Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетические аспекты дисфункции мононуклеарных фагоцитов при ремиттирующем типе рассеянного склероза

На правах рукописи

ШМУРЫГИНА Елена Анатольевна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДИСФУНКЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ РЕМИТТИРУЮЩЕМ ТИПЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

17 МАЯ 2012

Тюмень - 2012

005044282

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Баркова Эмилия Никифоровна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Долгих Владимир Терентьевич

ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор Суплотов Сергей Николаевич

ГБОУ ВГ10 «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Екатеринбург

Защита состоится «28» мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.01 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (г. Тюмень, ул. Одесская, 61).

Автореферат разослан «27» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Фролова О.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы рассеянного склероза (PC), остается приоритетной для неврологии и медицины в связи с продолжающимся ростом заболеваемости и дорогостоящими методами лечения (Малкова H.A., Иерусалимский А.П., 2006; Гусев Е.И. и соавт., 2008; Hassan-Smith G., Douglas M.R., 2011). В мире насчитывается более 2,5 млн. больных PC, в том числе в России около 200 тысяч (Гусев Е.И. и соавт., 2004).

Рассеянный склероз - аутоиммунное заболевание, обусловленное развитием демиелинизирующих очагов воспаления в центральной нервной системе (ЦНС). Аутоиммунная природа данной патологии имеет как экспериментальные, так и клинические подтверждения (Столяров И.Д., 2003; Zhang J., 2004; Stüve О. et al., 2008). В 90% случаев начало заболевания протекает в ремиттирующей форме, при которой периоды обострения чередуются с периодами полной или частичной ремиссии. Частые рецидивы приводят к нарастанию неврологического дефицита и инвалидизации пациентов (Гусев Е.И. и соавт, 2004; Завалишин И.А. и соавт., 2006).

Широкая распространенность PC и высокая степень инвалидизации среди лиц молодого трудоспособного возраста обусловливают необходимость совершенствования методов прогнозирования его течения и повышение эффективности лечения. Несмотря на внедрение в клиническую практику иммуномодулирующих препаратов, изменяющих течение PC, заболевание продолжает прогрессировать (Шмидт Т.Е., 2004; Байдина Т.В., Фотеева A.B., 2007; Goodin D.S. et al., 2002; Boneschi M.F. et al., 2003). Установлено, что через 10-15 лет от начала заболевания около 50% больных PC имеют трудности в самостоятельном передвижении и в выполнении профессиональных обязанностей, а через 20 лет - у 60% больных PC развивается инвалидность (Chapel Н. et al., 2008).

Учитывая, что даже в фазу полной клинической ремиссии иммунопатологические процессы и демиелинизация в ЦНС продолжаются, а иммунологические изменения опережают клинические (Гусев Е.И., Бойко А.Н., 2004; Демина Т.Л. и соавт., 2008), становится актуальным изучение характера изменений у больных PC в фазу ремиссии с целью выявления маркеров активности заболевания и предикторов обострения.

Участие макрофагов в иммунопатологических реакциях при PC и >

з

в фагоцитозе миелина, как заключительном этапе демиелинизации, обусловливает их ведущую роль в процессах прогрессирования заболевания (Столяров И. Д. и соавт., 2003; Hendriks J J. et al., 2005; Barnett M.H. et al., 2006; Cristophi G.P. et al., 2009). Выполнение однонаправленных функций резидентными макрофагами ЦНС и моноцитами периферической крови в патогенезе PC (Raivich G., Banati R., 2004; Van der Goes A. et al., 2005), позволяет исследовать функциональную активность гематогенных макрофагов -моноцитов.

Отсутствие данных об особенностях метаболизма и функции моноцитов при PC аргументирует необходимость изучения функциональной активности моноцитов у больных PC. Рациональность хронобиологического подхода обусловлена высокой чувствительностью циркадианных ритмов к изменениям в организме (Комаров Ф.И., Раппопорт С.И., 2000; Takahashi J.S. et al., 2008; Keller M. et al., 2009), что открывает перспективы для разработки критериев донозологической диагностики патологических состояний. Цель работы:

Определить особенности функциональной активности моноцитов периферической крови у больных ремиттирующей формой рассеянного склероза в стадии ремиссии на основе ритмометрического анализа и разработать критерии для прогнозирования обострений рассеянного склероза.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности циркадианной организации поглотительной и переваривающей способности моноцитов периферической крови у больных ремиттирующей формой PC без обострений и с наличием 1-2 обострений в течение года в стадии ремиссии.

2. Установить наличие и степень зависимости между фагоцитарной активностью моноцитов, концентрацией в сыворотке крови свободного железа (Fe ), МДА, МСМ, про- и противовоспалительных цитокинов и особенностями клинического течения ремиттирующей формы PC.

3. Провести анализ корреляций и оценить диагностическую значимость составляющих лабораторного статуса при разной степени активности ремиттирующей формы PC.

4. Разработать критерии для прогнозирования обострений ремиттирующей формы PC и оценить их информативность.

Научная новизна

Впервые у больных ремиттирующей формой PC (РРС) проведено исследование циркадианной организации функциональной активности моноцитов. Показано, что для стадии ремиссии РРС без обострений характерен десинхроноз с нивелированием ритмов стимулированных показателей фагоцитарной функции моноцитов. При РРС с наличием 1-2 обострений в течение года нивелирование ритмов характерно как для базальной, так и для стимулированной фагоцитарной способности моноцитов.

Впервые установлено, что при РРС, независимо от активности заболевания, напряжение фагоцитарной способности моноцитов сопровождается снижением их резервного потенциала. У больных РРС с обострениями повышение поглотительной и переваривающей способности моноцитов сопровождается ростом концентрации в сыворотке крови двухвалентного железа (Fe +), МДА, МСМ, а также ИЛ-1 и ИЛ-2.

Десинхроноз поглотительной и переваривающей способности моноцитов при РРС с наличием 1-2 обострений способствует дезорганизации составляющих сидеремии и, как следствие, активизации процессов липопероксидации и эндотоксикоза.

Установлена прямая взаимосвязь между функциональной активностью моноцитов, показателями шкалы инвалидизации EDSS и индексом прогрессирования заболевания.

Впервые обоснована прогностическая значимость показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста моноцитов в качестве предикторов обострения ремиттирующей формы PC.

Научно-практическая значимость

На основе ритмометрического анализа определены особенности фагоцитарной активности моноцитов и сопряженные с ними биохимические изменения в сыворотке крови у пациентов со стабильным и с активным течением РРС, которые могут быть использованы в качестве маркеров прогнозирования обострений РРС.

Аргументирована информативная значимость способа прогнозирования обострений РРС, основанная на оценке базального и стимулированного НСТ-теста моноцитов периферической крови. Получено решецие о выдаче патента на изобретение «Способ прогнозирования течения ремиттирующего рассеянного склероза» (заявка на изобретение №2011132906/15(048515), приоритетная справка от 04.08.2011).

Положения, выносимые на защиту

1. Для стадии ремиссии ремиттирующей формы PC характерен десинхроноз фагоцитарной функции моноцитов. У пациентов с РРС без обострений в течение года обнаружено нивелирование циркадианных ритмов показателей резервной мощности. У больных РРС с наличием 1-2 обострений циркадианные ритмы нивелированы как для базальных, так и для стимулированных показателей. При ремиттирующей форме PC, независимо от активности заболевания, напряжение фагоцитарной способности моноцитов сопровождается снижением их резервного потенциала.

2. У пациентов с ремиттирующей формой PC фагоцитарная активность моноцитов и процессы липопероксидации и эндотоксикоза взаимосвязаны. Десинхроноз функции макрофагов приводит к нарушению баланса составляющих сидеремии и активации мембрано - дестабилизирующих процессов, приводящих к разрушению миелиновой оболочки нейроцитов и накоплению неврологического дефицита. Констатация патологических изменений в фазу ремиссии подтверждает непрерывность аутоиммунного процесса при ремиттирующей форме PC.

3. Взаимосвязь между клинико-анамнестическими данными (частотой обострений РРС, длительностью первой ремиссии и степенью прогрессирования заболевания), показателями фагоцитарной активности моноцитов, концентрацией Fe2+, МДА, МСМ, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4 аргументирует использование указанных параметров с целью определения активности ремиттирующей формы PC и прогноза его течения.

4. Ритмометрический анализ демонстрирует чувствительность показателей резервной мощности фагоцитарной активности моноцитов для оценки патологического процесса при ремитирующей форме PC. Логистический регрессионный анализ выявил достоверную информативную значимость спонтанного и стимулированного НСТ-теста моноцитов и концентрации ИЛ-4 для ранней диагностики грядущего обострения ремиттирующей формы PC.

Внедрение в практику

Полученные результаты исследования используются в учебном процессе кафедры патологической физиологии, кафедры нервных

болезней с курсом детской неврологии и нейрохирургии ГБОУ ВПО

б

«Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, а также внедрены в практику работы неврологического отделения ГБУЗ Тюменской области «Областная клиническая больница №2».

Апробация работы и публикации

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях и форумах «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2006, 2011, 2012), IV Сибирской межрегиональной научно-практической конференции (Новосибирск, 2009), XI международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. «Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых ВАК журналах.

Апробация диссертации состоялась 4 апреля 2012 г. на заседании проблемной комиссии в ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 15 таблиц и 20 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 68 отечественных и 153 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе представлены результаты клинических наблюдений и лабораторных методов обследования 93 взрослых людей в возрасте от 18 до 45 лет. Из них 30 здоровых мужчин, не имеющих в анамнезе хронических заболеваний и 63 пациента с РРС, достоверно подтвержденным согласно критериям Mc-Donald, 2005.

Критерии включения в исследование: достоверный диагноз PC, ремиттирующее течение PC, фаза ремиссии, отсутствие данных о наличии сопутствующих системных заболеваний и заболеваний с органическим поражением головного мозга. Критерии исключения: вторично - или первично - прогрессирующее течение PC, фаза обострения, лечение глюкокортикостероидами менее, чем за месяц до обследования.

Рис. 1. Дизайн исследования

Пациенты с РРС находятся под наблюдением в Тюменском областном центре рассеянного склероза МСЧ «Нефтяник».

После проведения ретроспективного анализа 120 историй болезни пациентов с РРС и изучения особенностей течения заболевания, были выделены 2 группы: 30 пациентов с РРС не имели обострения заболевания в течение предшествующего года, у 33 из них диагностированы 1-2 обострения в течение года.

Соотношение мужчин и женщин в группе с РРС 1:0,91 (52,4% мужчин и 47,6% женщин). Выраженность неврологического дефицита у больных РРС оценивалась по расширенной шкале

8

инвалидизации (Expanded Disability Status Scale - EDSS), предложенной J.F.Kurtzke (1983). Степень инвалидизации по шкале EDSS составляла от 1,0 до 3,5 баллов (среднее значение в группе без обострений - 1,60±0,14, с наличием обострений - 1,88±0,13). Индекс прогрессирования заболевания оценивался, как изменение степени тяжести в баллах по EDSS за год (среднее значение в группе без обострений 0,17±0,02, в группе с обострениями 0,25±0,03). Частые обострения у пациентов с РРС способствовали накоплению неврологического дефицита при меньшей продолжительности заболевания.

На момент обследования пациенты с РРС получали превентивную иммуномодулирующую терапию препаратами глатирамера ацетата (Копаксон) 20 мг ежедневно подкожно.

Замеры изучаемых показателей проводили 4 раза в сутки через 6-и часовые интервалы (в 06, 12, 18 и 24 ч).

Поглотительную способность оценивали с помощью фагоцитоза частиц латекса 0,9 мкм. Определяли процент поглощающих клеток -фагоцитарный индекс (ФИ) и количество поглощенных частиц на 1 активную клетку - фагоцитарное число (ФЧ). Переваривающую способность макрофагов оценивали с помощью HGT-теста по методике Б.С.Нагоева (1983) в усовершенствованном на кафедре патофизиологии ТюмГМА варианте (Баркова Э.Н., 1984). Для определения резервной мощности клеток добавляли пирогенал (25 мкг/мл). Рассчитывали коэффициент активации (КА) как отношение показателей стимулированных тестов к базовым значениям.

Определение концентрации сывороточного железа проводили батофенатролиновым методом с реактивами фирмы «Лахема» (Чехия). Концентрацию МДА в сыворотке крови оценивали по его реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой по методу И.Д. Стальной, Т.Г. Гаришвили (1977). Содержание МСМ2бо и MCM2go оценивали по методу М.Я.Малаховой (1987; 1995). Определение концентрации интерлейкинов (ИЛ) осуществляли методом ферментативно усиленной иммунохемоилюминесценции на анализаторе Immulite-1000 (производитель «DPC», США).

Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ: BIOSTAT for Windows, SPSS -16. Данные в тексте и в таблицах представлены как M ± m, где M - среднее арифметическое, m - средняя ошибка среднего арифметического. Функциональные связи между признаками проанализированы с помощью коэффициента корреляции. Для оценки достоверности

9

различий использовали непарный I - критерий Стьюдента (при параметрическом распределении данных) и критерий Манна -Уитни (при непараметрическом распределении данных). Различие принималось достоверным при р<0,05. Результаты биоритмологических исследований оценены с помощью математической обработки данных по программе «Косинор» с определением следующих параметров циркадианных ритмов: мезор, акрофаза, амплитуда.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ритмометрический анализ фагоцитарной функции моноцитов при РРС в стадии ремиссии

Поглотительная активность моноцитов при РРС достоверно (р<0,05) повышена. Среднесуточные значения ФИ у пациентов с РРС без обострений выше на 20,9%, ФЧ - на 35,8%, по сравнению с таковыми у здоровых мужчин (табл. 1, рис. 2). Отсутствие достоверных различий между обозначенными показателями у больных РРС в подгруппах мужчин и женщин послужило основанием объединить их в единую группу.

Таблица 1

Ритмометрические параметры поглотительной способности моноцитов у

здоровых мужчин и у пациентов с РРС, М±т

Показатели ФИ,% КА ФИ ФЧ,% КА ФЧ

Здоровые мужчины

Мезор 46,10±0,82 6,51±0,16 4,83±0,20 4,81±0,19

Амплитуда 13,83±0,23 1,86±0,12 2,12±0,16 2,73±0,18

(% от мезора) (30,0) (31,1) (41,5) (56,8)

Акрофаза 19.24 07.15 19.36 07.09

(18.10; 20.15) (05.25; 08.00) (18.04; 20.05) (05.58; 07.47)

Пациенты с РРС без обострений в течение гола

Мезор 55,75±1,09** 2,52±0,16** 6,83±0,27** 2,40±0,28**

Амплитуда 12,00±1,06 0,25±0,10 1,37±0,8б 0,25±0,17

(% от мезора) (21,5) (9,9) (20,0) (10,4)

Акрофаза 19.01 нет ритма 18.32 нет ритма

(17.23; 22.07) (17.01; 22.19)

Пациенты с РРС с наличием 1-2 обострений в течение года

Мезор 56,43±1,15** 0,97±0,12** 7,78±0,23** 0,99±0,28**

Амплитуда, 2,34±1,56 0,10±0,10 0,50±0,86 0,08±0,07

(% от мезора) (4,1) (10,2) (6,4) (8,1)

Акрофаза нет ритма нет ритма нет ритма нет ритма

Примечание:**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин (р<0,05).

** **

Шш

Яш;

S * Здоровые мужчины

11 щш ч РРС без обострешш

:fl ■ ■ РРС с обострениями

§

-1 11

11 ж*' я Ш »*

ШШ и И*,-, | 1 И»**

ФИ К А ФИ ФЧ К А ФЧ

Рис. 2. Среднесуточные значения ФИ, ФЧ, КА ФИ и КА ФЧ моноцитов (** - достоверные различия с показателями здоровых мужчин, р<0,05).

У пациентов РРС с обострениями в течение года процент активных клеток, по результатам спонтанных показателей ФИ и ФЧ, достоверно (р<0,05) превышает показатели в контрольной группе на 18,3% и 37,9%, соответственно (табл. 1, рис. 2).

Таблица 2

Ритмометрические параметры переваривающей способности моноцитов у

здоровых мужчин и у пациентов с РРС, М±ш

Время суток, НСТ-ПМ,% КА НСТ-ПМ ПА,% КА ПА

часы

Зпоповые мvжчины

Мезор 43,85±0,87 3,52±0,07 4,27±0,23 3,24±0,07

Амплитуда 9,27±0,63 0,65±0,04 1,53±0,19 0,59±0,04

(% от мезора) (20,7) (36,9) (46,7) (34,9)

Акрофаза 19.54 06.27 20.15 06.11

(18.10; 00.15) (5.32; 7.21) 17.32; 21.05 (05.12; 07.28)

Пациенты с РРС без обострений в течение года

Мезор 50,10± 1,12* * 1,54±0,10** 6,56±0,16** 1,26±0,09**

Амплитуда 10,42±0,74** 0,17±0,09 1,43±0,16 0,15±0,09**

(% от мезора) (20,8) (11,0) (40,1) (10,7)

Акрофаза 19.41 нет ритма 19.18 нет ритма

(18.22; 00.35) 18.52; 20.47

Пациенты с РРС с наличием обострений в течение года

Мезор 55,95±1,36** 1,28±0,06** 6,83±0,22** 1,06±0,09**

Амплитуда 1,17±0;56** 0,12±0,05** 0,32±0,25** 0,10±0,06**

(% от мезора) (2,5) (36,9) (4,8) (9,8)

Акрофаза нет ритма нет ритма нет ритма нет ритма

Примечание:**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин (р<0,05).

п

Переваривающая способность моноцитов у пациентов с РРС без обострений также активирована (р<0,05), о чем свидетельствует повышение спонтанного НСТ - теста (НСТ - позитивные моноциты (ПМ)) на 9,3% и ПА - на 37,4%, по сравнению с группой контроля. Значения НСТ-ПМ у больных РРС с обострениями повышены на 21,6%, ПА увеличена на 52,3%, по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе (р<0,05) (табл. 2, рис. 3).

При стимуляции пирогеналом поглотительная функция моноцитов при РРС снижена, что свидетельствует о недостаточности резервных возможностей клеток (р<0,05). Мезор КА ФИ и КА ФЧ ниже в 2,6 и 2,0 раза у больных без обострений, по сравнению с таковыми у здоровых мужчин, у больных с обострениями КА ФИ и КА ФЧ ниже в 6,7 и 4,7 раза, соответственно (табл. 1, рис. 2).

На дефицит резервного потенциала моноцитов при РРС указывают низкие цифры индуцированных показателей переваривающей активности (р<0,05). У пациентов РРС с обострениями мезоры КА НСТ-ПМ и КА ПА снижены в большей степени, чем у пациентов без обострений (табл. 2, рис. 3).

10 40 30

■ Здоровые мужчины % РРС без обострений РРС с обострениями

HCT-TTM КА НСТ-ПМ ПА КАПА

Рис. 3. Среднесуточные значения НСТ-ПМ, ПА, КА НСТ-ПМ и КА ПА моноцитов (** - достоверные различия с показателями здоровых мужчин, р<0,05).

Таким образом, при РРС в стадии ремиссии, вне зависимости от наличия обострений, обнаружено прогрессирующее снижение показателей резервной мощности моноцитов, наиболее выраженное при частых обострениях. К категории закономерных процессов при РРС относится усиление фагоцитарной активности моноцитов. Повышение среднесуточного уровня показателей поглотительной и переваривающей способности моноцитов сопровождается увеличением продолжительности активной фазы этих показателей: проявляясь расширением доверительных границ акрофаз.

Время суток, часы 24 Об | 121 18 | 24

ФИ, % моноцитов КА ФИ моноцитов ФЧ, % моноцитов КА ФЧ моноцитов НСТ-тест моноцитов КА НСТ-теста ПА моноцитов КА ПА моноцитов Сывороточное железо Ре3+ сыворотки Ре2+ сыворотки МДА сыворотки МСМ2бо сыворотки МСМ28о сыворотки <4-о—►

Рис. 4. Пространственно-временная организация фагоцитарной функции моноцитов, концентрации железа, МДА и МСМ у пациентов с РРС без обострений в стадии ремиссии.

Условные обозначения: <-> - доверительные границы

о - акрофаза; »-• - ритма нет

Для суточной динамики фагоцитарной способности моноцитов пациентов с РРС без обострений выявлены синхронизированные статистически значимые циркадианные ритмы с активной фазой в вечернее время, закономерные для здоровых людей. Акрофазы поглотительной и переваривающей способности моноцитов синхронизированы, акрофаза поглотительной активности предшествует акрофазе переваривающей способности (рис. 4).

У больных РРС с обострениями констатирован десинхроноз фагоцитарной функции. Циркадианный ритм для фагоцитарной функции моноцитов, закономерный для здоровых мужчин и выявленный у больных РРС без обострений, в этой группе не обнаружен, значительно снижена амплитуда (табл. 1, 2).

В наибольшей степени дезорганизация функциональной активности моноцитов проявляется в изменении временной организации резервной мощности клеток, нивелирование циркадианных ритмов и снижение амплитуд зарегистрировано

13

независимо от наличия обострений (табл. 1), что демонстрирует наибольшую чувствительность индуцированных показателей фагоцитарной функции моноцитов для оценки патологических изменений при РРС.

Зависимость между фагоцитарной способностью моноцитов и активностью РРС, проявляющуюся нарастанием шкалы EDSS и индекса прогрессирования, позволяет использовать их как информативные критерии для прогнозирования обострений РРС.

Показатели, имеющие достоверные различия (р<0,05) между группами пациентов с РРС без обострений и с таковыми в течение года, включены в логистический регрессионный анализ, результаты которого представлены в табл. 3.

Таблица 3

_Предикторы обострений у больных РРС_

Предиктор I ß у3 Wald Р ОР(95%ДИ)

НСТ-тест моноцитов 0,278 4,178 0,041 1,32

_____(1,01±1,72)

КАНСТ-теста -22,154 4,302 0,038 1,24 моноцитов____ (0,2б±2,15)

Согласно результатам регрессионного анализа, предиктивным значением в отношении развития обострений РРС являются показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста моноцитов. Повышение спонтанного НСТ-теста более 53% повышает риск развития обострения РРС в 1,3 раза (от 1,01 до 1,72), понижение стимулированного НСТ-теста (КА НСТ-ПМ) ниже 1,5 - в 1,24 раза (от 0,26 до 2,15).

Патофизиологические аспекты процессов липопероксидации и эндотоксикоза при РРС в стадии ремиссии

Установлено, что у пациентов с РРС без обострений процентное соотношение концентраций для Fe2+ и Fe3+ составляет 24,62% и 75,18% от уровня общего железа, соответственно, достоверно не отличаясь от референтных значений (рис. 5).

Достоверных изменений для среднесуточных показателей сидеремии у пациентов с РРС без обострений, по сравнению с таковыми у здоровых мужчин, не выявлено (табл. 4, рис. 5).

У пациентов с РРС с обострениями концентрация свободного железа в сыворотке крови повышена на фоне снижения уровня общей сидеремии. В этом убеждает значительное уменьшение коэффициента Fe3+/ Fe2+ до 0,7 (у здоровых мужчин 3,7, у пациентов

без обострений - 3,1), связанное с повышением переваривающей активности макрофагов и экзоцитозом ферроионов.

Таблица 4

Ритмометрические параметры сидеремии (мкмоль/л) у здоровых мужчин и у

Время, часы Показатели концентрации

Общее Ре Ре3+ Ре2+

Здоровые мужчины

Мезор 16,11 ±0,34 12,52±0,64 3,42±0,43

Амплитуда 4,92±0,53 6,15±00,38 1,25±00,34

(% от мезора) (30,5) (49,1) (36,2)

Акрофаза 12.19 (11.15; 14.10) 13.34 (11.10; 15.21) 21.52 (18.15; 01.11)

Пациенты с РРС без обострений в течение года

Мезор 15,19±0,63 11,42±0,64 3,74±0,43

Амплитуда (% от мезора) 2,36±0,31** (15,6) 3,15±0,88** (27,6) 1,36±0,22** (36,3)

Акрофаза 15.12 (14.24; 06.00) 14.36 (13.06; 16.06) 23.30 (22.30; 00.24)

Пациенты с РРС с наличием обострений в течение года

Мезор 13,96±0,78** 6,00±0,36** 8,36±0,51**

Амплитуда 1,98±0,21** 0,72±0,04** 1,40±0,11**

(% от мезора) (14,2) (12,3) (16,7)

Акрофаза нет ритма нет ритма нет ритма

Примечание:**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин (р<0,05).

20 :

15

10

0

в Здоровые мужчины М РРС без обострении в РРС с обострениями

Ре?+

Ре2+

Общее железо

Рис. 5. Среднесуточные значения концентрации общего железа, Ре3+, Ре2+ (мкмоль/л) (** - достоверные различия с показателями здоровых мужчин, р<0,05).

У пациентов с РРС при неактивном течении заболевания циркадианный ритм концентрации общего железа и Ре3+, свойственный здоровым людям, сохраняет свои ритмометрические параметры, однако акрофаза смещена с полуденного времени на послеобеденное (15.12) и границы доверительных интервалов сужены. Ритмы Рез1 и общего железа синхронизированы. Для концентрации Ре2+ зарегистрированы циркадианные ритмы с

акрофазой в ночные часы (23.30 ч) и границы доверительного интервала сужены (табл. 4, рис. 4).

Статистически значимый циркадианный ритм концентрации общего железа у пациентов с обострениями не обнаружен. Суточная динамика содержания железа в сыворотке крови этой группы обследованных демонстрирует нивелирование циркадианного ритма и снижение амплитуд колебаний Fe2+ и Fe3+, свидетельствуя о внутрисистемном десинхронозе (табл. 4, рис. 4).

Ритмометрический анализ концентрации МДА в сыворотке крови пациентов с РРС без обострений и у здоровых людей выявил закономерный циркадианный ритм с наибольшими значениями в ночные часы и наименьшими - в дневные. У больных РРС без обострений изменения концентрации МДА на протяжении суток имеют циркадианную периодичность с активной фазой в 24.00 ч, границы доверительного интервала сужены (табл. 5).

Таблица 5

Ритмометрические параметры показателей концентрации МДА (нмоль/л), содержания МСМ26о и МСМ28о в сыворотке крови (усл.ед.) у здоровых мужчин

и у пациентов с РРС в стадии ремиссии, М±т

Время, часы Содержание в сыворотке

МДА мсм260 мсм280

Здоровые мужчины

Мезор 3,01±0,18 0,221±0,009 0,280±0,013

Амплитуда 1,04±0,08 0,052±0,003 0,049±0,014

(% от мезора) (32,4) (23,5) (17,5)

Акрофаза 23.42 00.48 01.24

(22.30; 03.12) (23.00; 01.36) (23.40; 03.36)

Пациенты с РРС без обострений в течение года

Мезор 2,94±0,21 0,229±0,007 0,299±0,013

Амплитуда 1,1±0,08** 0,045±0,001** 0,059±0,004**

(% от мезора) (26,8) (11,8) (16,9)

Акрофаза 24.00 01.12 01.37

(23.06; 01.36) (23.10; 01.16) (23.40; 03.36)

Пациенты с РРС с наличием обострений в течение года

Мезор 4,91±0,39** 0,618±0,032** 0,626±0,03**

Амплитуда 0,96±0,09** 0,77±0,016** 0,093±0,013**

(% от мезора) (19,6) (12,6) (15,0)

Акрофаза нет ритма нет ритма нет ритма

Примечание:**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин (р<0,05). Среднесуточные значения МДА (2,94±0,21 нмоль/л) в сыворотке крови у пациентов с РРС без обострений существенно не отличаются от таковых у здоровых лиц (3,01±0,18 нмоль). Интенсификация

процессов липопероксидации у больных РРС с обострениями проявляется в повышении содержания МДА в сыворотке на 63,1%, по сравнению с контрольной группой.

Циркадианный ритм концентрации МДА у больных с обострениями нивелирован и сопровождается снижением амплитуды колебаний (табл. 5).

Накопление МДА - одного из токсичных продуктов свободнорадикального окисления - инициирует процессы цитолиза.

Среднесуточные значения МСМ260 и МСМ28о сыворотки крови у пациентов с РРС без обострений существенно не отличаются от значений в контрольной группе (табл. 5). Анализ хронограмм МСМ2бо и МСМ28о обнаружил закономерный циркадианный ритм (рис. 4).

Усиление процессов свободнорадикального окисления у больных РРС с активным клиническим течением приводит к избыточному протеолизу и повышению содержания в крови метаболитов (МСМ26о - в 2,2; МСМ280- в 2,6 раза), также сопровождается нивелированием циркадианного ритма (табл.5).

Циркадианная организация процессов липопероксидации и эндотоксикоза у здоровых лиц и у пациентов с РРС без обострений синхронизирована с переваривающей активностью моноцитов и характеризуется ритмичностью на протяжении суток с акрофазой в ночное время. Акрофазы переваривающей активности моноцитов предшествуют акрофазам показателей свободнорадикального окисления (Fe2+, МДА, МСМ) (рис. 4).

Десинхроноз и усиление переваривающей активности моноцитов у больных РРС с обострениями сопряжены с нивелированием суточного ритма составляющих сидеремии и с изменением соотношения между фракциями Fe3+ и Fe2+. Установлены корреляционные связи между повышением переваривающей функции моноцитов и концентрацией в сыворотке крови Fe2+ (г=+82, Р<0,05), свидетельствуя о роли макрофагов в процессах эндотоксикоза. Активация фагоцитарной функции моноцитов у больных РРС с активным клиническим течением заболевания сопровождается интенсификацией кислородзависимого метаболизма, что приводит к избыточному протеолизу и насыщению крови метаболитами. Нарушение структуры миелиновой оболочки нейроцитов вызывает формирование неврологического дефицита и рост шкалы EDSS у больных РРС.

Особенности цитокинового профиля сыворотки крови у больных РРС в стадии ремиссии

Достоверные различия между группами с РРС и здоровыми мужчинами получены для концентрация ИЛ-1, продуцируемого, в основном, макрофагами. Повышение концентрации ИЛ-2 в 3,1 раза, по сравнению с контрольной группой (р<0,05), зарегистрировано только у больных РРС с обострениями, свидетельствуя об активно протекающих иммуновоспалительных процессах (табл. 6, рис. 6).

Полученные данные относительно концентрации ИЛ-8 у больных РРС статистически недостоверны (табл. 6).

Таблица 6

Концентрация про- и противоспалительных цитокинов сыворотки крови у

Показатель Здоровые мужчины Группы больных РРС

ИЛ, пг/мл без обострений с 1-2 обострениями

ИЛ-1 0,63±0,09 1,22±0,19** 1,88±0,27**

ИЛ-2 2,31±0,26 3,83±0,58 7,22±0,79**

ИЛ-8 8,41±0,92 5,6±1,13 8,81±1,24

ИЛ-4 0,41±0,14 0,93±0,45 0,05±0,02**

ИЛ-10 0,72±0,10 0,40±0,17 0,09±0,06**

ИЛ-2/ИЛ-4 5,63±1,86 2,05±1,23 144,4±39,5**

10

5

6

4

?

■ 'Здоровые мужчины

» РРС без обострений SS Й

а ррс с обострениями ИИ —F |

.. ** етИ ! Î

-к' |Ц g у II

ИЛ-1

ИЛ-2

ИЛ-S

Рис. 6. Концентрация провоспалительных ИЛ в сыворотке крови (пг/мл) (**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин, р<0,05).

Достоверной разницы при сравнении значений противоспалительного ИЛ-4 в группах здоровых мужчин и больных с РРС без обострений не выявлено (табл. 6, рис. 7). Уровень ИЛ-4 колебался от 0 до 11,7 пг\мл в группе больных РРС без обострений, у пациентов с обострениями колебания менее выражены: от 0 до 0,41 пг\мл. Повышенная продукция ИЛ-4 у больных со стабильным течением РРС отражает активацию ТЬ2 иммунного ответа.

Продукция ИЛ-10 у больных РРС с обострениями значительно снижена (0,09±0,06 пг\мл), по сравнению с контрольной группой

(0,72±0,10 пг/мл) (табл. 6, рис. 8). Наличие слабой взаимосвязи между показателями переваривающей активности моноцитов и концентрацией ИЛ-10 (г=+0,39 и г=+0,32, соответственно; р<0,05) подчеркивает незначительную роль моноцитов в продукции этого цитокина в стадию ремиссии. Корреляция с ИЛ-4 недостоверна.

1 - ^^ 0.8 ■ , f, ci - i ; I M

IL

IL H **

v---------------

UJI-4 .....—

11Л-10

Рис. 7. Концентрация противоспалительных ИЛ в сыворотке крови (пг/мл) (**- достоверные различия с показателями здоровых мужчин, р<0,05).

Учитывая выраженность колебаний концентрации ИЛ-4, рассчитали коэффициент, характеризующий индивидуальный баланс про- и противовоспалительных цитокинов - ИЛ-2/ИЛ-4. Достоверные значения, полученные у больных РРС с обострениями (табл. 6), свидетельствуют о дисбалансе в системе Thl/ Th2 иммунного ответа

У больных РРС с обострениями преобладает иммунный ответ Thl-типа, модуляцию которого осуществляют, в том числе, макрофаги. Доказательством их роли служит высокая степень корреляции между переваривающей активностью моноцитов и концентрацией ИЛ-1 (НСТ-тест - г=+0,72; ПА - г=+0,70; р<0,05).

Показатели, по которым получены достоверные различия (р<0,05) между группами пациентов с РРС без обострений и с таковыми в течение года, включены в логистический регрессионный анализ, результаты которого представлены в табл.7.

Таблица 7

Предикторы обострений у больных РРС_

Предиктор ß £ Wald ОР (95% ДИ)

ИЛ-4 -3,501 4,142 1,33 (0,79±1,88)

Согласно результатам регрессионного анализа предиктором обострения РРС является снижение концентрации ИЛ-4 в сыворотке крови, риск развития повышается в среднем в ],3 раза (от 0,79 до 1,88).

Таким образом, в стадию ремиссии РРС десинхроноз фагоцитарной активности моноцитов является ранним признаком прогрессирования заболевания.

* Здороеыемуж'пиы я РРС обострений и РРС с обострениями

выводы

1. При ремиттирующей форме рассеянного склероза в стадии ремиссии независимо от наличия обострений в течение года напряженность поглотительной и переваривающей функции моноцитов сопровождается снижением их резервного потенциала.

2. Циркадианные ритмы базовой поглотительной и переваривающей способности моноцитов у пациентов с рассеянным склерозом без обострений синхронизированы. У пациентов с рассеянным склерозом, перенесших 1-2 обострения в течение года, циркадианные ритмы спонтанной и стимулированной фагоцитарной активности нивелированы. Десинхроноз индуцированной поглотительной и переваривающей способности моноцитов независимо от наличия обострений определяет наибольшую чувствительность этих показателей для оценки патологического процесса при ремиттирующей форме рассеянном склерозе.

3. Для циклических колебаний переваривающей способности моноцитов у больных рассеянным склерозом без обострений характерна циркадианная периодичность с акрофазой в вечернее время. Циркадианные ритмы спонтанной переваривающей активности моноцитов синхронизированы с концентрацией двухвалентного железа (Ре2+), МДА, МСМ26о и МСМ28о сыворотки крови.

4. В стадию ремиссии ремиттирующей формы рассеянного склероза без обострений синхронизация акрофаз для Ре2+, МДА, МСМ26о и МСМ28о свидетельствует об их функциональной взаимосвязи. Для рассеянного склероза с обострениями характерен десинхроноз транспортного фонда железа за счет увеличения фракции Ре2+. Повышение концентрации Ре коррелирует с накоплением в сыворотке крови МДА, МСМ260 и

мсм280.

5. При активном течении ремиттирующей формы рассеянного склероза (частые обострения, высокие показатели шкалы инвалидизации ЕОББ и индекса прогрессирования) повышение спонтанной фагоцитарной способности моноцитов ассоциировано с активизацией процессов липопероксидации и эндотоксикоза, повышением концентрации ИЛ-1, ИЛ-2 и снижением продукции ИЛ-4, ИЛ-10.

6. Наиболее чувствительными маркерами (80,0%), отражающими активность ремиттирующего типа рассеянного склероза, следует считать показатели НСТ-теста моноцитов. Наибольшей специфичностью (90,0%) обладают спонтанный и стимулированный НСТ-тест моноцитов в сочетании с концентрацией ИЛ-4 в сыворотке крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. К группе риска по развитию обострений при ремиттирующей форме рассеянного склероза в стадии клинической ремиссии относятся пациенты, у которых спонтанный НСТ-тест моноцитов более 53% (54,68±1,48), стимулированный НСТ-тест ниже 1,5 (1,38±0,11), концентрация ИЛ-4 в сыворотке крови ниже 0,05 пг/мл (0,05±0,02), определяемые во временном интервале с 6.00 до 9.00.

2. Показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста моноцитов, определение концентрации ИЛ-4 в сыворотке крови рекомендуем включить в мониторинг для оценки активности иммунопатологического процесса и прогнозирования обострений при ремитирующей форме рассеянного склероза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Цитокиновый профиль сыворотки крови у больных рассеянным склерозом / Е.А.Шмурыгина, Ю.И.Голынская // Материалы 40-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации». - Тюмень.

- 2006. - С. 25-26.

2. Программная иммуносупрессивная терапия митоксантроном больных РС / С.А.Сиверцева, М.Н.Журавлев, Е.А.Шмурыгина // Материалы V терапевтического форума «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов». - Тюмень. - 2008. - С. 32.

3.* Опыт использования митоксантрона в лечении больных рассеянным склерозом / С.А.Сиверцева, М.Н.Журавлев, Е.А.Шмурыгина Е.А., Е.В.Дехтяренко, А.Н.Бойко // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2009. - Том 109. - №7.

- Вып. 2. - Рассеянный склероз. - С. 100-106.

4. Оценка эффективности иммуномодулирующей терапии

митоксантроном в лечении больных рассеянным склерозом / С.А.Сиверцева, М.Н.Журавлев, Е.А.Шмурыгина // Материалы IV Сибирской межрегиональной научно-практической конференции. -Новосибирск. - 2009. - С. 105-114.

5. Программная иммуносупрессивная терапия митоксантроном больных рассеянным склерозом / С.А.Сиверцева, М.Н.Журавлев, Е.А.Шмурыгина // Материалы XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз». Нейроиммунология. -2009. - Том VII. - №1. . с. 92-93.

6.* Циркадианная организация метаболизма и функции фагоцитов у жителей крайнего севера / Э.Н.Баркова, Е.В.Жданова, Н.А.Курлович, А.А.Туркин, Е.А.Шмурыгина, М.В.Шамаль // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2. -С. 131-132.

7. Иммунологические сдвиги при рассеянном склерозе в стадии ремиссии / Э.Н.Баркова, Е.А.Шмурыгина, Н.А.Курлович // Материалы XI международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». «Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни». - Москва. - 2010. - С. 63-64.

8. Иммунологические изменения и их прогностическая значимость у больных рассеянным склерозом / Е.А.Шмурыгина // Материалы 45-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации». - Тюмень. - 2011. - С. 282-283.

9.* Патофизиологические аспекты дисфункции поглотительной способности мононуклеарных фагоцитов и их прогностическое значение при ремиттирующем рассеянном склерозе / Э.Н.Баркова, Е.А.Шмурыгина, И.Д.Подлузская // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - №4.. с. 30-33.

10. Особенности функциональной активности моноцитов крови у больных ремиттирующей формой рассеянного склероза в стадии ремиссии / Е.А.Шмурыгина, Ю.И.Доян // Материалы 46-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации. - Тюмень. -2012.-С. 378-379.

*- помечены журналы, лицензируемые ВАК

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ интерлейкин

КА коэффициент активации

МДА малоновый диальдегид

МСМ молекулы средней массы НСТ-тест тест восстановления нитросинего тетразолия

ПА переваривающая активность

РРС ремиттирующая форма рассеянного склероза

PC рассеянный склероз

ФИ фагоцитарный индекс

ФЧ фагоцитарное число

EDSS Expanded Disability Status Scale - шкала инвалидизации

Fe2+ двухвалентное железо

Fe3+ трехвалентное железо

Подписано в печать 26.04.12 Формат 60x84/16. Печ. л. 1,0. Печать ризограф. Тираж 100 экз. Зак. № 1247

Типография ООО «Печатник», лицензия ПД №17-0027 Тюмень, ул. Неспублики, 148 корп. '/2. Тел. (3452) 20 Г.чЗ, тел./факс. (3452) 32-13-86