до начала терапии.

После окончания полного курса противотуберкулезной химиотерапии у пациентов большинства исследуемых групп уровень апоптоза как лимфоцитов, так и моноцитов оказался достоверно ниже такового до начала лечения, но по-прежнему превышал нормальные значения, и только при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ отмечалось восстановление количества аппехш У-положительных моноцитов до нормы.

При оценке экспрессии С095-рецептора на поверхности лимфоцитов у больных ТЛ после окончания курса интенсивной терапии существенных изменений в сравнении с предыдущим этапом исследования выявлено не было. Только у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ было зарегистрировано снижение абсолютного количества

С095+-лимфоцитов относительно их содержания на предыдущем этапе исследования. Как уже отмечалось выше, при туберкулезной инфекции до начала терапии уровень С095-позитивных лимфоцитов (по данным ковариационного анализа) определялся в качестве фактора, сопряженного с активностью апоптоза лимфоцитарных клеток. После курса интенсивной терапии устанавливалась аналогичная связь между количеством С095+-лимфоцитов и числом клеток, вступивших в раннюю фазу апоптоза, у больных с инфильтративным и диссеминированным ЛЧ (р<0,00001), а также с фиброзно-кавернозным ЛУ (р=0,00008) ТЛ.

После проведения курса под держивающей терапии была зарегистрирована нормализация относительного и абсолютного содержания С095+-лимфоцитов в крови только у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ. У больных же с диссеминированным ЛУ ТЛ в динамике лечения отмечалось еще большее повышение относительного числа С095-позитивных лимфоцитов.

Существенных изменений индекса стимуляции ДНК-репарации в лимфоцитах у больных ТЛ после завершения интенсивного курса специфической химиотерапии в сравнении с предыдущим этапом исследования установлено не было. Исключение составили больные с фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с инфильтративным ЛУ ТЛ, у которых было зарегистрировано увеличение индекса стимуляции ДНК-репаративного синтеза в лимфоцитах сравнительно с этапом до начала лечения. Кроме того, у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ обнаруживалось резкое повышение индекса ДНК-репарации в моноцитах относительно первого этапа исследования, в то время как при всех формах ЛУ ТЛ было показано статистически значимое его снижение. В остальных группах обследованных пациентов на фоне проведения терапии активность ДНК-репарации в моноцитарных клетках не изменялась.

Как уже указывалось ранее, дефицит факторов ДНК-репарации играет важную роль в инициации апоптотической гибели клеток. На этапе лечения данная зависимость сохранялась, на что указывала отрицательная корреляция между числом аппехт У-положительных лимфоцитов и ИС ДНК-репарации в лимфоцитарных клетках (р=-0,885; р=0,018) у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ после курса интенсивной терапии. Это совпадало с результатами ковариационного анализа, согласно которым на этапе интенсивного лечения низкий (ниже нормы) ИС ДНК-репарации (р=0,00025) был одним из факторов, определяющих высокий уровень апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ, в то время как повышение активности ДНК-репаративного синтеза в моноцитах (р=0,00001), возможно, как и до лечения, компенсировало чрезмерную активацию апоптоза моноцитарных клеток при диссе-минированном ЛЧ ТЛ.

В фазу клинического выздоровления после окончания курса поддерживающей терапии была зарегистрирована нормализация ИС ДНК-репарации в лимфоцитах у всех больных TJI. В моноцитах крови у больных КП, диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ репаративный ИС восстанавливался до нормы. В то же время у пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ обнаруживалось снижение данного показателя в моноцитарных клетках по сравнению с контролем. В остальных группах ИС ДНК-репарации оставался повышенным.

Стремление индекса ДНК-репарации к нормализации в условиях химиотерапии связано, вероятно, со снижением бактериальной нагрузки и негативного влияния МБТ на иммунокомпетентные клетки. По данным ковариационного анализа, на этапе поддерживающего лечения повышение активности репарации ДНК определяло снижение уровня апоптоза лимфоцитов у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ (р=0,00094).

Несмотря на очевидную тенденцию к стабилизации уровня ДНК-восстановительных процессов, по данным анализа метафазных пластинок лимфоцитов крови, у больных ТЛ после проведения интенсивной терапии уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах все еще был высоким. Более того, на фоне терапии ПТП отмечалось достоверное увеличение общего количества клеток с хромосомными нарушениями во всех группах больных (кроме пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ и КП). Было зарегистрировано увеличение числа лимфоцитов с изменением числа хромосом у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и с инфильтративным ЛУ ТЛ; у больных остальных групп наблюдения увеличивалось количество клеток с изменением структуры хромосом в динамике терапии.

Как уже отмечалось выше, терапия ТЛ опасна в плане повреждающего воздействия химиопрепаратов. Доказано токсическое действие ПТП на хромосомный аппарат клеток и связанное с этим увеличение хромосомных аберраций в лимфоцитах [Ек-mekci A., Sayli А., 1995; Masjedi M.R. et al., 2000]. Вероятно, именно этим и обусловливались обнаруженные по итогам проведенного исследования повышение содержания лимфоидных клеток с хромосомными нарушениями в крови больных ТЛ и значительная активация апоптоза.

По данным литературы, одним из механизмов цитотоксического действия ПТП является резкое усиление ПОЛ в клетках в сочетании с подавлением АОЗ [Гельдберг И.С. и соавт., 2002; Мишин В.Ю. и соавт., 2004; Tudek В. et al., 2006], что опосредует не только активацию ДНК-репаративных реакций, но и их дизрегуляцию (за счет токсического действия АФК на соответствующие ферменты) и накопление хромосомных аберраций. Известно, что при наличии в клетке повреждений хромосом белок р53 запускает программу апоптоза [Sengupta S., Harris С.С., 2005; Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006], что подтверждается данными статистики. Так, была выявлена положи-

тельная корреляция между содержанием аппехш У-положитсльных лимфоцитов и количеством хромосомных обменов у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ (г=0,940; р=0,005) и КП (г=0,893; р=0,016). Кроме этого, обнаружена положительная корреляция между содержанием лимфоцитов, вступивших в апоптоз, и числом хроматидных разрывов при КП (г=0,867; р=0,025) и хромосомных разрывов при диссеминирован-ном ЛУ ТЛ (г=0,839; р=0,004). Аналогичные результаты были зарегистрированы и при проведении ковариационного анализа: при всех формах ТЛ на этапе завершения интенсивной фазы лечения (исключением являлись только больные с фиброзно-кавернозным ТЛ) независимо от чувствительности микобактерий к ПТП была показана достоверная значимость хромосомных аберраций в индукции апоптоза лимфоцитов (р<0,001).

После полного курса лечения только у больных КП, диссеминированным и фиб-розно-кавернозным ЛУ ТЛ уровень лимфоцитов с хромосомными аберрациями оставался неизменно высоким. При этом у остальных пациентов отмечалось достоверное снижение числа аномальных лимфоцитов, однако оно все еще превышало уровень контрольных значений.

Снижение количества клеток с хромосомными нарушениями при проведении поддерживающего курса химиотерапии, вероятно, определяется не только фактором аба-циллирования больных и устранением влияния на клетки токсических компонентов МБТ, но и использованием меньшего количества препаратов в схеме лечения. Несмотря на это, у больных все же обнаруживались клетки с хромосомными аберрациями, которые, вероятно, элиминировались из организма посредством механизма программируемой гибели, на что указывает положительная корреляция между количеством аппехт У-положительных лимфоцитов и числом хроматидных обменов (г=0,752; р=0,019) и хроматидных разрывов (г=0,606; р=0,043) у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ. Важную роль хромосомных аберраций в активации программы апоптоза на этапе поддерживающей терапии демонстрирует также ковариация характеризующих их показателей у пациентов с КП (р=0,02362), фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (р=0,00341), инфильтративным ЛУ ТЛ (р<0,00001).

Что касается структурных особенностей, в частности микровязкостных свойств мембраны мононуклеарных лейкоцитов, то на втором этапе обследования регистрировалось снижение коэффициентов эксимеризации пирена при диссеминированном ЛЧ (в моноцитах) и ЛУ (в лимфоцитах) ТЛ относительно изучаемых параметров на долечебном этапе. При остальных формах ТЛ существенных изменений показателей флуоресценции мембраны иммуноцитов относительно показателей до лечения выявлено не было. Снижение флуоресценции мембранного зонда пирен может быть следствием перераспределения мембранных липидов, накоплением продуктов ПОЛ или

снижением уровня антиоксидантов [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980]. Результаты ковариационного анализа показали, что повышение текучести цитоплазматиче-ской мембраны на фоне применения ПТП также оказывает влияние на апоптоз лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном JI4 ТЛ (р<0,00001) и программированную гибель моноцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ (р<0,00001).

В фазу клинического выздоровления после окончания полного курса химиотерапии отмечалась тенденция к нормализации показателей флуоресценции пирена в лимфоцитах и моноцитах у всех больных ТЛ. Нормализации «жесткости» мембраны клеток способствовало, видимо, опять-таки снижение токсического действия этиологического фактора и химиопрепаратов на клетки крови. Тем не менее, у больных с инфильтративным ЛУ ТЛ низкая микровязкость мембраны на этапе поддерживающей терапии, так же как и после интенсивного курса лечения, все еще оказывала влияние на активность апоптоза моноцитов, о чем свидетельствует значимая их ковариация (р=0,00007).

При изучении фосфолипидного спектра мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных инфильтративным и диссеминированным ЛУ ТЛ после курса интенсивной терапии было зафиксировано повышение содержания лизофосфолипидов (ЛФЛ) в сравнении с предыдущим этапом лечения. На конец второго этапа лечения у всех больных ТЛ уровень СФМ, ФИ, ФХ, ФС и ФЭА в мембране мононуклеаров не отличался от такового у пациентов в острую фазу болезни до начала терапии. Однако у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ регистрировалось снижение количества СФМ в мембране лимфоцитов и моноцитов в динамике терапии. Кроме этого, у пациентов с диагнозом инфильтративного и фиброзно-кавернозного ЛЧ ТЛ концентрация ФС в мембране клеток оказалась выше, чем на предыдущем этапе лечения. В то же время у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ, а также инфильтративным ЛУ ТЛ регистрировалось достоверное снижение процентного содержания ХС при одновременном увеличении концентрации ЭХС в мембране мононуклеаров в сравнении с первым этапом исследования.

Результаты корреляционного анализа показали достоверную положительную связь между уровнем ЛФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов и количеством annexin V-положительных моноцитов у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (г=0,785; р=0,036). Это можно объяснить тем, что ЛФЛ могут индуцировать повышение проницаемости клеточных мембран для Са2+ [Forehand J.R. et all., 1993], запуская тем самым клеточную гибель.

Известно, что появление ФС в большом количестве в мембране, а особенно на ее внешней стороне, является одним из маркеров апоптоза [Жукова О.Б. и соавт., 2006]. Кроме того, ФС индуцирует деконденсацию хроматина и интенсивную межнуклео-

сомную фрагментацию ДНК. Не исключено, что ФС активирует церамид-опосредованный апоптоз [Tait J.F., 2008; Mirnikjoo В. et al., 2009]. Очевидно, что повышение содержания ФС в мембране клеток у больных TJI на фоне интенсивной терапии также приводит к активации апоптотической гибели. При этом содержание ряда структурных компонентов мембраны, по данным ковариационного анализа, оказывало модулирующее влияние на уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов: 1) в лимфоцитах - снижение уровня ФХ у больных инфильтративным ЛУ ТЛ, повышение содержания ФЭА и уменьшение концентрации СФМ при диссеминированном ЛУ ТЛ (р<0,00001); 2) в моноцитах - снижение содержания СФМ при диссеминированном (р<0,00001) и фиброзно-кавернозном ЛУ (р=0,00002) ТЛ, повышение концентрации ЛФЛ при инфильтративном ЛУ варианте, снижение уровня ФХ при инфильт-ративном ЛУ ТЛ (р<0,00001) и увеличение содержания ФЭА при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,01635). Роль СФМ в апоптозе лимфоцитов также подтверждалась результатами корреляционного анализа, который показал наличие отрицательной связи между содержанием СФМ в мембране клеток и количеством annexin V-положительных лимфоцитов у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (г=-0,810; р=0,026).

После завершения полного курса противотуберкулезной химиотерапии у больных инфильтративным и фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ отмечалось повышение содержания общих фосфолипидов в мембране иммуноцитов относительно предыдущего этапа лечения. У остальных больных данный показатель оставался в пределах нормальных значений. У пациентов с ТЛ также отмечалась нормализация содержания мембранных ЛФЛ и СФМ. Концентрация ФИ, ФХ, ФС и ФЭА в мембране клеток больных ТЛ в динамике терапии имела тенденцию к нормализации в динамике терапии, но отличалась от контрольных значений. На момент окончания под держивающего курса противотуберкулезной химиотерапии в мембране моноцитов и лимфоцитов у больных ТЛ обнаруживались снижение содержания ХС и восстановление уровня ЖК, а также повышение концентрации ЭХС в сравнении с этапом до лечения.

Как уже отмечалось выше, в числе факторов, оказывающих влияние на апоптоз лимфоцитов и моноцитов при ТЛ до лечения, определялась концентрация ФС в мембране. Подобный эффект ФС сохранялся и после курса поддерживающей терапии, на что указывала положительная корреляция между содержанием ФС в мембране моно-нуклеаров и числом annexin V-положительных моноцитов в крови у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ (г=0,840; р=0,036) и диссеминированным ЛУ (г=0,882; р=0,008) ТЛ.

Ковариационный анализ позволил определить влияние повышенной концентрации мембранных ЛФЛ на активность апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00241), а ФЭА - при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р<0,00001). В моду-

ляции апоптоза моноцитов также имели значение повышенное количество ФИ - при инфильтративном (р=0,00057) и фиброзно-кавернозном (р=0,00003) ЛЧ ТЛ; пониженный уровень ФС - при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р=0,00005); повышенное содержание ЛФЛ - при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00004); низкая концентрация ФХ (р=0,00110) и СМФ (р=0,00062) - при инфильтративном ЛУ ТЛ; повышенный уровень ФЭА - при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р<0,00001).

Анализ данных по изучению активности ПОЛ после проведения интенсивной фазы противотуберкулезной терапии показал, что у всех пациентов с ЛУ ТЛ отмечалось повышение содержания ТБК-а продуктов в мононуклеарах. Одновременно снижалось содержание ДК в моноцитах у всех больных ЛЧ ТЛ, а при диссеминированном ЛЧ ТЛ - еще и ТБК-а в сравнении с нелеченными пациентами. В лимфоцитах у больных с ЛЧ ТЛ регистрировалось также снижение активности СОД и каталазы и, напротив, в случае ЛУ ТЛ - увеличение активности данных ферментов в сравнении с таковой на предыдущем этапе лечения. В группе пациентов с диссеминированным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ в условиях терапии было выявлено повышение активности СОД в моноцитах. При этом ковариационный анализ показал значимое влияние ТБК-активных продуктов на апоптоз моноцитов крови при диссеминированном ЛЧ ТЛ (р<0,00001).

На момент окончания полного курса поддерживающей терапии у всех обследованных больных ТЛ выявлялось восстановление содержания ТБК-а, ДК, активности каталазы и СОД в лимфоцитах и моноцитах до величины показателей у здоровых доноров. Снижение активности ПОЛ и нормализация активности ферментов АОЗ согласовывались с результатами оценки апоптоза. В ходе ковариационного анализа достоверных связей между этими показателями выявлено не было, что подтверждает отсутствие значимого вклада дестабилизации в системе ПОЛ/АОЗ (в силу восстановления их равновесия) в индукцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов.

При изучении элементного состава лимфоцитов крови у больных ТЛ после проведения интенсивной химиотерапии было обнаружено, что концентрация К+ и Са2+ в них оказалась достоверно выше, чем на первом этапе исследования. Только при КП регистрировалось снижение уровня Ыа+ и К+ в лимфоцитах периферической крови по сравнению с этапом до лечения. У пациентов с диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ уровень К+ в моноцитах в динамике терапии также снижался. В группах больных ТЛ (кроме пациентов с инфильтративным ЛЧ и ЛУ ТЛ) содержание Са2+ в моноцитах после окончания интенсивной терапии оказалось ниже, чем до начала лечения.

В лимфоцитах после завершения интенсивного курса лечения обращало на себя внимание увеличение концентрации Ре2+, Си2+ и Мп2+ при всех формах ЛУ ТЛ по

сравнению с аналогичными показателями на предыдущем этапе исследования. Кроме этого, в условиях терапии в лимфоцитах у пациентов с инфильтративной формой ЛУ ТЛ возрастало содержание 2л?* и А13+, с диссеминированной - и А13+, а с фиб-розно-кавернозной - 2.п2* и У больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ внутриклеточный уровень Ре2+, Мп2+, 7л2*, Mg2+ и А13+ оказался также выше, чем до начала терапевтических мероприятий. Обращал на себя внимание факт снижения концентрации Си2+ и А13+ у больных КП после курса интенсивной терапии в лимфоцитах.

В моноцитах у большинства больных ТЛ после интенсивного курса лечения регистрировалось снижение концентрации изучаемых элементов в сравнении с уровнем их на предыдущем этапе исследования.

Как уже отмечалось выше, нарушение электролитного состава играет важную роль в модуляции программы апоптоза мононуклеаров крови при ТЛ, что подтверждалось и на втором этапе исследования. На это указывает положительная корреляция между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и содержанием натрия в лимфоцитарных клетках у больных с диссеминированным ЛУ ТЛ (г=0,827; р=0,005). Кроме этого, была выявлена положительная корреляционная связь между количеством аппехш V-положительных лимфоцитарных клеток и содержанием меди в лимфоцитах у пациентов с инфильтративным ЛУ ТЛ (г=0,811; р=0,049), по всей видимости (как было показано до лечения), ввиду того, что ионы меди опосредуют образование хромосомных аберрации и запуск апоптоза. Данный факт подтверждается результатами ковариационного анализа, который показал статистически достоверную связь (р<0,00001) между активностью апоптоза лимфоцитов и содержанием меди в клетках при инфильтра-тивном ЛУ ТЛ. Дополнительным доказательством этого может служить положительная корреляционная связь между уровнем аппехш У-положительных лимфоцитов и внутриклеточным содержанием меди у больных КП (г=0,811; р=0,049) и инфильтративным ЛУ ТЛ (г=0,922; р=0,019).

В результате корреляционного анализа была выявлена также положительная связь между активностью апоптоза лимфоцитов и содержанием ионов магния в них у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ (г=0,710; р=0,048), а также между уровнем аппехш У-положительных моноцитов и концентрацией кальция в моноцитарных клетках у больных КП (г=0,729; р=0,047). Активирующее влияние магния на апоптотиче-скую гибель лимфоцитов и моноцитов было зарегистрировано и при проведении ковариационного анализа при инфильтративном ЛЧ ТЛ (р<0,00001).

Ионы железа, как уже указывалось ранее, активируют ПОЛ, усиливая тем самым апоптотическую гибель лимфоцитов, что согласовывалось с результатами ковариационного анализа, показавшего достоверное значение повышенной концентрации железа в индукции апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном лекарственно-

резистентном ТЛ (р=0,00620). Кроме этого, в ходе анализа ковариаций было обнаружено, что на уровень апоптоза лимфоцитов статистически достоверно влияет увеличение внутриклеточной концентрации следующих катионов: кальция и марганца -при инфильтративном ЛЧ ТЛ (р<0,00001); алюминия - при инфильтративном ЛУ ТЛ (р<0,00001); натрия и марганца - при диссеминированном ЛУ варианте болезни (р<0,00001).

Наряду с этим окончание интенсивного курса противотуберкулезной химиотерапии характеризовалось разноплановыми изменениями уровня электролитного состава плазмы крови у больных ТЛ в сравнении с аналогичными значениями до начала лечения. По результатам ковариационного анализа оказалось, что в индукции апоптоза лимфоцитов имеют значение снижение плазменной концентрации цинка при инфильтративном ЛЧ ТЛ (р<0,00001) и магния - при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р=0,00005); повышение уровня кальция - при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00003) и натрия - при диссеминированном ЛУ варианте (р<0,00001). На активацию апоптотической гибели моноцитов статистически значимое влияние оказывало понижение в плазме содержания цинка (при КП, р=0,04734) и меди (при инфильтративном ЛУ ТЛ, р<0,00001).

После полного курса лечения у больных КП, инфильтративным ЛЧ и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ отмечалась нормализация концентрации К+, Са2+ и в лимфоцитах. Восстановление до нормальных значений содержания Са2+ в лимфоцитах было зарегистрировано у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и диссеминиро-ванным ЛУ ТЛ. При этом у пациентов остальных групп наблюдения, несмотря на достоверное снижение, уровень исследованных элементов в лимфоцитах все еще превышал нормальные значения, а в моноцитах - стремился к нормализации. При проведении корреляционного анализа у больных КП была выявлена положительная связь между уровнем аппехт У-положительных клеток и концентрацией кальция в лимфоцитах (г=0,883; р=0,046), вероятно, за счет тех же его эффектов (но менее выраженных), что и на этапе до лечения.

Несмотря на то, что катионный состав мононуклеаров и плазмы крови после полного курса специфической противотуберкулезной химиотерапии в целом проявлял тенденцию к восстановлению, он (в свете сохраняющихся отклонений) все еще оказывал свое влияние на апоптотическую гибель клеток. При диссеминированном ЛЧ ТЛ, по данным ковариационного анализа, на состояние программируемой гибели лимфоцитов статистически достоверно влияла повышенная концентрации меди (р=0,00008), магния (р=0,00002) и натрия (р=0,00016) в лимфоцитах, а на апоптоз моноцитов - низкий плазменный уровень цинка (р=0,00603). В индукции апоптоза лимфоцитов у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ было задействовано пониженное

содержание меди в плазме (р=0,00017). Стимулирующее действие на апоптотическую гибель лимфоцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ оказывала низкая концентрация цинка (р<0,00001), а моноцитов - калия (р=0,00098) и цинка (р=0,02008) в плазме. У пациентов с диссеминированным ЛУ ТЛ уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проявлял зависимость по отношению к пониженному количеству цинка в плазме (р=0,00675).

Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что при ТЛ вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя и клинической формы заболевания отмечается активация апоптоза лимфоцитов и моноцитов как до, так и в условиях проведения противотуберкулезной химиотерапии. При этом по результатам исследования можно сделать вывод о том что, что инициация апоптоза происходит через Раз-рецептор, а также по митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Об участии митохондирального пути в реализации апоптоза свидетельствует накопление кальция в клетках. Наряду с этим начальный период инфицирования МБТ сопровождается увеличением количества лимфоцитов с хромосомными аберрациями на фоне подавления ДНК-синтеза в лимфоцитах и его активации в моноцитах, нарушением катионного состава мононуклеаров и плазмы крови, изменениями фосфолипидного состава и повышением текучести мембраны, активацией ПОЛ (при ЛЧ ТЛ) (рис. 1, 2). Интенсивная химиотерапия ТЛ значительно усиливает выявленные нарушения, в большей степени выраженные при ЛУ, чем при ЛЧ ТЛ, что, по всей вероятности, связано с разной продолжительностью интенсивной фазы лечения, количеством и суммарной дозой применяемых в комбинированной полихимиотерапии ПТП.

В целом, к факторам, оказывающим влияние на апоптоз мононуклеарных лейкоцитов при туберкулезной инфекции, относятся накопление хромосомных аберраций, нарушение ДНК-репаративного синтеза, микровязкости и структуры липидного бислоя мембраны клеток. При этом микро- и макроэлементы могут быть разделены на 2 группы: стимулирующие (Са2+, Ре2+ и А13+) и подавляющие (Мп2+ и 2л2+)

апоптоз. Сц2+, по-видимому, может выступать в роли как индуктора (посредством стимуляции образования хромосомных аберраций), так и ингибитора (в связи с тем, что является структурным компонентом антиокислительного фермента - СОД) тана-тогенной программы клеток.

Рис. 1. Факторы модуляции апоптоза лимфоцитов крови при туберкулезе легких по результатам собственных исследований (в красных рамках). Примечание. Здесь и на рис. 2: ФХ - фосфатидилхолин; ФС - фосфатидилсерин; ФИ - фосфатидилинозитол; ФЭА - фосфатидилэтаноламин; СФМ -сфингомиелин; ЛФЛ - лизофосфолипиды; ХС - холестерин; пунктирная стрелка - ингибирующее влияние, сплошная стрелка - активирующее влияние.

Рис. 2. Факторы модуляции апогггоза моноцитов крови при туберкулезе легких по результатам собственных исследований (в красных рамках)

ВЫВОДЫ

1. Течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и НгОгиндуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации.

2. Степень активации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких связана с клинической формой заболевания и лекарственной чувствительностью возбудителя. Уровень апоптоза клеток наиболее значителен при инфильтра-тивной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии активация запрограммированной гибели мононуклеарных лейкоцитов имеет наименее выраженный характер.

3. Спектр факторов индукции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови (нарушения катионного состава клеток и плазмы, цитогенетического статуса, структурная модификация мембраны) при инфильтративном туберкулезе легких шире, чем при фиброзно-кавернозной и диссеминированной формах болезни, и ограничивается хромосомными аберрациями при казеозной пневмонии.

4. Активация апоптоза мононуклеарных лейкоцитов периферической крови вне зависимости от морфо-функционального типа клеток у больных туберкулезом легких сопряжена с повышением содержания холестерина и фосфатидилинозитола в клеточной мембране, уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, увеличением внутриклеточной концентрации Са2+, А13+, а также (при снижении содержания в плазме) Си2+ и (как фактор адаптации клетки) Хп2*, Мп2+.

5. Избирательное индуцирующее действие на апоптоз лимфоцитов при туберкулезе легких оказывают высокий уровень экспрессии СИ95 (характеризующий Раз-зависимую гибель клеток), угнетение ДНК-репарации, повышенное число хромосомных и хроматидных разрывов (коррелирующее с высокой внутриклеточной концентрацией Ре2+, А13+, Си2+) и снижение содержания сфингомиелина и фосфа-тидилсерина в мембране клеток, а на апоптоз моноцитов - повышенное содержание в плазме и фосфатидилэтаноламина в мембране клеток. При этом уровень программированной гибели моноцитов на фоне адаптивной активации эксцизион-ной репарации ДНК ниже, чем уровень апоптоза лимфоцитов.

6. Активация перекисного окисления липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких, в то время как при множественной лекарственной устойчивости воз-

будителя интенсивность липопероксидации сохраняется в переделах нормы и не оказывает существенного влияния (равно как активность антиокислительных ферментов) на уровень апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

7. Наряду с активацией перекисного окисления липидов у больных с лекарственно-чувствительным туберкулезом легких в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют высокий уровень экспрессии Рая-рецептора и цитогенетиче-ские аномалии, а в числе факторов апоптоза моноцитов - снижение микровязкости мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы. В то же время при лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз как лимфоцитов, так и моноцитов индуцируют, в основном, нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава клеток и плазмы крови.

8. К патогенетическим факторам, отличающим течение туберкулеза от хронической обструктивной болезни легких, относятся модулирующие активность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови изменения структуры (обмены, разрывы) хромосом, активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

9. После интенсивного курса специфической противотуберкулезной терапии прогрессирующее повышение активности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов вне зависимости от специализации клеток у больных туберкулезом легких сопряжено со снижением содержания фосфатидилхолина в мембране, возрастанием ее текучести и активности перекисного окисления липидов (при истощении ферментативного звена антиокислительной защиты).

10. Среди факторов, определяющих дифференцированное повышение активности программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов отдельных морфо-функциональных типов, у больных туберкулезом легких на этапе завершения интенсивной антимикобактериальной терапии приобретают значение более выраженное, чем до лечения, увеличение количества хромосомных аберраций и концентрации Ре2+, А13+, Си2+, (в клетках), Са2+, (в клетках и плазме) (как фактор апоптоза лимфоцитов), а также возрастание доли лизофракций фосфоли-пидов в мембране (как фактор апоптоза моноцитов).

11. После окончания курса поддерживающей противотуберкулезной терапии уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проявляет тенденцию к нормализации за счет снижения количества аберрантных форм и С095-позитивных лимфоцитов, активности перекисного окисления липидов, восстановления уровня эксцизионной ДНК-репарации, структурных свойств мембраны, макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цитогенетический статус лимфоцитов периферической крови при туберкулезе

легких // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения». - Томск, 2004. -С. 76 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

2. Структурные особенности мембран лимфоцитов периферической крови больных

туберкулезом легких II Сборник материалов III Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем». - М., 2004. - С.54 (соавторы В.В. Новицкий, О.И. Уразова, О.В. Ворон-кова и др.).

3. Цитохимическая и функциональная характеристика моноцитов крови у больных

туберкулезом легких // Материалы III Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)». - М., 2004. - С. 55 (соавторы О.В. Филинюк, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др.).

4. Структурно-функциональные особенности моноцитов периферической крови у

больных туберкулезом легких // Сборник материалов международной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере». - Сургут, 2004. - С. 12 (соавторы О.В. Воронкова, О.И. Уразова, И.Е. Есимова).

5. Структурные особенности мембран мононуклеарных лейкоцитов крови при ин-

фильтративном туберкулезе легких // Сборник материалов IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2005. - С. 43-44 (соавторы И.Е. Есимова, О.В. Воронкова, Е.А. Рябова и др.).

6. Оценка микровязкостных свойств мембран мононуклеарных лейкоцитов крови у

больных туберкулезом легких // Материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск: СибГМУ, 2005. - С. 74 (соавторы И.Е. Есимова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова и др.).

7. Особенности функционального статуса лимфоцитов крови у больных туберкуле-

зом легких // Сборник материалов I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Сочи, 2005. - С. 55 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И Уразова и др.).

8. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при туберкулезе легких // Сборник

материалов I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Сочи, 2005. - С. 118 (соавторы О.И. Уразова, И.Е. Есимова, О.В. Филинюк и др.).

9. Особенности окислительного дисбаланса в мононуклеарах крови больных тубер-

кулезом легких // Материалы Международный конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 3-8 октября 2005 г.) // Аллергология и иммунология в педиатрии. - 2005. - Т. 6, №5. - Прил. 1. - С. 203 (соавторы И.Е. Есимова, О.И. Уразова).

Ю.Цитогенетический статус лимфоцитов периферической крови при туберкулезе легких до лечения и на фоне химиотерапии // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2005. - №5. - С. 43-46 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

11. Функциональные и цитохимические особенности фагоцитов у больных туберкуле-

зом легких // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - №1. - С. 24-27 (соавторы О.В. Филинюк, H.A. Земляная, А.К. Стрелис и др.).

12. Активность ПОЛ и апоптоза при туберкулезе легких II Бюллетень эксперимен-

тальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 140, №11. - С. 497-499 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, С.Б. Ткаченко и др.).

13. Особенности поверхностного фенотипа лимфоцитов крови у больных туберкуле-

зом легких // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, №5-6. - С. 587-592 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

14. Особенности хромосомной дезорганизации лимфоцитов крови при туберкулезе

легких // Материалы XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2005 г.). - СПб.,

2005. - С. 66-68 (соавторы Е.А. Рябова, И.Е. Есимова, О.И. Уразова, и др.).

15. Макро- и микроэлементы мононуклеаров крови у больных туберкулезом легких //

Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М„ 2006. - С. 337 (соавторы Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

16. Структурные особенности мембран мононуклеарных лейкоцитов крови при дис-

семинированном туберкулезе легких // Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2006. - С. 130 (соавторы И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др.).

17. Функциональная активность фагоцитирующих клеток крови при туберкулезе лег-

ких // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - №1. - С. 79-81 (соавторы О.В. Филинюк, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др.).

18. Особенности функциональной активности лимфоцитов крови у больных туберку-

лезом легких // Иммунология. - 2006. - Т. 27, №2. - С. 76-79 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

19. Активность системы ДНК-репарации мононуклеаров крови при туберкулезе лег-

ких // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. -

2006. - № 1. - С. 53-55 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

20. Патология иммунитета: причина или следствие туберкулезной инфекции? // Бюл-

летень сибирской медицины. - 2006. - №2. - С. 70-74 (соавторы В.В. Новицкий, О.И. Уразова, А.К. Стрелис и др.).

21.Мононуклеарные клетки периферической крови у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких // Вестник РАМН. - 2006. - №2. - С. 25-30 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.В. Во-ронкова и др.).

22. Макро- и микроэлементы мононуклеаров крови у больных туберкулезом легких //

Микроэлементы в медицине. - 2006. - Т. 7, №2. - С. 33-38 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

23.Структурные особенности мембран и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мононуклеарах крови при диссеминированном туберкулезе легких // Фундаментальные исследования. - 2006. - №2. - С. 75-76 (соавторы И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др.).

24.Апоптоз, микро- и макроэлементный состав лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких // Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова: «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении». - Томск, 2007. - С. 90-91 (соавторы В.В. Новицкий, О.И. Уразова, А.К. Стрелис и др.).

25. Макро- и микроэлементы мононуклеаров крови у больных лекарственно-

чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких // Бюллетень сибирской медицины,- 2007. - Т. 6, №2. - С. 31-36 (соавторы В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.И. Уразова и др.).

26. The molecular-genetic bases of management of human adaptable blood system reactivity

during infection // Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilítatíon, Hannover, 2008. - P. 65-66 (соавторы V.V. No-vitsky, O.I. Urazova, O.V. Voronkova et al.).

27. К вопросу о патологии иммунитета при туберкулезе легких // Патологическая фи-

зиология и экспериментальная терапия. - 2008. - №1. - С. 15-18 (соавторы В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, О.И. Уразова и др.).

28. Апоптоз, микро- и макроэлементный состав лимфоцитов крови у больных тубер-

кулезом легких // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №8. - С. 2426 (соавторы О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др.).

29. Апоптоз лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких // Труды Всероссий-

ской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». — Новосибирск, 2009. - С. 392396 (соавторы В.В. Новицкий, О.И. Уразова, О.В. Воронкова).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита АФК - активные формы кислорода ДК - диеновые конъюгаты ЖК - жирные кислоты ИС - индекс стимуляции КП - казеозная пневмония

ЛУ ТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких ЛФЛ - лизофосфолипиды

ЛЧ ТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких

МБТ - микобактерии туберкулеза

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПТП - противотуберкулезные препараты

СОД - супероксиддисмутаза

СФМ - сфингомиелин

ТБК-а - ТБК-активные продукты

ТЛ - туберкулез легких

ФИ - фосфатидилинозитол

ФИО - фактор некроза опухолей

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

ХС - холестерин

ХС/ФЛ - холестерин-фосфолипидное отношение ЭХС - эфиры холестерина

Тираж 130. Заказ № 778. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. Туберкулез остается серьезной и актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [Краснов В.А., 2008; Jeong Y.J., Lee K.S., 2008]. Изучение эпидемиологической ситуации за последние годы показало, что прогноз относительно ликвидации туберкулеза не оправдался. Данные Европейского регионального бюро ВОЗ свидетельствуют о том, что распространение туберкулеза приобрело угрожающие масштабы. Так, например, в России заболеваемость туберкулезом в 2007 г. достигала 83,2 случаев на 100 тыс. населения, а в Томской области в 2007 г. - 102,5, в 2008 г. - 101,4. Серьезную эпидемиологическую проблему представляют группы риска - лица с асоциальным поведением, иммигранты, наркоманы, дезадаптированные подростки, среди которых имеют широкое распространение лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, включая полирезистентные варианты инфекции. Прогрессирующее увеличение числа случаев заражения антибиотико-рефракгерными штаммами микобактерий, устойчивых к двум, трем и более туберкулостатическим препаратам, является отрицательной тенденцией последних лет. Об этом свидетельствует рост частоты развития остропрогрессирующих форм лекарственно-резистентного туберкулеза с тяжелым клиническим течением и значительной распространенностью патологического процесса [Каминская Г. О. и соавт., 2006; Исакова Ж.Т. и соавт., 2007; Маркелов Ю.М., Дородная И.А., 2007; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Согласно современным представлениям, наиболее тяжелое течение туберкулеза отмечается при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа [Масленников A.A. и соавт., 2007]. Ведущая роль в обеспечении противотуберкулезной защиты организма, как известно, принадлежит тканевым и циркулирующим фагоцитам - альвеолярным макрофагам, моноцитам и полиморфно-ядерным нейтрофилам, а также индукторам иммунного воспаления -лимфоцитам: Между тем наиболее характерными признаками дизрегуляцшг иммунных процессов при туберкулезе, по данным ряда авторов, являются, прежде всего, нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов [Комогорова С.Э. и соавт., 2005; Пичугин A.B., 2005; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Установлено, что патогенез иммунной гипо- и анергии при инфекционном процессе во многом определен индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата иммунокомпетентных клеток и систем, обеспечивающих генетический гомсостаз макроорганизма. Основную функцию гомеостатической регуляции в организме выполняют система ДНК-репарации, обеспечивающая внутриклеточное восстановление генетических структур, и апоптоз, обусловливающий поддержание баланса между делением и гибелью клеток и элиминацию аберрантных клеточных форм и инфицированных клеток. В то же время цитогенетические повреждения и дисфункция ДНК-репаративной системы могут служить своего рода индукторами апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006; Camenisch U., Naegeli Н., 2009].

Выяснение путей запуска и молекулярных механизмов дизрегуляции запрограммированной гибели отдельных клеток в многоклеточном организме является одной из нерешенных задач медико-биологических наук. Актуальность этой проблемы определяется тем, что срыв (угнетение или, наоборот, усиление) апоптозной программы в организме обусловливает развитие и прогрессирование ряда заболеваний, в том числе инфекционных. Так, например, установлено, что дефект Fas-индуцированного апоптоза моноцитов/макрофагов и стимуляция экспрессии на макрофагальных клетках антиапоптозного гена bcl-2 при туберкулезе являются ключевыми факторами латентной микобактериальной инфекции [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa Т., 2007, 2008]. Вместе с тем многие вопросы относительно дизрегуляторных нарушений естественной гибели клеток и участия апоптоза в патогенезе иммунной дестабилизации при туберкулезном процессе остаются открытыми. До сих пор нет патогенетического обоснования роли перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и ионного дисбаланса в реализации апоптозных потенций иммуноцитов и формировании бактериальной иммунорезистентности при туберкулезе.

В свете изложенного представляется важным изучение молекулярно-биологических механизмов, определяющих развитие и характер течения туберкулезного процесса. Это, несомненно, расширит имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой для создания более совершенных методов диагностики и прогнозирования туберкулеза, выявления групп риска по развитию тяжелых прогрессирующих форм заболевания, а также для разработки более эффективных методов профилактики и коррекции иммунопатологических изменений, сопровождающих туберкулез и противотуберкулезные мероприятия.

Цель исследования: выявить общие закономерности и факторы модуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном туберкулезе легких до и в условиях противотуберкулезной химиотерапии.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных 18-55 лет с распространенным деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией).

2. Оценить роль нарушений макро- и микроэлементного состава, цитогенетического статуса, структурных свойств мембраны, перекисного окисления липидов в индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких.

3. Провести сравнительную оценку апоптоз-модулирующих факторов мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных легочным туберкулезом (лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией) й у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.

4. Установить патогенетические факторы индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови при отдельных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких до и в процессе противотуберкулезной полихимиотерапии.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный, фиброзно-кавернозный, казеозная пневмония) распространенного деструктивного туберкулеза легких в связи с чувствительностью возбудителя к терапии до начала лечения и на фоне проведения противотуберкулезной химиотерапии. Установлено, что течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Нг02-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации. При этом активность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов наиболее значительна при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии имеет наименее выраженный характер. Охарактеризована роль нарушений цитогенетического статуса, структурной организации мембраны и макро- и микроэлементного состава (Са2+, Бе2+, М^2+, А13+, Си2+, 7л\2+, Мп2+) клеток и плазмы в модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких до и на фоне противотуберкулезной терапии. Установлены дифференциальные факторы индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Наиболее значимыми из них при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких оказались увеличение числа предуготовленных к апоптозу СБ95+-клеток, хромосомные аберрации на фоне подавления ДНК-репарации (как фактор апоптоза лимфоцитов), повышение текучести мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы (как фактор апоптоза моноцитов); при лекарственно-резистентном туберкулезе легких - нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава внутриклеточной среды и плазмы. По результатам исследования сделано предположение о том, что апоптоз мононуклеарных лейкоцитов крови может быть реализован по Раз-опосредованному, а также (в связи с накоплением в клетках кальция) митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Показано, что спектр факторов активации апоптоза при туберкулезе легких существенно отличается от такового при хронической обструктивной болезни легких; при этом перекисное окисление липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких и не вызывает апоптогенного эффекта при множественной лекарственной резистентности. Установлено, что на фоне специфической противотуберкулезной терапии спектр апоптоз-стимулирующих факторов варьирует, выраженность составляющих его изменений равно как и непосредственно уровень активации апоптоза) возрастает после интенсивного курса лечения, в то время как после завершения фазы поддерживающей терапии уровень гибели клеток проявляет тенденцию к нормализации.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания о роли апоптоза в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, факторах активации программированной гибели лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных туберкулезом легких. Результаты исследования могут служить основой новых методологических подходов к иммунокоррекции, направленной на повышение жизнеспособности и регуляцию численности клеток крови, формирующих реакции доиммунного воспаления (хмоноциты) и адаптивного противотуберкулезного иммунитета (лимфоциты), а также быть использованы в качестве информативных критериев для оценки прогнозирования течения и исхода заболевания. Это позволит проводить своевременную профилактику осложнений легочного туберкулеза, в том числе вызванных иммунотоксическим действием применяемых в терапии туберкулеза фармакологических средств.

Положения, выносимые на защиту:

1. Течение туберкулеза легких сопровождается активацией апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. Степень выраженности и спектр факторов индукции программированной гибели клеток зависят от клинической формы заболевания. При этом они наиболее значительны при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-резистентного туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии являются минимальными.

2. К общим факторам индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких относятся повышенное содержание холестерина и фасфатидилинозитола в клеточной мембране в сочетании с уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, а также увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, А13+ и (при снижении содержания в плазме) Си2+. При этом степень активности апоптоза моноцитарных клеток в связи со стимуляцией эксцизионной ДНК-репарации ниже, чем уровень программированной гибели лимфоцитов.

3. При лекарственно-чувствительном туберкулезе, наряду с активацией перекисного окисления липидов, в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют гиперэкспрессия СБ95/Раз на фоне повышения количества хромосомных аберраций и подавления ДНК-репарации в клетках, а в числе факторов апоптоза моноцитов - повышение текучести мембраны и изменения внутриклеточной и плазменной концентрации макро- (Ка+, М§2+) и

3+ 2+ микроэлементов (Аг , Си ). При лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз лимфоцитов и моноцитов индуцируют нарушения липидного спектра мембраны (увеличение концентрации холестерина и легкоокисляемых фракций липидов) и катионного (Бе , Иа , М§ , Си ) состава клеток и плазмы крови.

4. К факторам модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, отличающим специфическую (туберкулез) и неспецифическую (хроническая обструктивная болезнь) патологии легких, относятся сопровождающие течение туберкулезного воспаления хромосомные аберрации (обмены, разрывы), изменения активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

5. В условиях интенсивной противотуберкулезной терапии усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов обусловлено более выраженными (чем до лечения) перестройками их клеточной мембраны, повышением активности перекисного окисления липидов, а также (в направлении гибели лимфоцитов) числа хромосомных аберраций и концентрации макро- и микроэлементов (Ре , Аг , Си2+, в клетках и Са2+, в клетках и плазме). При этом после курса поддерживающей химиотерапии восстановление активности процессов липопероксидации и ДНК-репарации, структуры и катионного состава клеток и плазмы определяет. тенденцию к нормализации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Томской области, 75-летию кафедры фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем»

Москва, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут,

2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург,

2005), IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), XIII Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Второй международной Германо-Российской конференции Форума им. Коха и Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilitation (Ганновер, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2003-2009).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление») и фтизиатрии (раздел «Иммунитет и аллергия при туберкулезе») на лечебном и педиатрическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Исследования проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (ГК №02.445.11.7419 «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы»; ГК №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма») и Совета по грантам при Президенте РФ (НШ-1051.2003.04 «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток крови при патологии»; НШ-4153.2006.7 «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы»).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 29 работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 96 таблицами. Библиографический указатель включает 382 источника, из них 225 отечественных и 157 зарубежных авторов.

274 ВЫВОДЫ

1. Течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Н202-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации.

2. Степень активации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких связана с клинической формой заболевания и лекарственной чувствительностью возбудителя. Уровень апоптоза клеток наиболее значителен при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии активация запрограммированной гибели мононуклеарных лейкоцитов имеет наименее выраженный характер.

3. Спектр факторов индукции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови (нарушения катионного состава клеток и плазмы, цитогенетического статуса, структурная модификация мембраны) при инфильтративном туберкулезе легких шире, чем при фиброзно-кавернозной и диссеминированной формах болезни, и ограничивается хромосомными аберрациями при казеозной пневмонии.

4. Активация апоптоза мононуклеарных лейкоцитов периферической крови вне зависимости от морфо-функционального типа клеток у больных туберкулезом легких сопряжена с повышением содержания холестерина и фосфатидилинозитола в клеточной мембране, уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, увеличением внутриклеточной концентрации Са2+, А13+, а у 1 I также (при снижении содержания в плазме) , Си и (как фактор адаптации о » о I клетки) Ътх , Ми .

5. Избирательное индуцирующее действие на апоптоз лимфоцитов при туберкулезе легких оказывают высокий уровень экспрессии СБ95 (характеризующий Баз-зависимую гибель клеток), угнетение ДНК-репарации, повышенное число хромосомных и хроматидных разрывов (коррелирующее с высокой внутриклеточной концентрацией Ре2+, А13+, Си2+) и снижение содержания сфингомиелина и фосфатидилсерина в мембране клеток, а на апоптоз моноцитов - повышенное содержание Ыа+ в плазме и фосфатидилэтаноламина в мембране клеток. При этом уровень программированной гибели моноцитов на фоне адаптивной активации эксцизионной репарации ДНК ниже, чем уровень апоптоза лимфоцитов.

6. Активация перекисного окисления липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких, в то время как при множественной лекарственной устойчивости возбудителя интенсивность липопероксидации сохраняется в переделах нормы и не оказывает существенного влияния (равно как активность антиокислительных ферментов) на уровень апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

7. Наряду с активацией перекисного окисления липидов у больных с лекарственно-чувствительным туберкулезом легких в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют высокий уровень экспрессии Раз-рецептора и цитогенетические аномалии, а в числе факторов апоптоза моноцитов -снижение микровязкости мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы. В то же время при лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз как лимфоцитов, так и моноцитов индуцируют, в основном, нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава клеток и плазмы крови.

8. К патогенетическим факторам, отличающим течение туберкулеза от хронической обструктивной болезни легких, относятся модулирующие активность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови изменения структуры (обмены, разрывы) хромосом, активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

9. После интенсивного курса специфической противотуберкулезной терапии прогрессирующее повышение активности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов вне зависимости от специализации клеток у больных туберкулезом легких сопряжено со снижением содержания фосфатидилхолина в мембране, возрастанием ее текучести и активности перекисного окисления липидов (при истощении ферментативного звена антиокислительной защиты).

10. Среди факторов, определяющих дифференцированное повышение активности программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов отдельных морфо-функциональных типов, у больных туберкулезом легких на этапе завершения интенсивной антимикобактериальной терапии приобретают значение более выраженное, чем до лечения, увеличение количества хромосомных аберраций и концентрации Ре2+, А13+, Си2+, (в клетках), Са2+, (в клетках и плазме) (как фактор апоптоза лимфоцитов), а также возрастание доли лизофракций фосфолипидов в мембране (как фактор апоптоза моноцитов).

11. После окончания курса поддерживающей противотуберкулезной терапии уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проявляет тенденцию к нормализации за счет снижения количества аберрантных форм и СБ95-позитивных лимфоцитов, активности перекисного окисления липидов, восстановления уровня эксцизионной ДНК-репарации, структурных свойств мембраны, макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы.

277

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, апоптоз является общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций, а также формообразование и выбраковку дефектных клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, напротив, ингибированием апоптоза. Приведенные в обзоре данные литературы свидетельствуют о том, что неадекватный ответ иммунной системы организма на внедрение М. tuberculosis с формированием выраженного иммунодефицита является одной из основных причин отрицательного патоморфоза туберкулеза легких. При этом факторами, приводящими к запуску апоптоза клеток, являются, прежде всего, нарушения цитогенетического статуса, макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы, структуры клеточной мембраны. Установление же особенностей и механизмов активации апоптотической гибели клеток крови при действии микобактерий, а также в условиях противотуберкулезной терапии, несомненно, расширит существующие представления о патогенезе туберкулеза и механизмах иммунодепрессивного действия возбудителя инфекции и антимикобактериальных препаратов, послужит основой для разработки более эффективных методов диагностики и прогнозирования туберкулезной инфекции, даст возможность определенным образом воздействовать на отдельные этапы апоптоза иммунокомпетентных клеток с целью его регуляции или коррекции. В настоящее время общепринято: если клетка погибает от апоптоза - подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза - нет. В связи с этим выявление общих закономерностей и факторов модуляции апоптоза иммуноцитов при туберкулезной инфекции представляется весьма актуальным и своевременным.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объект и материал исследования

2.1.1. Общая характеристика больных туберкулезом легких

В настоящей работе было обследовано 298 больных распространенным деструктивным туберкулезом легких. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной противотуберкулезной больнице (гл. врач -ЯноваГ.В.) во фтизиотерапевтических отделениях № 1 (зав. отд. -Новосельцева О.И.), № 2 (зав. отд. — Малиновская Т.З.), № 3 (зав. отд. - Янов А.А.). На завершающем этапе лечения больные наблюдались на базе Областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - Перемитин Г.Г.).

Среди обследованных лиц в основном преобладали мужчины в возрасте 1855 лет. Доля пациентов мужского пола была 89,95%, женского пола - 10,05%.

Пациенты поступали в Томскую областную клиническую туберкулезную больницу из учреждений поликлинической сети (МЛПМУ) г. Томска и Томской области. У 82,22% всех обследованных заболевание выявлялось при непосредственном обращении в МЛПМУ. У 17,78% заболевание было выявлено случайно при флюорографическом обследовании органов грудной клетки во время профилактических осмотров. Возрастно-половая характеристика обследуемых групп представлена в табл. 1.

Клинический осмотр пациентов, сбор анамнеза, физикальные методы обследования больных, постановку диагноза и назначение соответствующих схем лечения осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулезной клинической больницы (чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., к.м.н. ЯноваГ.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев А.С., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов А.А., Щегерцов Д.А.).

Диагноз туберкулеза легких устанавливали на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса.

Mycobacterium tuberculosis выявляли методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохромов (аурамина). Для видовой идентификации М. tuberculosis и определения их чувствительности к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Все исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы и Томского областного противотуберкулезного диспансера.